ES2735024T3 - Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa para la producción de butanol - Google Patents

Abstract

Una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) diseñada que tiene al menos 90% de identidad a SEQ ID NO:195, en donde la enzima comprende al menos una sustitución en un residuo que corresponde a la posición 73 o 129 de SEQ ID NO:195.

Description

DESCRIPCIÓN

Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa para la producción de butanol

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y la producción fermentativa de butanol e isómeros del mismo. Más específicamente, la invención se refiere a enzimas glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) con una Km para NADH alta, sustancialmente la misma afinidad por NADH y NADPH y/o enzimas GPD que son inhibidas por retroalimentación, microorganismos recombinantes que comprenden tales enzimas, y métodos para usar tales enzimas para producir butanol.

Referencia al listado de secuencias remitido electrónicamente

El contenido del listado de secuencias remitido electrónicamente en el archivo de texto ASCII (Nombre: 20140314_CL5707USNP_Sequence Listing; Tamaño: 401.408 bytes, y Fecha de Creación: 12 de marzo de 2014).

Antecedentes

El butanol es un importante producto químico industrial, útil como aditivo para combustibles, como producto químico materia prima en la industria de los plásticos, y como extractante de calidad alimentaria en la industria de los alimentos y los condimentos. Cada año se producen 4,5 a 5,4 mil millones de kilogramos (10 a 12 mil millones de libras) de butanol por medios petroquímicos, y la necesidad de este producto químico básico aumentará probablemente en el futuro.

Se conocen métodos para la síntesis química de isobutanol, tales como oxosíntesis, hidrogenación catalítica de monóxido de carbono (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim, Alemania, Vol. 5, págs. 716-719) y condensación de Guerbet de metanol con n-propanol (Carlini et al., J. Molec. Catal. A. Chem. 220:215-220, 2004). Estos procedimientos usan materiales de partida derivados de productos petroquímicos, son generalmente caros, y no son respetuosos con el medio ambiente. La producción de isobutanol a partir de materias primas derivadas de plantas minimizaría las emisiones de gases de invernadero y representarían un avance en la técnica.

El isobutanol se produce biológicamente como un subproducto de la fermentación por levaduras o por microorganismos diseñados de manera recombinante, modificados para expresar una ruta biosintética de butanol para producir butanol. Véase p.ej. la patente de EE.UU. N° 7.851.188. Como componente del “aceite de fusel”, que se forma como resultado del metabolismo incompleto de aminoácidos por hongos, el isobutanol es producido específicamente a partir del catabolismo de la L-valina. Después de que el grupo amina de la L-valina es recogido como fuente de nitrógeno, el a-cetoácido resultante es descarboxilado y reducido a isobutanol por enzimas de la llamada ruta de Ehrlich (Dickinson et al., J. Biol. Chem. 273:25752-25756, 1998).

Vishist K. Jain et al. (Appl Microbiol Biotechnol (2012) 93:131-141) investigaron la producción de metabolitos primarios y secundarios en cepas de S. cerevisiae donde la ruta de producción de glicerol fue inactivada mediante la deleción de los dos genes de glicerol-3-fosfato deshidrogenasas (GPD1/GPD2) y reemplazada con rutas generadoras de NAD+ alternativas.

La publicación de solicitud de patente N° WO 2012/129555 describe células huésped de levadura recombinantes y métodos para su uso para la producción de isobutanol. Las células huésped de levaduras descritas comprenden una ruta biosintética de isobutanol y al menos una de actividad aldehído deshidrogenasa reducida o eliminada, actividad acetolactato reductasa reducida o eliminada; o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad cetol-ácido reductoisomerasa.

Uno de los mecanismos clave de la pérdida de rendimiento en la producción de butanol por levaduras es la pérdida de carbono y equivalentes reductores que son desviados de la glicólisis por la conversión de fosfato de dihidroxiacetona en glicerol. La primera etapa en esta conversión es catalizada por una enzima llamada glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD). Eliminar la GPD, y por lo tanto la producción de glicerol, en levadura productora de butanol, se ha propuesto anteriormente. Sin embargo, se requiere glicerol para el crecimiento, y es un osmoprotector.

Por consiguiente, los métodos para aumentar el rendimiento de butanol y disminuir la producción de glicerol representan un avance en la técnica.

Breve compendio de la invención

Las realizaciones de la invención se exponen en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

En un aspecto, la presente invención proporciona una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) diseñada que tiene al menos 90% de identidad a SEQ Id NO: 195, en donde la enzima comprende al menos una sustitución en un residuo que corresponde a la posición 73 o 129 de SEQ ID NO: 195.

En algunas realizaciones, la enzima GPD diseñada comprende una sustitución que corresponde a la posición 73 de SEQ ID NO: 195 y una sustitución que corresponde a la posición 129 de SEQ ID NO: 195.

En algunas realizaciones, la enzima GPD diseñada tiene al menos 95% de identidad a SEQ ID NO: 195.

En algunas realizaciones, la enzima GPD diseñada tiene una Km para NADH de aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 1 mM.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante que comprende una enzima GPD diseñada de la invención, en donde el microorganismo comprende una ruta biosintética de alcohol que comprende al menos un gen que es heterólogo al microorganismo recombinante; en donde el microorganismo comprende una deleción o disrupción de un gen endógeno que codifica GPD; en donde el microorganismo tiene una producción mejorada de alcohol en comparación con un microorganismo que carece de la enzima GPD diseñada, y en donde el microorganismo es Saccharomyces cerevisiae.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la producción de alcohol usando la enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) diseñada de la invención, o el microorganismo recombinante de la invención.

Por tanto, en la presente memoria se proporcionan enzimas GPD, microorganismos recombinantes, y métodos para la producción de butanol.

También se proporcionan en la presente memoria microorganismos recombinantes de la invención que comprenden (a) una ruta biosintética de butanol diseñada que comprende al menos un polipéptido que es heterólogo al microorganismo recombinante; (b) una enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) heteróloga diseñada de la invención, en donde la GPD heteróloga tiene una Km para NADH más alta en comparación con la Km de la GPD endógena del microorganismo; y (c) una deleción o disrupción en un gen endógeno que codifica GPD. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante de la invención tiene una producción mejorada o aumentada de butanol en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una producción reducida o disminuida de glicerol en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una relación molar de butanol a glicerol aumentada en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene un rendimiento efectivo aumentado en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga.

También se describen en la presente memoria microorganismos recombinantes que comprenden (a) una ruta biosintética de butanol diseñada que comprende al menos un polipéptido que es heterólogo al microorganismo recombinante; (b) una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) heteróloga, en donde la GPD heteróloga tiene sustancialmente la misma afinidad por NADH y NADPH y/o está inhibida en retroalimentación; y (c) una deleción o disrupción en un gen endógeno que codifica GPD. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una producción de butanol mejorada o aumentada en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga. Opcionalmente, la GPD heteróloga es inhibida en retroalimentación por glicerol-3-fosfato. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una producción de glicerol reducida o disminuida en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una relación molar de butanol a glicerol aumentada en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene un rendimiento efectivo aumentado en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga.

En ciertos ejemplos, la GPD heteróloga es una GPD existente en la naturaleza. En ciertos ejemplos, la GPD existente en la naturaleza se selecciona del número EC 1.1.1.8, 1.1.5.3, o 1.1.1.94. La GPD existente en la naturaleza puede ser una GPD de un organismo seleccionado del grupo que consiste en Leishmania mexicana, Dunaliella viridis, Jaculus orientalis, Archeoglobus fulgidus, Rickettsia prowazekii, Beggiatoa alba, Kangiella koreenis, Aspergillus oryzae, Candida versatilis, Escherichia coli y Oryctolagus cuniculu.

En la invención, la GPD heteróloga es una GPD diseñada. La GPD diseñada comprende al menos una sustitución correspondiente a la posición 73 o 129 de SEQ ID NO:195. En ciertas realizaciones la DPD diseñada comprende al menos una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 73 de SEQ ID NO:195. En ciertas realizaciones la GPD diseñada comprende al menos una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 129 de SEQ ID NO:195. En ciertas realizaciones la GPD diseñada comprende al menos una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 73 de SEQ ID NO:195 y una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 129 de SEQ ID NO:195.

También se proporcionan enzimas glicerol-3-fosfato deshidrogenasas (GPD) diseñadas. En la invención, la enzima GPD diseñada tiene al menos 90% de identidad a SEQ ID NO:195. La enzima GPD diseñada comprende al menos una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 73 o 129 de SEQ ID NO:195. En ciertas realizaciones la enzima GPD diseñada comprende al menos una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 73 de SEQ ID NO:195. En ciertas realizaciones la enzima GPD diseñada comprende al menos una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 129 de SEQ ID NO:195. En ciertas realizaciones la enzima GPD diseñada comprende al menos una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 73 de SEQ ID NO:195 y una sustitución en un residuo correspondiente a la posición 129 de SEQ ID NO:129. En ciertas realizaciones, la enzima GPD diseñada tiene una Km para NADH de aproximadamente 0,01 mM a 1 mM.

También se proporcionan microorganismos recombinantes que comprenden cualquiera de las enzimas GPD diseñadas de la invención. Opcionalmente, el microorganismo recombinante puede comprender una ruta biosintética de butanol diseñada que comprende al menos un gen que es heterólogo al microorganismo recombinante. El microorganismo recombinante comprende una deleción o disrupción de un gen endógeno que codifica GPD. En ciertas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una producción de butanol mejorada o aumentada en comparación con un microorganismo que carece de la enzima GPD diseñada. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una producción de glicerol reducida o disminuida en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD diseñada. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene una relación molar de butanol a glicerol aumentada en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD diseñada. En algunas realizaciones, el microorganismo recombinante tiene un rendimiento efectivo aumentado en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD diseñada.

También se proporcionan métodos para la producción de butanol. Los métodos comprenden proporcionar un microorganismo recombinante de la invención que comprende (i) una ruta biosintética de butanol diseñada, (ii) una delación o disrupción en un gen endógeno que codifica GPD, y; (iii) una enzima GPD diseñada de la invención;

y poner en contacto el microorganismo recombinante con al menos un sustrato de carbono fermentable en condiciones en donde se produce butanol. Opcionalmente, la GPD heteróloga es inhibida en retroalimentación por glicerol-3-fosfato. En ciertas realizaciones, el microorganismo recombinante se cultiva en condiciones anaeróbicas.

El microorganismo recombinante puede comprender una ruta biosintética de butanol diseñada seleccionada del grupo que consiste en (a) una ruta biosintética de 1-butanol; (b) una ruta biosintética de 2-butanol; y (c) una ruta biosintética de isobutanol.

Opcionalmente, la ruta biosintética de 1-butanol comprende al menos un polipéptido que realiza una de las siguientes conversiones de sustrato a producto: (a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, catalizada por acetil-CoA acetiltransferasa; (b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, catalizada por 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa; (c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, catalizada por crotonasa; (d) crotonil-CoA a butiril-CoA, catalizada por butiril-CoA deshidrogenasa; (e) butiril-CoA a butiraldehído, catalizada por butiraldehído deshidrogenasa; y (f) butiraldehído a 1-butanol, catalizada por 1-butanol deshidrogenasa.

Opcionalmente, la ruta biosintética de 2-butanol comprende al menos un polipéptido que realiza una de las siguientes conversiones de sustrato a producto: (a) piruvato a alfa-acetolactato, catalizada por acetolactato sintasa; (b) alfaacetolactato a acetoína, catalizada por acetolactato descarboxilasa; (c) acetoína a 2,3-butanodiol, catalizada por butanodiol deshidrogenasa; (d) 2,3-butanodiol a 2-butanona, catalizada por butanodiol deshidratasa; y (e) 2-butanona a 2-butanol, catalizada por 2-butanol deshidrogenasa.

Opcionalmente, la ruta biosintética de isobutanol comprende al menos un polipéptido que realiza una de las siguientes conversiones de sustrato a producto: (a) piruvato a acetolactato, catalizada por acetolactato sintasa; (b) acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato, catalizada por cetol-ácido reductoisomerasa; (c) 2,3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato, catalizada por dihidroxiácido deshidratasa; (d) a-cetoisovalerato a isobutiraldehído, catalizada por una cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa; y (e) isobutiraldehído a isobutanol, catalizada por alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa.

En la invención, el microorganismo recombinante es Saccharomyces cerevisiae.

También se proporcionan microorganismos recombinantes de la invención que comprenden (a) una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) heteróloga, en donde la GPD heteróloga tiene una Km para NADH más alta en comparación con la Km de la GPD endógena del microorganismo; y (b) una deleción o disrupción en un gen endógeno que codifica GPD. En algunas realizaciones el microorganismo tiene una producción de glicerol disminuida en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga.

También se proporcionan microorganismos recombinantes de la invención que comprenden (a) una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) heteróloga, en donde la GPD heteróloga tiene sustancialmente la misma afinidad por NADH y NADPH y/o está inhibida en retroalimentación; y (b) una deleción o disrupción en un gen endógeno que codifica GPD. Opcionalmente, la GPD heteróloga es inhibida en retroalimentación por glicerol-3-fosfato. En algunas realizaciones el microorganismo tiene una producción de glicerol disminuida en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga.

También se proporcionan microorganismos recombinantes de la invención que comprenden una GPD heteróloga, en donde la GPD heteróloga tiene sustancialmente la misma afinidad por NADH y NADPH y/o es inhibida en retroalimentación, y en donde el microorganismo tiene una producción de glicerol disminuida en comparación con un microorganismo recombinante de control que carece de la GPD heteróloga. Opcionalmente, la GPD heteróloga es inhibida en retroalimentación por glicerol-3-fosfato.

Breve descripción de los dibujos/figuras

La Figura 1 muestra un mapa del plásmido usado para expresar proteínas GPD variantes en E. coli.

La Figura 2 muestra una alineación parcial de las secuencias de GPD truncada humana (SEQ ID NO:190), Saccharomyces cerevisiae (GPD1) (SEQ ID NO:191), Rickettsia prowazekii (SEQ ID NO:192), Beggiatoa alba (Se Q ID NO: 193) y Kangiella koreensis (SEQ ID NO:194). El asterisco (*) indica las posiciones de los phe41 y phe97 en la secuencia truncada humana.

La Figura 3 muestra un gráfico que demuestra datos de 20 horas de producción para los cultivos de la variante de GPD1 indicada y células de control. Se ensayaron por duplicado dos clones para cada variante. 2145: cepa de control isobutanológena con WT GPD que es PNY2145 transformada con pLMH111-JM44; EC_1 y EC_2: Gp D optimizada de E. coli; E3 y E8: variantes de GPD1 optimizadas de E. coli; N3 y N8: variantes de GPD con utilización de codones nativos de levadura; M3 y M8: variantes de GPD optimizados por codones de levadura. Las variantes E3, N3 y M3 tienen sustitución F73A, y las variantes E8, N8 y M8 tienen sustituciones F73G/F129G.

La Figura 4 muestra un gráfico que demuestra una comparación de la relación isobutanol (iBuOH)/glicerol (Gly) con la actividad de GPD medida (U/mg). La ecuación de regresión para la relación iBuOH/Gly es igual a 2,93 - 234GPD (U/mg) (R-Sq = 60,1%; R-Sq(pred) = 25,04%).

La Figura 5 muestra un gráfico que demuestra una comparación del título de isobutanol medido con valores calculados mediante la ecuación de regresión lineal (FIT_2) (S = 0,159277; R-Sq = 98,6%; R-Sq(adj) = 97,6%; PRESS = 0,415575; R-Sq(pred) = 94,32%). La constante y coeficientes para la ecuación de regresión se proporcionan en la Tabla 12.

La Figura 6 muestra un gráfico que demuestra una comparación del rendimiento de isobutanol (gramos de isobutanol/gramo de glucosa consumido) con los valores calculados mediante la ecuación de regresión lineal (FIT_4) (S = 0,0101071; R-Sq = 93,9%; R-Sq(adj) = 91,4%; PRESS = 0,00197878; R-Sq(pred) = 76,30%). La constante y coeficientes para la ecuación de regresión se proporcionan en la Tabla 13.

La Figura 7 muestra un gráfico del rendimiento de isobutanol (gramos de isobutanol producido por gramo de glucosa consumido) a 28 y 42 horas para las cepas isobutanológenas CPN97 y PNY2310.

La Figura 8 muestra un gráfico de la relación isobutanol/glicerol a 28 y 42 horas para las cepas isobutanológenas CPN97 y PNY2310.

La Figura 9 muestra un gráfico de la glucosa consumida en función del tiempo para las cepas isobutanológenas CPN97 y PNY2310.

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto corriente en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, la presente solicitud que incluye las definiciones prevalecerá. También, a menos que sea requerido de otro modo por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

A fin de definir adicionalmente esta invención, se proporcionan los siguientes términos, abreviaturas y definiciones.

Se entenderá que “derivado de”, con referencia a los polipéptidos descritos en la presente memoria, abarca secuencias sintetizadas en base a las secuencias de aminoácidos de las GPDs, u otras enzimas, presentes en los organismos indicados, así como los clonados directamente a partir del material genético del organismo.

Como se emplean en la presente memoria, se entenderá que los términos “comprende”, “que comprende”, “ incluye”, “que incluye”, “tiene”, “que tiene”, “contiene” o “que contiene”, o cualquier otra variación de los mismos, implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros, y se pretende que sean no exclusivos o de extremo abierto. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un procedimiento, un método, un artículo, o un aparato que comprende una lista de elementos no está limitado necesariamente a solo esos elementos sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a tal composición, mezcla, procedimiento, método, artículo o aparato. Además, a menos que se indique expresamente lo contrario, “o” hace referencia a un o inclusivo, y no a un o exclusivo. Por ejemplo, una condición A o B es satisfecha por uno cualquiera de lo siguiente: A es verdadero (o presente) y B es falso (o no presente), A es falso (o no presente) y B es verdadero (o presente), tanto A como B son verdaderos (o presentes).

Como se emplea en la presente memoria, el término “consiste en”, o variaciones tales como “consisten en” o “que consiste en”, usados en toda la memoria descriptiva y reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros recitados, pero que no puede añadirse ningún número entero o grupo de números enteros adicional al método, estructura o composición especificados.

Como se emplea en la presente memoria, el término “consiste esencialmente en”, o variaciones tales como “consisten esencialmente en” o “que consiste esencialmente en”, usados en toda la memoria descriptiva y reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros recitados, y la inclusión opcional de cualquier número entero o grupo de números enteros recitados que no cambien materialmente las propiedades básicas o nuevas del método, estructura o composición especificados. Véase M.P.E.P. § 2111.03.

También, se pretende que los artículos indefinidos “un” y “uno” que preceden un elemento o componente de la invención sean no restrictivos con respecto al número de casos, es decir, ocurrencias del elemento o componente. Por lo tanto “un/una” o “uno/una” deben ser leídos para incluir uno o al menos uno, y la forma de la palabra singular del elemento o componente también incluye el plural, a menos que signifique obviamente que el número sea singular.

El término “invención” o “presente invención”, como se emplea en la presente memoria, es un término no limitante y no pretende hacer referencia a ninguna realización única de la invención particular, sino que abarca todas las realizaciones posibles descritas en las reivindicaciones presentadas o enmendadas o suplementadas posteriormente, o en la memoria descriptiva.

Como se emplea en la presente memoria, el término “aproximadamente”, que modifica la cantidad de un ingrediente o reaccionante de la invención empleado, hace referencia a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, mediante procedimientos típicos de medida y manejo de líquidos usados para preparar concentrados o disoluciones en el mundo real; mediante un error en estos procedimientos; mediante diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o para llevar a cabo los métodos; y similares. El término “aproximadamente” también abarca cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Ya sean modificadas o no por el término “aproximadamente”, las reivindicaciones incluyen equivalentes a las cantidades. En una realización, el término “aproximadamente” significa dentro de 10% del valor numérico reportado, o dentro de 5% del valor numérico reportado.

El término “ruta biosintética de butanol”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la ruta enzimática para producir 1-butanol, 2-butanol o isobutanol.

El término “ruta biosintética de 1-butanol” hace referencia a una ruta enzimática para producir 1-butanol. Una “ruta biosintética de 1-butanol” puede hacer referencia a una ruta enzimática para producir 1-butanol a partir de acetilcoenzima A (acetil-CoA). Por ejemplo, se describen rutas biosintéticas de 1-butanol en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2008/0182308 y la publicación internacional N° WO 2007/041269.

El término “ruta biosintética de 2-butanol” hace referencia a una ruta enzimática para producir 2-butanol. Una “ruta biosintética de 2-butanol” puede hacer referencia a una ruta enzimática para producir 2-butanol a partir de piruvato. Por ejemplo, se describen rutas biosintéticas de 2-butanol en la patente de EE.UU. N° 8.206.970, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2007/0292927, las publicaciones internacionales Nos. WO 2007/130518 y WO 2007/130521.

El término “ruta biosintética de isobutanol” hace referencia a una ruta enzimática para producir isobutanol. Una “ruta biosintética de isobutanol” puede hacer referencia a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato. Por ejemplo, se describen rutas biosintéticas de isobutanol en la patente de Ee .UU. N° 7.851.188, la publicación de solicitud de EE.UU. N° 2007/0092957, y la publicación internacional N° WO 2007/050671. De vez en cuando “ruta biosintética de isobutanol” se usa de manera sinónima con “ruta de producción de isobutanol”.

El término “butanol”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a los isómeros de butanol 1-butanol (1-BuOH), 2-butanol (2-BuOH), terc-butanol (t-BuOH) y/o isobutanol (iBuOH o i-BuOH, conocido también como 2-metil-1-propanol), bien individualmente o bien como mezclas de los mismos. De vez en cuando, como se emplean en la presente memoria, los términos “biobutanol” y “butanol bioproducido” pueden usarse de manera sinónima con “butanol”.

Los usos para el butanol pueden incluir, pero no se limitan a, combustibles (p.ej., biocombustibles), un aditivo para combustibles, un alcohol usado para la producción de ésteres que pueden usarse como combustible diésel o biodiésel, como producto químico en la industria de los plásticos, un ingrediente en productos formulados tales como cosméticos, y un compuesto químico intermedio. El butanol también puede usarse como disolvente para pinturas, revestimientos, barnices, resinas, gomas, tintes, grasas, ceras, resinas, goma laca, cauchos y alcaloides.

Como se emplea en la presente memoria, el término “bioproducido” significa que la molécula (p.ej., butanol) se produce a partir de una fuente renovable (p.ej., la molécula puede producirse durante un proceso de fermentación a partir de una materia prima renovable). Así, por ejemplo, un butanol bioproducido puede ser isobutanol producido por un proceso de fermentación a partir de una materia prima renovable. Las moléculas producidas a partir de una fuente renovable pueden ser definidas además por la relación de isótopos 14C/12C. Una relación de isótopos 14C/12C en el intervalo de 1:0 a mayor que 0:1 indica una molécula bioproducida, mientras que una relación de 0:1 indica que la molécula es de procedencia fósil.

Una célula huésped recombinante que comprende una “ruta de producción de alcohol diseñada” (tal como una ruta de producción de butanol o isobutanol diseñada) hace referencia a una célula huésped que contiene una ruta modificada que produce alcohol de una manera diferente de la presente normalmente en la célula huésped. Tales diferencias incluyen la producción de un alcohol no producido típicamente por la célula huésped, o una producción aumentada o más eficaz.

El término “ruta biosintética heteróloga”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a una ruta enzimática para producir un producto en el que al menos una de las enzimas no es endógena a la célula huésped que contiene la ruta biosintética.

El término “extractante”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a uno o más disolventes orgánicos que pueden usarse para extraer alcohol (p.ej., butanol) de un caldo de fermentación.

El término “productividad de isobutanol efectiva”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la cantidad total en gramos de isobutanol producido por gramo de células.

El término “título efectivo”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la cantidad total de un alcohol particular (p.ej., butanol) producido por fermentación por litro de medio de fermentación. La cantidad total de butanol incluye: (i) la cantidad de butanol en el medio de fermentación; (ii) la cantidad de butanol recuperada del extractante orgánico; y (iii) la cantidad de butanol recuperada de la fase gaseosa, si se usa purificación de gases.

El término “tasa efectiva”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la cantidad total de alcohol (p.ej., butanol) producido por fermentación por litro de medio de fermentación por hora de fermentación.

El término “rendimiento efectivo”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la cantidad de alcohol (p.ej., butanol) producido por unidad de sustrato de carbono fermentable consumido por el biocatalizador.

El término “separación”, como se emplea en la presente memoria, es sinónimo a “recuperación”, y hace referencia a retirar un compuesto químico de una mezcla inicial para obtener el compuesto en mayor pureza o en una concentración más alta que la pureza o concentración del compuesto en la mezcla inicial.

El término “fase acuosa”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la fase acuosa de una mezcla bifásica obtenida poniendo en contacto un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmiscible con el agua. En una realización de un procedimiento descrito en la presente memoria que incluye extracción fermentativa, el término “caldo de fermentación” hace referencia específicamente entonces a la fase acuosa en extracción fermentativa bifásica.

El término “fase orgánica”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida poniendo en contacto un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmiscible con el agua.

El término “sustrato de carbono” o “sustrato de carbono fermentable” hace referencia a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por organismos huéspedes de la presente descripción y particularmente fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, y sustratos de un carbono o mezclas de los mismos. Se proporcionan en la presente memoria ejemplos no limitantes de sustratos de carbono, e incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, etanol, lactato, succinato, glicerol, dióxido de carbono, metanol, glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, dextrosa, celulosa, metano, aminoácidos o mezclas de los mismos.

“Caldo de fermentación”, como se emplea en la presente memoria, significa la mezcla de agua, azúcares (fuentes de carbono fermentables), sólidos disueltos (si están presentes), microorganismos que producen alcohol, alcohol producto y todos los demás constituyentes del material en el que se está formando el alcohol producto por la reacción de azúcares a alcohol, agua y dióxido de carbono (CO²) por los microorganismos presentes. De vez en cuando, como se emplea en la presente memoria, el término “medio de fermentación” y “mezcla fermentada” pueden usarse de manera sinónima con “caldo de fermentación”.

Como se emplea en la presente memoria, un “fermentador” hace referencia a cualquier recipiente, recipientes o aparatos que se usan para fermentar un sustrato. Un fermentador puede contener un medio de fermentación y un microorganismo capaz de realizar una fermentación. El término “recipiente de fermentación” se refiere al recipiente en el que se lleva a cabo la reacción de fermentación por la cual se forma un alcohol tal como butanol. “Fermentador” puede usarse en la presente memoria de manera intercambiable con “recipiente de fermentación”.

El término “producto de fermentación” incluye cualquier producto de interés deseado, que incluye, pero no se limita a, 1-butanol, 2-butanol, isopropanol, etc.

“Biomasa”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a un producto natural que contiene un almidón hidrolizable que proporciona un azúcar fermentable, incluyendo cualquier material celulósico o lignocelulósico y materiales que comprenden celulosa, y que comprenden opcionalmente además hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos, disacáridos y/o monosacáridos. La biomasa también puede comprender componentes adicionales, tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede derivar de una única fuente, o la biomasa puede comprender una mezcla derivada de más que una fuente. Por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas de maíz y rastrojo de maíz, o una mezcla de hierba y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bioenergéticos, residuos agrícolas, desechos sólidos urbanos, desechos sólidos industriales, fango de la fabricación de papel, desechos de jardinería, madera y desechos forestales. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, grano de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como hojas de maíz, rastrojo de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto varilla, desechos de papel, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, serrín, arbustos y matorrales, vegetales, frutas, flores, estiércol animal y mezclas de los mismos.

“Materia prima”, como se emplea en la presente memoria, significa un producto que contiene una fuente de carbono fermentable. Las materias primas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, centeno, trigo, maíz, masa de maíz, caña, masa de caña, caña de azúcar, cebada, material celulósico, material lignocelulósico y mezclas de los mismos.

El término “biomasa”, como se emplea en la presente memoria, en algunos casos, hace referencia a la masa del cultivo, p.ej., la cantidad de microorganismos recombinantes, proporcionada típicamente en unidades de gramos por litro (g/l) de peso de células secas (dcw).

El término “condiciones aeróbicas”, como se emplea en la presente memoria, significa condiciones de crecimiento en presencia de oxígeno.

El término “condiciones microaeróbicas”, como se emplea en la presente memoria, significa condiciones de crecimiento con niveles de oxígeno bajos (es decir, por debajo de los niveles de oxígeno atmosférico normales).

El término “condiciones anaeróbicas”, como se emplea en la presente memoria, significa condiciones de crecimiento en ausencia de oxígeno.

El término “polinucleótido” pretende abarcar un ácido nucleico singular así como ácidos nucleicos plurales, y hace referencia a una molécula o constructo de ácido nucleico, p.ej., ARN mensajero (ARNm) o ADN plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de longitud completa, o un fragmento de la misma, que incluye las secuencias 5' y 3' no traducidas y las secuencias codificantes. El polinucleótido puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser a Rn o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar compuestos de ADN de hebra única y doble, ADN que es una mezcla de regiones de hebra única y doble, ARN de hebra única y doble, ARN que es una mezcla de regiones de hebra única y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebra única o, más típicamente, de hebra doble o una mezcla de regiones de hebra única y doble. “polinucleótido” abarca formas modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente.

Una secuencia de polinucleótidos puede denominarse como “aislada”, en la que ha sido retirada de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido que tiene actividad ALS contenida en un vector se considera aislado para los fines de la presente descripción. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcialmente o sustancialmente) en disolución. Los polinucleótidos aislados o ácidos nucleicos según la presente descripción incluyen además tales moléculas producidas sintéticamente. Un fragmento de polinucleótido aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Como se emplea en la presente memoria, “actividad reducida” hace referencia a cualquier disminución mensurable en una actividad biológica conocida de un polipéptido cuando se compara con la misma actividad biológica del polipéptido antes del cambio que da como resultado la actividad reducida. Tal cambio puede incluir una modificación de un polipéptido o un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria. Una actividad reducida de un polipéptido descrito en la presente memoria puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. La actividad reducida de una enzima hace referencia a regulación en descenso, ya sea parcial o total, de la actividad de la enzima en comparación con la actividad de la enzima de tipo salvaje. La regulación en descenso puede ocurrir cuando un gen nativo tiene una “disrupción” o “modificación”, que hacen referencia a una inserción, deleción o mutación dirigida a diana dentro de una porción de ese gen, que da como resultado, p.ej., una eliminación completa del gen de tal modo que el gen es borrado del genoma y no se traduce ninguna proteína, o se traduce una subunidad de proteína que tiene una inserción, deleción, sustitución de aminoácidos u otra mutación dirigida a diana. La ubicación de la modificación en la proteína puede estar, por ejemplo, dentro de la porción N-terminal de la proteína o dentro de la porción C-terminal de la proteína. La proteína modificada tendrá una actividad afectada con respecto a la proteína que no fue alterada, y puede ser no funcional. La actividad reducida en una enzima también podría resultar por manipulación de los dominios regulatorios corriente arriba o por el uso de tecnología de sentido, antisentido o ARNi, etc. Otro mecanismo para reducir la actividad de una enzima es la introducción de una mutación que altera las propiedades cinéticas de la enzima (p.ej., reduciendo la afinidad por un sustrato, disminuyendo el kcat, etc.).

Como se emplea en la presente memoria, “actividad eliminada” hace referencia a la completa abolición de una actividad biológica conocida de un polipéptido cuando se compara con la misma actividad biológica del polipéptido antes del cambio que da como resultado la actividad eliminada. Tal cambio puede incluir una modificación de un polipéptido o un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria. Una actividad eliminada incluye una actividad biológica de un polipéptido que no es mensurable cuando se compara con la misma actividad biológica del polipéptido antes del cambio que da como resultado la actividad eliminada. Una actividad eliminada del polipéptido descrito en la presente memoria puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria.

Los términos “PDC-“, “inactivación de PDC” o “PDC-KO”, como se emplean en la presente memoria, hacen referencia a una célula que tiene una modificación genética para inactivar o reducir la expresión de un gen que codifica piruvato descarboxilasa (PDC), con lo que la célula carece sustancialmente o completamente de actividad enzimática piruvato descarboxilasa. Si la célula tiene más que un gen PDC expresado (activo), entonces cada uno de los genes PDC activos puede estar inactivado o tener una expresión mínima, produciendo de este modo una célula PDC-.

El término “actividad específica”, como se emplea en la presente memoria, se define como las unidades de actividad en una cantidad dada de proteína. Así, la actividad específica no se mide directamente, sino que se calcula dividiendo 1) la actividad en unidades/ml de la muestra de enzima por 2) la concentración de proteína en esa muestra, con lo que la actividad específica se expresa como unidades/mg, donde una unidad de enzima se define como moles de producto formado/minuto. La actividad específica de una muestra de enzima totalmente activa, pura, es una característica de esa enzima. La actividad específica de una muestra de una mezcla de proteínas es una medida de la fracción relativa de proteína en esa muestra que está compuesta de la enzima activa de interés.

Los términos “kcat” y “K^m” son conocidos por los expertos en la técnica, y se describen en Enzyme Structure and Mechanism, 2a ed. (Ferst; W.H. Freeman Press, NY, 1985; págs. 98-120). K^m , la constante de Michaelis, es la concentración de sustrato que conduce a la mitad de la velocidad máxima. El término “kcat”, llamado a menudo “número de producción”, se define como el número máximo de moléculas de sustrato convertidas en productos por sitio activo por unidad de tiempo, o el número de veces que la enzima rinde por unidad de tiempo. kcat = Vmax/[E], donde [E] es la concentración de la enzima (Ferst, arriba). Los términos “producción total” y “número de producción total” se usan en la presente memoria para hacer referencia a la cantidad de producto formado por la reacción de una enzima con un sustrato.

El término “eficacia catalítica” se define como el kcat/KM de una enzima. La eficacia catalítica se usa para cuantificar la especificidad de una enzima por un sustrato.

El término “molécula de ácido nucleico aislado”, “fragmento de ácido nucleico aislado” y “constructo genético” se usan de manera intercambiable y significan un polímero de ARN o ADN que es de hebra única o doble, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El término “aminoácido” hace referencia a la unidad estructural química básica de una proteína o polipéptido. Las abreviaturas en la Tabla 1 se usan en la presente memoria para identificar aminoácidos específicos.

Tabla 1: Aminoácidos y abreviaturas de los mismos.

El término “gen” hace referencia a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de ser expresado como una proteína específica, que incluye opcionalmente secuencias regulatorias que preceden (secuencias no codificantes 5') o que siguen (secuencias no codificantes 3') a la secuencia codificante. “Gen nativo” hace referencia a un gen encontrado en la naturaleza con sus propias secuencias regulatorias. “Gen quimérico” hace referencia a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias regulatorias y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias regulatorias y secuencias codificantes que derivan de fuentes diferentes, o secuencias regulatorias y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente de la encontrada en la naturaleza. “Gen endógeno” hace referencia a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un microorganismo. Un gen “extraño” hace referencia a un gen no encontrado normalmente en el microorganismo huésped, pero que se introduce en el microorganismo huésped por transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un microorganismo no nativo, o genes quiméricos. Un “transgen” es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

Como se emplea en la presente memoria, “nativa” hace referencia a la forma de un polinucleótido, gen o polipéptido encontrado en la naturaleza con sus propias secuencias regulatorias, si están presentes.

Como se emplea en la presente memoria, el término “secuencia codificante” o “región codificante” hace referencia a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos específica.

Como se emplea en la presente memoria, “endógena” hace referencia a la forma nativa de un polinucleótido, gen o polipéptido en su ubicación natural en el organismo o en el genoma de un organismo. “Polinucleótido endógeno” incluye un polinucleótido nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. “Gen endógeno” incluye un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. “Polipéptido endógeno” incluye un polipéptido nativo en su ubicación natural en el organismo transcrito y traducido a partir de un polinucleótido o gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo.

El término “heterólogo”, cuando se emplea en referencia a un polinucleótido, un gen o un polipéptido hace referencia a un polinucleótido, gen o polipéptido no encontrado normalmente en el organismo huésped. “Heteróloga” también incluye una región codificante nativa, o porción de la misma, que es reintroducida en el organismo fuente en una forma que es diferente del gen nativo correspondiente, p.ej., no en su ubicación natural en el genoma del organismo. El polinucleótido o gen heterólogo puede ser introducido en el organismo huésped, p.ej., por transferencia de genes. Un gen heterólogo puede incluir una región codificante nativa con regiones regulatorias no nativas que es reintroducido en el huésped nativo. Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir una región codificante nativa que es una porción de un gen quimérico que incluye regiones regulatorias no nativas que es reintroducido en el huésped nativo. “Polipéptido heterólogo” incluye un polipéptido nativo que es reintroducido en el organismo fuente en una forma que es diferente del polipéptido nativo correspondiente. Un polipéptido o polinucleótido “heterólogo” también puede incluir un polipéptido o polinucleótido diseñado por ingeniería genética que comprende una diferencia del polipéptido o polinucleótido “nativo”, p.ej., una mutación de punto dentro del polinucleótido endógeno puede dar como resultado la producción de un polipéptido “heterólogo”. Como se emplea en la presente memoria, un “gen quimérico”, un “gen extraño” y un “transgen” pueden ser ejemplos de genes “heterólogos”.

Un “transgen” es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

Como se emplea en la presente memoria, el término “modificación” hace referencia a un cambio en un polinucleótido descrito en la presente memoria que da como resultado una actividad reducida o eliminada de un polipéptido codificado por el polinucleótido, así como un cambio en un polipéptido descrito en la presente memoria que da como resultado una actividad reducida o eliminada del polipéptido. Tales cambios pueden hacerse por métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, deleción, mutación (p.ej., mutagénesis espontánea, mutagénesis aleatoria, mutagénesis causada por genes mutadores, o mutagénesis de transposón), sustitución, inserción, regulación en descenso, alteración de la ubicación celular, alteración del estado del polinucleótido o polipéptido (p.ej., metilación, fosforilación o ubiquitinación), retirada de un cofactor, introducción de un ARN/ADN antisentido, introducción de un ARN/ADN interferente, modificación química, modificación covalente, irradiación con rayos UV o X, recombinación homóloga, recombinación mitótica, métodos de reemplazo de promotores, y/o combinaciones de los mismos. Puede encontrarse una guía en la determinación de qué nucleótidos o residuos de aminoácidos pueden ser modificados comparando la secuencia del polinucleótido o polipéptido particular con la de polinucleótidos o polipéptidos homólogos, p.ej., de levaduras o bacterianos, y maximizando el número de modificaciones hechas en regiones de alta homología (regiones conservadas) o secuencias de consenso.

La expresión “elemento de expresión genética recombinante” hace referencia a un fragmento de ácido nucleico que expresa una o más proteínas específicas, que incluyen secuencias regulatorias que preceden (secuencias no codificantes 5') y que siguen (secuencias de terminación 3') a secuencias codificantes para las proteínas. Un gen quimérico es un elemento de expresión genética recombinante. Las regiones codificantes de un operón pueden formar un elemento de expresión genética recombinante, junto con un promotor enlazado de manera operable y una región de terminación.

“Secuencias regulatorias” hace referencia a secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro de, o corriente abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias regulatorias pueden incluir promotores, potenciadores, operadores, represores, señales de terminación de transcripción, secuencias principales de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento de ARN, sitio de unión con efectores y estructura ...

El término “promotor” hace referencia a una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante está situada 3' a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ácidos nucleicos sintéticos. Los expertos en la técnica entienden que promotores diferentes pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos celulares diferentes, o en diferentes fases de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Los promotores que causan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares en la mayoría de las veces se denominan habitualmente “promotores constitutivos”. “Promotores inducibles”, por otra parte causan que un gen se exprese cuando el promotor es inducido o excitado por una señal o molécula específica al promotor. Se reconoce además que, dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias regulatorias no han sido definidos completamente, fragmentos de ADN de longitudes diferentes pueden tener una actividad promotora idéntica. Por ejemplo, se entenderá que puede usarse “promotor FBA1” para hacer referencia a un fragmento derivado de la región promotora del gen FBA1.

El término “terminador” como se emplea en la presente memoria, hace referencia a secuencias de ADN ubicadas corriente abajo de una secuencia codificante. Esto incluye secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales regulatorias capaces de afectar al procesamiento de ARNm o expresión de genes. La señal de poliadenilación se caracteriza habitualmente afectando a la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. La región 3' puede influir en la transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia codificante asociada. Se reconoce que, dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias regulatorias no han sido definidos completamente, fragmentos de ADN de longitudes diferentes pueden tener una actividad terminadora idéntica. Por ejemplo, se entenderá que puede usarse “terminador CYC1” para hacer referencia a un fragmento derivado de la región terminadora del gen CYC1.

La expresión “enlazado de manera operable” hace referencia a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico, con lo que la función de uno es afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está enlazado de manera operable con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar enlazadas de manera operable a secuencias regulatorias en orientación sentido o antisentido.

El término “expresión”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la descripción. Expresión también puede hacer referencia a traducción de ARNm en un polipéptido.

El término “sobreexpresión”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a una expresión que es más alta que la expresión endógena de un gen endógeno comparable.

El término sobreexpresión hace referencia a un aumento en el nivel de ácido nucleico o proteína en una célula huésped. Así, puede resultar sobreexpresión de aumentar el nivel de transcripción o traducción de una secuencia endógena en una célula huésped o puede resultar de la introducción de una secuencia heteróloga en una célula huésped. También puede resultar sobreexpresión de aumentar la estabilidad de una secuencia de ácido nucleico o proteína.

Como se emplea en la presente memoria, el término “transformación” hace referencia a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de un microorganismo huésped, dando resultado una herencia genéticamente estable. Los microorganismos huéspedes que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformado se denominan microorganismos “transgénicos”, o “recombinantes” o “transformados”.

Los términos “plásmido”, “vector” y “caja” hacen referencia a un elemento cromosómico extra que lleva a menudo genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y están habitualmente en la forma de fragmentos de ADN de doble hebra circulares. Tales elementos pueden ser secuencias autónomamente replicantes, secuencias integradoras del genoma, secuencias de fagos o nucleótidos, lineales o circulares, de un ADN o ARN de hebra única o doble, derivadas de cualquier fuente, en la que varias secuencias de nucleótidos han sido unidas o recombinadas en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN para un producto genético seleccionado junto con una secuencia no traducida 3'apropiada en una célula. “Caja de transformación” hace referencia a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que facilita la transformación de una célula huésped particular. “Caja de expresión” hace referencia a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos además del gen extraño que permiten una expresión potenciada de ese gen en un huésped extraño.

Como se emplea en la presente memoria, el término “degeneración de codón” hace referencia a la naturaleza en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El experto en la materia conoce bien la “preferencia a codones” exhibida por una célula huésped específica en la utilización de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para una expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el gen de tal modo que su frecuencia de utilización de codones se acerca a la frecuencia de utilización de codones preferida de la célula huésped.

El término “optimizado por codones”, cuando hace referencia a genes o regiones codificantes de moléculas de ácidos nucleicos para la transformación de diversos huéspedes, hace referencia a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácidos nucleicos para reflejar la utilización de codones típica del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ADN. Tal optimización incluye reemplazar al menos uno, o más que uno, o un número significativo de codones con uno o más codones que son usados más frecuentemente en los genes de ese organismo.

Las desviaciones en la secuencia de nucleótidos que comprenden los codones que codifican los aminoácidos de cualquier cadena polipeptídica permiten variaciones en la secuencia que codifica para el gen. Dado que cada codón consiste en tres nucleótidos, y los nucleótidos que comprenden ADN están restringidos a cuatro bases específicas, hay 64 combinaciones posibles de nucleótidos, 61 de las cuales codifican aminoácidos (los tres codones restantes codifican señales que terminan la traducción). El “código genético” que muestra qué codones codifican qué aminoácidos se reproduce en la presente memoria como Tabla 2A. Como resultado, muchos aminoácidos son designados por más que un codón. Por ejemplo, los aminoácidos alanina y prolina son codificados por cuatro tripletes, la serina y arginina por seis, mientras que el triptófano y la metionina son codificados por sólo un triplete. Esta degeneración permite que la composición de bases del a Dn varíe sobre un amplio intervalo sin alterar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el ADN.

Tabla 2A: El código genético estándar

Muchos organismos presentan una tendencia al uso de codones particulares para codificar para la inserción de un aminoácido particular en una cadena peptídica creciente. La preferencia de codones, o tendencia de codones, las diferencias en la utilización de codones entre organismos, es proporcionada por la degeneración del código genético, y está bien documentada entre muchos organismos. La tendencia de codones a menudo se correlaciona con la eficacia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que es dependiente de, entre otros, las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt). La predominancia de ARNts seleccionados en una célula es generalmente un reflejo de los codones usados más frecuentemente en la síntesis de péptidos.

Por consiguiente, los genes pueden ser adaptados para una expresión de genes óptima en un organismo dado en base a la optimización por codones.

Dado el gran número de secuencias de genes disponibles para una amplia variedad de especies animales, vegetales y microbianas, es posible calcular las frecuencias relativas de utilización de codones. Están fácilmente disponibles tablas de utilización de codones, por ejemplo, en el “Codon Usage Database” disponible en http://www.kazusa.or.jp/codon/ (visitada el 20 de marzo de 2008), y estas tablas pueden ser adaptadas de varias maneras. Véase Nakamura, Y., et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Las tablas de utilización de codones para la levadura, calculadas a partir de GenBank Release 128.0 [15 de febrero de 2002], se reproducen a continuación como Tabla 2B. Esta tabla usa la nomenclatura de ARNm, y por tanto, en lugar de timina (T), que se encuentra en el ADN, las tablas usan uracilo (U), que se encuentra en el ARN. La Tabla 2B ha sido adaptada para que se calculen las frecuencias para cada aminoácido, en vez de para los 64 codones.

Tabla 2B: Tabla de utilización de codones para Saccharomyces cerevisiae

Utilizando esta tabla o similares, un experto habitual en la técnica puede aplicar las frecuencias a cualquier secuencia polipeptídica dada, y producir un fragmento de ácido nucleico de una región codificante optimizada por codones que codifica el polipéptido, pero que usa codones óptimos para una especie dada.

Asignar al azar codones a una frecuencia optimizada para codificar una secuencia polipeptídica dada puede hacerse manualmente calculando las frecuencias de codón para cada aminoácido, y asignando después los codones a la secuencia polipeptídica al azar. Adicionalmente, están disponible para los expertos habituales en la técnica diversos algoritmos y programas informáticos. Por ejemplo, la función “EditSeq” en el Paquete Lasergene, disponible en DNAstar, Inc., Madison, WI, la función de retrotraducción en el Paquete VectorNTI, disponible en InforMax, Inc., Bethesda, MD, y la función “retrotraducir” en el Paquete GCG-Wisconsin, disponible en Accelrys, Inc., San Diego, CA. Además, están disponibles públicamente varios recursos para optimizar por codones secuencias de regiones codificantes, p.ej., la función de “retrotraducción” en http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php?lanl=eng (visitada el 15 de abril de 2008) y la función “retro-transeq” disponible en http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html (visitada el 9 de julio de 2002). Construir un algoritmo rudimentario para asignar codones en base a una frecuencia dada también puede ser llevado a cabo fácilmente con funciones matemáticas básicas por un experto habitual en la técnica.

Las regiones codificantes optimizadas en codones pueden diseñarse por diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen paquetes informáticos tales como “diseñador de genes sintéticos” (userpages.umbc.edu/~wug1/codon/sgd/, visitada el 19 de marzo de 2012).

Un polinucleótido o fragmento de ácido nucleico es “hibridable” a otro fragmento de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico, o molécula de ARN, cuando una forma de hebra única del fragmento de ácido nucleico puede combinarse con el otro fragmento de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica en disolución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas, y se ilustran en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 en el mismo. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la “astringencia” de la hibridación. Las condiciones de astringencia pueden ajustarse para cribar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homólogas de organismos relacionados lejanamente), a fragmentos altamente similares (tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos relacionados estrechamente). Los lavados post-hibridación determinan las condiciones de astringencia. Un juego de condiciones usa una serie de lavados que parten de 6X SSC, 0,5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, repetido después con 2X SSC, 0,5% s Ds a 45°C durante 30 min, y repetido después dos veces con 0,2X SSC, 0,5% Sd S a 50°C durante 30 min. Otro juego de condiciones astringentes usa temperaturas más altas, en las que los lavados son idénticos a los anteriores excepto que la temperatura de los dos lavados de 30 min finales en 0,2X SSC, 0,5% SDS se aumentó hasta 60°C. Otro juego de condiciones altamente astringentes usa dos lavados finales en 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C. Un juego adicional de condiciones astringentes incluye una hibridación a 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C y lavados con 2X SSC, 0,1% SDS seguido de 0,1X SSC, 0,1% SDS, por ejemplo.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la astringencia de la hibridación, son posibles las discordancias entre bases. La astringencia apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a un Tm más alto) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos mayores que 100 nucléotidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook et al, arriba, 9.50 9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de las discordancias se hace más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al, arriba, 11.7 11.8). En una realización la longitud para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 10 nucleótidos. En una realización, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 15 nucleótidos; al menos aproximadamente 20 nucleótidos; o la longitud es al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, el experto en la materia reconocerá que la temperatura y concentración salina de la disolución de lavado puede ajustarse como sea necesario según factores tales como la longitud de la sonda.

Como se emplea en la presente memoria, el término “polipéptido” pretende abarcar un “polipéptido” singular, así como “polipéptidos” plurales, y hace referencia a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) enlazados linealmente por enlaces amida (conocidos también como enlaces peptídicos). El término “polipéptido” hace referencia a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no hace referencia a una longitud específica del producto. Por tanto, péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, “proteína”, “cadena de aminoácidos”, o cualquier otro término usado para hacer referencia a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, están incluidos dentro de la definición de “polipéptido”, y el término “polipéptido” puede usarse en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o producirse por tecnología recombinante, pero no es traducido necesariamente desde una secuencia de ácidos nucleicos designada. Puede generarse de cualquier manera, incluyendo por síntesis química.

Mediante un polipéptido “aislado” o un fragmento, variante o derivado del mismos se quiere decir un polipéptido que no está en su entorno natural. No se requiere ningún nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede ser retirado de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para los fines de la descripción, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido separados, fraccionados, o purificados parcialmente o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.

Como se emplea en la presente memoria, los términos “variante” y “mutante” son sinónimos y hacen referencia a un polipéptido que difiere de un polipéptido recitado específicamente en una o más inserciones, deleciones, mutaciones y sustituciones de aminoácidos, creadas usando, p.ej., técnicas de ADN recombinante, tales como mutagénesis. Puede encontrarse una guía para determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser reemplazados, añadidos o borrados sin abolir actividades de interés, comparando la secuencia del polipéptido particular con la de polipéptidos homólogos, p.ej., de levadura o bacterianos, y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en regiones de alta homología (regiones conservadas) o reemplazando aminoácidos con secuencias de consenso.

“Polipéptido diseñado”, como se emplea en la presente memoria, hace referencia a un polipéptido que es sintético, es decir, que difiere de alguna manera de un polipéptido encontrado en la naturaleza.

Alternativamente, pueden sintetizarse o seleccionarse variantes de polinucleótidos recombinantes que codifican estos mismos o similares polipéptidos haciendo uso de la “redundancia” en el código genético. Pueden introducirse diversas sustituciones de codones, tales como cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un plásmido o vector vírico para expresión. Las mutaciones en la secuencia del polinucleótido pueden reflejarse en el polipéptido o dominios de otros péptidos añadidos al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido. Por ejemplo, pueden usarse mutaciones para reducir o eliminar la expresión de una proteína diana, e incluyen, pero no se limitan a, deleción del gen entero o una porción del gen, inserción de un fragmento de ADN en el gen (en el promotor o bien la región codificante) para que la proteína no se exprese o se exprese en niveles más bajos, introducir una mutación en la región codificante que añade un codón de parada o desplazamiento estructural de tal modo que una proteína funcional no se exprese, e introducir una o más mutaciones en la región codificante para alterar aminoácidos para que se exprese una proteína no funcional o una menos activa enzimáticamente.

Las “sustituciones” de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, reemplazos de aminoácidos conservativos, o pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con un aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes, es decir, reemplazos de aminoácidos no conservativos. Las sustituciones de aminoácidos “conservativas” pueden hacerse en base a similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos “no conservativas” pueden hacerse seleccionando las diferencias en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, o la naturaleza anfipática de cualquiera de estos aminoácidos. Las “inserciones” o “deleciones” pueden estar dentro del intervalo de variación tolerado estructuralmente o funcionalmente por las proteínas recombinantes. La variación permitida puede determinarse experimentalmente haciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptido usando técnicas de ADN recombinante y ensayando las variantes recombinantes resultantes en cuanto a actividad.

Una “porción sustancial” de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos es la porción que comprende lo suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, bien por evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica, o bien por comparación y/o identificación de secuencias automatizada por ordenador usando algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). En general, es necesaria una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos para identificar putativamente una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos como homóloga a una proteína o gen conocidos. Además, con respecto a secuencias de nucleótidos, pueden usarse sondas de oligonucleótidos específicas a genes que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos en métodos dependientes de secuencias de identificación de genes (p.ej., hibridación Sureña) y aislamiento (p.ej., hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos). Además, pueden usarse oligonucleótidos cortos de 12-15 bases como cebadores de amplificación en PCR para obtener un fragmento de ácido nucleico particular que comprende los cebadores. Por consiguiente, una “porción sustancial” de una secuencia de nucleótidos comprende lo suficiente de la secuencia para identificar específicamente y/o aislar un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente memoria descriptiva explica la secuencia de aminoácidos y nucleótidos completa que codifica proteínas particulares. El experto en la materia, que tiene el beneficio de las secuencias reportadas en la presente memoria, puede usar ahora todo o una porción sustancial de las secuencias descritas para fines conocidos por los expertos en esta técnica. Por consiguiente, la presente descripción comprende las secuencias completas reportadas en el Listado de Secuencias acompañante, así como porciones sustanciales de esas secuencias definidas anteriormente.

El término “complementarias” se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos que son capaces de hibridarse unas a otras. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a ala guanina, y con respecto al ARN, la adenina es complementaria al uracilo y la citosina es complementaria a la guanina.

La expresión “porcentaje de identidad”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, como pueda ser el caso, determinada por la concordancia entre cuerdas de tales secuencias. La “identidad” y “similitud” pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M. and Griffin, H. G., eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.) Stockton: Ny (1991).

Los métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor concordancia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Las alineaciones de secuencias y cálculos de porcentajes de identidad pueden realizarse usando el programa MegAlign™ del paquete de computación bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Las alineaciones múltiples de secuencias se realizan usando el “método de alineación Clustal” que abarca varias variedades del algoritmo que incluye el “método de alineación Clustal V” correspondiente al método de alineación etiquetado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) y encontrado en el programa MegAlign™ del paquete de computación bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineaciones múltiples, los valores por defecto corresponden a GAP PENALTY=10 y GAP LENGTH PENALTY=10. Los parámetros por defecto para alineaciones por pares y el cálculo de porcentajes de identidad de secuencias de proteínas usando el método Clustal son KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 y DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 y DIAGONALS SAVED=4. Después de la alineación de las secuencias usando el programa Clustal V, es posible obtener un “porcentaje de identidad” viendo la tabla de “distancias de secuencias” en el mismo programa. Adicionalmente está disponible el “método de alineación Clustal W”, y corresponde al método de alineación etiquetado como Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) y encontrado en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete de computación bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Los parámetros por defecto para alineación múltiple (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PEnAlTY=0,2, Secs. Divergentes de Retardo(%)=30, Peso de Transición de a Dn=0,5, Matriz de Peso de Proteína=Serie Gonnet, Matriz de Peso de ADN=IUB). Después de la alineación de las secuencias usando el programa Clustal W, es posible obtener un “porcentaje de identidad” viendo la tabla de “distancias de secuencias” en el mismo programa.

En bien entendido por un experto en la técnica que son útiles muchos niveles de identidad de secuencias en la identificación de polipéptidos, tal como de otras especies, en donde tales polipéptidos tienen la misma o similar función o actividad, o en la descripción de los polinucleótidos correspondientes. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero no se limitan a: 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, o puede ser útil cualquier porcentaje en número entero de 55% a 100% en la descripción de la presente descripción, tales como 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Los fragmentos de polinucleótidos adecuados no solo tienen las homologías anteriores, sino que comprenden típicamente un polinucleótido que tiene al menos 50 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, al menos 150 nucleótidos, al menos 200 nucleótidos o al menos 250 nucleótidos. Además, los fragmentos de polinucleótidos adecuados que tienen las homologías anteriores codifican un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos o al menos 250 aminoácidos.

La expresión “programa de análisis de secuencias” hace referencia a cualquier algoritmo de ordenador o programa informático que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El “programa informático de análisis de secuencias” puede estar disponible en el mercado o desarrollarse independientemente. Un programa informático de análisis de secuencias típico incluirá, pero no se limita a: 1.) el paquete de programas GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor.

Plenum: New York, NY). Dentro del contexto de esta solicitud se entenderá que donde se usa un programa informático de análisis de secuencias para análisis, los resultados del análisis estarán basados en los “valores por defecto” del programa referenciado, a menos que se especifique de otro modo. Como se emplea en la presente memoria, “valores por defecto” significarán cualquier juego de valores o parámetros que se cargan originariamente con el programa informático cuando se inicia por primera vez.

Las técnicas estándar de ADN recombinante y clonación molecular se conocen bien en la técnica y son descritas por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (en lo sucesivo “Maniatis”); y por Silhavy, T. J., Bennan, M.

L. y Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987). Los métodos adicionales usados aquí están en Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Part A, 2004, Christine Guthrie y Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA). Se conocen en la técnica otras herramientas y técnicas moleculares, e incluyen división por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con extensión solapante (Yu et al. (2004) Fungal Genet. Biol.

41:973-981), selección positiva para mutaciones en el locus URA3 de Saccharomyces cerevisiae (Boeke, J.D. et al.

(1984) Mol. Gen. Gent. 197, 345-346; M A Romanos, et al. Nucleic Acids Res. 11 Enero 1991; 19(1): 187), el sistema de recombinación específico a sitio cre-lox, así como sitios lox mutantes y mutaciones de sustrato FLP (Sauer, B.

(1987) Mol Cell Biol 7:2087-2096; Senecoff, et al. (1988) Journal of Molecular Biology, Volumen 201, Número 2, Páginas 405-421; Albert, et al. (1995) The Plant Journal. Volumen 7, Número 4, páginas 649-659), deleción de genes “sin costuras” (Akada, et al. (2006) Yeast;23(5):399-405), y metodología de reparación de huecos (Ma et al., Genetics 58:201-216; 1981).

Polipéptidos con actividad GPD

La “glicerol-3-fosfato deshidrogenasa” o “GPD” dependiente de NAD endógena es una enzima clave en la síntesis de glicerol, que convierte el fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) en glicerol-3-fosfato. Los términos “glicerol-3-fosfato deshidrogenasa” y “GPD” hacen referencia a cualquier polipéptido (o polipéptidos) que tiene la función biológica de la GPD. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos que tienen una actividad enzimática que cataliza la conversión de fosfato de dihidroxiacetona en glicerol-3-fosfato. Las GPDs están ampliamente extendidas en la naturaleza y pueden clasificarse en tres categorías. En la primera categoría, EC 1.1.1.8, una GPD es una enzima citoplasmática soluble donde el cofactor redox es la pareja NAD/NADH, las GPDs en la categoría EC 1.1.1.8 se describen como específicas a NADH, pero esto no excluye que algunas de las GPDs puedan tener una actividad mensurable con NADPH. La GPD1 de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo de este tipo de GPD (Albertyn et. Al, 1992, FEBS Lett 308: 130­ 132; Valadi, et al, 2004, J. Biol. Chem 279: 39677-39685). Otro ejemplo es la GPD1 humana, para la que hay múltiples estudios estructurales tridimensionales (Ou et al, 2005, J.Mol.Biol. 357: 858-869). Los ensayos para enzimas en esta categoría pueden utilizar la medida espectrofotométrica de la oxidación de NADH en presencia de DHAP y la enzima GPD (Niesel et al. 1982 Methods Enzymol 89: 296-301). La segunda categoría, EC 1.1.5.3, las enzimas GPD son proteínas de membrana intrínsecas de la membrana mitocondrial interna, y contienen un cofactor de flavina, y equivalentes reductores son transferidos a la pareja quinona/quinol en la mitocondria. Hay una tercera categoría menor de GPDs, EC 1.1.1.94, que utilizan NADH o bien NADPH con sustancialmente la misma afinidad. Las GPDs de la tercera categoría menor también pueden ser inhibidas en retroalimentación por el glicerol-3-fosfato.

Los microorganismos recombinantes tales como la levadura pueden tener uno o más genes endógenos que codifican glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD). En algunas levaduras, tales como S. cerevisiae, S. pombe y P. stipitis, GPD1 y GPD2 son homólogos funcionales. Cualquiera de los genes que codifican enzimas GPD de levadura puede ser alterado para reducir la actividad GPD en una célula de levadura.

Uno de los mecanismos clave de la pérdida de rendimiento en la producción de butanol en levaduras es la pérdida de carbono y equivalentes reductores que son desviados de la glicólisis por la conversión de fosfato de dihidroxiacetona en glicerol. Dado que la GPD cataliza la primera etapa en esta conversión de fosfato de dihidroxiacetona en glicerol, la actividad de la GPD puede contribuir a la producción de glicerol y la pérdida del rendimiento de butanol. Como resultado, algunos han considerado eliminar la función de la GPD (por ejemplo, eliminando el gen que codifica la proteína GPD) en la levadura productora de butanol. Sin embargo, se requiere glicerol para el crecimiento, y es un osmoprotector importante. Por tanto, retener la capacidad de producir algo de glicerol ofrece ciertas ventajas.

Una manera de retener la capacidad de producir glicerol, pero también mejorar la producción del alcohol producto, es alterar la especificidad al cofactor de la GPD. La GPD1 de Saccharomyces cerevisiae favorece generalmente el cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (“NADH”) en la catálisis de la primera etapa en la conversión de fosfato de dihidroxiacetona en glicerol en una célula de levadura. Sin embargo, como se demuestra en la presente memoria, las enzimas GPD también pueden usar el cofactor nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (“NADPH”).

El uso de enzimas GPD con preferencia por NADPH en comparación con NADH puede permitir a las células huésped retener la capacidad para producir glicerol en condiciones metabólicas diferentes cuando se comparan con enzimas con una preferencia por NADH. Sin embargo, esta producción de glicerol puede ser limitada ventajosamente en condiciones anaeróbicas cuando la producción de NADPH es limitada.

Al mismo tiempo, disminuir la preferencia por NADH por la GPD puede aumentar la disponibilidad de NADH en una célula huésped. El NADH también es usado por otras enzimas en una ruta de producción de alcohol producto, por ejemplo, en la ruta de producción de isobutanol el NADH disponible puede ser utilizado por KARI y alcohol deshidrogenasa. Por tanto, disminuir la afinidad de la GPD por NADH puede aumentar la producción del alcohol producto (p.ej., isobutanol). Por consiguiente, en algunas realizaciones, la GPD diseñada se expresa en un microorganismo recombinante que también expresa una enzima que utiliza NADH, por ejemplo, una enzima que utiliza NADH que actúa en la ruta de producción de isobutanol tal como KARI y alcohol deshidrogenasa.

Una manera adicional de mejorar la producción de un alcohol producto (p.ej., butanol) es alterar la GPD para disminuir la Km para NADPH. Disminuir la Km para NADPH alterando la GPD puede aumentar la velocidad de oxidación del NADPH catalizada por GPD, permitiendo así un aumento en la disponibilidad de NADH en la célula huésped. El NADH disponible puede ser usado por otras enzimas en la ruta de producción de alcohol producto, por ejemplo, en la ruta de producción de isobutanol NADH disponible puede ser utilizado por KARI y alcohol deshidrogenasa. Por tanto, aumentar la afinidad de la GPD por NADPH puede aumentar la producción del alcohol producto (p.ej., isobutanol). Por consiguiente, en algunas realizaciones, la JPD diseñada por ingeniería genética se expresa en un microorganismo recombinante que también expresa otras enzimas que utilizan NADH, por ejemplo, una enzima que utiliza NADH que actúa en la ruta de producción de isobutanol tal como KARI y alcohol deshidrogenasa.

Otra manera de retener la capacidad de producir algo de glicerol y mejorar también la producción de alcohol producto es usar enzimas GPD heterólogas que pueden reducir la cantidad de glicerol producida en comparación con la cantidad producida por las enzimas GPD endógenas. Un ejemplo de enzima heteróloga es la gpsA de E. coli. Dos rasgos mecanísticos de la gpsA de E. coli que pueden contribuir a su capacidad para producir menos glicerol incluyen (1) la gpsA es inhibida en producto por glicerol-3-fosfato, y (2) la gpsA utiliza los cofactores NADH y NADPH con sustancialmente la misma afinidad (Edgar y Bell, JBC 255:3492-7 (1980)) y en ciertas condiciones esto también puede permitir la producción de glicerol usando NADPH, permitiendo así la disponibilidad de NADH en la célula huésped. La inhibición en producto por glicerol-3-fosfato en Saccharomyces puede dar como resultado una producción de glicerol reducida, especialmente si la reacción enzimática de glicerol-3-fosfato fosfatasa es más lenta que la reacción enzimática que la GPD. Las constantes de Michaelis publicadas para las fosfatasas de Saccharomyces GPP1 y GPP2 son 3,1 y 3,9, respectivamente (Norbeck, JBC 271:13875-81 (1996), que es casi 1.000 veces más alta que la constante de inhibición (Ki) del glicerol-3-fosfato en gpsA de E. coli (Edgar y Bell, JBC 253:6345-63 (1978)). La mayoría de condiciones son favorables para la inhibición de producto por glicerol-3-fosfato.

Las enzimas GPD que pueden utilizar NADH o NADPH y/o son inhibidas en retroalimentación por glicerol-3-fosfato pueden incluir tanto proteínas existentes en la naturaleza como proteínas diseñadas. Por ejemplo, se describen enzimas GPD que utilizan NADH o que utilizan NADPH por EC 1.1.1.94 y se han encontrado en Aspergillus oryzae, Candida versatilis, Escherichia coli y Oryctolagus cuniculus.

En algunos ejemplos, la GPD heteróloga descrita en la presente memoria es una GPD de Leishmania mexicana, Dunaliella viridis, Jaculus orientalis, Archeoglobus fulgidus, Rickettsia prowazekii, Beggiatoa alba, Kangiella koreenis, Aspergillus oryzae, Candida versatilis, Escherichia coli o Oryctolagus cuniculu.

En ciertas realizaciones, las secuencias de otras enzimas GPD que pueden utilizar NADH o bien NADPH y/o son inhibidas en retroalimentación por glicerol-3-fosfato puede ser identificadas en la bibliografía, y pueden identificarse candidatos en bases de datos de bioinformática bien conocidas por el experto en la materia usando secuencias descritas en la presente memoria y disponibles en la técnica. Por ejemplo, tales secuencias pueden ser identificadas mediante una búsqueda BLAST de bases de datos disponibles públicamente con secuencias de polinucleótidos o polipéptidos que codifican GPD conocidas. En tal método, las identidades pueden estar basadas en el método de alineación Clustal W usando los parámetros por defectos GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 0,1, y la serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteína.

Adicionalmente, pueden usarse secuencias de polinucleótidos o polipéptidos de GPD descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica para identificar otros homólogos de g Pd candidatos en la naturaleza. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican GPD descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica pueden usarse para aislar genes que codifican proteínas homólogas. El aislamiento de genes homólogos usando protocolos dependientes de secuencias incluyen, pero no se limitan a (1) métodos de hibridación de ácidos nucleicos; (2) métodos de amplificación de ADN Y ARN, ilustrados por diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (p.ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Mullis et al; patente de EE.UU. N° 4.683.202; reacción en cadena de la ligasa (LCR), Tabor, S. et al; PNAS u Sa 82:1074 (1985); o amplificación por desplazamiento de hebras (SDA), Walker et al; PNAS USA 89:392 (1992)]; y (3) métodos de construcción de librerías y cribado por complementación.

Otra manera de mejorar la producción de un alcohol producto es alterar la GPD para aumentar la Km para NADH. Aumentar la Km para NADH alterando la GPD puede disminuir la velocidad de oxidación del NADH catalizada por GPD, permitiendo así un aumento en la disponibilidad de NADH en una célula huésped. El NADH puede ser usado por otras enzimas en la ruta de producción del alcohol producto, por ejemplo, en la ruta de producción de isobutanol el NADH disponible puede ser utilizado por KARI y alcohol deshidrogenasa. Por tanto, disminuir la afinidad de la GPD por NADH puede aumentar la producción del alcohol producto (p.ej., isobutanol). Por consiguiente, en algunas realizaciones, la GPD diseñada se expresa en un microorganismo recombinante que también expresa otras enzimas que utilizan NADH, por ejemplo, una enzima que utiliza NADH que actúa en la ruta de producción de isobutanol tal como KARI y alcohol deshidrogenasa.

Las enzimas GPD con una Km para NADH aumentada también pueden producirse por medio de diseño de proteínas por ingeniería genética. En la invención, la GPD tiene al menos 90% o 95% de identidad a la GPD1 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 195), pero no es 100% idéntica a SEQ ID NO:195. La GPD comprende al menos una sustitución en un residuo que corresponde a la posición 73 o 129 de la GPD1 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO:195). Puede haber sustituciones adicionales en un residuo que corresponde a la posición 42, 44, 45, 71, 75, 95, 124, 126, 151, 152, 183, 184, 185, 246, 310, 336, 337 o 339.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la GPD comprende una sustitución del residuo que corresponde a la posición 44 de SEQ ID NO:195 (Asn en SEQ ID NO:195) a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, G, I, L, M, S y V.

En algunas realizaciones, la GPD comprende una sustitución del residuo que corresponde a la posición 45 de SEQ ID NO:195 (Trp en SEQ ID NO:195) a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T y V.

En algunas realizaciones, la GPD comprende una sustitución del residuo que corresponde a la posición 73 de SEQ ID NO:195 (Phe en SEQ ID NO:195) a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, A, R y K.

En algunas realizaciones, la GPD comprende una sustitución del residuo que corresponde a la posición 129 de SEQ ID NO:195 (Phe en SEQ ID NO:195) a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, A, R y K.

En algunas realizaciones, la GPD comprende una sustitución del residuo que corresponde a la posición 337 de SEQ ID NO:195 (Ser en SEQ ID NO:195) a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, E, G, I, L, M, N, Q y V.

En algunas realizaciones, la GPD comprende una sustitución del residuo que corresponde a la posición 339 de SEQ ID NO:195 (Gln en SEQ ID NO:195) a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, G, I, L, M, S y V.

En algunas realizaciones, la GPD comprende una sustitución del residuo que corresponde a la posición 42, 71, 75, 95, 124, 126, 151, 152, 183, 184, 185, 246, 310, y/o 336 de SEQ ID NO:195 (Ser, Trp, Glu, Tyr, Gln, Pro, Leu, Lys, Asn, Ile, Ala, Asn, Arg, Gln de SEQ ID NO:195, respectivamente) a cualquier otro aminoácido seleccionado de los 19 aminoácidos existentes en la naturaleza.

En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente 0,10 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente O, 15 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente 0,20 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente 0,30 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente 0,40 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADH que es aproximadamente 0,50 mM a aproximadamente 1 mM. Se describen ensayos para medir la Km para NADH de la GPD en el Ejemplo 1 más adelante y se conocen en la técnica, véase, p.ej., Niesel et al., Methods Enzymol. 89:296-301 (1982). Ciertos ensayos pueden denominarse “ensayos de consumo de NADH”, que hacen referencia a un ensayo enzimático para la determinación de la actividad específica de la enzima GPD, que implica medir la desaparición del cofactor de la GPD, el NADH, de la reacción enzimática.

En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,10 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,15 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,20 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,30 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,40 mM a aproximadamente 1 mM. En algunas realizaciones, la GPD tiene una Km para NADPH que es aproximadamente 0,50 mM a aproximadamente 1 mM. Los ensayos de NADH descritos más adelante en el Ejemplo 1 pueden adaptarse para medir la Km para NADPH de la GPD reemplazando el NADH con NADPH. Se conocen en la técnica ensayos adicionales para medir la Km para NADPH de la GPD, véase, p.ej., Niesel et al., Methods Enzymol. 89:296-301 (1982). Ciertos ensayos pueden denominarse “ensayos de consumo de NADPH”, que hacen referencia a un ensayo enzimático para la determinación de la actividad específica de la enzima GPD, que implica medir la desaparición del cofactor de la GPD, el NADH, de la reacción enzimática.

En algunas realizaciones, la GPD diseñada puede aumentar el crecimiento de un microorganismo recombinante que comprende la GPD diseñada en comparación con un microorganismo recombinante que no contiene la GPD diseñada.

En algunas realizaciones, la GPD diseñada puede aumentar la producción del alcohol producto (p.ej., isobutanol) de un microorganismo recombinante que comprende la GPD diseñada en comparación con un microorganismo recombinante que no contiene la GPD diseñada.

En algunas realizaciones, la GPD diseñada puede disminuir la producción de glicerol de un microorganismo recombinante que comprende la GPD diseñada en comparación con un microorganismo recombinante que no contiene la GPD diseñada.

En algunas realizaciones, la GPD diseñada puede aumentar la relación de alcohol producto (p.ej., isobutanol) a glicerol producidos por un microorganismo recombinante que comprende la GPD diseñada en comparación con un microorganismo recombinante que no contiene la GPD diseñada.

En algunas realizaciones, la GPD diseñada puede aumentar el rendimiento (p.ej., gramos de isobutanol producidos por gramo de sustrato consumido) de un microorganismo recombinante que comprende la GPD diseñada en comparación con un microorganismo recombinante que no contiene la GPD diseñada.

Por tanto, en un microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética de butanol, una GPD diseñada que tiene una Km para NADH más alta que la GPD endógena del microorganismo, y una deleción o disrupción de un gen endógeno que codifica la GPD, “producción mejorada de butanol” puede hacer referencia a una producción aumentada de butanol, una producción disminuida de glicerol o ambos, en comparación con un microorganismo que carece de la GPD diseñada.

En un microorganismo recombinante que comprende una GPD diseñada que tiene una KM para NADH más alto que la GPD endógena del microorganismo, y una deleción o disrupción de un gen endógeno que codifica la GPD, “producción mejorada de alcohol” puede hacer referencia a una producción aumentada de alcohol, una producción disminuida de glicerol o ambos, en comparación con un microorganismo que carece de la GPD diseñada.

Por tanto, en un microorganismo recombinante que comprende una ruta biosintética de butanol, una GPD heteróloga que tiene sustancialmente la misma afinidad por NADH y NADPH y/o es inhibida en retroalimentación por glicerol-3-fosfato, y una deleción o disrupción de un gen endógeno que codifica la GPD, “producción mejorada de butanol” puede hacer referencia a una producción aumentada de butanol, una producción disminuida de glicerol o ambos, en comparación con un microorganismo que carece de la GPD heteróloga.

En un microorganismo recombinante que comprende una GPD heteróloga que tiene sustancialmente la misma afinidad por NADH y NADPH y/o es inhibida en retroalimentación por glicerol-3-fosfato, y una deleción o disrupción de un gen endógeno que codifica la GPD, “producción mejorada de alcohol” puede hacer referencia a una producción aumentada de alcohol, una producción disminuida de glicerol o ambos, en comparación con un microorganismo que carece de la GPD heteróloga.

Microorganismos recombinantes

Aunque no se desea estar limitado por una teoría, se cree que los procedimientos descritos en la presente memoria son útiles en relación con cualquier microorganismo productor de alcohol, particularmente microorganismos recombinantes que producen alcohol.

Los microorganismos recombinantes que producen alcohol son también conocidos en la técnica (p.ej., Ohta et al., Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900 (1991); Underwood et al., Appl. Envrion. Microbiol. 68:1071-81 (2002); Shen y Liao, Metab. Eng. 10:312-20 (2008); Hahnai et al., Appl. Environ. 73:7814-8 (2007); patente de EE.UU. N° 5.514.583; patente de EE.UU. N° 5.712.133; publicación internacional N° WO 1995/028476; Feldmann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38:354-61 (1992); Zhang et al., Science 267:240-3 (1995); publicación de patente de EE.UU. N° 2007/0031918A1; patente de EE.UU. N° 7.223.575; patente de EE.UU. N° 7.741.119; publicación de patente de EE.UU. N° 2009/0203099A1; publicación de patente de EE.UU. N° 2009/0246846A1; y publicación internacional N° WO 2010/075241).

Por ejemplo, las rutas metabólicas de los microorganismos pueden ser modificadas genéticamente para producir butanol. Estas rutas pueden ser modificadas también para reducir o eliminar metabolitos indeseados, y mejorar de este modo el rendimiento del alcohol producto. La producción de alcohol por un microorganismo se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nos. 7.851.188; 7.993.889; 8.178.328, 8.206.970; las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. Nos. 2007/0292927; 2008/0182308; 2008/0274525; 2009/0305363; 2009/0305370; 2011/0250610; 2011/0313206; 2011/0111472; 2012/0258873; y 2013/0071898. En ciertas realizaciones, el microorganismo se modifica genéticamente para comprender una ruta biosintética de butanol o una ruta biosintética para un isómero de butanol, tal como 1-butanol, 2-butanol o isobutanol. En ciertas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco polipéptidos que catalizan conversiones de sustrato a producto en la ruta biosintética de butanol son codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. En ciertas realizaciones, todos los polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto en la ruta biosintética de butanol son codificados por polinucleótidos heterólogos en el microorganismo. Se apreciará que los microorganismos que comprenden una ruta biosintética de butanol pueden comprender además una o más modificaciones genéticas, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2013/0071898.

En la invención, el microorganismo es Saccharomyces cerevisiae.

En la invención, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae. Los Saccharomyces cerevisiae son bien conocidos en la técnica, y están disponibles a partir de diversas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, American Type Culture Collection (Rockville, MD), Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, LeSaffre, Gert Strand AB, Ferm Solutions, North American Bioproducts, Martrex, y Lallemand. Los S. cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, BY4741, CEN.PK 113-7D, levadura Ethanol Red®, levadura Ferm ProTM, levadura Bio-Ferm®, levadura de alcohol Gert Strand Prestige Batch Turbo, levadura Gert Strand Pot Distillers, levadura Gert Strand Pot Distillers Turbo, levadura FerMax™ Green, levadura FerMax™ Gold, levadura Thermosacc®, BG-1, PE-2, CAT-1, CBS7959, CBS7960 y CBS7961.

En algunas realizaciones, el microorganismo puede ser inmovilizado o encapsulado. Por ejemplo, el microorganismo puede ser inmovilizado o encapsulado usando alginato, alginato de calcio o geles de poliacrilamida, o mediante la inducción de la formación de biopelícula sobre diversas matrices de soporte de alta área de superficie tales como diatomita, celite, tierra de diatomeas, geles de sílice, plásticos o resinas. En algunas realizaciones, puede usarse ISPR en combinación con microorganismos inmovilizados o encapsulados. Esta combinación puede mejorar la productividad, tal como la productividad volumétrica específica, velocidad metabólica, rendimientos de alcohol producto, tolerancia al alcohol producto. Además, la inmovilización y encapsulación pueden minimizar los efectos de las condiciones de proceso, tales como el cizallamiento sobre los microorganismos.

Las rutas biosintéticas para la producción de isobutanol que pueden usarse incluyen las descritas por Donaldson et al. en la patente de EE.UU. N° 7.851.188; la patente de Ee .Uu . N° 7.993.388; y la publicación internacional N° WO 2007/050671. En una realización, la ruta biosintética de isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto:

a) piruvato a acetolactato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa;

b) el acetolactato de la etapa a) a 2,3-dihidroxiisovalerato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por cetol-ácido reductoisomerasa;

c) el 2,3-dihidroxiisovalerato de la etapa c) a a-cetoisovalerato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por dihidroxiácido deshidratasa;

d) el a-cetoisovalerato de la etapa c) a isobutiraldehído, que puede ser catalizada, por ejemplo, por una a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa; y

e) el isobutiraldehído de la etapa d) a isobutanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, por una alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa.

En otra realización, la ruta biosintética de isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: a) piruvato a acetolactato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa;

b) el acetolactato de la etapa a) a 2,3-dihidroxiisovalerato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por cetol-ácido reductoisomerasa;

c) el 2,3-dihidroxiisovalerato de la etapa c) a a-cetoisovalerato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por dihidroxiácido deshidratasa;

d) el a-cetoisovalerato de la etapa c) a valina, que puede ser catalizada, por ejemplo, por transaminasa o valina deshidrogenasa;

e) la valina de la etapa d) a isobutilamina, que puede ser catalizada, por ejemplo, por valina descarboxilasa;

f) la isobutilamina de la etapa e) a isobutiraldehído, que puede ser catalizada, por ejemplo, por omega transaminasa; g) el isobutiraldehído de la etapa f) a isobutanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, por una alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa.

En otra realización, la ruta biosintética de isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: a) piruvato a acetolactato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa;

b) el acetolactato de la etapa a) a 2,3-dihidroxiisovalerato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por cetol-ácido reductoisomerasa;

c) el 2,3-dihidroxiisovalerato de la etapa c) a a-cetoisovalerato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por dihidroxiácido deshidratasa;

d) el a-cetoisovalerato de la etapa c) a isobutiril-CoA, que puede ser catalizada, por ejemplo, por cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa;

e) la isobutiril-CoA de la etapa d) a isobutiraldehído, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acilación de aldehido deshidrogenasa; y

f) el isobutirilaldehído de la etapa e) a isobutanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, por una alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa.

Las rutas biosintéticas para la producción de 1-butanol que pueden usarse incluyen las descritas en la publicación de patente de EE.UU. N° 2008/0182308 y la solicitud de patente internacional WO2007/041269. En una realización, la ruta biosintética de 1-butanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto:

a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetil-CoA acetiltransferasa;

b) la acetoacetil-CoA de la etapa a) a 3-hidroxibutiril-CoA, que puede ser catalizada, por ejemplo, por 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa;

c) la 3-hidroxibutiril-CoA de la etapa b) a crotonil-CoA, que puede ser catalizada, por ejemplo, por crotonasa; d) la crotonil-CoA de la etapa c) a butiril-CoA, que puede ser catalizada, por ejemplo, por butiril-CoA deshidrogenasa; e) la butiril-CoA de la etapa d) a butiraldehído, que puede ser catalizada, por ejemplo, por butiraldehído deshidrogenasa; y

f) el butiraldehído de la etapa e) a 1-butanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, por butanol deshidrogenasa. Las rutas biosintéticas para la producción de 2-butanol que pueden usarse incluyen las descritas por Donaldson et al. en la patente de EE.u U. N° 8.206.970; las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. Nos. 2007/0292927 y 2009/0155870; las publicaciones internacionales Nos. WO 2007/130518 y WO 2007/130521. En una realización, la ruta biosintética de 2-butanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto:

a) piruvato a alfa-acetolactato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa;

b) el alfa-acetolactato de la etapa a) a acetoína, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato descarboxilasa;

c) la acetoína de la etapa b) a 3-amino-2-butanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, acetoína aminasa; d) el 3-amino-2-butanol de la etapa c) a 3-amino-2-butanol fosfato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por aminobutanol cinasa;

e) el 3-amino-2-butanol fosfato de la etapa d) a 2-butanona, que puede ser catalizada, por ejemplo, por aminobutanol fosfato fosforilasa; y

f) la 2-butanona de la etapa e) a 2-butanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, por butanol deshidrogenasa. En otra realización, la ruta biosintética de 2-butanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: a) piruvato a alfa-acetolactato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa;

b) el alfa-acetolactato de la etapa a) a acetoína, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato descarboxilasa;

c) la acetoína a 2,3-butanodiol de la etapa b), que puede ser catalizada, por ejemplo, por butanodiol deshidrogenasa; d) el 2,3-butanodiol de la etapa c) a 2-butanona, que puede ser catalizada, por ejemplo, por diol deshidratasa; y, e) la 2-butanona de la etapa d) a 2-butanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, por butanol deshidrogenasa. Las rutas biosintéticas para la producción de 2-butanona que pueden usarse incluyen las descritas en la patente de EE.UU. N° 8.206.970 y las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU Nos. 2007/0292927 y 2009/0155870. En una realización, la ruta biosintética de 2-butanona comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: a) piruvato a alfa-acetolactato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa;

b) el alfa-acetolactato de la etapa a) a acetoína, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato descarboxilasa;

c) la acetoína de la etapa b) a 3-amino-2-butanol, que puede ser catalizada, por ejemplo, acetoína aminasa; d) el 3-amino-2-butanol de la etapa c) a 3-amino-2-butanol fosfato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por aminobutanol cinasa; y,

e) el 3-amino-2-butanol fosfato de la etapa d) a 2-butanona, que puede ser catalizada, por ejemplo, por aminobutanol fosfato fosforilasa.

En otra realización, la ruta biosintética de 2-butanona comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: a) piruvato a alfa-acetolactato, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa;

b) el alfa-acetolactato de la etapa a) a acetoína, que puede ser catalizada, por ejemplo, por acetolactato descarboxilasa;

c) la acetoína de la etapa b) a 2,3-butanodiol, que puede ser catalizada, por ejemplo, por butanodiol deshidrogenasa; d) el 2,3-butanodiol de la etapa c) a 2-butanona, que puede ser catalizada, por ejemplo, por diol deshidratasa.

Los términos “acetohidroxiácido sintasa”, “acetolactato sintasa” y “acetolactato sintetasa” (abreviados como “ALS”) se usan de manera intercambiable en la presente memoria para hacer referencia a una enzima que cataliza la conversión de piruvato a acetolactato y CO². Los ejemplos de acetolactato sintasas se conocen por el número EC 2.2.1.6 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego). Estas enzimas están disponibles de varias fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis (Nos. GenBank: CAB07802.1, Z99122, NCBI (National Center for Biotechnology Information) secuencia de aminoácidos, secuencia de nucleótidos NCBI, respectivamente), CAB15618, Klebsiella pneumoniae (Nos. GenBank: AAA25079, M73842), y Lactococcus lactis (Nos. GenBank:AAA25161, L16975).

El término “cetol-ácido reductoisomerasa” (“KARI”), “acetohidroxiácido isomerorreductasa”, y “acetohidroxiácido reductoisomerasa” se usarán de manera intercambiable, y hacen referencia a enzimas capaces de catalizar la reacción de (S)-acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato. Los ejemplos de enzimas KARI pueden clasificarse como número EC 1.1.1.86 (Enzyme Nomenclature, 1992, Academic Press, San Diego), y están disponibles de un vasto grupo de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli (Nos. GenBank: NP_418222, NC_000913), Saccharomyces cerevisiae (Nos. GenBank: NP_013459, NC_001144), Methanococcus maripaludis (Nos. GenBank: CAF30210, BX957220), y Bacillus subtilis (Nos. GenBank: CAB14789, Z99118). Los KARIs incluyen las variantes de KARI de Anaerostipes caccae “K9G9” (SEQ ID NO:85), “K9D3” (SEQ ID NO:86) y “K9JB4P” (SEQ ID NO:87). Se describen enzimas cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) en las patentes de EE.UU. Nos. 7.910.342 y 8.129.162; las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. Nos. 2008/0261230, 2009/0163376, 2010/0197519, publicación de solicitud PCT N° WO/2011/041415, publicación de solicitud PCT N° WO2012/129555; y publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. US 2014/0093930, presentada el 26 de septiembre de 2013. Los ejemplos de KARIs descritos en los mismos son los de mutantes de Lactoccocus lactis, Vibrio cholera, Pseudomonas aeruginosa PAO1, y Pseudomonas fluorescens PF5. En algunas realizaciones, el KARI utiliza NADH. En algunas realizaciones, el KARI utiliza NADPH. En algunas realizaciones, el KARI utiliza NADH o NADPH.

El término “acetohidroxiácido deshidratasa” y “dihidroxiácido deshidratasa” (DHAD”) hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato. Las acetohidroxiácido deshidratasas ilustrativas se conocen por el número EC 4.2.1.9. Tales enzimas están disponibles de una vasta variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a, E. coli (Nos. GenBank: YP_026248, NC000913), Saccharomyces cerevisiae (Nos. GenBank: NP_012550, NC 001142), M. maripaludis (Nos. GenBank: CAF29874, BX957219), B. subtilis (Nos. GenBank: CAB14105, Z99115), L. lactis (SEQ ID NO:88), y N. crassa. La publicación de solicitud de patente de e E.UU. N° 2010/0081154, la patente de EE.UU. N° 7.851.188 y la patente de EE.UU. N° 8.241.878 describen dihidroxiácido deshidratasas (DHADs), que incluyen una DHAD de Streptococcus mutans (SEQ ID NO:89) y variantes de la misma.

El término “a-cetoácido descarboxilasa”, “a-cetoácido descarboxilasa”, “a-cetoisovalerato descarboxilasa” o “2-cetoisovalerato descarboxilasa” (“KIVD”) hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiraldehído y CO². Los ejemplos de a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasas se conocen por el número EC 4.1.1.72, y están disponibles en varias fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Lactoccocus lactis (Nos. GenBank: AAS49166, AY548760; CAG34226, AJ746364), Salmonella typhimurium (Nos. GenBank: NP_461346, NC_003197), Clostridium acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_149189, nC_001988), M. caseolyticus, y L. grayi. acetoácido de cadena ramificada descarboxilasas adecuadas pueden comprender SEQ ID NO:90 de Lactoccocus lactis y SEQ ID NO:91 de Listeria grayi.

El término “alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa (ADH”) hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de isobutiraldehído a isobutanol. Los ejemplos de alcohol de cadena ramificada deshidrogenasas se conocen por el número EC 1.1.1.265, pero también pueden clasificarse bajo otras alcohol deshidrogenasas (específicamente, EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2). Las alcohol deshidrogenasas pueden ser dependientes de NADPH o dependientes de NADH. Tales están disponibles de varias fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, S. cerevisiae (Nos. GenBank: NP_010656, NC_001136, NP_014051, NP_001145), E. coli (Nos. GenBank: NP_417484, NC_000913), C. acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_349892, NC_003030; NP_349891, NC_003030). La publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2009/0269823 describe SadB, una alcohol deshidrogenasa (ADH) de Achromobacter xylosoxidans (SEQ ID NO: 92). Las alcohol deshidrogenasas también incluyen ADH de hígado de caballo (SEQ ID No :93) y ADH de Beijerinkia indica (SEQ ID NO:94) (descrita por la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2011/0269199).

El término “butanol deshidrogenasa” hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de isobutiraldehído a isobutanol o la conversión de 2-butanona y 2-butanol. Las butanol deshidrogenasas son un subconjunto de una amplia familia de alcohol deshidrogenasas. La butanol deshidrogenasa puede ser dependiente de NAD o de NADP. Las enzimas dependientes de NAD se conocen como EC 1.1.1.1 y están disponibles, por ejemplo, de Rhodococcus ruber (Nos. GenBank: CAD36475, AJ491307). Las enzimas dependientes de NADP se conocen como EC 1.1.1.2 y están disponibles, por ejemplo, de Pyroccocus furiosus (Nos. GenBank: AAC25556, AF013169). Adicionalmente, está disponible una butanol deshidrogenasa de Escherichia coli (Nos. GenBank: NP 417484, NC_000913) y está disponible una ciclohexanol deshidrogenasa de Acinetobacter sp. (Nos. GenBank: AAG10026, AF282240). El término “butanol deshidrogenasa” también hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de butiraldehído a 1-butanol, usando NADH o bien NADPH como cofactor. Las butanol deshidrogenasas están disponibles de, por ejemplo, C. acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_149325, NC_001988; nota: esta enzima posee actividad tanto aldehído como alcohol deshidrogenasa); NP_349891, NC_003030; y NP_349892, NC_003030) y E. coli (Nos. GenBank: NP_417-484, NC_000913).

El término “cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiril-CoA (isobutiril-coenzima A), usando típicamente NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) como aceptor de electrones. Los ejemplos de cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasas se conocen por el número EC 1.2.4.4. Tales cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasas están comprendidas de cuatro subunidades, y las secuencias de todas las subunidades están disponibles de una vasta variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a, B. subtilis (Nos. GenBank: CAB14336, Z99116; CAB14335, Z99116; CAB14334, Z99116; y CAB14337, Z99116) y Pseudomonas putida (Nos GenBank: AAA65614, M57613; AAA65615, M57613; AAA65617, M57613; y AAA65618, M57613).

El término “aldehído deshidrogenasa de acilación” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de isobutiril-CoA a isobutirladehído, usando típicamente NADH o bien NADPH como donador de electrones. Los ejemplos de aldehído deshidrogenasas de acilación se conocen por los números EC 1.2.1.10 y 1.2.1.57. Tales enzimas están disponibles de múltiples fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Clostridium beijerinckii (Nos. GenBank: AAD31841, AF157306), C. acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_149325, NC_001988; NP_149199, NC_001988), P. putida (Nos. GenBank: AAA89106, U13232), y Thermus thermopilus (Nos. GenBank: YP_145486, NC_006461).

El término “transaminasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a L-valina, usando alanina o bien glutamato como donador de amina. Los ejemplos de transaminasas se conocen por los números EC 2.6.1.42 y 2.6.1.66. Tales enzimas están disponibles de varias fuentes. Los ejemplos de fuentes para enzimas dependientes de alanina incluyen, pero no se limitan a, E. coli (Nos. GenBank: y P_026231, NC_000913) y Bacillus licheniformis (Nos. GenBank: YP_093743, NC_006322). Los ejemplos de fuentes para enzimas dependientes de glutamato incluyen, pero no se limitan a, E. coli (Nos. GenBank: YP_026247, NC_000913), Saccharomyces cerevisiae (Nos. GenBank: NP_012682, NC_001142) y Methanobacterium thermoautotrophicum (Nos. GenBank: NP_276546, NC_000916).

El término “valina deshidrogenasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a L-valina, usando típicamente NAD(P)H como donador de electrones y amoniaco como donador de amina. Los ejemplos de valina deshidrogenasas se conocen por los números EC 1.4.1.8 y 1.4.1.9, y tales enzimas están disponibles de varias fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Streptomyces coelicolor (Nos. GenBank: NP_628270, NC_003888) y B. subtilis (Nos. GenBank: CAB14339, Z99116).

El término “valina descarboxilasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de L-valina a isobutilamina y CO². Los ejemplos de valina descarboxilasas se conocen por el número EC 4.1.1.14. Tales enzimas se encuentran en Streptomyces, tales como por ejemplo, Streptomyces viridifaciens (Nos. GenBank: AAN10242, AY116644).

El término “omega transaminasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de isobutilamina a isobutiraldehído usando un aminoácido adecuado como donador de amina. Los ejemplos de omega transaminasas se conocen por el número EC 2.6.1.18 y están disponibles de varias fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Alcaligenes denitrificans (AAP92672, AY330220), Ralstonia eutropha (Nos. GenBank: YP_294474, NC_007347), Shewanella oneidensis (Nos. GenBank: NP_719046, NC_004347), y P. putida (Nos. GenBank: AAN66223, AE016776).

El término “acetil-CoA acetiltransferasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de dos moléculas de acetil-CoA a acetoacetil-CoA y coenzima A (CoA). Los ejemplos de acetil-CoA acetiltransferasas son acetil-CoA acetiltransferasas con preferencias de sustrato (reacción en la dirección hacia delante) para una acil-CoA de cadena corta y acetil-CoA, y se clasifican como EC 2.3.1.9 [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego]; aunque enzimas con un intervalo de sustratos más amplio (E.C. 2.3.1.16) funcionarán también. Las acetil-CoA acetiltransferasas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, Escherichia coli (Nos. GenBank: NP_416728, NC_000913; secuencia de aminoácidos de NCBI (National Center for Biotechnology Information) secuencia de nucleótidos de NCBI), Clostridium acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_349476.1, NC_003030; NP_149242, NC_001988, Bacillus subtilis (Nos. GenBank: n P_390297, NC_000964), y Saccharomyces cerevisiae (Nos. GenBank: NP_015297, NC_001148).

El término “3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA. Los ejemplos de 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas pueden ser dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH), con una preferencia de sustrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA o (R)-3-hidroxibutiril-CoA. Los ejemplos pueden clasificarse como E.C. 1.1.1.35 y E.C. 1.1.1.30, respectivamente. Adicionalmente, las 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas pueden ser dependientes de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH), con una preferencia de sustrato por (S)-3-hidroxibutiril-CoA o (R)-3-hidroxibutiril-CoA, y se clasifican como E.C. 1.1.1.157 y E.C. 1.1.1.36, respectivamente. Las 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, C. acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_349314, NC_003030), B. subtilis (Nos. GenBank: AAB09614, U29084), Ralstonia eutropha (Nos. GenBank: YP_294481, NC_007347), y Alcaligenes eutrophus (Nos. GenBank: AAA21973, J04987).

El término “crotonasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA y H²O. Los ejemplos de crotonasas pueden tener una preferencia de sustrato por S)-3-hidroxibutiril-CoA o (R)-3-hidroxibutiril-CoA, y pueden clasificarse como E.C. 4.2.1.17 y E.C. 4.2.1.155, respectivamente. Las crotonasas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, E. coli (Nos. GenBank: NP_415911, NC_000913), C. acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_349318, NC_003030), B. subtilis (Nos. GenBank: CAB13705, Z99113), y Aeromonas caviae (Nos. GenBank: BAA21816, D88825).

El término “butiril-CoA deshidrogenasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de crotonil-CoA a butiril-CoA. Los ejemplos de butiril-CoA deshidrogenasas pueden ser dependientes de NADH, dependientes de NADPH, o dependientes de flavina, y pueden clasificarse como E.C. 1.3.1.44, E.C. 1.3.1.38 y E.C. 1.3.99.2, respectivamente. Las butiril-CoA deshidrogenasas están disponibles de varias fuentes, por ejemplo, C. acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_347102, NC_003030), Euglena gracilis (Nos. GenBank: Q5EU90, AY741582), Streptomyces collinus (Nos. GenBank: AAA92890, U37135), y Streptomyces coelicolor (Nos. GenBank: CAA22721, AL939127).

El término “butiraldehído deshidrogenasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de butiril-CoA a butiraldehído, usando NADH o NADPH como cofactor. Las butiraldehído deshidrogenasas con una preferencia por NADH se conocen como E.C. 1.2.1.57 y están disponibles de, por ejemplo, Clostridium beijerinckii (Nos. GenBank: AAD31841, AF157306) y C. acetobutylicum (Nos. GenBank: NP_149325, NC_001988).

El término “ isobutiril-CoA mutasa” hace referencia a una enzima que cataliza la conversión de butiril-CoA a isobutiril-CoA. Esta enzima usa la coenzima B¹² como cofactor. Los ejemplos de isobutiril-CoA mutasas se conocen por el número EC 5.4.99.13. Estas enzimas se encuentran en varios Streptomyces, que incluyen, pero no se limitan a, Streptomyces cinnamonensis (Nos. GenBank: AAC08713, U67612; CAB59633, AJ246005), S. coelicolor (Nos. GenBank: CAB70645, AL939123; CAB92663, AL939121), y Streptomyces avermitilis (Nos. GenBank: NP_824008, NC_003155; NP_824637, NC_003155).

El término “acetolactato descarboxilasa” hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de alfa-acetolactato a acetoína. Los ejemplos de acetolactato descarboxilasas se conocen como EC 4.1.1.5, y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus subtilis (Nos. GenBank: AAA22223, L04470), Klebsiella terrigena (Nos. GenBank: AAA25054, L04507) y Klebsiella pneumoniae (Nos. GenBank: AAU43774, AY722056).

El término “acetoína aminasa” o “acetoína transaminasa” hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína a 3-amino-2-butanol. La acetoína aminasa puede utilizar el cofactor piridoxal 5'-fosfato o NADH (nicotinamida adenina dinucleótico reducido) o NADPH (nicotinamida adenina dinucleótico fosfato reducido). El producto resultante puede tener estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente de piridoxal fosfato puede usar un aminoácido tal como alanina o glutamato como donador de amina. Las enzimas dependientes de NADH o NADPH pueden usar amoniaco como segundo sustrato. Un ejemplo adecuado de una acetoína aminasa dependiente de NADH, conocida también como amino alcohol deshidrogenasa, es descrito por Ito, et al. (patente de EE.UU. N° 6.432.688). Un ejemplo de una acetoína aminasa dependiente de piridoxal es la amina:piruvato aminotransferasa (llamada también amina:piruvato transaminasa) descrita por Shin y Kim (J. Org. Chem. 67:2848-2853, 2002).

El término “acetoína cinasa” hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína a fosfoacetoína. La acetoína cinasa puede utilizar ATP (trifosfato de adenosina) o fosfoenolpiruvato como donador de fosfato en la reacción. Las enzimas que catalizan la reacción análoga en el sustrato similar dihidroxiacetona, por ejemplo, incluyen enzimas conocidas como EC 2.7.1.29 (Garcia-Alles, et al., Biochemistry 43:13037-13046, 2004).

El término “acetoína fosfato aminasa” hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de fosfoacetoína a 3-amino-2-butanol O-fosfato. La acetoína fosfato aminasa puede usar el cofactor piridoxal 5'-fosfato, NADH o NADPH. El producto resultante puede tener estereoquímica (R) o (S) en la posición 3. La enzima dependiente de piridoxal fosfato puede usar un aminoácido tal como alanina o glutamato. Las enzimas dependientes de NADH o NADPH pueden usar amoniaco como segundo sustrato. Aunque no hay informes de enzimas que catalizan esta reacción sobre la fosfoacetoína, hay una enzima dependiente de piridoxal fosfato que está propuesta para llevar a cabo la reacción análoga sobre el sustrato similar serinol fosfato (Yasuta, et al., Appl. Environ. Microbial. 67:4999-5009, 2001).

El término “aminobutanol fosfato fosfoliasa”, llamado también “amino alcohol O-fosfato liasa”, hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 3-amino-2-butanol O­ fosfato a 2-butanona. La aminobutanol fosfato fosfoliasa puede utilizar el cofactor piridoxal 5'-fosfato. Hay informes de enzimas que catalizan la reacción análoga sobre el sustrato similar 1-amino-2-propanol fosfato (Jones, et al., Biochem J. 134:167-182, 1973). La publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2007/0259410 describe una aminobutanol fosfato fosfoliasa del organismo Erwinia carotovora.

El término “aminobutanol cinasa” hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 3-amino-2-butanol a 3-amino-2-butanol O-fosfato. La aminobutanol cinasa puede utilizar ATP como donador de fosfato. Aunque no hay informes de enzimas que catalizan esta reacción sobre 3-amino-2-butanol, hay informes de enzimas que catalizan la reacción análoga sobre los sustratos similares etanolamina y 1-amino-2-propanol (Jones, et al., arriba). La publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2009/0155870 describe, en el Ejemplo 14, una aminoalcohol cinasa de Erwinia carotovora subsp. Atroseptica.

El término “butanodiol deshidrogenasa”, conocida también como “acetoína reductasa”, hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de acetoína a 2,3-butanodiol. Las butanodiol deshidrogenasas son un subgrupo de la amplia familia de alcohol deshidrogenasas. Las enzimas butanodiol deshidrogenasas pueden tener especificidad para la producción de estereoquímica (R) o (S) en el alcohol producto. Las butanodiol deshidrogenasas específicas a (S) se conocen como EC 1.1.1.76 y están disponibles, por ejemplo, de Klebsiella pneumoniae (Nos. GenBank: BBA13085, D86412). Las butanodiol deshidrogenasas específicas a (R) se conocen como EC 1.1.1.4 y están disponibles, por ejemplo, de Bacillus cereus (Nos. GenBank NP 830481, NC_004722; AAP07682, AE017000), y Lactoccocus lactis (Nos. GenBank AAK04995, AE006323).

El término “butanodiol deshidratasa”, conocido también como “dial deshidratasa” o “propanodiol deshidratasa” hace referencia a un polipéptido (o polipéptidos) que tiene una actividad enzimática que cataliza la conversión de 2,3-butanodiol a 2-butanona. La butanodiol deshidratasa puede utilizar el cofactor adenosilcobalamina (conocido también como coenzima Bw o vitamina B¹²; aunque la vitamina B¹² puede hacer referencia también a otras formas de cobalamina que no son coenzima B12). Las enzimas dependientes de adenosilcobalamina se conocen como EC 4.2.1.28 y están disponibles, por ejemplo, de subunidad alfa), (Nos. GenBank: AA08099 (subunidad alfa), D45071; BAA08100 (subunidad beta), D45071; y BBA08101 (subunidad gamma), D45071 (Nota, se requieren las tres subunidades para la actividad), y Klebsiella pneumonia (Nos. GenBank: AAC98384 (subunidad alfa), AF102064; Nos. GenBank: AAC98385 (subunidad beta), AF102064, Nos. GenBank: AAC98386 (subunidad gamma), AF102064). Otras dial deshidratasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, dial deshidratasas dependientes de B12 disponibles de Salmonella typhimurium (Nos. GenBank: AAB84102 (subunidad grande), AF026270; Nos. GenBank: AAB84103 (subunidad media), AF026270; Nos. GenBank: AAB84104 (subunidad pequeña), AF026270); y Lactobacillus collinoides (Nos. GenBank: CAC82541 (subunidad grande), AJ297723; GenBank Nos: CAC82542 (subunidad media); AJ297723, Nos. GenBank: CAD01091 (subunidad pequeña), AJ297723); y enzimas de Lactobacillus brevis (particularmente las cepas CNRZ734 y CNRZ735, Speranza, et al., J. Agrie. Food Chem. 45:3476-3480, 1997), y secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas correspondientes. Los métodos de aislamiento de genes de diol deshidrogenasa son bien conocidos en la técnica (p.ej., patente de EE.UU. N° 5.686.276).

El término “piruvato descarboxilasa” hace referencia a una enzima que cataliza la descarboxilación de ácido pirúvico a acetaldehído y dióxido de carbono. Las piruvato descarboxilasas se conocen por el número EC 4.1.11. Estas enzimas se encuentran en varias levaduras, que incluyen Saccharomyces cerevisiae (Nos. GenBank. CAA97575, CAA97705, CAA97091).

Se apreciará que las células huésped que comprenden una ruta biosintética de isobutanol proporcionada en la presente memoria pueden comprender además una o más modificaciones adicionales. La publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2009/0305363 describe una conversión aumentada de piruvato a acetolactato diseñando levadura para la expresión de una acetolactato sintasa citosol-localizada y una eliminación sustancial de la actividad piruvato descarboxilasa. En algunas realizaciones, las células huésped comprenden modificaciones para reducir la actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y/o una disrupción en al menos un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad piruvato descarboxilasa o una disrupción en al menos un gen que codifica un elemento regulatorio que controla la expresión de genes de piruvato descarboxilasa, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2009/0305363, modificaciones a una célula huésped que proporcionan un flujo de carbono aumentado a través de una Ruta de Entner-Doudoroff o un equilibrio de equivalentes reductores como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2010/0120105. Otras modificaciones incluyen la integración de al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una etapa en una ruta biosintética que utiliza piruvato.

Otras modificaciones incluyen al menos una deleción, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad acetolactato reductasa. Como se emplea en la presente memoria, “actividad acetolactato reductasa” hace referencia a la actividad de cualquier polipéptido que tiene la capacidad de catalizar la conversión de acetolactato a DHMB. Tales polipéptidos pueden determinarse por métodos bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. Como se emplea en la presente memoria, “DHMB” hace referencia a butirato de 2,3-dihidroxi-2-metilo. DHMB incluye “DHMB rápido”, que tiene la configuración 2S, 3S, y “DHMB lento”, que tiene la configuración 2S, 3R. véase Kaneko et al., Phytochemistry 39: 115-120 (1995), que hace referencia a DHMB rápido como ácido anglicérico y DHMB como ácido tiglicérico. En realizaciones, el polipéptido que tiene actividad acetolactato reductasa es YMR226C de Saccharomyces cerevisiae o un homólogo del mismo.

Las modificaciones adicionales incluyen una deleción, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad aldehido deshidrogenasa y/o aldehido oxidasa. Como se emplea en la presente memoria, “actividad aldehido deshidrogenasa” hace referencia a cualquier polipéptido que tiene una función biológica de una aldehido deshidrogenasa. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la oxidación (deshidrogenación) de aldehidos. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutirico. Tales polipéptidos también incluyen un polipéptido que corresponde a Enzyme Comission Numbers EC 1.2.1.3, EC 1.21.4 o EC 1.2.15. Tales polipéptidos pueden determinarse por métodos bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. Como se emplea en la presente memoria, “actividad de aldehido oxidasa” hace referencia a cualquier polipéptido que tiene una función biológica de una aldehido oxidasa. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la producción de ácidos carboxilicos a partir de aldehidos. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la conversión de isobutiraldehido a ácido isobutirico. Tales polipéptidos también incluyen un polipéptido que corresponde a Enzyme Comission Number EC 1.2.3.1. Tales polipéptidos pueden determinarse por métodos bien conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. En alunas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aldehido deshidrogenasa es ALD6 de Saccharomyces cerevisiae o un homólogo del mismo.

Una modificación genética que tiene el efecto de reducir la represión de glucosa en donde la célula huésped de producción de levadura es pdc- se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2011/0124060. En algunas realizaciones, la piruvato descarboxilasa que es borrada o regulada en descenso se selecciona del grupo que consiste en: PDC1, PDC5, PDC6 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la piruvato descarboxilasa se selecciona de piruvato descarboxilasa PDC1 de Saccharomyces cerevisiae, piruvato descarboxilasa PDC5 de Saccharomyces cerevisiae, piruvato descarboxilasa PDC6 de Saccharomyces cerevisiae, piruvato descarboxilasa de Candida glabrata, piruvato descarboxilasa PDC1 de Pichia stipites, piruvato descarboxilasa PDC2 de Pichia stipites, piruvato descarboxilasa de Kluveromyces lactis, piruvato descarboxilasa de Yarrowia lipolytica, piruvato descarboxilasa de Schizosaccharomyces pombe, y piruvato descarboxilasa de Zygosaccharomyces rouxii. En algunas realizaciones, las células huésped contienen una deleción o regulación en descenso de un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de gliceraldehido-3-fosfato a glicerato 1,3 bifosfato. En algunas realizaciones, la enzima que cataliza esta reacción es gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa.

La publicación WIPO número WO 2011/103300 describe células huésped recombinantes que comprenden (a) al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa; (b)(i) al menos una deleción, mutación, y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta a la biosintesis de centros Fe-S; y/o (ii) al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta a la biosintesis de centros Fe-S. En realizaciones, el polipéptido que afecta a la biosintesis de centros Fe-S es codificado por AFT1, AFT2, FRA2, GRX3 o CCC1. En realizaciones, el polipéptido que afecta a la biosintesis de centros Fe-S es AFT1 L99A, AFT1 L102A, AFT1 C291F o AFT1 C293F mutantes constitutivos.

Adicionalmente, las células huésped pueden comprender polinucleótidos heterólogos que codifican un polipéptido con actividad fosfocetolasa y/o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad fosfotransacetilasa como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° 2012/0156735.

En algunas realizaciones, cualquier molécula de ácido nucleico o polipéptido particular puede ser al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos o secuencia de polipéptidos descrita en la presente memoria. El término “porcentaje de identidad”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinado comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, como sea el caso, determinado por la concordancia entre cuerdas de tales secuencias. La “identidad” y “similitud” pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., Ed.s) Stockton: Ny (1991).

Las técnicas estándar de ADN recombinante y de clonación molecular son bien conocidas en la técnica, y son descritas por Sambrook, et al. (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989, denominado en la presente memoria Maniatis) y por Ausubel, et al. (Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience, 1987). Se describen ejemplos de métodos para construir microorganismos que comprenden una ruta biosintética de butanol, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 7.851.188, y las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. Nos. 2007/0092957; 2007/0259410; 2007/0292927; 2008/0182308; 2008/0274525; 2009/0155870; 2009/0305363; y 2009/0305370.

Expresión de una ruta biosintética de butanol en Saccharomyces cerevisiae

Los métodos para expresión de genes en Saccharomyces cerevisiae se conocen en la técnica (p.ej., Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink, eds., Elsevier Academic Press, San Diego, CA). La expresión de genes en levadura requiere típicamente un promotor, seguido del gen de interés, y un terminador transcripcional. Pueden usarse varios promotores de levadura, incluyendo los usados en los Ejemplos en la presente memoria, en la construcción de cajas de expresión para genes que codifican una ruta biosintética de butanol, que incluyen, pero no se limitan a, promotores constitutivos FBA, GPD, ADH1 y GPM, y los promotores inducibles g Al 1, GAL10 y CUP1. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, FBAt, GPDt, GPMt, ERG10t, GAL1t, CYC1 y ADH1. Por ejemplo, promotores adecuados, terminadores transcripcionales, y los genes de una ruta biosintética de butanol pueden clonarse en vectores lanzadera de E. coli-levadura y transformarse en células de levadura como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2010/0129886. Estos vectores permiten la propagación de cepas tanto en cepas de E. coli como de levadura. Por regla general, el vector contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica en el huésped deseado. Los plásmidos usados típicamente en levadura son vectores lanzadera pRS423, pRS424, pRS425 y pRS426 (American Type Culture Collection, Rockville, MD), que contienen un origen de replicación de E. coli (p.ej., pMB1), un origen de replicación 2|j de levadura, y un marcador para selección nutricional. Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 (vector pRS423), Trp1 (vector pRS424), Leu2 (vector pRS425) y Ura3 (vector pRS426). La construcción de vectores de expresión con genes que codifican polipéptidos de interés puede realizarse por técnicas estándar de clonación molecular en E. coli o bien por el método de recombinación por reparación de huecos en levadura.

La estrategia de clonación por reparación de huecos aprovecha la altamente eficaz recombinación homóloga en la levadura. Por regla general, se digiere un ADN vector de levadura (p.ej., en su sitio de clonación múltiple) para crear un “hueco” en su secuencia. Se generan varios ADNs de inserto de interés que contienen una secuencia > 21 bp tanto en ambos extremos 5' y 3' que se solapan secuencialmente unos con otros, y con el 'termino 5' y 3' del ADN vector. Por ejemplo, para construir un vector de expresión de levadura para 'Gen X', se seleccionan un promotor de levadura y un terminador de levadura para la caja de expresión. El promotor y el terminador se amplifican a partir del ADN genómico de levadura, y el Gen X es amplificado por PCR desde su organismo fuente o bien es obtenido de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen X. Hay al menos una secuencia solapante de 21 bp entre el extremo 5' del vector linealizado y la secuencia del promotor, entre el promotor y el Gen X, entre el Gen X y la secuencia del terminador, y entre el terminador y el extremo 3' del vector linealizado. El vector “dotado de huecos” y los ADNs de inserto son cotransformados después en una cepa de levadura y puestos en placa en el medio que contiene las mezclas de compuestos apropiadas que permiten una complementación de los marcadores de selección nutricional en los plásmidos. La presencia de combinaciones de insertos correctas puede ser confirmada por mapeo PCR usando ADN plásmido preparado a partir de las células seleccionadas. El ADN plásmido aislado de levadura (habitualmente bajo en concentración) puede ser transformado después en una cepa de E. coli, p.ej., TOP10, seguido de mini preps y mapeo de restricción para verificar adicionalmente el constructo del plásmido. Finalmente el constructo puede ser verificado por análisis de secuencias.

Como la técnica de reparación de huecos, la integración en el genoma de levadura también aprovecha el sistema de recombinación homóloga en la levadura. Por regla general, una caja que contiene una región codificante y elementos de control (promotor y terminador) y marcador auxotrófico es amplificada por PCR con una ADN polimerasa de alta fidelidad usando cebadores que se hibridan a la caja y contienen 40-70 pares de bases de homología de secuencia a las regiones 5' y 3' del área genómica donde se desea la inserción. El producto de PCR es transformado después en levadura y puesto en placa en un medio que contiene las mezclas de compuestos apropiadas que permiten la selección para el marcador auxotrófico integrado. Por ejemplo, para integrar el “Gen X” en la ubicación cromosómica “Y”, el constructo promotor-región codificante X-terminador es amplificado por PCR a partir de un constructo de ADN plásmido y unido a un marcador autotrófico (tal como URA3) por PCR SOE o bien por digestiones de restricción habituales y clonación. La caja completa, que contiene el promotor-región codificante X-terminador-región URA3, es amplificada por PCR con secuencias de cebadores que contienen 40-70 bp de homología a las regiones 5' y 3' de la ubicación “Y” en el cromosoma de levadura. El producto de PCR es transformado en levadura y seleccionado en medios de crecimiento que carecen de uracilo. Los transformantes pueden ser verificados por PCR de colonias o bien por secuenciación directa de ADN cromosómico.

Crecimiento para la producción

Las células huésped recombinantes descritas en la presente memoria se ponen en contacto con sustratos de carbono adecuados, típicamente en medios de fermentación. Los sustratos de carbono adicionales pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como fructosa, oligosacáridos tales como lactosa, maltosa, galactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o mezclas de los mismos y mezclas no purificadas de materias primas renovables tales como permeado de suero de queso, licor de maicena, melazas de remolacha y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir etanol, lactato, succinato o glicerol.

Adicionalmente el sustrato de carbono también pueden ser sustratos de un carbono tales como dióxido de carbono, o metanol, para los que se ha demostrado la conversión metabólica en intermedios bioquímicos clave. Además de sustratos de uno o dos carbonos, también se sabe que organismos metilotróficos utilizan varios otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y diversos aminoácidos para actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que levaduras metilotróficas utilizan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th (1993), 415-32, Editores: Murrell, J. Collin, Kelly, Don P.; Publicador: Intercept, Andover, UK). De manera similar, diversas especies de Candida metabolizarán alanina o ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbio!. 153:485-489 (1990)). Por tanto se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solo será limitada por la elección del organismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y mezclas de los mismos son adecuados en la presente invención, en algunas realizaciones, los sustratos de carbono son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estas con azúcares C5 tales como xilosa y/o arabinosa para células de levadura modificadas para usar azúcares C5. La sacarosa puede derivar de fuentes de azúcar renovables tales como caña de azúcar, remolachas, mandioca, sorgo dulce, y mezclas de los mismos. La glucosa y dextrosa pueden derivar de fuentes de grano renovables mediante la sacarificación de materias primas basadas en almidón, que incluyen granos tales como maíz, trigo, centeno, cebada, avena, y mezclas de los mismos. Además, los azúcares fermentables pueden derivar de biomasa celulósica o lignocelulósica renovable mediante procedimientos de pretratamiento y sacarificación, como se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2007/0031918 A1. La biomasa, cuando se usa en referencia a sustrato de carbono, hace referencia a cualquier material celulósico o lignocelulósico, e incluye materiales que comprenden celulosa, y que comprenden opcionalmente además hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos. La biomasa también puede comprender componentes adicionales, tales como proteína y/o lípido. La biomasa puede derivar de una única fuente, o la biomasa puede comprender una mezcla derivada de más que una fuente; por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas de maíz y rastrojos de maíz, o una mezcla de hierba y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bioenergéticos, residuos agrícolas, desechos sólidos urbanos, desechos sólidos industriales, fango de la fabricación de papel, desechos de jardinería, madera y desechos forestales. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, grano de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como hojas de maíz, rastrojo de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto varilla, desechos de papel, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, serrín, arbustos y matorrales, vegetales, frutas, flores, estiércol animal y mezclas de los mismos.

Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación deben contener minerales adecuados, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes, conocidos por los expertos en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática descrita en la presente memoria.

Condiciones de cultivo

Por regla general, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C en un medio apropiado. Los medios de crecimiento adecuados en la presente descripción son medios habituales preparados en el mercado, tales como caldo de Luria Bertani (LB), caldo de Dextrosa de Saboraud (SD) o caldo de Medio Levadura (YM), o caldo que incluye base de nitrógeno de levadura, sulfato de amonio y dextrosa (como fuente de carbono/energía) o medio YPD, una mezcla de peptona, extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para cultivar la mayoría de las cepas de Saccharomyces cerevisiae. También pueden usarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular será conocido por un experto en la técnica de la microbiología o ciencia de fermentación. El uso de agentes conocidos por modular la represión de catabolitos directamente o indirectamente, p.ej., adenosina 2',3'-monofosfato cíclica (AMPc), también puede incorporarse en el medio de fermentación.

Los intervalos de pH adecuados para la fermentación están entre aproximadamente pH 5.0 y pH 9.0, donde se prefiere pH 6.0 a pH 8.0 para la condición inicial. Los intervalos de pH adecuados para la fermentación de levadura están típicamente entre aproximadamente pH 3.0 y aproximadamente pH 9.0. En una realización, se usa aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente pH 8.0 para la condición inicial. Los intervalos de pH adecuados para la fermentación de otros microorganismos están entre aproximadamente pH 3.0 y aproximadamente pH 7,5. En una realización, se usa aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente pH 6,5 para la condición inicial.

Las fermentaciones pueden realizarse en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. En una realización, se usan condiciones anaeróbicas o microaeróbicas para la fermentación.

Fermentaciones industriales discontinuas y continuas

El butanol, u otros productos, pueden producirse usando un método de fermentación discontinuo. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado donde la composición del medio se ajusta al comienzo de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Una variación en el sistema discontinuo estándar es el sistema discontinuo alimentado. Los procedimientos de fermentación discontinuos alimentados son adecuados también en la presente invención, y comprenden un sistema discontinuo típico con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos según progresa la fermentación. Los sistemas discontinuos alimentados son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y donde es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en los medios. Las fermentaciones discontinuas y discontinuas alimentadas son habituales y bien conocidas en la técnica, y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA., o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992).

El butanol, u otros productos, también puede producirse usando métodos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto donde se añade continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor, y se retira simultáneamente una cantidad igual de medios acondicionados para procesamiento. la fermentación continua mantiene generalmente los cultivos a una densidad alta constante, donde las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica. La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan al crecimiento celular o la concentración del producto final. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procedimientos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación de producto, son bien conocidos en la técnica dela microbiología industrial, y diversos métodos son detallados por Brock, arriba.

Se contempla que la producción de butanol, u otros productos, puede practicarse usando procedimientos discontinuos, discontinuos alimentados o continuos, y que cualquier modo conocido de fermentación sería adecuado. Adicionalmente, se contempla que las células pueden ser inmovilizadas en un sustrato como catalizadores celulares enteros, y ser sometidas a condiciones de fermentación para la producción de butanol.

Métodos para el aislamiento de butanol del medio de fermentación

El butanol bioproducido puede aislarse del medio de fermentación usando métodos conocidos en la técnica para fermentaciones ABE (véase, p.ej., Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:639-648 (1998), Groot et al., Process. Biochem. 27:61-75 (1992), y las referencias en los mismos). Por ejemplo, los sólidos pueden retirarse del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación o similares. El butanol puede aislarse del medio de fermentación usando métodos tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, purificación con gas, evaporación por membrana o pervaporación.

Debido a que el butanol forma una mezcla azeotrópica, de bajo punto de ebullición, con el agua, puede usarse destilación para separar la mezcla hasta su composición azeotrópica. La destilación puede usarse en combinación con los procedimientos descritos en la presente memoria para obtener la separación alrededor del azeótropo. Los métodos que pueden usarse en combinación con destilación para aislar y purificar el butanol incluyen, pero no se limitan a, decantación, extracción líquido-líquido, adsorción y técnicas basadas en membranas. Adicionalmente, el butanol puede aislarse usando destilación azeotrópica usando un arrastrador (véase, p.ej., Doherty y Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, Nueva York, 2001).

La mezcla butanol-agua forma un azeótropo heterogéneo, con lo que puede usarse destilación en combinación con decantación para aislar y purificar el isobutanol. En este método, el caldo de fermentación que contiene butanol se destila a cerca de la composición azeotrópica. Después, la mezcla azeotrópica se condensa, y el butanol se separa del medio de fermentación por decantación. La fase acuosa decantada puede ser devuelta a la primera columna de destilación como reflujo o a una columna de purificación independiente. La fase orgánica decantada rica en butanol puede ser purificada adicionalmente por destilación en una segunda columna.

El butanol también puede aislarse del medio de fermentación usando extracción líquido-líquido en combinación con destilación. En este método, el butanol se extrae del caldo de fermentación usando extracción líquido-líquido con un disolvente adecuado. La fase orgánica que contiene butanol se destila después para separar el butanol del disolvente.

También puede usarse destilación en combinación con adsorción para aislar el butanol del medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene el butanol se destila a cerca de la composición azeotrópica, y después el agua restante se retira mediante el uso de un adsorbente, tal como tamices moleculares (Aden et al., Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolisis and Enzymatic Hydrolisis for Corn Stover, Report NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, junio de 2002).

Adicionalmente, puede usarse destilación en combinación con pervaporación para aislar y purificar el butanol del medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene el butanol se destila a cerca de la composición azeotrópica, y después el agua restante se retira por pervaporación mediante una membrana hidrófila (Guo et al., J. Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)).

Puede usarse la retirada de producto in situ (ISPR) (denominada también fermentación extractiva) para retirar el butanol (u otro alcohol fermentativo) del recipiente de fermentación según se produce, permitiendo de este modo que el microorganismo produzca butanol en altos rendimientos. Un método para ISPR para retirar el alcohol fermentativo que se ha descrito en la técnica es la extracción líquido-líquido. En general, con respecto a la fermentación de butanol, por ejemplo, el medio de fermentación, que incluye el microorganismo, se pone en contacto con un extractante orgánico en un tiempo antes de que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico. El extractante orgánico y el medio de fermentación forman una mezcla bifásica. El butanol se reparte en la fase del extractante orgánico, disminuyendo la concentración en la fase acuosa que contiene el microorganismo, limitando de este modo la exposición del microorganismo al butanol inhibitorio.

La extracción líquido-líquido puede realizarse, por ejemplo, según los procedimientos descritos en las publicaciones de solicitudes de patente de Ee .UU. Nos. 2009/0305370 y 2011/0097773. Las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. Nos. 2009/0305370 y 2011/0097773 describen métodos para producir y recuperar butanol de un caldo de fermentación usando extracción líquido-líquido, comprendiendo los métodos la etapa de poner en contacto el caldo de fermentación con un extractante inmiscible con el agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. Por regla general, el extractante puede ser un extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos C12 a C22 saturados, monoinsaturados, poliinsaturados (o mezclas de los mismos), ácidos graos C12 a C22, ésteres de ácidos grasos C12 a C22, aldehídos grasos C12 a C22, y mezclas de los mismos. El (los) extractante(s) para ISPR pueden ser extractantes no de alcohol. El extractante ISPr puede ser un extractante orgánico exógeno tal como alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, 1-undecanol, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, undecanal, aldehído láurico, 20-metilundecanal, y mezclas de los mismos.

En algunas realizaciones, , puede formarse un éster de alcohol poniendo en contacto el alcohol en un medio de fermentación con un ácido orgánico (p.ej., ácidos grasos) y un catalizador capaz de esterificar el alcohol con el ácido orgánico. En tales realizaciones, el ácido orgánico puede servir como extractante de ISPR en el que los ésteres de alcohol se reparten. El ácido orgánico puede ser suministrado al recipiente de fermentación y/o derivar de la biomasa que suministra carbono fermentable alimentada al recipiente de fermentación. Los lípidos presentes en la materia prima pueden ser hidrolizados catalíticamente a ácido orgánico, y el mismo catalizador (p.ej., enzimas) puede esterificar el ácido orgánico con el alcohol. En ciertas realizaciones, los lípidos presentes en la materia prima pueden ser convertidos en ácidos grasos y glicerol utilizando los catalizadores (p.ej., enzimas) descritos anteriormente. El glicerol puede, por ejemplo, proporcionarse al recipiente de fermentación para suplementar los microorganismos con producción de glicerol reducida descritos en la presente memoria. Suplementar los microorganismos puede, por ejemplo, mejorar la producción de biomasa y la salud de las células de los microorganismos. El glicerol será proporcionado en cantidades suficientes más allá de las producidas por la levadura en condiciones de fermentación. Los ácidos carboxílicos que se producen durante la fermentación pueden ser esterificados adicionalmente con el alcohol producido por el mismo o un catalizador diferente. El catalizador puede ser suministrado a la materia prima antes de la fermentación, o puede ser suministrado al recipiente de fermentación antes o al mismo tiempo que con el suministro de la materia prima. Cuando se suministra el catalizador al recipiente de fermentación, pueden obtenerse ésteres de alcohol por hidrólisis de los lípidos a ácido orgánico una esterificación sustancialmente simultánea del ácido orgánico con el butanol presente en el recipiente de fermentación. También puede alimentarse ácido orgánico y/o aceite nativo no derivado de la materia prima al recipiente de fermentación, hidrolizándose el aceite nativo a ácido orgánico. Cualquier ácido orgánico no esterificado con el alcohol puede servir como parte del extractante ISPR. El extractante que contiene ésteres de alcohol puede ser separado del medio de fermentación, y el alcohol puede ser recuperado del extractante. El extractante puede ser reciclado al recipiente de fermentación. Así, en el caso de la producción de butanol, por ejemplo, la conversión del butanol a un éster reduce la concentración de butanol libre en el medio de fermentación, protegiendo a los microorganismos del efecto tóxico de aumentar la concentración de butanol. Además, puede usarse grano no fraccionado como materia prima sin separación de los lípidos en los mismos, dado que los lípidos pueden ser hidrolizados catalíticamente a ácido orgánico, disminuyendo de este modo la velocidad d e a c u m u la c ió n d e l íp id o s e n e l e x t r a c t a n t e I S P R .

L a r e t ir a d a d e p r o d u c t o in s itu p u e d e l le v a r s e a c a b o d e u n m o d o d is c o n t in u o o u n m o d o c o n t in u o . E n u n m o d o c o n t in u o d e r e t ir a d a d e p r o d u c t o in s itu , e l p r o d u c t o s e re t ira c o n t in u a m e n t e d e l r e a c t o r . E n u n m o d o d is c o n t in u o d e r e t ir a d a d e p r o d u c t o in s itu , s e a ñ a d e u n v o lu m e n d e e x t r a c t a n t e o r g á n ic o a l r e c ip ie n t e d e f e r m e n t a c ió n y e l e x t r a c t a n t e n o s e re t ir a d u r a n t e e l p r o c e d im ie n t o . P a r a la r e t ir a d a d e p r o d u c t o in s it u , e l e x t r a c t a n t e o r g á n ic o p u e d e c o n t a c t a r c o n e l m e d io d e f e r m e n t a c ió n a l in ic io d e la f e r m e n t a c ió n f o r m a n d o u n m e d io d e f e r m e n t a c ió n b if á s ic o . A lt e r n a t iv a m e n t e , e l e x t r a c t a n t e o r g á n ic o p u e d e c o n t a c t a r c o n e l m e d io d e f e r m e n t a c ió n d e s p u é s d e q u e e l m ic r o o r g a n is m o h a y a a l c a n z a d o u n a c a n t id a d d e c r e c im ie n t o d e s e a d a , q u e p u e d e d e t e r m in a r s e m id ie n d o la d e n s id a d ó p t ic a d e l c u lt iv o . A d e m á s , e l e x t r a c t a n t e o r g á n ic o p u e d e c o n t a c t a r c o n e l m e d io d e f e r m e n t a c ió n e n u n m o m e n t o e n e l q u e e l n iv e l d e a lc o h o l p r o d u c t o e n e l m e d io d e f e r m e n t a c ió n a l c a n z a u n n iv e l p r e s e le c c io n a d o . E n e l c a s o d e la p r o d u c c ió n d e b u t a n o l s e g ú n a l g u n a s r e a l iz a c io n e s d e la p r e s e n t e in v e n c ió n , e l e x t r a c t a n t e d e á c id o o r g á n ic o p u e d e c o n t a c t a r c o n e l m e d io d e f e r m e n t a c ió n e n u n m o m e n t o a n t e s d e q u e la c o n c e n t r a c ió n d e b u t a n o l a l c a n c e u n n iv e l t ó x ic o , p a r a e s t e r if ic a r e l b u t a n o l c o n e l á c id o o r g á n ic o p a r a p r o d u c ir é s t e r e s d e b u t a n o l y p o r c o n s ig u ie n t e r e d u c ir la c o n c e n t r a c ió n d e b u t a n o l e n e l r e c ip ie n t e d e f e r m e n t a c ió n . L a f a s e o r g á n ic a q u e c o n t ie n e é s t e r e s p u e d e s e r r e t ir a d a d e s p u é s d e l r e c ip ie n t e d e f e r m e n t a c ió n ( y s e p a r a d a d e l c a ld o d e f e r m e n t a c ió n q u e c o n s t it u y e la f a s e a c u o s a ) d e s p u é s d e q u e s e a l c a n c e u n t ít u lo e f e c t iv o d e s e a d o d e lo s é s t e r e s d e b u t a n o l. E n a l g u n a s r e a l iz a c io n e s , la f a s e o r g á n ic a q u e c o n t ie n e é s t e r e s e s s e p a r a d a d e la f a s e a c u o s a d e s p u é s d e q u e la f e r m e n t a c ió n d e l a z ú c a r f e r m e n t a b le d is p o n ib le e n e l r e c ip ie n t e d e f e r m e n t a c ió n e s t é s u s t a n c ia lm e n t e c o m p le t a .

C o n f ir m a c ió n d e la p r o d u c c ió n d e is o b u t a n o l

L a p r e s e n c ia y /o c o n c e n t r a c ió n d e is o b u t a n o l e n e l m e d io d e c u lt iv o p u e d e d e t e r m in a r s e p o r v a r io s m é t o d o s c o n o c id o s e n la t é c n ic a ( v é a s e , p o r e je m p lo , la p a t e n t e d e E E . U U . 7.851.188 ) . P o r e je m p lo , u n m é t o d o d e c r o m a t o g r a f ía l íq u id a d e a lt a r e s o lu c ió n ( H P L C ) e s p e c íf ic o u t i liz a u n a c o lu m n a S h o d e x S H - 10 11 c o n u n a c o lu m n a d e p r o t e c c ió n S h o d e x S H G , a m b a s p u e d e n a d q u ir ir s e e n W a t e r s C o r p o r a t io n ( M ilfo rd , M a s s .) , c o n d e t e c c ió n d e ín d i c e s d e r e f r a c c ió n ( R I) . L a s e p a r a c ió n c r o m a t o g r á f ic a s e c o n s ig u e u s a n d o H 2S O 40 ,01 M c o m o f a s e m ó v il c o n u n c a u d a l d e 0 , 5 m l/m in y u n a t e m p e r a t u r a d e c o lu m n a d e 50 ° C . E l is o b u t a n o l t ie n e u n t ie m p o d e r e t e n c ió n d e 46 ,6 m in e n la s c o n d ic io n e s u s a d a s .

A lt e r n a t iv a m e n t e , e s t á n d is p o n ib le s m é t o d o s d e c r o m a t o g r a f ía d e g a s e s ( G C ) . P o r e je m p lo , u n m é t o d o G C e s p e c íf ic o u t i liz a u n a c o lu m n a H P - I N N O W a x ( 30 m x 0 , 53 m m id , 1 p m d e e s p e s o r d e p e l íc u la , A g i le n t T e c h n o lo g ie s , W ilm in g t o n , D E ) , c o n u n d e t e c t o r d e io n iz a c ió n d e l la m a ( F I D ) . E l g a s p o r t a d o r e s h e lio a u n c a u d a l d e 4 , 5 m l/m in , m e d id o a 150 ° C c o n p r e s ió n e n c a b e z a c o n s t a n t e ; e l f r a c c io n a m ie n t o d e l in y e c t o r e s 1 : 25 a 200 ° C ; la t e m p e r a t u r a d e la e s t u f a e s 45 ° C d u r a n t e 1 m in , 45 a 220 ° C a 10 ° C / m i n , y 220 ° C d u r a n t e 5 m in ; y la d e t e c c ió n F I D s e e m p le a a 24 0 ° C c o n 26 m l/m in d e g a s h e lio d e r e c o n s t it u c ió n . E l t ie m p o d e r e t e n c ió n d e l is o b u t a n o l e s 4 , 5 m in .

A u n q u e s e h a n d e s c r it o e n la p r e s e n t e m e m o r ia d iv e r s a s r e a l iz a c io n e s d e la p r e s e n t e in v e n c ió n , d e b e e n t e n d e r s e q u e s e h a n p r e s e n t a d o a m o d o d e e je m p lo s o la m e n t e , y n o d e l im it a c ió n . S e r á e v id e n t e p a r a la s p e r s o n a s e x p e r t a s e n la t é c n ic a r e le v a n t e q u e p u e d e n h a c e r s e e n la m is m a d iv e r s o s c a m b io s e n f o r m a y d e t a lle s in a p a r t a r s e d e l a l c a n c e d e la in v e n c ió n .

P o r t a n t o , la a m p lit u d y a l c a n c e d e la p r e s e n t e in v e n c ió n n o d e b e n s e r l im it a d o s p o r n in g u n a d e l a s r e a l iz a c io n e s ilu s t r a t iv a s d e s c r it a s a n t e r io r m e n t e , s in o q u e d e b e n s e r d e f in id o s s o la m e n t e d e a c u e r d o c o n la s r e iv in d ic a c io n e s y s u s e q u iv a le n t e s .

T o d a s la s p u b l ic a c io n e s , p a t e n t e s y s o l ic it u d e s d e p a t e n t e m e n c i o n a d a s e n e s t a m e m o r ia d e s c r ip t iv a s o n in d ic a t iv a s d e l n iv e l d e lo s e x p e r t o s e n la t é c n ic a a la q u e e s t a in v e n c ió n p e r t e n e c e .

Ejemplos

L a p r e s e n t e in v e n c ió n s e d e f in e a d ic io n a lm e n t e e n lo s s ig u ie n t e s E je m p lo s . D e b e e n t e n d e r s e q u e e s t o s E je m p lo s , a u n q u e in d ic a n r e a l iz a c io n e s d e la in v e n c ió n , s e d a n a m o d o d e i lu s t r a c ió n s o la m e n t e . A p a rt ir d e la d is c u s ió n a n t e r io r y e s t o s E je m p lo s , u n e x p e r t o e n la t é c n ic a p u e d e c o m p r o b a r la s c a r a c t e r ís t ic a s e s e n c ia l e s d e e s t a in v e n c ió n , y s in a p a r t a r s e d e l a l c a n c e d e la m is m a , p u e d e h a c e r d iv e r s o s c a m b io s y m o d if ic a c io n e s d e la in v e n c ió n p a r a a d a p t a r la a d iv e r s o s u s o s y c o n d ic io n e s .

M é t o d o s g e n e r a le s

L a s t é c n i c a s e s t á n d a r d e A D N r e c o m b in a n t e , d e c lo n a c ió n m o le c u la r , y lo s p r o t o c o lo s d e t r a n s f o r m a c ió n u s a d o s e n lo s E je m p lo s s o n b ie n c o n o c id o s e n la t é c n ic a , y s o n d e s c r it o s p o r S a m b r o o k e t a l. ( S a m b r o o k , J . , F r it s c h , E . F . y M a n ia t is , T . ( M o le c u la r C lo n in g : A L a b o r a t o r y M a n u a l; C o ld S p r in g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o ld S p r in g H a r b o r , 1989 d e n o m in a d o e n la p r e s e n t e m e m o r ia M a n ia t is ) , p o r A u s u b e l e t a l. ( A u s u b e l e t a l ., C u r r e n t P r o t o c o ls in M o le c u la r B io lo g y , p u b l ic a d o p o r G r e e n e P u b l is h in g A s s o c . y W i le y - I n t e r s c ie n c e ( 1987 ) , y p o r A m b e r g e t a l ( A m b e r g , D . C . , B u r k e , D . J . y S t r a t h e r n , J . N . ( M e t h o d s in Y e a s t G e n e t ic s : A C o ld S p r in g H a r b o r L a b o r a t o r y C o u r s e M a n u a l, C o ld S p r in g H a r b o r P r e s s , 2005 ) . L o s m a t e r ia le s y m é t o d o s a d e c u a d o s p a r a e l m a n t e n im ie n t o y c r e c im ie n t o d e c u lt iv o s b a c t e r ia n o s s o n b ie n c o n o c id o s e n la t é c n ic a . L a s t é c n i c a s a d e c u a d a s p a r a e l u s o e n lo s s ig u ie n t e s e je m p lo s p u e d e n e n c o n t r a r s e c o m o s e e x p o n e e n m a n u a l o f M e t h o d s fo r G e n e r a l B a c t e r io lo g y ( P h il l ip p e t a l ., e d s . , A m e r ic a n S o c ie t y fo r M ic r o b io lo g y , W a s h in g t o n D C . , 1994 ) o p o r T h o m a s D . B r o c k e n ( B r o c k , B io t e c h n o lo g y : A T e x t b o o k o f In d u s t r ia l Microbiology, Segunda Edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron en Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, m O), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Invitrogen (Carlsbad, CA), HiMedia (Mumbai, India), SD Fine Chemicals (India), o Takara Bio Inc. (Shiga, Japón), a menos que se especifique otra cosa.

El significado de las abreviaturas es como sigue: “seg” significa segundo(s), “min” significa minuto(s), “h” significa hora(s), “nm” significa nanómetros, “ul” significa microlitro(s), “ml” significa mililitro(s), “mg/ml” significa miligramos por mililitro, “l” significa litro(s), “nm” significa nanómetros, “mM” significa milimolar, “M” significa molar, “mmol” significa milimol(es), “jm o l” significa micromol(es), “kg” significa kilogramo, “g” significa gramo(s), “|jg” significa microgramo(s) y “ng” significa nanogramo(s), “PCR” significa reacción en cadena de la polimerasa, “OD” significa densidad óptica, “OD600” significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm, “kDa” significa kilodaltons, “g” también puede significar la constante de gravitación, “bp” significa par(es) de bases, “kbp” significa kilopar(es) de bases, “kb” significa kilobase, “%” significa tanto por ciento, “% p/v” significa tanto por ciento en peso/volumen, “% v/v” significa tanto por ciento en volumen/volumen, “HPLC” significa cromatografía líquida de alta resolución, “g/l” significa gramos por litro, “ jg / l” significa microgramos por litro, “n g /jl” significa nanogramos por microlitro, “pm ol/jl” significa picomoles por microlitro, “RPM” significa rotación por minuto, “ jmol/min/mg” significa micromoles por minuto por miligramo, “p/v” significa peso por volumen, “v/v” significa volumen por volumen.

Construcción de cepas

Construcción de la cepa PNY2115

Se usa la cepa de Saccharomyces cerevisiae PNY0827 como célula huésped para la manipulación genética adicional para PNY2115. PNY0827 hace referencia a una cepa derivada de Saccharomyces cerevisiae que ha sido depositada en el ATCC bajo el Tratado de Budapest el 22 de septiembre de 2011 en el American Type Culture Collection, Patent Depository 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20110-2209, y tiene la designación de depósito de patente PTA-12105.

Deleción de URA3 y esporulación en haploides

A fin de suprimir la región codificante de URA3 endógeno, se amplificó por PCR una caja de deleción de pLA54 (SEQ ID NO: 95) que contiene una caja PTEF1-kanMX4-TEF1t flanqueada por sitios loxP para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador KANMX4. La PCR se hizo usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) y los cebadores BK505 (SEQ ID NO: 96) y BK506 (SEQ ID nO: 97). La porción de URA3 de cada cebador derivaba de la región 5' 180bp corriente arriba del ATG de URA3 y la región 3' 78bp corriente abajo de la región codificante, de tal modo que la integración de la caja kanMX4 da como resultado el reemplazo de la región codificante de URA3. El producto de la PCR se transformó en PNY0827 usando técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202) y se seleccionaron los transformantes en medio YEP suplementado con 2% de glucosa y 100 jg/m l de Geneticina a 30°C. Los transformantes fueron cribados por PCR de colonias con los cebadores LA468 (SEQ ID NO: 98) y LA492 (SEQ ID NO: 99) para verificar la presencia de la caja de integración. Se obtuvo un diploide heterocigótico: NYLA98 que tiene el genotipo MATa/a URA3/ura3::loxP-kanMX4.loxP. Para obtener haploides, se esporuló NYLA98 usando métodos estándar (Codon AC, Gasent-Ramírez JM, Benítez T. Factors wich affect the frequency of sporulation y tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeast. Appl Environ Microbiol. 1995 PMID: 7574601). Las tetradas se diseccionaron usando un micromanipulador y se cultivaron en medio YPE suplementado en 2% de glucosa. Las tetradas que contenían cuatro esporas viables fueron puestas sobre medio completo sintético que carecía de uracilo suplementado con 2% de glucosa, y el tipo concordante se verificó por PCR de colonias multiplex usando los cebadores AK109-1 (SEQ ID NO: 100), AK109-2 (SEQ ID NO: 101), AK109-3 (SEQ ID NO: 102). La cepa haploide identificada resultante llamada NYLA103, que tiene el genotipo: MATa ura3A::loxP-kanMX4-loxP, y NYLA¹⁰⁶ , que tiene el genotipo: MATa ura3A::loxP-kanMx4-loxP.

Deleción de His3

Para suprimir la región codificante de HIS3 endógena, se usó una caja de deleción sin marcas. Los cuatro fragmentos para la caja de PCR para la deleción de HIS3 sin marcas se amplificaron usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) y ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un kit Gentra Puregene Yeast/Bact (Qiagen; Valencia, CA). El Fragmento A de His3 fue amplificado con el cebador oBP452 (SEQ ID NO: 103) y el cebador oBP453 (SEQ ID nO 104), que contenían una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento B de His3. El Fragmento B de His3 fue amplificado con el cebador oBP454 (SEQ ID NO: 105), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento A de His3, y el cebador oBP455 (SEQ ID NO: 106), que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento U de His3. El Fragmento U de His3 fue amplificado con el cebador oBP456 (SEQ ID NO: 107), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento B de His3, y el cebador oBP457 (SEQ ID NO: 108), que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento C de His3. El Fragmento C de His3 fue amplificado con el cebador oBP458 (SEQ ID NO: 109), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento U de His3, y el cebador oBP459 (SEQ ID NO: 110). Los productos de PCR fueron purificados con un kit PCR Purification (Qiagen). El Fragmento AB de His3 fue creado por PCR solapante mezclando el Fragmento A de His3 y el Fragmento B de His3 y amplificando con los cebadores oBP452 (SEQ ID NO: 103) y oBP455 (SEQ ID NO: 106). El Fragmento UC de His3 fue creado por PCR solapante mezclando el Fragmento U de His3 y el Fragmento C de His3 y amplificando con los cebadores oBP456 (SEQ ID NO: 107) y oBP459 (SEQ ID NO: 110). Los productos de PCR resultantes se purificaron en un gel de agarosa seguido de un kit Gel Extraction (Qiagen). La caja HIS3 fue creada por PCR solapante mezclando el Fragmento AB de HIS3 y el Fragmento UC de HIS3 y amplificando con los cebadores oBP452 (S^eQ ID NO: 103) y oBP459 (SEQ ID NO: 110). El producto de PCR se purificó con un kit PCR Purification (Qiagen). Se transformaron células competentes de NYLA106 con la caja de PCR HIS3 ABUC y se pusieron en placa en medio completo sintético que carecía de uracilo suplementado con 2% de glucosa a 30°C. Los transformantes se cribaron para verificar la correcta integración poniendo en placa en réplica sobre medio completo sintético que carecía de histidina y suplementado con 2% de glucosa a 30°C. Se hicieron preps de ADN genómico para verificar la integración por PCR usando los cebadores oBP460 (SEQ ID NO: 111) y LA135 (SEQ ID NO: 112) para el extremo 5' y los cebadores oBP461 (SEQ ID NO: 113) y LA92 (SEQ ID NO: 114) para el extremo 3'. El marcador URA3 se recicló poniendo en placa en medio completo sintético que carecía de histidina y suplementado con 2% de glucosa y 5-FOA a 30°C siguiendo protocolos estándar. La retirada del marcador se confirmó poniendo colonias de las placas de 5-FOA sobre medio SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, llamada PNY2003, tiene el genotipo: MATa ura3A::loxP-kanMX4-loxP his3A.

Deleción de PDC1

Para suprimir la región codificante de PDC1 endógena, se amplificó por PCR una caja de deleción a partir de pLA59 (SEQ ID NO: 115), que contiene un marcador URA3 flanqueado por sitios loxP degenerados para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador URA3. La PCR se hizo usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) y los cebadores LA678 (SEQ ID NO: 116) y LA679 (SEQ ID NO: 117). La porción de PDC1 de cada cebador fue derivada de la región 5' 50bp corriente abajo del codón de inicio de PDC1 y la región 3' 50bp corriente arriba del codón de parada, de tal modo que la integración de la caja de URA3 da como resultado el reemplazo de la región codificante de PDC1 pero deja las primeras 50 bp y las últimas 50 bp de la región codificante. El producto de PCR fue transformado en PNY2003 usando técnicas genéticas estándar, y se seleccionaron transformantes en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 2% de glucosa a 30°C. Los transformantes se cribaron para verificar la correcta integración por PCR de colonias usando los cebadores LA337 (SEQ ID NO: 118), externo a la región codificante 5', y LA135 (SEQ ID NO: 112), un cebador interno para URA3. Después los transformantes positivos se cribaron por PCR de colonias usando los cebadores LA692 (SEQ ID NO: 119) y ^lA693 (SEQ ID NO: 120), internos a la región codificante de PDC1. El marcador URA3 se recicló por transformación con pLA34 (SEQ ID NO: 121), que contenía la recombinasa CRE bajo el promotor GAL1, y se puso en placa en medio completo sintético que carecía de histidina y suplementado con 2% de glucosa a 30°C. Los transformantes se pusieron en placa en medio rico suplementado con 0,5% de galactosa para inducir la recombinasa. La retirada del marcador se confirmó poniendo las colonias en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 2% de glucosa para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, llamada PNY2008, tiene el genotipo: MATa ura3A::loxP-kanMX4-loxP his3ApdclA::loxP71/66.

Deleción de PDC5

Para suprimir la región codificante de PDC5 endógena, se amplificó por PCR una caja de deleción a partir de pLA59 (SEQ ID NO: 115), que contiene un marcador URA3 flanqueado por sitios loxP degenerados para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador URA3. La PCR se hizo usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) y los cebadores LA722 (SEQ ID NO: 122) y LA733 (SEQ ID NO: 123). La porción de PDC5 de cada cebador fue derivada de la región 5' 50 bp corriente arriba del codón de inicio de PDC5 y la región 3' 50 bp corriente abajo del codón de parada, de tal modo que la integración de la caja de URA3 da como resultado el reemplazo de la región codificante de PDC5 entera. El producto de PCR fue transformado en PNY2008 usando técnicas genéticas estándar, y se seleccionaron transformantes en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se cribaron para verificar la correcta integración por PCR de colonias usando los cebadores LA453 (SEQ ID NO: 124), externo a la región codificante 5', y LA135 (SEQ ID NO: 112), un cebador interno para URA3. Después los transformantes positivos se cribaron por pCr de colonias usando los cebadores LA694 (SEQ ID NO: 125) y LA695 (SEQ ID NO: 126), internos a la región codificante de PDC5. El marcador URA3 se recicló por transformación con pLA34 (SEQ ID NO: 121), que contenía la recombinasa CRE bajo el promotor GAL1, y se puso en placa en medio completo sintético que carecía de histidina y suplementado con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se pusieron en placa en medio YEP rico suplementado con 1% de etanol y 0,5% de galactosa para inducir la recombinasa. La retirada del marcador se confirmó poniendo las colonias en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 1% de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, llamada PNY2009, tiene el genotipo: MATa ura3A::loxP-kanMX4-loxP his3Apdc1A::loxP71/66 pdc5A::loxP71/66.

Deleción de FRA2

La deleción de FRA2 se diseñó para suprimir 250 nucleótidos del extremo 3' de la secuencia codificante, dejando los primeros 113 nucleótidos de la secuencia codificante de FRA2 intactos. Estaba presente un codón de parada en la estructura 7 nucleótidos corriente abajo de la deleción. Los cuatro fragmentos para la caja PCR para la deleción de FRA2 sin marcas fueron amplificados usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA) y ADN genómico CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un kit Gentra Puregene Yeast/Bact (Quiagen; Valencia, CA). El Fragmento A de FRA2 fue amplificado con el cebador oBP594 (SEQ ID NO: 127) y el cebador oBP595 (SEQ ID NO: 128), que contenían una cola 5' con homología para el extremo 5' del Fragmento B de FRA2. El Fragmento B de FRA2 fue amplificado con el cebador oBP596 (SEQ ID NO: 129), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento A de FRA2, y el cebador oBP597 (SEQ ID NO: 130), que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento U de FRA2. El Fragmento U de FRA2 fue amplificado con el cebador oBP598 (SEQ ID NO: 131), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento B de FRA2, y el cebador oBP599 (SEQ ID NO: 132), que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del Fragmento C de FRA2. El Fragmento C de FRA2 fue amplificado con el cebador oBP600 (SEQ ID NO: 133), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento U de FRA2, y el cebador oBp601 (SEQ ID NO: 134). Los productos de PCR fueron purificados con un kit PCR Purification (Qiagen). El Fragmento AB de FRA2 fue creado por PCR solapante mezclando el Fragmento A de FRA2 y el Fragmento B de FRA2 y amplificando con los cebadores oBP594 (^s E^q ID NO: 127) y oBP597 (SEQ ID NO: 130). El Fragmento UC de FrA2 fue creado por PC solapante mezclando el Fragmento U de FRA2 y el Fragmento C de FRA2 y amplificando con los cebadores oBP598 (SEQ ID NO: 131) y oBP601 (SEQ ID NO: 134). Los productos de PCR resultantes fueron purificados en un gel de agarosa seguido de un kit Gel Extraction (Qiagen). La caja ABUC de FRA2 fue creada por PCR solapante mezclando el Fragmento AB de FRA2 y el Fragmento UC de FRA2 y amplificando con los cebadores oBP594 (SEQ ID NO: 127) y oBP601 (SEQ ID NO: 134). El producto de PCR fue purificado con un kit PCR Purification (Qiagen).

Para suprimir la región codificante de FRA2 endógena, la caja de deleción sin marcas obtenida anteriormente fue transformada en PNY2009 usando técnicas estándar, y se puso en placa en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 1% de etanol. Se hicieron preps de ADN genómico para verificar la integración por PCR usando los cebadores oBP602 (SEQ ID NO: 135) y LA135 (SEQ ID NO: 112) para el extremo 5', y los cebadores oBP602 (SEQ ID NO: 135) y oBP603 (SEQ ID NO: 136) para amplificar el locus entero. El marcador URA3 se recicló poniendo en placa en medio completo sintético suplementado con 1% de etanol y 5-FOA (ácido 5-fluoroorótico) a 30°C siguiendo protocolos estándar. La retirada del marcador se confirmó poniendo las colonias de las placas 5-FOA sobre medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 1% de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, PNY2037, tiene el genotipo: MATa ura3A::loxP-kanMX4.loxP his3A pdc1A::loxp71/66 pdc5A::loxP71/66 fra2A.

Adición de plásmido 2 micrón nativo

El marcador loxP71-URA3-loxP66 fue amplificado por PCR usando Phusion DNA polimerasa (New Ranglan Violas; Ipswich, MA) a partir de pLA59 (SEQ ID NO: 115), y transformado junto con los fragmentos de plásmido 2-micrón L^a 811^x817 (S^eQ ID Nos: 137, 138) y LA812x818 (S^eQ ID Nos: 139, 140) (amplificados a partir del plásmido 2-micrón nativo de CEN.PK 113-7D; Centraalbureau voor Schimmecultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre) en la cepa PNY2037 en placas de SE-URA a 30°C. La cepa resultante PNY20372|j::loxP71-UPA3-loxP66 fue transformada con pLA34 (pRS423::cre) (llamada también pLA34) (SEQ ID NO: 121) y seleccionada sobre placas de SE -HIS -URA a 30°C. Los transformantes se pusieron sobre placas de YP-1% de galactosa y se dejaron crecer durante 48 h a 30°C para inducir la expresión de Cre recombinasa. Las colonias individuales se pusieron después sobre placas SE -URA, SE -HIS y YPE para confirmar la retirada del marcador URA3. La cepa identificada resultante, PNY2050, tiene el genotipo: MATa ura3A::loxP-kanMX4-loxP, his3A pdc1A::loxP71/66 pdc5A::losxP71/66 fra2A 2-micrón.

Construcción de PNY2115 a partir de PNY2050

La construcción de PNY2115 [MATa ura3A::loxP his3A pdc5A::loxP66/71 fra2A 2-micrón plásmido (CEN.PK2) pdc1A::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6A:©UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1A::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 fra2A::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 gpd2A::loxP71/66] de PNY2050 fue como sigue.

Pdc1A::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66

Para integrar alsS en el locus pdc1A::loxP66/71 de PNY2050 usando el promotor de PDC1 endógeno, se amplificó por PCR una caja de integración a partir de pLA71 (SEQ ID NO: 146), que contiene el gen acetolactato sintasa de la especie ^{B ac illu s sub tilis} con un promotor FAB1 y un terminador CYC1, y un marcador URA3 flanqueado por sitios loxP degenerados para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador URA3. La PCR se hizo usando KAPA HiFi y los cebadores 895 (SEQ ID NO: 149) y 679 (S^eQ ID NO: 150). La porción PDC1 de cada cebador fue derivada de 60bp de la corriente arriba de la secuencia codificante y 50bp que son 53bp corriente arriba del codón de parada. El producto de PCR fue transformado en PNY2050 usando técnicas genéticas estándar, y los transformantes se seleccionaron en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes fueron cribados para verificar la correcta integración por PCR de colonias usando los cebadores 681 (SEQ ID NO: 151), externo a la región codificante 3', y 92 (SEQ ID ⁿO: 152), interno al gen URA3. Después los transformantes positivos se prepararon para ADN genómico y se cribaron por PCR usando los cebadores N245 (SEQ ID NO: 153) y N246 (SEQ iD NO: 154). El marcador de URA3 se recicló por transformación con pLA34 (SEQ ID NO: 121) que contenía la recombinasa CRE bajo el promotor GAL1, y se puso en placa en medios completos sintéticos que carecían de histidina y suplementados con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se pusieron en placa en medios ricos suplementados con 1% de etanol y 0,5% de galactosa para inducir la recombinasa. La retirada del marcador fue confirmada poniendo las colonias en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con 1% de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, llamada PNY2090, tiene el genotipo MATa ura3A::loxP, his3A, pdc1A::loxP71/66, pdc5A::loxP71/66 fra2A 2-micrón pdc1A::[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66.

Pdc6A::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66

Para suprimir la región codificante de PDC⁶ endógena, se amplificó por PCR una caja de integración a partir de pLA78 (SEQ ID NO: 147), que contiene el gen kivD de la especie Listeria Grayi con un promotor Fab1 híbrido y un terminador TDH3, y un marcador URA3 flanqueado por sitios loxP degenerados para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador URa 3. La PCR se hizo usando KAPA HiFi y los cebadores 896 (SEQ ID NO: 155) y 897 (SEQ ID NO: 156). La porción de PDC⁶ de cada cebador derivaba de 60bp corriente arriba de la secuencia codificante y 59bp corriente abajo de la región codificante. El producto de PCR fue transformado en PNY2090 usando técnicas genéticas estándar, y los transformantes se seleccionaron en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se cribaron para verificar la correcta integración por PCR de colonias usando los cebadores 365 (SEQ ID NO: 157) y 366 (SEQ ID NO: 158), cebadores internos al gen PDC⁶. Los transformantes con una ausencia de producto se cribaron después por PCR de colonias N638 (SEQ ID NO: 159), externo al extremo 5' del gen, y 740 (SEQ ID NO: 160), interno al promotor FBA1. Los transformantes positivos se prepararon para el ADN genómico y se seleccionaron mediante PCR con dos cebadores externos para la secuencia de codificación de PDC⁶. Los integrantes positivos darían un producto de 4720bp, mientras que los transformantes de tipo salvaje PDC⁶ darían un producto de 2130 bp. El marcador URA3 se recicló por transformación con pLA34 que contenía la CRE recombinasa bajo el promotor GAL1 y se puso en placa en medios completos sintéticos que carecían de histidina y suplementados con ¹ % de etanol a 30°C. Los transformantes se pusieron en medios ricos suplementados con 1% de etanol y 0,5% de galactosa para inducir la recombinasa. La retirada del marcador fue confirmada poniendo las colonias en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con 1% de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante se llama PNY2093, y tiene el genotipo MATa ura3A::loxP his3A pdc5A:loxP71/66 fra2A 2-micrón pdc1A::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6A::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVDILg(y)-TDH3t-loxP71/66.

Adh1A::Pr[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66

Para suprimir la región codificante de ADH1 endógena e integrar BiADH usando el promotor ADH1 endógeno, se amplificó por PCR una caja de integración a partir de pLA65 (SEQ ID NO: 148), que contiene la alcohol deshidrogenasa de la especia Beijerinckii con un promotor ILV5 y un terminador ADH1, y un marcador URA3 flanqueado por sitios loxP degenerados para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador URA3. La PCR se hizo usando Ka PA HiFi y los cebadores 856 (SEQ ID NO: 161) y 857 (SEQ Id NO: 162). La porción de ADH1 de cada cebador derivaba de la región 5' 50 bp corriente arriba del codón de partida ADH1 y los últimos 50 bp de la región codificante. El producto de PCR fue transformado en PNY2093 usando técnicas genéticas estándar, y los transformantes se seleccionaron en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con ¹ % de etanol a 30°C. Los transformantes se cribaron para verificar la correcta integración por PCR de colonias usando los cebadores PK415 (SEQ ID NO: 163, externo a la región codificante 5', y N1092 (SEQ ID NO: 164), interno al gen BiADH. Después los transformantes positivos fueron cribados por PCR de colonias usando los cebadores 413 (SEQ ID NO: 169), externo a la región codificante 3', y 92 (SEQ ID nO: 152), interno al marcador URA3. El marcador UrA3 se recicló por transformación con pLA34 (SEQ ID NO: 121) que contenía la recombinasa CRE bajo el promotor GAL1, y se puso en placa en medios completos sintéticos que carecían de histidina y suplementados con ¹ % de etanol a 30°C. Los transformantes se pusieron en placa en medios ricos suplementados con 1% de etanol y 0,5% de galactosa para inducir la recombinasa. La retirada del marcador fue confirmada poniendo las colonias en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con 1% de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, llamada p Ny 2101, tiene el genotipo MATa ura3A:loxP his3A pdc5A::loxP71/66 fra2A 2-micrón pdc1A::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6A::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1A::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66.

Fra2A::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66

Para integrar BiADH en el locus fra2A de PNY2101, se amplificó por PCR una caja de integración a partir de pLA65 (SEQ ID NO: 148), que contiene la alcohol deshidrogenasa de la especie Beijerinckii indica con un promotor ILV5 y un terminador ADH1, y un marcador URA3 flanqueado por sitios loxP degenerados para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador URA3. La PCR se hizo usando KAPA HiFi y los cebadores 906 (SEQ ID NO: 165) y 907 (SEQ ID NO: 166). La porción de FRA2 de cada cebador derivó de las primeras 60bp de la secuencia codificante partiendo de la ATG y 56bp corriente abajo del codón de parada. El producto de pCr fue transformado en PNY2101 usando técnicas genéticas estándar, y los transformantes se seleccionaron en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se cribaron para verificar la correcta integración por PCR de colonias usando los cebadores 667 (SEQ ID NO: 167), externo a la región codificante 5', y 749 (SEQ ID NO: 168), interno al promotor ILV5. El marcador URA3 se recicló por transformación con pLA34 (SEQ ID NO: 121) que contenía la recombinasa CRE bajo el promotor GAL1, y se puso en placa en medios completos sintéticos que carecían de histidina y suplementados con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se pusieron en placa en medios ricos suplementados con 1% de etanol y 0,5% de galactosa para inducir la recombinasa. La retirada del marcador se confirmó poniendo colonias en medios completos sintéticos que carecían de uracilo y suplementados con 1% de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, llamada PNY2110, tiene el genotipo MATa ura3A::loxP his3A pdc5A::loxP66/71 2-micrón pdc1A::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66 pdc6A:(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1A::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 fra2A::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66.

Deleción de GPD2

Para suprimir la región codificante GPD2 endógena, se amplificó por PCR una caja de deleción a partir de pLA59 (SEQ iD NO: 115), que contiene un marcador URA3 flanqueado por sitios loxP degenerados para permitir la recombinación homóloga in vivo y la retirada posterior del marcador URA3. La PCR se hizo usando KAPA HiFi y los cebadores LA512 (SEQ ID NO: 141) y LA513 (SEQ ID NO: 142). La porción de GPD2 de cada cebador derivó de la región 5' 50bp corriente arriba del codón de inicio GPD2 y la región 3' 50bp corriente abajo del codón de parada, de tal modo que la integración de la caja URA3 da como resultado el reemplazo de la región codificante de GPD2 entera. El producto de la PCR fue transformado en PNY2110 usando técnicas genéticas estándar, y los transformantes se seleccionaron en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se cribaron para verificar la correcta integración por PCR de colonias usando los cebadores LA516 (SEQ ID NO: 143), externo a la región codificante 5', y LA135 (SEQ ID NO: 112), interno a URA3. Después los transformantes positivos se cribaron por PCR de colonias usando los cebadores LA514 (SEQ ID NO: 144) y LA515 (SEQ ID NO: 145), internos a la región codificante de GPD2. El marcador URA3 se recicló por transformación con pLA34 (SEQ ID NO: 121) que contenía la recombinasa CRE bajo el promotor GAL1, y se puso en placa en medio completo sintético que carecía de histidina y suplementado con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se pusieron en placa en medio rico suplementado con 1% de etanol y 0,5% de galactosa para inducir la recombinasa. La retirada del marcador se confirmó poniendo las colonias en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con 1% de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, llamada PNY2115, tiene el genotipo MATa ura3A::loxP his3A pdc5A::loxP66/71 fra2A 2-micrón pdc1A::P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tloxP71/66 pdc6A::(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66 adh1A::P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 fra2A::P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66 gpd2A::loxP71/66.

Creación de PNY2145 a partir de PNY2115

El PNY2145 se construyó a partir del PNY2115 mediante la integración adicional de una caja de genes de fosfocetolasa en el locus pdc5A y reemplazando el gen AMN1 nativo con una versión optimizada por codón del ortólogo de CEN.PK. Los constructos de integración se describen adicionalmente a continuación.

Pdc5A: :FBA(L8)-xpk1-CYC1t-loxP71/66

El gen TEF(M4)-xpk1-CYC1t de pRS423::TEF(M4)-xpk1+ENO1-eutD (SEQ ID NO: 170) se amplificó por PCR usando los cebadores N1341 y N1338 (SEQ ID NOS: 171 y 172), generando un producto de 3.1 kb. La caja del gen URA3 flanqueado por loxP de pLA59 (SeQ ID NO: 115) se amplificó con los cebadores N1033c y N1342 (SEQ ID NOS: 173 y 174), generando un producto de 1,6 kb. Los productos de PCR xpk1 y URA3 se fusionaron combinándolos sin cebadores durante 10 ciclos adicionales de PCR usando ADN polimerasa Phusion. La mezcla de reacción resultante se usó después como plantilla para una reacción de PCR con KAPA Hi Fi y los cebadores N1342 y N1364 (SEQ ID NOS: 174 y 175).Se recuperó un producto de PCR de 4,2 kb por purificación desde un gel de agarosa de electroforesis (kit Zymo). Se amplificó la variante L⁸ del promotor FBA (SEQ ID NO: 176) usando los cebadores N1366 y N1368 (SEQ ID NOS: 177 y 178). El producto de PCR xpk1 ::URA3 se combinó con el promotor FBA por rondas adicionales de PCR. El producto resultante fue fosforilado con polinucleótido cinasa y ligado a pBR322 que había sido digerido con EcoRV y tratado con fosfatasa intestinal de ternero. La reacción de ligación fue transformada en células de E. coli (células competentes Stbl3 de Invitrogen). La caja de integración se confirmó por secuenciación. Para preparar ADN para integración, se usó el plásmido como plantilla en una reacción PCR con Kapa HiFi y los cebadores N1371 y N1372 (SEQ ID NOS: 179 y 180). El producto de PCR fue aislado por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol (usando métodos estándar; p.ej., Maniatas, et al.). Se usaron cinco microgramos de ADN para transformar la cepa PNY2115. Los transformantes se seleccionaron en medio que carecía de uracilo (medio completo sintético menos uracilo con 1% de etanol como fuente de carbono). Las colonias se cribaron en cuanto al caso de integración usando PCR (JumpStart) con los cebadores BK93 y N1114 (SEQ ID NOS: 181 y 182). Se seleccionaron dos clones para seguir adelante. El marcador URA3 se recicló por transformación con pJT254 (SEQ ID NO: 183) que contenía la recombinasa CRE bajo el promotor GAL1 y poniendo en placa sobre medio completo sintético que carecía de histidina y suplementado con 1% de etanol a 30°C. Los transformantes se cultivaron en medio rico suplementado con 1% de etanol para liberar la recombinasa. La retirada del marcador se confirmó para aislamientos de colonias individuales poniéndolas en medio completo sintético que carecía de uracilo y suplementado con ¹ % de etanol para verificar la ausencia de crecimiento. La pérdida del plásmido de recombinasa, pJT254, se confirmó poniendo en placa las colonias en medio completo sintético que carecía de histidina y suplementado con 1% de etanol. La retirada apropiada del marcador se confirmó por PCR (cebadores N160SeqF5 (SEQ ID NO: 184) y BK380. Un clon resultante se designó como PNY2293.

Amn1A::AMN1(y)-loxP71/66

Para reemplazar la copia endógena de AMN1 con una versión optimizada en codones del gen AMN1 de CEN.PK2, u n a c a ja d e in t e g r a c ió n q u e c o n t e n ía e l p r o m o t o r d e C E N . P K A M N 1 , e l g e n A M N 1 ( y ) ( S E Q ID d e á c id o s n u c le ic o s N O : 185 ; S E Q ID d e a m in o á c id o s N O : 186 ) , y e l t e r m in a d o r d e C E N . P K A M N 1 fu e e n s a m b la d a p o r P C R S O E y s u b c lo n a d a e n e l v e c t o r la n z a d e r a p L A 59. E l g e n A M N 1 ( y ) s e o r d e n ó a p a r t ir d e A D N 2.0 c o n o p t im iz a c ió n d e c o d o n e s p a r a S . cerevisiae. E l p lá s m id o P L A 67 c o m p le t a d o ( S E Q ID N O : 187 ) c o n t e n ía : 1 ) la s e c u e n c i a p r in c ip a l d e l v e c t o r p U C 19 q u e c o n t e n ía u n o r ig e n d e r e p l ic a c ió n d e E. coliy g e n d e r e s is t e n c ia a la a m p ic il in a ; 2 ) u n m a r c a d o r d e s e le c c ió n U R A 3 f la n q u e a d o p o r s it io s l o x P 71 y lo x P 66 ; y 3 ) la c a ja d e e x p r e s ió n PAM N 1(CEN .P K )-A M N 1(y)-term A M N 1(CEN .P K ). L a a m p l if ic a c ió n p o r P C R d e la c a ja A M N 1 ( y ) - l o x P 71 - U R A 3 - l o x P 66 s e h iz o u s a n d o K A P A K iF i d e K a p a B io s y s t e m s , ^{W o b u r n , M A , y lo s c e b a d o r e s L A 7 1 2} (SeQ ^{ID N O : 18 8 ) y L A 74 6 ( S E Q ID N O : 189 ) . E l p r o d u c t o d e P C R s e t r a n s f o r m ó} e n P N Y 2293 u s a n d o t é c n i c a s g e n é t ic a s e s t á n d a r , y lo s t r a n s f o r m a n t e s s e s e le c c io n a r o n e n m e d io c o m p le t o s in t é t ic o q u e c a r e c ía d e u r a c i lo y s u p le m e n t a d o c o n 1 % d e e t a n o l a 30 ° C . L o s t r a n s f o r m a n t e s s e o b s e r v a r o n b a jo a u m e n t o e n c u a n t o a la a u s e n c ia d e u n fe n o t ip o a g r u p a d o r c o n r e s p e c t o a l c o n t r o l ( P N Y 2293 ) . E l m a r c a d o r U R A 3 s e r e c ic ló u s a n d o e l p lá s m id o d e r e c o m b in a s a p J T 254 C r e d e s c r it o a n t e r io r m e n t e . D e s p u é s d e l r e c ic la d o d e l m a r c a d o r , lo s c lo n e s s e o b s e r v a r o n d e n u e v o b a jo a u m e n t o p a r a c o n f ir m a r la a u s e n c ia d e l fe n o t ip o a g r u p a d o r . U n a c e p a id e n t if ic a d a r e s u lt a n t e , P N Y 2145 , t ie n e e l g e n o t ip o : M A T a u r a 3 A : : l o x P h i s 3 A p d c 5 A : : P [ F B A ( L 8 ) ] - X P K | x p k 1 _ L p - C Y C t - l o x P 66 / 71 f r a 2 A 2 - m ic r ó n p lá s m id o ( C E N . P K 2 ) p d c 1 A : : P [ P D C 1 ] - A L S | a l s S _ B s - C Y C 1 t - l o x P 71 / 66 p d c 6 A : : ( U A S ) P G K 1 - P [ F B A 1 ] -K I V D | L g ( y ) - T D H 3 t - l o x P 71 / 66 a d h 1 A : : P [ A D H 1 ] - A D H | B i ( y ) - A D H t - l o x P 71 / 66 f r a 2 A : : P [ I L V 5 ] - A D H | B i( y ) - A D H t - l o x P 71 / 66 g p d 2 A : : lo x P 71 / 66 a m n 1 A : : A M N 1 ( y ) .

C r e a c ió n d e P N Y 2310 a p a r t ir d e P N Y 2145

S e g e n e r ó P N Y 2310 t r a n s f o r m a n d o la c e p a P N Y 2145 c o n lo s p lá s m id o s p L H 804 - L 2 V 4 y p R S 413 : : B i A D H - k i v D . E l p lá s m id o p L H 804 - L 2 V 4 ( S E Q ID N O : 12 ) e s u n v e c t o r la n z a d e r a d e l e v a d u r a - E . c o li b a s a d o e n p H R 81 ( A T C C # 87541 ) . ^{C o n t ie n e g e n e s p a r a la e x p r e s ió n d e la v a r ia n t e d e K A R I K 9 J B 4 P y la v a r ia n t e d e} DHAd ^{L 2 V 4 . É l p lá s m id o} p R S 413 : : B i A D H - k i v D ( S E Q ID N O : 13 ) e s u n v e c t o r la n z a d e r a d e le v a d u r a - E . c o li b a s a d o e n p R S 413 ( A T C C # 87518 ) . C o n t ie n e g e n e s p a r a la e x p r e s ió n d e B iA D H y k iv D . L a s p o s ic io n e s d e lo s r a s g o s r e le v a n t e s d e lo s g e n e s e n a m b o s p lá s m id o s s e e n u m e r a n e n la s T a b l a s 3 y 4. L o s t r a n s f o r m a n t e s d e lo s p lá s m id o s s e s e le c c io n a r o n p o n ie n d o e n p la c a e n m e d io c o m p le t o s in t é t ic o q u e c a r e c ía d e u r a c i lo e h is t id in a c o n 1 % ( v /v ) d e e t a n o l c o m o f u e n t e d e c a r b o n o . L a s c o lo n ia s fu e r o n t r a n s f e r id a s a p l a c a s f r e s c a s p o r p a r c h e o . D e s p u é s d e d o s d ía s , la s c é l u l a s d e lo s p a r c h e s s e t r a n s f ir ie r o n a p l a c a s q u e c o n t e n ía n m e d io c o m p le t o s in t é t ic o ( m e n o s u r a c i lo e h is t id in a ) c o n 2 % ( p /v ) d e g lu c o s a c o m o f u e n t e d e c a r b o n o . L a c e p a r e s u lt a n t e s e d e s ig n ó c o m o P N Y 2310 .

T a b l a 3 : P o s ic io n e s d e n u c le ó t id o s d e r a s g o s d e g e n e s d e ru ta e n e l p lá s m id o p L H 804 - L 2 V 4

T a b l a 4 : P o s ic io n e s d e n u c le ó t id o s d e r a s g o s d e g e n e s d e ru ta e n e l p lá s m id o p R S 413 _ B i A D H - k i v D

C r e a c ió n d e C P N 97 a p a r t ir d e P N Y 2145

P a r a r e e m p la z a r la G P D 1 e n d ó g e n a d e Saccharomyces cerevisiae c o n g p s A d e E. coli, s e d is e ñ a r o n c e b a d o r e s p a r a a m p l if ic a r e l m a r c o d e le c t u r a a b ie r t a d e g p s A d e E. coli p a r a in s e r t a r la u b ic a c ió n c r o m o s ó m ic a d e la G P D 1 e n d ó g e n a m a n t e n ie n d o la r e g ió n c o r r ie n t e a r r ib a d e l c o d ó n d e in ic io d e A T G y e l c o d ó n d e p a r a d a d e G P D 1 d e Saccharomyces cerevisiae e n d ó g e n a . S e u s ó P C R s o la p a n t e p a r a o b t e n e r u n p r o d u c t o d e P C R q u e c o n t e n ía 50 p a r e s d e b a s e s c o r r ie n t e a r r ib a d e la G P D 1 d e Saccharomyces cerevisiae p a r a r e c o m b in a c ió n , e l g e n g p s A d e E. coli, u n a c a ja lo x P URA3-loxP y 50 pares de bases cirreubte debajo de la GPD1 de Saccharomyces cerevisiae para recombinación en PNY2145. El ORF de gpaS de E. coli (producto 1 de PCR) se amplificó utilizando ADN cromosómico BL21 de E. coli como plantilla con los cebadores F1 (SeQ ID NO: 234) y R¹ (SeQ ID NO: 235). La caja loxP-URA3-loxP (producto 2 de PCR) se amplificó utilizando pLA59 (SEQ ID NO: 27) como plantilla usando los cebadores F2 (SEQ ID NO: 236) y R2 (SEQ ID NO: 237). El producto de PCR (producto 3 de PCR) que contenía 50 pares de bases corriente arriba de la GPD1 de Saccharomyces cerevisiae, el gen gpsA de E. coli, una caja loxP-URA3-loxP, y 50 pares de bases corriente abajo de la GPD1 de Saccharomyces cerevisiae se amplificó utilizando los productos de PCR 1 y 2 como plantillas y los cebadores F1 (SEQ ID NO: 234) y R2 (SEQ ID NO: 237). Todas las reacciones PCR se realizaron usando la enzima Herculase (Agilent; Santa Clara, CA) según las condiciones del fabricante.

El producto 3 de PCR se recuperó por purificación y se transformó en PNY2145 usando un kit de transformación de levadura (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). Se seleccionaron colonias en medio sintético de levadura que contenía 1% de etanol pero sin uracilo. Medio sintético de levadura: 6,7 g/l de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (Becton Dickinson; East Rutherford, NJ), 1,85 g/l de reducción Kaiser His-Ura (Formedium; Norfolk, UK). Se añadieron histidina o uracilo a 76 mg/l cuando se necesitó.

Para reciclar el marcador URA3, se seleccionó una colonia y se transformó con el plásmido pJT254 (SEQ ID NO: 183) que contenía recombinasa CRE bajo el promotor GAL1, y se puso en placa en medio sintético de levadura que contenía 1% de etanol y sin histidina. Se seleccionó una colonia y se cultivó durante una noche en medio YPE (20 g/l de peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de etanol) y se volvió a hacer un cultivo en rayas en placas de YPE (20 g/l de peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de etanol, 15 g/l de agar). Se seleccionaron colonias y se cultivaron en parches en placas de medio sintético de levadura que contenían ¹ % de etanol y sin uracilo, ¹ % de etanol y sin histidina, y placas de YPE. Se seleccionó una colonia incapaz de crecer en las placas que carecían de uracilo e histidina y se cribó en cuanto a la retirada del marcador y la inserción de gpsA de E. coli por PCR. La colonia se designó como CPN82.

Para producir una cepa con una ruta de producción de isobutanol, la CPN82 se transformó con pLH804::L2V4 (SEQ ID n O: 12) y pRS413::BiADH-kivD (SEQ ID NO: 13) descritos anteriormente. La transformación se puso en placa en medio sintético de levadura que carecía de uracilo e histidina y con ¹ % de etanol, y se seleccionaron tres colonias y se volvieron a cultivar en rayas en medio sintético de levadura que carecía de histidina y uracilo con 3 g/l de glucosa, 3 g/l de etanol. Las colonias se ensayaron en cuanto a producción de isobutanol, y se seleccionó una colonia y se designó como CPN97.

Creación de cepas variantes M1, M3 y M⁸ de GPD1 optimizadas por codones a partir de la integración de PNY2145 de variantes de GPD1 optimizadas por codones

A fin de ensayar mutantes de GPD1 en la cepa de Saccharomyces cerevisiae huésped, se intercambió la GPD1 nativa con una versión optimizada por codones de GPD1 sintetizada por ADN 2.0 usando utilización de codones de S. cerevisiae.

Preparación de la caja de integración

La caja de intercambio de genes se preparó clonando 2 fragmentos (corriente arriba de la región de homología corriente arriba de GPD1 y fragmento de GPD1 de levadura optimizada por codones) en el vector pBP3518 (SEQ ID NO: 9) que contenía el gen marcador de URA3 junto con el promotor y el terminador, y la región de homología corriente abajo de GPD clonada corriente abajo del gen marcador URA3.

El Fragmento 1 para la caja de integración se amplificó usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA), los cebadores oBP1329 (SEQ ID NO: 1) y oBP1333(SEQ ID NO: 2) y ADN genómico de PNY2145 como plantilla preparado usando el kit YeaStar TM Genomic DNA (Zymo Research). El Fragmento 2 se amplificó usando los cebadores oBP1334 (SEQ ID NO: 3) y oBP1335 (SEQ ID NO: 4) y GPD1 de levadura sintética optimizada por codones o variantes de GPD1 apropiadas como plantillas. El cebador oBP1333 (SEQ ID NO: 2) tiene una cola 5' con homología a la región 5' del Fragmento 2 (GPD1 sintética optimizada por codones), y el cebador oBP1334 (SEQ ID NO: 3) tiene una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento 1 (región corriente arriba de GPD). Los dos fragmentos se combinaron usando PCR de solapación usando el cebador oBP1329 (SEQ ID NO:1) y oBP1335 (SEQ ID NO:4). Este fragmento combinado se clonó en sitios Ascl y Pmel en el vector pBP3518 (SEQ iD NO:9) y el vector resultante, denominado pBP3518GPD* (SEQ ID NO:10) fue transformado en células competentes AgilentXL1Blue (Agilent Technologies, USA).

Transformación de la caja de integración en PNY2145

Se aisló el plásmido oBP3518GPD* (SEQ ID NO:10) usando el kit QIAprep Spin miniprep (Qiagen, GmbH) y se restringió usando las enzimas de restricción Sacl y Pacl (New England Biolabs Inc. Ipswich, MA). Los fragmentos de 4,2 kb resultantes (que contenían la caja de integración entera, la región de homología corriente arriba de GPD, GPD opt. por codones, gen marcador URA3 y región de GPD corriente abajo) fue transformada en PNY2145 usando el kit Frozen EZ Yeast Transformation II (Zymo Research). La mezcla de transformación se puso en placa en medio completo sintético que carecía de uracilo con 0,5% de etanol a 30°C durante 48 horas. Para la confirmación del sitio de integración, los transformantes se cribaron usando dos juegos de cebadores, oBP1342 (SEQ ID NO:⁶ ) y oBP1344 (SEQ ID NO:7) y oBP1341 (SEQ ID NO:5) y oBP1345 (SEQ ID NO:8) para la confirmación de la integración en ambos extremos. Los cebadores oBP1342 (SeQ ID NO:6) y oBP1345 (SEQ ID NO:8) se diseñaron a partir de una región fuera de la caja para confirmar la integración en el sitio correcto.

Retirada del marcador URA3

Los transformantes confirmados (cepa PNY2145 GPD1A::CO GPD1 URA3) fueron transformados con ^pRS423::P^{g a l 1}-cre usando un kit Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y poniendo en placa en medio completo sintético que carecía de histidina y uracilo suplementado con 0,5% de etanol, y se incubó a 30°C durante 48 horas. Los transformantes se cultivaron en medio completo sintético que carecía de histidina con 0,5% de etanol durante una noche y se pusieron en placa en medio completo sintético con 0,5% de etanol y 0,1% de 5FOA para el marcador URA3. La retirada del marcador se confirmó por PCR de colonias usando los cebadores oBP1341 (SEQ ID NO:5) y oBP1345 (SEQ ID NO:8).

Transformación de plásmido de ruta

La cepa PNY2145 GPD1A::CO GPD1 fue transformada después con el plásmido pLMH11-JM44 (SEQ ID NO:240) usando el kit Frozen-EZ Yeast Transformation II^TM (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se puso en placa en medio completo sintético sin uracilo con 0,5% de etanol. Las cepas resultantes se designaron como M, M3 (F73A), y M8 (F73G/F129G).

Creación de cepas EC1, E3 y E8 de GPD1 de levadura optimizadas por codones de E. coli a partir de la integración de PNY2145 de codón de GpD1 de levadura optimizada para ^{E. co li}

A fin de ensayar los mutantes de GPD1 en la cepa de Saccharomyces cerevisiae huésped, se intercambió la GPD1 nativa con una versión optimizada por codones de ^{E. c o li} de GPD1 sintetizada por ^a Dⁿ 2.0 usando utilización de codones de ^{E. coli.}

Preparación de la caja de integración

La caja de intercambio de genes se preparó clonando 2 fragmentos (corriente arriba de la región de homología corriente arriba de GPD1 y fragmento de GPD1 de levadura optimizada por codones) en el vector pBP3518 (SEQ ID NO: 9) que contenía el gen marcador de URA3 junto con el promotor y el terminador, y la región de homología corriente abajo de GPD clonada corriente abajo del gen marcador URA3.

El Fragmento 1 para la caja de integración se amplificó usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs; Ipswich, MA), los cebadores oBP1329 (SEQ ID NO: 1) y oBP1350(SEQ ID NO: 241) y ADN genómico de PNY2145 como plantilla preparado usando el kit YeaStar TM Genomic DNA (Zymo Research). El Fragmento 2 se amplificó usando los cebadores oBP1351 (SEQ ID NO: 242) y oBP1352 (SEQ iD No : 243) y gen de GPD1 optimizado por codones de ^{E. c o li} y levadura y variantes sintéticas E3 y E8 como plantillas. El cebador oBP1350 (SEQ ID NO: 241) tiene una cola 5' con homología a la región 5' del Fragmento 2 (GPD1 sintética optimizada por codones), y el cebador oBP1351 (SEQ ID NO: 242) tiene una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento 1 (región corriente arriba de GPD). Los dos fragmentos se combinaron usando PCR de solapación usando el cebador oBP1329 (SEQ ID NO:1) y oBP1352 (SEQ ID NO:243). Este fragmento combinado se clonó en sitios Ascl y Pmel en el vector pBP3518 (SEQ ID NO:9) y el vector resultante, denominado pBP3518GPD1_EcOpt (SEQ ID NO:249) fue transformado en células competentes AgilentXL1Blue (Agilent Technologies, USA).

Transformación de la caja de integración en PNY2145

Se aisló el plásmido pBP3518GPD_1EcOpt (SEQ ID NO:249) usando el kit QIAprep Spin miniprep (Qiagen, GmbH) y se restringió usando las enzimas de restricción Sacl y Pacl (New England Biolabs Inc. Ipswich, Ma ). Los fragmentos de 4,2 kb resultantes (que contenían la caja de integración entera, la región de homología corriente arriba de GPD, GPD1 optimizada por codones de ^{E. coli,} el gen marcador URA3 y la región de GPD corriente abajo) fueron transformados en PNY2145 usando el kit Frozen EZ Yeast Transformation II (Zymo Research). La mezcla de transformación se puso en placa en medio completo sintético que carecía de uracilo con 0,5% de etanol a 30°C durante 48 horas. Para la confirmación del sitio de integración, los transformantes se cribaron usando dos juegos de cebadores, oBP1342 (SEQ ID NO:6) y oBP1352 (SEQ ID NO:243) y oBP1357 (SEQ ID NO:248) y oBP1345 (SEQ ID NO:8) para la confirmación de la integración en ambos extremos. Los cebadores oBP1342 (SEQ ID NO:6) y oBP1345 (SEQ ID NO:8) se diseñaron a partir de una región fuera de la caja para confirmar la integración en el sitio correcto.

Retirada del marcador URA3

Los transformantes confirmados (cepa PNY2145 GPD1A::EC CO GPD1 URA3) fueron transformados con pRS423::P^GAL1-cre usando el kit Frozen EZ Yeast Transformation II^TM (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se pusieron en placa en medio completo sintético que carecía de histidina y uracilo suplementado con 0,5% de etanol, y se incubaron a 30°C durante 48 horas. Los transformantes se cultivaron en medio completo sintético que carecía de histidina con 0,5% de etanol durante una noche y se pusieron en placa en medio completo sintético con 0,5% de etanol y 0,1% de 5FOA para el marcador URA3. La retirada del marcador se confirmó por PCR de colonias usando los cebadores oBP1357 (SEQ ID NO:248) y oBP1345 (SEQ ID NO:⁸ ).

Transformación del plásmido de ruta

La cepa PNY2145 GPD1A::EC CO GPD1 fue transformada después con el plásmido pLMH11-JM44 (SEQ ID NO:240) usando el kit Frozen EZ Yeast Transformation IITM (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se puso en placa en medio completo sintético sin uracilo con 0,5% de etanol. Las cepas resultantes se designaron como EC1, E3 (F73A), y E⁸ (F73G/F129G).

Creación de cepas EC1, N, N3 y N⁸ de GPD1 de levadura nativa a partir de la integración de PNY2145 de variantes de CPD1 de levadura nativa

A fin de ensayar los mutantes de GPD1 de levadura nativa en la cepa de Saccharomyces cerevisiae huésped, se intercambió la GPD1 optimizada por codones de levadura con una versión nativa de levadura de GPD1 en la cepa PNY2145 GPD1A::EC CO GPD1.

Preparación de la caja de integración

La caja de intercambio de genes se preparó clonando 2 fragmentos (región de homología corriente arriba de GPD1 corriente arriba y fragmento de GPD1 nativo de levadura) en el vector pBP3518 (SEQ ID NO:9) que contenía el gen marcador URA3 junto con el promotor y el terminador y la región de homología corriente abajo de GPD clonada corriente abajo del gen marcador URA3.

El Fragmento 1 para la caja de integración fue amplificado usando Phusion High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc.; Ipswich, MA), los cebadores oBP1329 (SEQ ID NO:1) y oBP1353 (SEQ ID NO:244) y ADN genómico de PNY2145 como plantilla preparado usando el kit YeaStar TM Genomic DNA (Zymo Research). El Fragmento 2 fue amplificado usando los cebadores oBP1354 (SEQ ID NO:245) y oBP1355 (SeQ ID NO:246) y ADN genómico de PNY2145 y variantes apropiadas como plantillas. El cebador oBP1353 (SEQ ID NO:244) tiene una cola 5' con homología a la región 5' del Fragmento 2 (GPD1 nativa de levadura) y el cebador oBP1354 (SEQ ID NO:245) tiene una cola 5' con homología al extremo 3' del Fragmento 1 (región corriente arriba de GPD). Los dos fragmentos se combinaron usando PCR de solapamiento usando el cebador oBP1329 (SEQ ID NO:1) y oBP1355 (SEQ ID NO: 246). Este fragmento combinado se clonó en los sitios Ascl y Pmel en el vector pBP3518 (SEQ ID NO:9) y el vector resultante, denominado pBP3518GPD1_Nativo (SEQ ID NO:250) fue transformado en células competentes Agilent XLIBlue (Agilent Technologies, USA).

Transformación de la caja de integración en PNY2145

El plásmido pBP3518GPD1_Nativo (SEQ ID NO:250) fue aislado usando el kit QIAprep Spin miniprep (Qiagen, GmbH) y restringido usando las enzimas de restricción Sacl y Pacl (New England Biolabs Inc Ipswich, MA). Los fragmentos de 4,2 kb resultantes (que contenían la caja de integración entera, la región de homología corriente arriba de GPD1, GPD1 nativa de levadura, el gen marcador URA3 y la región de GPD corriente abajo) fueron transformados en PNY2145 GPD1A::CO GPD1 usando Frozen EZ Yeast Transformation II (Zymo Research). La mezcla de transformación se puso en placa en medio completo sintético que carecía de uracilo con 0,5% de etanol a 30°C durante 48 horas. Para la confirmación del sitio de integración, los transformantes se cribaron usando dos juegos de cebadores, oBP1342 (SEQ ID NO:⁶ ) y oBP1355 (SEQ ID NO:246) y oBP1356 (SEQ ID NO:247) y oBP1345 (SEQ ID NO:⁸ ) para la confirmación de la integración en ambos extremos.

Retirada del marcador URA3

Los transformantes confirmados (cepa PNY2145 CO GPD1A::GPD Nativa URA3) fueron transformados con pRS423::PG A Li-cre usando un kit Frozen EZ Yeast Transformation IITM (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se pusieron en placa en medio completo sintético que carecía de histidina y uracilo suplementado con 0,5% de etanol, y se incubaron a 30°C durante 48 horas. Los transformantes se cultivaron en medio completo sintético que carecía de histidina con 0,5% de etanol durante una noche y se pusieron en placa en medio completo sintético con 0,5% de etanol y 0,1% de 5FOA para el marcador URA3. La retirada del marcador se confirmó por PCR de colonias usando los cebadores oBP1356 (SEQ ID NO:247) y oBP1345 (SEQ ID NO:⁸ ).

Transformación de los plásmido de ruta

La cepa PNY2145 CO GPD1A::GPD Nativa GPD1 fue transformada después con el plásmido pLMH11-JM44 (SEQ ID NO:240) usando el kit Frozen EZ Yeast Transformation IITM (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) y se puso en placa en medio completo sintético sin uracilo con 0,5% de etanol. Las cepas resultantes se designaron como N, N3 (F73A), y N⁸ (F73G/F129G).

Integración de variantes de GPD1

Se prepararon cajas de integración para variantes de GPD1 de la misma manera que la descrita anteriormente para intercambio de GPD¹ optimizada por codones, excepto que la plantilla usada para amplificar el fragmento ² para cada variante de GPD1 fue la secuencia de codificación correspondiente con la mutación enumerada en la Tabla 5.

T a b l a 5 : V a r ia n t e s d e G P D c o n la s m u t a c io n e s c o r r e s p o n d ie n t e s

In t e g r a c ió n d e G P D s h e t e r ó lo g a s

P u e d e n p r e p a r a r s e c a ja s d e in t e g r a c ió n p a r a G P D s h e t e r ó lo g a s d e la m is m a m a n e r a q u e la d e s c r it a a n t e r io r m e n t e p a r a G P D 1 o p t im iz a d a p o r c o d o n e s , e x c e p t o q u e u n e x p e r t o e n la t é c n ic a r e d is e ñ a r ía lo s c e b a d o r e s e n b a s e a la G P D 1 h e t e r ó lo g a a s e r in s e r t a d a p a r a o b t e n e r u n e n s a m b l a je a p r o p ia d o d e la c a ja d e in t e g r a c ió n .

E je m p lo 1 : E n z i m a s v a r ia n t e s d e G P D 1

E n e s t e e je m p lo , s e c r e a r o n v e r s io n e s v a r ia n t e s d e G P D 1 d e S a cch a ro m yce s y s e e n s a y a r o n p o r e x p r e s ió n e n E. co li s e g u id o d e e n s a y o s e n z im á t ic o s e n e l e x t r a c t o c e l u l a r b ru to .

M u t a g é n e s is d e G P D 1

L a m u t a g é n e s is d e G P D 1 d e l e v a d u r a f u e d ir ig id a p o r e l d e s e o d e a u m e n t a r la K m p a r a N A D H s in t e n e r u n im p a c t o s o b r e o tro s p a r á m e t r o s c in é t ic o s d e la e n z im a . L a e s t r a t e g ia p a r a la m u t a g é n e s is s e b a s ó e n la s e s t r u c t u r a s c r is t a l in a s d e a lt a r e s o lu c ió n d e la G P D 1 h u m a n a ( O u e t a l, 2005 , J . M o l. B io l . 357 : 858 - 869 ) , q u e p e r m it ie r o n la d e t e r m in a c ió n d e lo s a m in o á c id o s d e n t r o d e la d is t a n c ia d e c o n t a c t o d e N A D e n e l s it io d e u n ió n d e l c o f a c t o r . A n a l iz a n d o lo s r e s id u o s d e a m in o á c id o s y e l t ip o d e c o n t a c t o h e c h o , f u e p o s ib le l im it a r e l n ú m e r o d e c a m b io s d e a m in o á c id o s p a r a d a r c o m o r e s u lt a d o u n a u m e n t o e n e l v a lo r d e K m p a r a N A D h . L a T a b l a 6 m u e s t r a lo s r e s u lt a d o s d e e s t e a n á l is is , d o n d e s e h a n e n u m e r a d o lo s r e s id u o s d e a m in o á c id o s d e n t r o d e 5 A n g s t r o m s d e l N A D u n id o , y s e in te rp re t ó e l p a p e l e n la u n ió n d e l N A D . D e b id o a s u p a p e l e n la e s t a b i l iz a c ió n p o r a p ila m ie n t o p i d e l N A D u n id o , s e p u s o u n fo c o in ic ia l e n la m u t a g é n e s is d e p o s ic io n e s h o m ó lo g a s a l p h e 41 y p h e 97 d e G P D 1 h u m a n a t r u n c a d a ( S E Q ID N O :84 ) ( p h e 73 y p h e 129 d e G P D 1 d e le v a d u r a ) .

T a b l a 6. R e s id u o s d e a m in o á c id o s d e n t r o d e 5 A n g s t r o m s ( A ) d e N A D u n id o e n la e s t r u c t u r a c r is t a l in a h u m a n a , y d ia n a s d e m u t a g é n e s is p o t e n c ia le s p a r a a u m e n t a r e l v a l o r d e K m p a r a N A D H .

C e p a s y m e d io s

S e o b t u v o E sch e rich ia c o li T O P 10 d e L ife T e c h n o l o g ie s C o r p . ( C a t . # C 404003 , G r a n d I s la n d , N Y ) . E l p lá s m id o d e e x p r e s ió n p B A D fu e d e s c r it o p r e v ia m e n t e ( p a t e n t e d e E E . U U . N ° 7.910.342 ) . S e o b t u v o e l g e n d e G P D 1 d e le v a d u r a s in t é t ic o , o p t im iz a d o p a r a e x p r e s ió n d e le v a d u r a , d e D N A 2.0 ( M e n lo P a r k , C A ) . S e c u lt iv a r o n la s c é l u l a s a 37 ° C e n c a ld o L B d e M ille r ( C a t . # 46 - 050 - C M , M e d ia t e c h , In c ., H e r n d o n , V A ) c o n 0 , 02 % d e L - ( ) - a r a b i n o s a ( C a t . # A 3256 , S i g m a - A l d r i c h , In c ., S t . L o u is , M O ) y 100 p g /m l d e a m p ic i l in a ( C a t . # A l 066 , S ig m a - A l d r ic h , In c ., S t . L o u is , M O ) . L a s c é l u l a s s e p u s ie r o n e n p l a c a s d e a g a r L B c o n 100 p g /m l d e a m p ic i l in a ( C a t . # L 1004 , T e k n o v a , H o ll is t e r , C A ) .

C o n s t r u c c ió n d e v a r ia n t e s d e G P D 1

S e in t r o d u je r o n m u t a c io n e s e n 4 p o s ic io n e s d e a m in o á c id o s d if e r e n t e s , s e g ú n la T a b l a 7. L a m u t a g é n e s is s e r e a liz ó u s a n d o u n k it Q u ik C h a n g e L ig h t n in g ( C a t . # 210519 , A g i le n t T e c h n o l o g ie s , L a J o lla , C A ) , s e g ú n la s in s t r u c c io n e s d e l f a b r ic a n t e . L o s c e b a d o r e s d e la m u t a g é n e s is s e o b t u v ie r o n d e S i g m a - A l d r i c h C o . L L C , S t . L o u is M O . L a s r e a c c io n e s f u e r o n t e r m o c ic la d a s e n u n G e n A m p 9700 ( P e r k in E lm e r A p p lie d B io s y s t e m s , N o r w a lk , C T ) . L a s E sch e rich ia c o li T O P 10 fu e r o n t r a n s f o r m a d a s c o n 1 p l d e l p r o d u c t o d e r e a c c ió n d e Q u ik C h a n g e s e g ú n la s in s t r u c c io n e s d e l f a b r ic a n t e , y lo s t r a n s f o r m a n t e s s e s e le c c io n a r o n e n p la c a s d e a g a r L B c o n 100 p g /m l d e a m p ic i l in a . S e o b t u v ie r o n s e c u e n c i a s d e A D N p a r a a is la m ie n t o s m ú lt ip le s d e c a d a t r a n s f o r m a c ió n a f in d e id e n t if ic a r a q u e l lo s c o n la s m u t a c io n e s d e s e a d a s . S e c o n s t r u y e r o n m u t a n t e s d o b le s d e la m is m a m a n e r a , e x c e p t o q u e la p la n t il la e n la r e a c c ió n d e m u t a g é n e s is y a c o n t e n ía u n a d e la s m u t a c io n e s , y s e u s a r o n lo s c e b a d o r e s a p r o p ia d o s p a r a in t r o d u c ir la s e g u n d a m u t a c ió n .

T a b l a 7 : V a r ia n t e s d e G P D 1 y c e b a d o r e s u s a d o s e n s u c o n s t r u c c ió n

Ensayo de GPD1

Se prepararon extractos celulares de las fracciones solubles a partir de 5 ml de cultivo por batido con bolas 2 x 10 segundos en MOPS 100 mM, pH ⁶ ,⁸ , MgCh 10 mM, EDTA 1 mM en una Mini-Bead-Beater (Cat. #3110BX, Biospec Products, Bartlesville, OK). La concentración de proteínas en el extracto celular se determinó por el ensayo de BCA de Pierce (Cat. #23224 y 23228, Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL).

Los ensayos se realizaron en un volumen de 100 pl que contenía MOPS 100 mM, pH ⁶ ,⁸ , EDTA 1 mM, glucosasfosfato 1 mM, 3 mU/ml de flucosa-⁶ -fosfato deshidrogenasa (Cat. #G8404, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), fosfato de dihidroxiacetona 1 mM (Cat. #D7137, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), concentraciones variadas de NADH, y concentraciones variadas de extracto celular. Las reacciones fueron terminadas por dilución de 4 veces en ácido fórmico al 0,1% (Suprapur, #1167-1, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) en agua (Omnisolv, #WX0001-1, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ). La producción de glicerol-3-fosfato se midió por LC/MS.

Método LC/MS

Se inyectaron 2 pl de cada muestra en un Waters Acuity UPLC/SQD System, usando una columna HSS T3 (2,1 x 100 mm, 1,8 pm, #186003539, Waters, Milford, MA) a una temperatura de 30°C. Las fases móviles de UPLC consistieron en 0,1% de ácido fórmico en agua (Móvil A) y 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo (Omnisolv, #AX0156-1, EMD Chemicals, Gibbston, NJ) (Móvil B) con un caudal constante de 0,3 ml/min. El gradiente consistió en un periodo de 1 minuto inicial a 99% de A, seguido de un gradiente lineal de 0,5 minutos que acababa en 75% de B, y después un gradiente lineal de 0,5 minutos de vuelta a 99% de A, antes de inyectar la siguiente muestra. El análisis MS se realizó p o r io n iz a c ió n n e g a t iv a p o r e le c t r o p u lv e r iz a c ió n a u n v o lt a je d e c o n o d e 30 V y m /z = 171. E l t ie m p o d e r e t e n c ió n y la s in t e n s id a d e s d e lo s p ic o s s e d e t e r m in a r o n u s a n d o e l p r o g r a m a in f o r m á t ic o M a s s L y n x 4.1 ( W a t e r s , M ilfo rd , M A ) . S e a n a l iz ó u n p a t ró n e x t e r n o ( g l ic e r o l -3 - f o s f a t o , C a t . # G 7886 , S ig m a - A l d r ic h , In c ., S t . L o u is , M O ) d e la m is m a m a n e r a q u e la u s a d a p a r a la c u a n t if ic a c ió n .

A n á l is is d e v a r ia n t e s d e G P D 1.

L a a c t iv id a d d e la s v a r ia n t e s d e G P D 1 s e c r ib ó in ic ia lm e n t e m id ie n d o la v e lo c id a d d e f o r m a c ió n in ic ia l d e g l ic e r o l 3 ^{fo s f a t o ( G 3 P ) a d o s c o n c e n t r a c io n e s d e N A D H ( 30 y 300} j M). ^{E s t o s ir v e c o m o m e d id a q u e in d ic a la} K^{m d e la s v a r ia n t e s p a r a N A D H : p a r a u n a} K^{m m u c h o m e n o r q u e 30} j M, ^{la r e la c ió n s e r í a 1 , 0 , p a r a u n a} K^{m m u c h o m á s a lt a q u e 300} j M ^la r e la c ió n s e r í a 10. L o s r e s u lt a d o s p a r a lo s m u t a n t e s s e n c i l lo s in d iv id u a le s s e m u e s t r a n e n la T a b l a 8.

T a b l a 8 : A c t iv id a d d e v a r ia n t e s d e G P D 1 m e d id a p o r v e lo c id a d d e f o r m a c ió n d e G 3 P in ic ia l

P u e d e in t e r p r e t a r s e q u e e s t o s d a t o s in d ic a n q u e c u a lq u ie r v a r ia n t e c o n u n a r e la c ió n m a y o r q u e 1 , 6 ( v a lo r m e d io d e t r e s m e d id a s d e c o n t r o l m á s d e s v ia c ió n e s t á n d a r ) t ie n e u n a K m p a r a N A D H m á s a lt a q u e la G P D 1 d e t ip o s a l v a je . S e c r e a r o n m u t a n t e s d o b le s d e lo s m u t a n t e s s e n c i l lo s in d iv id u a le s d e K m a lt a c o m o s e d e s c r ib ió a n t e r io r m e n t e . E l a n á l is is a e s c a l a c o m p le t a d e lo s v a l o r e s d e K m p a r a N A D H p a r a u n a s e le c c ió n d e lo s m u t a n t e s d o b le s y s e n c i l lo s s e m u e s t r a e n la T a b l a 9.

T a b l a 9 : C o n s t a n t e s d e M ic h a e l is ( K m ) p a r a N A D H d e v a r ia n t e s d e G P D 1

E s t o s d a t o s in d ic a n q u e la s m u t a c io n e s d e a m in o á c id o s c o r r e s p o n d ie n t e s a lo s r e s id u o s 44 , 45 , 73 y 129 ( s o lo s o e n c o m b in a c ió n ) d e la G P D d e S . ce re v is ia e p u e d e a u m e n t a r e l K ^m d e la G P D p a r a N A D H . C o m o s e m u e s t r a e n la F ig u r a 2 , lo s a m in o á c id o s 73 y 129 d e la G P D d e S . ce re v is ia e c o r r e s p o n d e n a lo s a m in o á c id o s 41 y 97 d e la G P D h u m a n a , r e s p e c t iv a m e n t e .

E je m p lo 2 : E n z i m a s G P D h e t e r ó lo g a s c o n K ^m m á s a lto p a r a N A D H q u e la G P D d e la G P D d e S . ce re v is ia e

E n e s t e e je m p lo , s e id e n t if ic a r o n e n z im a s g l ic e r o - 3 - f o s f a t o d e s h id r o g e n a s a s a lt e r n a t iv a s c o n c o n s t a n t e s d e M ic h a e l is ( K M ) p a ra N A D h q u e s o n m á s a lt a s q u e la G P D 1 d e le v a d u r a .

U n a e s t r a t e g ia p a r a id e n t if ic a r e n z im a s c o n K m p a r a N A D H e s u s a r v a lo r e s p u b l ic a d o s e n la b ib l io g r a f ía p a r a la s e n z im a s q u e h a n s id o id e n t if ic a d a s p r e v ia m e n t e . L a T a b l a 10 e n u m e r a p u b l ic a c io n e s d o n d e la K m p a r a N A D H e s m á s a lt a q u e la r e p o r t a d a p a r a la G P D 1 d e S acch a ro m yces .

E s t o s r e s u lt a d o s c o n f ir m a n q u e c ie r t a s G P D s d e o tro s o r g a n is m o s t ie n e n u n a K m p a r a N A D H m á s a lt a , y t a m b ié n a p o y a n a d e m á s q u e la K m p a r a N A D H p u e d e s e r e le v a d a d is e ñ a n d o e n z im a s G P D , p o r e je m p lo , p o r m o d if ic a c ió n d e a m in o á c id o s im p l ic a d o s e n e l p a r d e f e n i la la n in a s d e a p ila m ie n t o pi.

E je m p lo 3 : P r o d u c c ió n d e is o b u t a n o l y g l ic e r o l p a r a c e p a s d e le v a d u r a q u e c o m p r e n d e n v a r ia n t e s d e la e n z im a G P D 1.

E n e s t e e je m p lo , la s c e p a s d e le v a d u r a c o n e n z im a s G P D 1 v a r ia n t e s p r o d u c id a s y d e s c r it a s a n t e r io r m e n t e s e e n s a y a r o n e n c u a n t o a la p r o d u c c ió n d e is o b u t a n o l y g l ic e r o l.

L a s c é l u l a s s e c u lt iv a r o n e n p a r c h e s e n m e d io c o m p le t o s in t é t ic o [ I X b a s e d e n it r ó g e n o d e l e v a d u r a s in a m in o á c id o s ( D if c o ) , I X a m in o á c id o s e l im in a d o s s in u r a c i lo ( C l o n e - T e c h ) q u e c o n t e n ía 2 % d e a g a r ( D if c o ) , 1 % d e g lu c o s a ( S ig m a ) , 0 , 2 % d e e t a n o l] y s e in c u b a r o n d u r a n t e 72 h o r a s e n in c u b a d o r a 30 ° C ( N e w B r u n s w ic k ) . S e a d a p t a r o n la s c é l u l a s p o r c u lt iv o e n p la c a r e p e t it iv o c a d a t r e s d ía s e n e l m is m o m e d io d u r a n t e 30 d ía s .

L o s p a r c h e s d e la s c é lu la s a d a p t a d a s s e in o c u la r o n e n 10 m l d e m e d io l íq u id o c o m p le t o s in t é t ic o [ IX b a s e d e n it r ó g e n o d e l e v a d u r a s in a m in o á c id o s ( D if c o ) , I X a m in o á c id o s e l im in a d o s s in u r a c i lo ( C l o n e - T e c h ) q u e c o n t e n ía 2 % d e a g a r ( D if c o ) , 1 % d e g lu c o s a ( S ig m a ) , 0 , 2 % d e e t a n o l] c o m o c u lt iv o s p r im a r io s e n m a t r a c e s d e 125 m l ( B D ) y s e in c u b a r o n a 30 ° C d u r a n t e 24 h o r a s e n u n a g it a d o r in c u b a d o r ( N e w B r u n s w ic k ) a 250 rp m . S e in o c u la r o n c u lt iv o s s e c u n d a r i o s a p a r t ir d e lo s c u lt iv o s p r im a r io s e n e l m is m o m e d io c o n u n a O D in ic ia l d e 0 ,5 y s e d e ja r o n c r e c e r d u r a n t e o t r a s 24 h o r a s . D e s p u é s d e 24 h o r a s s e in o c u la r o n c u lt iv o s t e r c ia r io s e n e l m is m o m e d io a p a r t ir d e lo s c u lt iv o s s e c u n d a r i o s c o n u n a O D in ic ia l d e 0 ,5 y s e d e ja r o n c r e c e r d u r a n t e o t r a s 24 h o r a s . D e s p u é s e s t a s c é l u l a s s e u s a r o n p a r a e s t u d io s d e e v a lu a c ió n d e v a r ia n t e s d e G P D .

L a s c é l u l a s s e r e c o g ie r o n p o r c e n t r if u g a c ió n a 3.600 rp m d u r a n t e 5 m in u t o s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e e n u n a c e n t r íf u g a ( E p p e n d o r f ) y s e s u s p e n d ie r o n e n m e d io d e p r o d u c c ió n ( I X b a s e d e n it r ó g e n o d e le v a d u r a s in a m in o á c id o s ( D if c o ) , IX a m in o á c id o s e l im in a d o s s in u r a c i lo ( C l o n e - T e c h ) , 35 g /l d e g lu c o s a ( S ig m a ) , 2 g /l d e e t a n o l, M E S 100 m M ( S ig m a ) , IX p e p t o n a ( D if c o ) , I X e x t r a c t o d e l e v a d u r a ( D if c o ) , H C L 1 M ( S i g m a ) a p H 5 , 2 ) y u n a O D in ic ia l d e 2 e n 15 m l d e t u b o s f a lc o n . D e s p u é s s e in c u b a r o n lo s c u lt iv o s a 30 ° C e n u n a g it a d o r in c u b a d o r ( N e w B r u n x w ic k ) a 225 rp m d u r a n t e 20 h o r a s . L a s m u e s t r a s s e r e c o g ie r o n e n 20 h o r a s y s e a n a l iz a r o n p o r H P L C ( A g ile n t L if e S c ie n c e s ) ( F ig u r a 3 ).

P r e p a r a c ió n d e m u e s t r a s

C o n d ic ió n d e l e n s a y o

S e r e a l iz a r o n e n s a y o s d e g l ic e r o l - 3 - f o s f a t o ( G P D ) u s a n d o u n e s p e c t r o f o t ó m e t r o C a r y 100 U V - V i s e n u n v o lu m e n d e 1 m l q u e c o n t e n ía M O P S 100 m M ( S ig m a ) p H 6 ,8 , E D T A 1 m M , g lu c o s a - 6 -f o s f a t o 1 m M , 3 m U / p l d e g lu c o s a - 6 -f o s f a t o d e s h id r o g e n a s a ( C a t . # G 8404 , S ig m a - A l d r ic h , In c . S t . L o u is , M O ) , fo s fa t o d e d ih id r o x ia c e t o n a 1 m M ( C a t . # D 51269 , S i g m a - A l d r i c h , In c . S t . L o u is , M O ) , N A D H 0 , 3 m M , y c o n c e n t r a c io n e s v a r i a d a s d e e x t r a c t o c e lu la r . L a v e lo c id a d d e la r e a c c ió n s e c a lc u ló t o m a n d o la p e n d ie n t e d e l p r im e r 1 m in p a r a la d is m in u c ió n e n la c o n c e n t r a c ió n d e N A D H a 340 n m . E l c o e f ic ie n t e d e e x t r a c c ió n d e l N A D H s e t o m ó c o m o 6 , 22 m M '1 c i r r 1. P a r a la s v a r ia n t e s N 8 _ 1 , E 8 _ 1 y M 8 _ 1 ( e s d e c ir , a q u e l l a s c o n e l m u t a n t e d o b le F 73 G / F 129 G ) la c o n c e n t r a c ió n d e l N A D H a u m e n t ó h a s t a 0 ,45 m M . E s t e e s e l n iv e l d e n o s a t u r a c ió n d e l N A D H p a r a e s t a s v a r ia n t e s .

A n á l is is d e r e g r e s ió n d e lo s r e s u lt a d o s

L o s d a t o s u s a d o s e n e s t a s e c c ió n s e p r o p o r c io n a n e n la T a b l a 11 , e in c lu y e n m e d id a s d e lo s p r o d u c t o s m e t a b ó l ic o s y la s m e d id a s in v itr o d e G P D c o m o s e d e s c r ib ió a n t e r io r m e n t e . P a r a r e p r e s e n t a r la s d if e r e n c ia s e n la a c t iv id a d d e G P D m e d id a q u e s u r g e d e la m e d id a e n c a n t id a d e s d e s u b s a t u r a c ió n d e N A D H , la a c t iv id a d to t a l a Vmax s e c a lc u ló r e s o lv ie n d o la e c u a c ió n d e M ic h a e l is - M e n t o n d e s u s t r a t o ú n ic o p a r a Vmax, u s a n d o G P D ( U /m g ) p a r a la t a s a y e l v a lo r d e KM d e t e r m in a d o e n la T a b l a 9.

c o m o r e s u lt a d o u n a d is m in u c ió n d e 2 5 % e n e l t ít u lo d e is o b u t a n o l. E s t e m o d e lo d e r e g r e s ió n d e m o s t r ó p o r lo t a n t o q u e d is m in u ir la a f in id a d d e la G P D p o r N A D H ( K m a u m e n t a d a ) , a u m e n t ó e l t ít u lo d e is o b u t a n o l e n la s m u e s t r a s m o s t r a d a s a q u í.

E l r e n d im ie n t o d e is o b u t a n o l ( g r a m o s d e is o b u t a n o l/ g r a m o s d e g l u c o s a c o n s u m id a ) fu e m o d e r a d o d e m a n e r a s im i la r u s a n d o lo s s ig u ie n t e s p a r á m e t r o s d e la T a b l a 12 : g l u c o s a c o n s u m id a , e t a n o l, g l ic e r o l, is o b u t a n o l, K m d e G P D y Vmax d e G P D . L a e l im in a c ió n d e lo s p a r á m e t r o s m e n o s s ig n if ic a t iv o s d io u n m o d e lo d e r e g r e s ió n u s a n d o 2 p a r á m e t r o s , K m d e G P D y Vmax d e G P D ( V é a s e la F ig u r a 6 y la T a b l a 13 ) . E s t e m o d e lo d e r e g r e s ió n t u v o u n v a lo r R - S q d e 93 , 9 % . E s t e m o d e lo d e r e g r e s ió n p r e d ijo e l r e n d im ie n t o c o n e l v a lo r R -Sq(pred) d e 76 , 3 % , y n o t a b le m e n t e e s d e p e n d ie n t e ú n ic a m e n t e d e l n iv e l d e a c t iv id a d y la K m d e la e n z im a G P D . D e m a n e r a s im i la r a l m o d e lo d e r e g r e s ió n p a r a e l t ít u lo d e is o b u t a n o l, la Vmax d e G P D t ie n e u n a c o n t r ib u c ió n n e g a t iv a a l r e n d im ie n t o . E n e s t e m o d e lo d e r e g r e s ió n , a u m e n t a r la K m d e G P D d e 11 |j M (t ip o s a l v a j e ) h a s t a 550 j M , a l n iv e l d e a c t iv id a d d e G P D m á s b a jo o b s e r v a d o d e 0 , 0015 U /m g , d io c o m o r e s u lt a d o u n a m e jo r a d e l r e n d im ie n t o d e 28 % . E n e l n iv e l d e a c t iv id a d d e G P D m á s a lto o b s e r v a d o a q u í ( 0 , 019 U /m g ) la m e jo r a d e l r e n d im ie n t o f u e 78 % .

T a b l a 13 : M o d e lo d e r e g r e s ió n p a r a e l r e n d im ie n t o (g /g ) .

E je m p lo 4 : P r o f é t ic o

E n e s t e e je m p lo , lo s in t e g r a n t e s d e la le v a d u r a G P D 1 h e t e r ó lo g o s d e s c r it o s a n t e r io r m e n t e s e e n s a y a n e n c u a n t o a la p r o d u c c ió n d e is o b u t a n o l y g l ic e r o l.

M e d io s d e c u lt iv o y p r o c e d im ie n t o

S e u s a n d o s t ip o s d e m e d io s d u r a n t e e l p r o c e d im ie n t o d e c u lt iv o d e la s c e p a s d e le v a d u r a : u n m e d io d e p r e c u lt iv o a e r ó b ic o y m e d io d e c u lt iv o a n a e r ó b ic o . T o d o s lo s p r o d u c t o s q u ím ic o s s e o b t ie n e n d e S i g m a a m e n o s q u e s e in d iq u e o tra c o s a ( S t . L o u is , M O ) .

M e d io d e p r e c u lt iv o a e r ó b ic o ( S E - U r a - H i s ) : 6 , 7 g / l d e b a s e d e n it r ó g e n o d e le v a d u r a s in a m in o á c id o s ( D if c o , 291940 , S p a r k s , M D ) , 1, 4 g / l d e s u p le m e n t o d e m e d io d e e l im in a c ió n s in t é t ic o d e le v a d u r a s in h is t id in a , le u c in a , t r ip t ó fa n o y u r a c i lo , 0 , 2 % d e e t a n o l, 0 , 2 % d e g lu c o s a , 0 , 0 1 % p /v d e le u c in a y 0 , 002 % p / v d e t r ip t ó fa n o .

M e d io d e c u lt iv o a n a e r ó b ic o ( S E G - U r a - H i s ) : M E S 50 m M ( p H 5 , 5 , 6 , 7 g / l d e b a s e d e n it r ó g e n o d e l e v a d u r a s in a m in o á c id o s ( D if c o , 291940 , S p a r k s , M D ) , 1, 4 g /l d e s u p le m e n t o d e m e d io d e e lim in a c ió n s in t é t ic o d e le v a d u r a s in h is t id in a , le u c in a , t r ip t ó fa n o y u r a c i lo , 0 , 1 % d e e t a n o l, 3 % d e g lu c o s a , 0 , 0 1 % d e le u c in a , 0 , 002 % d e t r ip t ó fa n o , 30 m g /l d e á c id o n ic o t ín ic o , 30 m g /l d e t ia m in a y 10 m g /l d e e r g o s t e r o l c o n s t it u id o e n d is o lu c ió n d e T w e e n /e t a n o l 50 / 50 v /v .

L a s c é l u l a s c u lt iv a d a s e n p a r c h e s s e in o c u la n e n 25 m l d e m e d io S E G - U r a , H i s c o n 0 , 2 % d e g lu c o s a y 0 , 2 % d e e t a n o l, y s e c u lt iv a n e n c o n d ic io n e s p r o g r e s iv a m e n t e l im it a d a s e n o x íg e n o c o n la t a p a c e r r a d a d u r a n t e a p r o x im a d a m e n t e 48 h o r a s a 30 ° C c o n a g it a c ió n , h a s t a q u e s e a l c a n z a u n v a l o r d e O D 600 d ia n a d e a p r o x im a d a m e n t e 1, 5 a 2. L o s v a lo r e s O D 600 s e r e g is t r a n . L a s c é l u l a s s e a g r u p a n e n g r á n u lo s p o r m e d io d e c e n t r if u g a c ió n y e l s o b r e n a d a n t e s e d e s c a r t a . L o s g r á n u lo s d e c é l u l a s s e t r a n s f ie r e n a u n a C o y A n a e r o b ic B a g ( G r a s s L a k e , M I) d o n d e lo s g r á n u lo s s e r e s u s p e n d e n e n 1, 0 m l d e m e d io d e c r e c im ie n t o a n a e r ó b ic o ( S E G - U r a - H i s ) . L o s g r á n u lo s d e c é l u l a s r e s u s p e n d id o s s e u s a n p a r a in o c u la r 30 m l d e m e d io S E G - U r a - H i s e n b o t e lla s d e s u e r o d e 50 m l ( W h e a t o n , 223748 , M illv i lle , N J ) h a s t a u n v a lo r d e O D 600 d ia n a in ic ia l d e 0 ,2. T o d o s lo s m e d io s a n a e r ó b ic o s , v i a l e s d e s u e r o , t a p o n e s y c ie r r e s s e d e ja n d e s g a s if i c a r e n la b o ls a a n a e r ó b ic a d u r a n t e a l m e n o s 24 h o r a s a n t e s d e la in o c u la c ió n . L a s b o t e lla s d e s u e r o s e t a p o n a n , s e c ie r r a n y s e t r a n s f ie r e n f u e r a d e la b o ls a a n a e r ó b ic a y s e c u lt iv a n a 30 ° C c o n a g it a c ió n a 240 rp m . L o s c u lt iv o s a n a e r ó b ic o s s e c u lt iv a n d u r a n t e 24 o 72 h o r a s c o n u n v a l o r d e O D 600 d ia n a d e a l m e n o s 1, 2. L a s e t a p a s d e c u lt iv o a n a e r ó b ic o a d ic io n a l e s u s a r o n la s c é l u l a s d e la e t a p a d e c u lt iv o a n a e r ó b ic o a n t e r io r c o m o in o c u la n t e . S e e v a lu a r o n t r e s t r a n s f o r m a n t e s p a r a c a d a v a r ia n t e .

A n á l is is p o r H P L C d e c e p a s d e G P D 1 d e le v a d u r a v a r ia n t e s y h e t e r ó lo g a s

S e t o m a n m u e s t r a s p a r a a n á l is is p o r H P L C y p a r a o b t e n e r v a l o r e s d e O D 600 a l f in a l d e l p e r io d o d e c r e c im ie n t o a n a e r ó b ic o . E l a n á l is is p o r H P L C s e r e a l iz a u s a n d o u n a u n id a d d e s e p a r a c io n e s W a t e r s 2695 , d e t e c t o r d e m a t r iz d e d io d o s 2996 , y d e t e c t o r d e ín d ic e d e r e f r a c c ió n 24 14 ( W a t e r s , M ilfo rd , M A ) c o n u n a p r e c o lu m n a S h o d e x S u g a r S H - G y c o lu m n a d e s e p a r a c io n e s S h o d e x S u g a r S H 10 11 ( S h o d e x , J M S c ie n c e , G r a n d I s la n d , N Y ) . L o s c o m p u e s t o s s o n s e p a r a d o s p o r e lu c ió n is o c r á t ic a e n á c id o s u lf ú r ic o 0 ,01 N c o n u n c a u d a l d e 0 ,5 m l/m in . L o s c r o m a t o g r a m a s s e a n a l iz a n u s a n d o e l p r o g r a m a in f o r m á t ic o W a t e r s E m p o w e r P ro .

S e d e t e r m in a n lo s r e n d im ie n t o s m o la r e s p a r a g l ic e r o l, is o b u t a n o l y la r e la c ió n is o b u t a n o l/ g l ic e r o l. S e c a lc u la n la s

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. U n a e n z im a g l ic e r o l - 3 - f o s f a t o d e s h id r o g e n a s a ( G P D ) d is e ñ a d a q u e t ie n e a l m e n o s 9 0 % d e id e n t id a d a S E Q ID N O : 195 , e n d o n d e la e n z im a c o m p r e n d e a l m e n o s u n a s u s t it u c ió n e n u n r e s id u o q u e c o r r e s p o n d e a la p o s ic ió n 73 o 129 d e S E Q ID N O : 195.

2. L a e n z im a G P D d is e ñ a d a d e la r e iv in d ic a c ió n 1, e n d o n d e la e n z im a c o m p r e n d e u n a s u s t it u c ió n q u e c o r r e s p o n d e a la p o s ic ió n 73 d e S E Q ID N O : 195 y u n a s u s t it u c ió n q u e c o r r e s p o n d e a la p o s ic ió n 129 d e S E Q ID N O : 195.

3. L a e n z im a G P D d is e ñ a d a d e la r e iv in d ic a c ió n 1 o 2 , q u e t ie n e a l m e n o s 9 5 % d e id e n t id a d a S E Q ID N O : 195.

4. L a e n z im a G P D d is e ñ a d a d e u n a c u a lq u ie r a d e l a s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 3 , e n d o n d e la K m p a r a N A D H e s d e a p r o x im a d a m e n t e 0 ,05 m M a a p r o x im a d a m e n t e 1 m M .

5. U n m ic r o o r g a n is m o r e c o m b in a n t e q u e c o m p r e n d e la e n z im a G P D d is e ñ a d a d e u n a c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 - 4 , e n d o n d e e l m ic r o o r g a n is m o c o m p r e n d e u n a ru ta b io s in t é t ic a d e a lc o h o l q u e c o m p r e n d e a l m e n o s u n g e n q u e e s h e t e r ó lo g o a l m ic r o o r g a n is m o r e c o m b in a n t e ; e n d o n d e e l m ic r o o r g a n is m o c o m p r e n d e u n a d e le c ió n o d is r u p c ió n d e u n g e n e n d ó g e n o q u e c o d if ic a G P D ; e n d o n d e e l m ic r o o r g a n is m o t ie n e u n a p r o d u c c ió n d e a lc o h o l m e jo r a d a e n c o m p a r a c ió n c o n u n m ic r o o r g a n is m o q u e c a r e c e d e la e n z im a G P D d is e ñ a d a , y e n d o n d e el m ic r o o r g a n is m o e s S a cch a ro m yce s ce rev is iae .

6. U n m é t o d o p a r a la p r o d u c c ió n d e a lc o h o l u s a n d o la e n z im a g l ic e r o l - 3 - f o s f a t o d e s h id r o g e n a s a ( G P D ) d is e ñ a d a d e u n a c u a lq u ie r a d e la s r e iv in d ic a c io n e s 1 a 4 , o e l m ic r o o r g a n is m o r e c o m b in a n t e d e la r e iv in d ic a c ió n 5.