JP4314365B2 - エンドセリン−2/vicに対する特異的な抗体、作製方法、およびその用途 - Google Patents
エンドセリン−2/vicに対する特異的な抗体、作製方法、およびその用途 Download PDFInfo
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Description
一方、本発明者等は、マウスのゲノムの解析から、血管・腸管平滑筋収縮ペプチドVICを発見し、エンドセリンには3種類のペプチドが存在する事(エンドセリン遺伝子ファミリー)を初めて示した(特許文献1、非特許文献1参照)。またヒトにおいては、エンドセリン-2が相当するペプチドである事が報告された(特許文献2、非特許文献2参照)。
マウスVIC
CysSerCysAsnSerTrpLeuAspLysGluCysValTyrPheCysHisLeuAspIleIleTrp
ヒトET-2
CysSerCysSerSerTrpLeuAspLysGluCysValTyrPheCysHisLeuAspIleIleTrp
さらに、エンドセリン-2あるいはVICの前駆体としてアミノ酸約40個からなるペプチド(以後、これらをそれぞれビッグ-エンドセリン-2、ビッグ-VICと表わす)および約200個からなるペプチド(以後、エンドセリン-2前駆体/VIC前駆体と表す)も得られている。本明細書においてはエンドセリン-2/VIC、ビッグ-エンドセリン-2/ビッグ-VICおよびエンドセリン-2前駆体/VIC前駆体をあわせて、エンドセリン-2/ VICと総称する。
ビッグ-エンドセリン-2/ビッグ-VICとしては、たとえば以下のアミノ酸配列(a)、(b)で示されるアミノ酸配列のマウスやラットビッグ-VICや、アミノ酸配列(c)で示されるアミノ酸配列のヒトビッグ-エンドセリン-2などが挙げられる。
(a)マウスビッグVIC
CysSerCysAsnSerTrpLeuAspLysGluCysValTyrPheCysHisLeuAspIleIleTrpValAsnThrAlaG lyGlnThrAlaProTyrGlyLeuGlyAsnProProArgArgArgArgArg
(b)ラットビッグVIC
CysSerCysAsnSerTrpLeuAspLysGluCysValTyrPheCysHisLeuAspIleIleTrpValAsnThrAlaGlyGlnThrAlaProTyrGlyLeuGlyAsnProProGlnArgArgArgArg
(c)ヒトビッグET-2
CysSerCysSerSerTrpLeuAspLysGluCysValTyrPheCysHisLeuAspIleIleTrpValAsnThrProGluGlnThrAlaProTyrGlyLeuGlyAsnProProArgArgArgArgArg
エンドセリン-2前駆体/VIC前駆体としては、たとえば、アミノ酸配列1−203のマウスやラットVIC前駆体やアミノ酸配列1−212のヒトエンドセリン-2前駆体などが挙げられる。
すなわち、本発明は、以下の(1)〜(5)に関するものである。
(5) 担体上に上記(1)に記載の抗体を結合して不溶化せしめたことを特徴とする、エンドセリン−2及び/又はVICの定量用担体。
Trp:トリプトファン
Ile:イソロイシン
Leu:ロイシン
Asp:アスパラギン酸
Pro:プロリン
Thr:スレオニン
Gly:グリシン
His:ヒスチジン
Cys:システイン
Arg:アルギニン
Ser:セリン
Met:メチオニン
Asn:アスパラギン
Lys:リジン
Glu:グルタミン酸
Gln:グルタミン
Val:バリン
Tyr:チロシン
Phe:フェニルアラニン
Boc:t−ブトキシカルボニル
Tos:トシル
OBzl:ベンジルエステル
MeBzl:4−メチルベンジル
Bzl:ベンジル
Cl−Z:2−クロロベンジルオキシカルボニル
Br−Z:2−ブロモベンジルオキシカルボニル
Acm:アセトアミドメチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TEA:トリエチルアミン
PAM:4−(オキシメチル)フェニルアセトアミドメチル
pTs・OH:p−トルエンスルホン酸
HONB:N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド
ONB:N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド・エステル
DMF:N,N′−ジメチルホルムアミド
DCC:N,N′−シクロヘキシルカルボジイミド
WSCD・HCl:1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド・塩酸塩
固相法によりET-2(3-11)/VIC(3-11)やそれを含むペプチドを合成する場合、メリーフィールドの固相ペプチド合成方法〔ジャーナル オブ ジ アメリカン ケミカル ソサィエティ(J.Am.Chem.Soc.),85,2149(1963)〕を用いるのが好ましい。不溶性樹脂として当該技術分野で知られたもののいずれであってもよく、例えばクロロメチル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、フェナシルアセティックメチル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体のようなポリスチレン型樹脂、ポリジメチルアクリルアミド樹脂のようなポリアミド型樹脂が挙げられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル等が好都合に用いられる。
用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられる。
抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水(好ましくは血液)などから採取される。抗血清中の抗エンドセリン-2/VIC抗体価の測定は、例えば後記の標識化エンドセリン-2/VICと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。抗体の分離精製は免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原抗体結合物あるいは活性吸着剤により特異抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。
一方、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2−5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗エンドセリン-2/VIC抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー(Nature)、256、495(1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
抗エンドセリン-2/VIC抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、たとえばエンドセリン-2/VICを吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結合した抗エンドセリン-2/VICモノクローナル抗体を検出するEIA法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、HRPで標識したエンドセリン-2/VICを加え、固相に結合した抗エンドセリン-2/VICモノクローナル抗体を検出するEIA法などがあげられる。抗エンドセリン-2/VICモノクローナル抗体の選別、育種は通常HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加して、10−20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地(例、RPMI1640)で行われる。
抗エンドセリン-2/VICモノクローナル抗体の分離精製は上記のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。
上記で得られた抗エンドセリン-2/VICポリクローナル抗体、該抗体を含む抗血清あるいは抗エンドセリン-2/VICモノクローナル抗体を用いて、通常の免疫測定法等に従い、エンドセリン-2/VICの測定乃至、組織染色等を行ない得る。エンドセリン-2/VICの免疫測定法には、次に述べる競合法あるいはサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
該エンドセリン-2/VICの標識剤あるいは後記の抗体の標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば125I,131I, 3H,14Cなどが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスァターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいはエンドセリン-2/VICと標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
また、サンドイッチ法によるビッグ-エンドセリン-2/ビッグ-VICの免疫学的測定法においても同様である。
さらに、本発明で得られた抗エンドセリン-2/VIC抗体はエンドセリン-2/VICの免疫組織染色法等にも用いる事ができる。その方法は、例えば標識化抗エンドセリン-2/VIC抗体を用いる直接法、抗エンドセリン-2/VIC抗体および抗エンドセリン-2/VIC抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法等に順ずることができる。
本発明の抗体は、免疫組織染色で使われる他、ELISAやRIAキットとして診断キットとして使用できる。本発明は、抗原として、特に、エンドセリン−1と異なるアミノ酸を強調し得る配列を選んだ点、及びこれに加えVIC(3-11)とVICを交互に免疫する事で、双方で共通のアミノ酸が相互にブーストする効果を生じて、結果として違いを認識する特異性の高い抗体が作れた。特異性は、(RIAと)ELISAで測定した。図の実施例で解る。免疫染色の実際は図4−図9で示した。
i)VIC(3-11)及びそれを含むペプチドの合成
市販のBoc−Trp(CHO)−PAM樹脂、(アプライド・バイオシステムズ社製)を用い、ペプチド合成機(アプライド・バイオシステムズ社製・モデル430A)を使用し、通常の方法により合成した。縮合方法は、樹脂上のBoc基を塩化メチレン中50%トリフルオロ酢酸で処理し、末端アミノ基を遊離させ、この遊離のアミノ基にBoc−Ile,Boc−Asp(OBzl),Boc−Leu,Boc−His(Tos),Boc−Cys(Acm),Boc−Tyr(Br−z),Boc−Val,Boc−Phe,Boc−Glu(OBzl),BocーLys(Cl−Z),Boc−Met,Boc−Ser(Bzl)をC末端側よりVIC及びその一部VIC(3-11)を含む)のアミノ酸配列通りに、DCCの存在下に縮合させる反応をくり返した。
カラム:ケムコ社製ヌクレオシル50DS−H(4.6mmφ×250mm)
溶離液:A液(0.1%−トリフルオロ酢酸水)
B液(0.1%−トリフルオロ酢酸含有−50%含水アセトニトリル)
を用いA液からB液へ直線型濃度勾配溶出(20分)
流 速:1.0ml/分
測定条件
カラム:東洋ソーダ製 DEAE−2SW(4.6mmφ×250mm)
溶離液:A液(10mM トリス・塩酸pH7.5)
B液(1M NaCl含有A液)
を用いA液からB液へ直線型濃度勾配溶出(40分)
流 速:1.0ml/分
(i)免疫原(I)
VIC(3-11)及びそれを含むペプチド〔上記(1)で得られたもの〕とKLHとをグルタルアルデヒドを用いて結合させた。即ち、当該ポリペプチド4.5mgとTG13.5mgとを4.5mlの0.2Mリン酸緩衝液pH7.0に溶解させたのち、最終濃度0.2%のグルタルアルデヒドを加え、室温3時間反応させた。反応後、生理食塩水に対し4℃、2日間透析した。
上記合成したハプテンVIC(3-11)、免疫源として用いたハプテンVIC(3-11)−KLHのアミノ酸配列及びその構造を、VIC、ET-2及びET−1及びET−3とともに図1に示す。
上記(2)で得た免疫原(I)400μgを含む生理食塩水450μlに550μlの完全フロイントアジュバント(Freund complete adjuvant)を加えてよく混和し乳剤を作成し、ウサギの皮下約20ヶ所に接種した。6週間後に、不完全フロイントアジュバントを用い、同様の操作で乳剤を作りウサギの皮下に接種した。この操作を以後1ヶ月おきに3回〔免疫原(I)〕4回〔免疫原(II)〕または4回〔免疫原(III)〕行ない、追加免疫の7日後、ウサギから血液を部分採取し常法により抗血清を得た。同様に6−8週令のBALB/C雌マウスに免疫原(I)70μg/匹をアジュバントとともに皮下免疫した。以後3週間おきに2−3回追加免疫し、免疫7日後に部分採血し、抗血清を得た。
i)ペルオキシダーゼ標識化エンドセリン-2/VICの作製
エンドセリン-2/VIC 210n moleを450μlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0に溶解させ、GMBS295μg(1.05μmole)を含むDMF溶液50μlと混合し、室温で30分反応させた。反応後、セファデックスG−15カラムで分画を行ないマレイミド基の導入されたポリペプチド100n moleを得た。一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ10mg(250n mole)を0.15M食塩を含む0.02Mリン酸緩衝液、pH6.8、1.4mlに溶解させ、SPDP1.17mg(3.75μmole)を含むDMF溶液100μlを混合したのち室温40分間反応させた。反応後、ジチオスレイトール12.4mg(80μmole)を含む0.1M酢酸緩衝液、pH4.5、0.5mlを加え、室温20分反応させたのち、セファデックスG−25カラムで分画を行ない、SH基の導入された酵素6mg(150n mole)を得た。次に、マレイミド基導入エンドセリン-2/VICI 50n moleとSH基導入ペルオキシダーゼ10n moleとを混合し、4℃、16時間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44(LKB−ファルマシア社製)カラムで分画し、ペルオキシダーゼ標識化エンドセリン-2/VICを得た。
免疫原(I)に対するウサギ抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。即ち、抗ウサギIgG抗体(IgG画分、カッペル社製)を20μg/ml含む0.1M炭酸緩衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため1%BSA含有PBSを300μlずつ分注し、少なくとも4℃で24時間処理した。以上のように調製したプレートにバッファーA(0.02Mリン酸緩衝液、1%BSA、pH7.0)で希釈したウサギ抗血清50μl(6羽、No.1a−No.6a)および上述したペルオキシダーゼ標識化エンドセリン-2/VIC(I)(バッファーAで100倍に希釈)50μlを加え4℃で16時間反応させた。反応後PBSでよく洗浄したのち、固相上の酵素活性を測定するため0.2%オルソフェニレンジアミン、0.02%過酸化水素を含む0.1Mクエン酸緩衝液、pH5.5を100μlずつ分注し、室温で10分間反応させた。4規定硫酸100μlを加え、反応の停止させたのち492nmの吸収をプレートリーダー(MTP−32,コロナ社製)で測定し、抗体の活性を判定した。
(i)アフィニティ固相(I)
ポリペプタイドCys His Leu Asp Ile Ile Trpとヒト血清アルブミン(以下HSAと略す)との縮合物をCNBr活性化セファロース4B(ファルマシア社製)に結合させ、アフィニティ固相(I)とした。即ち、上記(2)記載の方法により、HSA20mgと2.1mgのGMBSとを室温60分反応させたのち、セファデックスG−25カラムで分画した。次に、マレイミド基の導入されたHSA5mgを含む該溶出画分1mlと、90%ジメチルスルホキシドを含む水溶液1mlに溶解あるいは分散させたポリペプチドCys His Leu Asp Ile Ile Trp1mgとを4℃で3日間反応させた。反応後、0.5M食塩を含む0.1M炭酸水素ナトリウムに対し透析したのち、CNBr活性化セファロース4B1gと室温3時間反応させた。次ぎに、未反応の活性基を0.1Mトリス−塩酸緩衝液、pH8で処理し、洗浄したのち、1%BSAを含むPBSに分散させ、4℃で保存した。
i)陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
ウサギ抗エンドセリン-2/VIC抗血清を塩析後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラィーで分画することにより、抗エンドセリン-2/VIC抗体をIgG画分にまで精製した。即ち、ウサギ抗エンドセリン-2/VIC抗血清No.1a10mlにPBS10mlを加え、さらに16.5mlの飽和硫安を除々に攪拌しながら加えた(最終45%),30分間放置したのち、12,000×gで20分間遠心し、沈殿をPBS10mlに溶解させた。次に、同様に飽和硫安を最終30%飽和になるように加えたのち遠心した。沈殿を、0.15M食塩を含む0.01Mホウ酸緩衝液、pH8(以下BBSと略す),10mlに溶解させたのち0.01M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液pH8(緩衝液B)に対し、4℃,2日間透析した。次に、あらかじめ緩衝液Bで平衡化したDEAE−セルロースカラム(ワットマン社製,DE−52,20mmφ×100mm)に上記の塩析および透析後の抗体画分を添加した。緩衝液Bでカラムを洗浄したのち、緩衝液B−緩衝液C(0.35M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液,pH8)の連続イオン強度勾配を用いて抗体を溶出した。溶出画分中の抗体価の測定は上記(5)に述べた方法に従った。
免疫原(I)に対するウサギ抗血清から、硫安塩析法により抗体を部分精製した。抗体画分をBBSに透析した後、上記のアフィニティ固相(I)を充填したカラム(10mmφ×40mm)に付した。BBSで十分に洗浄したのち特異抗体を0.5M食塩を含む0.1M酢酸緩衝液、pH4.5で溶出し、さらに0.1M食塩を含む0.05Mグリシン−塩酸緩衝液、pH2.0で溶出した。溶出画分中の抗体価を上記(5)記載のE1A法により測定した結果、pH2で溶出された画分にのみ、強い抗体価が認められ、該画分から特異抗体が得られた。
比較的高い抗体価を示したマウスに対して240μgの免疫原(I)を生理食塩水0.25mlに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫3日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメツシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エツセンシヤルメデイウム(MEM)に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3−×63.Ag8.U1(P3U1)を用いた〔カレント トピツクス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロジー、81、1(1978)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャー、256、495(1975)〕に準じて行なった。即ち、脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ血清を含有しないMEMで3度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5:1になるよう混合して、800回転で15分間遠心を行なって細胞を沈殿させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、45%ポリエチレングリコール(PEG)6000(コッホライト社製)を0.3ml加え、37℃温水槽中で7分間静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分2mlの割合でMEMを添加し、合計12mlのMEMを加えた後600回15分間遠心して上清を除去した。
抗体活性が陽性を示したウェルの各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。即ちハイブリドーマが1.5個/mlになるようにRPMI1640−20FCSに浮遊させ、96穴マイクロプレート(ヌンク社製)に1ウェル当り0.2mlずつ分注した。分注する際、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸腺細胞をウェル当り5×105個になるように加えた。約1週間後には細胞の増殖が認められるようになり、上清中の抗体価をEIA法で調べた。その結果、抗体活性を認めた。これらのクローンおよびその産生するモノクローナル抗体に注目し、以下の実験を実施した。
ミネラルオイル0.5mlを腹腔内投与されたマウス、あるいは未処置マウス(BALB/C)にハイブリドーマAwETN40 1−3×106セル/匹を腹腔内注射したのち、10−30日後に抗体含有腹水を採取した。
前記(10)記載の腹水を上記(7)記載の方法に従って塩析後、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーで分画することにより、モノクローナル抗体を精製した。即ち腹水7mlにPBS7mlを加え、さらに11.5mlの飽和硫安(最終45%)を徐々に攪拌しながら加えた。沈殿をBBSに溶解させ、0.01M食塩を含む0.01Mリン酸緩衝液pH8に透析したのちDEAE−セルロースカラム(20mmφ×100mm)に供した。抗体を0.01M−0.35M食塩濃度勾配により溶出しすることにより、腹水7mlから70mgのモノクローナル抗体を精製標品として得た。
ラット子宮筋より摘出した約2cmのらせん状条片を、混合ガス(95%O2+5%CO2)通気下にクレブス−ヘンゼライト液(以下栄養液と略す)で満たされたマグヌス管内に懸垂した。37℃で3時間放置したのち、腸管平滑筋の収縮により発生する張力をアイソメトリックトランスデューサー(ポリグラフ、NEC三栄社製)により測定した。試料と4℃、3時間反応させたエンドセリン-2/VIC溶液(最終エンドセリン-2/VICI濃度1×10-8M)を添加しても発生する張力は、60mMのKClにより惹起される張力の8%(n=4)であるのに対し、対照として、エンドセリン-2/VIC溶液(最終1×10-8M)を添加した場合には60mMのKClとほぼ同程度の収縮による張力が観測された。
以上のことから、エンドセリン-2/VICの腸管平滑筋収縮活性を中和することが明らかとなった。
1)免疫原(I)に対するポリクローナル抗体を用いるEIA
抗ウサギIgG結合マイクロプレートに、バッファーAで最終20万倍に希釈した免疫原(I)に対するウサギ抗エンドセリン-2/VIC血清(第1図参照)50μl、およびエンドセリン-2/VIC標準液50μl、ポリペプタイドCys His Len Asp Ile Ile Trp標準液50μlあるいはエンドセリン−1(株式会社ペプチド研究所より購入)標準液50μlを加え、4℃で16時間反応させた。そののち、ペルオキシダーゼ標識化エンドセリン-2/VIC(バッファーAで300倍に希釈)50μlを加え、室温で4時間反応させた。反応後、PBSでよく洗浄したのち固相上の酵素活性を上述した方法により測定した。結果を図2Cに示す。
図中、−●−がエンドセリン-2/VICの標準曲線を、−▲−がポリペプタイドCys His Leu Asp Ile Ile Trpの標準曲線を、又−○−がエンドセリン−1の標準曲線を示す。なお縦軸におけるBはエンドセリン-2/VIC、エンドセリン−1等の抗原存在下における固相上の酵素活性を、また、B0は、抗非存在下での固相上の酵素活性を示す。従来の生物活性を指標とする測定法では、エンドセリン−1等、他の血管収縮物質の影響を受けるものと予想されるが、上記の結果は、本発明の抗エンドセリン-2/VIC抗体を用いる免疫測定法においては、エンドセリン−1の影響を受けずエンドセリン-2/VICを特異的に測定し得ることを示している。
以下にエンドセリン-2/VIC測定用サンドイッチ法−EIAについて述べる。
i)酵素標識化抗体の作製
上記(7)ii)記載のアフィニティ精製抗Cys His Leu Asp Ile Ile Trp抗体より石川らの方法〔ジャーナル オブ アプライド バイオケミストリィー(J.Appl.Biochem).,6:56−63(1984)〕に従ってFab′−ペルオキダーゼ標識体を作製した。即ち、0.1M酢酸緩衝液、pH4.5に溶解した特異抗体6.4mgにペプシン(シグマ社、2回結晶)160μgを加え、37℃、16時間反応させたのち、BBSで平衡化したスーパーロース12カラムを用いるFPLC(ファルマシア社製)でF(ab′)2画分を精製した。該画分を0.1M酢酸緩衝液、pH5で透析したのち、最終20mMのβ−メルカプトエチルアミンを加え、37℃で90分放置した。反応液を2.5mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0で平衡化したスーパーロース12カラムを用いるFPLCで分離し、Fab′画分を得た。一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ5mgを0.9mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7に溶解させ、50μlのDMFに溶解させたGMBS1.05mgを加えて室温40分反応させた。反応液をセファデックスG−25カラム(溶離液0.1Mリン酸緩衝液、pH6.8)で分離し、得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ3.5mgと上記Fab′画分0.8mgとを混合し、コロジオンパック(エムエス機器社)で約0.3mlにまで濃縮したのち、4℃で16時間放置した。反応液を溶離液に0.1Mリン酸緩衝液、pH6.5を用いるウルトロゲルAcA44カラム(10mmφ×40mm)に供し、Fab′−ペルオキシダーゼ複合体画分を精製した。
精製したモノクローナル抗体AwETN40aを20μg/mlを含む0.1M炭酸緩衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。ウェルの余剰の結合部位をPBSで4倍希釈したブロックエース(雪印乳業社製、大日本製薬社販売)300μlを加え不活化した。以上のように調製したプレートにバッファーAで希釈したエンドセリン-2/VIC標準液100μlを加え、室温で5時間反応させた。プレートをPBSで洗浄したのち、抗Cys His Leu Asp Ile Ile Trp抗体Fab′−ペルオキシダーゼ標識体(バッファーAで300倍に希釈)100μlを加え、室温で3時間反応させた。プレートをPBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性を上記(5)記載の方法により測定した。結果を第9図に示す。以上の結果から、エンドセリン-2/VICのC端部以外を認識する抗エンドセリン-2/VICモノクローナル抗体を固相に、また、エンドセリン-2/VICのC端部を認識するポリクローナル抗体Fab′を標識体に用いるサンドイッチ法−EIA(比色法)により100pg/ml、50fmole/wellのエンドセリン-2/VICを測定し得ることが明らかになった。
St胃、Du十二指腸、Je空腸、Il回腸 Co結腸、Re直腸
図4中、
(A, C, E) ET-2/VICの分布(ET-2/VIC抗体染色)
(A) 絨毛、 (C) 筋層、(E) 絨毛の断面図
(B, D, F) ET-1の分布(ET-1抗体染色)
(B) 絨毛、(D) 筋層、(F) 絨毛の断面図
(G-O) ET-2/VICはVIPと一部、共局在する:
(G, J, M) ET-2/VIC抗体染色、(H、K、N)VIP抗体染色、(I, L, O)両者の共染色(共局在)
図5中、
(A, C, E) ET-2/VICの分布(ET-2/VIC抗体染色)
(A) 絨毛、 (C) 筋層、(E) 絨毛の断面図
(B, D, F) ET-1の分布(ET-1抗体染色)
(B) 絨毛、(D) 筋層、(F) 絨毛の断面図
(G-O) ET-2/VICはVIPと一部、共局在する:
(G, J, M) ET-2/VIC抗体染色、(H、K、N)VIP抗体染色、(I, L, O)両者の共染色(共局在)
図6中、
(A, C, D) ET-2/VICの分布(ET-2/VIC抗体染色)(B) ET-1の分布(ET-1抗体染色)
(E) M 細胞におけるET-2/VICの局在(青色:ET-2/VIC抗体と赤色:UEA-Iレクチンの二重染色)
図7中、
(A) ET-2/VICの分布(ET-2/VIC抗体染色)、 (B) ET-1の分布(ET-1抗体染色)、(C-F) in situ hybridization:(C)センスプローブ(コントロール)40倍、(D-E)アンチセンスプローブ(mRNAを検出する)、(D)40倍、(E)100倍、(F)200倍
図8中、
(A) ET-2/VICの分布(ET-2/VIC抗体染色)、 (B) ET-1の分布(ET-1抗体染色)、
図9中
(A) 結腸、(B) 回腸、ET-2/VIC抗体染色(緑色)、CD68抗体染色(赤色)
Claims (5)
- キャリアタンパク質を結合せしめた、エンドセリン−2及びエンドセリン−2の部分ペプチド、又はキャリアタンパク質を結合せしめた、VIC及びVICの部分ペプチドを動物に免疫して、免疫細胞を採取し、該免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られる融合細胞の中から、エンドセリン−2及びVICに対して特異的に反応する抗体を産生する細胞を選別し、選別された融合細胞を培養して、請求項1に記載の抗体を得る方法であって、エンドセリン−2の部分ペプチドが、以下a)のアミノ酸配列からなる環状ペプチドであり、VICの部分ペプチドが以下b)のアミノ酸配列からなる環状ペプチドであることを特徴とする、請求項1に記載の抗体の製造方法。
- 請求項1に記載の抗体あるいはこれらの標識化抗体を主成分として含有する、エンドセリン−2及び/又はVICの定量試薬。
- 担体上に請求項1に記載の抗体を結合して不溶化せしめたことを特徴とする、エンドセリン−2及び/又はVICの定量用担体。
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