KR101107313B1 - 알카노일화된 황산기 함유 다당류로 형성된 나노입자 및 그제조방법 - Google Patents

알카노일화된 황산기 함유 다당류로 형성된 나노입자 및 그제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황산기 함유 다당류가 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 황산기 함유 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자, 그 제조방법, 및 그 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자는 독성이 없고 생체 적합성일 뿐만 아니라, 나노입자간의 응집현상이 현격히 줄어들어 장기간 제제 안정성이 높은 약물 전달체로서 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 항암제의 약물 전달체로서 사용시 나노입자 본연의 수동적 타겟팅에 의해 암조직으로의 항암제의 축적을 가능하게 할 수 있으며, 나노입자를 구성하는 황산기 함유 다당류의 세포 친화성으로 인해 항암제가 암세포 내에 잘 유입되어 효과적으로 작용할 수 있도록 하는 장점이 있다. 또한, 나노입자에 다양한 기능성 고분자 물질을 도입하기 용이하므로 더욱 진보적인 다기능성 약물전달체를 개발하기 용이하다.

Description

알카노일화된 황산기 함유 다당류로 형성된 나노입자 및 그 제조방법{Nanoparticles formed from alkanoylated sulfate groups-containing ploysaccharides and a process for the preparation thereof}
본 발명은 새로운 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소수성기의 도입으로 양친매성화된 황산기 함유 다당류가 자가응집되어 형성된 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
암의 발병율은 계속해서 증가하고 있으며, 이에 따른 암 치료방법 및 약물의 개발이 끊임없이 이루어지고 있다. 현재 사용되고 있는 암 치료법은 암세포만을 외과수술로 제거하는 수술요법, 방사선 요법, 세포독성을 보이는 항암제를 이용한 화학요법 등이다. 항암제를 이용한 화학요법은 암 치료에 널리 사용되는 방법이지만, 암세포뿐만 아니라 정상세포에까지 세포 독성을 나타내므로 부작용의 위험성이 따른다. 따라서, 항암제를 이용한 화학요법 분야에서는 항암제의 부작용은 줄이면서 암 치료 효과는 극대화시키기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
나노입자는 항암제를 비롯한 약물의 선택적 표적부위 전달을 위한 약물 전달체중 하나로서, 직경이 수 nm 내지 수백 nm인 입자 크기를 갖는 넓은 표면적을 가 진 콜로이드 상의 불균일 분산입자를 의미한다. 항암제가 봉입된 나노입자는 어떤 암세포 표적 잔기가 없어도 정상조직에 부작용을 미치지 않으면서 암치료를 하기 위한 암조직으로의 타겟팅이 그 자체로서 가능하다. 나노입자의 이러한 타겟팅 효과는 향상된 투과성 및 유지(Enhanced permeability and retention; EPR) 효과라 불리는 암 세포의 특이적인병리 생리학적 특징에 의해 얻어진다. 체내에서의 악성 이상형상물(neoplasm)은 정상 조직보다 빠르게 자라고, 필수적으로 많은 영양분 및 산소의 공급을 요구하게 되며, 이로 인해 암세포 주변에 새로운 혈관의 급격한 생성을 유발하게 된다. 즉, 암세포 주변이 혈관은 빨리 생성되기 때문에, 이들 신생성 혈관은 혈관으로부터 나노 입자가 빠져 나가기 충분하게 큰 유출성의 구멍을 가지게 되며, 따라서 나노입자가 암 조직에 축적되게 되는 것이다.
생체 적합성의 다당류 물질에 소수성을 부여하여 양친매성화한 다당류를 미셀화에 의해 나노입자를 형성하고, 그러한 나노입자를 약물전달체로서 사용하는 방법이 알려져 있다(C.T. Lee et al. 2007, Biomolecular Engineering. 24, 131-139). 생체 적합성 다당류는 많은 하이드록실 그룹을 갖는 다당류 물질의 경우 친수성이 있고 생체활성 잔기를 포함하기 때문에, 친수성과 세포와의 친화성을 갖는다고 보고된 바 있다(Rodrigues N.S., Santos-Magalhaes N.S., Coelho. L.C.B.B, Couvreur. P., Ponchel. G., Gref. R. 2003. J. Contr. Rel. 92, 103-112). 생체 적합성 다당류의 이러한 관능기는 특정 점막유착 및 수용체를 인식할 수 있다는 특징을 지니고 있다고 알려져 있다(Torchilin. V.P., 2000, Eur. J. Pharm. Sci. 2, s81-s91). 따라서, 생체 적합성 다당류를 양친매성화하여 형성되는 나노입자는 나 노입자 자체로서의 제제학적 특성 이외에도 생체적 적합성 다당류의 생체 친화성으로 인해 우수한 약물전달체로서 이용될 수 있다.
따라서, 다양한 생체 적합성 다당류를 양친매성화 하여 제조하는 나노입자를 개발하기 위한 노력이 이루어지고 있으나, 실질적으로는 임의의 생체 적합성 다당류를 단순히 소수성화 함으로써 나노입자가 용이하게 생성될 수는 없다. 따라서, 원하는 생체 적합성 고분자를 양친매성화하여 원하는 나노입자를 제조하기 위해서는 적합한 생체 적합성 고분자의 선택 및 소수성화 잔기의 선택을 위한 부단한 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 약물 전달체로서 우수한 성질을 갖는, 생체 적합성 다당류를 이용한 나노입자의 개발을 위해 예의 연구한 결과, 황산기 함유 다당류를 소수성 잔기의 도입에 의해 양친매성화한 다음, 자가응집시켜 형성된 나노입자를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 양친매성화된 황산기 함유 다당류로 형성된 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 양친매성화된 황산기 함유 다당류로 형성된 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양친매성화된 황산기 함유 다당류로 형성된 나노입자를 포함하는 주사제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황산기 함유 다당류가 C2-C4알카노일화되어 양친매성화된 황산기 함유 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 제공한다.
상기 나노입자는
황산기 함유 다당류 및 C2-C4알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시켜, C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류 생성물을 얻는 단계;
상기 생성물과 물을 혼합하여 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류를 침전시켜 수득하는 단계;
상기 수득된 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계; 및
상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 황산기 함유 다당류가 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 황산기 함유 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 황산기를 함유하는 생체 적합성 친수성 고분자의 하이드록실기에 C2-C4알카노일기를 친핵성 치환반응에 의해 에스테르 결합시 상기 고분자가 양친매성화 되어, 자가응집에 의해 약물 전달체로서 적합한 나노입자를 형성할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 황산기 함유 다당류가 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 황산기 함유 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 제공한다.
상기 황산기 함유 다당류로는 황산 콘드로이친, 황산 더마탄, 황산 헤파란, 또는 황산 커들란 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, C2-C4 알카노일화에 의해 나노입자를 형성할 수 있는 임의의 황산기 함유 다당류가 될 수 있다. 상기 황산기 함유 다당류 중에서도, 특히 황산 콘드로이친이 바람직하다.
황산 콘드로이친은 연골, 피부, 각막 및 태반에 존재하는 산성 무코폴리사카이드(mucopolysaccharide)로서, 글리코사미노글리칸(GAG)의 일종으로서, 생체 적합성 및 세포 친환성이 우수하다. 황산 콘드로이친의 형태는 어떠한 것이든 상관없으며, 예를 들면 콘드로이친-4-설페이트 또는 콘드로이친-6-설페이트일 수 있다. 황산 콘드로이친 중에서도 바람직하게는, D-글루쿠론산, N-아세틸갈락토사민 및 술페이트 잔기가 동등 몰량으로 존재하는 하기 화학식 1와 같은 황산 콘드로이친을 사용할 수 있다.
Figure 112009013943777-pat00001
상기 황산 콘드로이친과 같은 황산기 함유 다당류는 다수의 황산 잔기를 포함하여 친수성이며 또한 하이드록실기(-OH)를 포함하고 있으므로 이 부분의 알카노일화를 통해서 황산기 함유 다당류에 양친매성을 부여할 수 있다. 양친매성을 띠는 황산 콘드로이친은 유기용매 중에 잘 용해되며 수중에서의 투석과정을 통해 나 노입자가 형성할 수 있게 되는 것이다. 상기 황산기 함유 다당류가 알카노일화되는 정도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 황산기 함유 다당류 1 몰당 200-600 몰의 C2-C4알칸산과 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 250-500 몰의 C2-C4알칸산과 반응시킬 수 있다.
상기 황산기 함유 다당류의 C2-C4 알카노일화는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 예를 들어 황산기 함유 다당류와 C2-C4 알칸산 무수물과의 반응에 의해 이루어질 수 있다. 상기 C2-C4알카노일화 중에서도 아세틸화가 바람직하다.
상기 본 발명에 따른 나노입자에 봉입된 약물은 그 나노입자에 봉입될 수 있는 임의의 약물일 수 있으며, 예를 들어 소수성 약물일 수 있다. 이러한 소수성 약물은 독소루비신, 탁솔, 캄토테신, 아드리아마이신, 파클리탁셀, 시스-플라틴(cis-platin), 미토마이신-C, 도노마이신(daunomycin) 및 5-플루오로우라실로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서,
황산기 함유 다당류 및 C2-C4알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시켜, C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류 생성물을 얻는 단계;
상기 생성물과 물을 혼합하여 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류를 침전시켜 수득하는 단계;
상기 수득된 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계; 및
상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 황산기 함유 다당류가 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 황산기 함유 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.
이하에서는, 상기 제조방법을 단계별로 보다 상세하게 설명한다.
1) 황산기 함유 다당류 및 C 2 -C 4 알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시켜, 알카노일화된 황산기 함유 다당류 생성물을 얻는 단계
상기 C2-C4 알칸산 무수물은 바람직하게는 아세트산 무수물이며, 하기 화학식 2와 같은 구조식을 갖는다.
Figure 112009013943777-pat00002
상기 C2-C4 알칸산 무수물은 황산 콘드로이친의 -CH2OH 모이어티와의 친핵성 치환반응을 통해 황산 콘드로이친의 -CH2OH 모이어티를 -CH2OCOC1-3알킬로 변화시킴 으로써 황산 콘드로이친에 소수성을 부여할 수 있다. 황산 콘드로이친과 알칸산 무수물의 반응이 종결된 후 남은 알칸산 무수물의 잔기들은 산성을 부여하게 되는데, 이러한 산성을 중화시켜 주기 위해 반응 용매 중에 피리딘 등을 부가할 수 있다.
상기 반응에서 사용되는 용매는 상기 황산기 함유 다당류 및 C2-C4 알칸산 무수물이 모두 녹으면서, 황산기 함유 다당류의 알카노일화를 저해하지 않는 임의의 용매가 이용될 수 있으며, 예를 들어 포름아미드 등이 이용될 수 있다.
상기 황산기 함유 다당류를 C2-C4알칸산과 반응시키는 비율은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 황산기 함유 다당류 1 몰당 200-600 몰의 C2-C4알칸산과 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 250-500 몰의 C2-C4알칸산과 반응시킬 수 있다.
상기 반응은 실온에서 이루어질 수 있으며, 반응시간은 약 8-16 시간 동안 수행할 수 있다.
2) 상기 생성물에 물을 가하여 C 2 -C 4 알카노일화된 황산기 함유 다당류를 침전시켜 수득하는 단계
상기 단계 1)의 과정에서 생성된 알카노일화된 황산기 함유 다당류를 분리하기 위해, 상기 알카노일화된 황산기 함유 다당류 생성물을 물과 혼합하여 소수성이 부여된 알카노일화된 황산기 함유 다당류만을 침전시킬 수 있다. 알카노일화된 황 산기 함유 다당류는 소수성이 부여되었기 때문에 상기 생성물을 친수성의 물에 부가하면, 알카노일화된 황산기 함유 다당류만이 용해되지 않아 침전될 수 있는 것이다. 그리하여 침전된 생성물을 다른 용매, 미반응물 등으로부터 용이하게 분리해 낼 수 있으며, 바람직하게는 원심분리에 의해 상기 침전된 생성물을 용이하게 분리해 낼 수 있다.
3) 상기 수득된 C 2 -C 4 알카노일화된 황산기 함유 다당류 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계
상기 단계 2)를 통해 얻어진 침전물(C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류) 및 약물을 용매에 녹인 후, 투석막에 넣고 수중에서 투석과정을 통해 나노입자를 제조할 수 있다. 이러한 투석과정을 통하면 투석막 안의 유기용매와 막 밖의 증류수간의 삼투압에 의하여 유기용매는 투석 막 밖으로 이동하고 증류수는 막 안으로 이동하게 된다. 이러한 과정 중 소수성이 부여된 양친매성 황산 콘드로이친이 자가응집되어 나노입자를 형성하게 되며, 이러한 나노입자 형성과정에서 나노입자의 소수성 부위와 약물의 소수성 부위가 상호작용을 통해 결합하게 되어 약물이 나노입자의 내부에 봉입될 수 있다. 이러한 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류의 나노입자 형성의 모식도를 도 1에 나타내었다.
상기 약물로서 독소루비신을 사용할 경우에는, 시중에 시판되는 독소루비신 염산염을 친수성을 제거하기 위해, 상기 나노입자 형성과정을 수행하기 전에 트리에틸아민을 가하여 염산을 제거하는 것이 바람직하다.
상기 침전물 및 약물을 용해하기 위한 용매는 약물을 봉입한 나노입자의 형성을 저해하지 않는 임의의 용매가 이용될 수 있으며, 예를 들어 디메틸술폭시드, 1,4-다이옥세인 등이 이용될 수 있다.
상기 알카노일화된 황산기 함유 다당류 및 약물을 용매 중에 용해한 혼합액을 투석막에 넣고 투석하기 위해 사용되는 외부의 물은, 상기 사용되는 약물의 특성에 따라 당업자가 적절히 선택한 완충제를 함유한 수용액으로서 이용될 수 있다. 예를 들어 독소루비신을 사용할 경우 독소루비신의 아민기의 안정성을 유지하기 위하여 pH 9 이상의 완충용액을 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 붕산염 완충염 완충용액을 사용할 수 있다.
상기 투석에 사용되는 투석막은 봉입되지 않는 약물, 및 상기 침전물과 약물을 용해하기 위해 사용된 용매가 투과될 수 있는 투석막을 사용할 수 있으며, MWCO 500-1000 범위의 투석막을 사용할 수 있다. 독소루비신과 같이 소수성 항암제를 봉입한 나노입자를 제조할 경우에는 소수성 항암제의 종류에 따라 달라질 수도 있으나, 통상적으로는 분자량 1,000 이하의 물질만 제거할 수 있는 범위의 투석막을 이용할 수 있다. 상기 투석과정에 의해, 투석막을 통해 유입된 물에 의해서 양친매성 알카노일화 황산기 함유 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집에 의해 나노입자를 형성할 수 있다. 이러한 나노입자의 형성과 함께, 부산물로서 형성될 수 있는 불순물 및 용매가 제거될 수 있고, 봉입되지 않은 약물 및 중합되지 않은 알칸 산 무수물이 제거될 수 있다.
4) 상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계.
상기 투석과정에 의해 생성 및 정제된 나노 입자를 동결건조시킴으로써 약물이 봉입된 순수한 나노입자만을 회수할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 나노입자는 소수성 약물을 비롯한 각종 약물의 전달체로서 사용될 수 있으며, 나노입자를 구성하는 황산기 함유 다당류가 독성이 없고, 생체내 분해성이 있어 생체 적합성을 가지며, 다당류에 다수의 황산기가 포함되어 나노입자의 전위가 음전하를 가져 입자간의 응집현상을 현격히 줄일 수 있다. 그리하여, 상기 본 발명에 따른 나노입자는 생체 적합성이면서도 장기 보관 시에도 입자간 응집이 일어나지 않는 장기적인 제제 안정성을 나타내는 약물 전달체로서 이용될 수 있다. 또한, 나노입자가 가지고 있는 본연의 특성인 약물의 서방성을 기대할 수 있다. 더욱이, 항암제의 약물 전달체로서 사용하여 수동적 암표적화에 의해 항암제의 여러 가지 부작용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 나노입자를 구성하는 황산기 함유 다당류의 세포 친화성으로 인해, 수동적 암표적화에 의해 암조직에 축적된 나노입자가 암세포 내로 잘 유입되어 세포 내에서 분해되면서 봉입되어 있던 항암제가 작용하여 암세포만을 효율적으로 사멸시키는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 나노입자를 구성하는 알카노일화된 황산기 함유 다당류는 다양한 관능기를 가지며, 이러한 관능기를 이용하여 기능성 고분자 물질을 도입하기 용이하므로 더욱 진보적인 다기능성 약물전달체를 개발하기 용이하다.
상기 본 발명에 따른 나노입자는 주사에 의해 생체에 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
이러한 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 나노입자는 독성이 없고 생체 적합성일 뿐만 아니라, 나노입자간의 응집현상이 현격히 줄어들어 장기간 제제 안정성이 높은 약물 전달체로서 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 항암제의 약물 전달체로서 사용시 나노입자 본연의 수동적 타겟팅에 의해 암조직으로의 항암제의 축적을 가능하게 할 수 있으며, 나노입자를 구성하는 황산기 함유 다당류의 세포 친화성으로 인해 항암제가 암세포 내에 잘 유입되어 효과적으로 작용할 수 있도록 하는 장점이 있다. 또한, 나노입자에 다양한 기능성 고분자 물질을 도입하기 용이하므로 더욱 진보적인 다기능성 약물전달체를 개발하기 용이하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 독소루비신이 봉입된 황산 콘드로이친 아세테이트 나노입자의 제조
1) 황산 콘드로이친의 소수성화(황산 콘드로이친의 아세틸화)
40℃의 온도에서 황산콘드로이친(Carl ROTH, Germany) 1g을 포름아미드(kanto chemical, Japan) 10 ml에 녹인 후, 피리딘(Junsei, Japan)을 3 mL 첨가하고 30 분 후, 아세트산 무수물(Junsei, Japan)을 7ml 첨가하였다. 아세트산 무수물을 넣어준 후 12 시간 동안 반응을 수행하였다.
2) 황산콘드로이친 아세테이트의 수득
상기 1)에서 제조한 황산콘드로이친 아세테이트만을 수득하기 위하여 반응이 끝난 용액을 증류수 300 ml에 넣어 침전시켰다. 황산콘드로이친 아세테이트만을 분리시키기 위하여 원심분리(3000rpm, 15분)를 통하여 침전물만을 분리시켰다. 침전물을 DMSO에 녹여 3일동안 투석(cut off 1000)한 후 동결건조하여 고체형태의 황산콘드로이친 아세테이트를 수득하였다.
3) 독소루비신이 봉입된 나노입자의 제조
독소루비신(Sigma-aldrich, USA) 0.5mg을 DMSO 1ml에 녹인 후 트리에틸아민(Sigma-aldrich, USA) 2μl를 첨가하고 12시간 정도 반응시켰다. 별도로, 상기 2)에서 수득한 황산콘드이친 아세테이트 10mg을 DMSO 2ml에 녹인 다음, 상기 독소루비신 용액과 혼합하였다. 그 혼합 용액을 pH 9.5 붕산염 완충제(borate buffer) 수용액 중에서 MWCO 1,000 투석막을 사용하여 투석하였다. pH 9.5, 붕산염 완충액제 수용액을 사용하여 투석을 실행한 이유는 독소루비신의 pKa 값이 8.4이므로 8.4이하의 pH에서는 독소루비신의 아민기(-NH2)가 친수성을 가져 물에 녹는 성질이 있기 때문에, 나노입자에 독소루비신을 봉입하는 과정에서 독소루비신의 나노입자의 소수성 부분과 소수성-소수성 상호작용을 극대화 시켜주기 위한 과정이다.
상기 투석과정에 의해 약물이 봉입된 나노입자를 형성시킴과 동시에, 유기용매인 디메틸설폭시드, 독소루비신 염산의 염산을 제거하기 위한 촉매로 사용된 트리에틸아민, 및 봉입되지 않은 독소루비신을 제거하였다.
그리하여 제조된 나노 입자 수용액을 동결 건조기를 사용하여 건조시켜 순수한 나노 입자만을 회수하였다.
실시예 2: 항암제 미봉입 나노입자 제조
독소루비신를 함유하지 않고 나노입자를 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 과정을 수행하여 약물이 미봉입된 나노입자를 수득하였다.
실험예 1: 황산콘드로이친 아세테이트 합성 검증
황산 콘드로이친 아세테이트의 합성을 검증하기 위하여 FT-IR(Nicolet, Magna IR 550)을 이용하였다. 상기 실시예 1의 1)에서 제조된 황산콘드로이친 아세테이트를 KBr과 함께 황산콘드로이친 아세테이트 : KBr = 1 : 5 (wt%)의 비율로 막자사발에 섞은 후 막자를 사용하여 갈아, 고체형태의 펠렛으로 만들고, 고체형태의 펠렛을 기기에 넣고 측정 하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 3400cm-1 파수의 하이드록실기(-OH)가 줄어들고 1800cm-1 부근의 카보닐기(C=O)가 생성되고, 1300cm-1 부근의 메틸기(-CH3)가 생성된 것을 확인하였다. 이러한 하이드록실기의 감소와 카보닐기와 메틸기의 생성을 확인함으로써 황산 콘드로이친이 아세틸화 되었다는 것이 확인되었다.
실험예 2: 나노입자의 특성분석
황산 콘드로이친 아세테이트 나노입자의 크기를 황산콘드로이친 아세테이트 나노입자를 탈이온수에 1mg/ml의 농도로 분산시킨 다음 제타전위 zetasizerSZ (Malvern, UK)를 이용하여 측정하였다. 나노입자의 약물 봉입효율과 약물함량 측정은 UV-VIS 분광광도계(UV-2450, Shimadzu)를 이용하여 490 nm 파장에서 독소루비신의 흡광도를 측정하였다. 봉입효율은 투입한 약물의 중량 대비 나노입자에 봉입된 약물의 중량을 퍼센트화한 지표이고, 약물함량은 수득한 나노입자 중량대비 약물의 중량을 퍼센트화한 지표이다.
나노입자의 약물봉입 양은 나노입자에 봉입시킨 약물인 독소루비신을 g/L의 농도 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.015625, 0.007813, 0.003906, 0.001953, 0.000977의 농도로 희석하여 흡광도를 측정하여 표준검량선을 얻었고, 실시예 1에서 얻어진 독소루비신 봉입 나노입자의 흡광도 값을 표준검량선에 도입하여 약물의 농도를 구한 다음 그에 기초하여 봉입된 약물양을 계산하여 약물의 봉입효율 및 약물함량을 계산하였다. 비교를 위해 실시예 2의 나노입자에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다. 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
입자크기(nm) 다분산 계수 봉입효율
(%)		 약물함량
(%)		 제타전위
(mV)
실시예2 502.23ㅁ38.55 0.16ㅁ0.03 - - -41.4ㅁ0.88
실시예1 234.93ㅁ58.30 0.54ㅁ0.06 91ㅁ0.17 4.58ㅁ0.01 -36.93ㅁ0.86
실험예 3: 임계 응집 농도 측정
나노입자가 형성될 수 있는 최소 임계 농도 값을 측정하기 위하여 형광물질인 파이렌 98%(Simga aldrich, USA)을 사용하였고, 형광분광광도계(RF-5301PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 파이렌의 형광을 측정하였다. 형광 분광의 측정을 위해 피렌 스톡 용액 (Pyrene stock solution, 6.0 x 10 M)을 아세톤에서 준비하였고, 사용할 때까지 5℃에서 저장하였다. 안정상태 형광분광의 측정을 위하여 피렌 농도 12.0x 10-7M을 맞추려고, 아세톤하의 피렌 용액을 증류수에 첨가하여 100ml의 용액을 만들었다, 다음으로 용액으로부터 아세톤을 제거하기 위하여 60℃에서 1시간동안 용액을 증류하였다. 아세톤이 없는 피렌 용액은 0.00025mg/ml에서 1.0 mg/mL 범위 농도의 자가 응집 나노입자와 함께 혼합되었다. 피렌 용액 1ml과 시료 용액 1ml을 혼합하여 최종 2ml의 용액을 만들었다. 각 시료에서 피렌의 최종농도는 6.0 x 10-7M이었고 이는 25 ℃의 물에서 용해도와 거의 같은 것이다. 그에 따른 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 (A)는 각 시료의 농도의 따른 형광 스펙트럼 변화를 측정한 그래프 이며, 도 3의 (B)는 형광 스펙트럼의 쉬프트(shift) 현상을 수식을 통해 시료의 농도에 따라 나타낸 그래프 이다.
실험예 4: 나노입자의 장기 안정성 측정
상기 실시예 1에서 제조한 나노입자를 1mg/ml의 농도로 탈이온수에 분산한 후, 시간에 따라 샘플 1ml을 취하여 zetasizerSZ (Malvern, UK)을 이용하여 입자 크기를 분석하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 22 일동안 350 nm의 입자크기를 유지함을 알 수 있다. 이는 황산콘드로이친 아세테이트에 포함된 황산 잔기에 의해 입자가 음전하를 띄게 되고 이 때문에 입자 사이에 반발력이 생겨 나노입자의 불안정한 응집현상을 막았기 때문이다.
실험예 5: 나노입자에서의 약물 방출시험
상기 실시예 1에서 얻어진 독소루비신이 봉입된 나노입자 2 ml를 투석막(MWCO 1,000, Spectra사)에 넣고 투석막을 10 mM 생리식염수 10ml 중에서 37℃, 50 rpm의 환경에서 약물의 방출 경향을 측정하였다. 특정 시간마다 생리식염수를 완전히 교체해주는 식으로 실험을 수행하였으며, 교체한 생리식염수에 녹아있는 독소루비신 흡광도를 UV-VIS 분광광도계(UV-2450, Shimadzu)를 이용하여 490nm 파장에서 측정함으로써 독소루비신의 양을 정량하였다. 그에 따른 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 약물방출이 60시간 동안 진행되었음을 알 수 있다.
실험예 6: 세포독성실험
본 발명에 따른 나노입자가 항암제를 봉입한 경우(실시예 1)와 약물을 전혀 봉입하지 않은 경우(실시예 2) 암세포인 HeLa 세포에 어떠한 독성 차이를 보이는지 알아보기 위하여 96 플레이트에 플레이트당 3 X 10-5 세포 농도로 세포를 분주하고 24 시간 후 나노입자 20 μl를 처리하였다. 각 웰의 농도가 순서대로 2mg/ml, 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 또는 0.125mg/ml가 되도록 처리하였다. 나노입자 처리 48 시간 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(Sigma Aldrich사) 20 μl를 처리하고 4 시간 후, 흡입기로 세포를 제외한 모든 용액을 제거하였다. 용액 제거 후 DMSO(Junsei사) 150μl를 처리, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 595nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 확인하였다.
그 결과를 도 6에서 나타내었다. 도 6에 따르면, 실시예 1에서 제조한 나노입자의 경우 1 mg/ml에서 세포 생존률이 50%로 감소하는데 반해, 실시예 2의 경우 세포독성이 없는 것으로 나타나, 본 발명에 따른 나노입자(약물성분 제외한 약물 전달체)는 생체적합성이 뛰어난 약물 전달체라는 것을 알 수 있다.
실험예 7: 항암제 봉입 황산콘드로이친 아세테이트 나노입자의 세포내 유입 실험
독소루비신을 봉입한 황산콘드로이친 아세테이트 나노입자가 암 세포 내로 유입될 수 있는지 알아보기 위하여 황산콘드로이친 아세테이트 30 mg을 FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer) 0.15mg을 이용하여 형광표지를 하는 것만을 제외하고 동일한 방식으로 실시예 1과 같이 나노입자를 제조하였다. 독소루비신은 자체 형광을 가지기 때문에 처리해주지 않았다.
HeLa 세포를 6 플레이트의 커버글라스 위에 1 X 10-5 세포 농도로 분주하고 24시간 후 나노입자 100 μl씩 처리하였다. 나노입자 처리 4시간 후 생리식염수로 3회에 걸쳐 세포 내로 유입되지 않은 모든 물질을 세척해주고, 4% 파라포름알데히드(Yakuri pure chemicals, Japan)를 이용하여 10분간 세포를 고정하고 다시 생리식염수로 3회에 걸쳐 세척을 시행하고 세포가 붙어 있는 커버글라스를 마운팅 용액(mounting solution)(Dako, Japan)을 사용하여 슬라이드 글라스에 고정시킨 다음 공촛점 현미경(Leica TCS NT, Leica,Germany)을 이용하여 관찰되는 세포의 사진을 촬영하였다.
그 촬영한 사진을 도 7에 나타내었다. 도 7a는 세포내 핵을 염색한 것이고, 도 7b는 황산콘드로이친 아세테이트 나노입자의 세포내 분포를 형광표지(FITC)에 의해 확인한 것이다. 또한 도 7c는 독소루비신의 세포내 분포를 확인한 것이고, 도 7d는 광학 이미지를 보여주고 있다. 도 7e는 도 7a-7e를 겹쳐서 본 영상이다. 이러한 사진에 따르면, 황산콘드로이친 아세테이트 나노 입자의 세포 내로의 유입을 확인할 수 있고, 항암제 또한 세포 내로 유입되었음을 확인 할 수 있었다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류의 나노입자 형성의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 황산 콘드로이친 아세테이트의 FT-IR 기기분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 발명의 일 실시예에 따른 황산콘드로이친 아세테이트 나노입자의 임계 응집농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3의 (A)는 각 시료의 농도의 따른 형광 스펙트럼 변화를 측정한 그래프이며, 도 3의 (B)는 형광 스펙트럼의 쉬프트(shift) 현상을 수식을 통해 시료의 농도에 따라 나타낸 그래프 이다.
도 4는 발명의 일 실시예에 따른 황산콘드로이친 아세테이트 나노입자의 수용액 내에서 입자크기를 시간 경과에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 발명의 일 실시예에 따른 황산콘드로이친 아세테이트 나노입자의 수중에서의 약물 방출율을 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자에 독소루비신이 봉입된 나노입자(실시예 1)와 약물이 봉입되지 않은 나노입자(실시예 2)의 암세포에 대한 세포 독성 시험을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자가 암세포에 유입는지 여부를 확인하기 위해, FITC 형광표지된 황산콘드로이친 아세테이트로 제조된 독소루비신이 봉입된 나노입자를 암세포에 처리한 다음, 공초점 현미경으로 관찰하여 촬영한 사진이다.

Claims (10)

  1. 황산기 함유 다당류가 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 황산기 함유 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 황산기 함유 다당류는 황산 콘드로이친, 황산 더마탄, 황산 헤파란, 또는 황산 커들란인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 황산기 함유 다당류는 아세틸화되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 약물은 소수성 약물인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 소수성 약물은 독소루비신, 탁솔, 캄토테신, 아드리아마이신, 파클리탁셀, 시스플라틴, 미토마이신-C, 도노마이신, 포피린(porphyrin), 클로린(chlorine) 및 5-플루오로우라실로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 황산기 함유 다당류 및 C2-C4알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시 켜, C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류 생성물을 얻는 단계;
    상기 생성물과 물을 혼합하여 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류를 침전시켜 수득하는 단계;
    상기 수득된 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 다당류가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계; 및
    상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 C2-C4알칸산 무수물은 아세트산 무수물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류 생성물을 얻는 단계에서 사용된 용매는 포름아미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류를 수득하는 단계는 침전된 C2-C4알카노일화된 황산기 함유 다당류를 원심분리에 의해 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 포함하는 주사제.
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