JP2005245272A - Simple method for detecting genetic polymorphism of alcohol dehydrogenase, and reagent for detection - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中に存在する薬物代謝酵素遺伝子多型の中で特にアルコール脱水素酵素の遺伝子多型を検出する方法および試薬に関する。 The present invention relates to a method and a reagent for detecting a gene polymorphism of an alcohol dehydrogenase, particularly among drug polymorphism gene polymorphisms present in a sample.
本発明において、遺伝子多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, 第８７〜９６頁; Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、(1989)）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。 In the present invention, gene polymorphism means having a nucleotide sequence different from that of the wild type. The nucleotide polymorphism of a gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism, and is also known as a cause of individual differences such as basic metabolism known as constitution. In addition, they also serve as genetic markers for a number of diseases. Therefore, elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical research (Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, pp. 87-96; Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-554 (1989)). In addition, a nucleic acid sequence analysis method for detecting each genotype following identification of the causative mutant gene is desired.
アルコール脱水素酵素 (ADH)は体内に取りこまれたアルコールの分解に関与する酵素である。ADH2の47番目のアミノ酸を決定している塩基がCGCの配列をとるものはADH2*1、CACとなるとADH2*2と区別される。またコドン369がCGTとなるとADH2*1、TGTとなるとADH2*3遺伝子となる。日本人を含む東アジアにはADH2*2が多いとの報告があるが、逆にADH2*3は頻度が低いと報告されている。ADH2*2はアルデヒド産生能と関連が深く、47G/AのSNPを検出することは臨床上有用であると考えられている。 Alcohol dehydrogenase (ADH) is an enzyme involved in the degradation of alcohol taken into the body. ADH2 * 1 is distinguished from ADH2 * 2 when the base that determines the 47th amino acid of ADH2 has CGC sequence, and CAC. When codon 369 becomes CGT, it becomes ADH2 * 1 and when TGT becomes ADH2 * 3 gene. There are reports that there are many ADH2 * 2 in East Asia, including the Japanese, but ADH2 * 3 is reported to be less frequent. ADH2 * 2 is closely related to the ability to produce aldehyde, and it is considered clinically useful to detect 47G / A SNP.
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間を必要でする。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing methods can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences. However, it is very difficult to analyze nucleic acid sequences such as template nucleic acid preparation, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, etc. It takes effort and time. Further, labor can be saved by using a recent automatic sequencer, but there is a problem that an expensive apparatus is required.
On the other hand, there are various known genetic diseases caused by point mutations in genes, and some of them know which part of the gene and how point mutations cause genetic diseases. Not a few.
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（例えば、特許文献１、特許文献２参照）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうち、一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。 As a method for detecting such an expected point mutation, a point mutation of a gene using a gene amplification method such as a PCR (polymerase chain reaction) method (for example, see Patent Document 1 and Patent Document 2) has been conventionally used. The detection method is known. In this method, one of the pair of oligonucleotides used in the gene amplification method, as one oligonucleotide, a wild type oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the wild type gene amplification region, and the amplification of the mutant gene A mutant oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the region is used. Mutant oligonucleotides have nucleotides complementary to the predicted point mutation at the 3 'end. Such wild-type and mutant-type oligonucleotides are separately used to subject the sample gene to the gene amplification method.
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。 If the sample gene is wild-type, nucleic acid amplification occurs when a wild-type oligonucleotide is used, but if a mutant-type oligonucleotide is used, the 3 ′ end of the oligonucleotide corresponds to the sample gene. Since it is not complementary to the nucleotide (mismatch), no extension reaction occurs, and no nucleic acid amplification occurs. On the other hand, if the sample gene is a mutant type, conversely, amplification does not occur when the wild-type oligonucleotide is used, and amplification occurs when the mutant-type oligonucleotide is used. Therefore, by examining whether amplification occurs when using each oligonucleotide, it is possible to determine whether the sample gene is a wild type or a mutant type, thereby identifying a point mutation in the sample gene. Can do. As a method to check whether amplification has occurred at this time, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, stained with a nucleic acid-specific binding fluorescent reagent such as ethidium bromide, and then irradiated with UV to detect the presence of amplified nucleic acid. it can. Other methods include Southern blotting, in which amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected using a labeled probe, sandwich hybridization in which detection probe is acted on after capturing with a supplementary probe immobilized on an individual carrier. Laws have been developed.
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、操作は煩雑であり、検出値を数値化することが困難である為に野生型シグナルと多型シグナルの比をとると言った解析が困難となり、正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。 Although it seems that the amplified nucleic acid can be detected by the method as described above and the polymorphism can be easily identified, the operation is complicated and it is difficult to quantify the detected value. The analysis of taking the ratio of type signal to polymorphic signal became difficult, and a great deal of work was required to identify the correct polymorphism.
たとえば電気泳動法によれば野生型及び変異型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑であることから、アルコール脱水素酵素の遺伝子多型を検出する場合、特殊な専用装置を使用することなく簡便、短時間に検出する方法は提案されていなかった。特に、プライマーを用いて増幅反応を行い、その増幅反応の有無を調べることで多型の同定を行う方法では、どの位置にハイブリダイズするプライマーを用いれはさせれば非特異的な反応を抑え、効果的に増幅反応させることができるかは解明されていなかった。 For example, according to the electrophoresis method, it is necessary to separately detect the wild type and the mutant type, and it is difficult to accurately quantify the amount of nucleic acid from the electrophoretic image. Further, Southern blotting and sandwich hybridization require a hybridization reaction with a probe, and the conditions must be strictly adjusted. Furthermore, since a process for removing excess probes is necessary and the operation is very complicated, when detecting a gene polymorphism of alcohol dehydrogenase, it is simple and short without using a special dedicated device. No detection method has been proposed. In particular, in the method of performing an amplification reaction using a primer and identifying the polymorphism by examining the presence or absence of the amplification reaction, if a primer that hybridizes to any position is used, a non-specific reaction is suppressed, It has not been clarified whether an amplification reaction can be effectively performed.
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、アルコール脱水素酵素の遺伝子多型を明確にかつ再現性よく検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。 An object of the present invention is to solve the above-described problems and provide a method and a reagent therefor that can detect a gene polymorphism of alcohol dehydrogenase clearly and with high reproducibility.
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、野生型検出用オリゴヌクレオチド及びまたは１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させた後、増幅された該オリゴヌクレオチドの量を測定することで、煩雑な検出操作を必要とせずまた容易に数値化したデータが得られ、したがって明確な多型同定が可能となる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。 In view of the above circumstances, the present inventors, as a result of intensive studies, in comparison with the above-described conventional method, a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphism site is used as a wild-type detection oligonucleotide and / or one or two kinds of oligonucleotides. By measuring the amount of the amplified oligonucleotide after reacting the mutant-type detection oligonucleotides simultaneously or separately, it is possible to obtain easily digitized data without requiring a complicated detection operation. The inventors have found a method that enables clear polymorphism identification and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１） アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを用いて増幅を行うことを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。
That is, the present invention has the following configuration.
(1) Among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-7 that can specifically hybridize to the alcohol dehydrogenase gene in the method for detecting the mutation site of the alcohol dehydrogenase gene, at least 15 consecutive sequences A method for detecting an alcohol dehydrogenase gene polymorphism, wherein amplification is performed using at least one of a base or a primer that can hybridize to a complementary base sequence.
（２）アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを、野生型および変異型の共通プライマーとして用いることを特徴とする上記（１）に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。 (2) Primer capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-3 capable of specifically hybridizing to the alcohol dehydrogenase gene The method for detecting an alcohol dehydrogenase gene polymorphism according to (1) above, wherein at least one of the above is used as a common primer for wild type and mutant type.
（３）アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子にハイブリダイズすることが可能な配列番号４−７に示されるオリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）または（２）記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。 (3) In the method for detecting the sequence of the mutation site of the alcohol dehydrogenase gene, the 3 ′ end of the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 4-7 capable of hybridizing to the alcohol dehydrogenase gene is complementary to the target gene The above (1) or (2), wherein the oligonucleotide is designed such that the second nucleotide from the 3 ′ end corresponds complementarily to the nucleotide of the wild-type or mutant sequence For detecting a polymorphism of alcohol dehydrogenase gene in human.
（４）上記（１）に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法において、用いられるプライマーがアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも２つの組み合わせであることを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。 (4) In the method for detecting the sequence of the mutation site of the alcohol dehydrogenase gene according to (1) above, SEQ ID NO: 1- 1 that allows the primer used to specifically hybridize to the alcohol dehydrogenase gene 7. A method for detecting an alcohol dehydrogenase gene polymorphism, which is a combination of at least two primers capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto among the sequences shown in 7.
（５） 増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。 (5) The alcohol according to any one of (1) to (4) above, wherein the amplification reaction is any method selected from the group consisting of PCR, NASBA, LCR, SDA, RCR and TMA A method for detecting a dehydrogenase gene polymorphism.
（６） オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。 (6) The method for detecting an alcohol dehydrogenase gene polymorphism according to any one of (1) to (5) above, wherein the oligonucleotide is labeled in advance.
（７） 核酸特異標識により検出することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出方法。 (7) The method for detecting an alcohol dehydrogenase gene polymorphism according to any one of (1) to (6) above, wherein the detection method is performed by nucleic acid-specific labeling.
（８） アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも１つを用いて増幅を行うことを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。 (8) Among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-7 that can specifically hybridize to the alcohol dehydrogenase gene in the method for detecting the sequence of the mutation site of the alcohol dehydrogenase gene, at least 15 consecutive sequences A kit for detecting an alcohol dehydrogenase gene polymorphism, wherein amplification is performed using at least one of a primer that can hybridize to a base or a complementary base sequence.
（９）アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも一つを、野生型および変異型の共通プライマーとして用いて増幅を行うことを特徴とする上記（８）記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。 (9) Primer capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a complementary base sequence among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-3 capable of specifically hybridizing to the alcohol dehydrogenase gene The detection kit for alcohol dehydrogenase gene polymorphism according to (8) above, wherein the amplification is performed using at least one of the above as a common primer for wild type and mutant type.
（１０）アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子にハイブリダイズすることが可能な配列番号４−７に示されるオリゴヌクレオチドの３‘末端が標的遺伝子と相補的であり、３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（８）または（９）記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。 (10) In the method for detecting the sequence of the mutation site of the alcohol dehydrogenase gene, the 3 ′ end of the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 4-7 that can hybridize to the alcohol dehydrogenase gene is complementary to the target gene (8) or (9) above, wherein the oligonucleotide is designed such that the second nucleotide from the 3 'end corresponds complementarily to the nucleotide of the wild-type or mutant sequence Detection kit for alcohol dehydrogenase gene polymorphism.
（１１）上記（８）に記載のアルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列の検出キットにおいて、用いられるプライマーがアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも２つの組み合わせであることを特徴とするアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。 (11) SEQ ID NOs: 1-7 in which the primer used in the detection kit for a mutation site of the alcohol dehydrogenase gene according to (8) above can specifically hybridize to the alcohol dehydrogenase gene A detection kit for detecting an alcohol dehydrogenase gene polymorphism, which is a combination of at least two primers capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto.
（１２）増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。 (12) The alcohol according to any one of (8) to (11) above, wherein the amplification reaction is any method selected from the group consisting of PCR, NASBA, LCR, SDA, RCR and TMA Dehydrogenase gene polymorphism detection kit.
（１３） オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。 (13) The detection kit for an alcohol dehydrogenase gene polymorphism according to any one of (8) to (12) above, wherein the oligonucleotide is labeled in advance.
（１４） 核酸特異標識により検出することを特徴とする上記（８）〜（１３）のいずれかに記載のアルコール脱水素酵素遺伝子多型の検出キット。 (14) The detection kit for an alcohol dehydrogenase gene polymorphism according to any one of (8) to (13) above, which is detected by a nucleic acid-specific label.
本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせ ず、遺伝子多型を迅速かつ容易に判定することができる。また、本発明の方法は非特異的な反応を抑え、効果的に増幅反応させることができる。 The present invention provides a method capable of clearly and easily detecting a gene polymorphism in a sample nucleic acid. In the method of the present invention, the genetic polymorphism can be determined quickly and easily without requiring complicated operations as in the conventional methods. In addition, the method of the present invention can suppress non-specific reactions and effectively carry out amplification reactions.
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う遺伝子多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Ａｌｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The chromosome or fragment thereof containing the gene polymorphic site contained in the sample is not particularly limited as long as it is a target nucleic acid containing the gene polymorphic site that bears information on the target gene. Examples of the target nucleic acid include Alu sequences, exons of genes encoding proteins, introns, promoters, and the like.
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異箇所とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。例えば、このような遺伝子多型が生じることにより薬物代謝酵素の代謝活性が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査し、被験者の有する遺伝子のタイプを検出する方法である。 In the present invention, the nucleic acid sequence may be simply referred to as a nucleic acid. The mutation site means that at least one of the wild-type nucleic acids, preferably one nucleotide is point-mutated and replaced with another nucleotide, or a part of the wild-type nucleic acid is inserted or deleted. It is a nucleic acid to be contained, and it has been elucidated which part of the nucleotide is mutated. For example, it has been elucidated that the metabolic activity of drug metabolizing enzymes is different due to the occurrence of such gene polymorphism, and the method of the present invention has such a predicted nucleic acid in a sample. It is a method of detecting whether or not the type of gene possessed by the subject is detected.
本発明は、アルコール脱水素酵素遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法においてアルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−１０に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて増幅を行うことを特徴とする。 The present invention provides a method for detecting a sequence of a mutation site in an alcohol dehydrogenase gene, wherein at least a continuous sequence among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-10 capable of specifically hybridizing to the alcohol dehydrogenase gene. Amplification is performed using a primer capable of hybridizing to 15 bases or a complementary base sequence.
本発明が適応できる遺伝子の変異箇所の配列を検出する方法としては、配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて増幅反応を行う方法であれば特に制限なく用いることができるが、例としては、アレル特異的オリゴマーを用いる方法、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等があげられるが、これらの代表として説明する以下の方法が好ましい。 As a method for detecting the sequence of a mutation site of a gene to which the present invention can be applied, a primer capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-7. Any method can be used without particular limitation as long as it is a method for performing an amplification reaction, and examples include a method using an allele-specific oligomer, a Taq Man PCR method, an Invader method, and the like. The following method is preferred.
なお、本発明において、「ハイブリダイズ可能なプライマー」の「ハイブリダイズ可能な」の意味は、各検出方法で用いるプライマーがその検出方法に適正な条件下で、増幅反応が進行する程度にハイブリダイズしていること、もしくはＴａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等で停止側のプライマーとして用いる場合には実用上停止できる程度にハイブリダイズしていることである。 In the present invention, the term “hybridizable” in “hybridizable primer” means that the primer used in each detection method is hybridized to the extent that the amplification reaction proceeds under conditions appropriate for the detection method. Or, when used as a primer on the stop side in Taq Man PCR method, Invader method or the like, it is hybridized to such an extent that it can be stopped practically.
また、当該プライマーは配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能であればよく、実際の検出において、配列番号１−７に示される配列を越えた部分までハイブリダイズしていてもよく、また、プライマー末端等がハイブリダイズせずに浮き上がっていてもよい。 In addition, the primer only needs to be capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-7. It may be hybridized up to the portion beyond the sequence shown, or the primer ends and the like may be floated without hybridization.
アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号4−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは、野生型配列および変異型配列を区別するために用いられることが好ましい。 Among the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-7 that can specifically hybridize to the alcohol dehydrogenase gene, a primer that can hybridize to at least 15 consecutive bases or a complementary base sequence is a wild type. It is preferably used to distinguish type sequences from variant sequences.
配列番号４−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは、アルコール脱水素酵素遺伝子の塩基多型（４７ G→A）配列を区別するために好ましく用いられる。 Among the sequences shown in SEQ ID NOs: 4-7, the primer capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto is the nucleotide polymorphism (47 G → A) sequence of the alcohol dehydrogenase gene. It is preferably used to distinguish.
なお、これらの野生型配列および変異型配列を区別するために用いられるプライマーは、塩基多型部分を含むことが好ましい。 In addition, it is preferable that the primer used in order to distinguish these wild-type sequence | arrangements and a variation | mutation type | mold sequence contains a base polymorphism part.
本発明を達成するには、検出のための重要な要素であるオリゴヌクレオチドの遺伝子多型部位近辺が、野生型検出用オリゴヌクレオチドの場合は変異型配列と、変異型検出用オリゴヌクレオチドの場合は野生型配列と２本鎖を形成することなく明確に解離しするような、野生型検出用および変異型検出用オリゴヌクレオチドを選択することが好ましい。このように明確に解離させることにより、伸長反応やハイブリダイズの有無などといった相補的なオリゴヌクレオチドと相補的でないオリゴヌクレオチドとの差異が生じる条件の範囲が広くなり、本発明を達成するのに好適である。 In order to achieve the present invention, the vicinity of the gene polymorphism site of the oligonucleotide, which is an important element for detection, is a mutant sequence in the case of a wild type detection oligonucleotide, and a mutation detection oligonucleotide in the case of a mutation detection oligonucleotide. It is preferable to select an oligonucleotide for wild type detection and a mutant type detection that clearly dissociates without forming a double strand with the wild type sequence. Such a clear dissociation broadens the range of conditions under which differences between complementary and non-complementary oligonucleotides, such as the presence or absence of extension reactions and hybridization, are suitable for achieving the present invention. It is.
本発明で用いられるこのようなプライマーは、配列番号４〜７に挙げたプライマーの例のように、対象となる配列に完全に相補的であることも好ましいが、変異箇所以外に少なくとも１箇所の人為的ミスマッチを有する野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドであることが好ましい。変異箇所以外の人為的ミスマッチ部位としては、変異箇所から５塩基以内が好ましく、さらに好ましくは４塩基以内、特に好ましくは３塩基以内である。最も好ましくは２塩基以内である。
Such a primer used in the present invention is preferably completely complementary to a target sequence as in the examples of the primers listed in SEQ ID NOs: 4 to 7, but at least one site other than the mutation site is used. It is preferable that the oligonucleotide is for wild type detection and mutation type detection having an artificial mismatch. The artificial mismatch site other than the mutation site is preferably within 5 bases from the mutation site, more preferably within 4 bases, and particularly preferably within 3 bases. Most preferably, it is within 2 bases.
また、PCRを実施するために必要なプライマーの組み合わせは配列番号1-7で示されるプライマー中から選択することができる。PCRが効果的に実施可能となるように選択されたプライマーペアのオリゴヌクレオチドの融解温度Tm(melting temperature)は５０℃から８０℃の範囲が好ましく、更に好ましくは５５℃から７５℃、より好ましくは６０℃から６８℃である。更に選択したプライマー間のTｍ差が少なくなるよう考慮されたプライマーペアであることが好ましい。Tm差としては１０℃以内が好ましく、更に好ましくは５℃以内、特に好ましくは３℃以内である。
In addition, a combination of primers necessary for performing PCR can be selected from the primers represented by SEQ ID NOs: 1-7. The melting temperature Tm (melting temperature) of the oligonucleotide of the primer pair selected so that PCR can be effectively performed is preferably in the range of 50 ° C to 80 ° C, more preferably 55 ° C to 75 ° C, more preferably 60 to 68 ° C. Furthermore, it is preferable that the primer pair is designed so that the Tm difference between the selected primers is reduced. The Tm difference is preferably within 10 ° C, more preferably within 5 ° C, and particularly preferably within 3 ° C.
また、人為的ミスマッチの数としては５個以下が好ましく、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、特に好ましくは１個以下である。具体的な例としては、実施例で用いたオリゴ4-7に記載したプライマーが挙げられる。 Further, the number of artificial mismatches is preferably 5 or less, more preferably 3 or less, still more preferably 2 or less, and particularly preferably 1 or less. Specific examples include the primers described in Oligo 4-7 used in the examples.
なお、プライマーはこれら人為的ミスマッチが存在したりする場合であっても、対象となる配列番号４−７に示される配列またはこれに相補的な塩基配列部分に特異的にハイブリダイズする必要があることは言うまでもない In addition, even when these artificial mismatches exist, the primer needs to specifically hybridize to the target sequence shown in SEQ ID NO: 4-7 or a base sequence portion complementary thereto. Needless to say
従来では変異箇所のみで差を出していたために２本鎖の形成の有無が明確でない場合があったが、オリゴヌクレオチドとしてこのような構成を採ることで変異箇所と他のミスマッチ部の２箇所で２本鎖形成を妨げることになり、複数箇所の変異部位を同一の条件で検出することが容易に出来るようになる。 In the past, there was a case where it was not clear whether or not a double strand was formed because the difference was made only at the mutated site. By adopting such a structure as an oligonucleotide, the mutated site and other mismatched sites were used. Double strand formation is hindered, and multiple mutation sites can be easily detected under the same conditions.
このようなオリゴヌクレオチドの例としては、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドを増幅のフォワード側プライマーとして用いる場合、好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３‘末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応し、かつ野生型及び変異型両方に相補的でない塩基を３’末端から３〜７番目の少なくとも１箇所、（特に好ましくは３番目）に有するよう設計されたオリゴヌクレオチドである。 As an example of such an oligonucleotide, when using a wild type detection oligonucleotide and a mutation type detection oligonucleotide as a forward primer for amplification, preferably from the 3 ′ end of the wild type detection oligonucleotide and the mutation detection oligonucleotide. Oligonucleotides designed such that the second nucleotide corresponds complementarily to the nucleotide of the wild type or mutant sequence. More preferably, the second nucleotide from the 3 ′ end of the wild-type detection and mutant detection oligonucleotide corresponds complementarily to the nucleotide of the wild-type or mutant sequence, and is complementary to both the wild-type and the mutant. It is an oligonucleotide designed to have a non-base at least at the third to seventh positions from the 3 ′ end (particularly preferably the third position).
このように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは少なくとも３’ 末端から２番目の配列までは一致する為伸長反応は起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいてはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長反応が起こらない。 In such a design, in the combination of the wild type oligonucleotide / wild type nucleic acid and the mutant type oligonucleotide / mutant nucleic acid, each oligonucleotide matches at least from the 3 ′ end to the second sequence, so the extension reaction is not Occur. On the other hand, in the combination of the wild type oligonucleotide / mutant nucleic acid and the mutant type oligonucleotide / wild type nucleic acid, there is an artificial mismatch between the 3 ′ end of the oligonucleotide or the second base from the 3 ′ end, and another base. There is no extension reaction.
また、アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは野生型および変異型の共通プライマーとして用いることが好ましい。このようなプライマーを用いることによって、野生型と変異型を検出する際に野生型および変異型に特異的なプライマー以外を共通化できるため、配合間違い等がなく、また、容易に測定を行うことができる。なお、このプライマーはハイブリダイズする範囲であればミスマッチがあってもよいが、ミスマッチがないことが最も好ましい。 Further, among the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-3 that can specifically hybridize to the alcohol dehydrogenase gene, the primer that can hybridize to at least 15 consecutive bases or a complementary base sequence thereof is It is preferably used as a common primer for wild type and mutant type. By using such primers, it is possible to share other than wild-type and mutant-specific primers when detecting wild-type and mutant types. Can do. The primer may have a mismatch as long as it hybridizes, but it is most preferable that there is no mismatch.
なお、アルコール脱水素酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが可能な配列番号１−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーは少なくとも１つを用いればよいが、さらに好ましくは、２つ以上の組み合わせで用いられる。 Of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1-7 that can specifically hybridize to the alcohol dehydrogenase gene, primers that can hybridize to at least 15 consecutive bases or a complementary base sequence are: At least one may be used, but more preferably two or more are used in combination.
組み合わせとしては、配列番号１−３に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも１つと、配列番号４−７に示される配列のうち、連続した少なくとも１５塩基またはこれに相補的な塩基配列にハイブリダイズ可能なプライマーの少なくとも１つの組み合わせであることが好ましい。 As a combination, at least one primer capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto among the sequences shown in SEQ ID NO: 1-3 and the sequence shown in SEQ ID NO: 4-7 Of these, at least one combination of primers capable of hybridizing to at least 15 consecutive bases or a base sequence complementary thereto is preferable.
本発明におけるオリゴヌクレオチドの長さとしては、下限は好ましくは１５塩基，より好ましくは１６塩基、さらに好ましくは１７塩基、特に好ましくは１８塩基であり、上限は好ましくは５０、より好ましくは３５塩基、さらに好ましくは３０塩基である。また、本発明におけるオリゴヌクレオチドは人為的ミスマッチが存在してもよく、その場合は該オリゴヌクレオチド中に少なくとも１つ存在することが好ましい。また、その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。
３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
As the length of the oligonucleotide in the present invention, the lower limit is preferably 15 bases, more preferably 16 bases, still more preferably 17 bases, particularly preferably 18 bases, and the upper limit is preferably 50, more preferably 35 bases, More preferably, it is 30 bases. In addition, the oligonucleotide in the present invention may have an artificial mismatch, and in that case, at least one is preferably present in the oligonucleotide. Further, the position is not particularly limited as long as it is from the 3rd to the 5 'end of the 3' end, but is preferably a position close to the 3rd end of the 3 'end, more preferably from the 3' end. The third is preferred.
Third, when an artificial mismatch is used, when a nucleic acid sequence that does not expect an extension reaction is used as a template, a mismatch of two bases is combined with the nucleotide polymorphism site, and the extension reaction is strongly inhibited.
なお、上記にはフォワード側プライマーに用い、伸長反応開始点の３’末端部を明確に解離させる例を示したが、リバース側プライマーとして用いる場合も同様に明確に解離させたりすることもできる。さらには、前述の思想を基に、相補的でないプライマー自身をハイブリダイズさせにくくしたりすることも可能である。 In the above example, the forward primer is used and the 3 'end portion of the extension reaction start point is clearly dissociated. However, when the primer is used as the reverse primer, it can be clearly dissociated. Furthermore, it is also possible to make it difficult to hybridize non-complementary primers themselves based on the above-mentioned idea.
本発明においては、上記野生型用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
In the present invention, the wild type oligonucleotide and the mutant type detection oligonucleotide are allowed to act on the sample separately or simultaneously.
In the present invention, the oligonucleotide extension method can basically be performed using a conventional method. Usually, a chromosome containing a specific nucleotide polymorphism site denatured into a single strand or a fragment thereof, together with four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) and a DNA polymerase, a wild-type detection oligonucleotide, one type or By using two types of mutant detection oligonucleotides simultaneously or separately, the oligonucleotides are extended using the target nucleic acid as a template.
該伸長反応は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrookら、1989)に記載の方法に従って行うことができる。本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、例えば、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。 The extension reaction can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989). In the present invention, a method for amplifying a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, for example, a specific nucleotide polymorphism denatured into a single strand. A chromosome containing a site or a fragment thereof, together with four types of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase and reverse primer, a wild type detection oligonucleotide and one or two types of mutant detection oligonucleotides (four By using the target nucleic acid as a template, amplification is performed between the forward oligonucleotide and the reverse oligonucleotide.
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。 Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature, Vol. 350, page 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research Vol. 20, 1691 (1992)), RCR (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin. Microbiol. Vol. 31, Vol. 31) 3270 (1993)).
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。 In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase, and thereby the above paired pair. In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the oligonucleotides is exponentially amplified. That is, the sample nucleic acid is denatured in the denaturation step, each oligonucleotide is hybridized with a region on the complementary single-stranded sample nucleic acid in the subsequent annealing step, and each oligonucleotide is the starting point in the subsequent extension step. As described above, a DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of DNA polymerase to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotides is theoretically amplified 2n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型検出用オリゴヌクレオチドと、変異型核酸を増幅できる変異型検出用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個又は同時に用いて遺伝子増幅法を行う。 In the method using the nucleic acid amplification method as described above, the gene amplification method is performed using a wild-type detection oligonucleotide capable of amplifying wild-type nucleic acid and a mutation-type detection oligonucleotide capable of amplifying the mutant nucleic acid separately or simultaneously. Do.
野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。 When the sample nucleic acid is extended or amplified using the wild type detection oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is the wild type, but no reaction occurs in the mutant type. Conversely, when a sample nucleic acid is extended or amplified using a mutant detection oligonucleotide, the reaction occurs if the sample nucleic acid is a mutant type, but does not occur if the sample nucleic acid is a wild type. Therefore, one sample is divided into two parts, one is reacted with the wild-type detection oligonucleotide and the other is reacted with the mutant detection oligonucleotide to check whether the reaction has occurred. This makes it possible to clearly know whether the sample nucleic acid is a wild type or a mutant type.
また、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチド及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を用いて反応を行い、どちらのオリゴヌクレオチドで反応が起こったかを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることもできる。 In addition, the sample nucleic acid is wild-type by reacting with both the wild-type detection oligonucleotide and the mutant-type detection oligonucleotide on one sample and examining which oligonucleotide caused the reaction. It is also possible to know clearly whether it is a mutant type.
特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。 In particular, humans and other higher organisms have one gene each derived from the father and one from the mother for each type of gene. According to this method, the sample gene is a wild-type homologue. It is also possible to distinguish between mutant homozygous or both heterozygous. That is, in the case of heterogeneity, both the wild type gene and the mutant gene exist, so that the reaction occurs both when the wild type detection oligonucleotide is used and when the mutation type detection oligonucleotide is used.
また、オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出する方法とは、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型検出用オリゴヌクレオチドと及び１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、核酸特異標識、特に２本鎖核酸特異的結合物質と反応させることによって前記増幅反応により生じたオリゴヌクレオチド量を検出できる。 In addition, the method for detecting whether or not the oligonucleotide has reacted includes a nucleic acid sample containing a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site, a certain amount of wild-type detection oligonucleotide, and one or two kinds. Of the mutant type oligonucleotides (corresponding to the forward primer) at the same time or separately, and then reacting with a nucleic acid-specific label, particularly a double-stranded nucleic acid-specific binding substance. The amount of oligonucleotide produced can be detected.
核酸特異標識を用いる場合は、電気泳動等の後処理を行うこともなくフォワードプライマーのタイプにより伸長反応が起こったか否かによってのみ判断するため、標識したオリゴヌクレオチドを用いる必要がなく、コスト面で有利であるにもかかわらず、未だ同一条件で伸長反応を行うことは困難であると考えられていたが、例えば上述のプライマーを用いることで同一条件で伸長反応を行うことが可能となった。 When using nucleic acid-specific labels, there is no need to use labeled oligonucleotides, because there is no need to use labeled oligonucleotides, because there is no post-treatment such as electrophoresis, and only an extension reaction occurs depending on the type of forward primer. Although it was advantageous, it was still considered difficult to perform the extension reaction under the same conditions. However, for example, the extension reaction can be performed under the same conditions by using the above-mentioned primers.
上記検出方法としては、標識したオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
例えば、該検出は、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子多型の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。２本鎖核酸特異的結合物質としては、エチレンブロマイド、SYBR Green Iなどが挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。フォワード側プライマーとして用いる場合は、好ましくは、５’ 部位である。
本鎖核酸特異的結合物質として、SYBR Green Iを使用する場合、増幅産物の長さによりシグナル強度を増大させることが可能である。SYBR Green Iを使用した場合の増幅産物長は100bp以上が好ましく、更に好ましくは200bp以上である。但しシグナルとノイズとの比（S/N）が十分得られるプライマーの組み合わせであればその限りではない。
As the detection method, a labeled oligonucleotide can also be used.
For example, the detection is performed by labeling each oligonucleotide in advance with an enzyme, biotin, fluorescent substance, hapten, antigen, antibody, radioactive substance, luminophore, etc., and then reacting with the labeled oligonucleotide after extension or amplification reaction. By detecting, gene polymorphism can be detected. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase. Examples of the fluorescent material include FITC, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Texas Red, Cy3, and Cy5. Examples of the double-stranded nucleic acid-specific binding substance include ethylene bromide and SYBR Green I. Examples of haptens include biotin and digoxigenin. Examples of radioactive substances include 32 P and 35 S.
Examples of the luminophore include ruthenium. The label may be bound to any position of the oligonucleotide as long as it does not affect the extension reaction of the oligonucleotide. When used as a forward primer, the 5 ′ site is preferred.
When SYBR Green I is used as a single-stranded nucleic acid-specific binding substance, the signal intensity can be increased by the length of the amplification product. When SYBR Green I is used, the length of the amplification product is preferably 100 bp or more, more preferably 200 bp or more. However, this is not the case as long as the primer combination is sufficient to obtain a sufficient signal / noise ratio (S / N).
野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、一つの試料に野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方を添加して、１つの反応槽で検出ができる。 When different labels are used for the wild-type detection oligonucleotide and the mutation-type detection oligonucleotide, both the wild-type detection oligonucleotide and the mutation-type detection oligonucleotide are added to one sample, and one reaction Detection is possible in the tank.
本発明で増幅を行う際には、溶液としては、その増幅方法に合った反応液を用いる。この反応液は、公知のものを用いることができる。 When performing amplification in the present invention, a reaction solution suitable for the amplification method is used as the solution. As this reaction liquid, a known one can be used.
例えば、ＰＣＲ法であれば、オリゴヌクレオチド及び試料以外では、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液、MgCl2、MgSO4等の各種塩類等が添加された溶液である。本発明の操作の簡便性、人為的ミスを少なくするためには、オリゴヌクレオチド以外の反応液は予め所定の濃度に調製されたものを用いることが好ましく、さらに、試料の濃度も同じにすることが好ましいが、本発明の、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出するためには、塩類等の濃度を適宜変えることもできる。 For example, in the case of the PCR method, in addition to the oligonucleotide and the sample, a DNA polymerase, four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), a buffer solution, and various salts such as MgCl 2 and MgSO 4 are added. . In order to simplify the operation of the present invention and reduce human error, it is preferable to use a reaction solution other than the oligonucleotide prepared in advance at a predetermined concentration, and the sample concentration should be the same. However, in order to detect the sequence of at least two different mutation sites under the same amplification conditions of the present invention, the concentration of salts and the like can be appropriately changed.
反応液の調整の方法としては、具体的には、試料に対して、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方ともが増幅してしまう場合には、オリゴヌクレオチド、塩類、ＤＮＡポリメラーゼ、等の濃度を下げることが好ましい。また、増幅すべきでない方の濃度のみ下げることも好ましい。
逆に、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドの両方とも増幅が認められない場合には、オリゴヌクレオチド、塩類、ＤＮＡポリメラーゼ、等の濃度を上げることが好ましい。また、増幅すべき方の濃度のみ上げることも好ましい。
なお、緩衝液、ｄＮＴＰの濃度は、野生型検出用オリゴヌクレオチドおよび変異型検出用オリゴヌクレオチドや対象の変異箇所にかかわらず、同一であることが好ましい。
As a method for preparing the reaction solution, specifically, when both the wild-type detection oligonucleotide and the mutant-type detection oligonucleotide are amplified with respect to the sample, the oligonucleotide, salts, DNA It is preferable to reduce the concentration of polymerase or the like. It is also preferable to reduce only the concentration that should not be amplified.
On the other hand, when amplification of both the wild type detection oligonucleotide and the mutation type detection oligonucleotide is not observed, it is preferable to increase the concentration of the oligonucleotide, salts, DNA polymerase, and the like. It is also preferable to increase only the concentration to be amplified.
In addition, it is preferable that the density | concentration of a buffer solution and dNTP is the same irrespective of the oligonucleotide for wild type detection, the oligonucleotide for a mutation type detection, and the object mutation location.
これらの反応液としては、反応液２５μｌあたり、オリゴヌクレオチドが0.5〜50pmol、×１０の緩衝液が0.5〜50μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰで0.5〜50μｌ、塩類が25mM濃度液で0.1〜30μｌ、ＤＮＡポリメラーゼが0.1〜30ｎｇ程度であることが好ましい。 These reaction solutions include 0.5-50 pmol of oligonucleotide per 25 μl of reaction solution, 0.5-50 μl of x10 buffer solution, 0.5-50 μl of 2 mM dNTP, 0.1-30 μl of salt at 25 mM concentration, and DNA polymerase It is preferably about 0.1 to 30 ng.
本発明では、少なくとも２箇所以上の異なった変異箇所を対象とした増幅反応を、温度および時間サイクルが同一の条件下で行う。
これまで知られているオリゴヌクレオチドを用いて変異箇所を検出する方法では、各変異箇所の周辺の塩基配列は全く同じではないため、異なった条件で増幅反応を行うことが必要である他、標的核酸部位を特異的に増幅させるために、増幅産物の塩基数は各変異箇所に応じて異なっていたため、複数の変異箇所を同じ温度及び時間サイクル条件では増幅が行えないと考えられていた。本発明では、各変異箇所に特異的なオリゴヌクレオチドを用いること、および反応液を適宜調整することによって従来の課題を克服し、本発明を完成するに至った。
In the present invention, amplification reactions targeting at least two different mutation sites are performed under the same temperature and time cycle conditions.
In conventional methods for detecting mutation sites using oligonucleotides, the base sequences around each mutation site are not exactly the same, so it is necessary to carry out amplification reactions under different conditions, In order to specifically amplify the nucleic acid site, the number of bases of the amplification product was different depending on each mutation site, and therefore it was considered that a plurality of mutation sites could not be amplified under the same temperature and time cycle conditions. In the present invention, the conventional problems have been overcome and the present invention has been completed by using oligonucleotides specific to each mutation site and appropriately adjusting the reaction solution.
増幅反応としては、最初の熱変形工程が80〜100℃で1〜15分、繰り返しの熱変形工程が80〜100℃で2〜300秒、アニーリンクが40〜80℃で2〜300秒、伸長反応工程が60〜85℃で2〜300秒程度行い、この繰り返しを20〜50回繰り返しすことが好ましい。 As the amplification reaction, the first heat deformation step is 80 to 100 ° C. for 1 to 15 minutes, the repeated heat deformation step is 80 to 100 ° C. for 2 to 300 seconds, the annealing is 40 to 80 ° C. for 2 to 300 seconds, The extension reaction step is preferably performed at 60 to 85 ° C. for about 2 to 300 seconds, and this repetition is preferably repeated 20 to 50 times.
本発明の方法により、従来は変異箇所個々に変異型を調べ、そのデータを総合して遺伝子多型を判断・検出していたが、複数箇所の変異型を同時に調べることができるため、遺伝子多型の検出が短時間で済む上、条件設定の複雑さが解消されたため、単純な設定ミスなどの人的ミスを減らすことができる。 According to the method of the present invention, conventionally, mutation types were individually examined for each mutation site, and the data were combined to determine and detect the gene polymorphism. The detection of the mold can be completed in a short time, and the complexity of condition setting is eliminated, so that human errors such as simple setting errors can be reduced.
キット
本発明において、キットとしては、野生型検出用オリゴヌクレオチド及び１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む遺伝子多型検出用試薬キットを含むものである。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
Kit In the present invention, the kit includes a wild-type detection oligonucleotide and one or two mutant detection oligonucleotides, a reverse oligonucleotide, a DNA polymerase, and a gene containing four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs). It contains a polymorphism detection reagent kit.
Each oligonucleotide may be labeled in advance with an enzyme, biotin, fluorescent substance, hapten, antigen, antibody, radioactive substance, luminophore or the like as described above.
また、キットとしては、複数の変異箇所に対応するそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマーを一つのセットとしてパッケージされていることが好ましい。
キットとしては、反応容器内にそれぞれの野生型検出用オリゴヌクレオチド及び／又は変異型検出用オリゴヌクレオチド、リバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、塩類など、試料以外の増幅に必要なものがすべて溶解された状態か、もしくは一定量の水を加えるのみで後は試料を加えるだけの反応液となる状態であることが好ましい。
また、キットのオリゴヌクレオチドの種類以外は同じ組成、含有量であることが好ましいが、本発明の、同一の増幅条件で少なくとも２箇所の異なった変異箇所の配列を検出するためには、塩類等の濃度を前述のように適宜変えることもできる。
In addition, as a kit, it is preferable that each wild type detection oligonucleotide and / or mutation detection oligonucleotide and reverse primer corresponding to a plurality of mutation sites are packaged as one set.
As a kit, each wild-type detection oligonucleotide and / or mutant-type detection oligonucleotide, reverse primer, DNA polymerase, four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), salts, etc. It is preferable that everything necessary for amplification is dissolved, or that a reaction solution is formed by adding a certain amount of water and then adding a sample.
In addition, the composition and content are preferably the same except for the type of oligonucleotide in the kit. In order to detect the sequences of at least two different mutation sites under the same amplification conditions of the present invention, salts and the like As described above, the concentration of can also be changed as appropriate.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１ アルコール脱水素酵素(ADH2 47)遺伝子多型の検出
（１）アルコール脱水素酵素遺伝子の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜７）と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。
（ ）内はTm値を示す。なお、TmはFreier S. M .et al., PNAS 83巻 (1986年) 9373-9377頁及びRychlick W., et al, NAR 18巻, (1990年) No. 21, 6409-6412頁の文献を参考にし、オリゴマーの長さを考慮した若干の改良を加えて算出した。なお、隣接エンタルピーの変化量および隣接エントロピーの変化量に関する値は、PNAS 83巻 (1986年) 3746-3750頁及び各社より公開されている値に従った。
Example 1 Detection of Alcohol Dehydrogenase (ADH2 47) Gene Polymorphism ( 1) Synthesis of Oligonucleotide that Detects Polymorphism of Alcohol Dehydrogenase Gene Using the DNA synthesizer type 392 manufactured by PerkinElmer, the phosphoramidite method was used. Thus, oligonucleotides containing the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 7 (hereinafter referred to as oligos 1 to 7) were synthesized. The synthesis was carried out according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out overnight with ammonia water at 55 ° C. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, we commissioned DNA synthesis contractors (Nippon Bioservice Co., Ltd., Sawaddy Co., Ltd., GENSET KK, Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.).
Figures in parentheses indicate Tm values. Tm refers to Freier S. M. et al., PNAS 83 (1986) 9373-9377 and Rychlick W., et al, NAR 18 (1990) No. 21, 6409-6412. Was calculated with some improvement in consideration of the length of the oligomer. In addition, the value regarding the variation | change_quantity of adjacent enthalpy and the variation | change_quantity of adjacent entropy followed the value published by PNAS 83 volume (1986) 3746-3750 and each company.
オリゴ１ 5’-GGT AGA GAA GGG CTT TAG ACT GA-3’ （63.58）
オリゴ２ 5’-GTT TAT TCA TCC GTA GCC ATG T -3’ （63.15）
オリゴ３ 5’-GGG AAA TCC TGG ATG GTG AAC -3’ （67.12）
オリゴ４ 5’-AAC CAC GTG GTC ATC TGT ACG -3’ （64.43）
オリゴ５ 5’-AAC CAC GTG GTC ATC TGT TTG -3’ （64.36）
オリゴ６ 5’-TGG CTG TAG GAA TCT GTT GC -3’ （62.59）
オリゴ７ 5’-GGT GGC TGT AGG AAT CTG TAA C -3’ （62.40）
Oligo 1 5'-GGT AGA GAA GGG CTT TAG ACT GA-3 '(63.58)
Oligo 2 5'-GTT TAT TCA TCC GTA GCC ATG T-3 '(63.15)
Oligo 3 5'-GGG AAA TCC TGG ATG GTG AAC -3 '(67.12)
Oligo 4 5'-AAC CAC GTG GTC ATC TGT ACG -3 '(64.43)
Oligo 5 5'-AAC CAC GTG GTC ATC TGT TTG -3 '(64.36)
Oligo 6 5'-TGG CTG TAG GAA TCT GTT GC -3 '(62.59)
Oligo 7 5'-GGT GGC TGT AGG AAT CTG TAA C-3 '(62.40)
オリゴ１から３はADH2遺伝子の47番目の多型を検出するためのものである。これらのオリゴは野生型、変異型何れも増幅することが可能なオリゴである。なお、すべてのオリゴは必要により標識して使用される。 Oligos 1 to 3 are for detecting the 47th polymorphism of the ADH2 gene. These oligos can amplify both wild type and mutant types. All oligos are labeled as necessary.
オリゴ４から７はADH2遺伝子の47番目の多型を検出するためのものである。
オリゴ4および６は野生型(G)を検出するためのオリゴヌクレオチドで3’末端から2番目に野生型(G)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチを有し、オリゴ５と７は変異型(A)を検出するためのオリゴヌクレオチドで3’末端から2番目に変異型(A)のヌクレオチド配列、および3番目に人為的ミスマッチを有し、オリゴ４，５がアンチセンス鎖であり、オリゴ１と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。また,オリゴ６，７がセンス鎖でありオリゴ２，３と組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。なお、すべてのオリゴは必要により標識して使用される。
Oligo 4 to 7 are for detecting the 47th polymorphism of the ADH2 gene.
Oligo 4 and 6 are oligonucleotides for detecting wild type (G), having a nucleotide sequence of wild type (G) second from the 3 ′ end, and an artificial mismatch third, and oligos 5 and 7 are Oligonucleotide for detecting variant (A), nucleotide sequence of variant (A) second from 3 'end, and artificial mismatch third, oligos 4 and 5 are antisense strands In combination with oligo 1, it is used as an oligonucleotide for amplification reaction. In addition, oligos 6 and 7 are sense strands and are used as oligonucleotides for amplification reaction in combination with oligos 2 and 3. All oligos are labeled as necessary.
また、本実施例での、オリゴ４から７の各オリゴヌクレオチドは３’末端から３番目に人為的ミスマッチを導入したが、前述のように、３〜７番目の範囲であっても良いし、さらにはこれ以外に数カ所（１〜５箇所程度でプライマーの全体長による（特に５’末端））のミスマッチが導入されていても良い。
さらに、オリゴ1-３の各オリゴヌクレオチドは伸長反応の有無を検出するのに適当な長さ等を基準に決めたものであって、対象となる遺伝子の適当な部分に対応するものであれば、本実施例の配列に限定されるものではない。
Further, in this example, each oligonucleotide of oligo 4 to 7 introduced an artificial mismatch third from the 3 ′ end, but as described above, it may be in the third to seventh range, In addition to this, mismatches at several places (about 1 to 5 places depending on the total length of the primer (particularly the 5 ′ end)) may be introduced.
Furthermore, each oligonucleotide of oligo 1-3 is determined on the basis of an appropriate length or the like for detecting the presence or absence of an extension reaction, and if it corresponds to an appropriate part of the gene of interest. The arrangement of the present embodiment is not limited.
（２）ＰＣＲ法によるアルコール脱水素酵素の47遺伝子多型の解析
＜１＞ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりADH2遺伝子多型を解析した。
(2) Analysis of 47 polymorphisms of alcohol dehydrogenase by PCR <1> Amplification reaction by PCR Using a DNA solution extracted from human leukocytes by phenol-chloroform method as a sample, add the following reagents The ADH2 gene polymorphism was analyzed under the following conditions.
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を6種類調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液ａ
オリゴ１ 5 pmol
オリゴ４ 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 2.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
The 25μl solution containing the following reagents reagents were six prepared.
Taq DNA polymerase reaction solution a
Oligo 1 5 pmol
Oligo 4 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 2.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｂ
オリゴ１ 5 pmol
オリゴ５ 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 3.5μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
Taq DNA polymerase reaction solution b
Oligo 1 5 pmol
Oligo 5 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 3.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｃ
オリゴ２ 5 pmol
オリゴ6 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 4.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
Taq DNA polymerase reaction solution c
Oligo 2 5 pmol
Oligo 6 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 4.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｄ
オリゴ２ 5 pmol
オリゴ7 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 4.5μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
Taq DNA polymerase reaction solution d
Oligo 2 5 pmol
Oligo 7 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 4.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
Taq DNAポリメラーゼ反応液e
オリゴ3 5 pmol
オリゴ6 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 3.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
Taq DNA polymerase reaction solution e
Oligo 3 5 pmol
Oligo 6 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 3.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
Taq DNAポリメラーゼ反応液f
オリゴ3 5 pmol
オリゴ7 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 3.5μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
Taq DNA polymerase reaction solution f
Oligo 3 5 pmol
Oligo 7 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 3.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
増幅条件（ａおよびｂ）
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
Amplification conditions (a and b)
95 ℃, 5 minutes
95 ℃, 30 seconds, 67.5 ℃, 30 seconds, 72 ℃, 30 seconds (35 cycles)
72 ℃ for 2 minutes.
増幅条件（ｃおよびｄ）
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
Amplification conditions (c and d)
95 ℃, 5 minutes
95 ℃, 30 seconds, 67.5 ℃, 30 seconds, 72 ℃, 30 seconds (35 cycles)
72 ℃ for 2 minutes.
増幅条件（eおよびf）
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
Amplification conditions (e and f)
95 ℃, 5 minutes
95 ℃, 30 seconds, 67.5 ℃, 30 seconds, 72 ℃, 30 seconds (35 cycles)
72 ℃ for 2 minutes.
＜２＞ポリアクリルアミドゲル電気泳動による検出
＜１＞のａ，ｂそれぞれの増幅反応液５μｌを5％ポリアクリルアミドゲルにアプライしＡＴＴＯ社電気泳動装置で１５０Ｖ-３０分間電気泳動を行った。結果は図１に示す。
<2> Detection by polyacrylamide gel electrophoresis 5 μl of each amplification reaction solution of <1> was applied to a 5% polyacrylamide gel and subjected to electrophoresis at 150 V for 30 minutes with an ATTO electrophoresis apparatus. The results are shown in FIG.
＜３＞核酸特異的結合物質による検出
＜１＞のａ，ｂそれぞれの増幅反応液3μｌを30000倍に希釈されたSyberGreenI（Molecular Probe製）の溶液100μlに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約10分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
FL（試料の蛍光強度）＝FLs-FLb （式１）
FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度
FLｓ：各試料の蛍光強度
<3> Detection by Nucleic Acid Specific Binding Substance Add 3 μl of each amplification reaction solution of a and b of <1> to 100 μl of SyberGreenI (Molecular Probe) solution diluted 30000 times and stir at room temperature in a dark room The fluorescence intensity was measured with a fluorescence plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). The time required was about 10 minutes.
From the obtained fluorescence intensity, the amount of fluorescence intensity of the sample was calculated using the following calculation formula.
FL (fluorescence intensity of sample) = FLs-FLb (Formula 1)
FLb: Negative Control (no sample added) fluorescence intensity
FLs: Fluorescence intensity of each sample
＜１＞のｃ，ｄそれぞれの増幅反応液3μｌを上記ａ，ｂと同様の条件で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。 The amount of fluorescence intensity of 3 μl of the amplification reaction solution for each of c and d in <1> was measured with a fluorescence plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) under the same conditions as in a and b above.
＜１＞のｅ，ｆそれぞれの増幅反応液3μｌを上記ａ，ｂと同様の条件で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。 The amount of fluorescence intensity of 3 μl of the amplification reaction solution for each of e and f in <1> was measured with a fluorescence plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) under the same conditions as in a and b above.
実施例２ アルコール脱水素酵素(ADH2 47)遺伝子多型の多検体測定
（１）ＰＣＲ法によるアルコール脱水素酵素の47遺伝子多型の解析
＜１＞ＰＣＲ法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりADH2遺伝子多型を解析した。なお、オリゴ1,3,4は実施例１と同様のオリゴを使用した。
Example 2 Measurement of multiple samples of alcohol dehydrogenase (ADH2 47) gene polymorphism (1) Analysis of 47 gene polymorphism of alcohol dehydrogenase by PCR <1> Amplification reaction by PCR method Phenol chloroform method from human leukocytes Using the DNA solution extracted as described above as a sample, the following reagents were added, and the ADH2 gene polymorphism was analyzed under the following conditions. Oligos 1, 3 and 4 were the same oligos as in Example 1.
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を2種類調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液ａ
オリゴ１ 5 pmol
オリゴ4 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 2.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
The 25μl solution containing the following reagents reagents were two prepared.
Taq DNA polymerase reaction solution a
Oligo 1 5 pmol
Oligo 4 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 2.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
Taq DNAポリメラーゼ反応液ｂ
オリゴ１ 5 pmol
オリゴ5 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 3.5μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
Taq DNA polymerase reaction solution b
Oligo 1 5 pmol
Oligo 5 5 pmol
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 3.5 μl
Taq DNA polymerase 1.3 U
Extracted DNA solution 20 ng
増幅条件
95℃・5分
95℃・30秒、67.5℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
Amplification conditions
95 ℃, 5 minutes
95 ℃, 30 seconds, 67.5 ℃, 30 seconds, 72 ℃, 30 seconds (35 cycles)
72 ℃ for 2 minutes.
＜２＞ 核酸特異的結合物質による検出
＜１＞のそれぞれの増幅反応液3μｌを30000倍に希釈されたSyberGreenI（Molecular Probe製）の溶液100μlに加えて、室温にて攪拌後に暗室中で蛍光プレートリーダー（大日本製薬社）で蛍光強度量を測定した。所要時間は約10分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
FL（試料の蛍光強度）＝FLs-FLb （式１）
FLｂ：Negative Control （試料が未添加）の蛍光強度
FLｓ：各試料の蛍光強度
<2> Detection with a nucleic acid-specific binding substance 3 μl of each amplification reaction solution of <1> is added to 100 μl of a solution of SyberGreenI (manufactured by Molecular Probe) diluted 30000 times, and stirred at room temperature, followed by a fluorescent plate in a dark room The amount of fluorescence intensity was measured with a reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). The time required was about 10 minutes.
From the obtained fluorescence intensity, the amount of fluorescence intensity of the sample was calculated using the following calculation formula.
FL (fluorescence intensity of sample) = FLs-FLb (Formula 1)
FLb: Negative Control (no sample added) fluorescence intensity
FLs: Fluorescence intensity of each sample
上記のように、オリゴヌクレオチドを用いて、塩基多型特異的増幅反応を行い、増幅反応物質を核酸特異的結合物質を用いて測定することで、容易にかつ迅速に遺伝子型を明確に判定することができた。 As described above, a nucleotide polymorphism-specific amplification reaction is performed using an oligonucleotide, and the amplification reaction substance is measured using a nucleic acid-specific binding substance, so that the genotype can be clearly and easily determined. I was able to.
上述したように、本発明により、試料核酸中の遺伝子多型を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要とせ ず、遺伝子多型を迅速かつ容易に判定することができる。また、本発明の方法は非特異的な反応を抑え、効果的に増幅反応させることができる。 As described above, the present invention provides a method that can clearly and easily detect a gene polymorphism in a sample nucleic acid. In the method of the present invention, the genetic polymorphism can be determined quickly and easily without requiring complicated operations as in the conventional methods. In addition, the method of the present invention can suppress non-specific reactions and effectively carry out amplification reactions.
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