JP4309845B2 - チモモナスペントース糖発酵株およびその使用 - Google Patents
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Description
[発明起源]
米国政府は、米国エネルギー省と、ミッドウエスト リサーチ インスティチュート(Midwest Researh Institute)の1部門であるザ ナショナル リニューワブル エナジー ラボラトリー(the National Renewable Energy Laboratory)との間の、規約DE−AC36−99G0103372に基づき、本発明に対して権利を有する。
[背景技術]
発酵技術は、再生可能バイオマスセルロース基質を、エタノールなどの燃料および化学物質に変換するのに有用である。典型的な基質は、35〜45%のセルロース、30〜40%のへミセルロース、および15%のリグニンからなる。加水分解画分はグルコースポリマーを含み、ヘミセルロース画分は主にキシロースを含む。アラビノースは、スイッチガラスガラスおよびとうもろこし繊維などの、バイオマス物質中で見出される重要な発酵可能基質でもある。このように、ペントース糖の発酵における、高い比速度の産物形成および変換効率を達成することは、再生可能基質からの燃料および化学物質の商業的生産において極めて重要である。
組込み体チモモナス株を、ペントース糖含有工業原料に加える工程、およびペントース糖を発酵して、エタノール含有組成物を提供する工程が含まれる。
E.coli株C118λ(pir)、CC118(pir)(mini−tn5Tc)、SM/0λ(pir)、およびプラスミドpUC19、pLOF/Km、pUC18sfi、pUT/Tc含有ミニトランスポゾンTn5、Tn10およびpUC18を、Dr. K. Timmis, GBF-Gasellschaft Fur Biotechnologische Forschung mbH, Mascheroder weg 1D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germanyより得た。E.coli DH5α(Life Technologies)を、プラスミドの構築用の宿主として使用した。E.coli SM10λpirを、接合実験におけるドナー宿主として使用した。Z.モビリス ATCC39676株およびその誘導体206C(米国特許第5,843,760号)を、本発明にしたがってレシピエントとして使用した。Tn10ベースプラスミドを構築し、E.coli CC118中で維持した。Z.モビリスATCC31821宿主またはその誘導体5C(組込みプラスミドを、31821/pZB5からプラスミドを取り除くことによって得たもの)における形質転換の前に、JM110やDM1などのメチル化欠損大腸菌宿主を形質転換するために使用した。大腸菌株を、LB培地内で、攪拌(200rpm)しながら37℃で培養した。別段の言及がない限り、Z.モビリス株は、20g/Lのグルコース、D−キシロースまたはL−アラビノースを補充されたRM(10g/L イーストエクストラクト、2g/L KH2PO4)で、嫌気的に維持した。プラスミドを含むすべての株を、適切な抗生物質、テトラサイクリン(Tc)(Z.モビリスおよび大腸菌についての液体培地中10μg/ml、Z.モビリスについての寒天培地中20μg/ml、ならびに大腸菌についての寒天培地中15μg/ml)、アンピシリン(Ap)(大腸菌について100μg/ml)、クロラムフェニコール(Cm)(Z.モビリスについて120μg/mlおよび大腸菌について100μg/ml)の存在下で、増殖させた。Z.モビリス形質転換体またはトランス接合体の作製および選択に関して、テトラサイクリンまたはナリジクス酸(20μg/ml)を補充された接合プレート((MMGまたはMMX;10g/L イーストエクストラクト、5g/L トリプトン、2.5g/L(NH4)2SO4、0.2g/L K2HPO4および50g/L 糖))を使用した。すべての寒天プレートを、15g/L アガーで作製した。
プラスミドDNAの単離、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーションおよび形質転換、アガロース電気泳動法およびその他の組換えDNA技術を、本技術分野で指定され周知の刊行プロトコールである、Sambrook et al.,(1989), Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory press, Cold Spring Harbor, NYまたは各試薬の取扱説明書にしたがって実施した。Z.モビリスのゲノムDNAを、250mlの50mM Tris−50mM EDTA緩衝液に懸濁された、3mlの一晩培養細胞を用いて抽出した。細胞をリソソームで37℃で30分間処理し、ついで100mlの5% SDS溶液およびRNAase(最終濃度=20ng/ml)を加え、さらに30分間インキュベートした。フェノール−クロロホルム抽出を2回行い、タンパク質を除去した。ゲノムDNAをエタノール沈殿によって回収した。または、Z.モビリスの全ゲノムDNAを、Puregenキット(Gentra System, MN)を用いて抽出した。プラスミドDNAの抽出は、Qiaprep Spin Miniprepキット(Qiagen, CA)を用いて行なった。
プラスミドを、フィルター接合技術(Conway et al., 1987)での接合によって、ドナー株E.coli SM10λpirまたはS17−1から、Z.モビリス株へ移した。
DNAを、Stratagene Posi Blotプレッシャーブロッターを用いて、ナイロン膜上に移した。DNAプローブの、Tc、xylB、TnpおよびTalを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、ジゴキシゲニン−UTPで標識した。以下のプライマーをDNA標識に使用した。
Tc: 5’−TTGCTAACGCAGTCAGGC−3’(配列番号:1)
5’−GAATCCGTTAGCGAGGTG−3’(配列番号:2)
xylB 5’−TATGGGTTCAGCGGCATGAG−3’(配列番号:3)
5’−ATGGGCATGAGATCCATAGCC−3’
(配列番号:4)
Tnp 5’−TCCTAACATGGTAACGTTC−3’(配列番号:5)
5’−CCAACCTTACCAGAGGGC−3’(配列番号:6)
Tal: 5’−CGTCTAAAAGATTTTAAGAAAGGTTTCGATA
TGACGGACAAATTGACC−3’(配列番号:7)
5‘−CATTTTGACTCCAGATCTAGATTACAGCAGA
TCGCCGATCATTTTTTCC−3’(配列番号:8)
遺伝子組込み用の種々の組込みプラスミドの構築のために、以下の断片を、Pfuポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA)およびその適切なプライマーペアーを用いて、PCRで増幅した。
鋳型:Z.モビリス31821DNA
プライマー:
p16(F)5‘CCATCGATTCTAGAATCTCGCGTAATAA
AACTATCAGGCGCAATCG3’(配列番号:9)
p17(R)5‘CGCGGATCCAGATCTGGCCTAGGCGGCC
TCATAATATGGGCAAAGACACTCCCG3’(配列番号:10)
鋳型:Z.モビリス31821DNA
プライマー:
p18(F)5‘GAAGATCTGCGGCCGCGTTTTGGTGCCA
ATGTTATCGCC3’(配列番号:11)
p19(R)5‘GAAGATCTAAGCTTGGATAGCGGCTTAT
AGCAACGAGTGC3’(配列番号:12)
鋳型:pBR322
プライマー:
Tc(F)5‘AAAGGCCGCCTAGGCC3’(配列番号:13)
Tc(R)5‘AAAGGCCTAGGCGGCC3’(配列番号:14)
鋳型:pZB186
プライマー:
Cm(F、Eag)5‘CCGAATAAATACGGCCGCCTGTGAC
GGAAGATCACTTC3’(配列番号:15)
Cm(R、Eag)5‘TAACGACCCTGCCGGCCGCCTGAAC
CGACGACCGGGTCG3’(配列番号:16)
ついでPgapxylAB(pZB4由来)およびTcr(PCR産物)を、5’IdhL4(1.9kb)断片および3’IdhL4(2.4kb)断片の間のNotIおよびSfiI部位に挿入することによって、組込みプラスミドpZB510xTc(図19(A)参照)を構築した。PgapxylABの方向を逆にする以外はpZB510XTcと同様にして、プラスミドpZB512XTc(図19(B)参照)を構築した。
PCR作製Cmr断片を、ベクターpMOD(Epicentre, WI)のSmaI部位でクローンニングして、pMODCmを得た。ついで、pUCtaltk(Zhang et al(1995)Science 267: 240-243)由来のBglII断片を、BamHI部位でpMODCmでクローンニングして、pMODPenotaltktCmを形成した(図20参照)。pMODでクローニングした断片は、2つの19bpモザイク末端(IS)に挟まれており、転位の際トランスポーゼースに認識される。
RMGTcCm(30℃)で増殖した、Z.モビリス5C/pZB512XTcの一晩培養液を、10回以内の植継ぎの間、37℃にて5ml RMGチューブで毎日培養した(1:100)。各植継ぎにおいて、培養液をプレートに塗布し、RMGおよびRMGCmプレート上のコロニー数を比較することによって、プラスミドの消失をモニターした。プラスミド保持細胞の集団が全体の10%以下の場合、培養液をRMGTc中に接種し(1:100)、潜在的なPgapxylABTc組込み体の増殖を高めた。RMGTc富化培養液を、RMGTcプレートに塗布し、RMGTcおよびRMGCmプレートにレプリカした。TcrCms表現型のコロニーをさらに解析して、組込みを確認した。
キシロースイソメラーゼ(XI)、キシルロキナーゼ(XK)、トランスケトラーゼ(TKT)およびトランスアルドラーゼ(TAL)を、場合によっては、Z.モビリス組込み体および対照株の細胞なしの抽出物を用いて、改変されたZhang et al.,(1995)Science 267: 240-243にしたがって、アッセイした。Z.モビリスの細胞なしの抽出物を、超音波処理緩衝液(10mM Tris−Cl、pH7.6、10mM MgCl2)で1回洗浄したのち、超音波処理した後期対数期の培養液を回収することによって調製した。細胞残渣を、遠心(14,000rpm、45分、4℃)によって除去した。
以下の実施例は、キシロース同化酵素をコードする遺伝子を含むMini−Tn5Tcの構築物、およびZ.モビリス206CおよびATCC39676への該構築物の接合トランスファーを示すものである。Pgap−xylAxylBオペロンを、プラスミドpGP704に含まれるMini−Tn5Tc固有のNotI部位に挿入することによって、キシロース同化酵素をコードするMini−Tn5Tc含有遺伝子を構築した。図1参照。Pgap−xylAxylBオペロンを、プラスミドpZB4またはpZB5(米国特許第5,712,133号および第5,726,053号)より得た。Mini−Tn5Tc xylAxylB(X4)およびMini−Tn5Tc xylAxylB(X5)と命名された該プラスミドを、エレクトロポレーションによって、ドナー株E.coli SM10λpir内に形質転換し、Z.モビリスATCC39676または206C株いずれかと接合した。Z.モビリス206Cは、言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,843,760号に開示されている。9つのチモモナスTcrトランス接合体を、Tcおよびナリジクス酸含有培地での選択によって、Mini−Tn5Tc xylAxylB(X4)およびMini−Tn5Tc xylAxylB(X5)を含むSM10λpirドナーの両方から得た。図2(b)参照。
本実施例は、4つのペントース発酵遺伝子を発現するチモモナス組込み体を作製するための組込み事象方法の有用性を示すものである。抗生物質選択のない状態で、改良された遺伝的に安定なチモモナス組込み体を、この方法によって作製する。キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードするキシロース同化遺伝子(xylAおよびxylB)、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードするペントースリン酸経路遺伝子(talBおよびtktA)を、ペントース発酵株の作製を実施するために、mini−Tn5を用いて、Z.モビリスゲノムに導入する必要がある。PgapxylA/xylBおよびPeno−talB/tktAを含む2つのオペロンを、mini−Tn5において構築し、得られたプラスミドを、Z.モビリスに接合した。mini−Tn5カセットの外側に位置するトランスポーゼースの助けを借りて、Pgap−xylAxylBおよびPeno−talB/tktAの単一コピーを、サザンハイブリダイゼーションによって示すように、Z.モビリスゲノムに挿入した。キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素解析によって、全ての遺伝子が同等に発現され、組込まれた株が、プラスミド保持株の酵素活性の約30〜70%を産生することが示された。このような酵素レベルは、有機体が増殖するのに、とくにペントース、キシロースをエタノールに発酵するのに充分なものであった。
以下の実施例は、Idhを介した相同組換えおよびミニトランスポゾンTn10を用いる転位を通じた、C25のゲノムへの、アラビノース同化酵素の導入を示すものである。以下に記載するプラスミドpZB1862−ldhL−araを使用して、エレクトロポレーションによって、Z.モビリスまたは大腸菌を形質転換した。形質転換体を、グルコースおよびテトラサイクリンで補充された接合プレートで選択した。Tcrコロニーはさらに、キシロースまたはアラビノースで補充されたRM(RMXおよびRMA)での増殖によって、Ara+Xyl+であることが確認された。また以下に記載するプラスミドTn10Gを、フィルター接合技術(Conway et al. 1987)での接合によって、E.coli SM10λpirドナーからZ.モビリスC25に移した。得られたトランス接合体を、アラビノース含有接合プレートで選択した。
以前の、相同領域の1kbのldh断片を用いるチモモナスゲノムにaraBADを組込む試みは、成功しなかった。組換え頻度を高めるために、より高い相同領域を使用した。ldhおよびそのフランキング領域を含む2.5kbのDNA断片を、Pfu PCRを用いて増幅した。プライマーは、Yamano I.,(1993)Journal of Bacteriology, Vol. 175. 3926-3933に公開された、Z.モビリスCP4のDNA配列に基づいて設計した。PCRからは2.5kb断片が予測されたが、そうではなく3.4kb断片が得られた。この3.4kb断片をBamHIで消化した後、2つの断片(2.5および0.9kb)が得られた。両断片について、ldhでのみアニールするよう設計されたプライマーを用いて、PCRで試験した。2.5kb断片は、正しい大きさのPCR産物を産出したが、0.9kb断片は産出しなかったことから、前者がldh配列を含むことを示唆している。したがって、2.5kbのBamHI断片(ldhLと命名)をクローニングし、C25への遺伝子組込み用の相同領域として使用した。
TCCCCATCACCTCGG−3'(配列番号:17)
5’−TCGCGGATCCGCGGCTGACATACATCTTGC
GAATATAGGG−3’(配列番号:18)
Peno−tal/tktおよびPgap−xylABオペロンとともにC25を構築するために、mini−Tn5を使用した。トランスポーゼース遺伝子はC25に存在しないが、mini Tn10を、その後Pgap−araBADの組込みに使用して、同一のトランスポゾン間の不和合性の可能性を回避した。プラスミドTn10G(図11)を、Tn10ベース伝達プラスミドであるpLOFKmに基づいて構築した。Kmr遺伝子を、pZB206から単理されたPgap−araBADのNotI断片で置換した。Tn10Gを構築し、E.coli C118中で維持した。ついでプラスミドを、Z.モビリスとの接合のために、接合ドナー、E.coli SM10λpir内に移した。Tn10Gは、Z.モビリスにおいては自殺プラスミドであるので、araBAD組込みによるトランス接合体のみが、アラビノースで補充された接合プレートで増殖可能であった。E.coli SM10λpirドナーは、ナリジクス酸の存在によって、プレートで阻害された。トランス接合体が、第7日に、接合/araプレートに出現した。コロニーをRMAおよびRMXでレプリカ接種し、その表現型を確認した。接種した86パーセントのコロニーがXyl+Ara+であった。接種プレートからの20コロニーを、異なるプレートに交差して移した(キシロースプレートからアラビノースプレート、またはその逆)。これらのコロニーの60%がXyl+Ara+であった。20個のコロニーを、予備サザンハイブリダイゼーションで解析した。tnpプローブを用いたところ、約50%の株が、ゲノム中にトランスポーゼース遺伝子を含んでいた。ついで8つの組込み体を、サザンハイブリダイゼーションによる、詳細な解析にかけた。pZB1862−IdhL−ara組込み体DNAについて、C25のIdhへのPgap−araBADの組込みを、DIG−標識化araおよびIdhプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションで確認した。図12(a)および(b)参照。ジゴキシゲニン(DIG)標識化ldh、ara、およびtnpプローブは、Taq DNAポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)を用いるPCRによって増幅した。DIG−UTPは、Boehringer Mannheim, Indianapolis, INより購入した。Tn10のトランスポーゼース遺伝子であるIS10Rを調べるために、tnpプローブを使用した。ldh、ara、およびtnpのPCR産物は、それぞれ1、1.4、および0.8kbであった。以下のプライマー配列を使用した。
AATATTCAGTTCC−3’(配列番号:20)
5’−TCGCGGATCCGTCGCTTGTCTATTAAA
CAAGCGCATCCGGC−3’(配列番号:21)
DIG−ara: 5’−CTAACATGTTGACTCCTTCTCTAGACT
TAGCG−3’(配列番号:22)
5’−GTTGAAACCGCTGGGCACCACGC−3’
(配列番号:23)
DIG−tnp: 5’−CGCACTACACGGTCGTTCTGTTAC−3’
(配列番号:24)
5’−GGTTGCAGCCACGAGTAAGTCTTC−3’
(配列番号:25)
以下の実施例は、相同組換えを介する、Z.モビリス31821−5CのldhへのPgapxylABの組込みを示すものである。Z.モビリス31821は、以前から、高糖供給流(high sugar feed stream)、高温および酢酸に対して高い耐性を有することが明らかにされている。そのため、Z.モビリス31821は、キシロース利用に関する4つの遺伝子(tal、tkt、xylAおよびxylB)を組込む標的として優れている。しかしながら、株31821は、通常の大腸菌宿主由来のDNAを用いて形質転換することが非常に困難であることがわかった。この株が、宿主のメチル化からDNAを制限する固有の遺伝的背景を有するようであることが見出された。ドナー宿主としてE.coli Sm10(λpir)を用いる、トランス接合を介したmini Tn5Tcを用いる既存の方法は、31821−5Cでは作用しなかったので、異なる組込み技術を試みた。mini−Tn5およびmini−Tn10系は、31821株での接合にトランスポゾンプラスミドが必要であり得る、メチル化欠損大腸菌ドナー宿主の欠如のため、適切ではない。miniTn5(挿入配列間にTcr遺伝子を含む)を31821−5Cへ接合するために、2回試験を行ったが、トランス接合体は得られなかった。Tcr(1.5kb)のように小さな断片が、mini−Tn5転位によって、31821−5Cのゲノムに接合および組込むことが出来ないことを考慮すると、PgapxylABTcまたはPenotaltktCmなどの、任意のより大きな断片の組込みは実現不可能である可能性がある。宿主への接合に代わる形質転換に基づいた転位方法が開発され(EZ::TN挿入キット、以下参照)、相同組換えのための拡大された相同領域が、株31821の低い組換え率のために開発された。
以下の実施例は、転位を介する、Z.モビリス31821−5CのゲノムへのPenotaltktの組込みを示すものである。mini−Tn5またはmini−Tn10転位は、接合用のメチル化欠損ドナー宿主の欠如のために、318212において適用されなかった。そこで、新規の転位方法(EZ::TN挿入キット)を採用した。本方法の性質は、細胞内にエレクトロポレーションしたときに、モザイク末端近接PenotaltktCmに結合し、末端の結合が維持している場合その断片を切断するトランスポゼースが必要である。細胞内部で、トランスポゼースは、宿主のゲノムへのDNA断片の転位を誘導する。組込みプラスミドpMODPenotaltktCm(図20を参照)は、メチル化欠損大腸菌宿主から調製した、チモモナスにおける非複製プラスミドである。エレクトロポレーションした細胞を、MMGCmプレート上に塗布した。Cmr形質転換体は組込み体であるべきである。3つのCmr組込み体は、この転位方法を用いて得られ、本明細書においてint1、int2およびint3と呼ぶ。組込み体を、talまたはCm用のプライマーを用いるPCRスクリーニングによって確認した。また、該確認は、PenotaltktCmrが、pMODプラスミドで運搬されないことを確認するために、組込み体由来のプラスミドを大腸菌内にバック形質転換することによって行なった。組込み体を、PgapxylAB(penotaltktではない)を有するプラスミドpZB188−zylで形質転換した。エレクトロポレーションした細胞を、MMXプレートに直接塗布した。この相補実験では、形質転換体は得られなかった。Penotaltktの単一コピーは、キシロースプレートでの初期増殖では、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの十分な活性を提供し得ない。Ppdc(ピルビン酸ジカルボキシラーゼ遺伝子)およびPgap(グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子)などのより強力なチモモナスプロモーターは、taltkt発現に対する低コピー数効果を相補し得る。
以下の実施例は、Penotaltkt/PgapxylAB組込み体の構築を示すものである。4つのキシロース利用遺伝子を組込む試みは、転位または相同組換えいずれを使用しても成功しなかった。31821−5CゲノムへのPenotaltktの単一コピーは、キシロース同化遺伝子をプラスミドに供給する場合、キシロースでの株の増殖を支持するものではなかった。本発明者らは、株31821ネイティブプラスミドへのpMODPenotaltktCmのインビトロ転位によって、組込みPenotaltktのコピー数の増加を試みた。ついで、転位ネイティブプラスミドを、PgapxylAB組込み体(x9i)内にエレクトロポレーションした。TcrCmrで最終的に選択した組込み体を、x9t(enott)Piとした。組込み体から単離したプラスミドを、Z.モビリス31821−5Cおよび大腸菌DH5aへバック形質転換に使用した。バック形質転換体は、Z.モビリスからは得られたが、大腸菌からは得られったことから、x9iのネイティブプラスミドに該遺伝子が組込みられたことが示された。他のアプローチにおいて、組込みプラスミドである、PgapxylABTcrを含むpZB510XTcおよびpZB512XTcを、E.coli DM1から調製し、int2に形質転換した。TcrCmr形質転換体は、多くのエレクトロポレーションの試みによって得られた。ついで形質転換体を用いて、前述のように、取り除きおよび濃縮工程を行った。両方のアプローチによって得た組込み体を、キシロースを含む培地(RMX)での増殖について試験した。複数の組込み体においてRMXでの増殖が観察されたが、最小限なものだった。RMXでの連続的な適応の後(以下の実施例を参照)、各組込みによる2つの組込み体(x9t(enott)Pi#4および#8;int2/321およびint2/1821)は、RMXにて比較的良好に機能し、さらに解析した。得られた潜在的Penotaltkt/PgapxylAB組込み体を、標的DNAの存在を確かめるために、サザンハイブリダイゼーション解析に供した。ハイブリダイゼーションをxylBプローブ(図21A)を用いて実施し、これらの組込み体から調製した全DNAおよびプラスミドDNAはSphIで消化した。プラスミドpZB512XTc(対照)が、2つの5.4および2.5kbのバンドを有し、そのうち2.5kbのバンドは、組込み体、x9t(enott)Pi#4、#8およびint2/321の全DNAに共通することが予想された。一方、プラスミドpZB510XTcは、2つのバンド4.2および3.7kbのバンドを有し、そのうち3.7kbは、組込み体int2/1821の全DNAに共通であることが予想された。すべての組込み体はx9i(PgapxylABが、ゲノム中のLDH座に組込まれている)に基づくものである。すべての組込み体は、第2のバンド(予想されるプラスミドから作製されるバンドとは異なるもの)だけでなく、各組込みプラスミドに共通する1つのバンドを有する。すべての組込み体は、プラスミドDNAプレップではなく、全DNAプレップにバンドを含むことから、PgapxylABが、ATCC31821のネイティブプラスミドにではなく、染色体に組込みられたことが示された。tktプローブによるハイブリダイゼーションにおいて、これらの組込み体から調製した、全DNAおよびプラスミドDNAを、BssHIIで消化した(図21B)。プラスミドpMODPenotaltktCm(対照)は、4.2、1.5、0.9および0.1kbの4つのバンドを有し、そのうち1.5および0.9kbのバンドは、全ての組込み体の全DNAに共通であることが予想された。0.1kbのバンドは小さすぎたため、ゲル上に残留できなかった。図21Bに示されるように、x9t(enott)Pi#4、#8は、全DNAおよびプラスミドDNAプレップの両方で1.5と0.9kbバンドを含んでいたため、Penotaltktが、ネイティブプラスミドに組込まれたことが確認された。ブロット上#4および#8にはない第3のバンドは、小さすぎるためゲル上に存在しないかもしれない。マップ(図20を参照)によると、このバンドは、0.4kbと小さい可能性がある。2つの共通のバンドに加えて、int2/321およびint2/1821は、プラスミドとは異なる6.4kbのバンドを有したことから、Penotaltktは、これらの2つの組込み体の染色体に組込まれたことを示された。
以下の実施例は、組込み体チモモナスの酵素活性を示すものである。培養液を、RMXからRMGへの第5回植継ぎ(x9(enott)Pi#4および#8)、および第4植継ぎ(int2/321およびint2/1821)から接種し、新鮮なRMGへの接種前に16時間増殖させた。細胞を、アッセイのために、RMGで増殖したものをOD600=1.0で回収した。結果を、図22に示す。
以下の実施例は、Z.モビリス38121−5C Penotaltkt/PgapxylAB組込み体が、RMXでの連続適応の後に、D−キシロースをエタノールに発酵可能であることを示すものである。組込み体を、蒸発を防ぐためにパラフィンで密封したRMXチューブ(2%のキシロースを含む)に播種した。増殖を、OD600測定によって定期的にモニターした。対数期からの培養液を、新鮮なRMXに移した。図23に示すように、第1回植継ぎおよび第4回植継ぎ間で、増殖曲線の比較を行った。
この実施例は、Z.モビリスへの転位用のpMODPgaptaltktCmの構築を示すものである。2つのLoxP部位を導入すること以外は、同様にしてpMODPenotaltktCmを構築した。2.2kbのtkt断片を、BglII/XbaI消化によってpUCtaltktより単離し、BamHI/XbaIで消化したpMODベクターにクローニングし、pMODtktを得た。PCR断片Pgaptalを、GAP(グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子)のチモモナスプロモーター領域とtalの構造遺伝子を融合することによって作製した。この断片を、XbaIで消化し、プラスミドpMODtktにクローンニングした。最後に、Cmrを挟む2つのLoxP配列を含むPCR断片(Palmeros et al., 2000, Gene 247: 255-264)(CmloxP)を、プラスミドのSfiI部位に挿入し、組込みプラスミドpMODPgaptaltktCmを形成した(図24)。Cmrを挟むLoxP配列は、ファージCre組換え酵素の結合標的として使用でき、必要に応じて、Cmrを組込み体ゲノムから除去できる。同様に、このアプローチは、Tc耐性遺伝子をルーピングアウトするのにも使用できる。抗生物質耐性遺伝子を除去できることは有利である。本発明者らは、この目的のために、LoxP/cre系を導入した。この構築のためのPCR用のオリゴ配列は、以下の通りである。
鋳型:pZB4
プライマー:
PgapXbSfi(F) 5’CAGTCTAGAGGCCGCCTAGGCCGTTCGATCAACAACCCGAATCC3’(配列番号:26)
3’Pgap5’tal(R) 5’CAATTTGTCCGTCATGTTTATTCTCCTAAC3’(配列番号:27)
鋳型: pZB4
プライマー:
3’Pgap5’tal(F) 5’GTTAGGAGAATAAACATGACGGACAAATTG3’(配列番号:28)
talXb(R) 5’CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3’(配列番号:29)
鋳型:Pgapおよびtal
プライマー:
PgapXbSfi(F) 5’CAGTCTAGAGGCCGCCTAGGCCGTTCGATCAACAACCCGAATCC3’ (配列番号:30)
talXb(R) 5’CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3’ (配列番号:31)
鋳型:pZB 186
Cmlox(F、sfi)
5’CAGGGCCGCCTAGGCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTGTGACGGAAGATCACTTCGC3’(配列番号:32)
Cmlox(R、sfi)
5’CAGGGCCTAGGCGGCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTGAACCGACGACCGGGTCG3’(配列番号:33)
以下の実施例は、Z.モビリス31821−5Cに基づくPgaptaltkt/PgapxlyAB組込み体の構築を示すものである。E.coli DM1またはJM110から調製したプラスミドpMODPgaptaltktCmをEZ::TN トランスポーゼースで処理してトランスポゾンを作製した。そのトランスポゾン混合物を、PgapxlyAB組込み体であるx91にエレクトロポレーションした。RMGTcCmでの選択により、Pgaptaltkt/PgapxlyAB組込み体を得た(Tc耐性遺伝子は既にx9iゲノムに組込まれた)。組込み体からのプラスミドDNAを用いた大腸菌でのバック形質転換などの初期解析を行い、プラスミド保持菌株に対する真の組込み体を同定した。複数回の組込み体プラスミドDNAは、大腸菌をバック形質転換し、それらの偽組込み体は除去した。潜在的なTcrCmr組込み体を、キシロースを単一炭素源として含むRMに播種し、30℃でインキュベートした。OD600での測定により増殖をモニターした。すべての菌株が、最初はOD0.3で、RMXでゆっくり増殖することができた。増殖率および最終的なODは、RMXでの第6回植継ぎ後に改善された。よりよく増殖した2つの菌株(#20、#21)の増殖曲線を図25に示す。
以下の実施例は、Pgaptaltkt/PgapxlyABおよびPgaptaltkt/PgapxlyABチモモナス組込み体の単離方法を示すものである。混合集団中でよりよく増殖する菌株を単離するために、細胞をRMXプレートにストリークし、培養した。第4回植継ぎ後、x9t(enott)Pi#4株およびx9t(enott)Pi#8株をストリークし、第3回植継ぎ後にint2/xy1321およびint2/xy1821をストリークし、第6回植継ぎ後に#20および#21をストリークした。この単離工程1回りを第1単離とした。RMXプレートには大きさの異なるコロニーが見られた。大きいコロニーを取り、さらにRMXプレートにストリークした(第2単離)。際立って大きい複数のコロニーを取り、増殖解析用にRMX液体培地に播種した。RMXでの促進された増殖をみせた4つの菌株を選び、サザンハイブリダイゼーション、発酵、および酵素アッセイなどのさらなる分析に用いた。その4つの菌株を321(5)(int2/xy1321由来)、481(x9t(enott)Pi#4由来)、2032(#20由来)、および2122(#21由来)と称した。実施例6に記載の同様の方法で、サザンハイブリダイゼーションを行なった。図26A(プローブとしてxylBを使用)および26B(プローブとしてtktを使用)に示すように、組込みが、プラスミドプレップにおいてハイブリッド形成バンドが見られないことにより確認された。なお、Z.モビリス31821のネイティブプラスミドへのPenotaltktの組込みにより故意に構築した、図26bの481株(x9t(enott)Pi#4由来)は例外である。481株と対照pMODPenotaltkCmとのバンドパターンの違いは、そのバンドが組込みプラスミドのものでないことを示した。そのかわり、それはネイティブプラスミドへのPentaltktCmの組込みによるもであった。図26Aにおいて、予想通り、2.5kbの通常のバンドが、pZB512xTcおよび4つの組込み体全てで観察された。しかし、第2のバンドは、pZB512xTcと組込み体のあいだで異なり、染色体(おそらく1dh遺伝子)へのxylABの組込みを示した。2032の高分子量バンドは、1dhL4領域近くのゲノムのSph1部位における自発的変化によるものである可能性がある。図26Bにおいて、1.5、0.9および0.1kbの共通のバンドが、pMODPenotalktCmまたはpMODPgaptalktとすべての組込み体のあいだで予想された。異なるバンドにより、31821−5CのゲノムへのPenotalktCmまたはpMODPgaptalktの組込みが確認された。
非活性(μmol/min−mgタンパク質)
XI XK TAL TKT
321(5) 0.06 0.17 2.10 0.91
481 0.04 0.23 2.27 0.74
2032 0.15 0.23 1.76 1.05
2122 0.04 0.19 1.56 0.51
int2 0.02 0.02 1.19 0.31
x9i 0.04 0.06 ND 0.03
31821/pZB5 0.06 0.55 2.52 1.78
C25 0.20 0.81 3.78 1.99
31821−5C 0.08 0.07 0.01 0.01
ND: 未測定
以下の実施例は、キシロース培地での増殖を改善することを試みる、チモモナスの突然変異誘発工程を示すものである。int2/xyl321およびx9t(Penott)Pi#8組込み体の単一コロニーをRMGに播種し、30℃で一晩インキュベートした。増殖した培養物を、5%グルコースで補充された接合培地(Mating Medium)への播種に用い(OD=0.15〜0.2)、OD=0.5〜0.6になるまで30℃にてインキュベートした。細胞を回収し、突然変異誘発化学物質である1−メチル−3−ニトロ−1−ニトロソグアニジン(MNNGまたはNTG)を濃度25μg/mlで用いて処理した。NTGで処理した細胞を集めてRMGで2回洗浄し、RMGX(0.5%グルコースおよび1.5%キシロース)中に懸濁させ、増殖させた。増殖した培養物を、同じ培地で2回培養したのち、RMXプレートにストリークした。より大きいコロニーをRMXプレートで再度ストリークした。もっとも大きいコロニーを採取して、RMX液体培地に接種した。増殖した培養物を再びRMXプレートでストリークした。最後に、もっとも大きいコロニーを採取してRMXで増殖させた。もっともよく増殖した2つの菌株を8bおよび2/321−2と称した。その菌株の1つである8bについて、さらに評価した。通常、突然変異体では、以下の実施例に記載するように、アセテートだけでなくグルコースとキシロースの混合物中において、キシロース利用が改良された。
以下の実施例は、Z.モビリスATCC31821−5C宿主を基にして構築した複数の組込み体の発酵評価を示すものである。C25株およびプラスミド保持株31821/pZB5を発酵評価の対照として用いた。
以下の実施例は、チモモナス組込み体の安定性を示すものである。10mlの培地を入れた15mlファルコン(Falcon)滅菌チューブを用いて、非選択培地(RMG)において培養物を連続して植継ぎすることにより試験を行なった(図31を参照)。それらの株をRMG培地で培養し、約10世代増殖後に毎日連続的に植継ぎを行なった。それぞれ第40世代に、細胞を2%のグルコースおよび2%のキシロースを入れたフラスコに接種し、グルコースおよびキシロースをエタノールに発酵させる能力を試験した。エタノール生産率およびキシロース利用率を、安定性の指標として用いた。30℃および37℃の両方で、選択なしで、すべての組込み体が少なくとも140〜160世代まで安定であることが示された(図32および33)。プラスミド保持株31821/pZB5は、30℃および37℃においては40世代以内のうちにキシロース利用能を消失した(図33に示す37℃のデータ)。
以下の実施例は、AX101の増殖およびキシロース発酵における酢酸濃度の影響、ならびにpHの影響を示すものである。酢酸は通常、前処理したバイオマス工業原料の加水分解物中に存在しており、微生物による発酵を阻害する。pH5、pH5.5およびpH6.0で、2g/Lのアセテート補充して、および補充しないで(pH5.5)発酵を行い、AX101株の性能を評価した。使用した培地は、所望の濃度のアセテートを補充したRMGXA(4%:4%:2%)である。この結果(図34)より、2g/Lのアセテートが菌株の増殖、キシロース利用、およびエタノール産生を阻害することが示された。阻害性は、より高いpH(6.0)に比べ、より低いpH(5.0)の方が数段強かった。
以下の実施例は、AX101による発酵の差し引き(fill and draw)方法を示すものである。AX101株のアセテートに対する段階的な適応が、高濃度の酢酸を含む培地で該菌株の性能が改良されるかどうか確認する試験を計画した。まず、pH5.5、T30℃において、RMGXA(4%:4%:2%)での一連のバッチ発酵を、アセテートを含まない場合と2g/Lの酢酸を含む場合とで比較した。アセテートが2g/Lというアセテートの低い濃度で糖の利用に影響したため、それぞれ0.5g/Lおよび1g/Lというより低い濃度のアセテートを含ませる以外は、2g/Lのアセテートで補充したRMGXA(4%:4%:2%)を含む2つの発酵槽と同様の糖濃度にて、別の発酵槽から接種するという別の調査を計画した。その結果、2g/Lのアセテートの存在下では、AX101株の糖利用の改善は見られなかった。
以下の実施例は、AX101の継続発酵を示すものである。MultiGen発酵槽(New Bruswick Scientific, NJ, USA)を300mlの使用容量および300rpmの攪拌回転数で用いて、継続発酵を行なった。pHはKOH(2N)で制御して、4.5、5および5.5で行なった。温度は試験中30℃を維持した。バッチ発酵を初期ODが600nmで0.1にて開始した。発酵工程を通して定期的に試料を採取し、糖、エタノールおよび副生成物をHPLCにより分析した。すべてのグルコースが利用され、ほぼ10g/Lのキシロースが発酵槽に残った状態になったら、所望の糖組成物を含む培地を0.02(1/hr)の低い希釈率(D)で加えることにより継続発酵を開始した。安定した周期で4〜5回後にグルコースがすべて利用され、キシロースが80%利用されたのが確認されたところで希釈率を増加させた(図35)。この工程を、残留キシロース濃度の上昇およびエタノール濃度の減少によって示される、ウォッシュアウト段階に達するまで継続した。エタノール生産率(Yp)を、培地に加えた初期の全糖重量当りの産生したエタノールの最終濃度に基づいて計算した。
以下の実施例は、組込み体が高濃度のアセテート存在下で、グルコースおよびキシロースをエタノールに発酵できることを示すものである。アセテートは、通常、前処理したバイオマス工業原料からの加水分解物中でみられる阻害化合物である。
以下の実施例は、Z.モビリス株39676および31821が、チモモナスピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)プロモーター(Ppdc)の制御下で、大腸菌リン酸マンノースイソメラーゼ遺伝子(ManA)を含有するプラスミドpZB701(図38)を用いて形質転換できることを示すものである。
Claims (24)
- ペントース糖からエタノールを産生するための、遺伝的に改変したチモモナス モビリス(Zymomonas mobilis)ATCC31821株由来のチモモナス組込み体の使用方法であって、
2以上のペントース糖発酵酵素をコードする配列を含むチモモナス組込み体を調製し、該ペントース発酵酵素が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼからなる工程、
該組込み体チモモナスを、適切な発酵条件下で、ペントースを含む工業原料に加える工程、
ペントース糖を発酵してエタノールを含む組成物を提供する工程を含み、
該ペントース発酵酵素をコードする該配列が、第1の組込み事象および第2の組込み事象によって、該組込みチモモナス内に組み込まれる方法。 - 前記第1組込み事象が転位であり、前記第2組込み事象が相同組換えである請求項1記載の方法。
- 前記第1組込み事象が、2以上のペントース発酵酵素をコードする配列を含む第1オペロンの転位組込みからなる請求項2記載の方法。
- 前記第1オペロンが、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列を含む請求項3記載の方法。
- 前記第1オペロンが、さらにPenoおよびPgapからなる群より選択されるプロモーターを含むように定義される請求項4記載の方法。
- 前記第2組込み事象が、2以上のペントース−発酵酵素をコードする配列を含む、第2オペロンとの相同組換えからなる請求項2記載の方法。
- 前記第2オペロンが、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする配列を含む請求項6記載の方法。
- 前記第2オペロンが、さらにプロモーターPgapを含むとして定義される請求項7記載の方法。
- 前記チモモナス組込み体が、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列およびそのプロモーターPenoならびにキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapが組み込まれたATCC31821−5Cである請求項1記載の方法。
- 前記チモモナス組込み体が、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapならびにキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapが組み込まれたATCC31821−5Cである請求項1記載の方法。
- 前記第1組込み事象が相同組換え事象、前記第2組込み事象が転位事象からなる請求項1記載の方法。
- ペントース含有工業原料をエタノールに発酵することができるチモモナス組込み体を調製するための方法であって、
ナイーブなチモモナス モビリス(Zymomonas mobilis)ATCC31821株に対して第1組込み事象を実施し、ペントース−発酵酵素をコードする配列を含む第1オペロンを組み込み、部分的チモモナス組込み体を提供する工程、
該部分的チモモナス組込み体に対して第2組込み事象を実施し、第1オペロンの酵素以外の、2以上のペントース−発酵酵素をコードする配列を含む第2オペロンを組み込み、ペントース含有工業原料をエタノールに発酵することができるチモモナス組込み体を提供する工程を含む方法。 - 前記チモモナス組込み体が、少なくとも4つのペントース糖発酵酵素をコードする配列を含み、該ペントース発酵酵素が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼからなる請求項12記載の方法。
- 前記第1オペロンが、さらにキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapを含むとして定義される請求項12記載の方法。
- 前記第2オペロンが、さらにトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列およびそのプロモーターPenoを含むかまたはトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapを含むとして定義される請求項12記載の方法。
- 請求項12記載の工程によって調製される、ペントース発酵可能なチモモナス組込み体。
- 前記チモモナス組込み体が、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列およびそのプロモーターPenoならびにキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapが組み込まれたATCC31821−5Cである請求項12記載の方法。
- 前記チモモナス組込み体が、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapならびにキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする配列およびそのプロモーターPgapが組み込まれたATCC31821−5Cである請求項12記載の方法。
- リットル培地あたり8グラムのアセテート/酢酸の存在下で、増殖可能なATCC31821株由来のチモモナス組込み体。
- 請求項16記載のチモモナス組込み体を含む、ペントース発酵のための生体触媒。
- 染色体上またはネイティブなプラスミド上に組込まれた、2以上のペントース−発酵酵素をコードする配列からなる、ペントースをエタノールに発酵可能なチモモナス組込み体であって、該組込み体が、少なくとも80世代安定である、ATCC31821株由来のチモモナス組込み体。
- さらに、アセテートの存在下で、ペントース糖をエタノールに発酵可能であると定義される請求項21記載のチモモナス組込み体。
- さらに、リットル培地あたり、8グラムのアセテート/酢酸の存在下で、ペントース糖を発酵可能であると定義される請求項22記載のチモモナス組込み体。
- マンノース−発酵酵素をコードする配列をさらに含む請求項21記載のチモモナス組込み体。
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