JP4310675B2 - Nucleotide polymorphism identification method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸配列の変異または多型の同定方法に関する。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, 第８７〜９６頁; Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、(1989)）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
【０００５】
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction)法（特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００６】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、UV照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。
【０００７】
また最近開発された検出方法は、プローブのハイブリッド形成の検出に蛍光強度を直接検出するのではなく、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FＲET)の方法を利用している。蛍光共鳴エネルギー移動は、ドナー蛍光体と消光剤色素(蛍光体でも、蛍光体でなくてもよい。)の間で発生し、一方(消光剤)の吸収スペクトルがもう一方(ドナー)の発光スペクトルとオーバーラップし、この2つの色素が近接したときに発生する。これらの特性を有する色素は、ドナー/消光剤色素対またはエネルギー移動色素対と呼ばれる。ドナー蛍光体の励起状態エネルギーは、共鳴双極子により引き起こされる双極子相互作用により、近くの消光剤に移動される。その結果、ドナー蛍光体の消光が起こる。場合によっては、消光剤も蛍光体の場合、その蛍光強度が増強されることもある。エネルギー移動効率は、ドナーと消光剤の距離に高度に依存しており、これらの関係を予測する式がForster(1948. Ann. Phys.2, 55-75)により開発されている。エネルギー移動効率が50％であるドナーと消光剤色素の距離はForster距離(Ro)と呼ばれる。蛍光消光の機序として他に、例えば、電荷移動消光および衝突消光等がある。
【０００８】
近接する2つの色素の相互作用により消光を引き起こすことに基づくエネルギー移動とその他の機序は、均一方式で実施できるため、ヌクレオチド配列を検出または同定する魅力的な手段である。均一分析方式は、1つの蛍光体標識の蛍光の検出に基づく従来のプローブハイブリッド形成分析法よりも簡単である。なぜならば、一般に、不均一分析はハイブリッド形成していない遊離標識からハイブリッド形成した標識を分離する更なるステップを必要とするからである。
【０００９】
典型的には、FＲETおよび関連方法は、2つの相補的オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成により結合された時に、一方または両方の色素標識の蛍光特性の変化を監視することに基づくものである。この方式において、蛍光特性の変化は、エネルギー移動量の変化として、あるいは蛍光消光量の変化として測定され、典型的には、一方の色素の蛍光強度の増加として示される。この方法においては、ハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを分離せずに、目的のヌクレオチド配列を検出することが可能である。一方はドナー蛍光体で、もう一方は消光剤で標識された2つの別々の相補的オリゴヌクレオチドの間でハイブリッド形成を生じることができる。この時一方のオリゴヌクレオチドを塩基多型特異的配列を有する場合多型特異的にＦＲＥＴシグナルが得られることで塩基多型の同定が可能となる。
【００１０】
FＲETハイブリッド形成分析法に関する幾つかの方式が、Nonisotopic DNA Probe Techniques(1992. Academic Press, Inc., pags. 311-352)に概説されている。あるいは、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成していない場合と、相補的配列とハイブリッド形成した場合とで、一方または両方の蛍光特性に検出可能な差が生じるように、ドナーと消光剤を1つのオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
【００１１】
この方式においては、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成するとドナー蛍光は増加し、エネルギー移動/消光は減少する。例えば、両端に標識された自己相補的オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成すると、これによって2つの蛍光体(即ち、5'末端と3'末端)が近接し、エネルギー移動と消光が起こる。自己相補的オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの中の相補的配列がハイブリッド形成すると、ヘアピン構造は破壊され、2つの色素間距離が拡大するため消光は減少する。ヘアピン構造の欠点は、安定性が非常に高く、非消光ハイブリッド形成型への変換がしばしば遅く、僅かにそちらに偏るだけで、一般的に性能は低い。
【００１２】
TyagiおよびKramer(1996.Nature Biotech.14, 303-308)は、ステムを形成するヘアピン構造の自己相補的アームの間のループ中に検出配列を含む上記の様に標識されたヘアピン構造を報告している。塩基対合したステムは、検出配列が標的とハイブリッド形成し、消光の減少を引き起こすためには融解しなくてはならない。「二重ヘアピン」プローブとそれを利用する方法が、B. Bagwell, et al. (1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425;米国特許No.5,607,834)に報告されている。これらの構造はヘアピン構造内に標的結合配列を含んでおり、従って、標的とヘアピン構造の自己相補的配列との間に競合的ハイブリッド形成が関与している。Bagwellは、ミスマッチによりヘアピン構造を不安定化させることにより、不利なハイブリッド形成速度論の問題を解決している。
【００１３】
標的結合配列に塩基多型特異的配列を選択することでこの方法を用いて塩基多型の同定が可能であるが、一般的に１塩基の違いをオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション法により見分けるためには厳密なハイブリダイゼーション条件の設定が必要となる。
【００１４】
核酸増幅を検出するためにエネルギー移動またはその他の蛍光消光の機序を利用する均一方法も報告されている。L. G. Lee, et al. (1993. Nuc. Acids Res.21, 3761-3766)は、PCR中に標的増幅に特異的に二重標識検出プローブが切断されるリアルタイム検出方法を開示している。検出プローブが増幅プライマーの下流でハイブリッド形成されると、Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が検出プローブを消化し、エネルギー移動対を形成する2つの蛍光色素を分離する。
この方法においても二重標識検出プローブを塩基多型特異的プローブとすることで塩基多型の同定が可能である。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、従来の方法では操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難であり、その為に野生型シグナルと多型シグナルの比をとると言った解析が困難となり、正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。
【００１６】
たとえば電気泳動法によれば野生型及び多型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。
【００１７】
またＦＲＥＴを用いた方法は均一分析が可能であり過剰なプローブの除去等が不必要で検出が容易になっているが、各多型特異的に、異なる標識を付与した２本のオリゴヌクレオチドプローブが必要であったり、２重標識プローブが必要である。
【００１８】
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、核酸特異標識を作用させて、該標識と核酸特異標識との相互作用を測定することで、煩雑な検出操作や高価な標識プローブを多数必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確な多型同定が可能となる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］ 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、核酸特異標識を作用させて、該標識と核酸特異標識との相互作用により塩基多型を同定する方法。
［２］ 核酸特異標識が２本鎖核酸特異的であることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］ 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする［１］及び［２］に記載の方法。
［４］ オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする［１］〜［３］に記載の方法。
［５］ 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする［１］〜［４］に記載の方法。
［６］ 少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする［１］〜［５］記載の方法。
［７］ 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドをプライマーとして同時に又は別々に作用させ、多型特異的に伸長反応を行った後、伸長生成物に核酸特異的標識を作用させ、該オリゴヌクレオチドの標識と該核酸特異的標識の相互作用により、塩基多型を同定する方法。
［８］ 核酸特異標識が２本鎖核酸特異的であることを特徴とする［７］に記載の方法。
［９］ 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする［７］及び８に記載の方法。
［１０］ オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする［７］〜［９］に記載の方法。
［１１］相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする［７］〜［１０］に記載の方法。
［１２］試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする［７］〜［１１］に記載の方法。
［１３］少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする［７］〜［１２］記載の方法。
［１４］ 試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定する方法において、以下の工程、
１）少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドをプライマーとして作用させ、伸長反応を行う。
２）伸長生成物を変性させ１本鎖にした後、伸長生成物に相補的なオリゴヌクレオチドを作用させ、伸長反応を行い２本鎖核酸を生成させる。
３）２本鎖核酸特異的蛍光色素を作用させ、該蛍光色素とオリゴヌクレオチドの標識との相互作用及び核酸特異標識の蛍光信号を測定する。
を含むことを特徴とする方法。
［１５］ 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１６］ 試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする［１４］〜［１５］に記載の方法。
［１７］ 工程１及び２を繰り返して、増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする［１４］〜［１６］記載の方法。
［１８］ 少なくとも一つが蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、核酸特異標識を含む試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定するキット。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ(Angiotensin I
Converting Enzyme)遺伝子が挙げられる。
【００２２】
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法である。
【００２３】
本発明において、野生型オリゴヌクレオチドと変異型オリゴヌクレオチドを作用させる反応とは一般的に、一本鎖に変性した標的核酸にオリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される反応を含む。
【００２４】
本発明において、野生型用オリゴヌクレオチドとは、通常の表現型を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、変異型用オリゴヌクレオチドとは、野生型とは異なる配列を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
本発明に用いられる上記オリゴヌクレオチドは、野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端から２番目のヌクレオチドが変異型配列のヌクレオチドと対応するように設計された。このように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは少なくとも３' 末端もしくは３’末端から２番目の配列までは一致する為伸長反応は起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいてはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長反応が起こらない。
【００２６】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩基であり、上記ミスマッチ部位は、該オリゴヌクレオチド中に少なくとも１つ存在する。また、その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。
【００２７】
３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
【００２８】
本発明においては、上記野生型用オリゴヌクレオチドと１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
【００２９】
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００３０】
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、１９８９)に記載の方法に従って行うことができる。また、該オリゴヌクレオチドが伸長されたか否かによって塩基多型を検出する方法において、標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、増幅しておくことも可能である。
【００３１】
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。
【００３２】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。
【００３３】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ⁿ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００３４】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型核酸を増幅できる変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個又は同時にに用いて遺伝子増幅法を行う。
【００３５】
野生型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変異型用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００３６】
本発明においては、標識オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーション法にも利用できる。すなわち、標的核酸に対し、多型特異的及び野生型特異的オリゴヌクレオチドを用意して、各オリゴヌクレオチドを同時及びまたは別々に作用させて、各オリゴヌクレオチドの標識と核酸特異的標識との相互作用を検出することで、塩基多型の同定が可能である。更には上記多型特異オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションを行う外側の配列をプライマーとして用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行いながらもしくはその後に上記多型特異プローブを作用させることで塩基多型の同定が可能である。
【００３７】
本発明において、オリゴヌクレオチドの標識は核酸特異標識と相互作用を起こす標識であれば何でもよく、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン等があるがこの限りではない。
【００３８】
本発明において核酸特異標識物質は標識オリゴヌクレオチドが反応行った核酸に特異的に結合し、該オリゴヌクレオチドの標識と相互作用すれば何でもよく、好ましくは２本鎖核酸に特異的な標識が好ましい。２本鎖特異標識としては２本鎖にインターカーレートするサイバーグリーンＩ、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等があるがこの限りではない。
【００３９】
酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。 蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
放射性物質としては、³²Ｐ、³⁵Ｓなどが挙げられる。 発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
【００４０】
該標識は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５' 部位である。
野生型用オリゴヌクレオチドと変異型用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、１回で検出が可能である。
【００４１】
キット
本発明において、キットとしては、野生型用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型用オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む塩基多型検出用試薬キットを含むものである。
増幅によって検出する場合には、更に、リバースオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１ β3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型 (Trp64Arg)の検出
（１）β 3 adrenergic receptor 遺伝子の 190 番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜3に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜3と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。
オリゴ１は3'末端から2番目に野生型(T)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ2は3'末端から2番目に変異型(C)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチ(C→A)を有し、オリゴ３がアンチセンス鎖であり、オリゴ１、2と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、オリゴ1、2、3は必要により標識して使用される。
【００４４】
（２） PCR 法によるβ 3 adrenergic receptor 遺伝子多型の解析
▲１▼ PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトβ3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型 (Trp64Arg)を解析した。
【００４５】
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ１および／または２
(オリゴ1は5'をTexas Redにより標識、オリゴ2は未標識) 5 pmol
オリゴ3 (未標識) 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl₂ 1.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 100 ng
【００４６】
増幅条件
95℃・5分
95℃・30秒、62.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
▲２▼ FRETによる検出
▲１▼の増幅反応液5μlを Syber GreenI(Molecular probes社)の溶液100μlに加えて、室温にて10分間反応させた。これによって、増幅されたヒトβ3 adrenergic receptor 遺伝子断片中にSyber Green Iが取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。
所要時間は数分であった。
【００４７】
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
［式１］ FL１（試料の蛍光強度）＝FLb1-FLs1
FLｂ1：Negative Control （試料が未添加）の励起波長:355/蛍光波長612における蛍光強度
FLｓ1：各試料の励起波長:355/蛍光波長612における蛍光強度
［式２］ FL２（試料の蛍光強度）＝FLb2-FLs2
FLｂ2：Negative Control （試料が未添加）の励起波長:355/蛍光波長538における蛍光強度
FLｓ2：各試料の励起波長:355/蛍光波長538における蛍光強度
【００４８】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、試料核酸中の塩基多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られた。
【００４９】
【配列表】

【００５０】

【００５１】

【図面の簡単な説明】
【図１】β3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型の検出における各試料の蛍光強度[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for identifying a mutation or polymorphism in a nucleic acid sequence. The present invention is particularly useful for diagnosis of genetic diseases, nucleotide polymorphism analysis, and the like.
[0002]
[Prior art]
In the present invention, the nucleotide polymorphism means having a nucleotide sequence different from the wild type. The nucleotide polymorphism of a gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism, and is also known as a cause of individual differences such as basic metabolism known as constitution. In addition, they also serve as genetic markers for a number of diseases. Therefore, elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical research (Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, pp. 87-96; Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-554 (1989)). In addition, a nucleic acid sequence analysis method for detecting each genotype following identification of the causative mutant gene is desired.
[0003]
As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences, but requires a great deal of effort to prepare template nucleic acids, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, analysis of nucleic acid sequences, etc. And time is needed. Further, labor can be saved by using a recent automatic sequencer, but there is a problem that an expensive apparatus is required.
[0004]
On the other hand, there are various known genetic diseases caused by point mutations in genes, and some of them know which part of the gene and how point mutations cause genetic diseases. Not a few.
[0005]
As a method for detecting such an expected point mutation, a gene amplification method such as a PCR (polymerase chain reaction) method (Japanese Patent Publication No. 4-67960 and Japanese Patent Publication No. 4-67957) has been conventionally used. Methods for detecting point mutations in genes are known. In this method, as one of the pair of oligonucleotides used in the gene amplification method, a wild-type oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the wild-type gene amplification region and the mutant-type gene amplification A mutant oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the region is used. The mutated oligonucleotide has a nucleotide that is complementary to the predicted point mutation at the 3 'end. Such wild-type and mutant-type oligonucleotides are separately used to subject the sample gene to the gene amplification method.
[0006]
If the sample gene is wild-type, nucleic acid amplification occurs when a wild-type oligonucleotide is used, but if a mutant-type oligonucleotide is used, the 3 ′ end of the oligonucleotide corresponds to the sample gene. Since it is not complementary to the nucleotide (mismatch), no extension reaction occurs, and no nucleic acid amplification occurs. On the other hand, if the sample gene is a mutant type, conversely, amplification does not occur when the wild-type oligonucleotide is used, and amplification occurs when the mutant-type oligonucleotide is used. Therefore, by examining whether amplification occurs when using each oligonucleotide, it is possible to determine whether the sample gene is a wild type or a mutant type, thereby identifying a point mutation in the sample gene. Can do. As a method to check whether amplification occurred at this time, after amplifying the amplified product with agarose gel, staining with a nucleic acid-specific binding fluorescent reagent such as ethidium bromide, and then irradiating with UV, the presence of amplified nucleic acid is detected. it can. Other methods include Southern blotting, in which amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected using a labeled probe, sandwich hybridization in which detection probe is acted on after capturing with a supplementary probe immobilized on an individual carrier. Laws have been developed.
[0007]
In addition, recently developed detection methods do not directly detect fluorescence intensity for detection of probe hybridization, but use a fluorescence resonance energy transfer (FRET) method. Fluorescence resonance energy transfer occurs between the donor phosphor and the quencher dye (either phosphor or not), the absorption spectrum of one (quencher) being the emission spectrum of the other (donor) Occurs when the two dyes come close to each other. Dyes with these properties are called donor / quencher dye pairs or energy transfer dye pairs. The excited state energy of the donor phosphor is transferred to a nearby quencher due to the dipole interaction caused by the resonant dipole. As a result, quenching of the donor phosphor occurs. In some cases, when the quencher is also a phosphor, the fluorescence intensity may be enhanced. Energy transfer efficiency is highly dependent on the distance between the donor and the quencher, and Forster (1948. Ann. Phys. 2, 55-75) has developed a formula to predict these relationships. The distance between the donor and the quencher dye with an energy transfer efficiency of 50% is called the Forster distance (Ro). Other mechanisms for fluorescence quenching include, for example, charge transfer quenching and collisional quenching.
[0008]
Energy transfer and other mechanisms, which are based on causing quenching by the interaction of two adjacent dyes, can be performed in a uniform manner and are therefore attractive means of detecting or identifying nucleotide sequences. The homogeneous analysis method is simpler than the conventional probe hybridization analysis method based on the detection of the fluorescence of one phosphor label. This is because, generally, heterogeneous analysis requires a further step of separating the hybridized label from the unhybridized free label.
[0009]
Typically, FRET and related methods are based on monitoring changes in the fluorescence properties of one or both dye labels when two complementary oligonucleotides are combined by hybridization. In this method, the change in the fluorescence characteristics is measured as a change in the amount of energy transfer or a change in the fluorescence extinction amount, and is typically indicated as an increase in the fluorescence intensity of one of the dyes. In this method, it is possible to detect the target nucleotide sequence without separating the hybridized oligonucleotide from the non-hybridized oligonucleotide. Hybridization can occur between two separate complementary oligonucleotides, one with a donor fluorophore and the other with a quencher. At this time, when one oligonucleotide has a base polymorphism-specific sequence, the base polymorphism can be identified by obtaining a FRET signal specifically for the polymorphism.
[0010]
Several schemes for FRET hybridization analysis are outlined in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992. Academic Press, Inc., pags. 311-352). Alternatively, the donor and quencher can be combined into one oligonucleotide so that there is a detectable difference in one or both fluorescent properties when the oligonucleotide is not hybridized and when it is hybridized to a complementary sequence. Can be combined.
[0011]
In this manner, typically the donor fluorescence increases and the energy transfer / quenching decreases when the oligonucleotides are hybridized. For example, when self-complementary oligonucleotides labeled at both ends form a hairpin structure, this brings two phosphors in close proximity (ie, 5 ′ end and 3 ′ end), causing energy transfer and quenching. When the complementary sequences in the self-complementary oligonucleotide and the second oligonucleotide hybridize, the hairpin structure is destroyed and quenching is reduced due to the increased distance between the two dyes. The disadvantages of the hairpin structure are very stable, the conversion to the non-quenching hybrid form is often slow, and only slightly biased there is generally poor performance.
[0012]
Tyagi and Kramer (1996.Nature Biotech. 14, 303-308) report a hairpin structure labeled as described above that contains a detection sequence in the loop between the self-complementary arms of the hairpin structure that form the stem. ing. The base paired stem must melt in order for the detection sequence to hybridize with the target and cause a decrease in quenching. A “double hairpin” probe and methods utilizing it are reported in B. Bagwell, et al. (1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425; US Pat. No. 5,607,834). These structures contain a target binding sequence within the hairpin structure, and thus competitive hybridization is involved between the target and the self-complementary sequence of the hairpin structure. Bagwell solves the disadvantageous hybridization kinetics problem by destabilizing the hairpin structure by mismatch.
[0013]
By selecting a nucleotide polymorphism-specific sequence as the target binding sequence, it is possible to identify nucleotide polymorphisms using this method. Generally, in order to distinguish a single nucleotide difference by oligonucleotide hybridization methods, Strict hybridization conditions must be set.
[0014]
Uniform methods that utilize energy transfer or other fluorescence quenching mechanisms to detect nucleic acid amplification have also been reported. LG Lee, et al. (1993. Nuc. Acids Res. 21, 3761-3766) discloses a real-time detection method in which a dual-labeled detection probe is cleaved specifically for target amplification during PCR. When the detection probe is hybridized downstream of the amplification primer, the 5′-3 ′ exonuclease activity of Taq polymerase digests the detection probe and separates the two fluorescent dyes that form an energy transfer pair.
Also in this method, the base polymorphism can be identified by using the double-labeled detection probe as a base polymorphism-specific probe.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
Although it seems that the amplified nucleic acid can be detected by the method as described above and the polymorphism can be easily identified, in practice, the conventional method is complicated and it is difficult to quantify the detected value. For this reason, it was difficult to analyze the ratio of the wild type signal to the polymorphic signal, and much work was required to identify the correct polymorphism.
[0016]
For example, according to the electrophoresis method, it is necessary to separately detect the wild type and the polymorphism, and it is difficult to accurately quantify the amount of nucleic acid from the electrophoretic image. Further, Southern blotting and sandwich hybridization require a hybridization reaction with a probe, and the conditions must be strictly adjusted. Furthermore, a process for removing excess probes is required, and the operation is very complicated.
[0017]
In addition, the method using FRET is capable of homogeneous analysis and does not require the removal of excess probes and is easy to detect. However, two oligonucleotide probes with different labels specific to each polymorphism. Or a double-labeled probe is required.
[0018]
An object of the present invention is to provide a method and a reagent therefor that can solve the above-described problems and detect a polymorphism in a nucleic acid sequence clearly and reproducibly.
[0019]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above circumstances, the present inventors, as a result of intensive studies, have compared with the conventional methods described above, a wild-type oligonucleotide in which at least one is labeled on a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphism site and 1 After reacting species or two types of mutant oligonucleotides simultaneously or separately, a nucleic acid-specific label is allowed to act, and the interaction between the label and the nucleic acid-specific label is measured. Thus, the present invention has been completed by finding a method that does not require a large number of such labeled probes and that easily obtains quantified data and thus enables clear polymorphism identification.
[0020]
That is, the present invention has the following configuration.
[1] A nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample is reacted simultaneously or separately with a wild-type oligonucleotide labeled with at least one and one or two mutant oligonucleotides. Then, a nucleic acid specific label is allowed to act, and a base polymorphism is identified by the interaction between the label and the nucleic acid specific label.
[2] The method according to [1], wherein the nucleic acid-specific label is specific to a double-stranded nucleic acid.
[3] The method according to [1] and [2], wherein the nucleic acid-specific label is a fluorescent dye.
[4] The method according to [1] to [3], wherein the oligonucleotide is labeled with a fluorescent dye.
[5] The method according to [1] to [4], wherein the interaction is fluorescence resonance energy transfer.
[6] Performing polymorphism-specific amplification reaction using at least one labeled wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides, and measuring during and / or after the amplification reaction The method according to [1] to [5], which is characterized.
[7] Nucleic acid sequences containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample are used simultaneously or separately by using at least one labeled wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides as primers. After a polymorphism-specific extension reaction, a nucleic acid-specific label is allowed to act on the extension product, and the nucleotide polymorphism is identified by the interaction between the oligonucleotide label and the nucleic acid-specific label. Method.
[8] The method according to [7], wherein the nucleic acid-specific label is specific to a double-stranded nucleic acid.
[9] The method according to [7] and 8, wherein the nucleic acid-specific label is a fluorescent dye.
[10] The method according to [7] to [9], wherein the oligonucleotide is labeled with a fluorescent dye.
[11] The method according to [7] to [10], wherein the interaction is fluorescence resonance energy transfer.
[12] The method according to [7] to [11], wherein a specific nucleic acid sequence contained in the sample is amplified in advance.
[13] Performing polymorphism-specific amplification reaction using at least one labeled wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides, and measuring during and / or after the amplification reaction The method according to [7] to [12], which is characterized.
[14] In a method for identifying a base polymorphism present in a specific nucleic acid sequence contained in a sample, the following steps:
1) An extension reaction is performed by using at least one fluorescently labeled wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides as primers.
2) The extension product is denatured into a single strand, and then an oligonucleotide complementary to the extension product is allowed to act on the extension product to generate a double-stranded nucleic acid.
3) A double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye is allowed to act, and the interaction between the fluorescent dye and the oligonucleotide label and the fluorescence signal of the nucleic acid-specific label are measured.
A method comprising the steps of:
[15] The method according to [14], wherein the interaction is fluorescence resonance energy transfer.
[16] The method according to [14] to [15], wherein a specific nucleic acid sequence contained in the sample is amplified in advance.
[17] The method according to [14] to [16], wherein steps 1 and 2 are repeated to carry out an amplification reaction, and measurement is performed during and / or after the amplification reaction.
[18] Nucleotide polymorphisms present in a specific nucleic acid sequence contained in a sample containing at least one fluorescently labeled wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides, a polymerase, and a nucleic acid-specific label Kit to identify.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The chromosome or fragment thereof containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample is not particularly limited as long as it is a target nucleic acid including a nucleotide polymorphic site that bears information on the target gene. Examples of the target nucleic acid include Alu sequences, exons of genes encoding proteins, introns, promoters, and the like. More specifically, genes related to various diseases including genetic diseases, drug metabolism, lifestyle-related diseases (hypertension, diabetes, etc.) can be mentioned. For example, ACE (Angiotensin I
Converting Enzyme) gene.
[0022]
In the present invention, the nucleic acid sequence may be simply referred to as a nucleic acid. Mutant nucleic acids are those in which at least one of wild-type nucleic acids, preferably one nucleotide is point-mutated and replaced with other nucleotides, or inserted or deleted sequences in a part of wild-type nucleic acid, etc. It has been elucidated which part of the nucleotide is mutated. It has been elucidated that the constitution is different depending on such base polymorphism, and the method of the present invention is a method for examining whether or not the nucleic acid in a sample has such an expected mutation. is there.
[0023]
In the present invention, the reaction of reacting a wild-type oligonucleotide and a mutant-type oligonucleotide generally comprises an oligonucleotide, four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTP) and a DNA polymerase on a target nucleic acid denatured into a single strand. This includes a reaction in which an oligonucleotide extension reaction using the target nucleic acid as a template occurs to synthesize a complementary strand of the nucleic acid sequence.
[0024]
In the present invention, the wild-type oligonucleotide is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome containing a base polymorphism site having a normal phenotype or a fragment thereof, Is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome containing a nucleotide polymorphism site having a sequence different from the wild type or a fragment thereof.
[0025]
The oligonucleotide used in the present invention was designed so that the second nucleotide from the 3 ′ end or the 3 ′ end of the wild-type and mutant oligonucleotides corresponds to the nucleotide of the mutant sequence. When designed in this way, in the combination of wild-type oligonucleotide / wild-type nucleic acid and mutant-type oligonucleotide / mutated nucleic acid, each oligonucleotide matches at least from the 3 ′ end or from the 3 ′ end to the second sequence. Therefore, an elongation reaction occurs. On the other hand, in the combination of the wild type oligonucleotide / mutant nucleic acid and the mutant type oligonucleotide / wild type nucleic acid, there is an artificial mismatch between the 3 ′ end of the oligonucleotide or the second base from the 3 ′ end, and another base. There is no extension reaction.
[0026]
The length of the oligonucleotide in the present invention is 13 to 35 bases, preferably 16 to 30 bases, and at least one mismatch site is present in the oligonucleotide. Further, the position is not particularly limited as long as it is from the 3rd to the 5 'end of the 3' end, but is preferably a position close to the 3rd end of the 3 'end, more preferably from the 3' end. The third is preferred.
[0027]
Third, when an artificial mismatch is used, when a nucleic acid sequence that does not expect an extension reaction is used as a template, a mismatch of two bases is combined with the nucleotide polymorphism site, and the extension reaction is strongly inhibited.
[0028]
In the present invention, the wild-type oligonucleotide and one or two kinds of mutant-type oligonucleotides are allowed to act on a sample separately or simultaneously.
[0029]
In the present invention, the oligonucleotide extension method can basically be performed using a conventional method. Usually, a chromosome containing a specific nucleotide polymorphism site denatured into a single strand or a fragment thereof, together with four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) and a DNA polymerase, a wild-type oligonucleotide and one or two The oligonucleotides are extended using the target nucleic acid as a template by acting the oligonucleotides for mutations of the species simultaneously or separately.
[0030]
The extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989). Further, in the method for detecting a base polymorphism depending on whether or not the oligonucleotide is extended, if the target nucleic acid does not contain a sufficient amount for detection, a nucleic acid fragment containing the polymorphic sequence in advance is It can also be amplified by the amplification reaction shown.
[0031]
In the present invention, a method for amplifying a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and usually a specific nucleotide polymorphism denatured into a single strand. In addition to 4 types of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase and reverse primer, a wild type oligonucleotide and one or two types of mutant oligonucleotides (forward primer) By using the target nucleic acid as a template, and amplification is performed between the forward oligonucleotide and the reverse oligonucleotide.
[0032]
Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature, Vol. 350, page 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research Vol. 20, 1691 (1992)), RCR (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin. Microbiol. Vol. 31, Vol. 31) 3270 (1993)).
[0033]
In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase, and thereby the above paired pair. In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the oligonucleotides is exponentially amplified. That is, the sample nucleic acid is denatured in the denaturation step, each oligonucleotide is hybridized with a region on the complementary single-stranded sample nucleic acid in the subsequent annealing step, and each oligonucleotide is the starting point in the subsequent extension step. As described above, a DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of DNA polymerase to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotides is theoretically amplified 2 ⁿ times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .
[0034]
In the method using the nucleic acid amplification method as described above, the gene amplification method is performed using the wild-type oligonucleotide capable of amplifying the wild-type nucleic acid and the mutant-type oligonucleotide capable of amplifying the mutant nucleic acid separately or simultaneously. .
[0035]
When a sample nucleic acid is extended or amplified using a wild-type oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is wild-type, but no reaction occurs in the mutant type. Conversely, when a sample nucleic acid is extended or amplified using a mutant oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is a mutant type, but does not occur if the sample nucleic acid is a wild type. Therefore, one sample is divided into two, one is reacted with a wild-type oligonucleotide and the other is reacted with a mutant-type oligonucleotide to determine whether the reaction has occurred. It is possible to clearly know whether the sample nucleic acid is a wild type or a mutant type. In particular, humans and other higher organisms have one gene each derived from the father and one from the mother for each type of gene. According to this method, the sample gene is a wild-type homologue. It is also possible to distinguish between mutant homozygous or both heterozygous. That is, in the case of heterogeneity, both the wild type gene and the mutant gene exist, so that the reaction occurs both when the wild type oligonucleotide is used and when the mutant type oligonucleotide is used.
[0036]
In this invention, it can utilize also for the hybridization method which uses a labeled oligonucleotide. In other words, polymorphism-specific and wild-type specific oligonucleotides are prepared for the target nucleic acid, and each oligonucleotide is allowed to act simultaneously or separately to interact with each oligonucleotide label and the nucleic acid-specific label. It is possible to identify nucleotide polymorphisms by detecting. Furthermore, nucleotide polymorphisms can be identified by using the polymorphism-specific probe during or after a nucleic acid amplification reaction such as PCR using the outer sequence that hybridizes with the polymorphism-specific oligonucleotide as a primer. It is.
[0037]
In the present invention, the oligonucleotide label may be any label that interacts with a nucleic acid-specific label, such as FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, rhodamine, etc. is not.
[0038]
In the present invention, the nucleic acid-specific labeling substance is not particularly limited as long as it specifically binds to the nucleic acid reacted with the labeled oligonucleotide and interacts with the label of the oligonucleotide, and preferably a label specific to a double-stranded nucleic acid. Examples of the double-stranded specific label include, but are not limited to, Cyber Green I, ethidium bromide, acridine orange, thiazole orange, oxazole yellow, rhodamine and the like that intercalate into double strands.
[0039]
Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase. Examples of the fluorescent material include FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, and Cy5.
Examples of haptens include biotin and digoxigenin.
Examples of radioactive substances include ³² P and ³⁵ S. Examples of the luminophore include ruthenium.
[0040]
The label may be attached to any position of the oligonucleotide as long as it does not affect the hybridization and extension reaction of the oligonucleotide. A 5 ′ site is preferred.
When different labels are used for the wild-type oligonucleotide and the mutant-type oligonucleotide, detection can be performed once.
[0041]
Kit In the present invention, the kit includes a nucleotide polymorphism including a wild-type oligonucleotide and one or two mutant oligonucleotides, a DNA polymerase, and four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs). A detection reagent kit is included.
When detecting by amplification, a reverse oligonucleotide may be further contained.
Each oligonucleotide may be labeled in advance with an enzyme, biotin, fluorescent substance, hapten, antigen, antibody, radioactive substance, luminophore or the like as described above.
[0042]
【Example】
Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0043]
Example 1 Detection of nucleotide polymorphism (Trp64Arg) of β3 adrenergic receptor gene
(1) Synthesis of an oligonucleotide that detects the 190th polymorphism of the β 3 adrenergic receptor gene. Were synthesized (hereinafter referred to as oligos 1 to 3). The synthesis was carried out according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out overnight with ammonia water at 55 ° C. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, we commissioned DNA synthesis contractors (Nippon Bioservice Co., Ltd., Sawaddy Co., Ltd., GENSET KK, Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.).
Oligo 1 has a wild-type (T) nucleotide sequence second from the 3 ′ end, and an artificial mismatch (C → A) third, and oligo 2 is the second variant from the 3 ′ end (C). The oligo sequence is an antisense strand, and is used as an oligonucleotide for amplification reaction in combination with oligo 1 and 2. Oligos 1, 2, and 3 are used after being labeled if necessary.
[0044]
(2) Analysis of β 3 adrenergic receptor gene polymorphism by PCR method (1) Amplification reaction by PCR method Using a DNA solution extracted from human leukocytes by phenol / chloroform method as a sample, adding the following reagents, The nucleotide polymorphism (Trp64Arg) of human β3 adrenergic receptor gene was analyzed according to conditions.
[0045]
Reagents A 25 [mu] l solution containing the following reagents was prepared.
Taq DNA polymerase reaction oligo 1 and / or 2
(Oligo 1 labeled 5 'with Texas Red, oligo 2 unlabeled) 5 pmol
Oligo 3 (unlabeled) 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl ₂ 1.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 100 ng
[0046]
Amplification conditions
95 ℃, 5 minutes
95 ℃, 30 seconds, 62.5 ℃, 30 seconds, 72 ℃, 30 seconds (35 cycles)
72 ℃ for 2 minutes.
(2) Detection by FRET 5 μl of the amplification reaction solution from (1) was added to 100 μl of Syber Green I (Molecular probes) solution and reacted at room temperature for 10 minutes. As a result, Syber Green I is incorporated into the amplified human β3 adrenergic receptor gene fragment.
Next, the amount of fluorescence intensity was measured with a fluorescent plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) in a dark room.
The time required was several minutes.
[0047]
From the obtained fluorescence intensity, the amount of fluorescence intensity of the sample was calculated using the following calculation formula.
[Formula 1] FL1 (fluorescence intensity of sample) = FLb1-FLs1
FLb1: Negative Control (sample not added) excitation wavelength: 355 / fluorescence intensity at fluorescence wavelength 612
FLs1: Excitation wavelength of each sample: 355 / fluorescence intensity at fluorescence wavelength 612 [Formula 2] FL2 (fluorescence intensity of sample) = FLb2-FLs2
FLb2: Negative Control (sample not added) excitation wavelength: 355 / fluorescence intensity at fluorescence wavelength 538
FLs2: Excitation wavelength of each sample: 355 / fluorescence intensity at fluorescence wavelength 538
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a method capable of clearly and easily detecting a base polymorphism in a sample nucleic acid. Since the method of the present invention does not require a complicated operation as in the conventional methods, results with good reproducibility were obtained quickly and easily.
[0049]
[Sequence Listing]

[0050]

[0051]

[Brief description of the drawings]
[Fig. 1] Fluorescence intensity of each sample in detection of nucleotide polymorphism of β3 adrenergic receptor gene

Claims (5)

試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、長さが１６〜３０塩基である野生型用オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔで標識されたオリゴヌクレオチドを用い、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼを作用させ多型特異的に伸長反応させた後、サイバー（登録商標）グリーンIを作用させて、オリゴヌクレオチドに標識されている１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔとの蛍光共鳴エネルギー移動を測定することにより塩基多型を同定する方法。Any one of a wild-type oligonucleotide having a length of 16 to 30 bases and a mutant oligonucleotide having a length of 16 to 30 bases in a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample The types are 1H, 5H, 11H, 15H-xantheno [2,3,4-ij: 5,6,7-i'j '] diquinolizin-18-ium, 9- (2-sulfo-4-chlorosulfonphenyl)- 2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-, inner labeled oligonucleotide used in salt, after simultaneously or separately by the action of DNA polymerase polymorphism specifically elongation reaction 1H, 5H, 11H, 15H- labeled with an oligonucleotide by the action of Cyber (registered trademark) Green I xantheno [2,3,4-ij: 5,6,7-i'j '] diquinolizin-18-ium, 9- (2-sulfo-4-chlorosulfenphenyl) -2,3,6,7,12,13 , 16, 17-octahydro-, a method of identifying a base polymorphism by measuring fluorescence resonance energy transfer with an inner salt. 長さが１６〜３０塩基である野生型用オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔで標識されたオリゴヌクレオチドを用い、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼを作用させ多型特異的増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に蛍光共鳴エネルギー移動を測定することを特徴とする請求項１記載の方法。 Length is 16 to 30 bases either one wild type oligonucleotide and length are 16 to 30 bases mutant oligonucleotide is, 1H, 5H, 11H, 15H -xantheno [2,3, 4-ij: 5,6,7-i′j ′] diquinolizin-18-ium, 9- (2-sulfo-4-chlorosulfenphenyl) -2,3,6,7,12,13,16,17-octahydrro -, and characterized by using a labeled oligonucleotide with inner, salt, performs multi-specific amplification reactions by the action of DNA polymerase simultaneously or separately, measuring the fluorescence resonance energy transfer during or after the amplification reaction and or reaction The method according to claim 1. 試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定する方法において、以下の１〜３の行程を含むことを特徴とする方法。
１）長さが１６〜３０塩基である野生型用オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が、１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔで標識されたオリゴヌクレオチドを用い、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼを作用させ多型特異的に伸張反応を行う。
２）伸張生成物を変性させ１本鎖にした後、伸張生成物に相補的なオリゴヌクレオチドを作用させ、伸張反応を行い２本鎖核酸を生成させる。
３）サイバー（登録商標）グリーンＩを作用させオリゴヌクレオチドに標識された１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔとの蛍光共鳴エネルギー移動およびサイバーグリーンＩの蛍光信号を測定する。A method for identifying a base polymorphism present in a specific nucleic acid sequence contained in a sample, comprising the following steps 1 to 3.
1) Any one of a wild type oligonucleotide having a length of 16 to 30 bases and a mutant type oligonucleotide having a length of 16 to 30 bases is represented by 1H, 5H, 11H, 15H-xantheno [2, 3,4-ij: 5,6,7-i'j '] diquinolizin-18-ium, 9- (2-sulfo-4-chlorosulfenphenyl) -2,3,6,7,12,13,16,17 -Octahydro-, labeled oligonucleotide used in inner, salt, performing polymorphism specifically extension reaction by the action of DNA polymerase simultaneously or separately.
2) The extension product is denatured into a single strand, and then an oligonucleotide complementary to the extension product is allowed to act on the extension product to generate a double-stranded nucleic acid.
3) 1H, 5H, 11H, 15H-xantheno [2,3,4-ij: 5,6,7-i′j ′] diquinolizin-18 labeled with oligonucleotide by acting Cyber (registered trademark) Green I -ium, 9- (2-sulfo- 4-chlorosulfonphenyl) -2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-, fluorescence fluorescence co tinnitus energy transfer and SYBR Green I with inner, salt Measure the signal. 請求項３記載の行程１及び２を繰り返して、増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定をすることを特徴とする請求項３記載の方法。4. The method according to claim 3, wherein steps 1 and 2 according to claim 3 are repeated to carry out an amplification reaction, and measurement is performed during and / or after the amplification reaction. 試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定するキットであって、次の（１）〜（３）の特徴を有するキット。A kit for identifying a nucleotide polymorphism present in a specific nucleic acid sequence contained in a sample, which has the following features (1) to (3).
（１）長さが１６〜３０塩基である野生型オリゴヌクレオチド及び長さが１６〜３０塩基である変異型用オリゴヌクレオチドの両方を含み、かつ、該野生型オリゴヌクレオチド及び該変異型用オリゴヌクレオチドのいずれか１種類が１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−（２−ｓｕｌｆｏ−４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｐｈｅｎｙｌ）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔで標識され、前記オリゴヌクレオチドが野生型または変異型に多型特異的に作用する。(1) It includes both a wild-type oligonucleotide having a length of 16 to 30 bases and a mutant-type oligonucleotide having a length of 16 to 30 bases, and the wild-type oligonucleotide and the mutant-type oligonucleotide 1H, 5H, 11H, 15H-xantheno [2,3,4-ij: 5,6,7-i′j ′] diquinolizin-18-ium, 9- (2-sulfo-4- chlorosulfenphenyl) -2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-, inner salt, the oligonucleotide acts on the wild type or mutant type polymorphically.
（２）ポリメラーゼを含む。(2) Contains a polymerase.
（３）サイバー（登録商標）グリーンIを含む。(3) Includes Cyber (R) Green I.

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