JP4359670B2 - 凍結用具 - Google Patents
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標本の凍結方法は、図2に示すように、(ア)一またはそれ以上の標本Eを平衡液B1,B2で数段階平衡した後、凍結液Lに短時間浸漬する。その後、標本Eを凍結液Lとともにパスツールピペット5に吸引し、(イ)実体顕微鏡下で確認しながら、ピンセット6により把持する凍結用具1の保持部3に滴下し、(ウ)決められた時間に凍結用具1全体を液体窒素等の凍結物質Fに投入し凍結する。次に、(ウ)凍結した凍結用具1の識別部4側を保持し、既存の耐寒性の標本保存筒7に凍結物質Fとともに挿入し、(エ)閉蓋して保管器8で保存する。
標本の融解方法は、図2に示すように、(オ)予め用意した凍結物質F内へ保管器8から取り出した標本保存筒7を入れ、標本保存筒7から凍結用具1を引き出し、(カ)識別部4を保持して、速やかに融解希釈液Wに保持部3を投入し、融解する。(キ)融解した標本Eは顕微鏡下で必要な段階希釈(希釈液W1,W2)を行い、保存液Mに投入後、種々の作業に利用する。
と畜場でと畜された雌ウシから卵巣を切り取り、20℃の抗生物質を添加したビタミンB1加リンゲル液で洗浄後、と畜から6時間内に卵胞卵子を吸引した。吸引は、直径10mm以内の形態的に正常な卵胞から、18ゲージまたは20ゲージの鈍尖注射針を装着した注射筒に予め吸引しておいた0.3%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加したダルベッコリン酸緩衝液(D−PBS)とともに、卵丘細胞卵子複合体(COCs)を吸引した。
形態的に良好なCOCsを、5%仔ウシ血清(CS)を添加したTCM199(卵子成熟液)で2回洗浄後、1ウェルあたり50個のCOCsを流動パラフィンで覆った卵子成熟液500μlで、5%CO2、95%空気および38.5℃の気相条件下で20時間から22時間成熟した。
黒毛和種牛凍結***を38℃で融解後、融解***をテオフィリンおよびカフェインを添加したブラケットとオリファント液(BO液)で希釈して遠心分離を2回施して洗浄し、濃縮***を***濃度で107/mlにBSAおよびヘパリンを添加したBO液で***液を調製した。***液で200μlドロップを作成し、成熟卵子50個を導入し、流動パラフィンで覆い、5%CO2、95%空気および38.5℃の気相条件下で4時間媒精した。
媒精完了した卵子を、10%CSを添加したグルコース不含TCM199(初期発生培地)で洗浄後、1ウェルあたり50個の卵子を卵子成熟に用いた同じウェルに、初期発生培地500μl内で3日または4日培養し、その後10%CSを添加したTCM199(後期発生培地)に交換し、その後2日おきに新鮮な後期発生培地200μlを交換し、受精8日まで培養した。培養気相条件は5%CO2、95%空気および38.5℃で行った。
体外受精後7日または8日において、形態的に栄養膜細胞が単層で均一に発育した上、充実した内部細胞塊を有している拡張胚盤胞期胚を、20%CS添加D−PBS(保存液)で洗浄後、37℃の保存液中で保存して、緩慢冷却による凍結またはガラス化に供試した。
発生胚を10%エチレングリコール、0.1Mシュクロースおよび20%CSを添加したD−PBS(10ES)に導入し、15分平衡し、0.25mlプラスチックストローに吸引封入した。プログラムフリーザを用い、−7℃の冷媒中にストローをセットし、2分経過後液体窒素で冷却した金属製ピンセットを用い強制植氷した。強制植氷して10分経過後、0.3℃/分で緩慢冷却して、−30℃に到達した後、液体窒素へ導入し保存した。
発生胚を2種類のガラス化液でガラス化した。1つは、10%グリセロール、0.1Mシュクロース、0.1Mキシロースおよび1%ポリエチレングリコールを添加したD−PBS(VS1)、および、10%グリセロール、10%エチレングリコール、0.2Mシュクロース、0.2Mキシロースおよび2%ポリエチレングリコールを添加したD−PBS(VS2)に順次5分前平衡し、20%グリセロール、20%エチレングリコール、0.3Mシュクロース、0.3Mキシロースおよび3%ポリエチレングリコールを添加したD−PBS(GESX)に浸漬した。
凍結ストローを液体窒素から取り出し、室温で6秒保持し、その後30℃温湯中で20秒維持することで胚を融解した。次に融解したストローを室温で5分保持し、封印側をストローカッターで切断し、ストローの綿栓側から圧力をかけ、凍結液とともに胚を押し出した。次に胚を保存液に導入して凍結液を希釈した。
液体窒素からピンセットでガラス化した凍結用具1をつまみ、保持部3を素早く0.5Mシュクロースおよび20%CSを添加したD−PBSへ導入して、胚を凍結用具1から加温離脱した。この状態で5分浸漬し、次に胚を0.25Mシュクロースおよび20%CSを添加したD−PBSへ導入し、再び5分浸漬してガラス化液の希釈を行った。加温希釈は室温下で行い、ガラス化液希釈後は37℃の保存液に導入して保存した。
融解または加温した緩慢冷却凍結胚および超急速ガラス化胚は、100μMベータメルカプトエタノールおよび20%ウシ胎仔血清を添加したTCM199(培養液)で数回洗浄後、流動パラフィンで覆った1胚あたり20μlの培養液ドロップで72時間培養した。培養の気相条件は5%CO2、95%空気および38.5℃で行った。
融解または加温した胚は培養開始から24時間、48時間および72時間で生存、発育および状態を観察した。
保存胚の融解または加温後の生存胚数および透明帯脱出胚数を同系列内でカイ自乗検定を行った。
融解または加温後培養した体外受精胚の生存率は、24時間後で10ES:72%、VS:87%およびGESX:100%、48時間後で67%、86%および99%、72時間後で65%、83%および99%とガラス化液VSおよびGESXは80%以上の生存率を維持した。
融解または加温後培養した体外受精胚の透明帯脱出率は、24時間後で10ES:15%、VS:10%およびGESX:62%、48時間後で33%、51%および96%、72時間後で48%、61%および97%と全ての試験区で経時的に上昇が見られた。48時間および72時間後ではガラス化が緩慢冷却より透明帯脱出率が高い傾向にあった。特に、ガラス化液GESXは加温後24時間後で62%、48時間後には96%が透明帯を脱出し、脱出した胚は細胞発育並びに内部細胞塊の形態等良好な発生経過を示した。表2に保存胚の融解または加温後透明帯脱出率を示す。表2から分かるように、aとbの有意差はp<0.05、cとdの有意差はp<0.0005であった。
2 本体部
3 保持部
4 識別部
Claims (5)
- 生物学的標本を凍結液で包被して一端に保持し、凍結物質の中に浸漬することによりガラス化し、ガラス化後、そのまま標本保存筒内に入れて冷凍保存するための凍結用具であって、ポリアミド繊維からなる直径0.2mm〜0.4mmの直線糸状の本体部と、この本体部の一端に勾配を設けて形成された平面状の保持部とを備え、前記本体部の前記保持部に対して反対側の他端に磁力により引き寄せ可能な磁性体材料を備えた凍結用具。
- 前記勾配は、20〜40°である請求項1記載の凍結用具。
- 前記磁性体材料は、鉄である請求項1または2に記載の凍結用具。
- 前記本体部の前記保持部に対して反対側の他端を着色した請求項1から3のいずれかに記載の凍結用具。
- 前記本体部および保持部は、有色透明である請求項1から4のいずれかに記載の凍結用具。
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