JP4235902B2 - Nucleotide polymorphism identification method - Google Patents
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Description
本発明は、核酸配列の変異または多型の同定方法に関する。本発明は、遺伝病の診断、塩基多型解析等に際して特に有用である。 The present invention relates to a method for identifying a mutation or polymorphism in a nucleic acid sequence. The present invention is particularly useful for diagnosis of genetic diseases, nucleotide polymorphism analysis, and the like.
本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。遺伝子の塩基多型は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変動の原因として重要な役割を果たし、体質として知られる基礎代謝等の個人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとしての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチンの表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推奨される（GramおよびBrsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, 第８７〜９６頁; Balantら、 Eur. J. Clin. Pharmacol. 第３６巻、第５５１〜５５４頁、(1989)）。また、原因となる変異型遺伝子の同定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。 In the present invention, the nucleotide polymorphism means having a nucleotide sequence different from the wild type. The nucleotide polymorphism of a gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism, and is also known as a cause of individual differences such as basic metabolism known as constitution. In addition, they also serve as genetic markers for a number of diseases. Therefore, elucidation of these mutations is clinically important and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical research (Gram and Brsen, European Consensus Conference on Pharmacogenetics. Commission of the European Communities, Luxembourg, 1990, pp. 87-96; Balant et al., Eur. J. Clin. Pharmacol. 36, 551-554 (1989)). In addition, a nucleic acid sequence analysis method for detecting each genotype following identification of the causative mutant gene is desired.
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。 As a conventional nucleic acid sequence analysis technique, for example, there is a nucleic acid sequencing method (sequencing method). Nucleic acid sequencing can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences, but requires a great deal of effort to prepare template nucleic acids, DNA polymerase reaction, polyacrylamide gel electrophoresis, analysis of nucleic acid sequences, etc. And time is needed. Further, labor can be saved by using a recent automatic sequencer, but there is a problem that an expensive apparatus is required.
一方、遺伝子の点突然変異により引き起こされる遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。 On the other hand, there are various known genetic diseases caused by point mutations in genes, and some of them know which part of the gene and how point mutations cause genetic diseases. Not a few.
このような予想される点突然変異を検出する方法として、従来より、ＰＣＲ（polymerase chain reaction)法（特公平４−６７９６０号公報、特公平４−６７９５７号公報）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の点突然変異の検出方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうちの一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。 As a method for detecting such an expected point mutation, a gene amplification method such as a PCR (polymerase chain reaction) method (Japanese Patent Publication No. 4-67960 and Japanese Patent Publication No. 4-67957) has been conventionally used. Methods for detecting point mutations in genes are known. In this method, as one of the pair of oligonucleotides used in the gene amplification method, a wild-type oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the wild-type gene amplification region and the mutant-type gene amplification A mutant oligonucleotide that is completely complementary to the end region of the region is used. Mutant oligonucleotides have nucleotides complementary to the predicted point mutation at the 3 'end. Such wild-type and mutant-type oligonucleotides are separately used to subject the sample gene to the gene amplification method.
試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、UV照射して増幅核酸の有無を検出できる。またほかの様式として、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法などが開発されてきた。 If the sample gene is wild-type, nucleic acid amplification occurs when a wild-type oligonucleotide is used, but if a mutant-type oligonucleotide is used, the 3 ′ end of the oligonucleotide corresponds to the sample gene. Since it is not complementary to the nucleotide (mismatch), no extension reaction occurs, and no nucleic acid amplification occurs. On the other hand, if the sample gene is a mutant type, conversely, amplification does not occur when the wild-type oligonucleotide is used, and amplification occurs when the mutant-type oligonucleotide is used. Therefore, by examining whether amplification occurs when using each oligonucleotide, it is possible to determine whether the sample gene is a wild type or a mutant type, thereby identifying a point mutation in the sample gene. Can do. As a method to check whether amplification occurred at this time, after amplifying the amplified product with agarose gel, staining with a nucleic acid-specific binding fluorescent reagent such as ethidium bromide, and then irradiating with UV, the presence of amplified nucleic acid is detected. it can. Other methods include Southern blotting, in which amplified nucleic acid is immobilized on a nylon membrane and detected using a labeled probe, sandwich hybridization in which a detection probe is used after capturing with a supplementary probe immobilized on an individual carrier. Laws have been developed.
また最近開発された検出方法は、プローブのハイブリッド形成の検出に蛍光強度を直接検出するのではなく、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FＲET)の方法を利用している。蛍光共鳴エネルギー移動は、ドナー蛍光体と消光剤色素(蛍光体でも、蛍光体でなくてもよい。)の間で発生し、一方(消光剤)の吸収スペクトルがもう一方(ドナー)の発光スペクトルとオーバーラップし、この2つの色素が近接したときに発生する。これらの特性を有する色素は、ドナー/消光剤色素対またはエネルギー移動色素対と呼ばれる。 In addition, recently developed detection methods do not directly detect fluorescence intensity for detection of probe hybridization, but use a fluorescence resonance energy transfer (FRET) method. Fluorescence resonance energy transfer occurs between the donor phosphor and the quencher dye (either phosphor or not), the absorption spectrum of one (quencher) being the emission spectrum of the other (donor) Occurs when the two dyes come close to each other. Dyes with these properties are called donor / quencher dye pairs or energy transfer dye pairs.
ドナー蛍光体の励起状態エネルギーは、共鳴双極子により引き起こされる双極子相互作用により、近くの消光剤に移動される。その結果、ドナー蛍光体の消光が起こる。場合によっては、消光剤も蛍光体の場合、その蛍光強度が増強されることもある。エネルギー移動効率は、ドナーと消光剤の距離に高度に依存しており、これらの関係を予測する式がForster(1948. Ann. Phys.2, 55-75)により開発されている。エネルギー移動効率が50％であるドナーと消光剤色素の距離はForster距離(Ro)と呼ばれる。蛍光消光の機序として他に、例えば、電荷移動消光および衝突消光等がある。 The excited state energy of the donor phosphor is transferred to a nearby quencher due to the dipole interaction caused by the resonant dipole. As a result, quenching of the donor phosphor occurs. In some cases, when the quencher is also a phosphor, the fluorescence intensity may be enhanced. Energy transfer efficiency is highly dependent on the distance between the donor and the quencher, and Forster (1948. Ann. Phys. 2, 55-75) has developed a formula to predict these relationships. The distance between the donor and the quencher dye with an energy transfer efficiency of 50% is called the Forster distance (Ro). Other mechanisms for fluorescence quenching include, for example, charge transfer quenching and collisional quenching.
近接する2つの色素の相互作用により消光を引き起こすことに基づくエネルギー移動とその他の機序は、均一方式で実施できるため、ヌクレオチド配列を検出または同定する魅力的な手段である。均一分析方式は、1つの蛍光体標識の蛍光の検出に基づく従来のプローブハイブリッド形成分析法よりも簡単である。なぜならば、一般に、不均一分析はハイブリッド形成していない遊離標識からハイブリッド形成した標識を分離する更なるステップを必要とするからである。典型的には、FＲETおよび関連方法は、2つの相補的オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成により結合された時に、一方または両方の色素標識の蛍光特性の変化を監視することに基づくものである。この方式において、蛍光特性の変化は、エネルギー移動量の変化として、あるいは蛍光消光量の変化として測定され、典型的には、一方の色素の蛍光強度の増加として示される。 Energy transfer and other mechanisms, which are based on causing quenching by the interaction of two adjacent dyes, can be performed in a uniform manner and are therefore attractive means of detecting or identifying nucleotide sequences. The homogeneous analysis method is simpler than the conventional probe hybridization analysis method based on the detection of the fluorescence of one phosphor label. This is because, generally, heterogeneous analysis requires a further step of separating the hybridized label from the unhybridized free label. Typically, FRET and related methods are based on monitoring changes in the fluorescence properties of one or both dye labels when two complementary oligonucleotides are combined by hybridization. In this method, the change in the fluorescence characteristics is measured as a change in the amount of energy transfer or a change in the fluorescence extinction amount, and is typically indicated as an increase in the fluorescence intensity of one of the dyes.
この方法においては、ハイブリッド形成しないオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを分離せずに、目的のヌクレオチド配列を検出することが可能である。一方はドナー蛍光体で、もう一方は消光剤で標識された2つの別々の相補的オリゴヌクレオチドの間でハイブリッド形成を生じることができる。 In this method, it is possible to detect the target nucleotide sequence without separating the hybridized oligonucleotide from the non-hybridized oligonucleotide. Hybridization can occur between two separate complementary oligonucleotides, one with a donor fluorophore and the other with a quencher.
この時一方のオリゴヌクレオチドを塩基多型特異的配列を有する場合多型特異的にＦＲＥＴシグナルが得られることで塩基多型の同定が可能となる。FＲETハイブリッド形成分析法に関する幾つかの方式が、Nonisotopic DNA Probe Techniques(1992. Academic Press, Inc., pags. 311-352)に概説されている。あるいは、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成していない場合と、相補的配列とハイブリッド形成した場合とで、一方または両方の蛍光特性に検出可能な差が生じるように、ドナーと消光剤を1つのオリゴヌクレオチドに結合させることができる。この方式においては、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成するとドナー蛍光は増加し、エネルギー移動/消光は減少する。例えば、両端に標識された自己相補的オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形成すると、これによって2つの蛍光体(即ち、5'末端と3’末端)が近接し、エネルギー移動と消光が起こる。自己相補的オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドの中の相補的配列がハイブリッド形成すると、ヘアピン構造は破壊され、2つの色素間距離が拡大するため消光は減少する。 At this time, when one oligonucleotide has a base polymorphism-specific sequence, the base polymorphism can be identified by obtaining a FRET signal specifically for the polymorphism. Several schemes for FRET hybridization analysis are outlined in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992. Academic Press, Inc., pags. 311-352). Alternatively, the donor and quencher can be combined into one oligonucleotide so that there is a detectable difference in one or both fluorescent properties when the oligonucleotide is not hybridized and when it is hybridized to a complementary sequence. Can be combined. In this manner, typically the donor fluorescence increases and the energy transfer / quenching decreases when the oligonucleotides are hybridized. For example, when self-complementary oligonucleotides labeled at both ends form a hairpin structure, this brings two phosphors in close proximity (ie, the 5 ′ end and the 3 ′ end), causing energy transfer and quenching. When the complementary sequences in the self-complementary oligonucleotide and the second oligonucleotide hybridize, the hairpin structure is destroyed and quenching is reduced due to the increased distance between the two dyes.
ヘアピン構造の欠点は、安定性が非常に高く、非消光ハイブリッド形成型への変換がしばしば遅く、僅かにそちらに偏るだけで、一般的に性能は低い。TyagiおよびKramer(1996.Nature Biotech.14, 303-308)は、ステムを形成するヘアピン構造の自己相補的アームの間のループ中に検出配列を含む上記の様に標識されたヘアピン構造を報告している。塩基対合したステムは、検出配列が標的とハイブリッド形成し、消光の減少を引き起こすためには融解しなくてはならない。「二重ヘアピン」プローブとそれを利用する方法が、B. Bagwell, et al. (1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425;米国特許No.5,607,834)に報告されている。これらの構造はヘアピン構造内に標的結合配列を含んでおり、従って、標的とヘアピン構造の自己相補的配列との間に競合的ハイブリッド形成が関与している。Bagwellは、ミスマッチによりヘアピン構造を不安定化させることにより、不利なハイブリッド形成速度論の問題を解決している。 The disadvantages of the hairpin structure are very stable, the conversion to the non-quenching hybrid form is often slow, and only slightly biased there is generally poor performance. Tyagi and Kramer (1996.Nature Biotech. 14, 303-308) report a hairpin structure labeled as described above that contains a detection sequence in the loop between the self-complementary arms of the hairpin structure forming the stem. ing. The base paired stem must melt in order for the detection sequence to hybridize with the target and cause a decrease in quenching. A “double hairpin” probe and methods utilizing it are reported in B. Bagwell, et al. (1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425; US Pat. No. 5,607,834). These structures contain a target binding sequence within the hairpin structure, and thus competitive hybridization is involved between the target and the self-complementary sequence of the hairpin structure. Bagwell solves the disadvantageous hybridization kinetics problem by destabilizing the hairpin structure by mismatch.
標的結合配列に塩基多型特異的配列を選択することでこの方法を用いて塩基多型の同定が可能であるが、一般的に１塩基の違いをオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション法により見分けるためには厳密なハイブリダイゼーション条件の設定が必要となる。 By selecting a nucleotide polymorphism-specific sequence as the target binding sequence, it is possible to identify nucleotide polymorphisms using this method. Generally, in order to distinguish a single nucleotide difference by oligonucleotide hybridization methods, Strict hybridization conditions must be set.
核酸増幅を検出するためにエネルギー移動またはその他の蛍光消光の機序を利用する均一方法も報告されている。L. G. Lee, et al. (1993. Nuc. Acids Res.21, 3761-3766)は、PCR中に標的増幅に特異的に二重標識検出プローブが切断されるリアルタイム検出方法を開示している。検出プローブが増幅プライマーの下流でハイブリッド形成されると、Taqポリメラーゼの5'-3’エキソヌクレアーゼ活性が検出プローブを消化し、エネルギー移動対を形成する2つの蛍光色素を分離する。
この方法においても二重標識検出プローブを塩基多型特異的プローブとすることで塩基多型の同定が可能である。
Uniform methods that utilize energy transfer or other fluorescence quenching mechanisms to detect nucleic acid amplification have also been reported. LG Lee, et al. (1993. Nuc. Acids Res. 21, 3761-3766) discloses a real-time detection method in which a dual-labeled detection probe is cleaved specifically for target amplification during PCR. When the detection probe is hybridized downstream of the amplification primer, the 5′-3 ′ exonuclease activity of Taq polymerase digests the detection probe and separates the two fluorescent dyes that form an energy transfer pair.
Also in this method, the base polymorphism can be identified by using the double-labeled detection probe as a base polymorphism-specific probe.
標識された多型部位特異プローブと、そのプローブに隣接してドナー標識体を有するプローブの２本を用いて検出する方法も知られている。（Rapid Cycle Real-Time PCR Methods and Applications(2001)91-96）この時多型特異プローブの標識とドナー標識との組み合わせで２種類のFRETシグナルを検出することで多型を同定できる。この方法も、上述したように、１塩基の違いをオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション法により見分けるためには厳密なハイブリダイゼーション条件の設定が必要となるし、標識した４本のプローブが必要となる。またこの変法として１種類の標識した多型特異部位特異プローブとドナー標識プローブをハイブリさせた後、昇温して多型部位特異プローブの１本鎖に分離する温度で多型を同定する方法も知られている（Analytical Biochemistry 255, 101-107(1998)）。しかしこれらの方法においては、標識した多型部位特異プローブとドナー標識したプローブの２本必要であり、ドナープローブの１本鎖への解離も制御しなくてはならない。 A method of detecting using a labeled polymorphic site-specific probe and a probe having a donor label adjacent to the probe is also known. (Rapid Cycle Real-Time PCR Methods and Applications (2001) 91-96) At this time, the polymorphism can be identified by detecting two types of FRET signals by combining the label of the polymorphism-specific probe and the donor label. Also in this method, as described above, in order to distinguish the difference of one base by the oligonucleotide hybridization method, it is necessary to set strict hybridization conditions and four labeled probes are required. In addition, as a modified method, after one type of labeled polymorphic site-specific probe and a donor-labeled probe are hybridized, the polymorphism is identified at a temperature at which the temperature is raised and separated into single strands of the polymorphic site-specific probe Are also known (Analytical Biochemistry 255, 101-107 (1998)). However, these methods require two labeled polymorphic site-specific probes and a donor-labeled probe, and the dissociation of the donor probe into a single strand must also be controlled.
核酸特異標識としてインターカーレーターと標的核酸にハイブリしたプローブの蛍光標識とのFRETによる標的核酸の検出法もHeller、Cardullo、Morrisonなどにより開示されている（例えば、非特許文献１、２、３参照）。しかしMorissonらはインターカーレータ−はプローブとハイブリした部分以外にも非特異的に結合するのでノイズが高くなることを報告している。
A method for detecting a target nucleic acid by FRET using an intercalator and a fluorescent label of a probe hybridized with the target nucleic acid as a nucleic acid-specific label is also disclosed by Heller, Cardullo, Morrison, etc. (see, for example,
サイバーグリーンとCy5標識プローブによるFRETによる検出方法も開示されている（特許文献１参照）。しかしサイバーグリーンとCy5標識プローブによるFRETはノイズが高く実用的でないことも報告されている（例えば、非特許文献４参照）。 A detection method by FRET using Cyber Green and Cy5 labeled probe is also disclosed (see Patent Document 1). However, it has also been reported that FRET using Cyber Green and Cy5 labeled probes is noisy and impractical (see, for example, Non-Patent Document 4).
上記のような方法により増幅核酸を検出し、容易に多型を同定が行えるように思われるが、実際には、従来の方法では操作は煩雑であり、その為に安定した野生型シグナルと多型シグナルをとる解析が困難となり、正確な多型を同定するには多大な作業が必要であった。
たとえば電気泳動法によれば野生型及び多型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。
Although it seems that the amplified nucleic acid can be detected by the method as described above and the polymorphism can be easily identified, in practice, the conventional method is complicated, and for this reason, stable wild-type signal and polymorphism are Analysis using a type signal has become difficult, and a great deal of work has been required to identify an accurate polymorphism.
For example, according to the electrophoresis method, it is necessary to separately detect the wild type and the polymorphism, and it is difficult to accurately quantify the amount of nucleic acid from the electrophoretic image. Further, Southern blotting and sandwich hybridization require a hybridization reaction with a probe, and the conditions must be strictly adjusted. Furthermore, a process for removing excess probes is required, and the operation is very complicated.
またＦＲＥＴを用いた方法は均一分析が可能であり過剰なプローブの除去等が不必要で検出が容易になっているが、各多型特異的に、異なる標識を付与した２本のオリゴヌクレオチドプローブが必要であったり、二重標識プローブが必要である。また上述したようにサイバーグリーンとCy5標識プローブによる方法も開示されているがノイズが高く実用的でないことも報告され、遺伝子多型の検出に実用出来るかは疑問視されていた。 In addition, the method using FRET is capable of homogeneous analysis and does not require the removal of excess probes and is easy to detect. However, two oligonucleotide probes with different labels specific to each polymorphism. Or a dual-labeled probe is required. In addition, as described above, a method using cyber green and a Cy5-labeled probe has been disclosed, but it has been reported that it is noisy due to high noise, and it has been questioned whether it can be used for detection of genetic polymorphisms.
本発明の目的は、上記のような課題を解決して、明確にかつ再現性よく核酸配列中の多型を検出することができる方法及びそのための試薬を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method and a reagent therefor that can solve the above-described problems and detect a polymorphism in a nucleic acid sequence clearly and reproducibly.
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、上記の従来法に対して、特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、標識されている野生型用または変異型用オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、核酸特異標識を作用させて、該オリゴヌクレオチドの標識と核酸特異標識との相互作用を検出して塩基多型を同定する方法において、ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドが１本鎖に分離する条件が塩基多型により異なることを測定することで、煩雑な検出操作や高価な標識プローブを多数必要とせずまた容易に、明確な多型同定が可能となる方法を見出し、本発明を完成させるに至った。 In view of the above circumstances, the present inventors, as a result of intensive studies, compared to the conventional method described above, a labeled wild-type or mutant-type oligonucleotide was added to a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphism site. In the method of identifying a nucleotide polymorphism by detecting a interaction between a label of the oligonucleotide and a nucleic acid-specific label by applying a nucleic acid-specific label after hybridization, the hybridized oligonucleotide is single-stranded. By measuring that the conditions for separation into different polymorphisms are measured, a method that enables easy and clear polymorphism identification without requiring a complicated detection operation and a large number of expensive labeled probes has been found. It came to complete.
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、標識されている野生型用または変異型用オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、核酸特異標識を作用させて、該オリゴヌクレオチドの標識と核酸特異標識との相互作用を検出して塩基多型を同定する方法において、ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドが１本鎖に分離する条件が塩基多型により異なることを用いることを特徴とする方法。
That is, the present invention has the following configuration.
(1) After hybridizing a labeled wild-type or mutant-type oligonucleotide to a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample, a nucleic acid-specific label is allowed to act on the oligo A method for identifying a nucleotide polymorphism by detecting an interaction between a nucleotide label and a nucleic acid-specific label, wherein the condition for separating the hybridized oligonucleotide into a single strand is different depending on the nucleotide polymorphism. And how to.
（２）核酸特異標識が２本鎖核酸特異的であることを特徴とする（１）に記載の方法。 (2) The method according to (1), wherein the nucleic acid-specific label is specific to a double-stranded nucleic acid.
（３）核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする（１）及び（２）に記載の方法。 (3) The method according to (1) or (2), wherein the nucleic acid-specific label is a fluorescent dye.
（４）核酸特異標識の蛍光色素が500〜600nmの蛍光波長域を有する蛍光色素である事を特徴とする（１）〜（３）に記載の方法。 (4) The method according to (1) to (3), wherein the fluorescent dye for nucleic acid-specific labeling is a fluorescent dye having a fluorescent wavelength region of 500 to 600 nm.
（５）オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする（１）〜（４）に記載の方法。 (5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the oligonucleotide is labeled with a fluorescent dye.
（６）オリゴヌクレオチドの蛍光標識が520〜580nmの励起波長域を有する蛍光色素である事を特徴とする（１）〜（５）に記載の方法。 (6) The method according to (1) to (5), wherein the fluorescent label of the oligonucleotide is a fluorescent dye having an excitation wavelength range of 520 to 580 nm.
（７）オリゴヌクレオチドの蛍光標識が580nm以上の最大蛍光波長を有する蛍光色素である事を特徴とする（１）〜（６）に記載の方法 (7) The method according to (1) to (6), wherein the fluorescent label of the oligonucleotide is a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 580 nm or more.
（８）相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする（１）〜（７）に記載の方法。 (8) The method according to any one of (1) to (7), wherein the interaction is fluorescence resonance energy transfer.
（９）ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドを１本鎖に分離する条件が温度であることを特徴とする（１）〜（８）に記載の方法。
（１０）試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする（１）〜（９）に記載の方法。
(9) The method according to (1) to (8), wherein the condition for separating the hybridized oligonucleotide into single strands is temperature.
(10) The method according to (1) to (9), wherein a specific nucleic acid sequence contained in the sample is amplified in advance.
（１１）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも増幅用オリゴヌクレオチド、標識されている野生型用または変異型用オリゴヌクレオチド、核酸特異標識が含まれている反応溶液を作用させ、増幅反応を行った後、予め含まれている標識オリゴヌクレオチドと核酸特異標識を用いて塩基多型を同定することを特徴とする（１）〜（９）に記載の方法。 (11) A reaction solution in which a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample contains at least an amplification oligonucleotide, a labeled wild-type or mutant oligonucleotide, and a nucleic acid-specific label The method according to any one of (1) to (9), wherein the nucleotide polymorphism is identified using a labeled oligonucleotide and a nucleic acid-specific label that are contained in advance after performing an amplification reaction.
（１２） 反応溶液にＤＮＡポリメラーゼが含まれていることを特徴とする（１１）に記載の方法。 (12) The method according to (11), wherein the reaction solution contains DNA polymerase.
（１３） 反応溶液に含まれるＤＮＡポリメラーゼが実質的に５‘エキソヌクレアーゼ活性を有しないことを特徴とする（１１）及び（１２）に記載の方法。 (13) The method according to (11) or (12), wherein the DNA polymerase contained in the reaction solution has substantially no 5 'exonuclease activity.
（１４）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、標識されている野生型用または変異型用オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた後、核酸特異標識を作用させて、該オリゴヌクレオチドの標識と核酸特異標識との相互作用を検出して塩基多型を同定する方法において、反応液を徐々に昇温して、ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドが１本鎖に分離する温度が塩基多型により異なることを特徴とする方法。 (14) After a labeled wild-type or mutant-type oligonucleotide is hybridized to a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample, a nucleic acid-specific label is allowed to act on the oligo In the method for detecting a nucleotide polymorphism by detecting the interaction between a nucleotide label and a nucleic acid-specific label, the temperature at which the hybridized oligonucleotide is separated into single strands is gradually increased by raising the temperature of the reaction solution. A method characterized by different polymorphisms.
（１５） 核酸特異標識が２本鎖核酸特異的であることを特徴とする（１４）に記載の方法。 (15) The method according to (14), wherein the nucleic acid-specific label is specific to a double-stranded nucleic acid.
（１６） 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする（１４）及び（１５）に記載の方法。 (16) The method according to (14) or (15), wherein the nucleic acid-specific label is a fluorescent dye.
（１７） 核酸特異標識の蛍光色素が500〜600nmの蛍光波長域を有する蛍光色素である事を特徴とする請求項１４〜１６に記載の方法。 (17) The method according to any one of (14) to (16), wherein the fluorescent dye of the nucleic acid-specific label is a fluorescent dye having a fluorescent wavelength region of 500 to 600 nm.
（１８）オリゴヌクレオチドの標識が蛍光色素である事を特徴とする（１４）〜（１７）に記載の方法。 (18) The method according to any one of (14) to (17), wherein the oligonucleotide is labeled with a fluorescent dye.
（１９） オリゴヌクレオチドの蛍光標識が520〜580nmの励起波長域を有する蛍光色素である事を特徴とする（１４）〜（１８）に記載の方法。 (19) The method according to (14) to (18), wherein the fluorescent label of the oligonucleotide is a fluorescent dye having an excitation wavelength range of 520 to 580 nm.
（２０）オリゴヌクレオチドの蛍光標識が580nm以上の最大蛍光波長を有する蛍光色素である事を特徴とする（１４）〜（１９）に記載の方法 (20) The method according to (14) to (19), wherein the fluorescent label of the oligonucleotide is a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 580 nm or more.
（２１）相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする（１４）〜（２０）に記載の方法。 (21) The method according to (14) to (20), wherein the interaction is fluorescence resonance energy transfer.
（２２）試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする（１４）〜（２１）に記載の方法。 (22) The method according to (14) to (21), wherein a specific nucleic acid sequence contained in the sample is amplified in advance.
（２３）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも増幅用オリゴヌクレオチド、標識されている野生型用または変異型用オリゴヌクレオチド、核酸特異標識が含まれている反応溶液を作用させ、増幅反応を行った後、予め含まれている該標識オリゴヌクレオチドと核酸特異標識を用いて塩基多型を同定することを特徴とする（１４）〜（２１）に記載の方法。 (23) A reaction solution in which a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample contains at least an amplification oligonucleotide, a labeled wild-type or mutant oligonucleotide, and a nucleic acid-specific label The method according to any one of (14) to (21), wherein the nucleotide polymorphism is identified using the labeled oligonucleotide and the nucleic acid-specific label that are contained in advance after performing the amplification reaction.
（２４）反応溶液にＤＮＡポリメラーゼが含まれていることを特徴とする（２３）に記載の方法。 (24) The method according to (23), wherein the reaction solution contains DNA polymerase.
（２５）反応溶液に含まれるＤＮＡポリメラーゼが実質的に５‘エキソヌクレアーゼ活性を有しないことを特徴とする（２３）及び（２４）に記載の方法。 (25) The method according to (23) or (24), wherein the DNA polymerase contained in the reaction solution has substantially no 5 'exonuclease activity.
（２６） 試料中に含まれる特定核酸配列に存在する塩基多型を同定する方法において、以下の行程、
１）１本鎖状態の標的核酸に蛍光標識されている野生型用オリゴヌクレオチド又は変異型用オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
２）２本鎖核酸特異的蛍光色素を作用させ、該蛍光色素とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの標識との相互作用による蛍光信号を測定する。
３）徐々に温度を上げながら、蛍光信号の変化を測定し該オリゴヌクレオチドが１本鎖に分離する温度を測定する。
を含むことを特徴とする方法。
(26) In a method for identifying a base polymorphism present in a specific nucleic acid sequence contained in a sample, the following steps are carried out:
1) A wild-type oligonucleotide or a mutant-type oligonucleotide that is fluorescently labeled is hybridized to a target nucleic acid in a single-stranded state.
2) A fluorescent signal specific to a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye is allowed to act, and a fluorescence signal due to interaction with the label of the oligonucleotide hybridized with the fluorescent dye is measured.
3) While gradually raising the temperature, the change in the fluorescence signal is measured and the temperature at which the oligonucleotide is separated into single strands is measured.
A method comprising the steps of:
（２７） ２本鎖核酸特異標識の蛍光色素が500〜600nmの蛍光波長域を有する蛍光色素である事を特徴とする（２６）に記載の方法。 (27) The method according to (26), wherein the fluorescent dye having a double-stranded nucleic acid-specific label is a fluorescent dye having a fluorescent wavelength region of 500 to 600 nm.
（２８）オリゴヌクレオチドの蛍光標識が520〜580nmの励起波長域を有する蛍光色素である事を特徴とする（２６）および（２７）に記載の方法。 (28) The method according to (26) or (27), wherein the fluorescent label of the oligonucleotide is a fluorescent dye having an excitation wavelength range of 520 to 580 nm.
（２９） オリゴヌクレオチドの蛍光標識が580nm以上の最大蛍光波長を有する蛍光色素である事を特徴とする（２６）〜（２８）に記載の方法 (29) The method according to (26) to (28), wherein the fluorescent label of the oligonucleotide is a fluorescent dye having a maximum fluorescence wavelength of 580 nm or more.
（３０）相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする（２６）〜（２９）に記載の方法。 (30) The method according to any one of (26) to (29), wherein the interaction is fluorescence resonance energy transfer.
（３１）試料中に含まれる特定の核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする（２６）〜（３０）に記載の方法。 (31) The method according to (26) to (30), wherein a specific nucleic acid sequence contained in the sample is amplified in advance.
（３２）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、少なくとも増幅用オリゴヌクレオチド、標識されている野生型用または変異型用オリゴヌクレオチド、核酸特異標識が含まれている反応溶液を作用させ、増幅反応を行った後、予め含まれている該標識オリゴヌクレオチドと核酸特異標識を用いて塩基多型を同定することを特徴とする（２６）〜（３０）に記載の方法。 (32) A reaction solution in which a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample contains at least an amplification oligonucleotide, a labeled wild-type or mutant oligonucleotide, and a nucleic acid-specific label The method according to any one of (26) to (30), wherein the nucleotide polymorphism is identified using the labeled oligonucleotide and the nucleic acid-specific label, which are contained in advance, after performing the amplification reaction.
（３３）反応溶液にＤＮＡポリメラーゼが含まれていることを特徴とする（３２）に記載の方法。 (33) The method according to (32), wherein the reaction solution contains DNA polymerase.
（３４）反応溶液に含まれるＤＮＡポリメラーゼが実質的に５‘エキソヌクレアーゼ活性を有しないことを特徴とする（３２）及び（３３）に記載の方法。 (34) The method according to (32) or (33), wherein the DNA polymerase contained in the reaction solution has substantially no 5 'exonuclease activity.
本発明の方法により、煩雑な操作を経ることなく、また反応液の添加や反応容器の開閉等なく、容易にかつ迅速に標的核酸遺伝子多型を明確に判定することができる。 By the method of the present invention, the target nucleic acid gene polymorphism can be clearly and easily determined without complicated operations and without adding a reaction solution or opening / closing a reaction vessel.
以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子が挙げられる。例えば、高血圧としてＡＣＥ(Angiotensin I Converting Enzyme)遺伝子が挙げられる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The chromosome or fragment thereof containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample is not particularly limited as long as it is a target nucleic acid including a nucleotide polymorphic site that bears information on the target gene. Examples of the target nucleic acid include Alu sequences, exons of genes encoding proteins, introns, promoters, and the like. More specifically, genes related to various diseases including genetic diseases, drug metabolism, lifestyle-related diseases (hypertension, diabetes, etc.) can be mentioned. For example, an ACE (Angiotensin I Converting Enzyme) gene is mentioned as high blood pressure.
本発明において、核酸配列を単に核酸ということがある。変異型核酸とは、野生型核酸のうち少なくとも１つ、好ましくは１つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことであり、どの部位のヌクレオチドが変異しているかが解明されているものである。このような塩基多型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の核酸がこのような予想される変異を有しているか否かを検査する方法である。 In the present invention, the nucleic acid sequence may be simply referred to as a nucleic acid. Mutant nucleic acids are those in which at least one of wild-type nucleic acids, preferably one nucleotide is point-mutated and replaced with other nucleotides, or inserted or deleted sequences in a part of wild-type nucleic acid, etc. It has been elucidated which part of the nucleotide is mutated. It has been elucidated that the constitution is different depending on such base polymorphism, and the method of the present invention is a method for examining whether or not a nucleic acid in a sample has such an expected mutation. is there.
本発明において、野生型オリゴヌクレオチドまたは変異型オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる反応とは一般的に、一本鎖に変性した標的核酸にオリゴヌクレオチドを作用させ、２本鎖を形成させることを含む。 In the present invention, the reaction of hybridizing a wild type oligonucleotide or a mutant type oligonucleotide generally includes causing the oligonucleotide to act on a target nucleic acid denatured into a single strand to form a double strand.
本発明において、野生型用オリゴヌクレオチドとは、通常の表現型を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、変異型用オリゴヌクレオチドとは、野生型とは異なる配列を有している塩基多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。るオリゴヌクレオチドの長さとしては、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩基である。 In the present invention, the wild-type oligonucleotide is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome containing a base polymorphism site having a normal phenotype or a fragment thereof, Is an oligonucleotide having a sequence complementary to a chromosome containing a nucleotide polymorphism site having a sequence different from the wild type or a fragment thereof. The length of the oligonucleotide is 13 to 35 bases, preferably 16 to 30 bases.
本発明においては、上記野生型用オリゴヌクレオチド又は変異型用オリゴヌクレオチドのどちらかを試料に作用させる。この時、どちらのオリゴヌクレオチドを作用させても、野生型配列及び変異型配列の両方に、オリゴヌクレオチドがハイブリするような条件で作用させる。例えば50%溶解温度が70℃であるオリゴヌクレオチドを50℃で作用させた場合、野生型及び変異型の配列を区別することなくオリゴヌクレオチドはハイブリして２本鎖を形成する。この後、オリゴヌクレオチドが核酸配列から分離して１本鎖に戻るような条件を与えたときに、野生型配列と、変異型配列にハイブリしたオリゴヌクレオチドが１本鎖になる条件が異なっておりその差異を測定することで塩基多型を同定することができる。 In the present invention, either the wild-type oligonucleotide or the mutant-type oligonucleotide is allowed to act on the sample. At this time, whichever oligonucleotide is allowed to act, it is allowed to act under conditions such that the oligonucleotide hybridizes to both the wild type sequence and the mutant type sequence. For example, when an oligonucleotide having a 50% dissolution temperature of 70 ° C. is allowed to act at 50 ° C., the oligonucleotide hybridizes to form a double strand without distinguishing between the wild type and mutant sequences. After this, when conditions are given such that the oligonucleotide is separated from the nucleic acid sequence and returns to single strand, the conditions for the oligonucleotide hybridized to the wild type sequence and the mutant sequence to become single strand are different. Nucleotide polymorphism can be identified by measuring the difference.
本発明においてオリゴヌクレオチドを１本鎖に分離する条件としては、温度、ｐＨ、電気等があるが核酸の２本鎖を１本鎖に分離することができればこの限りではない。例えば温度を用いた場合、オリゴヌクレオチドを核酸配列に作用させた後、ゆっくりと温度を上げてオリゴヌクレオチドを１本鎖に分離させる。このとき、野生型配列にハイブリした野生型オリゴヌクレオチドは変異型配列にハイブリしたオリゴヌクレオチドより高い温度で１本鎖に分離する。この温度の差異により塩基多型を同定することができる。 In the present invention, conditions for separating oligonucleotides into single strands include temperature, pH, electricity, etc. However, the conditions are not limited as long as the double strands of nucleic acids can be separated into single strands. For example, when temperature is used, after the oligonucleotide is allowed to act on the nucleic acid sequence, the temperature is slowly increased to separate the oligonucleotide into single strands. At this time, the wild-type oligonucleotide hybridized to the wild-type sequence is separated into single strands at a higher temperature than the oligonucleotide hybridized to the mutant-type sequence. The base polymorphism can be identified by this temperature difference.
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びフォワードプライマー、リバースプライマーと共に作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードプライマーとリバースプライマーの間で増幅される。 In the present invention, a method for amplifying a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site can also be basically performed using a conventional method, and usually a specific nucleotide polymorphism denatured into a single strand. Amplification between the forward primer and the reverse primer using the target nucleic acid as a template by acting on the chromosome containing the site or a fragment thereof together with four types of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), DNA polymerase, forward primer and reverse primer Is done.
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）などが挙げられる。 Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature, Vol. 350, page 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research Vol. 20, 1691 (1992)), RCR (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcription mediated amplification method; J. Clin. Microbiol. Vol. 31, Vol. 3270 (1993)).
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。 In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of oligonucleotides, and a heat-resistant DNA polymerase, and thereby the above paired pair. In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the oligonucleotides is exponentially amplified. That is, the sample nucleic acid is denatured in the denaturation step, each oligonucleotide is hybridized with a region on the complementary single-stranded sample nucleic acid in the subsequent annealing step, and each oligonucleotide is the starting point in the subsequent extension step. As described above, a DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of DNA polymerase to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of oligonucleotides is theoretically amplified 2n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .
本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片を上述の方法で増幅し、標識されている野生型用または変異型用オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、核酸特異標識を作用させ、ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドを１本鎖に分離する条件を測定することで、塩基多型を同定するが、この時予め反応に必要な試薬をすべて含んでおいても良い。すなわち増幅用プライマー、ポリメラーゼ、検出用標識プローブ、核酸特異標識試薬等を含む反応液に標的核酸を入れた後、核酸増幅反応および多型検出反応を反応容器の蓋を開けることなく連続して行うことが可能である。この方法によれば、検出に要する煩雑な操作が不要で、核酸増幅法で危惧される、増幅産物による汚染の危険性を大きく低減できる。 In the present invention, a chromosome or fragment containing a specific nucleotide polymorphism site is amplified by the above-described method, a labeled wild-type or mutant-type oligonucleotide is hybridized, and a nucleic acid-specific label is allowed to act to hybridize. The base polymorphism is identified by measuring the conditions for separating the oligonucleotide into single strands. At this time, all reagents necessary for the reaction may be included. That is, after putting the target nucleic acid in a reaction solution containing an amplification primer, polymerase, detection labeled probe, nucleic acid-specific labeling reagent, etc., the nucleic acid amplification reaction and polymorphism detection reaction are continuously performed without opening the reaction vessel lid. It is possible. According to this method, a complicated operation required for detection is unnecessary, and the risk of contamination by amplification products, which is a concern in the nucleic acid amplification method, can be greatly reduced.
本発明では、ノイズを少なくして再現性の高い結果を得るために、核酸特異標識の最大蛍光波長の蛍光強度を１とした場合に、核酸特異標識が０．３以上の蛍光強度を持つ波長の範囲内のいずれかの波長で、オリゴヌクレオチドの標識は最大励起波長の強度を１とした場合に０．２５以上の吸収強度を持つことが好ましく、より好ましくは０．３以上、さらに好ましくは０．３５以上、特に好ましくは０．４以上吸収強度を持つ。 In the present invention, in order to obtain a highly reproducible result with reduced noise, the wavelength at which the nucleic acid-specific label has a fluorescence intensity of 0.3 or more when the fluorescence intensity at the maximum fluorescence wavelength of the nucleic acid-specific label is 1. It is preferable that the oligonucleotide label has an absorption intensity of 0.25 or more, more preferably 0.3 or more, and still more preferably, at any wavelength within the above range, where the intensity of the maximum excitation wavelength is 1. It has an absorption strength of 0.35 or more, particularly preferably 0.4 or more.
さらに具体的には、オリゴヌクレオチドの標識は５２０〜５８０ｎｍに励起波長域を含む色素が好ましい。特には、最大励起波長の強度を１とした場合に、５２０〜５８０ｎｍの全範囲に渡り０．０５以上の吸収強度を持つことが好ましく、５２０〜５８０ｎｍのいずれかに０．２５以上の吸収強度を持つことが好ましく、より好ましくは０．３以上、さらに好ましくは０．３５以上、特に好ましくは０．４以上吸収強度を持つ。 More specifically, the oligonucleotide label is preferably a dye containing an excitation wavelength region at 520 to 580 nm. In particular, when the intensity of the maximum excitation wavelength is 1, it is preferable to have an absorption intensity of 0.05 or more over the entire range of 520 to 580 nm, and an absorption intensity of 0.25 or more in any of 520 to 580 nm. And more preferably 0.3 or more, still more preferably 0.35 or more, and particularly preferably 0.4 or more.
また、核酸特異標識は、５００〜６００ｎｍの蛍光波長域を有することが好ましく、最大蛍光波長の蛍光強度を１とした場合に、５００〜６００ｎｍのいずれかに０．５以上、さらには０．６以上、特には０．８以上の蛍光強度を持つことが好ましく、最も好ましくは５００〜６００ｎｍに最大蛍光波長を持つことが好ましい。 The nucleic acid-specific label preferably has a fluorescence wavelength range of 500 to 600 nm, and when the fluorescence intensity at the maximum fluorescence wavelength is 1, 0.5 or more at any of 500 to 600 nm, and further 0.6 As described above, it is particularly preferable to have a fluorescence intensity of 0.8 or more, and most preferable to have a maximum fluorescence wavelength at 500 to 600 nm.
更には、核酸特異標識の蛍光波長とオリゴヌクレオチドの標識の蛍光波長は重複部分が少ないことが好ましく、オリゴヌクレオチドの標識の蛍光測定波長において、核酸特異標識の蛍光波長の蛍光強度は、その最大蛍光波長の蛍光強度を１とした場合に０．２５以下、さらには０．２以下、特には０．１５以下であることが好ましい。
また、オリゴヌクレオチドの標識の蛍光を測定する際には、オリゴヌクレオチドの標識の最大蛍光波長の蛍光強度を１とした場合、蛍光強度０．５以上、さらには０．６以上、特には０．７以上の波長で測定することが好ましい。
さらに、オリゴヌクレオチドの標識の最大吸収波長は５８０ｎｍ以上であることが好ましい。
なお、これら励起、蛍光波長の特性は実際の増幅後の測定溶液中での特性である。
Furthermore, it is preferable that the fluorescence wavelength of the nucleic acid-specific label and the fluorescence wavelength of the oligonucleotide label have few overlapping portions. At the fluorescence measurement wavelength of the oligonucleotide label, the fluorescence intensity of the fluorescence wavelength of the nucleic acid-specific label is the maximum fluorescence. When the fluorescence intensity of the wavelength is 1, it is preferably 0.25 or less, more preferably 0.2 or less, and particularly preferably 0.15 or less.
When measuring the fluorescence of the oligonucleotide label, assuming that the fluorescence intensity at the maximum fluorescence wavelength of the oligonucleotide label is 1, the fluorescence intensity is 0.5 or more, further 0.6 or more, and particularly preferably 0.8. It is preferable to measure at a wavelength of 7 or more.
Furthermore, the maximum absorption wavelength of the oligonucleotide label is preferably 580 nm or more.
These excitation and fluorescence wavelength characteristics are characteristics in the measurement solution after actual amplification.
上記条件を満たすものであれば、オリゴヌクレオチドの標識は核酸特異標識と相互作用を起こす標識であれば何でも良いが、これらの例として、テキサスレッド、Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＲＥＤ６４０，Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＲＥＤ７０５、ＴＡＭＲＡ、ＡｌｅｘａＦｉｕｏｒｏ６３３等が挙げられる。該標識は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５‘または３‘部位である。 As long as the above conditions are satisfied, the oligonucleotide label may be any label that interacts with a nucleic acid-specific label. Examples of these include Texas Red, Light Cycler RED640, Light Cycler RED705, TAMRA, AlexaFiuro633, and the like. Can be mentioned. The label may be attached to any position of the oligonucleotide as long as it does not affect the hybridization of the oligonucleotide. Preferably, it is a 5 'or 3' site.
核酸特異標識物質も上記条件を満たすものであれば、標識オリゴヌクレオチドが反応行った核酸に特異的に結合し、該オリゴヌクレオチドの標識と相互作用すれば何でもよく、好ましくは２本鎖核酸に特異的な標識が好ましい。２本鎖特異標識としては２本鎖にインターカーレートするサイバーグリーンＩ、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン、ピコグリーン等があり、中でもサイバーグリーンＩ、ピコグリーンが好ましいがこの限りではない。
これらの、核酸特異標識物質とオリゴヌクレオチドの標識の組み合わせとしては、上述の基準に従って選べば良いが、具体的には、サイバーグリーンＩとテキサスレッド、サイバーグリーンＩとＬｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＲＥＤ６４０，サイバーグリーンＩとＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＲＥＤ７０５、サイバーグリーンＩとＴＡＭＲＡ、サイバーグリーンＩとＡｌｅｘａＦｉｕｏｒｏ６３３、ピコグリーンとＲＯＸ、ピコグリーンとテキサスレッド、ピコグリーンとＬｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＲＥＤ６４０，ピコグリーンとＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＲＥＤ７０５、ピコグリーンとＴＡＭＲＡ、ピコグリーンとＡｌｅｘａＦｉｕｏｒｏ６３３が好ましい例として挙げられる。
As long as the nucleic acid-specific labeling substance also satisfies the above conditions, anything may be used as long as the labeled oligonucleotide specifically binds to the reacted nucleic acid and interacts with the label of the oligonucleotide, preferably specific to a double-stranded nucleic acid. A typical label is preferred. Examples of double-strand specific labels include Cyber Green I, ethidium bromide, acridine orange, thiazole orange, oxazole yellow, rhodamine, and pico green that intercalate into double strands. Of these, cyber green I and pico green are preferred. Not as long.
These nucleic acid-specific labeling substances and oligonucleotide labels may be combined according to the above-mentioned criteria. Specifically, Cyber Green I and Texas Red, Cyber Green I and Light Cycler RED640, Cyber Green I and Light Cycler RED705, Cyber Green I and TAMRA, Cyber Green I and AlexaFiuoro 633, Pico Green and ROX, Pico Green and Texas Red, Pico Green and Light Cycler RED 640, Pico Green and Light Cycler RED 705, Pico Green and TAM Exor u, and Pico Green and TAMra 6 Take as an example.
キット
本発明において、キットとしては、標識した野生型用オリゴヌクレオチドまたは変異型用オリゴヌクレオチド、核酸特異標識を含む塩基多型検出用試薬キットを含むものである。
増幅法と同時に検出する場合には、更に、フォワードプライマー、リバースプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含んでいてもよい。
ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸長させ、増幅反応をすれば何でもよく好ましくは５‘エキソヌクレアーゼの活性が実質的に含まれない物がよい。
Kit In the present invention, the kit includes a labeled wild-type oligonucleotide or mutant oligonucleotide, and a nucleotide polymorphism detection reagent kit containing a nucleic acid-specific label.
When detecting simultaneously with the amplification method, it may further contain a forward primer, a reverse primer, a DNA polymerase, and four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs).
The DNA polymerase may be anything as long as the primer is extended and an amplification reaction is performed, and preferably a substance that does not substantially contain the 5 ′ exonuclease activity.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１ Endothelial Nitric Oxide Synthase 遺伝子の塩基多型の検出
（１）Endothelial Nitric Oxide Synthase 遺伝子の298番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
配列番号1〜３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ1〜３）をDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ KK、アマシャムファルマシア バイオテク（株）等）に依頼した。
オリゴ１は多型部位を5’末端から１０番目の位置に有し、その配列がＧであり、5’末端にテキサスレッドが標識されている。また3’末端はダイデオキシ化されている。
Example 1 Detection of nucleotide polymorphism of Endothelial Nitric Oxide Synthase gene
(1) Endothelial Nitric Oxide Synthase Synthesis of oligonucleotide detecting the 298th polymorphism of the gene An oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 (hereinafter referred to as
（２）融解曲線を用いたEndothelial Nitric Oxide Synthase 遺伝子多型の解析
〈１〉 PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEndothelial Nitric Oxide Synthase 遺伝子の塩基多型 (Glu298Asp)部位を含む核酸断片を増幅した。
(2) Analysis of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphism Using Melting Curve <1> Amplification Reaction by PCR Using a DNA solution extracted from human leukocytes by phenol / chloroform method as a sample, add the following reagents The nucleic acid fragment containing the nucleotide polymorphism (Glu298Asp) site of the human Endothelial Nitric Oxide Synthase gene was amplified under the following conditions.
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ２ 4 pmol
オリゴ3 20 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl２ 1.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ（東洋紡績（株）） 1 Ｕ
抽出DNA溶液 20 ng
The 25μl solution containing the following reagents reagents were prepared.
Taq DNA polymerase
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl 2 1.5 μl
Taq DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.) 1 U
Extracted DNA solution 20 ng
増幅条件
95℃・5分
95℃・30秒、60℃・30秒、72℃、30秒（35サイクル）
72℃・2分。
Amplification conditions
95 ℃, 5 minutes
95 ℃, 30 seconds, 60 ℃, 30 seconds, 72 ℃, 30 seconds (35 cycles)
72 ℃ for 2 minutes.
〈２〉 融解曲線による検出
〈１〉の増幅反応液25μlに下記試薬を５μlを加え、LightCycler（Rosche）用キャピラリー反応容器に移した。キャピラリー反応溶液をLightCyclerにセットし、下記の反応条件で融解曲線を作成した。
<2> Detection by melting curve 5 μl of the following reagent was added to 25 μl of the amplification reaction solution of <1> and transferred to a LightCycler (Rosche) capillary reaction vessel. The capillary reaction solution was set in the LightCycler, and a melting curve was created under the following reaction conditions.
試薬
以下の試薬を含む5μｌ溶液を調製した。
1000倍希釈Syber GreenI(Molecular probes社) 1.2μl
200mMＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０） 1μl
オリゴ１ １０ｐｍｏｌ
The 5μl solution containing the following reagents reagents were prepared.
1000 times diluted Syber GreenI (Molecular probes) 1.2μl
200 mM EDTA (pH 8.0) 1 μl
反応条件
95℃・１秒
50℃・１分
50℃から95℃へ0.5℃／秒で昇温し、STEPで蛍光測定
Reaction conditions
95 ℃ for 1 second
50 ℃ for 1 minute
Increase the temperature from 50 ° C to 95 ° C at 0.5 ° C / sec, and measure fluorescence with STEP
得られた融解曲線を図１に示す。図から明らかなように、オリゴ１と完全に相補的配列の場合は約70℃をピークとした融解曲線が得られ、多型配列がホモの場合は約65℃にピークを持つ融解曲線が得られ、ヘテロの場合は70℃と65℃の２つのピークを有する融解曲線が得られた。
所要時間は数分であった。
The resulting melting curve is shown in FIG. As can be seen from the figure, a melting curve with a peak at about 70 ° C is obtained when the sequence is completely complementary to
The time required was several minutes.
上記のように、多型部位の配列を含む核酸断片を増幅した後、標識した多型部位を含むオリゴヌクレオチドをハイブリさせ、核酸特異的標識を作用させた後、標識した折り後ヌクレオチドが１本鎖に解離する温度を測定することで、煩雑な操作を経ることなく、容易にかつ迅速に標的核酸遺伝子多型を明確に判定することができた。 As described above, after amplifying a nucleic acid fragment containing the sequence of the polymorphic site, the oligonucleotide containing the labeled polymorphic site is hybridized and subjected to a nucleic acid-specific label, and then one labeled folded nucleotide is present. By measuring the temperature of dissociation into strands, the target nucleic acid gene polymorphism could be clearly and easily determined without complicated operations.
（３）リアルタイム増幅＋融解曲線を用いたEndothelial Nitric Oxide Synthase 遺伝子多型の解析
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加してLightCycler（Rosche）用キャピラリー反応容器に移した後、LightCyclerにセットし、下記の反応条件によりヒトEndothelial Nitric Oxide Synthase 遺伝子の塩基多型 (Glu298Asp)部位を含む核酸断片を増幅した後、反応容器の蓋を開けることなく予め含まれる標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて融解曲線を作成した。
(3) Analysis of Endothelial Nitric Oxide Synthase gene polymorphism using real-time amplification + melting curve Using DNA solution extracted from human leukocytes by phenol-chloroform method as a sample, add the following reagents for LightCycler (Rosche) After transferring to a capillary reaction vessel, set it in the LightCycler, amplify the nucleic acid fragment containing the nucleotide polymorphism (Glu298Asp) site of human Endothelial Nitric Oxide Synthase gene under the following reaction conditions, and then open the reaction vessel in advance without opening the lid. Melting curves were generated using the included labeled oligonucleotide probe.
試薬
以下の試薬を含む25μｌ溶液を調製した。
オリゴ１ 10 pmol
オリゴ２ 4 pmol
オリゴ３ 20 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgSO4 1.25 μl
KOD plus DNAポリメラーゼ（東洋紡績（株）） 1 Ｕ
3000倍希釈Syber GreenI(Molecular probes社) 2.5μl
2.5mg/mlBSA 2.5μl
抽出DNA溶液 20 ng
The 25μl solution containing the following reagents reagents were prepared.
× 10 buffer 2.5 μl
2 mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgSO 4 1.25 μl
KOD plus DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.) 1 U
3000 times diluted Syber GreenI (Molecular probes) 2.5μl
2.5mg / ml BSA 2.5μl
Extracted DNA solution 20 ng
増幅、検出条件
増幅サイクル
95℃・1分
95℃・1秒、60℃・10秒、72℃、3秒（40サイクル）
融解曲線サイクル
95℃・１秒
50℃・１分
50℃から95℃へ0.5℃／秒で昇温し、STEPで蛍光測定
Amplification and detection conditions <br/> Amplification cycle
95 ℃, 1 minute
95 ℃ for 1 second, 60 ℃ for 10 seconds, 72 ℃ for 3 seconds (40 cycles)
Melting curve cycle
95 ℃ for 1 second
50 ℃ for 1 minute
Increase the temperature from 50 ° C to 95 ° C at 0.5 ° C / sec, and measure fluorescence with STEP
得られたSyberGreenＩによる増幅産物のシグナルを図２に、融解曲線を図３に示す。図２からSyberGreenＩのシグナルからRealtimeに増幅している明らかに測定できた。また連続して作成した融解曲線により、オリゴ１と完全に相補的配列の場合は約70℃のピークが得られ、多型配列がホモの場合は約65℃にピークが、ヘテロの場合は70℃と65℃の２つのピークを有するが得られた。
所要時間は約30分であった。
The signal of the amplification product obtained by SyberGreen I is shown in FIG. 2, and the melting curve is shown in FIG. From FIG. 2, it was clearly measured that the signal was amplified to Realtime from the SyberGreen I signal. In addition, the melting curve created continuously gives a peak at about 70 ° C when the sequence is completely complementary to
The time required was about 30 minutes.
なお、テキサスレッドの吸光強度は５２０ｎｍにおいて０．０７、５５０ｎｍにおいて０．３１、５８０ｎｍにおいて０．６３（いずれも最大吸光波長での吸光強度を１とした場合）であり、サイバーグリーンＩの蛍光強度は５２０ｎｍにおいて１．００、５５０ｎｍにおいて０．６２、５８０ｎｍにおいて０．２９（いずれも最大蛍光波長での吸光強度を１とした場合）である。
また、サイバーグリーンＩは４９５ｎｍで励起させ、テキサスレッドの蛍光の測定波長は６２０ｎｍのフィルターを通して測定を行った。この時のテキサスレッドの蛍光強度は１、サイバーグリーンの蛍光強度は０．１３（いずれも最大蛍光波長での吸光強度を１とした場合）である。
なお、テキサスレッドの最大吸収波長は約５９０ｎｍである。
また、核酸特異標識として、ＲＯＸ，Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＲＥＤ６４０，Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＲＥＤ７０５に変えた場合でも同様に測定が可能であった（但しＣｙｃｌｅｒ ＲＥＤ７０５の測定は７００ｎｍのフィルターを用いた）。
The absorption intensity of Texas Red is 0.07 at 520 nm, 0.31 at 550 nm, and 0.63 at 580 nm (both assuming the absorption intensity at the maximum absorption wavelength as 1), and the fluorescence intensity of Cyber Green I Is 1.00 at 520 nm, 0.62 at 550 nm, and 0.29 at 580 nm (both in the case where the absorption intensity at the maximum fluorescence wavelength is 1).
Cyber Green I was excited at 495 nm, and the measurement wavelength of Texas Red fluorescence was measured through a 620 nm filter. At this time, the fluorescence intensity of Texas Red is 1, and the fluorescence intensity of Cyber Green is 0.13 (both of which are 1 when the absorption intensity at the maximum fluorescence wavelength is 1).
The maximum absorption wavelength of Texas Red is about 590 nm.
Moreover, even when the nucleic acid-specific label was changed to ROX, Light Cycler RED640, or Light Cycler RED705, the same measurement was possible (however, measurement of Cycler RED705 was performed using a 700 nm filter).
上記のように、多型部位の配列を含む核酸断片の増幅と連続して、標識した多型部位を含むオリゴヌクレオチドをハイブリさせ、核酸特異的標識を作用させた後、標識した折り後ヌクレオチドが１本鎖に解離する温度を測定することで、煩雑な操作を経ることなく、また反応液の添加や反応容器の開閉等なく、容易にかつ迅速に標的核酸遺伝子多型を明確に判定することができた。 As described above, after the amplification of the nucleic acid fragment containing the sequence of the polymorphic site, the oligonucleotide containing the labeled polymorphic site is hybridized and allowed to act on the nucleic acid-specific label. By measuring the temperature dissociated into single strands, the target nucleic acid gene polymorphism can be clearly and easily determined without complicated operations and without adding a reaction solution or opening / closing the reaction vessel. I was able to.
本発明の方法により、煩雑な操作を経ることなく、また反応液の添加や反応容器の開閉等なく、容易にかつ迅速に標的核酸遺伝子多型を明確に判定することができ、産業界に寄与すること大である。 By the method of the present invention, the target nucleic acid gene polymorphism can be clearly and easily determined without any complicated operation, without adding a reaction solution, opening or closing a reaction vessel, etc., contributing to the industry. It is great to do.
Claims (8)
（ａ）試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に、標識されているオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。ここにおいて、上記オリゴヌクレオチドは、上記核酸における特定の塩基多型部位において、野生型または変異型の配列に対して相補的な配列を有し、そしてその標識が、テキサスレッド、Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＲＥＤ６４０，Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＲＥＤ７０５、ＴＡＭＲＡ、および、ＲＯＸからなる群より選ばれる消光剤蛍光色素である。
（ｂ）核酸特異標識を、該オリゴヌクレオチドと該核酸の混合物に作用させる。ここにおいて、上記核酸特異標識は２本鎖核酸にインターカレートするサイバーグリーンＩ、および、ピコグリーンからなる群より選ばれるドナー蛍光色素である。
（ｃ）該オリゴヌクレオチドの標識と核酸特異標識との蛍光共鳴エネルギー移動を検出する。
（ｄ）ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドが１本鎖に分離する条件が塩基多型により異なることを用いて塩基多型を同定する。 A method for identifying a nucleotide polymorphism, comprising the following steps (a) to (d):
(A) A labeled oligonucleotide is hybridized to a nucleic acid sequence containing a specific nucleotide polymorphic site contained in a sample. Here, the oligonucleotide has a sequence complementary to a wild-type or mutant sequence at a specific nucleotide polymorphism site in the nucleic acid, and its label is Texas Red, Light Cycler RED640, Light Cycler. A quencher fluorescent dye selected from the group consisting of RED705, TAMRA, and ROX .
(B) A nucleic acid specific label is allowed to act on the mixture of the oligonucleotide and the nucleic acid. Here, the nucleic acid-specific label is a donor fluorescent dye selected from the group consisting of Cyber Green I and Pico Green that intercalate into double-stranded nucleic acid.
(C) Detecting fluorescence resonance energy transfer between the oligonucleotide label and the nucleic acid-specific label.
(D) The nucleotide polymorphism is identified using the fact that the conditions under which the hybridized oligonucleotide is separated into single strands differ depending on the nucleotide polymorphism.
１本鎖状態の標的核酸に蛍光標識されている野生型または変異型の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。
２本鎖核酸特異的蛍光色素を作用させ、該蛍光色素とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの標識との相互作用による蛍光信号を測定する。
徐々に温度を上げながら、蛍光信号の変化を測定し該オリゴヌクレオチドが１本鎖に分離する温度を測定する。 The method for identifying a nucleotide polymorphism according to claim 2, comprising the following steps.
An oligonucleotide having a sequence complementary to a wild-type or mutant sequence that is fluorescently labeled with a target nucleic acid in a single-stranded state is hybridized.
A fluorescent signal specific to a double-stranded nucleic acid-specific fluorescent dye is allowed to act and an interaction with the label of the oligonucleotide hybridized with the fluorescent dye is measured.
While gradually raising the temperature, the change in the fluorescence signal is measured, and the temperature at which the oligonucleotide is separated into single strands is measured.
8. The method for identifying a nucleotide polymorphism according to claim 6 or 7, wherein the DNA polymerase contained in the reaction solution does not have 5 ′ exonuclease activity.
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