JP4309223B2

JP4309223B2 - 染色体上のｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされたＬ−トレオニン生成変異微生物及びこれを用いたＬ−トレオニンの製造方法

Info

Publication number: JP4309223B2
Application number: JP2003352416A
Authority: JP
Inventors: ヨウンホーンパーク; ジンホリー; ビョウンチョーンリー; デチョルキム; ジェヨンチョ
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: RU2005114011A; AU2003224490A1; WO2004033671A1; CN100378215C; RU2305132C2; ATE442459T1; DE60329153D1; US20040132145A1; KR20040033174A; KR100505797B1; MXPA03009345A; EP1408123B1; US20090093030A1; JP2004129666A; EP1408123A1; CN1500863A

Description

本発明は、Ｌ−トレオニン生産微生物及びこれを用いたＬ−トレオニンの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、Ｌ−トレオニン生産微生物の染色体上に存在するｆａｄＲ遺伝子を、ｃｒｅ遺伝子及びｌｏｘｐ部位のような部位特異的相同性組み換えシステムを用いてノックアウトさせ、Ｌ−トレオニンの生合成過程でａｃｅＢＡＫオペロンの発現が抑制されないようにすることにより、高収率でＬ−トレオニンを生成する変異微生物及びこれを用いたＬ−トレオニンの製造方法に関する。

Ｌ−トレオニンは、必須アミノ酸の一種であって、飼料及び食品添加剤として広く使用されており、医薬品を合成するための医薬原料としても使用されている。Ｌ−トレオニンは、発酵法で製造するが、大腸菌(Escherichia)、コリネ型細菌(coryneform bacteria)、セラチア属細菌(Seratia)、プロビデンシア(Providencia)属菌株の野生株から誘導された人工変異株を使用している。例えば、日本国特公昭５６−１００３７号公報には、エシェリキア(Escherichia)属に属し、ジアミノピメリン酸及びメチオニンを要求し、その生合成系がトレオニンのフィードバック抑制作用(feedback inhibition)を阻止する微生物を用いる方法が記述されている。日本国特開昭５８−２２４６８４号公報には、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びα−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸に対する耐性を有し、Ｌ−イソロイシン及びＬ−リジン栄養要求性微生物を用いる方法が記述されている。韓国特許公開公報第８７−８０２２号には、エシェリキア属に属し、ジアミノピメリン酸、メチオニン要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸耐性をもち、リファンピシン、リジン、メチオニン、アスパラギン酸及びホモセリンの少なくとも１種の物質に対する耐性を有し或いは低下したＬ−トレオニン分解能を有する微生物を用いた方法が記述されている。日本国特開平２−２１９５８２号公報には、プロビデンシア(Providencia)属に属し、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、Ｌ−エチオニン、チアイソロイシン(thiaisoleucine)、オキシチアミン(oxythiamine)及びスルファグアニジン(sulfaguanidine)耐性を有し、Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−イソロイシンリーキー(leaky)型要求性微生物を用いる方法が記述されている。

ところが、上述した公知の方法は、Ｌ−トレオニン生産性が高くないか、或いはジアミノピメリン酸要求性又はイソロイシン要求性のような高価の物質を添加しなければならないという欠点がある。すなわち、ジアミノピメリン酸要求性菌株を使用する場合、ジアミノピメリン酸を追加発酵させなければならないのでコスト負担要因が大きく、イソロイシン要求性菌株を使用する場合にも、イソロイシンを発酵培地に添加しなければならないが、この場合、イソロイシンが高価なので、コスト上昇要因となる。

かかる問題点を克服するために、本発明者は、イソロイシンリーキー型要求性菌株を使用して発酵培地内にイソロイシンを添加する必要がなく、リジン合成の中間媒体であるジアミノピメリン酸要求性菌株を使用しないながらも従来の菌株より発酵法によって高濃度のＬ−トレオニンを生成することが可能な菌株として、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性及びα−アミノ酪酸耐性を有し、Ｌ−トレオニンを生産することが可能な大腸菌に属する微生物を開発し、このような微生物及びこれを用いたＬ−トレオニンの製造方法に対し特許登録を受けたことがある（韓国特許公告第９２−８３６５号）

本発明者は、Ｌ−トレオニンの生産収率をさらに高めることが可能な菌株を開発するために鋭意研究を重ね、脂肪酸分解関連オペロン(fad operon)とグリオキシレートバイパスオペロン(aceBAK operon)の発現調節因子であるｆａｄＲ遺伝子を標的としてＬ−トレオニンの生産量の向上を図った。ｆａｄＲ蛋白質は、細胞内脂肪酸濃度が高い場合、ｆａｄオペロンとａｃｅＢＡＫオペロンの発現を抑制し、脂肪酸濃度が低い場合、脂肪酸生合成関連オペロンの発現を増加させるものと知られている(J. E. Cronan Jr, and D. Lapore, E. coli and Salmonella, vol 1, pp211-214)。ａｃｅＢＡＫオペロンは、クエン酸回路(TCA cycle)の中間体であるイソシトレートをグリオキシレートに転換させ、グリオキシレートをマレートに転換させ、マレートをオキサロアセテートに転換させる５段階反応によってピルベート(pyruvate)からオキサロアセテートを合成する。反面、クエン酸回路は、８段階反応によってピルベートからオキサロアセテートを合成し、この過程で中間体が二酸化炭素を含めて他の代謝中間体に転換される。従って、ａｃｅＢＡＫオペロンの発現が減少すると、グリオキシレート回路反応が抑制されるので、クエン酸回路を介して炭素源が他の代謝中間体に転換される比率が高くなり、同量の炭素源に対してトレオニンの生産収率は減少することになる。また、この過程でトレオニン生合成過程に効率的なａｃｅＢＡＫオペロンの発現も抑制する。従って、ａｃｅＢＡＫ発現を高めて高濃度のトレオニン生産菌株を開発するためには、ｆａｄＲ遺伝子は必須的にノックアウトさせなければならない。また、抗生剤マーカーが染色体上に組み込まれる場合、前記マーカーは別の遺伝子のノックアウトに再び使用することができないため、染色体から前記マーカー遺伝子を除去する必要がある。このため、本発明者は、ｆａｄＲ遺伝子をノックアウトさせるためにｃｒｅ／ｌｏｘｐ部位特異的組み換えシステムを適用した。

本発明者は、ノックアウト突然変異技術(Knockout Mutation Technology)を用いてＬ−トレオニン生成微生物の染色体上に存在するｆａｄＲ遺伝子を組み換えによってノックアウトさせることにより、高濃度のＬ−トレオニン生成菌株を開発し、実質的にこの菌株を発酵に利用して、著しく改善した収率でＬ−トレオニンを得ることができる。

従って、一つの観点として、本発明は、アミノ酸Ｌ−トレオニンを生成することが可能な微生物の染色体中に存在するｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされていることを特徴とするアミノ酸Ｌ−トレオニンの生成用変異微生物を提供する。

他の観点として、本発明は、ｆａｄＲ遺伝子又はこのＤＮＡフラグメントのノックアウトカセット(knock-out cassette)を製造し、Ｌ−トレオニン生成微生物に導入して、微生物の染色体上に存在するｆａｄＲ遺伝子と組み換え、ｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされた変異微生物を選択することを特徴として、アミノ酸Ｌ−トレオニンの生成用変異微生物を製造する方法を提供する。

さらに他の観点として、本発明は、アミノ酸Ｌ−トレオニンを生成することが可能な微生物の染色体中に存在するｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされたＬ−トレオニンの生成用変異微生物を培養し、培養物からアミノ酸Ｌ−トレオニンを精製することを特徴として、アミノ酸Ｌ−トレオニンを製造する方法を提供する。

さらに他の観点として、本発明は、微生物のｆａｄＲ遺伝子の内部にこれの両側末端にｌｏｘｐ部位が隣接した抗生剤マーカーを挿入し、ｆａｄＲ遺伝子又はこのＤＮＡフラグメントのノックアウトされたカセットを提供し、前記ｌｏｘｐ部位はｌｏｘｐ部位特異的な組み換え酵素をコードするｃｒｅ遺伝子を発現させることにより、組み込まれた突然変異体(integrated mutants)の染色体から前記抗生剤マーカーを除去するのに使用される。

本発明は、脂肪酸分解関連オペロン(fad operon)とグリオキシレートバイパスオペロン(aceBAK operon)の発現調節因子であるｆａｄＲ遺伝子を標的としてＬ−トレオニンの生産量の向上を特徴とする。より具体的には、本発明は、ノックアウト突然変異技術を用いてＬ−トレオニン生成微生物の染色体上に存在するｆａｄＲ遺伝子を相同組み換えによってノックアウトさせることにより、トレオニン合成過程でａｃｅＢＡＫオペロンの発現がｆａｄＲ蛋白質によって妨害されず円滑になされるようにしてＬ−トレオニンの生産量を増大させるものである。

このような本発明のアイデアは、原核及び真核を含んだＬ−トレオニンを生成することが可能な全ての微生物に適用することができ、代表的な微生物としては、Ｌ−トレオニンを生成するために従来より使用されている大腸菌、コリネ型細菌、セラチア属細菌、プロビデンシア属細菌に属する変異菌株などを挙げることができる。好ましくは、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性及びα−アミノ酪酸耐性を有し、Ｌ−トレオニンを生産することが可能な大腸菌に属する微生物である。別の好ましい微生物群は、元来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子、トレオニンオペロンに含有された酵素の他にさらに１コピー以上のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及びトレオニンオペロンに含有された遺伝子ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ及びｔｈｒＣが染色体ＤＮＡの中に挿入された変異微生物である。

本発明によってＬ−トレオニン生成微生物の染色体に存在するｆａｄＲ遺伝子をノックアウトさせる方法は、ノックアウト突然変異技術によって行うことができる。このノックアウト突然変異は、試験管内で必ずしも必要なものではないが、便利には優性選別マーカーを提供する外来ＤＮＡ断片が天然染色体ＤＮＡの特定の蛋白質コード領域内に挿入され、その配列がノックアウトされることを意味する。蛋白質コード領域内におけるノックアウト突然変異は、野生型蛋白質の発現を抑制し、通常その蛋白質によって提供される機能を喪失させる。

ノックアウトの手続は、ノックアウト遺伝子カセットを菌株の培養物と混合して行うことができる。天然的に、菌株はＤＮＡの取り込みに対しコンピテント(competent)して形質転換することができるが、予め菌株を適切な方法によってＤＮＡ取り込みにコンピテントであるように作ることが好ましい（参照：LeBlanc et al., Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi et al., J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996）。ノックアウト遺伝子カセットは、選択マーカーを提供することが可能な外来ＤＮＡ断片がクローニングされた天然染色体ＤＮＡのフラグメントを意味する。ノックアウト遺伝子カセットは、ゲノムＤＮＡの切片内に外来ＤＮＡ断片を導入し、この配列の野生型染色体コピーをノックアウトカセットで置き換えることにより形成される。一様態として、ノックアウトプロトコルは標的部位のＤＮＡを含んだ「テール」がノックアウトカセットの５’及び３’末端に残っているように標的ＤＮＡ内に外来ＤＮＡ断片をクローニングすることを含む。テールは少なくとも５０個の塩基対でなければならず、好ましくは効率的な組み換え及び／又は遺伝子転換のために２００〜５００個の塩基対でなければならない。便利上、標的ＤＮＡ内にクローニングされた外来ＤＮＡはまた、選択マーカー、例えば抗生剤耐性遺伝子を提供する。標的ＤＮＡが抗生剤耐性遺伝子によってノックアウトされる場合、形質転換体の選択は適切な抗生物質が含有された寒天平板上で実施する。形質転換の後、ノックアウトカセットが導入された細胞分画は、そのカセットのゲノムＤＮＡテールに沿って同種組み換え又は遺伝子転換を経ることになり、結果として、野生型ゲノム配列はノックアウトカセットで置き換えられる。ノックアウト組み換えがなされたか否かは、例えばサザンブロットハイブリダイゼーションによって容易に確認することができ、さらに便利にはＰＣＲによって検証することができる。

一様態として、本発明のノックアウト突然変異は、次の過程を含む。Ｌ−トレオニンを生産することが可能な菌株からゲノムＤＮＡを分離し、これを鋳型として通常の技術を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｆａｄＲ遺伝子を増幅する。これにより得られたｆａｄＲ遺伝子を適切なプラスミド又はその他のベクター内にクローニングし、形成された組み換えベクターを形質転換によって大腸菌のような宿主細胞内に導入する。形質転換体を培養増殖した後、これらからｆａｄＲ遺伝子を有する組み換えベクターを抽出する。抽出された組み換えベクター内のｆａｄＲ遺伝子に抗生剤耐性遺伝子フラグメントを挿入して、ｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされた組み換えベクターを製作し、この組み換えベクターを前記のように形質転換によって宿主細胞内に導入して培養する。得た形質転換体から増殖された組み換えベクターを分離し、適切な制限酵素の処理によってｆａｄＲ遺伝子のノックアウトカセットフラグメントを得る。これらのフラグメントを、Ｌ−トレオニンを生産することが可能な菌株にエレクトロポレーション(electroporation)法のような通常の技術によって導入させた後、抗生剤耐性を用いて、抗生剤マーカーを含むｆａｄＲ遺伝子のフラグメントが染色体上の野生ｆａｄＲ遺伝子と組み換えて生長を重ねても、引き続きｆａｄＲ遺伝子のノックアウト特性を有する菌株が単離される。

当業者は、本発明のノックアウトカセット及びＤＮＡフラグメントが一般的なクローニング方法によって製造できることを認知するであろう。本発明に係るｆａｄＲ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅方法が好ましい。ＰＣＲ増幅方法は、本分野によく知られている（参照：PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press(1990);又は米国特許第４,８８９,８１８号）。ＰＣＲはゲノムＤＮＡ、適切な酵素、プライマー及び緩衝液を含み、便利にはＤＮＡサーマルサイクラー(DNA Thermal Cycler)(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA)で実施する。陽性ＰＣＲ結果は、例えば適切なサイズのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって検出することにより決定する。

好ましい様態として、本発明は、Ｌ−トレオニンを生産することが可能な変異菌株として、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性及びα−アミノ酪酸耐性を有する菌株を使用する。Ｌ−メチオニン類似体としてはＤ,Ｌ−エチオニン、ノルロイシン、α−メチルメチオニン又はＬ−メチオニン−Ｄ,Ｌ−スルホキシミンが含まれる。Ｌ−トレオニン類似体としてはα−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸又はＤ,Ｌ−トレオニンヒドロキサメートが含まれる。Ｌ−リジン類似体としてはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン又はδ−メチル−Ｌ−リジンが含まれる。

特に好ましい様態として、本発明者は、組み換えプラスミドｐＴ７ｂｌｕｅ／ｆａｄＲ及びｐＴ７ΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔを製作してこれからノックアウトカセットΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔを収得し、この切片をＬ−メチオニン類似体に対する耐性、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性及びα−アミノ酪酸耐性を有する大腸菌ＫＣＣＭ１０２３６にエレクトロポレーション法で形質転換させることにより、野生ｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされて母菌株ＫＣＣＭ１０２３６に比べて高濃度のＬ−トレオニンを生成する新菌株を開発した。この新菌株は大腸菌ＦＴＲ１２０１と命名し、２００２年９月１６日にブダペスト協約の下に国際寄託機関Korean Culture Center of Microorganismsに寄託番号ＫＣＣＭ−１０４２２で寄託された。

本発明の新菌株は、菌株ＫＣＣＭ１０２３６から誘導されたもので、菌株ＫＣＣＭ１０２３６は大腸菌ＴＦ４０７６から誘導されたものである。Ｌ−トレオニン生産菌株としてのＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）は、メチオニン要求性、トレオニン類似体（例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、ＡＨＶ）に対する耐性、リジン類似体（例えば、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、ＡＥＣ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例えば、α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニン類似体（例えば、エチオニン）に対する耐性などの特性を持っている。前記韓国特許の全体内容は本願に参考として援用される。Ｌ−トレオニンを生産するに当たって、ホスホエノールピルビン酸（phosphoenol pyruvate,ＰＥＰ）はトレオニンの代謝経路の中間体であるオキサロアセテート(oxaloacetate)の前駆体である。ＫＣＣＭ１０２３６菌株はＬ−トレオニンの生産菌株である前記大腸菌ＴＦ４０７６の染色体からポリメラーゼ連鎖反応によって得たホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(phosphoenol pyruvate carboxylase gene,ｐｐｃ遺伝子)とトレオニンオペロン(thr operon)を再び母菌株ＴＦ４０７６の染色体に挿入させることにより、ＴＦ４０７６の染色体ＤＮＡの中にｐｐｃ遺伝子とトレオニンオペロンの数を２個に増加させた。従って、ＫＣＣＭ１０２３６菌株は、ＰＥＰからトレオニン生合成の中間体であるオキサロアセテートに転換させる酵素としてのｐｐｃ遺伝子の発現量と、アスパラギン酸(aspartate)からトレオニンを合成する経路関連遺伝子(ｔｈｒＡ：aspartokinase I-homoserine dehydrogenase,ｔｈｒＢ：homoserine kinase,ｔｈｒＣ：threonine synthase)の発現量を増加させることにより、Ｌ−トレオニンの生産量を向上させることを特徴とする。

トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０２３６からゲノムＤＮＡ(genomic DNA)を抽出する。このゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施してｆａｄＲ遺伝子を増幅する。ＰＣＲの産物をアガロースゲルで電気泳動して単離し、単離されたｆａｄＲ遺伝子又はこの切片を適切なベクター内に挿入させる。形成された組み換えベクター内のｆａｄＲ遺伝子に抗生剤耐性遺伝子切片を挿入させ、ｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされた組み換えベクターを形成する。この組み換えベクターから抗生剤耐性遺伝子切片を含んだノックアウトｆａｄＲ遺伝子又はこの切片を単離する。単離されたノックアウトｆａｄＲ遺伝子又はこの断片を大腸菌ＫＣＣＭ１０２３６のようなＬ−トレオニン生産菌株にエレクトロポレーション法のような通常の手段により形質転換させ、Ｌ−トレオニンを高収率で生成する菌株を収得する。

本発明において、ベクターは、ｆａｄＲ遺伝子のノックアウトカセット又はこのフラグメントを製造する過程で外来ＤＮＡを宿主細胞に導入するのに使用される核酸分子である。一般に使用されるベクターの例としては、天然状態又は組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルス及びバクテリオファージが挙げられる。

本発明によって、ｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされ且つＬ−トレオニンを生成することが可能な本発明の変異菌株からＬ−トレオニンを量産するために、その菌株を発酵させ、発酵液から目的のＬ−トレオニンを分離する全工程は本分野でよく知られている。Ｌ−トレオニンの生産に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機物質、及び菌株が要求する微量栄養素(trace amounts of nutrients)を適切に含有する限り、全ての合成培地及び天然培地を使用することができる。炭素源の例としては、グルコース、フルクトース、ラクトース、糖蜜、セルロース加水分解物及び澱粉加水分解物のような炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸及び乳酸のような有機酸、並びにグリセリン及びエタノールのようなアルコール類を含む。窒素源の例としては、アンモニア、様々な無機酸（たとえば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム）、有機酸のアンモニウム塩、アミン、ペプトン、肉エキス(meat extract)、コーンスティープリカー(Corn Steep Liquor)、カゼイン加水分解物、大豆ケーキ加水分解物、様々な発酵させた細胞及びその消化物質を含む。無機物質の例としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化カルシウム及び炭酸カルシウムを含む。

培養は、例えば通気の下で振盪培養又は回転培養(spinner culture)させることにより、好気の条件下で行われる。培養温度は２０〜４０℃の範囲、好ましくは２８〜３７℃である。培地のｐＨは５〜９の範囲、好ましくは約中性である。ｐＨ調整は炭酸カルシウム、有機又は無機酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。一般に、Ｌ−トレオニンは１〜７日間培養させることにより、培養物内に形成されて蓄積される。培養のための選択的な方法は、例えば連続培養、半連続培養及び回分培養のいずれか一つである。

培養を完了した後、細胞などの沈殿物を培養物から除去し、Ｌ−トレオニンはイオン交換クロマトグラフィー、濃縮、脱塩などを組み合わせて使用することにより除去することができる。例えば、培養ブロス(culture broth)からのＬ−トレオニンの回収は下記の方法で行われる。細胞を除去しようとする培養ブロスを塩酸でｐＨ２に調整する。その後、ブロス溶液を強酸イオン交換樹脂を介して通過させ、吸着剤を希釈アンモニア水溶液で溶出させる。アンモニアを蒸発させた後、収得される溶液を濃縮させる。アルコールを濃縮物に加えた後、冷却の下に形成された結晶を収集することにより、Ｌ−トレオニンを収得することができる。

本発明は下記の実施例でより具体的に例示されるであろう。ところが、これらの実施例は本発明の具現例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

組み換えプラスミド製作とこれを用いたｆａｄＲ遺伝子のノックアウト
ゲノミックチップシステム(QIAGEN Genomic-tip system)を用いてトレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０２３６菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡ鋳型からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてｆａｄＲ遺伝子のＯＲＦ(Open Reading Frame)を含むＤＮＡフラグメント、約０.８ｋｂを増幅した。使用されたプライマーは5’-tcg cgg aag agt aca tta ttg-3’と 5’-atc ggg ggc gca aag aag tcc-3’であり、変性(denaturation)段階は９４℃で３０秒間、アニーリング(annealing)段階は５５℃で３０秒間、伸長(extension)段階は７２℃で１分間実施し、３０周期を行った。
このＰＣＲ結果物を１.０％アガロースゲルで電気泳動した後、０.８ｋｂサイズのバンドを溶出して得、ｐＴ７Ｂｌｕｅクローニングベクター(Novagen Co.)のＥｃｏＲＶに１６℃で一晩中連結させた（図１）。これにより形成された組み換えプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｆａｄＲを大腸菌ＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩中培養した。

コロニーを白金耳に付けてカルベニシリン入りの３ｍＬ液体培地に接種して一晩中培養した後、ミニプレップキット(QIAGEN mini prep kit)を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIIで処理した後、ｆａｄＲ遺伝子のクローニングを確認した。確認されたプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｆａｄＲを制限酵素ＳａｃIIで処理した後、０.８％アガロースゲルで約３.８ｋｂサイズのバンドを溶出し、さらにクレノウ(Klenow)酵素を処理して平滑断端(blunt end)に作った。ここに、プラスミドｐｌｏｘｐｃａｔ２(Gosset et al, A family of removable cassettes designed to obtain Ab-resistance-free genomic modifications of E. coli, Gene 247, pp255-264)を制限酵素ＨｉｎｃIIで処理して得たｌｏｘｐ部分を含むクロラムフェニコール耐性遺伝子フラグメント（約１.１ｋｂ）を平滑断端連結させて組み換えプラスミドｐＴ７ΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔ（約５.０ｋｂ）を得た（図２）。

この組み換えプラスミドｐＴ７ΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔをＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリンとクロラムフェニコール（それぞれ５０ｍｇ／Ｌと１５ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３２℃で一晩中培養した。コロニーを白金耳に付けてカルベニシリンとクロラムフェニコール入りの３ｍＬ液体培地に接種して一晩中培養した後、ミニプレップキット(QIAGEN mini prep kit)を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩで処理して０.７％アガロースゲルで約２.２ｋｂサイズのＤＮＡフラグメントΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔを溶出した（図２）。このＤＮＡフラグメントΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔをトレオニン生産菌株（ＫＣＣＭ１０２３６）にエレクトロポレーション法で導入させてクロラムフェニコール含有の固体培地に塗抹した後、選抜したコロニーに対するフラスコ力価確認実験を行った。

選別菌株に対する三角フラスコでのトレオニン生産力価比較実験
抗生剤クロラムフェニコール含有の固体培地に塗抹して、選別したコロニー３０株を選抜し、表１に示すトレオニン力価培地を用いて三角フラスコでトレオニンの生産性を比較した。

３２℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩中培養した単一コロニーを２５ｍｌの力価培地に１白金耳ずつ接種して３２℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。分析結果を下記表２に示した。

コントロール菌株のＫＣＣＭ１０２３６菌株は、２３ｇ／Ｌである反面、ｆａｄＲ遺伝子が破壊された組み換え菌株は全てがコントロール菌株に比べて優れた成績を示し、これらの菌株は同様に約２４〜２５ｇ／Ｌの収得率を示した。この結果より、濃度がコントロール菌株に比べて約８％程度向上したことを観察し、その中の一つの菌株を大腸菌ＦＴＲ１２０１（ＫＣＣＭ−１０４２２）と命名した。

サザンブロット分析を用いたｆａｄＲ遺伝子のノックアウト確認実験
実施例２で選択した菌株のｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされたか否かを確認するために、サザンブロット分析を行った。コントロール菌株のＫＣＣＭ１０２３６菌株と前記選択されたＦＴＲ１２０１（ＫＣＣＭ−１０４２２）菌株をクロラムフェニコール含有の３ｍＬ液体培地で一晩中培養した後、ゲノムキット(QIAGEN genomic kit 20)を用いてゲノムＤＮＡを分離した。

このゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｍｎＩで一晩中切断し、０.７％アガロースゲルで電気泳動してＤＮＡフラグメントの大きさ別に分離した。電気泳動済みのゲルを毛細管伝達 (Molecular Cloning vol 1. pp6.31-6.38)方法を用いて、ＤＮＡをナイロン膜(YOUNG Sci. Biodyne B Membrane)に付着させた。この膜を乾燥させた後、ＵＶ（１２０ｍＪ／ｃｍ²、SpectroLinker^TM）を照射して、付いていたＤＮＡを膜に固定させた(Molecular Cloning, vol 1. pp6.45)。この膜を５５℃で２時間予備プレハイブリダイゼーション化溶液(prehybridization solution I)(Roche #1093657)で処理して予備ハイブリッド化させ、変性されたＤＮＡプローブを入れた後、５５℃に固定されたハイブリダイゼーションオーブン(BAMBINO 230300)内で一晩中ハイブリダイゼーションさせた。

前記プローブは次のように準備した。ＱＩＡＧＥＮキットを用いて分離したプラスミドｐｌｏｘｐｃａｔ２を制限酵素ＨｉｎｃIIで処理して、ｌｏｘｐ部分を含むクロラムフェニコール耐性遺伝子フラグメント（約１.１ｋｂ）を得た。このＤＮＡ断片を１００℃の熱水で５分間加熱した後、直ちに氷で再び５分間冷却させて一本鎖ＤＮＡ分子に作った。このＤＮＡをＤＩＧ標識及び検出キット(Roche #1093657)を用いて３７℃で一晩中反応させてＤＩＧ−ＵＤＰ標識のＤＮＡプローブを製造した。

ハイブリダイゼーションが終わると、洗浄溶液Ｉ、II(Roche #1093657)を用いて、膜に非特異的にハイブリダイゼーションされたＤＮＡを除去した。プレハイブリダイゼーション緩衝液２(Roche #1093657)を用いて常温で３０分間膜をマスキングした後、ＤＩＧ−ＵＴＰに特異的に結合する抗ＤＩＧ抗体を添加して常温で３０分間反応させた。洗浄溶液III (Roche #1093657)を用いて、非特異的に膜に付着している抗ＤＩＧ抗体を除去し、前記標識及び検出キット(Roche #1093657)を用いて、バンドが現われるまで常温で発色反応させた。ＦＬＡ−５０００イメージシステム(FUJIFILM)を用いてイメージをスキャニングした。その結果は、図３に示す通りである。コントロール菌株ＫＣＣＭ１０２３６（レイン３）ではクロラムフェニコール耐性遺伝子がないため、何のバンドも表わさなかった。反面、本発明で選択されたＦＴＲ１２０１（ＫＣＣＭ−１０４２２）菌株（レイン２）では予想通りに約２.８ｋｂ程度のバンドが見られた。これはｆａｄＲ遺伝子の一部１.７ｋｂとクロラムフェニコール耐性遺伝子約１.１ｋｂとを合わせて約２.８ｋｂサイズが得られたものである。

発酵槽を用いたトレオニン比較実験
実施例２で選別され、実施例３で遺伝子破壊が確認された菌株ＦＴＲ１２０１（ＫＣＣＭ−１０４２２）とＫＣＣＭ１０２３６コントロール菌株を用いて５Ｌの発酵槽でトレオニン生産性を比較した。初期培地の組成は下記表３に示した。

種菌培養はＬＢ培地にブドウ糖１０ｇ／ＬとＬ−メチオニンを０.１ｇ／Ｌとなるように添加した培地を使用し、発酵槽の初期接種体積は初期培養体積の３％〜５％で調整した。追加糖は６回にわたって添加し、追加後のブドウ糖の濃度が５％となるようにし、追加時点はブドウ糖が枯渇した時点である。また、ブドウ糖を追加する際、第１リン酸カリウム（ＫＨ-₂ＰＯ₄）を重量基準で１％となるように添加した。初期培養体積は１.５Ｌ、最終体積は３.０Ｌ、発酵終了後に投入された総ブドウ糖の濃度は２５０ｇ／Ｌである。撹拌速度は７００〜１０００ｒｐｍにし、ｐＨと温度はそれぞれ７.０と３２℃にし、時間は９０時間とした。培養中のｐＨ調整は２５〜２８％のアンモニア水を使用した。また、通気量は０.５ｖｖｍに調整した。

その結果は下記表４に示されている。

コントロール菌株は９３.５ｇ／Ｌのトレオニンを生産して、消費したブドウ糖に対して３７.４％の収率を示す反面、本発明に係る組み換え新菌株ＦＴＲ１２０１は１０２ｇ／Ｌのトレオニンを生産して４１％の収率を示すことにより、コントロール菌株の濃度に比べて９％の収率向上を示した。

本発明によってｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされたＬ−トレオニン生成微生物はＬ−トレオニンの収率を増大させる。

図１は本発明に係る組み換えプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｆａｄＲの作製図である。図２は本発明に係る組み換えプラスミドｐＴ７ΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔからＤＮＡフラグメントΔｆａｄＲ：：ｌｏｘｐｃａｔを得た作製図である。図３は本発明に係るノックアウトされたｆａｄＲ遺伝子の染色体上における組み換えを示すサザンブロット分析(southern blotting analysis)結果である。

Claims

アミノ酸Ｌ−トレオニンを生成することが可能な微生物の染色体中に存在するｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされていることを特徴とするアミノ酸Ｌ−トレオニンの生成用変異微生物であって、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性及びα−アミノ酪酸耐性を有することを特徴とする、変異微生物。
微生物が大腸菌である、請求項１に記載の変異微生物。
微生物が、元来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、トレオニンオペロンに含有された酵素の他にさらに１コピー以上のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及びトレオニンオペロンに含有された遺伝子ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ及びｔｈｒＣが染色体ＤＮＡの中に挿入された菌株である、請求項１に記載の変異微生物。
変異微生物が大腸菌ＦＴＲ１２０１（ＫＣＣＭ−１０４２２）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異微生物。
ノックアウトされたｆａｄＲ遺伝子又はこのＤＮＡフラグメントを製造し、Ｌ−トレオニン生成微生物に導入させて微生物の染色体上のｆａｄＲ遺伝子と組み換え、ｆａｄＲ遺伝子がノックアウトされた変異微生物を選別することを特徴とする、アミノ酸Ｌ−トレオニンの生成用変異微生物を製造する方法であって、変異微生物がＬ−メチオニン類似体に対する耐性、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、イソロイシンリーキー型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性及びα−アミノ酪酸耐性を有することを特徴とする、方法。
ｆａｄＲ遺伝子又はこのＤＮＡフラグメントが微生物のｆａｄＲ遺伝子の内部に抗生剤マーカーを挿入してノックアウトされる、請求項５記載の方法。
請求項１による変異微生物を培養し、培養物からアミノ酸Ｌ−トレオニンを単離することを特徴とする、アミノ酸Ｌ−トレオニンを製造する方法。