JP4323148B2 - ｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩およびその製造法 - Google Patents
ｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩およびその製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩およびその製造法に関する。さらに詳しくは、疎水部位と親水部位を併せ持ち、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用なｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩およびその製造法に関する
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸はＮ−アセチルーＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖であり、多数の遊離カルボキシル基と多数の遊離ヒドロキシル基を有するために水に対する親和性に富み、任意の量の水に溶けて高粘度の水溶液を形成する。この遊離カルボキシル基と遊離ヒドロキシル基を封鎖する事により物性の異なるヒアルロン酸を入手することが期待される。そのため、医療品、食品、化粧品分野などに使用することを目的として、ヒアルロン酸またはその塩（以下、「ヒアルロン酸（塩）」と記述することがある）の化学修飾が行われている（例えば、特許文献１，２参照。）。しかしながら、従来の何れの反応も水分子の存在する系での反応であり、ヒアルロン酸（塩）の化学修飾に適用しうる有機反応が制限されていた。このため、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材となる疎水部位と親水部位を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）の製造は非常に困難であった。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−３０９９０２号公報
【特許文献２】
特開平８−５３５０１号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用な、疎水部位と親水部位を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）について鋭意研究した。その結果、ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒に溶解し、次いで該複合体をｎ−アルカノイル基を有する酸ハロゲン化物と反応させることにより、疎水域と親水域を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）が得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用な、疎水部位と親水部位を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）、特に、非水系での製造であるため発熱物質、抗原性物質などの混入が少なく、さらに体内で代謝されるため特に医薬分野で、例えば手術時等の保湿剤、潤滑剤、創傷被覆剤、さらにはＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）材料として利用できるヒアルロン酸（塩）およびその製造法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（１０）で示される。
（１）下記一般式（１）で表されるｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ水素または直鎖状のＣ５〜Ｃ１５のｎ−アルカノイル基を表し、Ｒ５は水素、金属陽イオン、またはカチオン性化合物を表し、ｎは２〜７，５００の整数を表す。）。
【０００６】
（２）ｎ−アルカノイル基が、下記一般式（２）で表されるｎ−アルカノイル基である前記（１）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ− （２）
（式中、ｍは４〜１０の整数を表す。）。
【０００７】
（３）カチオン性化合物が第４級アンモニウム塩である前記（１）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
【０００８】
（４）第４級アンモニウム塩がジステアリルジメチルアンモニウム塩である前記（３）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
【０００９】
（５）ヒアルロン酸もしくはその塩とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒中でハロゲン化ｎ−アルカノイルと反応させることを特徴とする下記一般式（３）で表されるｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ水素またはＣ４〜Ｃ１８のｎ-アルカノイル基を表し、Ｒ５は水素、金属陽イオン、またはカチオン性化合物を表し、ｎは２〜７，５００の整数を表す。）。
【００１０】
（６）ハロゲン化ｎ−アルカノイルが、下記一般式（４）で表されるハロゲン化ｎ−アルカノイルである前記（５）記載のｎ-アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−Ａ （４）
（式中、ｍは３〜１５の整数を表し、Ａはハロゲンを表す。）。
【００１１】
（７）ハロゲン化ｎ−アルカノイルが、下記一般式（５）で表されるハロゲン化ｎ−アルカノイルである前記（５）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−Ａ （５）
（式中、ｍは４〜１０の整数であり、Ａはハロゲンを表す。）。
【００１２】
（８）非水系溶媒がＤＭＦ，エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、トルエン、塩化メチレンまたはヘプタンから選ばれた１種以上の溶媒である前記（５）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造方法。
【００１３】
（９）カチオン性化合物が第４級アンモニウム塩である前記（５）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【００１４】
（１０）第４級アンモニウム塩がジステアリルジメチルアンモニウム塩である前記（９）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するヒアルロン酸（塩）は特に限定されるものではなく、鶏の鶏冠など各種動物組織由来であっても、ヒアルロン酸（塩）の生産能を有する微生物由来であってもよいが、本発明に使用するヒアルロン酸（塩）は微生物由来であることが好ましい。ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)などを挙げることができる。
【００１６】
微生物による生産は、例えば、１リットル当たりブドウ糖２０〜３０ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸１カリウム３ｇ、リン酸２カリウム２ｇ、チオ硫酸ナトリウム０．１ｇ、硫酸マグネシュウム７水塩０．１ｇ、亜硫酸ナトリウム０．０２ｇ、塩化コバルト０．０１ｇ、塩化マンガン０，０１ｇ、泡消剤５ｇを含む培地に予め準備しておいた種菌を添加し、ｐＨ６．０〜８．５、好ましくは７．０、培養温度２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３５℃で１〜３日間振とう培養もしくは通気培養し、ヒアルロン酸（塩）を該培養液中に生成蓄積させ、該培養液を遠心分離もしくはろ過して菌体を除去した後、ろ過液を限外ろ過もしくは透析することによって低分子量物質を除去し、低分子量物質を除去したろ過液に塩化ナトリウムを溶解後、水溶性有機溶剤を添加してヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させ、該沈殿を遠心分離回収後、真空乾燥する方法を挙げることができる。また、和光純薬製、ナカライテスク製、東京化成製、生化学工業製、シグマ製など市販の試薬グレードのヒアルロン酸（塩）を使用しても特に差し支えない。
【００１７】
また、本発明において原料として使用するヒアルロン酸（塩）はＨＰＬＣ法により測定される平均分子量が、少なくとも５０００から１５０万のものが好ましい。該ＨＰＬＣによる平均分子量の測定には、多糖類の分子量測定に適する任意のカラムを用いることができるが、例えばShodex Ionpak KS806およびIonpak KS-G等のカラムを用いることが好ましい。この場合、溶出液としては０.２mol／L の塩化ナトリウム水溶液を用い、流速１.０ml／分で流し、ヒアルロン酸（塩）の検出は２０６nmで行うことができる。該平均分子量は極限粘度で求めた分子量既知のヒアルロン酸ナトリウムで作製した検量線を用いて計算により求めることができる。
【００１８】
陽イオンとしては、アルカリ金属イオン、カリウムイオン，ナトリウムイオンなどを挙げることができ、本発明においてはナトリウムイオンが好ましい。
【００１９】
本発明において用いるカチオン性化合物は、具体的には第４級アンモニウム塩、アミノ基を２個以上有するアミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸の塩、およびアミノ基を有する糖質の塩などを挙げることができ、好ましくは第４級アンモニウム塩である。
【００２０】
第４級アンモニウム塩としては、アルキル基のうちの少なくとも１個が炭素数８個以上からなるものが好ましい。具体的には、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド（Distearyldimethylammonium Chloride）、ジオレイルジメチルアンモニウムクロライド(Dioleyldimethylammonium Chloride)、セチルピリジニウムクロライド（Cetylpyridinium Chloride）、セチルトリメチルアンモニウムクロライド（Cetyltrimethylammonium Chloride）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Cetyltrimethylammonium Bromide）、ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロマイド(Ditetradecyldimethylammonium Bromide)、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（Didodecyldimethylammonium Bromide）、ジデシルジメチルアンモニウム ブロミド（Didecyldimetylammonium Bromide）、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Octadecyltrimethylammonium Chloride）、ノルマルオクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｎ−Octadecyltrimethylammonium Bromide）、トリドデシルメチルアンモニウムクロライド(Tridodecylmethylammonium Chloride)、トリオクチルメチルアンモニウムブロミド(Trioctylmethylammonium Bromide)、ジオクタノイルＬ−アルファーフォスファチジルコリン(Dioctanoyl Ｌ−α−Phosphatidylcholine)、ジラウロイル、Ｌ−アルファーフォスファチジルコリン(Dilauroyl Ｌ−α−Phosphatidylcholine)、ジパルミトイル Ｄ,Ｌ−アルファーフォスファチジルコリン(Dipalmitoyl Ｄ,Ｌ−α−Phosphatidylcholine)、１,２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Dimyristoyl−３−Trimethylammonium Propane)、１,２―ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Dioleoyl−３−Trimethylammonium Propane)、１,２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Dipalmitoyl−３−Trimethylammonium Propane)、１,２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Distearoyl−３−Trimethylammonium Propane)、ベンザルコニウムクロライド(Benzalkonium Chloride)、ベンゼトニウムクロライド(Benzethonium Chloride)などを挙げることができる。
【００２１】
ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体とはヒアルロン酸のアニオン性部位（カルボキシル基）とカチオン性化合物とがイオン的に結合したものを言い、その調製法の一例を以下に示す。
【００２２】
＜ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体の調製法＞
（Ａ) ヒアルロン酸（塩）を蒸留水またはこれに相当する純水に０.０１〜１０重量％の濃度、好ましくは０.０５〜１重量％の濃度になるように溶解する。なお、本発明において、蒸留水に相当する純水とは、例えば、連続イオン交換（Electric Deionization）および逆浸透（Reverse Osmosis）等により精製した水を意味する。
（Ｂ) 一方、ヒアルロン酸（塩）と複合体を形成させるカチオン性化合物、好ましくは第４級アンモニウム塩を蒸留水または純水に添加し、均一に分散させる。
【００２３】
（Ｂ）で調製したカチオン性化合物の水溶液中のカチオン基と、（Ａ）で調製したヒアルロン酸（塩）の水溶液中のカルボキシル基とのモル比が、０.５〜５：１、好ましくは０.７〜１.５：１、例えば１：１になるように２つの水溶液を混合する。
【００２４】
なお、混合する際の温度は室温でも良いが、好ましくは使用するカチオン性化合物のゲル−液晶転移温度以上に両液を加温して行う。
【００２５】
混合により発生した水不溶物は通常化学実験で使用する分離法、例えば遠心分離、吸引ろ過、加圧ろ過等の方法で混合液より回収する。回収した水不溶物は、当該カチオン性化合物のゲル−液晶転移温度以上に加温した蒸留水または純水にて洗浄した後、乾燥に供する。乾燥は、通常化学実験で使用する乾燥手段、例えば常圧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等により行うことができる。
【００２６】
また、本発明において使用しうる非水系溶媒は、例えば、ＤＭＦ，エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、トルエン、ヘプタン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ等、またはこれらの２種以上の混合溶媒が包含される。ＤＭＦ，エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、トルエンもしくはヘプタン、またはこれらの混合溶媒が好ましい。
【００２７】
非水系溶媒に溶解させるヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体の濃度は、特に限定するものではないが、１〜１０００mmol／Ｌの範囲であることが好ましい。
【００２８】
該複合体の非水系溶媒への溶解後に行うＯ−アシル化反応（ｎ−アルカノイル化反応）としては、ピリジンなど塩基性溶剤の存在下、ハロゲン化ｎ−アルカノイルを用いるＯ−アシル化法（Schotten−Baumann法)などを挙げることができる。ここで、ハロゲン化ｎ−アルカノイルとしては具体的には、ｎ−ブチリルクロライド、ｎ−ヘキサノイルクロライド、ｎ−オクタノイルクロライド、ｎ−デカノイルクロライド、ｎ−ドデカノイルクロライド、ｎ−ステアロイルクロライド等を挙げる事ができ、Ｃ４〜Ｃ１８、好ましくはＣ５〜Ｃ１７、より好ましくはＣ６〜Ｃ１２のハロゲン化ｎ−アルカノイルである。
【００２９】
例えば、O-アシル化反応がｎ−ドデカノイル化、即ちｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸（塩）の製造の場合は、上述のように得られたヒアルロン酸（塩）のカチオン性化合物複合体を窒素雰囲気下、ＤＭＦに溶解し、ピリジン、ｎ−ドデカノイルクロライドを加え攪拌し、反応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え、析出した沈殿をアセトン／水（9/1）で洗浄後、真空乾燥し、ｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸（塩）を得ることができる。
【００３０】
本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）の用途は、特に限定されるものではないが、医薬品、食品、化粧品分野などに用いられる各種材料として使用可能である。特に本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）は、非水系での製造であるため発熱物質、抗原性物質などの混入が少なく、さらに体内で代謝されるため特に医薬分野で、例えば手術時等の保湿剤、潤滑剤、創傷被覆剤、さらにはＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）材料として用いることが可能である。中でもその子宮内における分解速度が、人体（子宮）内のバイオリズムと高い相関性を示すことが期待されていることから、例えば子宮内膜症治療薬を担持する子宮内もしくは膣内埋植用製剤のデバイスとして極めて有効である。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明を詳細に説明する。
各種のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）の製造例を以下に示す。
実施例１
１．ｎ−ブチリル化ヒアルロン酸（塩）の製造
１−１． ヒアルロン酸とジステアリルジメチルアンモニウムクロライド錯体の作製
ヒアルロン酸ナトリウム（チッソ ＣＨＡ、極限粘度より求めた平均分子量５万、以下、「ＣＨＡ」と記載する）１.８ｇを純水３００mlに溶解するとともに、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド（以下、ＤＳＣと略する）２.４７ｇを５６０mlの純水にケン濁させた。両液を４５℃に加温後攪拌しながら混合し、５分間攪拌を続けた。発生した錯体を遠心分離（５０００rpm、室温）にて回収し、４５℃の温水にて洗浄した。洗浄終了後、一夜凍結乾燥し、その後、５０℃で一夜真空乾燥し、ヒアルロン酸とジステアリルジメチルアンモニウムクロライド錯体（以下ＣＨＡ−ＤＳＣと略する）を得た。収量３.３ｇ、収率８５％。
【００３２】
１−２．ｎ−ブチリル化ヒアルロン酸の合成
得られたＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、目的のＤＳに必要な量のｎ−ブチリルクロライド、ピリジンを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃で真空乾燥し、白色固体のｎ−ブチリル化ヒアルロン酸を得た。
【００３３】
実施例２
ｎ−ヘキサノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、目的のＤＳに必要な量のｎ−ヘキサノイルクロライド、ピリジンを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−ヘキサノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３４】
実施例３
ｎ−オクタノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、ｎ−オクタノイルクロライド１６．３mg、ピリジン３０ｍｌを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−オクタノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３５】
実施例４
ｎ−デカノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、ｎ−デカノイルクロライド１９．１mg、ピリジン３０ｍｌを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−デカノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３６】
実施例５
ｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、ｎ−ドデカノイルクロライド２１．９mg、ピリジン３０ｍｌを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３７】
実施例６
ｎ−ステアロイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たCHA-DSC４６４mgを窒素雰囲気下、60 ℃でDMF 30 mlに溶解し、ピリジン，目的のＤＳに必要な量のステアロイルクロライドを加え、2 hr攪拌した。反応溶液に酢酸ナトリウム飽和エタノール60 ml加え、析出した沈殿をアセトン / 水 (9 / 1 ) で５回洗浄した。これを真空乾燥して白色固体のｎ−ステアロイル化ヒアルロン酸を得た。
なお、ここでいうＤＳとは各反応条件のＨＡ−ＤＳＣと酸ハロゲン化物のモル比で実施した際の理論上のヒアルロン酸二糖単位当たり存在する4個の水酸基へのアルカノイル基の導入割合を表わす。
【００３８】
実施例７
実施例１〜６で得られた各ｎ−アルカノル化ヒアルロン酸の溶解性及びゲル化の評価
各ｎ−アルカノル化ヒアルロン酸５ｍｇを各溶剤１ｍｌに添加、試験管ミキサーで均一にした後、室温で一日放置し、その状態を観察し、その結果を表１〜３に示した。
各表中で溶液特性の表現は以下の状態を意味する
可溶：溶媒に完全に溶解し、ゲル等の形成しない状態
不溶：白色固体のまま溶媒に溶解しない状態
Ｓ−Ｇ（ゾル-ゲル）：溶媒中に細かいゲルを形成した状態
不均一Ｇ（不均一ゲル）：ゲルではあるが均一性を欠くゲル
Ｇ（ゲル）：均一のゲル
【００３９】
表 １ 各種ｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸の溶解特性
【００４０】
表 ２ ＤＳが異なるn-ブチリル化およびヘキサノイル化ヒアルロン酸の溶解特性
【００４１】
表 ３ ＤＳの異なるn-ステアロイル化ヒアルロン酸の溶解特性
【００４２】
【発明の効果】
本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩は、、疎水域と親水域を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）であり、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として極めて有用である。特に本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）は、非水系での製造であるため発熱物質、抗原性物質などの混入が少なく、さらに体内で代謝されるため特に医薬分野で、例えば手術時等の保湿剤、潤滑剤、創傷被覆剤、さらにはＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）材料として利用できる。また、本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法は、ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒に溶解し、次いで該複合体をｎ−アルカノイル基を有する酸ハロゲン化物と反応させることにより、疎水部位と親水部位を併せ持ち、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用なヒアルロン酸（塩）を容易に製造することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩およびその製造法に関する。さらに詳しくは、疎水部位と親水部位を併せ持ち、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用なｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩およびその製造法に関する
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸はＮ−アセチルーＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖であり、多数の遊離カルボキシル基と多数の遊離ヒドロキシル基を有するために水に対する親和性に富み、任意の量の水に溶けて高粘度の水溶液を形成する。この遊離カルボキシル基と遊離ヒドロキシル基を封鎖する事により物性の異なるヒアルロン酸を入手することが期待される。そのため、医療品、食品、化粧品分野などに使用することを目的として、ヒアルロン酸またはその塩（以下、「ヒアルロン酸（塩）」と記述することがある）の化学修飾が行われている（例えば、特許文献１，２参照。）。しかしながら、従来の何れの反応も水分子の存在する系での反応であり、ヒアルロン酸（塩）の化学修飾に適用しうる有機反応が制限されていた。このため、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材となる疎水部位と親水部位を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）の製造は非常に困難であった。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−３０９９０２号公報
【特許文献２】
特開平８−５３５０１号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用な、疎水部位と親水部位を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）について鋭意研究した。その結果、ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒に溶解し、次いで該複合体をｎ−アルカノイル基を有する酸ハロゲン化物と反応させることにより、疎水域と親水域を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）が得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用な、疎水部位と親水部位を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）、特に、非水系での製造であるため発熱物質、抗原性物質などの混入が少なく、さらに体内で代謝されるため特に医薬分野で、例えば手術時等の保湿剤、潤滑剤、創傷被覆剤、さらにはＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）材料として利用できるヒアルロン酸（塩）およびその製造法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（１０）で示される。
（１）下記一般式（１）で表されるｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
【０００６】
（２）ｎ−アルカノイル基が、下記一般式（２）で表されるｎ−アルカノイル基である前記（１）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ− （２）
（式中、ｍは４〜１０の整数を表す。）。
【０００７】
（３）カチオン性化合物が第４級アンモニウム塩である前記（１）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
【０００８】
（４）第４級アンモニウム塩がジステアリルジメチルアンモニウム塩である前記（３）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩。
【０００９】
（５）ヒアルロン酸もしくはその塩とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒中でハロゲン化ｎ−アルカノイルと反応させることを特徴とする下記一般式（３）で表されるｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【００１０】
（６）ハロゲン化ｎ−アルカノイルが、下記一般式（４）で表されるハロゲン化ｎ−アルカノイルである前記（５）記載のｎ-アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−Ａ （４）
（式中、ｍは３〜１５の整数を表し、Ａはハロゲンを表す。）。
【００１１】
（７）ハロゲン化ｎ−アルカノイルが、下記一般式（５）で表されるハロゲン化ｎ−アルカノイルである前記（５）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−Ａ （５）
（式中、ｍは４〜１０の整数であり、Ａはハロゲンを表す。）。
【００１２】
（８）非水系溶媒がＤＭＦ，エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、トルエン、塩化メチレンまたはヘプタンから選ばれた１種以上の溶媒である前記（５）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造方法。
【００１３】
（９）カチオン性化合物が第４級アンモニウム塩である前記（５）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【００１４】
（１０）第４級アンモニウム塩がジステアリルジメチルアンモニウム塩である前記（９）記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するヒアルロン酸（塩）は特に限定されるものではなく、鶏の鶏冠など各種動物組織由来であっても、ヒアルロン酸（塩）の生産能を有する微生物由来であってもよいが、本発明に使用するヒアルロン酸（塩）は微生物由来であることが好ましい。ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)などを挙げることができる。
【００１６】
微生物による生産は、例えば、１リットル当たりブドウ糖２０〜３０ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸１カリウム３ｇ、リン酸２カリウム２ｇ、チオ硫酸ナトリウム０．１ｇ、硫酸マグネシュウム７水塩０．１ｇ、亜硫酸ナトリウム０．０２ｇ、塩化コバルト０．０１ｇ、塩化マンガン０，０１ｇ、泡消剤５ｇを含む培地に予め準備しておいた種菌を添加し、ｐＨ６．０〜８．５、好ましくは７．０、培養温度２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３５℃で１〜３日間振とう培養もしくは通気培養し、ヒアルロン酸（塩）を該培養液中に生成蓄積させ、該培養液を遠心分離もしくはろ過して菌体を除去した後、ろ過液を限外ろ過もしくは透析することによって低分子量物質を除去し、低分子量物質を除去したろ過液に塩化ナトリウムを溶解後、水溶性有機溶剤を添加してヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させ、該沈殿を遠心分離回収後、真空乾燥する方法を挙げることができる。また、和光純薬製、ナカライテスク製、東京化成製、生化学工業製、シグマ製など市販の試薬グレードのヒアルロン酸（塩）を使用しても特に差し支えない。
【００１７】
また、本発明において原料として使用するヒアルロン酸（塩）はＨＰＬＣ法により測定される平均分子量が、少なくとも５０００から１５０万のものが好ましい。該ＨＰＬＣによる平均分子量の測定には、多糖類の分子量測定に適する任意のカラムを用いることができるが、例えばShodex Ionpak KS806およびIonpak KS-G等のカラムを用いることが好ましい。この場合、溶出液としては０.２mol／L の塩化ナトリウム水溶液を用い、流速１.０ml／分で流し、ヒアルロン酸（塩）の検出は２０６nmで行うことができる。該平均分子量は極限粘度で求めた分子量既知のヒアルロン酸ナトリウムで作製した検量線を用いて計算により求めることができる。
【００１８】
陽イオンとしては、アルカリ金属イオン、カリウムイオン，ナトリウムイオンなどを挙げることができ、本発明においてはナトリウムイオンが好ましい。
【００１９】
本発明において用いるカチオン性化合物は、具体的には第４級アンモニウム塩、アミノ基を２個以上有するアミノ酸、ペプチド、ポリアミノ酸の塩、およびアミノ基を有する糖質の塩などを挙げることができ、好ましくは第４級アンモニウム塩である。
【００２０】
第４級アンモニウム塩としては、アルキル基のうちの少なくとも１個が炭素数８個以上からなるものが好ましい。具体的には、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド（Distearyldimethylammonium Chloride）、ジオレイルジメチルアンモニウムクロライド(Dioleyldimethylammonium Chloride)、セチルピリジニウムクロライド（Cetylpyridinium Chloride）、セチルトリメチルアンモニウムクロライド（Cetyltrimethylammonium Chloride）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Cetyltrimethylammonium Bromide）、ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロマイド(Ditetradecyldimethylammonium Bromide)、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（Didodecyldimethylammonium Bromide）、ジデシルジメチルアンモニウム ブロミド（Didecyldimetylammonium Bromide）、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Octadecyltrimethylammonium Chloride）、ノルマルオクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｎ−Octadecyltrimethylammonium Bromide）、トリドデシルメチルアンモニウムクロライド(Tridodecylmethylammonium Chloride)、トリオクチルメチルアンモニウムブロミド(Trioctylmethylammonium Bromide)、ジオクタノイルＬ−アルファーフォスファチジルコリン(Dioctanoyl Ｌ−α−Phosphatidylcholine)、ジラウロイル、Ｌ−アルファーフォスファチジルコリン(Dilauroyl Ｌ−α−Phosphatidylcholine)、ジパルミトイル Ｄ,Ｌ−アルファーフォスファチジルコリン(Dipalmitoyl Ｄ,Ｌ−α−Phosphatidylcholine)、１,２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Dimyristoyl−３−Trimethylammonium Propane)、１,２―ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Dioleoyl−３−Trimethylammonium Propane)、１,２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Dipalmitoyl−３−Trimethylammonium Propane)、１,２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(１,２−Distearoyl−３−Trimethylammonium Propane)、ベンザルコニウムクロライド(Benzalkonium Chloride)、ベンゼトニウムクロライド(Benzethonium Chloride)などを挙げることができる。
【００２１】
ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体とはヒアルロン酸のアニオン性部位（カルボキシル基）とカチオン性化合物とがイオン的に結合したものを言い、その調製法の一例を以下に示す。
【００２２】
＜ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体の調製法＞
（Ａ) ヒアルロン酸（塩）を蒸留水またはこれに相当する純水に０.０１〜１０重量％の濃度、好ましくは０.０５〜１重量％の濃度になるように溶解する。なお、本発明において、蒸留水に相当する純水とは、例えば、連続イオン交換（Electric Deionization）および逆浸透（Reverse Osmosis）等により精製した水を意味する。
（Ｂ) 一方、ヒアルロン酸（塩）と複合体を形成させるカチオン性化合物、好ましくは第４級アンモニウム塩を蒸留水または純水に添加し、均一に分散させる。
【００２３】
（Ｂ）で調製したカチオン性化合物の水溶液中のカチオン基と、（Ａ）で調製したヒアルロン酸（塩）の水溶液中のカルボキシル基とのモル比が、０.５〜５：１、好ましくは０.７〜１.５：１、例えば１：１になるように２つの水溶液を混合する。
【００２４】
なお、混合する際の温度は室温でも良いが、好ましくは使用するカチオン性化合物のゲル−液晶転移温度以上に両液を加温して行う。
【００２５】
混合により発生した水不溶物は通常化学実験で使用する分離法、例えば遠心分離、吸引ろ過、加圧ろ過等の方法で混合液より回収する。回収した水不溶物は、当該カチオン性化合物のゲル−液晶転移温度以上に加温した蒸留水または純水にて洗浄した後、乾燥に供する。乾燥は、通常化学実験で使用する乾燥手段、例えば常圧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等により行うことができる。
【００２６】
また、本発明において使用しうる非水系溶媒は、例えば、ＤＭＦ，エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、トルエン、ヘプタン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ等、またはこれらの２種以上の混合溶媒が包含される。ＤＭＦ，エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、トルエンもしくはヘプタン、またはこれらの混合溶媒が好ましい。
【００２７】
非水系溶媒に溶解させるヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体の濃度は、特に限定するものではないが、１〜１０００mmol／Ｌの範囲であることが好ましい。
【００２８】
該複合体の非水系溶媒への溶解後に行うＯ−アシル化反応（ｎ−アルカノイル化反応）としては、ピリジンなど塩基性溶剤の存在下、ハロゲン化ｎ−アルカノイルを用いるＯ−アシル化法（Schotten−Baumann法)などを挙げることができる。ここで、ハロゲン化ｎ−アルカノイルとしては具体的には、ｎ−ブチリルクロライド、ｎ−ヘキサノイルクロライド、ｎ−オクタノイルクロライド、ｎ−デカノイルクロライド、ｎ−ドデカノイルクロライド、ｎ−ステアロイルクロライド等を挙げる事ができ、Ｃ４〜Ｃ１８、好ましくはＣ５〜Ｃ１７、より好ましくはＣ６〜Ｃ１２のハロゲン化ｎ−アルカノイルである。
【００２９】
例えば、O-アシル化反応がｎ−ドデカノイル化、即ちｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸（塩）の製造の場合は、上述のように得られたヒアルロン酸（塩）のカチオン性化合物複合体を窒素雰囲気下、ＤＭＦに溶解し、ピリジン、ｎ−ドデカノイルクロライドを加え攪拌し、反応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え、析出した沈殿をアセトン／水（9/1）で洗浄後、真空乾燥し、ｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸（塩）を得ることができる。
【００３０】
本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）の用途は、特に限定されるものではないが、医薬品、食品、化粧品分野などに用いられる各種材料として使用可能である。特に本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）は、非水系での製造であるため発熱物質、抗原性物質などの混入が少なく、さらに体内で代謝されるため特に医薬分野で、例えば手術時等の保湿剤、潤滑剤、創傷被覆剤、さらにはＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）材料として用いることが可能である。中でもその子宮内における分解速度が、人体（子宮）内のバイオリズムと高い相関性を示すことが期待されていることから、例えば子宮内膜症治療薬を担持する子宮内もしくは膣内埋植用製剤のデバイスとして極めて有効である。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明を詳細に説明する。
各種のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）の製造例を以下に示す。
実施例１
１．ｎ−ブチリル化ヒアルロン酸（塩）の製造
１−１． ヒアルロン酸とジステアリルジメチルアンモニウムクロライド錯体の作製
ヒアルロン酸ナトリウム（チッソ ＣＨＡ、極限粘度より求めた平均分子量５万、以下、「ＣＨＡ」と記載する）１.８ｇを純水３００mlに溶解するとともに、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド（以下、ＤＳＣと略する）２.４７ｇを５６０mlの純水にケン濁させた。両液を４５℃に加温後攪拌しながら混合し、５分間攪拌を続けた。発生した錯体を遠心分離（５０００rpm、室温）にて回収し、４５℃の温水にて洗浄した。洗浄終了後、一夜凍結乾燥し、その後、５０℃で一夜真空乾燥し、ヒアルロン酸とジステアリルジメチルアンモニウムクロライド錯体（以下ＣＨＡ−ＤＳＣと略する）を得た。収量３.３ｇ、収率８５％。
【００３２】
１−２．ｎ−ブチリル化ヒアルロン酸の合成
得られたＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、目的のＤＳに必要な量のｎ−ブチリルクロライド、ピリジンを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃で真空乾燥し、白色固体のｎ−ブチリル化ヒアルロン酸を得た。
【００３３】
実施例２
ｎ−ヘキサノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、目的のＤＳに必要な量のｎ−ヘキサノイルクロライド、ピリジンを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−ヘキサノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３４】
実施例３
ｎ−オクタノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、ｎ−オクタノイルクロライド１６．３mg、ピリジン３０ｍｌを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−オクタノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３５】
実施例４
ｎ−デカノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、ｎ−デカノイルクロライド１９．１mg、ピリジン３０ｍｌを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−デカノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３６】
実施例５
ｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たＣＨＡ−ＤＳＣ４６４mgを窒素雰囲気下、ＤＭＦ３０mlに攪拌溶解させ、ｎ−ドデカノイルクロライド２１．９mg、ピリジン３０ｍｌを加え６０℃、２時間攪拌した。反応終了後、酢酸ナトリウム飽和エタノール溶液（60 ｍｌ）を加え、ゲルを析出させると共にDSCを除去した。これをアセトン/水＝９：１の溶液で５回洗浄後、６０℃真空乾燥し白色固体のｎ−ドデカノイル化ヒアルロン酸を得た。
【００３７】
実施例６
ｎ−ステアロイル化ヒアルロン酸の合成
実施例１の１−１．に準拠して得たCHA-DSC４６４mgを窒素雰囲気下、60 ℃でDMF 30 mlに溶解し、ピリジン，目的のＤＳに必要な量のステアロイルクロライドを加え、2 hr攪拌した。反応溶液に酢酸ナトリウム飽和エタノール60 ml加え、析出した沈殿をアセトン / 水 (9 / 1 ) で５回洗浄した。これを真空乾燥して白色固体のｎ−ステアロイル化ヒアルロン酸を得た。
なお、ここでいうＤＳとは各反応条件のＨＡ−ＤＳＣと酸ハロゲン化物のモル比で実施した際の理論上のヒアルロン酸二糖単位当たり存在する4個の水酸基へのアルカノイル基の導入割合を表わす。
【００３８】
実施例７
実施例１〜６で得られた各ｎ−アルカノル化ヒアルロン酸の溶解性及びゲル化の評価
各ｎ−アルカノル化ヒアルロン酸５ｍｇを各溶剤１ｍｌに添加、試験管ミキサーで均一にした後、室温で一日放置し、その状態を観察し、その結果を表１〜３に示した。
各表中で溶液特性の表現は以下の状態を意味する
可溶：溶媒に完全に溶解し、ゲル等の形成しない状態
不溶：白色固体のまま溶媒に溶解しない状態
Ｓ−Ｇ（ゾル-ゲル）：溶媒中に細かいゲルを形成した状態
不均一Ｇ（不均一ゲル）：ゲルではあるが均一性を欠くゲル
Ｇ（ゲル）：均一のゲル
【００３９】
表 １ 各種ｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸の溶解特性
表 ２ ＤＳが異なるn-ブチリル化およびヘキサノイル化ヒアルロン酸の溶解特性
表 ３ ＤＳの異なるn-ステアロイル化ヒアルロン酸の溶解特性
【発明の効果】
本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩は、、疎水域と親水域を併せ持つ新しいタイプのヒアルロン酸（塩）であり、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として極めて有用である。特に本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸（塩）は、非水系での製造であるため発熱物質、抗原性物質などの混入が少なく、さらに体内で代謝されるため特に医薬分野で、例えば手術時等の保湿剤、潤滑剤、創傷被覆剤、さらにはＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）材料として利用できる。また、本発明のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法は、ヒアルロン酸（塩）とカチオン性化合物との複合体を非水系溶媒に溶解し、次いで該複合体をｎ−アルカノイル基を有する酸ハロゲン化物と反応させることにより、疎水部位と親水部位を併せ持ち、医療品、食品、化粧品分野などの新しい素材として有用なヒアルロン酸（塩）を容易に製造することができる。
Claims (5)
- ヒアルロン酸もしくはその塩と第４級アンモニウム塩との複合体を非水系溶媒中でハロゲン化ｎ−アルカノイルと反応させることを特徴とし、非水系溶媒中の複合体の濃度が１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である、下記一般式（３）で表されるｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ水素またはＣ４〜Ｃ１８のｎ-アルカノイル基を表し、Ｒ５は水素、金属陽イオン、またはカチオン性化合物を表し、ｎは２〜７，５００の整数を表す。）。 - ハロゲン化ｎ−アルカノイルが、下記一般式（４）で表されるハロゲン化ｎ−アルカノイルである請求項１記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−Ａ （４）
（式中、ｍは３〜１５の整数であり、Ａはハロゲンを表す。）。 - ハロゲン化ｎ−アルカノイルが、下記一般式（５）で表されるハロゲン化ｎ−アルカノイルである請求項１記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
ＣＨ３−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−Ａ （５）
（式中、ｍは４〜１０の整数であり、Ａはハロゲンを表す。）。 - 非水系溶媒がＤＭＦ，エタノール、メタノール、アセトン、クロロホルム、トルエン、塩化メチレンまたはヘプタンから選ばれた１種以上の溶媒である請求項１記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造方法。
- 第４級アンモニウム塩がジステアリルジメチルアンモニウム塩である請求項１記載のｎ−アルカノイル化ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
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