TWI469992B - 濃縮剪切靈敏生物聚合物的方法 - Google Patents
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Description
此處聲明2008年8月28日申請之美國臨時專利申請案序號第61/190,453號在35 U.S.C. §119(e)下的權益，其揭露係併入作為參考。
本揭露大體而言係關於濃縮如溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)(vWF)的剪切靈敏生物聚合物的方法。
已知的濃縮(和滲濾)生物聚合物方法包括在平板和中空纖維裝置中的切向流(交叉流)超濾(和滲濾)。這些裝置係在夠高的流速和透膜壓力下操作以確保濾液通量能適合成本效益操作。然而，這些操作條件產生了高的剪切率。此外，這些裝置可包括網屏以進一步增加濾液通量。這些網屏也增加了給生物聚合物的剪切應力。當試圖濃縮剪切靈敏生物聚合物時，此剪切應力係特別不希望的，因為這些應力會使諸如蛋白質或病毒顆粒的生物聚合物被破壞、變性、或失去活性。
有各種已知的方法用來減少在平板或切向流(交叉流)中空纖維裝置中濃縮和/或滲濾期間的剪切應力。這些方法包括減少流速、增加膜表面積和增加膜的截斷大小。然而，這些方法每個都有各種問題。例如，減少流速也減少了濾液通量，其會非所欲地增加總操作時間、增加膜積垢的風險以及增加剪切靈敏生物聚合物曝露在剪切應力下的時間。在低流速下增加膜表面積保持高的濾液通量且避免總操作時間的增加。然而，在減少的流速下，膜積垢的風險增加。增加的膜表面積造成更多的產物損失，因為增加的表面積吸附之緣故、也花費更多在增加的膜面積和緩衝液消耗，且在濃縮後可能會有大於產物所欲體積的無效體積。增加膜的截斷大小會因為較大的孔隙大小而產生足夠的濾液通量。然而，增加膜積垢或在與剪切靈敏生物聚合物的相容性問題(即，生物聚合物可能穿透膜且在濾液中損失)仍在。
在許多生物加工操作中會使用清潔劑以避免表面吸附和蛋白質聚集物形成。然而，這些操作需要特定的緩衝添加物以穩定剪切靈敏生物聚合物。
對於切向流中空纖維裝置，建議的剪切率係2000到8000sec-1
，且對於剪切靈敏的進料原料為2000到4000sec-1
。見GE Healthcare，Operating Handbook：Hollow fiber cartridges for membrane separations 8(2004)。然而，剪切靈敏生物聚合物，如例如vWF或病毒顆粒，在剪切率高於2000sec-1
下開始降解、變性、或展開。因此，在此技藝中，需要濃縮剪切靈敏生物聚合物而不給該聚合物高剪切應力的方法。
大體而言，先前技藝並沒有充分教導或建議所屬技術領域中具有通常知識者一種濃縮剪切靈敏生物聚合物而不會實質損失生物聚合物成為蛋白質沈澱、膜積垢和膜表面吸附之具有成本效益的方法。類似地，減少含生物聚合物的混合物流速會從而減少裝置中的剪切應力但無法提供有效的替代，因為需要特定的最小流速以避免膜積垢和沈澱吸附。
本文揭露一種濃縮剪切靈敏生物聚合物的方法，其包括使一含有如vWF之剪切靈敏生物聚合物的混合物流入一中空纖維透析模組中以形成一具有剪切靈敏生物聚合物的滯留物，其中該滯留物的剪切靈敏生物聚合物濃度比在混合物中的高。該方法可進一步包括，在濃縮期間或之後，與含有剪切靈敏生物聚合物之混合物進行緩衝液交換或透析。
中空纖維透析模組的膜較佳係具有少於約200微米的厚度，例如，膜可為約10微米到約100微米厚，且較佳係約30微米厚。在較佳的具體實例中，在中空纖維透析模組中的管壁剪切率係少於約2300sec-1
，且較佳為約50sec-1
到約1800sec-1
。在中空纖維透析模組中的透膜壓力較佳係約1mmHg到約600mmHg(約0.1kPa到約80kPa)，且更佳係約10mmHg到約150mmHg(約1kPa到約20kPa)。
含有剪切靈敏生物聚合物的混合物可視情況含有一溶液緩衝液。假如混合物含有溶液緩衝液，該方法可進一步包括將部分的溶液緩衝液以透析緩衝液取代。
在較佳的具體實例中，滯留物包括至少約70%在混合物中的剪切靈敏生物聚合物，較佳至少約80%在混合物中的剪切靈敏生物聚合物，且更佳至少約90%在混合物中的剪切靈敏生物聚合物。滯留物較佳保有至少約70%在混合物中的剪切靈敏生物聚合物的活性，且更佳保有至少約80%在混合物中剪切靈敏生物聚合物的活性。
所揭露的方法提供一具有成本效益的方法以濃縮剪切靈敏生物聚合物，且同時避免實質的生物聚合物損失於蛋白質沈澱、膜積垢和膜表面黏著。
從檢閱下面詳細說明並連結圖式、實施例以及隨附的申請專利範圍，本發明額外的特徵對於所屬技術領域中熟習技術者而言係顯而易見的。
為了更完整的瞭解本揭露，應參考下面的詳細說明和伴隨的圖式。
雖然揭露之濃縮剪切靈敏生物聚合物的方法容許各種形式的具體實例，在圖式(且將於後面描述)中有說明特定的本發明具體實例，要瞭解的是該揭露僅是作為說明，而不是作為將本發明限制在其中所描述或說明的特定具體實例。
本發明大體而言係關於從含有剪切靈敏生物聚合物的混合物中濃縮該剪切靈敏生物聚合物的方法。已知的濃縮生物聚合物方法會不欲地提供高剪切應力，其會使剪切靈敏生物聚合物被破壞、變性或失去活性。本文揭露的濃縮剪切靈敏生物聚合物方法包括：使一含有剪切靈敏生物聚合物的混合物流入一中空纖維透析模組以形成一具有剪切靈敏生物聚合物的滯留物，其中該滯留物的剪切靈敏生物聚合物濃度比在混合物中的高。揭露的方法確保剪切應力夠低以避免破壞剪切靈敏生物聚合物，且同時維持高的濾液通量。
適合根據揭露的方法濃縮之剪切靈敏生物聚合物包括該些當曝露在嚴重的剪力(即，相當大的速度梯度)下易被損害、破壞、和/或失去活性者。此剪切靈敏生物聚合物的一實例係溫韋伯氏因子(vWF)，其與因子VIII錯合在血漿中循環，且促進生物血液凝固活性的調節。雖然以520-kDa的二聚物為基礎，vWF以一系列具有分子量範圍從約1,000kDa(kilodalton)到約20,000kDa的寡聚體/聚合物形式存在血漿中，但揭露的方法並不必然僅基於此特定的分子量範圍來限制其濃縮剪切靈敏生物聚合物的能力。
具體而言，vWF對於因傳送流體媒介之速度梯度所引發的剪力係敏感的，特別是當vWF通過或靠近過濾膜時(即，該處流動壓縮和在過濾膜孔隙附近的繞行流動路徑造成特別大的速度梯度)。例如，剪切率高於2000sec-1
(秒的倒數)造成vWF從球狀分子變形成延伸的鏈狀分子。此結構的變形增加了黏著過濾表面和其他蛋白質的可能性。大的vWF多聚體係特別容易有此結構變形且增加黏著的可能性。在濃縮期間，增加的黏著減少了產物產率，且大多聚體的損失減少了vWF瑞斯托菌素(Ristocetin)輔因子活性。
中空纖維透析模組具有高濾液通量和低剪切率。這些模組可確保高的產物產率和剪切靈敏生物聚合物的最小損失。中空纖維透析模組係具有中空纖維或管狀膜的裝置，裝置長度的跨距如圖1(不按比例)所示。中空纖維透析模組係已知用於血液透析且係從例如Edwards Lifesciences(Saint-Prex,Switzerland)和Asahi Kasei Chemicals Corp.(Tokyo,Japan)商業上可獲得的。雖然不希望被任何特別的理論約束，但相信的是模組在透析原理下操作，其中壓力梯度並非質量轉移的主要驅動力。取而代之的，濃縮梯度驅動質量的轉移或緩衝液穿過膜的交換。
圖1顯示的係一中空纖維透析模組100，其具有進料流入口102、滯留物流出口104、濾液流出口106、和視情況地，透析緩衝液流入口108。中空纖維透析模組100具有中空纖維110，其跨距模組100與進料流動平行。中空纖維110係被封裝材料112圍繞。視進料體積而定，中空纖維透析模組可單獨使用或以串聯或並聯使用。
在中空纖維透析模組中高的濾液通量係可達到的，因為該中空纖維透析模組的膜係遠比在超濾或切向流之中空纖維裝置中的膜還薄。後者的膜係多於200微米厚，因為這些膜必須禁得起高的透膜壓力、大體積(因為再循環的緣故)以及多用途。那麼厚的膜會減少濾液通量。相反的，中空纖維透析模組的膜係少於約200微米厚，較佳係約10微米至約100微米厚，且更佳係約30微米厚。該薄膜允許較高的濾液通量且因此透膜壓力可比其他模組低。
因為中空纖維透析模組具有高的濾液通量，需要通過中空纖維透析模組的次數比需要通過切向流中空纖維裝置的少。此外，當透析緩衝液的流動以順流或逆流流動時，和其中透析緩衝液直接加至進料流的方法相比，可減少再循環的次數。中空纖維透析模組的效率係遠比需要許多再循環以達到相同濃縮之超濾和切向流中空纖維裝置來的大。與在高剪切率下多次通過相比(如可見於超濾或切向流中空纖維裝置)，在低剪切率下較少次通過中空纖維透析模組能使更多的蛋白質維持其結構。
在中空纖維透析模組中的剪切率較佳係低於約2300sec-1
。可調整或控制含剪切靈敏生物聚合物之混合物的流速以確保剪切率低於某個程度，例如，低於2300sec-1
、低於2000sec-1
或低於1800sec-1
。剪切率係由下面的公式計算：
其中Q係流速(mL/sec)，n係在中空纖維透析模組中的纖維數，且r係纖維內徑(cm)。
見表1在各種流速和模組纖維數下，纖維內徑為0.2毫米的剪切率。
較佳地，在中空纖維透析模組中的透膜壓力係約1mmHg(毫米汞柱)到最大約600mmHg(約0.1kPa(千帕)到約80kPa)，且更佳約10mmHg到約150mmHg(約1kPa到約20kPa)。因為超濾和切向流中空纖維裝置具有厚膜，所以它們可禁得起更高的壓力。這些裝置也要求更高的壓力以確保經濟操作的效能和最小的濾液流。例如，切向流中空纖維裝置的最大透膜壓力在10 o
C係約2600mmHg到3100mmHg(340kPa到415kPa)。在室溫下，最大透膜壓力係約2300mmHg到2600mmHg(310kPa到345kPa)。見GE Healthcare,Operating Handbook:Hollow fiber cartridges for membrane separations 19(2004)。然而，這些壓力和流速很可能破壞剪切靈敏生物聚合物，如vWF。
中空纖維透析模組的膜可由各種能抵抗生物聚合物黏著的材料製造。典型地，非常親水的膜或低蛋白質結合的膜係較佳的。較佳的材料具有低於1g/m2
(每平方公尺克數)的蛋白質吸附。一些適當的材料包括，例如，織維素衍生物(例如，經改質或再生的織維素)和合成的膜(例如，聚碸、聚醚碸、聚二氟亞乙烯、聚丙烯腈、聚醯亞胺、陶瓷和脂肪聚醯胺)。較佳的膜材料包括聚碸、聚醚碸和經改質的織維素。例如，對於聚醚碸，典型的蛋白質吸附係0.5g/m2
，且對於再生的織維素，典型的蛋白質吸附係0.1g/m2
。
中空纖維透析模組可以多種模式操作，包括濃縮，濃縮和滲濾，以及濃縮和透析。繼續參考圖1，在濃縮中，進料流進入入口102、流過中空纖維110以形成滯留物，其從模組100透過出口104出去。來自含有剪切靈敏生物聚合物之混合物的小分子通過中空纖維110的膜進入封裝材料112，且經由出口106從模組100作為濾液被移除。剪切靈敏生物聚合物經過中空纖維110形成滯留物。
含有剪切靈敏生物聚合物的混合物可包括溶液緩衝液。例如，如vWF之剪切靈敏生物聚合物的溶液緩衝液可為在室溫pH為7.4之20mM(毫莫耳)HEPES和150mM NaCl的緩衝液。HEPES或4-(2-羥乙基)-1-哌基乙磺酸係兩性離子有機化學緩衝劑。溶液緩衝液可通過中空纖維110的膜進入封裝材料且以濾液離開中空纖維透析模組。
滯留物將包括剪切靈敏生物聚合物。滯留物可視情況地包括透析緩衝液。例如，如vWF之剪切靈敏生物聚合物的透析緩衝液可為在室溫pH為7.3之20mM檸檬酸鹽和15mM甘胺酸的緩衝液。在滲濾中，可將透析緩衝液在濃縮期間或之後直接加至滯留物中，如圖2所說明。圖2係有透析緩衝液直接加至滯留物之中空纖維透析模組的程序流程圖。若希望有多個中空纖維透析模組的通過，滯留物可視情況地回到進料中，如虛線所示。
在透析中，如圖1所說明，透析緩衝液可在濃縮期間或之後以順流或逆流流經封裝材料112，取代溶液緩衝液。圖3係有導入與進料流逆流之透析緩衝液的中空纖維透析模組的程序流程圖。可藉由交換濾液和透析緩衝液流來達到順流(未顯示)。若需要多個流經中空纖維透析模組的通過，滯留物可視情況回到進料，如虛線所示。
如圖1所說明，透析緩衝液經由入口108進入模組100，且以逆流接觸中空纖維110膜的外表面，且取代部份的溶液緩衝液。在圖1中，具體而言，含有溶液緩衝液和剪切靈敏生物聚合物的進料流經由入口102進入模組100。透析緩衝液經由入口108進入模組，且以逆流流經封裝材料112。在中空纖維110中，部份的溶液緩衝液和部份的透析緩衝液通過膜。溶液緩衝液以濾液移除，且透析緩衝液和剪切靈敏生物聚合物形成滯留物經由出口104離開模組100。或者，可交換透析緩衝液和濾液流以使透析緩衝液和進料流以順流的方式進行(未顯示)。
在平板和切向流中空纖維超濾裝置中，沒有藉由透過膜之緩衝液交換進行透析。取而代之地，在濃縮後，將透析緩衝液加至滯留物且再一次濃縮。執行此動作許多次以達到足夠的緩衝液交換。相對地，中空纖維透析模組可同時在濃縮和透析模式，減少通過模組的次數。
緩衝液較佳係與生物聚合物相容。緩衝液大體而言根據特定生物聚合物的特定要求而改變。例如，對於大部分的治療蛋白質，緩衝液較佳具有在室溫約4到約9的pH。在此pH範圍外的緩衝液可能造成蛋白質的變性。然而，一些蛋白質(例如，胃蛋白酶)在酸環境下作用最好，例如，在約1到約2的pH。此外，緩衝液較佳應不含會破壞生物聚合物的還原或離液化合物。還原劑僅對含有雙硫鍵的蛋白質或胜肽有害。大部份的治療蛋白質含有雙硫鍵且還原劑會破壞這些鍵。還原成分包括，例如，β-巰乙醇、硫醇乙胺、二硫蘇糖醇和參(2-羧基乙基膦)。離液成分包括，例如，尿素、氯化胍、硫氰酸胍和硫氰酸钙。
在濃縮後，滯留物較佳含有至少約在混合物中的70%剪切靈敏生物聚合物，且更佳至少約80%，以及甚至更佳至少約90%之在混合物中的剪切靈敏生物聚合物。在濃縮後，在滯留物中剪切靈敏生物聚合物較佳維持在至少約70%在混合物中的活性，且更佳至少約80%在混合物中的活性。
揭露的方法避免了使用清潔劑以減少表面吸附和聚集物形成，且發展了特定的緩衝液添加物以穩定剪切靈敏生物聚合物。使用清潔劑係有問題的，因為在臨界的濃度之上，它們會形成高分子量微膠粒，其表現像蛋白質且可和剪切靈敏生物聚合物一起被濃縮。因此，最後清潔劑的濃縮會很難控制。
實施例
提供下面的實施例來說明本發明，但不打算用來限制其範疇。實施例1描述四個以具有3000cm2
膜表面積之中空纖維透析模組進行的實驗。實施例2描述兩個以具有7000cm2
膜表面積之中空纖維透析模組進行的實驗。膜表面積係在中空纖維中的內膜表面積乘上在模組中的中空纖維數目。如圖2所說明，這些實驗係以透析緩衝液逆流進行。
實施例1
進行四個以vWF作為剪切靈敏生物聚合物、用中空纖維透析模組的實驗。中空纖維透析模組具有3000cm2
的膜表面積，30微米厚的膜、纖維長度為100毫米，且纖維內直徑為200微米。膜材料係聚醚碸。進料流的濃度為每升0.7克的vWF蛋白質(g vWF/L)、0.56g vWF/L、0.39g vWF/L和0.27g vWF/L。在濃縮後，滯留物的濃度分別為2.52g vWF/L、4.59g vWF/L、2.23g vWF/L和1.26g vWF/L。實驗花費約2到4小時完成。
在進料流中的溶液緩衝液係在室溫pH為7.4之20mM(毫莫耳)HEPES與150mM NaCl的緩衝液。透析緩衝液係在室溫pH為7.3之20mM檸檬酸鹽與15mM甘胺酸的緩衝液。HEPES的濃度從在進料中的大於15mM減少到在滯留物中少於1mM。
實施例2
進行兩個以vWF作為剪切靈敏生物聚合物、用中空纖維透析模組的實驗。中空纖維透析模組具有7000cm2
的膜表面積，30微米厚的膜、纖維長度為100毫米，且纖維內直徑為200微米。膜材料係聚醚碸。實驗係以300ml/mm的進料流速與2L/hr之起始體積減少率和5L/hr的透析率進行。進料流速提供的剪切率係約571sec-1
。進料流的濃度為約0.189vWF/L和約0.22g vWF/L。滯留物的濃度分別為約0.88g vWF/L和約0.95g vWF/L。
在進料流中的溶液緩衝液係在室溫pH為7.4之20mM HEPES與150mM NaCl的緩衝液。透析緩衝液係在室溫pH為7.3之無鹽的20mM檸檬酸鹽與15mM甘胺酸的緩衝液。
圖4係實驗2-1之透膜壓力、過濾前壓力、體積減少率和總濾液體積之數據的圖解表示。
比較實施例
以商業上可從GE Healthcare(Buckinghamshire,United Kingdom)獲得之300kDa的膜在切向流中空纖維裝置上進行九個實驗。切向流中空纖維裝置的內直徑係0.5mm。六個實驗係在有140cm2
膜表面積的切向流中空纖維裝置中進行，且三個實驗以650cm2
的膜表面積進行。濃縮方法包括超濾步驟和滲濾步驟。剪切靈敏進料原料之建議的剪切率為2000到4000sec-1
，然而，這些剪切率對於被測試的剪切靈敏生物聚合物vWF係太高的。因此，實驗在比建議之流速低的流速下進行以減少對生物聚合物的剪切應力。在超濾後，平均vWF蛋白質產率為50.7%，且vWF瑞斯托菌素輔因子產率為59.0%。在最後的步驟滲濾後，平均vWF蛋白質產率為48.3%且vWF瑞斯托菌素輔因子產率為53.8%。
這些產率係遠小於以中空纖維透析模組所達到者。此外，在切向流中空纖維裝置中為了減少減切率而需要之較低流速會增加進行時間至過高的程度。在因低流速造成的低濾液通量無法被補償下，進行時間係無法為經濟上可行的。增加濾液通量的方法，如增加TMP或膜表面積，會造成剪切靈敏生物聚合物損失成為蛋白質沈澱或表面吸附。
前面的實施例論證了有效之濃縮剪切靈敏生物聚合物的方法，其藉由減少剪切應力且維持足夠高的濾液通量來達到高產率。此方法確保含有剪切靈敏生物聚合物之混合物被濃縮而沒有因為結構變形、蛋白質沈澱、膜積垢和/或膜表面吸附之生物聚合物的顯著量損失。
前面的敘述係僅是為了清楚的了解本發明，而應了解不該以其作為限制，在本發明範疇中的變化對於該些在所屬領域中具有通常知識者係明顯的。
100‧‧‧中空纖維透析模組
102‧‧‧進料流入口
104‧‧‧滯留物流出口
106‧‧‧濾液流出口
108‧‧‧透析緩衝液流入口
110‧‧‧中空纖維
112‧‧‧封裝材料
圖1係中空纖維透析模組(不按比例)的截面圖。
圖2係有透析緩衝液直接加至滯留物之中空纖維透析模組的程序流程圖；圖3係有導入與進料流逆流之透析緩衝液透析的中空纖維透析模組的程序流程圖；以及圖4係顯示實施例2-1之方法數據的圖表。
100．．．中空纖維透析模組
102．．．進料流入口
104．．．滯留物流出口
106．．．濾液流出口
108．．．透析緩衝液流入口
110．．．中空纖維
112．．．封裝材料
Claims (13)
- 一種濃縮剪切靈敏生物聚合物的方法，該方法包括：使一包含剪切靈敏生物聚合物和溶液緩衝液的混合物流入一中空纖維透析模組中以形成一滯留物，該滯留物的剪切靈敏生物聚合物濃度比在該混合物中及濾液中的高，其中在該混合物和該濾液之間的透膜壓力係約1mmHg到約150mmHg，其中該中空纖維透析模組的膜厚係少於約200微米，且其中在該中空纖維透析模組中的管壁剪切率係少於約2300sec-1 ，其中存在於該滯留物中的剪切靈敏生物聚合物維持至少約存在該混合物中剪切靈敏生物聚合物活性的70%活性。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該中空纖維透析模組的膜厚係約10微米到約100微米。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該中空纖維透析模組的膜厚係約30微米。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中在該中空纖維透析模組中的管壁剪切率係約50sec-1 到約1800sec-1 。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該中空纖維透析模組的膜包含具有低於每平方公尺1克之蛋白質吸附的材料。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該中空纖維透 析模組的膜包含選自由下列群組所構成之材料：聚碸、聚醚碸、聚二氟亞乙烯、聚醯亞胺、陶瓷、經改質的纖維素、脂肪聚醯胺和聚丙烯腈。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該中空纖維透析模組的膜包含選自由下列群組所構成之材料：聚碸、聚醚碸和經改質的纖維素。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括以一透析緩衝液取代部份的溶液緩衝液。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該滯留物包含至少約70%存在該混合物之剪切靈敏生物聚合物。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該滯留物包含至少約80%存在該混合物之剪切靈敏生物聚合物。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該滯留物包含至少約90%存在該混合物之剪切靈敏生物聚合物。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該剪切靈敏生物聚合物包含溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中存在於該滯留物中的剪切靈敏生物聚合物維持至少約存在該混合物中剪切靈敏生物聚合物活性的80%活性。
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