WO2019187754A1 - フローサイトメーター及び粒子検出方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a flow cytometer and a particle detection method.
- Flow cytometers are widely used for analyzing biological sample liquids containing particles such as cells and microorganisms.
- a flow cytometer In a flow cytometer, light generated from particles in a biological sample liquid flowing inside a transparent flow cell is detected. Inside the flow cell, the flow of the sample liquid such as the biological sample liquid and the flow of the sheath liquid form a laminar flow. By flowing particles one by one through the flow cell, it is possible to optically analyze each of the particles in the sample liquid.
- Patent Document 1 discloses irradiating particles inside a flow cell with light, modulating the light generated from the particles with an optical grating, and calculating the flow velocity of the particles flowing inside the flow cell based on the detection period of the modulated light. ing. By capturing particles in synchronism with the calculated particle velocity and the charge transfer timing in the charge-coupled device (CCD) array, it is possible to acquire a bright and high-SNR particle image.
- CCD charge-coupled device
- the time that the particles cross the light irradiated toward the flow cell corresponds to the exposure time. Therefore, if the velocity of the particles flowing inside the flow cell is high, the intensity of the light generated from the particles is low, and the signal obtained from the detector that detects the light generated from the particles is also weakened. In addition, if the velocity of the particles flowing inside the flow cell is slow, the intensity of the light generated from the particles increases, and the signal obtained from the detector that detects the light generated from the particles also increases. Thus, in the flow cytometer, the intensity of the signal obtained from the detector is affected by the flow velocity of the particles.
- the intensity of the signal obtained from the detector changes for each particle to be measured because it affects the analysis of the particle.
- the flow velocity of the liquid flowing inside the flow cell is influenced by the temperature, the temperature of the apparatus, the temperature of the liquid, the viscosity of the liquid, the change in the liquid level of the liquid in the supply chamber, and the like. For example, when the temperature around the flow cell increases from 15 ° C. to 30 ° C., the viscosity of the liquid flowing through the flow cell decreases, and the flow rate of the liquid flowing through the flow cell may increase from about 2 ⁇ L / second to about 7 ⁇ L / second.
- An object of the present invention is to provide a flow cytometer and a particle detection method in which detection of light generated from particles is not easily affected by changes in the flow velocity of the liquid flowing inside the flow cell.
- the flow cell 10 in which the liquid flows inside the liquid feeding unit 40 that sends the liquid into the flow cell 10
- the control unit 300 that acquires information on the flow velocity of the liquid flowing in the flow cell 10
- the light source 121 for irradiating light to the liquid flowing inside the flow cell 10 and the detector 162 for detecting light generated from the particles in the liquid irradiated with light, and the control unit 300 is based on information on the flow velocity.
- a flow cytometer for changing the liquid feeding conditions of the liquid feeding unit 40 is provided.
- control unit 300 can change the liquid feeding condition of the liquid feeding unit 40 based on the information on the flow speed, thereby suppressing the influence of the change in the flow speed on the particle detection. is there.
- control unit 300 may further change the detection condition of the detector 162 based on the acquired information on the flow velocity.
- control unit 300 can change the detection condition of the detector 162 based on the information on the flow velocity, thereby suppressing the influence of the flow velocity change on the particle detection.
- control unit 300 may selectively change the liquid feeding condition of the liquid feeding unit 40 or the detection condition of the detector 162 based on the acquired information on the flow velocity.
- the influence of the change in the flow velocity on the detection of the particles is affected. It is possible to suppress.
- the control unit 300 changes the liquid feeding condition of the liquid feeding unit 40 and sets the obtained flow velocity.
- the detection condition of the detector 162 may be changed.
- the flow rate when the difference between the measured value of the flow rate and the reference value of the flow rate is large, the flow rate can be changed by changing the liquid supply condition of the liquid supply unit 40 to bring the flow rate closer to the reference value. Is possible.
- the flow rate for the particle detection is changed by changing the detection condition of the detector 162. It is possible to suppress the influence of the difference.
- the control unit 300 supplies the liquid to the flow cell 10 of the liquid supply unit 40 when the acquired measured value of the flow velocity is larger than the reference value of the flow velocity and the difference is larger than a predetermined value. If the measured value of the flow velocity is smaller than the reference value of the flow velocity and the difference is larger than a predetermined value, the amount of liquid delivered to the flow cell 10 of the liquid delivery unit 40 may be increased. .
- the flow rate is changed by changing the amount of liquid fed to the flow cell 10 of the liquid feeding unit 40 based on the feedback of the difference between the measured value of the flow rate and the reference value of the flow rate. It is possible to approach the reference value.
- the detector 162 may include a photoelectric conversion element that photoelectrically converts light generated from particles flowing inside the flow cell 10.
- the controller 300 may further change the sensitivity of the detector 162 based on the acquired information regarding the flow velocity.
- the sensitivity of the detector 162 is increased, and the acquired measurement value of the flow velocity is smaller than the reference value of the flow velocity.
- the difference is smaller than a predetermined value, the sensitivity of the detector 162 may be reduced.
- the sensitivity of the detector 162 is changed based on the feedback of the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity, thereby obtaining from the detector 162 that detects the light generated from the particles. It is possible to suppress fluctuations in signal strength.
- the flow cytometer may further include a lens 137 that collects light generated from particles in the liquid irradiated with light.
- the control unit 300 may further change the magnification of the particle image formed by the lens 137 based on the acquired information on the flow velocity. When the acquired measured value of the flow velocity is larger than the reference value of the flow velocity and the difference is smaller than a predetermined value, the control unit 300 reduces the magnification of the particle image formed by the lens 137, and the acquired measured value of the flow velocity is the flow velocity. If the difference is smaller than a predetermined value, the magnification of the particle image formed by the lens 137 may be increased.
- the fluctuation of the light intensity of the particle image can be suppressed by changing the magnification of the particle image based on the feedback of the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity. Is possible.
- the control unit 300 may further change the intensity of light emitted from the light source 121 based on the acquired information on the flow velocity.
- the control unit 300 increases the intensity of the light emitted from the light source 121, and the acquired measured value of the flow velocity is the reference value of the flow velocity. If it is smaller and the difference is smaller than a predetermined value, the intensity of the light emitted from the light source 121 may be reduced.
- the variation in the intensity of light generated from the particles is suppressed by changing the intensity of light emitted from the light source 121 based on the feedback of the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity. It is possible.
- the detector 162 may capture an image of particles flowing inside the flow cell 10.
- the detector 162 may capture an image of particles flowing inside the flow cell 10 by a TDI (Time Delay Integration) method.
- the detector 162 may set the scan speed based on the acquired information regarding the flow velocity.
- the particle is a cell fluorescently labeled at a specific locus of the chromosome, it is possible to suppress the influence of the change in the flow rate on the luminance of the fluorescence image of the cell.
- control unit 300 may calculate information on the flow velocity based on the optical characteristics of particles flowing inside the flow cell 10.
- the flow cell 10 in which the liquid flows inside the liquid feeding unit 40 that sends the liquid into the flow cell 10, and the control unit 300 that acquires information on the flow velocity of the liquid flowing in the flow cell 10.
- a light source 121 that irradiates the liquid flowing inside the flow cell 10 with light
- a detector 162 that detects light generated from particles in the liquid irradiated with the light
- the control unit 300 relates to the acquired flow velocity.
- a flow cytometer is provided that changes the sensitivity of the detector 162 based on the information.
- control unit 300 can change the sensitivity of the detector 162 based on the information on the flow velocity, thereby suppressing the influence of the flow velocity change on the particle detection.
- the flow cell 10 in which the liquid flows inside the liquid feeding unit 40 that sends the liquid into the flow cell 10, and the control unit 300 that acquires information on the flow velocity of the liquid flowing in the flow cell 10.
- a light source 121 that irradiates the liquid flowing inside the flow cell 10 with light
- a detector 162 that detects light generated from particles in the liquid irradiated with the light
- the control unit 300 relates to the acquired flow velocity.
- a flow cytometer is provided that changes the intensity of light emitted by the light source 121 based on the information.
- the liquid is sent into the flow cell 10, the information about the flow velocity of the liquid flowing through the flow cell 10 is acquired, and the liquid is sent into the flow cell 10 based on the acquired information about the flow velocity.
- a particle detection method for changing the liquid feeding conditions for liquefying, irradiating the liquid flowing inside the flow cell 10 with light, and detecting the light generated from the particles in the liquid irradiated with the light.
- the influence of the change in the flow rate on the particle detection can be suppressed by changing the liquid supply condition for sending the liquid into the flow cell 10 based on the information on the flow rate. Is possible.
- the detection conditions for detecting light generated from the particles may be further changed based on the acquired information on the flow velocity.
- the particle detection method described above it is possible to suppress the influence of the change in the flow velocity on the particle detection by changing the detection conditions for detecting the light generated from the particles based on the information on the flow velocity.
- the liquid feeding condition or the detection condition may be selectively changed based on the acquired information on the flow velocity.
- the above particle detection method it is possible to suppress the influence of the change in the flow velocity on the particle detection by selectively changing the liquid feeding condition or the detection condition based on the information on the flow velocity.
- the liquid feeding condition when the difference between the acquired measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity is larger than the predetermined value, the liquid feeding condition is changed, and the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity is predetermined. If the value is smaller than this value, the detection condition may be changed.
- the flow rate is changed by changing the flow condition for feeding the liquid into the flow cell 10, and the flow rate is changed. It is possible to approach the reference value. Further, when the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity is so small that it is difficult to reduce by changing the liquid feeding conditions for feeding the liquid into the flow cell 10, light generated from the particles is detected. It is possible to suppress the influence of the difference in flow velocity on the particle detection by changing the conditions for the detection.
- the amount of the liquid fed to the flow cell 10 is reduced and the acquired flow velocity is measured.
- the amount of liquid fed to the flow cell 10 may be increased.
- the flow velocity is brought close to the reference value by changing the amount of liquid to be fed to the flow cell 10 based on the feedback of the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity. Is possible.
- light generated from particles in the liquid flowing inside the flow cell 10 may be photoelectrically converted by a photoelectric conversion element.
- the sensitivity of the detector 162 for detecting light generated from the particles in the liquid may be further changed.
- the sensitivity of the detector 162 for detecting light is increased, and the measured value of the flow velocity is smaller than the reference value of the flow velocity,
- the difference is smaller than a predetermined value, the sensitivity of the detector 162 may be reduced.
- the sensitivity of the detector 162 is changed based on the feedback of the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity, thereby obtaining from the detector 162 that detects light generated from the particles. It is possible to suppress fluctuations in signal strength.
- light generated from particles in the liquid irradiated with light may be collected by the lens 137.
- the magnification of the image of the particles formed by the lens 137 may be further changed based on the acquired information regarding the flow velocity. If the acquired flow velocity measurement value is greater than the flow velocity reference value and the difference is less than the predetermined value, the magnification of the particle image formed by the lens is reduced, and the obtained flow velocity measurement value is smaller than the flow velocity reference value, When the difference is smaller than a predetermined value, the magnification of the image of the particles formed by the lens may be increased.
- the variation in the light intensity of the particle image can be suppressed by changing the magnification of the particle image based on the feedback of the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity. Is possible.
- the intensity of the light irradiated to the inside of the flow cell 10 may be further changed based on the acquired information on the flow velocity.
- the intensity of light irradiated inside the flow cell 10 is increased, the measured value of the flow velocity is smaller than the reference value of the flow velocity, and the difference is predetermined.
- the intensity of the light applied to the flow cell 10 may be reduced.
- the intensity of light emitted from the particles is changed by changing the intensity of light irradiated to the flow cell 10 based on feedback of the difference between the measured value of the flow velocity and the reference value of the flow velocity. It is possible to suppress.
- an image of particles flowing inside the flow cell 10 may be taken.
- An image of particles flowing inside the flow cell 10 may be taken by a TDI (Time Delay Integration) method.
- the scan speed of the detector for detecting light generated from the particles in the liquid may be set.
- the particle detection method for example, when the particle is a cell fluorescently labeled at a specific locus of the chromosome, it is possible to suppress the influence of the change in flow rate on the luminance of the fluorescence image of the cell.
- information on the flow velocity may be calculated based on the optical characteristics of particles flowing inside the flow cell 10.
- liquid is fed into the flow cell 10, information on the flow velocity of the liquid flowing in the flow cell 10 is acquired, light is irradiated to the liquid flowing in the flow cell 10, and the light is irradiated.
- a particle detection method for detecting light generated from particles in a liquid and changing the sensitivity of the detector 162 for detecting light generated from particles in the liquid based on the acquired information on the flow velocity.
- liquid is fed into the flow cell 10, information on the flow velocity of the liquid flowing in the flow cell 10 is acquired, light is irradiated to the liquid flowing in the flow cell 10, and the light is irradiated.
- a particle detection method for detecting light generated from particles in a liquid and changing the intensity of light irradiated to the inside of the flow cell 10 based on the acquired information on the flow velocity.
- the above particle detection method it is possible to suppress the influence of the change in the flow rate on the particle detection by changing the intensity of the light irradiated inside the flow cell 10 based on the information on the flow velocity.
- the present invention it is possible to provide a flow cytometer and a particle detection method in which detection of light generated from particles is not easily affected by changes in the flow velocity of the liquid flowing inside the flow cell.
- FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a flow cytometer, an optical system, and the like of the flow cytometer according to the embodiment.
- FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an optical system and the like of the flow cytometer according to the embodiment.
- FIG. 3 is a schematic diagram illustrating the optical grating according to the embodiment.
- FIG. 4 is a graph schematically showing the relationship between the flow velocity of the particles flowing inside the flow cell and the luminance of the image of the captured particles.
- FIG. 5 is a schematic diagram illustrating a flow path and the like of the flow cytometer according to the embodiment.
- FIG. 6 is a schematic diagram illustrating a flow path and the like of the flow cytometer according to the embodiment.
- FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a flow cytometer, an optical system, and the like of the flow cytometer according to the embodiment.
- FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an optical system and the like of the flow cytometer according to the embodiment.
- FIG. 7 is a flowchart illustrating the particle detection method according to the embodiment.
- FIG. 8 is a continuation of the flowchart illustrating the particle detection method according to the embodiment.
- FIG. 9 is a continuation of the flowchart illustrating the particle detection method according to the embodiment.
- the present invention is applied to fluorescence detection in a fluorescence in situ hybridization method (FISH method).
- FISH method a probe containing a nucleic acid sequence having a sequence complementary to the target sequence and hybridized with a fluorescent dye is hybridized to a target sequence existing in the chromosome of the cell.
- Chromosomes may be treated with multiple probes labeled with different fluorescent dyes for each target sequence. For example, when a translocation of a gene containing a target sequence occurs in a chromosome, the position where a fluorescent bright spot is observed on the chromosome changes from a normal position. Therefore, translocation can be detected by the FISH method.
- the FISH method not only translocation but also chromosomal abnormalities such as deletion, inversion, and duplication can be detected.
- the flow cytometer includes a flow cell 10 in which a liquid flows, a liquid feeding unit 40 that sends the liquid into the flow cell 10, and information on the flow velocity of the liquid that flows in the flow cell 10.
- the control unit 300 for acquiring the light, the light source 121 for irradiating the liquid flowing in the flow cell 10 with light, and the detector 162 for detecting particles in the liquid irradiated with the light.
- the control unit 300 changes the liquid feeding condition of the liquid feeding unit 40 based on the information regarding the flow velocity.
- the control unit 300 is configured by a central processing unit (CPU).
- the liquid feeding unit 40 includes a sheath liquid feeding unit 40A for feeding the sheath liquid to the flow cell 10 and a sample liquid feeding unit 40B for feeding a sample liquid containing particles to the flow cell 10.
- the sheath liquid feeding unit 40A includes a chamber 41 that stores the sheath liquid, an electropneumatic converter 42 that receives an electric control signal and applies atmospheric pressure to the chamber 41, and a compressor 43 that is a pressure source of the electropneumatic converter 42.
- the electropneumatic converter 42 is an element capable of adjusting the air pressure to be discharged based on the input electric signal (current or voltage).
- the sheath liquid feeding unit 40A may be a syringe pump or a diaphragm pump.
- the sample liquid feeding unit 40B includes, for example, a syringe 21, an actuator 22 such as a plunger and a piston inserted in the syringe 21, and a driving device 23 such as a motor that moves the actuator 22.
- the driving device 23 presses the actuator 22, the sample liquid is sent to the flow cell 10 via the sample liquid flow path 53.
- the sample liquid feeding unit 40B may be a diaphragm pump, or may feed the sample liquid using an atmospheric pressure generated by an electropneumatic converter connected to a pressure source such as a compressor.
- the sheath liquid feeding unit 40A may send the sheath liquid also to the sample liquid feeding unit 40B, and may balance the pressure of the sheath liquid and the pressure of the sample liquid inside the flow cell 10.
- the particles contained in the sample liquid are either sample particles whose characteristics are analyzed by a flow cytometer or reference particles for monitoring the flow velocity of particles flowing inside the flow cell 10.
- the sample particles are cells treated with a plurality of probes.
- the reference particles are particles different from the sample particles, for example, non-biological particles, and are made of a polymer such as latex, an inorganic substance, or the like.
- the reference particles have optical properties that, for example, produce scattered light that is stronger than the sample particles when irradiated with light.
- a sample liquid containing both sample particles and reference particles may be supplied to the flow cell 10, or a sample liquid containing sample particles and a sample liquid containing reference particles may be supplied to the flow cell 10 separately.
- the flow cell 10 is made of a transparent material such as quartz. Inside the flow cell 10, the flow of the sample liquid and the flow of the sheath liquid form a laminar flow, and the sample liquid flows so as to be surrounded by the flow of the sheath liquid. The sample liquid and the sheath liquid that have flowed through the flow cell 10 are discharged into the waste liquid chamber 90 from the end of the waste liquid flow path 55 via the waste liquid flow path 55. For example, the end of the waste liquid channel 55 is in contact with the atmosphere.
- the flow cytometer includes an optical system capable of measuring the flow velocity of particles based on the optical characteristics of the reference particles flowing inside the flow cell 10.
- the flow cell 10 is shown in cross section.
- the optical system capable of measuring the flow velocity of the reference particles flowing inside the flow cell 10 includes a light source 121A that irradiates the flow cell 10 with light.
- a light source 121A a laser, a light emitting diode, or the like can be used.
- the light emitted from the light source 121 ⁇ / b> A is collected by the lens 131, passes through the dichroic mirrors 141 and 142, and is collected on the flow cell 10.
- the reference particles flowing inside the flow cell 10 have optical characteristics that generate Mie scattered light as reaction light when irradiated with light, scattered light having the same wavelength as the light emitted from the light source 121A is generated from the particles.
- the scattered light is collected by the lens 135 and reflected by the dichroic mirror 143.
- An optical grating 151 is disposed on the optical path of scattered light reflected by the dichroic mirror 143.
- the optical grating 151 includes a plurality of transparent portions 152a, 152b, 152c,... And a plurality of opaque portions 153a, 153b, 153c,.
- the pitch of the optical grating 151 is constant, and the width of each of the plurality of transparent portions 152a and the plurality of opaque portions 153a is, for example, the size of the reference particles flowing inside the flow cell 10 shown in FIG. Approximate.
- the scattered light generated from the reference particle is converted into a plurality of transparent portions 152a... And a plurality of opaque portions 153a. ⁇ Alternatively crossing. Therefore, the intensity of scattered light is modulated by the optical grating 151.
- the modulated light of the scattered light generated by the optical grating 151 is collected by the lens 136 shown in FIG. 2 and detected by the flow velocity detector 161.
- a photodetector having a photoelectric conversion element such as a photomultiplier tube and a photodiode can be used.
- the period in which the flow velocity detector 161 detects the modulated light is proportional to the flow velocity of the particles flowing inside the flow cell 10.
- the flow velocity detector 161 is connected to the control unit 300 shown in FIG.
- the control unit 300 specifies the period f by fast Fourier transform (FFT), and calculates the measured value of the flow velocity v of the particles flowing inside the flow cell 10 as a value related to the flow velocity based on the following equation (1).
- v fp
- p represents the pitch of the optical grating 151.
- the value of the flow velocity may be an average value.
- the average value may be calculated by a moving average.
- the structure of the apparatus which measures a flow rate is not limited above.
- a known beam diameter of light irradiated on the flow cell 10 is D B
- a known diameter of the reference particle is D S
- a pulse width of fluorescence generated when the reference particle crosses the beam diameter is P W.
- the optical grating 151 is unnecessary, and the control unit 300 may calculate the flow velocity v based on the pulse width of the reaction light detected by the flow velocity detector 161.
- the instrument for measuring the flow rate may include at least two particle detectors.
- the control unit 300 determines the known distance between the two particle detectors and the period from when the reference particle is detected by the upstream particle detector to when the reference particle is detected by the downstream particle detector.
- the particle flow velocity v may be calculated based on the time.
- the device for measuring the flow velocity may include a flow meter provided in a flow path connected to the outlet side of the flow cell 10.
- the control unit 300 may calculate the flow velocity v of the particles based on the flow rate measured by the flow meter and the difference between the diameter of the flow cell 10 and the diameter of the flow path.
- the flow cytometer includes an optical system capable of capturing an image of cells flowing inside the flow cell 10.
- the optical system capable of capturing an image of cells flowing in the flow cell 10 further includes light sources 121B, 121C, and 121D in addition to the light source 121A described above.
- the light source 121A emits light with a wavelength ⁇ E1 .
- the light source 121A can adjust the intensity of light to be irradiated.
- fluorescence of wavelength ⁇ F1 is emitted from the gene locus containing the target sequence of the cell flowing inside the flow cell 10. It is done.
- the wavelength ⁇ F1 is, for example, a green wavelength.
- the light source 121B emits light having a wavelength ⁇ E2 different from the wavelength ⁇ E1 .
- the light source 121B can adjust the intensity of light to be irradiated.
- the light emitted from the light source 121B is collected by, for example, the lens 132, reflected by the dichroic mirror 141 toward the flow cell 10, and passes through the dichroic mirror 142 to reach the flow cell 10.
- fluorescence of wavelength ⁇ F2 is emitted from the gene locus containing the target sequence of the cell flowing inside the flow cell 10. It is done.
- the wavelength ⁇ F2 is, for example, a red wavelength.
- the light source 121C emits light having a wavelength ⁇ E3 different from the wavelengths ⁇ E1 to ⁇ E2 .
- the light source 121C can adjust the intensity of light to be irradiated.
- the light emitted from the light source 121 ⁇ / b> C is collected by, for example, the lens 133, reflected by the dichroic mirror 142 toward the flow cell 10, and reaches the flow cell 10.
- fluorescence of wavelength ⁇ F3 is emitted from the gene locus containing the target sequence of the cell flowing inside the flow cell 10. It is done.
- the wavelength ⁇ F3 is, for example, a blue wavelength.
- the light source 121D emits light having a wavelength ⁇ E4 different from the wavelengths ⁇ E1 to ⁇ E3 .
- the light source 121D can adjust the intensity of light to be irradiated.
- the light with the wavelength ⁇ E4 is, for example, visible light.
- the light irradiated by the light source 121D is collected by, for example, the lens 134 and reaches the flow cell 10.
- the light with the wavelength ⁇ E4 passes through the particles inside the flow cell 10. Therefore, transmitted light having a wavelength ⁇ E4 is generated in the particles.
- the fluorescence having the wavelengths ⁇ F1 to ⁇ F3 and the transmitted light having the wavelength ⁇ E4 generated from the particles in the flow cell 10 pass through the lens 135 through the dichroic mirror 143 and reach the optical unit 144.
- the optical unit 144 for example, four dichroic mirrors are combined.
- the four dichroic mirrors reflect the fluorescence with wavelengths ⁇ F1 to ⁇ F3 and the transmitted light with wavelength ⁇ E4 toward the detector 162 at slightly different angles.
- the fluorescence having the wavelengths ⁇ F1 to ⁇ F3 reflected by the optical unit 144 and the transmitted light having the wavelength ⁇ E4 are collected by the lens 137 and reach different positions on the light receiving surface of the detector 162.
- the lens 137 may be selected and arranged from a plurality of lenses for changing the magnification of the particle image on the light receiving surface.
- the detector 162 includes a plurality of photoelectric conversion elements on the light receiving surface. Each of the plurality of photoelectric conversion elements converts fluorescence and transmitted light into an electric signal. The sensitivity of each of the plurality of photoelectric conversion elements can be adjusted.
- the detector 162 is, for example, a TDI imaging device, and includes a CCD array as a photoelectric conversion element array.
- the detector 162 receives information on the value of the flow velocity of the particles flowing through the flow cell 10 from the control unit 300 shown in FIG.
- the detector 162 shown in FIG. 2 synchronizes the scan speed (charge transfer speed) in the CCD array with the received flow velocity value, and three fluorescence images corresponding to the fluorescence of the wavelengths ⁇ F1 to ⁇ F3 and the wavelength ⁇ E4. And a bright field image corresponding to the transmitted light.
- the brightness of the fluorescence image is proportional to the strength of the electrical signal photoelectrically converted from fluorescence in the detector 162.
- the control unit 300 changes the liquid feeding condition of the liquid feeding unit 40.
- control unit 300 may change the detection condition of the detector 162 or change the emission condition of the light source 121.
- magnification condition of the lens 137 may be changed.
- the liquid feeding unit 40 can greatly change the flow velocity of the cells flowing inside the flow cell 10 by changing the liquid feeding conditions, but may not be suitable for finely changing the flow velocity. Therefore, the predetermined value of the difference between the flow speeds is set based on, for example, the minimum value of the change width of the flow speed that can be changed by the liquid supply unit 40 changing the liquid supply conditions.
- the luminance of the fluorescent image can be finely changed by changing each of the detection condition of the detector 162, the light emission condition of the light source 121, the magnification condition of the lens 137, etc., but the detection condition, the light emission condition, and Each of the magnification conditions may be difficult to change significantly. Therefore, the predetermined value of the difference between the flow velocities may be set based on, for example, the maximum value of the change width of the fluorescence image luminance that can be changed by changing the detection condition, the light emission condition, and the magnification condition. .
- Information indicating the reference value of the flow velocity and the predetermined value of the difference in flow velocity is stored in the memory provided in the control unit 300 or the storage device 351 connected to the control unit 300. Further, this information may be changed by an input from the user, for example.
- the liquid feeding conditions of the liquid feeding unit 40 include, for example, the amount of liquid fed per unit time for the sheath liquid feeding unit 40A to feed the sheath liquid to the flow cell 10 and the sample liquid feeding unit 40B for the sample liquid to the flow cell 10. Is the amount of liquid delivered per unit time.
- the pressure at which the sheath liquid feeding unit 40A sends the sheath liquid to the flow cell 10 and the pressure at which the sample liquid feeding unit 40B sends the sample liquid to the flow cell 10 may be used.
- the brightness of the fluorescence image is proportional to the strength of the electrical signal obtained by the detector 162, and the strength of the electrical signal obtained by the detector 162 is inversely proportional to the flow velocity of the liquid flowing inside the flow cell 10. Therefore, as shown in FIG.
- the luminance of the fluorescent image is inversely proportional to the flow velocity of the liquid flowing inside the flow cell 10.
- the flow rate of the liquid flowing through the flow cell 10 shown in FIG. 1 is proportional to the amount of liquid fed by the liquid feeding unit 40 or the pressure applied to the liquid.
- the control unit 300 sends the amount of sheath liquid to be fed by the sheath liquid feeding unit 40A to the flow cell 10, And the sample liquid feeding unit 40 ⁇ / b> B reduces the liquid feeding amount for feeding the sample liquid to the flow cell 10.
- the controller 300 sends the amount of the sheath liquid feeding unit 40A that sends the sheath liquid to the flow cell 10 and the sample liquid feeding.
- the liquid unit 40 ⁇ / b> B increases the amount of liquid that is sent to the flow cell 10.
- the control unit 300 changes the amount of liquid that the sheath liquid feeding unit 40A sends the sheath liquid to the flow cell 10, and the amount of liquid that the sample liquid feeding unit 40B sends the sample liquid to the flow cell 10 is as follows. It does not have to be changed.
- the flow velocity v of the sheath liquid is ( It is approximated by equation 3).
- v (2gh) 1/2 (3)
- g represents a gravitational acceleration.
- h indicates a difference in height between the liquid level of the sheath liquid in the chamber 41 and the open end of the waste liquid channel 55. Therefore, when the liquid level of the sheath liquid in the chamber 41 is lowered, the difference h in height in the equation (3) is reduced, so that the flow velocity v of the sheath liquid is lowered.
- the sheath liquid feeding unit 40A feeds the sheath liquid to the flow cell 10 based on the calculated measurement value of the flow velocity, and the sample liquid feeding unit.
- the amount of liquid that 40B delivers the sample liquid to the flow cell 10 is feedback controlled. Therefore, even if the liquid level of the sheath liquid in the chamber 41 changes or the viscosity of the sheath liquid changes, the flow rate of the cells flowing in the flow cell 10 is brought close to the reference value of the flow rate, and the brightness of the fluorescent image is increased. Can be brought close to an appropriate value and fluctuations in luminance can be suppressed.
- the detection condition of the detector 162 shown in FIG. 1 is, for example, the sensitivity of the photoelectric conversion element provided in the detector 162.
- the luminance of the fluorescent image is proportional to the sensitivity of the photoelectric conversion element. Therefore, for example, when the measured value of the flow velocity is larger than the reference value of the flow velocity and the difference is smaller than a predetermined value, the control unit 300 illustrated in FIG. 1 increases the sensitivity of the photoelectric conversion element included in the detector 162. When the measured value of the flow velocity is smaller than the reference value of the flow velocity and the difference is smaller than a predetermined value, the control unit 300 decreases the sensitivity of the photoelectric conversion element of the detector 162. By such control, the control unit 300 brings the luminance of the fluorescent image closer to an appropriate value and suppresses the variation in luminance.
- the light emission condition of the light source 121 is, for example, the intensity of light emitted from the light source 121.
- the luminance of the fluorescent image is proportional to the intensity of light emitted from the light source 121. Therefore, for example, when the measured value of the flow velocity is larger than the reference value of the flow velocity and the difference is smaller than a predetermined value, the control unit 300 increases the intensity of light emitted from the light source 121. When the measured value of the flow velocity is smaller than the reference value of the flow velocity and the difference is smaller than a predetermined value, the control unit 300 reduces the intensity of light emitted from the light source 121. By such control, the control unit 300 brings the luminance of the fluorescent image closer to an appropriate value and suppresses the variation in luminance.
- the magnification condition of the lens 137 is, for example, the magnification of the image of the particle that the lens 137 forms on the light receiving surface of the detector 162.
- the brightness of the fluorescent image is inversely proportional to the magnification of the particle image formed by the lens 137. Therefore, for example, when the measured value of the flow velocity is larger than the reference value of the flow velocity and the difference is smaller than a predetermined value, the control unit 300 reduces the magnification of the particle image formed by the lens 137 by replacing the lens 137.
- the control unit 300 increases the magnification of the particle image formed by the lens 137 by replacing the lens 137. By such control, the control unit 300 brings the luminance of the fluorescent image closer to an appropriate value and suppresses the variation in luminance.
- step S101 for starting the flow cytometer step S102 for instructing the flow cytometer to analyze
- step S103 for starting liquid feeding into the flow cell 10
- step S104 for acquiring information related to the flow velocity of the liquid flowing inside the flow cell 10
- Step S105 for determining information related to the acquired flow velocity
- Step S106 for changing the liquid supply condition for supplying the liquid into the flow cell 10
- Step S107 is included for detecting light generated from particles in the liquid irradiated with the internal light.
- step S101 in FIG. 7 the flow cytometer according to the embodiment is activated.
- step S102 the flow cytometer is instructed to start particle analysis.
- step S103 the sheath liquid feeding unit 40A shown in FIG. 1 starts feeding the sheath liquid to the flow cell 10 with a predetermined liquid feeding amount, and the sample liquid feeding unit 40B contains the sample liquid containing particles in the flow cell 10. Starts to be fed in a predetermined amount.
- step S104 the light source 121A shown in FIG. 2 irradiates the particles flowing through the flow cell 10 with light, and the flow velocity detector 161 detects the light modulated by the optical grating 151 of the scattered light generated from the particles.
- the control unit 300 shown in FIG. 1 calculates a measured value of the flow velocity as a value related to the flow velocity based on the period of the modulated light. Note that step S104 may be started simultaneously with step S103.
- step S105 the control unit 300 calculates a measured value of the flow velocity.
- the control unit 300 reads the reference value of the flow velocity from the memory or the storage device 351.
- the control unit 300 calculates the difference between the measured value of the flow velocity of the particles and the reference value of the flow velocity.
- step S107 when the difference between the measured value of the flow velocity of the particles and the reference value of the flow velocity is larger than a predetermined value, the control unit 300 changes the liquid feeding condition of the liquid feeding unit 40.
- the control unit 300 changes the detection condition of the detector 162.
- the control unit 300 may change the light emission condition of the light source 121 or may change the magnification condition of the lens 137.
- step S201 in FIG. 8 the control unit 300 determines whether the difference between the measured value of the flow velocity of particles and the reference value of the flow velocity is greater than a predetermined value.
- the process proceeds to step S202, and the control unit 300 determines whether the measured value of the flow velocity is greater than the reference value.
- the process proceeds to step S203, and the liquid feeding unit 40 controls the liquid feeding unit 40 so that the difference approaches zero under the control of the control unit 300. Reduce the amount. Thereafter, the process returns to step S105 in FIG.
- step S204 the liquid feeding unit 40 is controlled by the control unit 300.
- the amount of liquid delivery is increased so that the difference approaches zero. Thereafter, the process returns to step S105 in FIG.
- step S201 in FIG. 8 When it is determined in step S201 in FIG. 8 that the difference between the measured value of the flow velocity of the particle and the reference value of the flow velocity is not greater than a predetermined value, the process proceeds to step S301 in FIG. 9, and the control unit 300 measures the flow velocity. It is determined whether the value is larger than the reference value. When it is determined that the difference is smaller than the predetermined value and the measured value is larger than the reference value, the process proceeds to step S302, and the control unit 300 detects the detector 162 so that the luminance of the fluorescent image approaches the appropriate value. Change the condition. The control unit 300 may change the light emission condition of the light source 121 or may change the magnification condition of the lens 137.
- step S303 When it is determined in steps S201 and S301 that the difference is smaller than the predetermined value and the measured value is smaller than the reference value, the process proceeds to step S303, and the control unit 300 causes the luminance of the fluorescent image to approach an appropriate value.
- the detection condition of the detector 162 is changed.
- the control unit 300 may change the light emission condition of the light source 121 or may change the magnification condition of the lens 137.
- step S107 the detector 162 generates a fluorescent image of the particles.
- the analysis is completed.
- the flow velocity of the liquid flowing inside the flow cell 10 is the temperature, the temperature of the apparatus, the temperature of the liquid, the viscosity of the liquid, the change in the liquid level of the liquid in the supply chamber, and the like. Even if it fluctuates due to the influence of the above, it is possible to suppress that the luminance of the fluorescent image is affected by the fluctuation of the flow velocity. Furthermore, even when the flow cytometer according to the embodiment is used, if the luminance of the fluorescent image varies, it can be determined that there has been a variation in the condition of fluorescent staining of the particles.
- the method of labeling cells as sample particles with a fluorescent dye is not limited to a method using a nucleic acid probe, and may be a method using a labeling reagent that utilizes antibody antigen reaction or interaction between proteins other than antibodies.
- the sample particles may be microorganisms.
- scattered light is used as reaction light generated from particles irradiated with light when measuring the flow velocity of particles.
- fluorescence may be used as the reaction light.
- the present invention includes various embodiments and the like not described herein.
- the present invention can be suitably used, for example, in the field of analysis of biological sample liquids containing particles such as cells and microorganisms.
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Abstract
粒子から生じる光の検出がフローセル内部を流れる液体の流速の変化の影響を受けにくいフローサイトメーターを提供する。フローサイトメーターは、内部を液体が流れるフローセル(10)と、フローセル(10)内部に液体を送液する送液ユニット(40)と、フローセル(10)内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部(300)と、フローセル(10)内部を流れる液体に光を照射する光源(121)と、光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出する検出器(162)と、を備え、制御部(300)が、取得した流速に関する情報に基づいて、送液ユニット(40)が送液条件を変更する。
Description
本発明は、フローサイトメーター及び粒子検出方法に関する。
細胞及び微生物等の粒子を含む生物サンプル液の解析に、フローサイトメーターが広く用いられている。フローサイトメーターでは、透明なフローセル内部を流れる生物サンプル液中の粒子から生じた光が検出される。フローセル内部においては、生物サンプル液等のサンプル液の流れと、シース液の流れとが層流をなしている。フローセル内部に粒子を一つずつ流すことにより、サンプル液中の粒子の一つ一つを光学的に解析することが可能である。
特許文献1は、フローセル内部の粒子に光を照射し、粒子から生じた光を光学格子で変調し、変調光の検出周期に基づいて、フローセル内部を流れる粒子の流速を算出することを開示している。算出された粒子の速度に、電荷結合素子(CCD)アレイにおける電荷転送タイミングを同期させて粒子を撮像することにより、明るく、SN比の高い粒子の画像を取得することが可能である。
フローセル内部を流れる粒子を光学的に検出する際には、フローセルに向けて照射された光を粒子が横切る時間が露光時間に該当する。そのため、フローセル内部を流れる粒子の速度が速ければ、粒子から生じる光の強度は低くなり、粒子から生じる光を検出する検出器から得られる信号も弱くなる。また、フローセル内部を流れる粒子の速度が遅ければ、粒子から生じる光の強度は強くなり、粒子から生じる光を検出する検出器から得られる信号も強くなる。このように、フローサイトメーターにおいて、検出器から得られる信号の強さは、粒子の流速に影響される。
しかし、検出器から得られる信号の強さが測定する粒子ごとに変化するのは、粒子の分析に影響を与えるため好ましくない。例えば、TDI(Time Delay Integration)方式で粒子の画像を撮像するフローサイトメーターにおいては、撮像された画像の輝度が流速に応じて変化してしまうため、粒子ごとに一定の明るさの画像を得ることが困難となる。本発明者らの知見によれば、フローセル内部を流れる液体の流速は、気温、装置の温度、液体の温度、液体の粘度、及び供給チャンバーにおける液体の液面の変化等に影響される。例えばフローセルの周囲の温度が15℃から30℃まで上昇すると、フローセルを流れる液体の粘度が低下し、フローセルを流れる液体の流速が、2μL/秒程度から7μL/秒程度まで上昇することもある。
本発明は、粒子から生じる光の検出がフローセル内部を流れる液体の流速の変化の影響を受けにくいフローサイトメーター及び粒子検出方法を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、内部を液体が流れるフローセル10と、フローセル10内部に液体を送液する送液ユニット40と、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部300と、フローセル10内部を流れる液体に光を照射する光源121と、光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出する検出器162と、を備え、制御部300が、流速に関する情報に基づいて、送液ユニット40の送液条件を変更する、フローサイトメーターが提供される。
上記のフローサイトメーターによれば、流速に関する情報に基づいて、制御部300が送液ユニット40の送液条件を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、制御部300が、取得した流速に関する情報に基づいて、検出器162の検出条件をさらに変更してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速に関する情報に基づいて、制御部300が検出器162の検出条件を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、制御部300が、取得した流速に関する情報に基づいて、送液ユニット40の送液条件又は検出器162の検出条件を選択的に変更してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速に関する情報に基づいて、送液ユニット40の送液条件又は検出器162の検出条件を選択的に変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、制御部300が、取得した流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より大きい場合、送液ユニット40の送液条件を変更し、取得した流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より小さい場合、検出器162の検出条件を変更してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速の測定値と流速の基準値との差分が大きい場合、送液ユニット40の送液条件を変更して流速を変化させ、流速を基準値に近づけることが可能である。また、流速の測定値と流速の基準値との差分が送液条件の変更では減らすことが困難であるほど小さい場合は、検出器162の検出条件を変更することによって、粒子の検出に対する流速の差分の影響を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、制御部300が、取得した流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より大きい場合、送液ユニット40のフローセル10に液体を送液する送液量を低下させ、取得した流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より大きい場合、送液ユニット40のフローセル10に液体を送液する送液量を上昇させてもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいて送液ユニット40のフローセル10に液体を送液する送液量を変化させることによって、流速を基準値に近づけることが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、検出器162が、フローセル10内部を流れる粒子から生じた光を光電変換する光電変換素子を備えていてもよい。制御部300が、取得した流速に関する情報に基づいて、検出器162の感度をさらに変更してもよい。制御部300が、取得した流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、検出器162の感度を上昇させ、取得した流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、検出器162の感度を低下させてもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいて検出器162の感度を変化させることによって、粒子から生じた光を検出する検出器162から得られる信号の強さの変動を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターが、光を照射された液体中の粒子から生じる光を集光するレンズ137をさらに備えていてもよい。制御部300が、取得した流速に関する情報に基づいて、レンズ137が形成する粒子の像の倍率をさらに変更してもよい。制御部300が、取得した流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、レンズ137が形成する粒子の像の倍率を低下させ、取得した流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、レンズ137が形成する粒子の像の倍率を上昇させてもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいて粒子の像の倍率を変化させることによって、粒子の像の光強度の変動を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、制御部300が、取得した流速に関する情報に基づいて、光源121が発する光の強度をさらに変更してもよい。制御部300が、取得した流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、光源121が発する光の強度を上昇させ、取得した流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、光源121が発する光の強度を低下させてもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいて光源121が発する光の強度を変化させることによって、粒子から生じる光の強度の変動を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、検出器162が、フローセル10内部を流れる粒子の画像を撮像してもよい。検出器162が、TDI(Time Delay Integration)方式によりフローセル10内部を流れる粒子の画像を撮像してもよい。検出器162が、取得した流速に関する情報に基づいて、スキャン速度を設定してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、例えば粒子が染色体の特定の遺伝子座を蛍光標識された細胞である場合に、細胞の蛍光画像の輝度に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、制御部300が、フローセル10内部を流れる粒子の光学特性に基づき、流速に関する情報を算出してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、フローセル10内部を流れる液体の流速を正確に算出することが可能である。
また、本発明の態様によれば、内部を液体が流れるフローセル10と、フローセル10内部に液体を送液する送液ユニット40と、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部300と、フローセル10内部を流れる液体に光を照射する光源121と、光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出する検出器162と、を備え、制御部300が、取得した流速に関する情報に基づいて、検出器162の感度を変更する、フローサイトメーターが提供される。
上記のフローサイトメーターによれば、流速に関する情報に基づいて、制御部300が検出器162の感度を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
また、本発明の態様によれば、内部を液体が流れるフローセル10と、フローセル10内部に液体を送液する送液ユニット40と、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部300と、フローセル10内部を流れる液体に光を照射する光源121と、光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出する検出器162と、を備え、制御部300が、取得した流速に関する情報に基づいて、光源121が発する光の強度を変更する、フローサイトメーターが提供される。
上記のフローサイトメーターによれば、流速に関する情報に基づいて、光源121が発する光の強度を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
さらに、本発明の態様によれば、フローセル10内部に液体を送液し、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得し、取得した流速に関する情報に基づいて、フローセル10内部に液体を送液するための送液条件を変更し、フローセル10内部を流れる液体に光を照射し、光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出する、粒子検出方法が提供される。
上記の粒子検出方法によれば、流速に関する情報に基づいて、フローセル10内部に液体を送液するための送液条件を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法において、取得した流速に関する情報に基づいて、粒子から生じた光を検出する検出条件をさらに変更してもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速に関する情報に基づいて、粒子から生じた光を検出する検出条件を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法において、取得した流速に関する情報に基づいて、送液条件又は検出条件を選択的に変更してもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速に関する情報に基づいて、送液条件又は検出条件を選択的に変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法において、取得した流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より大きい場合、送液条件を変更し、流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より小さい場合、検出条件を変更してもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速の測定値と流速の基準値との差分が大きい場合、フローセル10内部に液体を送液するための送液条件を変更して流速を変化させ、流速を基準値に近づけることが可能である。また、流速の測定値と流速の基準値との差分がフローセル10内部に液体を送液するための送液条件の変更では減らすことが困難であるほど小さい場合は、粒子から生じた光を検出するための条件を変更することによって、粒子の検出に対する流速の差分の影響を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法において、取得した流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より大きい場合、フローセル10に液体を送液する送液量を低下させ、取得した流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より大きい場合、フローセル10に液体を送液する送液量を上昇させてもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいてフローセル10に液体を送液する送液量を変化させることによって、流速を基準値に近づけることが可能である。
上記の粒子検出方法において、フローセル10内部を流れる液体中の粒子から生じた光を光電変換素子で光電変換してもよい。取得した流速に関する情報に基づいて、液体中の粒子から生じた光を検出するための検出器162の感度をさらに変更してもよい。取得した流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、光を検出するための検出器162の感度を上昇させ、流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、検出器162の感度を低下させてもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいて検出器162の感度を変化させることによって、粒子から生じた光を検出する検出器162から得られる信号の強さの変動を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法において、光を照射された液体中の粒子から生じる光をレンズ137で集光してもよい。取得した流速に関する情報に基づいて、レンズ137が形成する粒子の像の倍率をさらに変更してもよい。取得した流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、レンズが形成する粒子の像の倍率を低下させ、取得した流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、レンズが形成する粒子の像の倍率を上昇させてもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいて粒子の像の倍率を変化させることによって、粒子の像の光強度の変動を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法において、取得した流速に関する情報に基づいて、フローセル10内部に照射される光の強度をさらに変更してもよい。流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、フローセル10内部に照射される光の強度を上昇させ、流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、フローセル10に照射される光の強度を低下させてもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速の測定値と流速の基準値との差分のフィードバックに基づいてフローセル10に照射される光の強度を変化させることによって、粒子から生じる光の強度の変動を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法の粒子を検出することにおいて、フローセル10内部を流れる粒子の画像を撮像してもよい。TDI(Time Delay Integration)方式によりフローセル10内部を流れる粒子の画像を撮像してもよい。取得した流速に関する情報に基づいて、液体中の粒子から生じた光を検出するための検出器のスキャン速度を設定してもよい。
上記の粒子検出方法によれば、例えば粒子が染色体の特定の遺伝子座を蛍光標識された細胞である場合に、細胞の蛍光画像の輝度に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
上記の粒子検出方法において、フローセル10内部を流れる粒子の光学特性に基づき、流速に関する情報を算出してもよい。
上記の粒子検出方法によれば、フローセル10内部を流れる液体の流速を正確に測定することが可能である。
また、本発明の態様によれば、フローセル10内部に液体を送液し、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得し、フローセル10内部を流れる液体に光を照射し、光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出し、取得した流速に関する情報に基づいて、液体中の粒子から生じた光を検出するための検出器162の感度を変更する、粒子検出方法が提供される。
上記の粒子検出方法によれば、流速に関する情報に基づいて、検出器162の感度を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
また、本発明の態様によれば、フローセル10内部に液体を送液し、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得し、フローセル10内部を流れる液体に光を照射し、光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出し、取得した流速に関する情報に基づいて、フローセル10内部に照射される光の強度を変更する、粒子検出方法が提供される。
上記の粒子検出方法によれば、流速に関する情報に基づいて、フローセル10内部に照射される光の強度を変更することにより、粒子の検出に対する流速の変化の影響を抑制することが可能である。
本発明によれば、粒子から生じる光の検出がフローセル内部を流れる液体の流速の変化の影響を受けにくいフローサイトメーター及び粒子検出方法を提供可能である。
以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。
以下に示す実施形態は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法(FISH法)における蛍光検出に本発明を適用したものである。FISH法の前処理においては、細胞の染色体内に存在する標的配列に、標的配列と相補的な配列を有する核酸配列を含み、蛍光色素により標識されたプローブがハイブリダイズされる。染色体は、標的配列ごとに異なる蛍光色素で標識された複数のプローブで処理されてもよい。例えば、染色体において標的配列を含む遺伝子の転座が生じると、染色体上において蛍光の輝点が観察される位置が正常な位置から変化する。そのため、FISH法によって、転座を検出することが可能である。また、FISH法によれば、転座のみならず、欠失、逆位、及び重複等の染色体異常を検出可能である。
実施形態に係るフローサイトメーターは、図1に示すように、内部を液体が流れるフローセル10と、フローセル10内部に液体を送液する送液ユニット40と、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部300と、フローセル10内部を流れる液体に光を照射する光源121と、光を照射された液体中の粒子を検出する検出器162と、を備える。実施形態に係るフローサイトメーターにおいては、制御部300が、流速に関する情報に基づいて、送液ユニット40の送液条件を変更する。制御部300は、中央演算処理装置(CPU)により構成される。
送液ユニット40は、シース液をフローセル10に送液するシース液送液ユニット40A、及び粒子を含むサンプル液をフローセル10に送液するサンプル液送液ユニット40Bを含む。
シース液送液ユニット40Aは、シース液を格納するチャンバー41、電気制御信号を受けてチャンバー41に気圧を与える電空変換器42、及び電空変換器42の気圧源であるコンプレッサー43を備える。電空変換器42は、入力された電気信号(電流又は電圧)に基づいて排出する空気圧を調整することが可能な素子である。気圧がチャンバー41内に加えられると、チャンバー41内のシース液が、シース液流路54を介して、フローセル10に送液される。なお、シース液送液ユニット40Aは、シリンジポンプであってもよいし、ダイヤフラムポンプであってもよい。
サンプル液送液ユニット40Bは、例えば、シリンジ21、シリンジ21に挿入されたプランジャー及びピストン等の作動子22、及び作動子22を移動させるモーター等の駆動装置23を備える。駆動装置23が作動子22を押すと、サンプル液が、サンプル液流路53を介して、フローセル10に送液される。なお、サンプル液送液ユニット40Bは、ダイヤフラムポンプであってもよいし、コンプレッサー等の圧力原に接続された電空変換器で発せられる気圧を用いて、サンプル液を送液してもよい。
シース液送液ユニット40Aは、サンプル液送液ユニット40Bにもシース液を送液し、フローセル10内部において、シース液の圧力とサンプル液の圧力とを平衡にしてもよい。
サンプル液に含まれる粒子は、フローサイトメーターでその特性が解析されるサンプル粒子、及びフローセル10内部を流れる粒子の流速を監視するための参照粒子のいずれかである。本実施形態において、サンプル粒子は、複数のプローブで処理された細胞である。参照粒子は、サンプル粒子とは異なる粒子であり、例えば非生物粒子であり、ラテックス等の重合体や、無機物等からなる。参照粒子は、例えば、光を照射された場合に、サンプル粒子よりも強い散乱光を生じさせる光学特性を有する。サンプル粒子と参照粒子の両方を含むサンプル液がフローセル10に供給されてもよいし、サンプル粒子を含むサンプル液と参照粒子を含むサンプル液が別々にフローセル10に供給されてもよい。
フローセル10は、石英等の透明材料からなる。フローセル10内部において、サンプル液の流れと、シース液の流れとは層流を形成し、シース液の流れに取り囲まれるようにしてサンプル液が流れる。フローセル10を流れたサンプル液とシース液は、廃液流路55を経由して廃液流路55の端部から廃液チャンバー90内に放出される。例えば、廃液流路55の端部は、大気に接している。
図2に示すように、実施形態に係るフローサイトメーターは、フローセル10内部を流れる参照粒子の光学特性に基づき、粒子の流速を測定可能な光学系を備える。なお、図2において、フローセル10は断面で示されている。フローセル10内部を流れる参照粒子の流速を測定可能な光学系は、フローセル10に光を照射する光源121Aを備える。光源121Aとしては、レーザー及び発光ダイオード等が使用可能である。光源121Aから照射された光は、例えば、レンズ131によって集光され、ダイクロイックミラー141、142を透過してフローセル10に集光される。フローセル10内部を流れる参照粒子が、光が照射されると反応光としてミー散乱光を生じさせる光学特性を有する場合、光源121Aが発した光の波長と同じ波長を有する散乱光が粒子から生じる。散乱光は、例えばレンズ135で集光され、ダイクロイックミラー143で反射される。
ダイクロイックミラー143で反射される散乱光の光路には、光学格子151が配置されている。光学格子151は、図3に示すように、交互に配置された、複数の透明部分152a、152b、152c・・・と、複数の不透明部分153a、153b、153c・・・とを備える。複数の透明部分152a・・・と、複数の不透明部分153a・・・とのそれぞれは、例えば矩形状である。光学格子151のピッチは一定であり、複数の透明部分152a・・・と、複数の不透明部分153a・・・とのそれぞれの幅は、例えば、図2に示すフローセル10内部を流れる参照粒子の大きさに近似する。
フローセル10内部で光源121Aが発した光を参照粒子が横切ると、参照粒子から生じた散乱光は、図3に示す光学格子151の複数の透明部分152a・・・と、複数の不透明部分153a・・・とを交互に横切る。そのため、散乱光の強度は、光学格子151によって変調される。光学格子151で生じた散乱光の変調光は、図2に示すレンズ136で集光され、流速検出器161で検出される。流速検出器161としては、光電子増倍管及びフォトダイオード等の光電変換素子を備える光検出器が使用可能である。
流速検出器161が変調光を検出する周期は、フローセル10内部を流れる粒子の流速に比例する。流速検出器161は、図1に示す制御部300に接続されている。制御部300は、例えば、高速フーリエ変換(FFT)によって周期fを特定し、下記(1)式に基づいて、フローセル10内部を流れる粒子の流速vの測定値を流速に関する値として算出する。
v=fp (1)
(1)式において、pは光学格子151のピッチを表す。流速の値は、平均値であってもよい。平均値は、移動平均により算出されてもよい。
v=fp (1)
(1)式において、pは光学格子151のピッチを表す。流速の値は、平均値であってもよい。平均値は、移動平均により算出されてもよい。
なお、流速を測定する機器の構成は、上記に限定されない。例えば、フローセル10に照射された光のフローセル10内部における既知のビーム径をDB、参照粒子の既知の直径をDS、参照粒子がビーム径を横切った時に生じる蛍光のパルス幅をPWとして、下記(2)式に基づいて、フローセル10内部を流れる粒子の流速vを算出してもよい。
v=(DB+DS)/PW (2)
この場合、光学格子151は不要であり、制御部300は、流速検出器161が検出した反応光のパルス幅に基づいて、流速vを算出してもよい。
v=(DB+DS)/PW (2)
この場合、光学格子151は不要であり、制御部300は、流速検出器161が検出した反応光のパルス幅に基づいて、流速vを算出してもよい。
あるいは、流速を測定する機器は、少なくとも2つの粒子検出器を備えていてもよい。この場合、制御部300は、2つの粒子検出器の間の既知の距離と、上流側の粒子検出器で参照粒子が検出されてから下流側の粒子検出器で参照粒子が検出されるまでの時間に基づいて、粒子の流速vを算出してもよい。またあるいは、流速を測定する機器は、フローセル10の出口側に接続された流路に設けられた流量計を備えていてもよい。この場合、制御部300は、流量計が計測した流量と、フローセル10の口径と流路の口径の差等に基づき、粒子の流速vを算出してもよい。
実施形態に係るフローサイトメーターは、図2に示すように、フローセル10内部を流れる細胞の画像を撮像可能な光学系を備える。フローセル10内部を流れる細胞の画像を撮像可能な光学系は、上述した光源121Aに加えて、光源121B、121C、121Dをさらに備える。
光源121Aは、波長λE1の光を照射する。光源121Aは、照射する光の強度を調整可能である。光源121Aが照射した波長λE1の光で励起される蛍光色素で細胞内の標的配列が標識されていた場合、フローセル10内部を流れる細胞の標的配列を含む遺伝子座から波長λF1の蛍光が発せられる。波長λF1は、例えば、緑色の波長である。
光源121Bは、波長λE1と異なる波長λE2の光を照射する。光源121Bは、照射する光の強度を調整可能である。光源121Bが照射した光は、例えばレンズ132で集光され、ダイクロイックミラー141でフローセル10の方向に反射され、ダイクロイックミラー142を透過してフローセル10に到達する。光源121Bが照射した波長λE2の光で励起される蛍光色素で細胞内の標的配列が標識されていた場合、フローセル10内部を流れる細胞の標的配列を含む遺伝子座から波長λF2の蛍光が発せられる。波長λF2は、例えば、赤色の波長である。
光源121Cは、波長λE1~λE2と異なる波長λE3の光を照射する。光源121Cは、照射する光の強度を調整可能である。光源121Cが照射した光は、例えばレンズ133で集光され、ダイクロイックミラー142でフローセル10の方向に反射され、フローセル10に到達する。光源121Cが照射した波長λE3の光で励起される蛍光色素で細胞内の標的配列が標識されていた場合、フローセル10内部を流れる細胞の標的配列を含む遺伝子座から波長λF3の蛍光が発せられる。波長λF3は、例えば、青色の波長である。
光源121Dは、波長λE1~λE3と異なる波長λE4の光を照射する。光源121Dは、照射する光の強度を調整可能である。波長λE4の光は、例えば、可視光である。光源121Dが照射した光は、例えばレンズ134で集光され、フローセル10に到達する。波長λE4の光は、フローセル10内部の粒子を透過する。そのため、粒子において、波長λE4の透過光が生じる。
フローセル10内部の粒子から生じた波長λF1~λF3の蛍光と、波長λE4の透過光とは、レンズ135を経てダイクロイックミラー143を透過し、光学ユニット144に到達する。光学ユニット144においては、例えば、4枚のダイクロイックミラーが組み合わされている。4枚のダイクロイックミラーは、波長λF1~λF3の蛍光と、波長λE4の透過光とを、互いにわずかに異なる角度で検出器162に向けて反射する。光学ユニット144で反射された波長λF1~λF3の蛍光と、波長λE4の透過光とは、レンズ137で集光され、検出器162の受光面の異なる位置に到達する。レンズ137は、受光面における粒子の像の倍率を変更するための複数のレンズから選択されて配置されてもよい。検出器162は、受光面に、複数の光電変換素子を備える。複数の光電変換素子のそれぞれは、蛍光及び透過光を電気信号に変換する。複数の光電変換素子のそれぞれは、感度を調整可能である。
検出器162は、例えば、TDI撮像装置であり、光電変換素子アレイとしてCCDアレイを備える。検出器162は、図1に示す制御部300から、フローセル10内部を流れる粒子の流速の値の情報を受け取る。図2に示す検出器162は、受け取った流速の値にCCDアレイにおけるスキャン速度(電荷転送速度)を同期させて、波長λF1~λF3の蛍光に対応する3つの蛍光画像と、波長λE4の透過光に対応する明視野画像とを生成する。蛍光画像の輝度は、検出器162において蛍光から光電変換された電気信号の強さに比例する。
図1に示す制御部300は、粒子の流速の測定値と、流速の基準値との差分の絶対値を算出する。流速の基準値は、例えば、撮像された蛍光の輝度が適切な所定の値になる流速に基づいて設定される。なお、本開示においては、「差分の絶対値」を単に「差分」と呼ぶ。粒子の流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より大きい場合、制御部300は、送液ユニット40の送液条件を変更する。粒子の流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より小さい場合、制御部300は、検出器162の検出条件を変更してもよいし、光源121の発光条件を変更してもよいし、及びレンズ137の倍率条件を変更してもよい。
送液ユニット40は、送液条件を変更することにより、フローセル10内部を流れる細胞の流速を大きく変更することができるが、流速を細かく変更するには適していない場合がある。そのため、流速の差分の所定の値は、例えば、送液ユニット40が送液条件を変更することによって変更することができる流速の変化幅の最小値に基づいて設定される。
また、検出器162の検出条件、光源121の発光条件、及びレンズ137の倍率条件等のそれぞれを変更することにより、細かく蛍光画像の輝度を変更することができるが、検出条件、発光条件、及び倍率条件のそれぞれは大きく変更することが困難である場合がある。そのため、流速の差分の所定の値は、例えば、検出条件、発光条件、及び倍率条件を変更することによって変更することができる蛍光画像の輝度の変化幅の最大値に基づいて設定されてもよい。
流速の基準値及び流速の差分の所定の値を示す情報は、制御部300が備えるメモリや、制御部300に接続された記憶装置351に保存されている。また、この情報は、例えば、ユーザからの入力により変更されてもよい。
送液ユニット40の送液条件とは、例えば、シース液送液ユニット40Aがフローセル10にシース液を送液する単位時間あたりの送液量、及びサンプル液送液ユニット40Bがフローセル10にサンプル液を送液する単位時間あたりの送液量である。または、シース液送液ユニット40Aがフローセル10にシース液を送液する圧力、及びサンプル液送液ユニット40Bがフローセル10にサンプル液を送液する圧力であってもよい。蛍光画像の輝度は、検出器162で得られる電気信号の強さに比例し、検出器162で得られる電気信号の強さは、フローセル10内部を流れる液体の流速に反比例する。したがって、図4に示すように、蛍光画像の輝度は、フローセル10内部を流れる液体の流速に反比例する。図1に示すフローセル10内部を流れる液体の流速は、送液ユニット40が送液する送液量、または液体に加えられる圧力に比例する。
そのため、例えば、流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より大きい場合、制御部300は、シース液送液ユニット40Aがフローセル10にシース液を送液する送液量、及びサンプル液送液ユニット40Bがフローセル10にサンプル液を送液する送液量を低下させる。流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より大きい場合、制御部300は、シース液送液ユニット40Aがフローセル10にシース液を送液する送液量、及びサンプル液送液ユニット40Bがフローセル10にサンプル液を送液する送液量を上昇させる。このような制御により、制御部300は、フローセル10内部を流れる粒子の流速を基準値に近づけて、蛍光画像の輝度を適切な値に近づけ、輝度の変動を抑制する。
通常、シース液の流量はサンプル液の流量よりも多いため、サンプル液に含まれる粒子の流速に与える影響は、サンプル液を送液する送液量より、シース液を送液する送液量のほうが支配的になる。したがって、制御部300は、シース液送液ユニット40Aがフローセル10にシース液を送液する送液量を変更させ、サンプル液送液ユニット40Bがフローセル10にサンプル液を送液する送液量は変更させなくてもよい。
シース液及びサンプル液のうちシース液のみに着目し、チャンバー41内のシース液に加えられる圧力が一定であり、シース液の粘度が一定であると仮定すると、シース液の流速vは、下記(3)式で近似される。
v=(2gh)1/2 (3)
ここで、gは重力加速度を示す。hは、図5に示すように、チャンバー41内のシース液の液面と廃液流路55の解放端との間の高さの差分を示す。したがって、チャンバー41内のシース液の液面が低下すると、(3)式において高さの差分hが減少するため、シース液の流速vが低下する。これは、図5に示すように、チャンバー41内のシース液の液面が廃液流路55の解放端より高い位置にある場合であっても、図6に示すように、チャンバー41内のシース液の液面が廃液流路55の解放端より低い位置にある場合であっても同じである。また、上記(3)式では、シース液の粘度が一定であると仮定したが、シース液の粘度が温度の変化等に伴って変化しても、シース液の流速vは変化し得る。
v=(2gh)1/2 (3)
ここで、gは重力加速度を示す。hは、図5に示すように、チャンバー41内のシース液の液面と廃液流路55の解放端との間の高さの差分を示す。したがって、チャンバー41内のシース液の液面が低下すると、(3)式において高さの差分hが減少するため、シース液の流速vが低下する。これは、図5に示すように、チャンバー41内のシース液の液面が廃液流路55の解放端より高い位置にある場合であっても、図6に示すように、チャンバー41内のシース液の液面が廃液流路55の解放端より低い位置にある場合であっても同じである。また、上記(3)式では、シース液の粘度が一定であると仮定したが、シース液の粘度が温度の変化等に伴って変化しても、シース液の流速vは変化し得る。
これに対し、実施形態に係るフローサイトメーターにおいては、算出された流速の測定値に基づき、シース液送液ユニット40Aがフローセル10にシース液を送液する送液量、及びサンプル液送液ユニット40Bがフローセル10にサンプル液を送液する送液量がフィードバック制御される。そのため、チャンバー41内のシース液の液面が変動したり、シース液の粘度が変化したりしても、フローセル10内部を流れる細胞の流速を、流速の基準値に近づけて、蛍光画像の輝度を適切な値に近づけ、輝度の変動を抑制することが可能である。
図1に示す検出器162の検出条件とは、例えば、検出器162が備える光電変換素子の感度である。蛍光画像の輝度は、光電変換素子の感度に比例する。そのため、例えば、流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、図1に示す制御部300は、検出器162が備える光電変換素子の感度を上昇させる。流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、制御部300は、検出器162の光電変換素子の感度を低下させる。このような制御により、制御部300は、蛍光画像の輝度を適切な値に近づけ、輝度の変動を抑制する。
光源121の発光条件とは、例えば、光源121が発する光の強度である。蛍光画像の輝度は、光源121が発する光の強度に比例する。そのため、例えば、流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、制御部300は、光源121が発する光の強度を上昇させる。流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、制御部300は、光源121が発する光の強度を低下させる。このような制御により、制御部300は、蛍光画像の輝度を適切な値に近づけ、輝度の変動を抑制する。
レンズ137の倍率条件とは、例えば、レンズ137が検出器162の受光面上に形成する粒子の像の倍率である。蛍光画像の輝度は、レンズ137が形成する粒子の像の倍率に反比例する。そのため、例えば、流速の測定値が流速の基準値より大きく、差分が所定の値より小さい場合、制御部300は、レンズ137を交換することにより、レンズ137が形成する粒子の像の倍率を低下させる。流速の測定値が流速の基準値より小さく、差分が所定の値より小さい場合、制御部300は、レンズ137を交換することにより、レンズ137が形成する粒子の像の倍率を上昇させる。このような制御により、制御部300は、蛍光画像の輝度を適切な値に近づけ、輝度の変動を抑制する。
次に図7、図8及び図9を参照して実施形態に係る粒子検出方法を説明する。図7に示すように、実施形態に係る粒子検出方法は、フローサイトメーターを起動するステップS101、フローサイトメーターに解析を指示するステップS102、フローセル10内部に液体の送液を開始するステップS103、フローセル10内部を流れる液体の流速に関する情報を取得するステップS104、取得した流速に関する情報を判定するステップS105、フローセル10内部に液体を送液するための送液条件を変更するステップS106、及びフローセル10内部の光を照射された液体中の粒子から生じた光を検出するステップS107を含む。
図7のステップS101で、実施形態に係るフローサイトメーターが起動される。ステップS102で、フローサイトメーターに粒子の解析の開始が指示される。ステップS103で、図1に示すシース液送液ユニット40Aがフローセル10にシース液を所定の送液量で送液することを開始し、サンプル液送液ユニット40Bがフローセル10に粒子を含むサンプル液を所定の送液量で送液することを開始する。ステップS104で、図2に示す光源121Aはフローセル10内部を流れる粒子に光を照射し、流速検出器161は、粒子から生じた散乱光の光学格子151による変調光を検出する。図1に示す制御部300は、変調光の周期に基づいて、流速に関する値として流速の測定値を算出する。なお、ステップS104はステップS103と同時に開始されてもよい。
ステップS105で、制御部300は、流速の測定値を算出する。また、制御部300は、メモリや記憶装置351から、流速の基準値を読み出す。次に、制御部300は、粒子の流速の測定値と流速の基準値の差分を算出する。ステップS107で、粒子の流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より大きい場合、制御部300は、送液ユニット40の送液条件を変更する。粒子の流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より小さい場合、制御部300は、検出器162の検出条件を変更する。制御部300は、光源121の発光条件を変更してもよいし、レンズ137の倍率条件を変更してもよい。
具体的には、図8のステップS201で、制御部300は、粒子の流速の測定値と流速の基準値の差分が、所定の値より大きいか判定する。差分が所定の値より大きいと判定された場合、ステップS202に進み、制御部300は、流速の測定値が基準値より大きいか判定する。差分が所定の値より大きく、かつ、測定値が基準値より大きいと判定された場合、ステップS203に進み、制御部300の制御により、送液ユニット40は、差分がゼロに近づくよう、送液量を低下させる。その後、図7のステップS105に戻る。図8のステップS201及びS202で、差分が所定の値より大きく、かつ、測定値が基準値より小さいと判定された場合、ステップS204に進み、制御部300の制御により、送液ユニット40は、差分がゼロに近づくよう、送液量を上昇させる。その後、図7のステップS105に戻る。
図8のステップS201で、粒子の流速の測定値と流速の基準値の差分が、所定の値より大きくないと判定された場合、図9のステップS301に進み、制御部300は、流速の測定値は基準値より大きいか判定する。差分が所定の値より小さく、かつ、測定値が基準値より大きいと判定された場合、ステップS302に進み、制御部300は、蛍光画像の輝度を適切な値に近づくよう、検出器162の検出条件を変更する。制御部300は、光源121の発光条件を変更してもよいし、レンズ137の倍率条件を変更してもよい。ステップS201及びS301で、差分が所定の値より小さく、かつ、測定値が基準値より小さいと判定された場合、ステップS303に進み、制御部300は、蛍光画像の輝度を適切な値に近づくよう、検出器162の検出条件を変更する。制御部300は、光源121の発光条件を変更してもよいし、レンズ137の倍率条件を変更してもよい。
ステップS302又はステップS303で検出条件が変更された後、ステップS107で、検出器162は、粒子の蛍光画像を生成する。所定の量のサンプル液が解析されると、解析が終了する。
実施形態に係るフローサイトメーター及び粒子検出方法によれば、フローセル10内部を流れる液体の流速が、気温、装置の温度、液体の温度、液体の粘度、及び供給チャンバーにおける液体の液面の変化等の影響により変動しても、蛍光画像の輝度が、流速の変動に影響されることを抑制することが可能である。さらに、実施形態に係るフローサイトメーターを用いても蛍光画像の輝度が変動する場合は、粒子の蛍光染色の条件に変動があったと判断することも可能である。
また、フローサイトメーターにおいては、取得した粒子の画像を解析する際に、ノイズによる解析精度の低下を抑制するために、輝度の値が所定の値より弱い画像は、解析対象から除外する場合がある。これに対し、実施形態に係るフローサイトメーター及び粒子検出方法によれば、所望の輝度の画像が得られるため、解析対象から除外される画像の数を減らすことが可能である。そのため、解析対象となる画像の母集団が大きくなるため、粒子の正確な解析が可能である。
上記のように本発明を実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、サンプル粒子である細胞を蛍光色素で標識する方法は、核酸プローブを用いる方法に限定されず、抗体抗原反応や抗体以外のタンパク質間の相互作用を利用する標識試薬を用いる方法であってもよい。また、サンプル粒子は、微生物であってもよい。さらに、上記の実施形態において、粒子の流速を測定する際に、光を照射された粒子から生じる反応光として散乱光を用いる例を説明した。しかし、粒子が蛍光を発する光学特性を有する場合は、反応光として蛍光を用いてもよい。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を包含するということを理解すべきである。
本発明は、例えば、細胞及び微生物等の粒子を含む生物サンプル液の解析の分野において好適に利用できる。
10・・・フローセル、21・・・シリンジ、22・・・作動子、23・・・駆動装置、40・・・送液ユニット、40A・・・シース液送液ユニット、40B・・・サンプル液送液ユニット、41・・・チャンバー、42・・・電空変換器、43・・・コンプレッサー、53・・・サンプル液流路、54・・・シース液流路、55・・・廃液流路、90・・・廃液チャンバー、121・・・光源、121A・・・光源、121B・・・光源、121C・・・光源、121D・・・光源、131・・・レンズ、132・・・レンズ、133・・・レンズ、134・・・レンズ、135・・・レンズ、136・・・レンズ、137・・・レンズ、141・・・ダイクロイックミラー、142・・・ダイクロイックミラー、143・・・ダイクロイックミラー、144・・・光学ユニット、151・・・光学格子、152・・・透明部分、153・・・不透明部分、161・・・流速検出器、162・・・検出器、300・・・制御部、351・・・記憶装置
Claims (32)
- 内部を液体が流れるフローセルと、
前記フローセル内部に液体を送液する送液ユニットと、
前記フローセル内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部と、
前記フローセル内部を流れる液体に光を照射する光源と、
前記光を照射された前記液体中の粒子から生じた光を検出する検出器と、
を備え、
前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記送液ユニットの送液条件を変更する、
フローサイトメーター。 - 前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記検出器の検出条件をさらに変更する、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記送液ユニットの送液条件又は前記検出器の検出条件を選択的に変更する、請求項2に記載のフローサイトメーター。
- 前記制御部が、
取得した前記流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より大きい場合、前記送液ユニットの送液条件を変更し、
取得した前記流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より小さい場合、前記検出器の検出条件を変更する、
請求項2に記載のフローサイトメーター。 - 前記制御部が、
取得した前記流速の測定値が前記流速の基準値より大きく、前記差分が前記所定の値より大きい場合、前記送液ユニットの前記フローセルに液体を送液する送液量を低下させ、
取得した前記流速の測定値が前記流速の基準値より小さく、前記差分が前記所定の値より大きい場合、前記送液ユニットの前記フローセルに液体を送液する送液量を上昇させる、
請求項4に記載のフローサイトメーター。 - 前記検出器が、前記フローセル内部を流れる粒子から生じた光を光電変換する光電変換素子を備える、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記検出器の感度をさらに変更する、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 前記光を照射された前記液体中の粒子から生じる光を集光するレンズをさらに備える、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記レンズが形成する前記粒子の像の倍率をさらに変更する、請求項8に記載のフローサイトメーター。
- 前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記光源が発する光の強度をさらに変更する、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 前記検出器が、前記フローセル内部を流れる粒子の画像を撮像する、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 前記検出器が、TDI(Time Delay Integration)方式により前記フローセル内部を流れる粒子の画像を撮像する、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 前記検出器が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、スキャン速度を設定する、請求項12に記載のフローサイトメーター。
- 前記制御部が、前記フローセル内部を流れる粒子の光学特性に基づき、前記流速に関する情報を算出する、請求項1に記載のフローサイトメーター。
- 内部を液体が流れるフローセルと、
前記フローセル内部に液体を送液する送液ユニットと、
前記フローセル内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部と、
前記フローセル内部を流れる液体に光を照射する光源と、
前記光を照射された前記液体中の粒子から生じた光を検出する検出器と、
を備え、
前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記検出器の感度を変更する、
フローサイトメーター。 - 内部を液体が流れるフローセルと、
前記フローセル内部に液体を送液する送液ユニットと、
前記フローセル内部を流れる液体の流速に関する情報を取得する制御部と、
前記フローセル内部を流れる液体に光を照射する光源と、
前記光を照射された前記液体中の粒子から生じた光を検出する検出器と、
を備え、
前記制御部が、取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記光源が発する光の強度を変更する、
フローサイトメーター。 - フローセル内部に液体を送液し、
前記フローセル内部を流れる液体の流速に関する情報を取得し、
取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記フローセル内部に液体を送液するための送液条件を変更し、
前記フローセル内部を流れる液体に光を照射し、
前記光を照射された前記液体中の粒子から生じた光を検出する、
粒子検出方法。 - 取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記粒子から生じた光を検出する検出条件をさらに変更する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- 取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記送液条件又は前記検出条件を選択的に変更する、請求項18に記載の粒子検出方法。
- 取得した前記流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より大きい場合、前記送液条件を変更し、
取得した前記流速の測定値と流速の基準値との差分が所定の値より小さい場合、前記検出条件を変更する、
請求項18に記載の粒子検出方法。 - 取得した前記流速の測定値が前記流速の基準値より大きく、前記差分が前記所定の値より大きい場合、前記フローセル内部に液体を送液する送液量を低下させ、
取得した前記流速の測定値が前記流速の基準値より小さく、前記差分が前記所定の値より大きい場合、前記フローセル内部に液体を送液する送液量を上昇させる、
請求項20に記載の粒子検出方法。 - 前記液体中の粒子から生じた光を光電変換素子で光電変換する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- 取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記液体中の粒子から生じた光を検出するための検出器の感度をさらに変更する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- 前記光を照射された前記液体中の粒子から生じる光をレンズで集光する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- 取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記レンズが形成する前記粒子の像の倍率をさらに変更する、請求項24に記載の粒子検出方法。
- 取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記フローセル内部に照射される光の強度をさらに変更する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- 前記粒子から生じた光を検出することにおいて、前記フローセル内部を流れる粒子の画像を撮像する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- TDI(Time Delay Integration)方式により前記フローセル内部を流れる粒子の画像を撮像する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- 取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記液体中の粒子から生じた光を検出するための検出器のスキャン速度を設定する、請求項28に記載の粒子検出方法。
- 前記フローセル内部を流れる粒子の光学特性に基づき、前記流速に関する情報を算出する、請求項17に記載の粒子検出方法。
- フローセル内部に液体を送液し、
前記フローセル内部を流れる液体の流速に関する情報を取得し、
前記フローセル内部を流れる液体に光を照射し、
前記光を照射された前記液体中の粒子から生じた光を検出し、
取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記液体中の粒子から生じた光を検出するための検出器の感度を変更する、
粒子検出方法。 - フローセル内部に液体を送液し、
前記フローセル内部を流れる液体の流速に関する情報を取得し、
前記フローセル内部を流れる液体に光を照射し、
前記光を照射された前記液体中の粒子から生じた光を検出し、
取得した前記流速に関する情報に基づいて、前記フローセル内部に照射される光の強度を変更する、
粒子検出方法。
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