JP4303468B2 - 膜スカホールドタンパク質 - Google Patents

Description

【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０００年１１月２０日に出願された米国仮出願番号６０／２５２，２３３号の一部継続出願である。
【０００２】
（連邦研究支援の承認）
本発明は、少なくとも一部分、国立衛生研究所からの基金（認可番号Ｒ０１ＧＭ３１７５６、Ｒ０１ＧＭ３３７７５、ＧＭ６３５７４および５Ｆ３２ＧＭ１９０２４）でなされた。従って、合衆国政府は本発明において特定の権利をもつ。
【０００３】
（発明の背景）
本発明の分野は、分子生物学および膜技術を包含する。より詳細には、本発明は、人工膜スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）、これらをコードする配列、ベクターおよび組換え宿主細胞、これらの組換え生産のための方法、および繋がれたか、包埋膜タンパク質または内在性膜タンパク質のような、完全または部分的に疎水性のタンパク質を、これら膜タンパク質の生物学的活性を維持しながら、安定化、分散および可溶化するため、または膜フラグメントを安定化、分散および可溶化するための上記膜スカホールドタンパク質を用いる方法に関する。
【０００４】
数年前、本発明者らは、配向された様式での雲母上への合成高密度リポタンパク質ディスク（ｒＨＤＬ、アポＡ−Ｉ）への吸着を基礎にした、走査プローブ顕微鏡法による膜タンパク質の研究のための新しいシステムを開発した（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９７；Ｂａｙｂｕｒｔら、１９９８；Ｂａｙｂｕｒｔら、２０００；Ｃａｒｌｓｏｎら、２０００）。観察された円板状構造の直径は、５．５ナノメーターの高さをともなって約１０ｎｍである。観察されたこの５．５ｎｍ高さのトポロジーは、原子的に平坦な雲母表面上でエピタキシャルに配向した単膜二重層と最も適合している（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９７）。
【０００５】
精製された膜タンパク質は、特定のそのような円板状構造のホスホリピド二重層に再構築され、そして原子間力顕微鏡、または配向されたタンパク質−二重層アセンブリの表面を利用する分光学的技術による検査のいずれかのために、溶液中または次いで適切な表面上に吸着させて研究され得る。さらに、膜タンパク質を含む基礎となる円板状構造は、容易に認識され、そして試料の質を判定するための参照の点およびイメージを提供する。繋がれた膜タンパク質であるＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼが、ｒＨＤＬ二重層ディスク中に組み込まれ、そして物理的に研究された（Ｂａｙｂｕｒｔら、１９９８；Ｂａｙｂｕｒｔら、２０００）。このレダクターゼは、１０ｎｍ直径のｒＨＤＬディスク中に組み込まれ得、これらのディスクは、雲母上に吸着され得、そして二重層構造の頂部から突出するレダクターゼの触媒ドメインがイメージされ得る。この組み込まれた酵素は、このような表面上で活性であり、代謝回転数は、粒子状膜調製物で得られたのと一致する。力曲線分析を用い、このドメインの高さ、およびＡＦＭプローブの力の下のその圧縮性が推定された（Ｂａｙｂｕｒｔら、２０００）。二重層表面の上のこの分子の高さは、最近のＸ線結晶構造を基礎にした予想された高さに対応している（Ｗａｎｇら、１９９７）。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、本発明のＭＳＰ支持ナノスケール構造中に活性形態で組み込まれ得る。
【０００６】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、アポＡ−Ｉと称されるタンパク質成分および種々のホスホリピドのアセンブリである。ＨＤＬ粒子は、逆コレステロールトランスポートのための主要導管として作用することにより哺乳動物コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を演じている（ＦｉｅｌｄｉｎｇおよびＦｉｅｌｄｉｎｇ、１９９１）。コレステロールトランスポーターとしてのＨＤＬの機能は、ＨＤＬ−関連酵素レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ、またはＬＣＡＴの活性に依存し（Ｇｌｏｍｓｅｔ、１９６８；Ｊｏｎａｓ、１９９１）、これは、ＨＤＬリポタンパク質粒子中へのコレステロールエステルの挿入を媒介する。アポＡ−Ｉタンパク質の特定の部分は、この酵素の活性に必要である（Ｈｏｌｖｏｅｔら、１９９５）。さらに、アポＡ−Ｉタンパク質の一部分は、Ｎ末端の球状ドメイン中に存在し、そして細胞表面レセプターとの相互作用を担うと考えられている。ＨＤＬ粒子の１つの初期の形態は、染色された調製物の電子顕微鏡検査に基づく円板状のものであると仮定されている（Ｆｏｒｔｅら、１９７１）。本発明者らの実験室は、水性条件下の合成形態のＡＦＭ研究を用い、これを確認した。しかし、この形態は、インビボの循環において優勢な形態ではない。むしろ、このアポＡ−Ｉ構造は、球状形態を安定化するために進化したように見える。
【０００７】
ＨＤＬディスクの構造に対する２つの一般モデルが提案されている。１つのモデルは、湾曲するセグメント化されたαらせんロッドから構成される水平バンドまたは「ベルト」として、環状の二重層セクションを取り囲むアポＡ−Ｉタンパク質を有する（Ｗｌｏｄａｗｅｒら、１９７９）。他のモデルは、一連のαらせんセグメント中で、二重層のエッジを垂直に横切るタンパク質を有する（Ｂｏｇｕｓｋｉら、１９８６）。両方のモデルは、主に、間接的な実験証拠に基づいており、そしてそれらの間を区別する決定的な手段は出現していない。アポＡ−Ｉ遺伝子の配列分析は、このタンパク質が、ほぼ二重層の厚さと一致する、ほぼ２２アミノ酸長の一連のらせんに折り畳まれることを示唆する。このディスクにおけるらせんの配置が、コンピューターモデリング（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９７）および減衰総反射率赤外分光光度法測定（Ｗａｌｄら、１９９０）により推定されている。これらの努力は、これらのらせんが、アシル鎖にほぼ平行に横たわり、そして二重層の厚さよりわずかに短いことを示唆した。タンパク質および脂質のこの配置は、ピケットフェンスモデルと一致する。
【０００８】
ベルトモデルは、特定の電子顕微鏡法および中性子散乱データ（Ｗｌｏｄａｗｅｒら、１９７９）と一致し、ここでは、これららせんは、二重層ディスクのエッジのまわりを「ベルト」のように長軸方向に配置されている。二色法測定のために試料配向の新たな方法を用いるより最近の赤外分光光度法研究は、先の研究に比較して、ベルトモデルにより一致している（Ｗａｌｄら、１９９０；Ｋｏｐｐａｋａら、１９９９）。これまで、どのモデルが正確であるかに関し、たとえ、脂質なしで結晶化されたアポＡ−Ｉの低解像度ｘ線結晶構造が得られたとしても（Ｂｏｒｈａｎｉら、１９９７）、人を引き付ける直接的証拠はない。Ｎ末端が短縮化されたアポＡ−Ｉの低解像度結晶構造は、蹄鉄形状に折り曲げられ、そして組合せられて約１２５×８０×４０Åの環状凝集物を与える、４つのらせんロッドから構成されるテトラマー種を含む単位セルを示す。このベルト立体配置中のダイマー種は、円板状粒子を形成し得ることが示唆された。
【０００９】
逆コレステロール輸送サイクルおよびＨＤＬ粒子の成熟に関するデータに収集された情報は、アポＡ−Ｉタンパク質が、それを膜と自発的に相互作用させ、リポタンパク質粒子の形成を生じる特有の性質をもつことを示唆する。初期のアポＡ−Ｉ脂質結合事象が提案されているが（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９８）、二重層会合形態の円板状粒子への変換は不明のままである。利用可能な証拠は、脂質フリーのアポＡ−Ｉの安定化エネルギーはかなり低く、そして２つのコンフォーマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）間に平衡があることを示唆する（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＳｍａｌｌ、１９８６；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９８）。１つのコンフォーマーは、長いらせんロッドであり得、そして他は、ほぼ半分の長さのらせん「ヘアピン」構造であり得る。低い安定化エネルギーおよび立体構造可塑性は、アポＡ−Ｉが、それが脂質膜と遭遇するとき構造的に再組織化されるのを可能にし、それ故、膜およびタンパク質の両方において構造的変化が生じるに違いないことを可能にすることを促進し、別個のリポタンパク質粒子を生成することが示唆されている（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９８）。一旦これらの粒子が形成されると、アポＡ−Ｉは、なお、このリポタンパク質粒子の動力学的機能性に寄与する特定の立体構造変化を受け得る。これらの相互作用および変化のすべては、タンパク質−脂質界面で生じる。従って、アポＡ−Ｉそれ自身が、安定なナノメーターサイズのホスホリピド二重層を生成するために理想的であり得ると信じる理由はほとんどない。
【００１０】
合成ｒＨＤＬが、特定のタンパク質−脂質比、および脂質の相転移温度またはそれ以上の温度における、アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンリポソームとの相互作用に際して自発的に形成される（Ｊｏｎａｓ、１９８６）。アポＡ−Ｉとホスホリピドとの混合物の界面活性剤透析の方法をまた用いて粒子状構造を形成し、そして精製された膜タンパク質を組み込む方法が与えられる。形成される円板状粒子のサイズは、形成混合物のタンパク質対脂質の比に依存し、そして二重膜ドメインの直径を反映する（Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔｔｅら、１９８４；Ｗａｌｄら、１９９０）。従って、サイズのクラスが、ホスホリピドディクスの周において会合したアポＡ−Ｉ分子の数から生じる。これらのクラスは、ディスクあたりのアポＡ−Ｉタンパク質分子の化学量論について、ＬＰ１、ＬＰ２、ＬＰ３、およびＬＰ４と称される。これらのＬＰクラス内の可変サイズがまた、アポＡ−Ｉの立体構造における不均一性に起因して生じる。本発明の１つの局面は、この不均一性の原因となる構造を識別し、そしてそれをなくし単分散のディスク構造の集団を生成する能力に基づく。現在、１０ｎｍ直径より大きい均一粒子の形成は、２〜４個会合したアポＡ−Ｉ分子を含む種の混合物からの粒子の分離を必要とし、その一方、１０ｎｍ直径の粒子が、低アポＡ−Ｉ／ホスホリピド比における形成の間の主要形態てある。単一サイズクラスの純度、および高効率の膜タンパク質または膜フラグメント組み込みを得るための能力は、アポＡ−Ｉ構造の改変を必要とする。
【００１１】
異なる型の脂質凝集物が、精製された膜タンパク質の再構築および研究のために用いられており；これらは、膜分散物、界面活性剤ミセルおよびリポソームを含む。図１を参照のこと。生化学的および物理的研究のための精製された系は、いくつかの系では必ずしも固有ではない、安定性を必要とする。リポソームは、水性の内面を含む閉じた球状の二重層殻である。界面活性剤透析またはその他の方法によるリポソーム中への再構築は、代表的には、外部スペースおよび管腔スペースに対する、タンパク質のランダム配向を生じる。リガンドまたはタンパク質標的は、通常、親水性または荷電しているので、図１に示されるようなリポソーム二重層を通過し得ず、これはいくつかの例では有利ではない。リポソーム二重層の両側面は、バルク溶媒に接近可能ではないので、二重層の対向する側面上のドメイン間のカップリング効果は研究され得ない。リポソームはまた、凝集および融合する傾向があり、そして、通常、約１週間より長い期間、または停止した流れまたは激しい混合のような特定の物理的操作下では不安定である。規定された円筒型ポアサイズを通って押し出すことにより得られたリポソームのサイズは、一様の直径を示すよりむしろ、サイズ分布において多分散である。
【００１２】
リポソームはまた、光散乱、および二重層中に存在する膜タンパク質の凝集に起因する困難性を提示し得る。リポソームの表面領域は相対的に大きい（１０^５〜１０^８Å）。単一膜タンパク質をもつリポソームを得るために、大きな脂質／タンパク質モル比を必要とする。界面活性剤ミセルは、膜タンパク質の膜に包埋された部分との相互作用による膜タンパク質の可溶化を可能にし、そして使用容易である。界面活性剤ミセルは動的であり、そしてサブユニット解離を促進する構造的動揺を受け、そしてしばしば、希釈溶液中でタンパク質を取り扱う能力において困難性を提示する。しかし、過剰の界面活性剤ミセルが、非凝集かつ可溶性状態にあるタンパク質を維持するために必要である。界面活性剤はまた、温和な変性性であり得、そしてしばしばホスホリピド二重層系で見出される性質を維持しない。特定のホスホリピド種は、しばしば、タンパク質構造および機能を支持および調整するために必要である（Ｔｏｃａｎｎｅら、１９９４）。従って、界面活性剤可溶化膜タンパク質の構造、機能，および安定性は疑問であり得る。過剰の界面活性剤ミセルが必要であるので、タンパク質複合体は、タンパク質濃度および界面活性剤タンパク質比に依存して解離し得る。対照的に、本発明のＭＳＰナノ構造は、別個のサイズおよび組成のホスホリピド二重層模倣ドメイン、および単層リポソームより大きな安定性およびより小さな表面積を有して、構造的により頑丈である。このディスク構造は、二重層様界面活性剤の両側面への接近を可能にし、そしてまたリポソームの二重層構造のような二重層構造を提供する。
【００１３】
当該技術分野には、膜タンパク質およびその他の疎水性または部分的に疎水性であるタンパク質の、これらタンパク質のネイティブな活性および性質が保存されるような分散のための、安定で規定された組成物に対する長年求められた必要性がある。
【００１４】
（発明の要旨）
本明細書で用いられる膜スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）は、それ自身が、ホスホリピドおよびホスホリピド混合物と自己アセンブルするか、またはホスホリピドの非存在下でナノメーターサイズの膜二重層に自己アセンブルする人工タンパク質である。これらナノメーターサイズアセンブリのサブセットはね形状が円板状であり、そしてナノディスク（ｄｉｓｃ）またはナノディスク（ｄｉｓｋ）構造と呼ばれている。これらの「ナノスケール」粒子は、直径が、約５〜約５００ｎｍ、約５〜約１００ｎｍまたは約５〜約５０ｎｍであり得る。ホスホリピドおよびＭＳＰを含むこれらの構造は、正常膜の全体の二重膜構造を保存するが、これは、溶液中で可溶性であり、かつ種々の表面にアセンブルまたは固定され得る、システムを提供する。詳細に例示されるＭＳＰのアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号９、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２９、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５に与えられる。
【００１５】
本発明は、本発明のＭＳＰを用いて形成されるナノメータースケールホスホリピド二重層構造またはナノディスクの使用をさらに提供し、さらなる疎水性または部分的に疎水性のタンパク質分子の組み込みに有用である。これらのさらなるタンパク質は、例えば、界面活性剤の使用により可溶化され得、そしてこの可溶化されたタンパク質は、ホスホリピドとともにまたはなしでＭＳＰの溶液に添加され得、そしてこのナノスケール粒子は自己アセンブルし、その結果、ＭＳＰおよびさらなるタンパク質は、安定かつ可溶性粒子中に組み込まれる。次いで、任意の界面活性剤は、透析により除去され得る。これらのタンパク質は、生存する生物の種々の膜構造中に天然に見出され、ＭＳＰ支持ナノ二重層またはナノディスク中で可溶化され、そして標的タンパク質のネイティブ構造および活性は、これらのＭＳＰ支持構造中で保存される。疎水性または部分的に疎水性のタンパク質の他に、膜フラグメントまたは破壊された膜が、本発明のＭＳＰとアセンブルされ得る。
【００１６】
ＭＳＰ支持構造中に組み込まれた天然のタンパク質のネイティブな構造およびリガンド結合が維持されるように、ＭＳＰ支持二重層またはナノディスクを溶液中で用いるかまたは多数の表面に適用し得る。具体的に例示したように、ＭＳＰ支持構造体は、（例えば、表面プラズモン共鳴技術における使用のために）金表面に固定される。
【００１７】
本発明は、本発明の少なくとも１つのＭＳＰを含むナノスケールの脂質二重層またはナノディスクへの内在性膜タンパク質の組み込みのための方法に関する。３つのクラスの膜タンパク質（係留膜タンパク質、包埋膜タンパク質および内在性膜タンパク質）が、本発明の方法において用いられ得る。第一の膜タンパク質のクラスは、係留膜タンパク質である；このクラスは、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびヒト組織因子によって例示される。包埋膜タンパク質の例としては、ウサギの肝臓ミクロソーム由来のシトクロムＰ４５０ ２Ｂ４、ヒト肝臓ミクロソーム由来のシトクロムＰ４５０ ３Ａ４および昆虫ミクロソーム由来のシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１が挙げられるがこれらに限定されない。内在性膜タンパク質は、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ由来のバクテリオドロプシン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の５−ヒドロキシトリプタミン１Ａ Ｇタンパク質共役レセプターおよび他のＧタンパク質共役タンパク質レセプターを含むがこれらに限定されない、７ヘリックス膜貫通タンパク質によって例示される。各クラスの膜タンパク質のメンバーは、本発明のＭＳＰおよび方法を用いてナノスケールの構造体中に成功裏に組み込まれた。特に、細胞表面レセプター、特にＧタンパク質共役レセプターは、あるクラスの膜スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）から形成されたナノ二重層の二重層構造体中に組み込まれ得る。
【００１８】
本発明者らは、得られるナノスケールのリポタンパク質粒子における、より大きな安定性、サイズの均質性および有用な官能基のために、スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）を操作することによって、構造的技術、生化学的技術および薬学的技術において使用するためのナノディスクを開発した。これらの粒子は、（例えば、ヒドロゲル中または金バイオセンサ表面上で）ディスクの精製および物理的操作のためのタグを形成し得、そしてこれらは、迅速かつ再現性のあるアッセイおよび結晶化のための実体として役立ち得る。ナノ粒子および膜タンパク質のスカホールドは、生物工学、製薬産業ならびに基礎研究において有用である。さらに、本発明者らの知見および関連技術によって含まれない構造原理および機能原理は、分子レベルでのタンパク質と脂質二重層との相互作用の理解を促進する。
【００１９】
本発明の別の局面は、膜タンパク質を可溶化し得かつ機能的に安定な単分散リン脂質二重層会合形態で複合体を形成し得る、あるクラスの膜スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）に関する。さらに、このＭＳＰは、一重膜タンパク質の物理的操作の手段を提供する。ＭＳＰは、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉに倣ってモデル化され、これは、特定の条件下では、リン脂質と自己アセンブリして、１００Å〜２００Åの直径を有する円盤状構造を形成し得る（Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔｔｅら、１９８４）。他の両親媒性タンパク質もまた、出発点として役立ち得る。アポタンパク質Ａ−Ｉは既知であるが、これは、どのような一般的方法においても、完全に無関係な起源の係留膜タンパク質、包埋膜タンパク質および内在性膜タンパク質を可溶化および研究するためには用いられていない。本発明の特定の実施形態は、膜タンパク質の可溶化、操作および研究のための脂質結合ＭＳＰの使用である。
【００２０】
本発明はさらに、親分子の配列を変更することによって、遺伝子操作されたＭＳＰを用いてＭＳＰのサイズを膜粒子形成に関して最小にし、そして自己アセンブリナノ粒子の安定性および単分散性を増大させる、材料および方法を提供する。特に、本発明者らは、Ｇタンパク質共役レセプターの研究のためのＭＳＰを開発した。Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、哺乳動物細胞膜（ここでこれらはシグナル伝達要素として機能し、いくつかのクラスの生物活性リガンドに結合し、そして情報を細胞内機構に伝達する）における重要でかつ多様なクラスの薬学的標的である。本発明の人工ＭＳＰは、膜結合形態のＧＰＣＲを安定化および可溶化して、高処理能力スクリーニング適用における使用のための溶液中または固体支持体上での精製および操作、ならびに表面プラズモンバイオセンサおよび走査プローブ技術の表面上での精製および操作を可能にする。本発明の人工ＭＳＰを用いて、可溶性形態での組換え膜タンパク質の発現および精製を容易にし得る。
【００２１】
本発明の範囲内にはまた、ＭＳＰをコードする組換えＤＮＡ分子およびこれらの組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞（これは、ＭＳＰを生成するために用いられる）が存在する。これらの組換えＤＮＡ分子によってコードされるＭＳＰとしては、以下を含むがこれらに限定されないアミノ酸配列を含むＭＳＰが挙げられる：配列番号６、配列番号９、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２９、配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本願において使用される略語としては、以下が挙げられる：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｔ、Ｔｈｒ、スレオニン、Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｖ、Ｖａｌ、バリン；Ｋ、Ｌｙｓ、リジン；Ｗ、Ｔｒｙ、トリプトファン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン；ＭＳＰ、膜スカホールドタンパク質；ＤＰＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン；ＰＣ，ホスファチジルコリン；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＢＲ、バクテリオロドプシン。
【００２３】
最も単純な単細胞生物は、水性物質で満たされた中心領域ならびに種々の可溶性低分子および高分子からなる。二重層構造で配置されたリン脂質からなる膜が、この領域を囲んでいる。より複雑な生存細胞においては、膜によってまた囲まれた内部区画および構造が存在する。これらの膜構造内に包埋または会合した、多くのタンパク質分子が存在し、そしてこれらのいわゆる膜タンパク質は、しばしば、情報およびエネルギーの伝達および処理を含む細胞機能を決定するために、最も重要である。膜タンパク質を研究する際の最も大きな問題は、リン脂質二重層の内側が疎水性であり、そして膜タンパク質の包埋または係留された部分自体もまた疎水性であることである。これらの膜タンパク質をそれらのネイティブな膜環境から単離する際に、これらのタンパク質が不活性な凝集体を形成することを防止することが、非常に困難である。本発明は、それ自体ネイティブ様のリン脂質二重層である可溶性ナノ粒子を生成する方法を提供し、この中に、目的の疎水性タンパク質（標的タンパク質）が組み込まれて、標的タンパク質を可溶性の単分散実態として維持し得る。これは、膜タンパク質のような疎水性タンパク質を、ナノメートル規模の構造体に組み込むことによって、達成される。
【００２４】
膜スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）とは、本明細書中で使用される場合、リン脂質およびリン脂質混合物をナノメートルサイズの膜二重層に自己アセンブリさせる、人工タンパク質である。これらのナノメートルサイズのアセンブリのサブセットは、形状が円盤状であり、そしてナノディスクまたはナノディスク構造と称される。これらの構造は、通常の膜の二重層構造全体を保存するが、溶液中に可溶であり、かつ種々の表面にアセンブリまたは固定され得る系を提供する。
【００２５】
本発明のＭＳＰは、両親媒性でなければならず、この構造の一部が、多少親水性であり、そして水性溶媒に面し、そして他の部分が、多少疎水性であり、そして安定化されるべき疎水性二重層の中心に面する。基本的な生化学的文献の調査により、この必要な両親媒性特徴を有するタンパク質構造の２つの候補が明らかとなる：αヘリックスおよびβシート。文献中には、βシートが折り畳まれて、「内側」が疎水性でありそして「外側」が親水性である構造を作製し得る例が存在するが、これらの構造の最も単純なものにおいて、このように形成される中心キャビティは小さい。このような小さな内部領域は、リン脂質二重層を安定化させ得るが、この大きさは、任意の所望の膜タンパク質標的を組み込むためには小さすぎる。従って、本発明者らは、本発明のＭＳＰを、基本的な両親媒性構築ブロックとしてαヘリックスを有するように設計した。各ＭＳＰは、より疎水性の残基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＷまたはＹ）を優先的にヘリックスの片面に有し、そしてより極性のまたは荷電した残基（Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、ＫまたはＲ）を、このヘリックスの他方の面に有する、両親媒性αヘリックスを形成するアミノ酸配列を有する。概略的表現については、図２を参照のこと。さらに、この螺旋構造は、約２０〜２５アミノ酸ごとにプロリン残基（Ｐ）で終止して、「ねじれ」を形成するか、またはターンを開始して、円盤状のリン脂質二重層の縁部の周囲でのＭＳＰの「巻き込み」を容易にする。図２を参照のこと。図２は、一般化された線型アミノ酸配列および螺旋状ホイール図を示し、このヘリックスの片側における、疎水性アミノ酸の優先的な配置を示す。正確なアミノ酸配列は、設計された線型配列における疎水性アミノ酸の位置および数が変化し得る。いずれかの螺旋軸が、ナノディスク二重層の垂線に対して平行または垂直のいずれかである、単純なモデルが作製され得る；図３Ａおよび３Ｂを参照のこと。およそ１０ｎｍの直径を有するディスクを作製するためには、ＭＳＰは、この一般化された両親媒性配列を有する、約１２〜約２０以上の繰り返し単位を含む。好ましくは、このタンパク質は、両親媒性αヘリックスからなり、このヘリックスの各々が、１４アミノ酸と２５アミノ酸との間の長さを有し、ヘリックス形成のために折り畳み不可能な残基（例えば、プロリン）によって線状配列で終止し、これは、脂質二重層の疎水性コアを安定化させる、小さな螺旋構築ブロックを形成する。これらの小さな螺旋セグメントは、約１〜約５のアミノ酸残基で、一緒に結合される。１０ｎｍの円盤粒子の縁部を、与えられる「ベルト」モデルまたは「ピケットフェンス」モデルでカバーするためには、１０〜２０の間のこのようなヘリックスが必要であり、図３Ａおよび３Ｂの単純な図の分析に基づくと、１６が最適な数である。従って、本発明者らは、所望の両親媒性ヘリックスを含むタンパク質を発現するように、合成遺伝子を構築した。
【００２６】
本発明のＭＳＰは、係留膜タンパク質、包埋膜タンパク質、または内在性膜タンパク質を、ナノスケールの構造体中で安定化するために使用され得る。係留膜タンパク質は、大部分が、二重層の外側であり比較的単純な（例えば、単一パスのヘリックス）比較的可溶性の球状ドメインからなり、これが、このドメインを膜二重層に繋留する。この球状のドメインは、本質的に、配向が細胞外であり得るか、または細胞質であり得る。包埋膜タンパク質とは、本明細書中で定義される場合、ポリペプチドの膜繋留セグメントを含むがタンパク質の表面に疎水性アミノ酸の集団を有し、この疎水性ドメインが、膜二重層に包埋されている、タンパク質である。内在性膜タンパク質は、優先的に、膜二重層の内部に位置する；このタンパク質の比較的小さな部分は、細胞内の水性環境または細胞外の水性環境に曝露される。
【００２７】
係留膜タンパク質のクラスは、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ（例えば、ラット肝臓小胞体由来）、シトクロムｂ５およびヒト組織因子によって、例示される。ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼは、小胞体において見出される膜タンパク質であり、そしてピリジンヌクレオチドの脱水および膜結合シトクロムＰ４５０への電子移動を触媒する。類似の構造のアイソザイムは、ヒト、植物、他の哺乳動物、昆虫などにおいて見出される。組織因子（ＴＦ）、またはトロンボプラスチンは、血液凝固カスケードの開始に重要な、３０，０００ＤａのＩ型係留膜タンパク質である。この膜結合タンパク質は、第ＶＩＩ因子に対する活性化補因子（血液凝固における最初の酵素段階を実施する、可溶性セリンプロテアーゼ）として働く。組織因子の発現は、血漿に直接接触しない細胞に制限され、血管構造の周囲および生物全体に、「止血エンベロープ」を形成する。高レベルのＴＦが、皮膚、脳、および血管を囲む外膜層において見出される。ＴＦ：ＶＩＩ複合体は、膜表面でアセンブリされて、高い活性を示さなければならず、そして最適な活性は、その膜が負に荷電したヘッド基を有するリン脂質を含む場合にのみ見られる。シトクロムｂ５は、膜二重層に貫入する単一の膜アンカードメインを有する、膜に繋留（係留）したヘムタンパク質である。ネイティブな膜から可溶化されたシトクロムｂ５は、界面活性剤の非存在下で大きな凝集物として存在し、そしてネイティブなポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）において、不連続なバンドよりむしろ、スミアとして現れる（図１７、レーン２）。本発明において教示されるＭＳＰを使用する自己アセンブリプロセス（ここで、シトクロムｂ５がＭＳＰおよびリン脂質の調製物に添加される）を介する、ナノディスクの形成の結果として、シトクロムｂ５が、ディスクの大きさの構造体に組み込まれる（図１７のレーン４）。このことは、右側のパネルにおいてナノディスクに対応するバンドの、強いヘム染色によって、裏付けられる。陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離された、シトクロムｂ５を含むナノディスクは、図１７のレーン５および６に示される。２つのピークが、この陰イオン交換カラムから、３１０ｍＭ ＮａＣｌの近くおよび３７０ｍＭ ＮａＣｌの近くで、溶出した。ディスク単独は、３１０ｍＭ ＮａＣｌの近くで溶出し、そしてシトクロムｂ５単独は、４５０ｍＭ ＮａＣｌと７００ｍＭ ＮａＣｌとの間で溶出することが、観察された。このデータは、シトクロムｂ５がＭＳＰ技術を使用して可溶化されること、ならびにシトクロムｂ５を含むディスク複合体が、所望でない凝集物質からクロマトグラフィーによって分離および精製され得ることを示す。精製された物質のヘム発色団の光吸収特性は、ヘム活性部位がネイティブのコンホメーションに存在することを示す。
【００２８】
包埋膜タンパク質の例としては、ウサギ肝臓ミクロソーム由来のシトクロムＰ４５０ ２Ｂ４、ヒト肝臓ミクロソーム由来のＰ４５０ ３Ａ４、および昆虫ミクロソーム由来のシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１が挙げられるが、これらに限定されない。シトクロムＰ４５０は、全ての形態の生命において見出される酵素のスーパーファミリーである。多くの哺乳動物Ｐ４５０の１つの役割は、生体異物を解毒することである；例えば、ヒト肝臓Ｐ４５０は、内因性化合物および外因性化合物の大部分を解毒し、そしてこれらの酵素は、摂取された薬物全ての平均血漿寿命を決定する。最も広範に研究されるヒト肝臓シトクロムＰ４５０の１つは、シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ ３Ａ４）である。この膜結合Ｐ４５０は、ヒト肝臓において最も高度に発現されるＰ４５０であり、そして全ての医薬品のほぼ５０％を代謝する原因である（Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，Ｆ．Ｐ．，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，Ｐ．Ｒ．Ｏｒｔｉｚ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ編、１９９５、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ．４７３−５３５）。シトクロムＰ４５０の研究のためのナノディスク技術の有用性を実証するために、本発明者らは、ＣＹＰ ３Ａ４を、ＭＳＰに支持されたナノ二重層ディスクに組み込んだ。図１８〜２１は、カラムから溶出するＣＹＰ ３Ａ４の保持時間（４１７ｎｍの吸光度によって観察された）およびナノディスクの保持時間（ＭＳＰとＰ４５０との両方を吸収する２８０ｎｍでモニタリングされた）が同時であり、約２４分であることを示す。この溶出時間はまた、ディスクタンパク質複合体の計算された保持時間に密接に相関する。このことを支持するさらなる証拠は、溶出したナノディスク粒子の大きさを直接的に測定する、ネイティブのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）である（図２１）。
【００２９】
シトクロムＰ４５０ ６Ｂ１（ＣＹＰ ６Ｂ１）は、大きなシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼタンパク質スーパーファミリーのメンバーであり、そして包埋膜タンパク質の別の例である。ＣＹＰ ６Ｂ１は、Ｐａｐｉｌｉｏ ｐｏｌｙｘｅｎｅｓ（アメリカクロアゲハ）（これは、フラノクマリン（大部分の生物に対して光毒性である植物代謝産物）を生成する植物を専らえさとするから単離された。ＣＹＰ ６Ｂ１は、エポキシ化反応であると考えられる反応によって、フラノクマリンの解毒を触媒する（Ｍａ，Ｒら（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１０（２），３３２−４０）。本発明のＭＳＰ技術の新たな適用を示すために、本発明者らは、膜タンパク質のレパートリーを含む単離された膜が、ＭＳＰを含むナノディスクに組み込まれ得ることを実証する。特に重要な実施形態は、通常の昆虫細胞培養物（異種発現系として広範に使用される、バキュロウイルス発現系）の使用である。従って、本発明者らは、過剰発現された昆虫ＣＹＰ ６Ｂ１および過剰発現された昆虫ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼを含むミクロソーム調製物が産生されるように同時感染させた、市販のＳｆ９昆虫細胞株を使用した。従って、本発明者らは、ＭＳＰナノディスクを使用して別のシトクロムＰ４５０系を可溶性単分散粒子に組み込み得ることのみでなく、このＰ４５０の供給源がまた、単に、クローニングされたＣＹＰ ６Ｂ１遺伝子で感染されたＳｆ９細胞株由来の膜全体であり得ることを実証した。従って、ＭＳＰに支持されたナノディスクは、ハイスループットスクリーニング事業（例えば、膜結合タンパク質に対するリガンドの同定）における使用のため、または新たな医薬の同定のために、製造され得る。この適用は、目的の標的タンパク質を含む膜フラグメントの他の任意の供給源（例えば、任意の哺乳動物細胞培養系、または哺乳動物発現系）に拡張され得る。
【００３０】
本発明のナノディスク技術の重要な用途は、酵素活性またはレセプター結合活性についてのハイスループットスクリーニングにおいてである。多くのこのような系において、例えば、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ触媒またはＧタンパク質共役レセプターに組み込まれた対応するＧタンパク質のために必要な電子移動パートナーの、ナノディスクに組み込まれた１つより多くの膜タンパク質標的を有することは、有利である。これらの状況におけるＭＳＰナノディスク技術の用途を実証するために、本発明者らは、ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼおよびシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１を、首尾よく組み込んだ。本明細書中で実証されるように、各標的膜タンパク質は、ＭＳＰを使用してナノディスクに個々に組み込まれ得るか、またはこれらは、組み合わせて組み込まれ得る。レダクターゼに対するシトクロムＰ４５０の内因性の相対量は、レダクターゼ１分子あたり約１０〜２０分子のＰ４５０である（Ｆｅｙｅｒｅｉｓｅｎ，Ｒ（１９９９）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ４４，５０１−５３３）。ディスクへの再形成の後のＣＹＰ６Ｂ１の活性を得るためには、Ｐ４５０分子およびレダクターゼ分子の両方が、単一のディスクに分割されるように、過剰量のレダクターゼがこの再形成混合物に添加されることが好ましい。ミクロソーム調製物に、外因的に添加されたレダクターゼを補充することが、達成された。このサンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイジングカラムによって分離し、ここで、２８０ｎｍにおける吸光度は、ＭＳＰ１の存在を示し、４２０ｎｍおよび４５６ｎｍにおける吸光度は、鉄を含む種の存在を示し、そして４５６ｎｍにおける吸光度はまた、レダクターゼの存在を示す（図２５）。４５６ｎｍ対４２０ｎｍの比をプロットし、これは、４５６ｎｍにおける吸光度がＣＹＰ ６Ｂ１に関する吸光度より高く、従って、レダクターゼによる吸光度に起因し得る、クロマトグラムの位置を示す（図２６）。保持時間は、ＣＹＰ６Ｂ１とレダクターゼとの両方を含む１０ｎｍの粒子の存在に相関した。図２２〜２４もまた参照のこと。
【００３１】
内在性膜タンパク質は、７ヘリックス膜貫通タンパク質によって例示され、これには、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｂｉｕｍ由来のバクテリオロドプシン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来の５−ヒドロキシトリプタミン１Ａ Ｇタンパク質共役レセプター、および他のＧタンパク質共役タンパク質レセプターが挙げられるが、これらに限定されない。膜タンパク質の各クラスのメンバーは、本発明のＭＳＰおよび方法を使用して、ナノスケールの構造に首尾よく組み込まれた。特に、細胞表面レセプター、および特に、Ｇタンパク質共役レセプターは、膜スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）のクラスから形成したナノ二重層の二重層構造に組み込まれ得る。ＢＲは、本明細書中以下に記載れるように、ＭＳＰナノディスクに組み込まれ、そして本発明者らは、ヒト由来のＧタンパク質共役レセプターを５−ＨＴ−１Ａ（セロトニン）に対するホストにする膜画分を提供する、市販の昆虫細胞発現系を使用した。ナノディスクへの５−ＨＴ−１Ａの組み込みについて示されたリガンド結合活性は、このタンパク質が、本発明のナノディスクにおいて、活性コンホメーションにあることを示す。
【００３２】
図１０は、ＭＳＰ／ＢＲ／ジミリストイルホスファチジルコリン合成混合物のゲル濾過溶出プロフィールを示し、バクテリオロドプシンが可溶化されたことを実証する。ＭＳＰの非存在下では、バクテリオロドプシンは、ボイド画分において定量的に溶出する。バクテリオロドプシンの主要なピークは、大部分のＭＳＰディスクよりわずかに早い位置で溶出する（較正標準のＳｔｏｋｅ半径に基づいて、小さな複合体は約１００Åの直径）。ＢＲを含む、より大きな複合体もまた形成される。この複合体に存在するＢＲは、６Ｈｉｓタグを含む操作されたＭＳＰを通してのニッケルアフィニティーカラムに特異的に結合し得、そしてこのカラムから溶出され得る。さらに、ゲル濾過におけるＢＲの溶出プロフィールは、ＢＲの非存在下でのＭＳＰディスクの溶出プロフィールによく似ている。複合体におけるＢＲのスペクトルは、界面活性剤で可溶化されたモノマーＢＲのスペクトルに類似しており、そして４℃での貯蔵の際に、数週間変化しないようである。驚くべきことに、ＭＳＰは、外因的に添加されたリン脂質の非存在下で、ＢＲを定量的に可溶化する。脂質に乏しいこれらの複合体はまた、小さなＭＳＰ／リン脂質ディスクの大きさである。
【００３３】
本発明者らは、短いリンカーにより連結されたＭＳＰ１のタンデム反復を新たな分子を作製するように設計することによって、人工ＭＳＰ（ＭＳＰ２）を作製した。図５Ｇおよび配列番号１７を参照のこと。比較的多量（数十ミリグラム／リットルの細胞培養物）の本発明の人工ＭＳＰを、細菌発現系において生成する。本発明者らの構築物は、形成され得るサイズクラス（３つのＭＳＰ１分子に対応するクラス）の数を減少する。予備的な証拠は、ＭＳＰ２と共に形成される主な種のサイズが、２つのＭＳＰ１分子および４つのＭＳＰ１分子に対応することを示す。さらに、ＭＳＰ１を含む調製物において、低いリン脂質：ＭＳＰの比で見出される膜スカホールドタンパク質の代替のコンフォメーションに起因する最小のディスクサイズが、ＭＳＰ２には存在しない。理論に縛られることは望まないが、本発明者らは、より小さな粒子は、一分子のＭＳＰ２を含み、より大きなディスクが、２分子のＭＳＰ２を含むと考える。
【００３４】
スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）は、円盤状リン脂質二重層実体の構造における可変性を最小限にし、より大きな構造的安定性およびディスク構造の増加したサイズ均質性を提供し、そしてディスクの精製および物理的操作のための有用な機能性（例えば、タグ）を組み込むように操作される。ディスクの均質性は、単一の膜タンパク質または単一の膜タンパク質複合体をディスクの単一のサイズクラスのディスクに効率的に組み込むために必要である。親分子であるａｐｏ Ａ−Ｉは、ディスク構造の安定化を越える機能を有し；これには、細胞レセプター結合、ＬＣＡＴ活性化、および種々のリポタンパク種間の構造変換が挙げられる（Ｆｏｒｔｅら、１９７１；Ｈｏｌｖｏｅｔら、１９９５；Ｆｉｄｇｅ、１９９９）。これらの機能的領域は、不必要であり、そしてしばしば、本発明の人工二重層系において有害である。人工スカホールドタンパク質は、両親媒性螺旋膜タンパク質構造の研究において使用され得る。
【００３５】
二次構造の予測は、スカホールドタンパク質の構造的特徴を評価する方法を提供する。この構造の大部分は、図４に示されるように、反復配列中のプロリンにより中断されるαヘリックスから構成される。８〜９個のαヘリックスは、ディスクの形態の脂質と会合していると考えられる。ａｐｏ Ａ−ＩのＮ末端領域の特徴は、より球状であることが予想される。分子のこの部分を、ディスクを形成し得る構築物を生成するために、取り出した。高度な単分散性を有するディスク構築物を産生するＭＳＰが望ましい。中心ヘリックス（９９〜１８６）は、関連のタンパク質であるアポリポタンパクＡ−ＩＩの脂質を含まない形態（これはディスク構造体の溶液に添加される）により置換され得（ＤｕｒｂｉｎおよびＪｏｎａｓ、１９９９）、これらのヘリックスは、「ヒンジ」ドメインの一部であり得（図５Ａ〜５Ｂ）、これはディスクの縁部から解離し、ＬＰ２、ＬＰ３およびＬＰ４クラス内の種々の粒径を生成する（Ｊｏｎａｓら、１９８９）。解離したヒンジ領域を有するディスク形態はまた、タンパク質分解（これは望ましくない）に対してより感受性である（ＤａｌｔｏｎおよびＳｗａｎｅｙ、１９９３）。中心ヘリックスの対（１００−１４３、１２２−１６５、および１４４−１８６）の欠失は、全長ａｐｏ Ａ−Ｉより小さいサイズのディスクを形成する組換え体を生じ、そしてさらに、２つの変異体（１２２−１６５および１４４−１８６）は、化学変性に対する安定性を増加する（Ｆｒａｎｋら、１９９７）。さらなる研究は、ヘリックス５および６（１４３−１８６）を別のヘリックスのセットと置き換えた（図５Ｄ）。ヘリックス３および４は、ディスクに安定性を与えると考えられる領域を含む（Ｆｒａｎｋら、１９９７）。ヘリックス３は、高い脂質親和性を有し、塩架橋を介する脂質結合形態に安定性を与えると考えられる。ヘリックス１はまた、高い脂質親和性を有し、完全に螺旋状である（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９８）。ヘリックス対５−６の代わりにヘリックス対１−２を組み込む構築物が所望される。半反復の役割は、非常に興味が持たれる。これらの１１マー反復は、αヘリックスであることが予測されるが、杭柵モデルにおいて二重層を架橋するのに十分に長くない。杭柵モデルにおけるディスクの分子動力学的モデルにおいて、半反復１に対応する領域は、実際に、「フロッピー」であり、そして脂質と相互作用せず、一方、半反復２は、ヘッド基領域付近の二重層に対して平行であることが見出された（図５Ａおよび５Ｃ）。このような構造は、得られるディスクに障害を与え得る。半反復の役割を確認し、ＭＳＰ構造および機能をさらに最適化するために、変異誘発および指向された進化を使用して、本明細書中以下に記載される改変体を作製した。
【００３６】
ＭＳＰディスクに組み込まれたレセプターは、構造的、生化学的および薬学的な検索において有用である。膜タンパク質の研究は、現在、不溶性膜分散物、界面活性ミセルおよびリポソームに限定されている。多くの場合、界面活性剤を用いて得られるか得られないかもしれない、生化学的および物理学的研究のための精製された系は、安定性を必要とする。界面活性ミセルは、動力学的であり、そしてサブユニットの解離を促進しかつ希釈溶液においてタンパク質を扱う能力の困難性を示す構造的変動を受ける。ＭＳＰナノ二重層（ナノディスク）は、構造的により強固であり、別個のサイズおよび組成のリン脂質二重層模倣ドメインを有し、そして単層リポソームよりも大きな安定性および小さな表面積を有する。本発明の粒子は、４℃で少なくとも一ヶ月間、サイズおよび構造において安定である。
【００３７】
シグナル伝達エレメントは、膜全体に存在するが、小胞は、膜の一方の面を、親水性試薬およびエフェクタータンパク質にアクセス可能にする。本発明の特定の実施形態は、キャリア粒子上の膜結合形態の薬学的標的（例えば、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、レセプターキナーゼ、およびホスファターゼ）を安定化するために、ディスクを使用する。本発明者らは、ＧＰＣＲに注目して、タンパク質を複数の架橋ヘリックスと共に、本発明のディスクに組み込んだ。本発明者らは、モデルの蛇行したレセプターである、バクテリオロドプシンを首尾良く組み込んだ。バクテリオロドプシンは、ＧＰＣＲのモデルであり、これは、薬物発見のための現在の標的である。現在は、種々の生物体由来の１０００を越える有望なＧタンパク質レセプターがクローニングされており、そしていわゆる「オーファン」レセプターの多くは、天然リガンドの同定を待っている。リガンドクラスとしては、ペプチドホルモン、エイコサノイド、脂質、カルシウム、ヌクレオチドおよび生体アミンが挙げられる。ＧＰＣＲは、現在市販されている医薬の半分より多くの割合を占めると考えられる。当業者は、過度の実験を行うことなく、この構造クラスの膜タンパク質の組込み方法を最適化し得る。再構成されたレセプターの構造の特徴付けは、以下に記載されるように、化学分析、分光法および原子間力顕微鏡を使用して実施される。
【００３８】
本発明のＭＳＰは、膜タンパク質を可溶化、安定化、操作するために、ディスクにおいて使用される。本発明のＭＳＰは、ディスク上に処方された場合、ハイスループットスクリーニングまたは固相アッセイ技術のための表面技術（例えば、バイオセンサチップ）において適用可能である。ディスクスカホールドについての本発明者らの研究はまた、表面会合アセンブリを含んだ。例えば、ＳＰＲバイオセンサは、光学要素上の約５０ｎｍ厚の金フィルムを使用して、表面プラズモンをこの金フィルムの表面の誘電性成分（サンプル）に結合する。ＭＳＰ安定化二重層は、システインをＭＳＰに操作することによって、生体模倣層含有タンパク質または他の目的の標的として使用するために、表面に結合され得る（図１５Ａ）。金表面に分子を結合するためにチオールを使用することは、周知である。システインの置換は、システイン残基の置換のために使用されるモデルに依存する。ベルトモデルに基づいて、システインは、両親媒性ヘリックスの軸の極性面に沿って配置され得るが、ただし、システイン残基は、ヘリックス−ヘリックス界面には位置しない。このベルトのヘリックス−ヘリックス界面は、ａｐｏ Ａ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（Ｒ１７３Ｃ）（これは、ジスルフィド結合ダイマーを形成する）の位置を表すと考えられる（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９９）。代替の方法は、可撓性の、すなわちＣ末端リンカー内にシステインを導入することである。このような構築物は、理論上は、ベルト形態または杭柵形態のいずれかのディスクを金表面に結合し得る。あるいは、チオール脂質は、二重層ドメインに組み込まれ得る。ＳＰＲに加えて、金上の表面結合ディスクは、ＳＴＭおよび電気化学研究（例えば、膜結合レドックスタンパク質（例えば、シトクロムＰ４５０およびその黄色蛋白）、ならびにイオンチャネル）において使用され得る。
【００３９】
ＳＰＲデータはまた、誘電性の薄膜（例えば、通常はＳＰＲの基板として使用される、金属フィルムに塗布された二酸化ケイ素）を使用して行われる測定から得られ得る。この技術のバリエーションは、結合プラズモン導波管共鳴（ＣＰＷＲ）と命名された（Ｓａｌａｍｏｎら、１９９７ａ）。シリカは、これらのプラズモン共鳴実験において活性表面として使用され得るため、自己構築二重層を生成するプロセスは、マイカまたは他の酸化ケイ素表面の表面上で表面を生成するために使用される同じ手順に単純化され得る。このことは、ＳＰＲ実験に使用される条件を、ＡＦＭ実験に使用される条件と直接比較可能にするという付加的な利点を有する。ＣＰＷＲ技術は、シリカコーティングを金属フィルムスライド（これはＳＰＲ分光法で現在使用される）に単に加えることによって、本発明者らのＳＰＲ機器を用いて容易に実施され得る。
【００４０】
利用可能なシステイン基を有するＭＳＰはまた、化学反応性基またはゲルマトリクスにおける固定化のための親和性タグでの特異的標識を可能にする。反応性結合基を有するヒドロゲルは、ＳＰＲ測定のためのタンパク質を固定化するために有用である。ヒドロゲルの構成（図１５Ｂ）において、ディスクは、リガンド結合のために利用可能な細胞内ドメインおよび細胞外ドメインの両方を含む、単分散性形態の二重層構築膜タンパク質のためのキャリアとして働く。本発明者らは、Ｈｉｓタグを含むディスクが、ＢＲを固定化するために使用され得る金属キレートマトリクスに結合することを、すでに証明した。このことは、ディスク構造の別の用途、すなわち、生体分離プロセスのための親和性マトリクスの調製およびリガンド親和性の測定を示す。本発明の粒子および技術は、薬物発見、構造／機能の相関付け、および膜タンパク質の構造決定のために有用である。
【００４１】
膜タンパク質の構造決定に対する現在の制限は、多量の膜タンパク質を生成し、そしてこれらのタンパク質を結晶化する能力である。ＭＳＰは、膜タンパク質の安定化および発現のためのキャリアとして有用である。ＭＳＰは、界面活性剤の代わりに、結晶化のための膜タンパク質を可溶化するのに役立ち得る。実際に、脂質結合形態のＭＳＰが構造的に安定でありかつ堅い（ｒｉｇｉｄ）場合、結晶化は、ＭＳＰを通して結晶接触を導入することによって促進される。本発明者らは、ＭＳＰ１またはＭＳＰ２が、外因性脂質の存在下および非存在下においてＢＲを可溶化するために使用され得ることをすでに証明した。ＭＳＰ領域を有する膜タンパク質とのさらなる非例示的な融合構築物は、当該分野で公知の多数のベクターのいずれかを使用して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて発現され得る。このように、安定かつ可溶性形態の膜タンパク質（これは膜アンカーを含む）は、多量に生成される。ＭＳＰが添加されたリン脂質の非存在下でＢＲを安定化するという興味深い発見は、界面活性剤または脂質添加物の非存在下で、膜タンパク質を安定化するために人工ＭＳＰを使用することを可能にする。本発明の人工ＭＳＰは、ＢＲおよび他の膜タンパク質（シトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびお５−ＨＴ−１Ａレセプターを含むが、これらに限定されない）の可溶化に使用され得る。
【００４２】
一般的に膜タンパク質、特にＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を提供する膜スカホールドタンパク質（ＭＳＰ）を、均質生化学的アッセイまたは結晶化に適切な環境で使用する際の１つの重要な目的は、粒子の均質な調製を有する弧とである。全長ヒトＡｐｏ−ＡＩおよびその誘導体から代替の膜スカホールドタンパク質までの範囲の、本発明者らが記載した膜スカホールドタンパク質（短縮型ヒトＡｐｏ−ＡＩ（ｔ−ＭＰ）（アミノ末端可溶性ドメインは除去されている）、欠失変異体（１つ以上のタンパク質セグメントが除去されている）、および上記の物質のいずれか（ヒスチジンタグが組み込まれている）を含むが、これらに限定されない）は、溶液中でリン脂質と自己構築される場合に、主に８〜１０ｎｍの粒子を形成する。しかし、最初の再構築の際に、他のサイズの粒子が存在する。標準的なサイズ分離クロマトグラフィーは単一のサイズクラスの粒子を精製するために使用され得るが、標的タンパク質とＭＳＰとリン脂質との最初の再構築混合物のサイズ分布を最小限にすることが好ましい。８〜１０ｎｍの粒子は名目上、２つのＭＳＰタンパク質、Ａｐｏ−ＡＩタンパク質またはＡｐｏ−ＡＩ誘導タンパク質から構成される。従って、本発明者らは、２つの短縮型Ａｐｏ−ＡＩタンパク質（ＭＳＰ１と呼ぶ）が遺伝的に、単一のポリペプチド鎖から構成されるスカホールドタンパク質を形成する傾向がある、膜スカホールドタンパク質を構築した。これは、図５Ｇに概略的に例示される。
【００４３】
ナノスケールのリン脂質二重層内で安定化され得るＧＰＣＲとしては、クラスＡ（ロドプシン様）ＧＰＣＲが挙げられ、これはアミン、ペプチド、ホルモンタンパク質、ロドプシン、嗅覚プロスタノイド、ヌクレオチド様化合物、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、チロトロピン放出ホルモンおよび分泌促進物質、メラトニン、ならびにリゾスフィンゴリピドおよびＬＰＡに結合する。アミンリガンドを有するＧＰＣＲとしては、アセチルコリンまたはムスカリン性レセプター、アデノレセプター、ドパミン、ヒスタミン、セロトニンまたはオクトパミンレセプターが挙げられるが、これらに限定されず；ペプチドリガンとしては、アンギオテンシンリガンド、ボンベシンリガンド、ブラジキニンリガンド、アナフィラトキシンリガンド、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅリガンド、インターロイキン−８リガンド、ケモカインリガンド、コレシストキニンリガンド、エンドセリンリガンド、メラノコルチンリガンド、神経ペプチドＹリガンド、神経ペプチドリガンド、オピオイドリガンド、ソマトスタチンリガンド、タキキニンリガンド、トロンビンバソプレシン様リガンド、ガラニンリガンド、プロテイナーゼ活性化リガンド、オレキシンリガンドおよび神経ペプチドＦＦリガンド、アドレノメデュリン（Ｇ１０Ｄ）リガンド、ＧＰＲ３７／エンドセリンＢ様リガンド、ケモカインレセプター様リガンドおよびニューロメディンＵリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
他の特定のＧＰＣＲのリガンドとしては、とりわけ、ホルモンタンパク質、ロドプシン、嗅覚プロスタノイド、ヌクレオチド様化合物（アデノシン、プリンレセプター）、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、チロトロピン放出ホルモンおよび分泌促進物質、メラトニン、ならびにリゾスフィンゴリピドおよびＬＰＡが挙げられる。クラスＢセクレチン様ＧＰＣＲとしては、以下に結合するＧＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない：カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、胃抑制性ポリペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作用性腸ポリペプチド、利尿ホルモン、ＥＭＲ１およびラトロフィリン（ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ）。クラスＣ代謝生成物産性グルタメートレセプターとしては、とりわけ、以下に結合するレセプターが挙げられる：代謝生成物産性グルタメート、細胞外カルシウム感作またはＧＡＢＡ−Ｂ。そのリガンドが未だ知られていない「嗅覚」レセプターもまた、本発明のアッセイの潜在的な標的である。
【００４５】
特定のリガンドの結合を示すか、またはＭＳＰ支持型ＧＰＣＲに結合するリガンドのインヒビターもしくはコンペティターを同定するために使用され得る、本発明のアッセイにおいて、種々の標識が、リガンド分子内（例えば、放射性同位体、例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^３２Ｐ）に組み込まれ得るか、または検出可能な化合物がリガンド分子に結合され得るが、ただし、同族レセプターに対する結合は、標識に起因して、有意には減少されない。標識としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、蛍光化合物、発光化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
融合されたＭＳＰ間のリンカー配列の必要な特性は、この融合されたタンパク質が、２つの別々のＭＳＰと類似の様式で、粒子を構築するような可撓性および可溶性である。Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−（配列番号４６）の繰返しからなるリンカー配列は、これらの特性を有する。このリンカーの長さを最小にすることがまた、所望される。本発明者らは、本明細書の以下で記載されるように、Ｋｐｎ Ｉに対するコンセンサスＤＮＡ制限部位に対応する、この最小のリンカーである−ＧＴ−との融合体を構築する。このＫｐｎ Ｉ部位は、Ｋｐｎ Ｉを用いた制限および任意の所望のリンカーをコードする二本鎖合成ＤＮＡの挿入により任意の所望のリンカー配列を容易に挿入する方法を提供する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９８）。本発明者らはまた、リンカー配列−ＧＴＧＧＧＳＧＧＧＴ−（配列番号１５）を含む融合構築物を作製した。しかし、最小のリンカーを有するＭＳＰ２は、２つのＭＳＰ１タンパク質を含む粒子と非常に類似する粒子を構築する。
【００４７】
ＭＳＰ２スカホールドタンパク質についての完全なアミノ酸配列および核酸配列は、表７および８において示される（配列番号１６および配列番号１７も参照のこと）。このＭＳＰ２融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、そして単一のＭＳＰについて記載されるのと同一の手順を基本的に使用して、均質となるまで精製した。このＭＳＰ２タンパク質は、有効なスカホールドタンパク質として役立ち、可溶な界面活性剤を除去して、リン脂質とともに自己構築する。サンプルの不均質性の取り組みについて、図１３は、粒子の平均直径（Å）として標識された個々のピークを有する、ネイティブな勾配のポリアクリルアミドゲルのデンシトメトリートレースを示す。明らかに、特に、公称１０ｎｍ粒子に対応する２００の脂質／二量体の比において、大きな単分散性がＭＳＰ２タンパク質によって与えられる。
【００４８】
重要なことに、このディスクの全体的な安定性は、化学的に誘導された変性およびトリプトファン残基の溶媒への曝露によってモニタリングされるように、図１４に示されるようなモノマー膜のスカホールドタンパク質の融合によって変質されない。
【００４９】
ディスク構造および関連するタンパク質の特徴付けにおいて使用される重要な技術は、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）である。ＳＰＭは、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）で最初に開発された走査原理を利用する、任意の顕微鏡のためのアンブレラターム（ｕｍｂｒｅｌｌａ ｔｅｒｍ）であるが、これらの顕微鏡は、非常に変化し得るので、これらの指針となる中心的な原理に関して、最良に議論される。この技術は、生物学的な膜および関連するタンパク質、二重層構造および組み込まれた膜タンパク質表面の分析において使用されている。ＳＰＭは、全ての空間的な３次元方向への独立した移動度（スキャニング）を、この表面のいくつかの特徴を検出（プローブ）し得る検出システムと組み合わせる。プローブされ得る種々の表面特徴（伝導率、表面力、圧縮性、キャパシタンス、磁気、蛍光発光）が、得られ得る情報の価値を示す。原子間力顕微鏡の優れたｚ軸感度により、ｒＨＤＬ単層に結合するタンパク質の存在を容易に検出可能にし、本発明者らは、ＭＳＰにより支持されたナノディスクにおいて固定された、十分に特徴付けられた内在性膜タンパク質および固着膜タンパク質について示した（Ｂａｙｂｕｒｔら、１９９８）。ＡＦＭを用いて可能となる正確な高さ測定の有用性の他の例は、本研究者のｒＨＤＬの正確な高さの定量化（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９７）、および種々のナノディスクアセンブリにおいてＡＦＭプローブの力を調節することによって得られる膜タンパク質の高さの測定である（Ｂａｙｂｕｒｔら、２０００）。ＭＳＰから形成されるディスクの表面会合は、ヒトアポＡ−Ｉタンパク質およびその改良された改変体の利用を可能にし、ＳＰＭによって表面のリン脂質二重層に組み込まれた単一の膜タンパク質の生物物理学的な特性を直接的に調査し得る。ディスクが原子レベルで（ａｔｏｍｉｃａｌｌｙ）フラットな伝導性表面（例えば、金）に結合する能力は、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）にとって必要である。理論的に、酸化還元活性系を介したトンネル効果を使用して、酵素の機能状態をプローブし得る（Ｆｒｉｉｓら、１９９９；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、２０００）。これらの２つの技術は、相補的なデータを提供し、そして二重層／溶液の界面で生じる事象を可能な限り完全な画像として作製するために一緒に使用され得る。ディスクを金の表面上に配置する能力はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の使用も可能にする。膜タンパク質のこのような人口の脂質二重層への挿入、または表面に会合したタンパク質とこれらの相互作用は、ＳＰＲによって検出および定量され得る。
【００５０】
ディスクの安定性の測定およびクラス中のサイズ分散性の決定は、作製される構築物を評価するために必要である。ゲル濾過および未変性のゲル電気泳動を使用して、異なるサイズのクラスを分離し、そして定量する。分光法を使用して、操作したＭＳＰの二次構造（ＣＤ）および脂質会合（蛍光）特性（理論に基づく安定性および化学的変性を含む）を定量する。ディスク中の成分の組成および化学量論は、従来の方法によって定量される（Ｊｏｎａｓ、１９８６）。
【００５１】
ＡＦＭを使用して、製造された系の脂質およびタンパク質成分の構造的な編成に基づいて、分子分解能のデータを提供する。この技術は、大気中、真空中、および水性流体および非水性流体下で使用され得る。この後者の能力は、生物科学において、この技術を最も重要な走査型プローブ技術にする。このＡＦＭは、非常に汎用性のある装置であり、この装置は、種々の異なるモードにおける力データの画像および他の形態（例えば、接点力、タッピング力、位相力、および側方力）を獲得し得る（Ｓａｒｉｄ、１９９４）。これらの全ての走査型モードは、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）で市販され、そしてこれらは、ｒＨＤＬおよび生物学的緩衝液中でｒＨＤＬ層と会合されるタンパク質を画像化するために首尾良く使用されている。この装置をまた、ＳＴＭおよび電子化学モードにおいても使用して、金に会合した構造および組み込まれた酸化還元タンパク質の特性を研究し得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、膜スカホールドタンパク質は、リン脂質およびリン脂質混合物をナノメーターサイズの膜二重層に自己構築する、タンパク質またはポリペプチドである。これらの構造のサブセットは、円盤形状であり、そしてナノディスクと呼ばれる。疎水性タンパク質（例えば、膜タンパク質）または膜フラグメントは、これらの粒子と会合し得、この疎水性タンパク質または膜フラグメントは、安定な構造で効率的に可溶化され、これにより、酵素の活性またはリガンドの結合に関して、このタンパク質の機能を維持する。これらの粒子は、溶液中で安定であるか、またはこれらは、この表面に関して、有利に均一な配向で表面に固定され得る。本明細書中で使用される場合、ＭＳＰを含むナノ粒子（別の疎水性のタンパク質または部分的に疎水性のタンパク質を含むか、または含まないナノ粒子）は、約５〜約５００ｎｍ、望ましくは、約５〜約１００ｎｍ、または約５〜約５０ｎｍの直径であり得る。約５〜約１５ｎｍの直径のナノ粒子（ディスク）は、特に有用である。
【００５３】
本発明者らは、ＭＳＰ１およびＭＳＰ２の両方が、バクテリオロドプシンとともに構築することを示した。添加されたリン脂質の非存在下で、粒子が、ＭＳＰ１（図１１）またはＭＳＰ２（図１２）とともに形成される場合、最初の再構成混合物から、２つのバクテリオロドプシン含有種が観測される。本発明者らは、これらの種を形成するバクテリオロドプシンの可溶性のためにＭＳＰが絶対に必要とされることを見出した。なぜならば、形成混合物由来のＭＳＰを含まないと、ゲル濾過カラムの空隙容量中で溶出する、大きな非特異的なバクテリオロドプシンの凝集が生じるからである。図１１の１５分目にある小さなピークは、ＢＲの凝集を示す。これらの実験において、バクテリオロドプシンの大部分は、ＭＳＰの存在下で可溶化されるようである。観測された粒子の２つのサイズは、この構造において変性コンフォメーションを組み込む推定「ヒンジドメイン」と完全に一致する。先行技術から、この可撓性ヒンジ領域は、ＭＳＰ１に対する推定により、ヒトＡｐｏ−ＡＩのらせん体５および６に対応するらせん体を構成すると考えられている。従って、９．８ｎｍの直径のバクテリオロドプシン含有粒子において、このタンパク質構造のこれらの可撓性部分は、この構造の疎水性コアと会合するが、７．６ｎｍの直径の粒子において、このらせん領域は、この疎水性コアから解離して、より小さな直径粒子を形成するようである。
【００５４】
親のＡｐｏ−ＡＩタンパク質のさらなる改変は、より効果的かつ安定な膜スカホールドタンパク質を形成し得る。例えば、ＢＲ／ＭＳＰ構造の均一性を増加し、そして上述のタンパク質構造の可撓性「ヒンジ」領域の問題を処理するために、本発明者らは、ヒンジドメイン領域を欠失させ、２つの新しい膜スカホールドタンパク質を産生した。第１の場合において、推定らせん領域４および５をＭＳＰ１ヒスチジンタグ化構造から欠失させて、ＭＳＰ１Ｄ５−６と呼ばれる構造を産生した。第２の実験において、推定ヘリックス５および６を欠失させて、ＭＳＰ１Ｄ４−５と呼ばれる物質を産生した。本発明者らは、ｌａｃ調節構造において、イソプロピル−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いた発現の誘導により、高レベルで発現される、これらのタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現させた。
【００５５】
複数の粒子サイズのクラスの形成を避ける代替の方法は、ＭＳＰ構造を操作することであり、このヒンジドメインのらせん体は、この粒子の疎水性コアに対してより高い親和性を有するらせん体と置換される。この場合、より高い親和性相互作用は、より小さい種の形成を所望せず、ここで、このヒンジドメインは、解離される。この実験の指針において、本発明者らは、このヒンジ領域（らせん５および６）を、らせん１および２に対応するネイティブ配列に対応するタンパク質配列と置換するように選択した。別の形態において、本発明者らは、膜スカホールドタンパク質をコードするＤＮＡ構造を選択し、ここで、推定らせん領域３および４に対応するタンパク質配列を使用して、バクテリオロドプシンと脂質との構築の際に、単一のサイズの粒子を得る目的で、このヒンジ領域を置換する。
【００５６】
親のヒトＡｐｏ−ＡＩタンパク質中に存在する、いわゆる「半反復（ｈａｌｆ−ｒｅｐｅａｔ）」単位はまた、ＭＳＰアセンブリ中のコンフォメーション不均質性を生じ得る。例えば、このピケットフェンスモデルにおいて、これらのらせん体は、この二重層平面に対して平行なコンフォメーションを取り、そしてタンパク質配列の他の領域が寄与すると考えられる場合、この粒子の疎水性コアとの相互作用に主な役割を果たさない。この「ベルトモデル」において、これらの短いらせん体の反復は、ＭＳＰが異なるコンフォメーションを取ることを可能にする、セグメント化された移動度を生じ得る。換言すれば、構造エレメントのタイプの数が最小化されるＭＳＰは、膜スカホールドタンパク質概念の最も所望される実施形態である。従って、内在性膜タンパク質標的に可溶化する能力に関して、膜スカホールドタンパク質の構造をさらに最適化するために、本発明者らは、両方の半反復単位を欠失する誘導体配列を操作して、単純化されたＭＳＰ構造を産生し得る。
【００５７】
本発明のＭＳＰと特異的に反応する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、当該分野で公知の方法によって作製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。
【００５８】
クローニング、ＤＮＡの単離、増幅、および精製のため標準的な技術、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどに関連する酵素反応のための標準的な技術、および種々の分離技術は、当業者に公知の技術であり、普通に使用される技術である。多くの標準的な技術が、以下に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｕ（編）（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８，第１部；Ｗｕ（編）（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８；Ｗｕら（編）（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００および１０１；ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏｌｄａｖｅ（編）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（編）（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＯｌｄおよびＰｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；ＳｃｈｌｅｉｆおよびＷｅｎｓｉｎｋ（１９８２）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ（編）（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第１巻および第ＩＩ巻，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；ＳｅｔｌｏｗおよびＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＭｅｔｈｏｄｓ，第１〜４巻，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ。使用した略語および命名法は、当該分野で標準的であり、そして本明細書中で引用されるような専門雑誌中で普通に使用される。
【００５９】
本出願において引用される全ての参考文献は、本発明の開示と矛盾が生じない範囲で本明細書中で参考として援用されている。
【００６０】
本明細書中で提供される記載は、本明細書中で権利を主張する場合、本発明の範囲を限定するように意図されない。当業者に生じる、例示の物品および方法における任意のバリエーションは、本発明の範囲内であると意図される。
【００６１】
（実施例）
（実施例１．ＭＳＰの発現のための組換えＤＮＡ分子の構築）
以下に示されるヒトｐｒｏＡｐｏＡＩコード配列を、ｐＥＴ−２８（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＮｃｏ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩ部位（下線が引かれている）との間に挿入した。開始コドンおよび終止コドンは、太字である。クローニングに使用される制限エンドヌクレアーゼ認識部位に、下線を引く。
【００６２】
（表１．ＰｒｏＡｐｏＡＩコード配列（配列番号１）クローニングにおいて使用した制限部位に下線を引き、そして翻訳の開始シグナルおよび終止シグナルを、太字で示す）。
【００６３】
【化１】

（表２．ＰｒｏＡｐｏＩアミノ酸配列（配列番号２））
【００６４】
【化２】

ＭＳＰ１コード配列の構築を、以下のようにして達成した。ＭＳＰ１（ＰｒｏＡｐｏＡＩのＮ末端ドメインを欠く短縮型タンパク質）をコードするＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発によって産生するために、プライマーを設計した（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９８８）。プライマー１（配列番号３）。
【００６５】
【化３】

は、ＭＳＰ１の精製および操作のためにＮ−末端６−ヒスチジンタグ、およびヒスチジンタグタグの除去のためにＸａ因子切断部位を導入する。Ｘａ因子は、タンパク質配列ＩＥＧＲ中のＲの後ろを切断する。プライマー２（配列番号４）
【００６６】
【化４】

を、逆方向プライマーとして使用した。
【００６７】
【化５】

【００６８】
【化６】

Ｎ−末端ヒスチジンタグなしでのＭＳＰ１の生成のために、プライマー１を、配列番号８に提供される配列を生成するためにプライマー１ａ：
【００６９】
【化７】

（配列番号７）で置換した。
【００７０】
【化８】

【００７１】
【化９】

タンデム型リピートを有するＭＳＰ（ＭＳＰ２）の生成を、以下に記載されるように実行した。次のプライマーを、ＭＳＰ２を生成するために使用した（図６Ａ〜６Ｂを参照のこと）：
プライマー３（配列番号１０）：
【００７２】
【化１０】

プライマー３ａ（配列番号１１）：
【００７３】
【化１１】

プライマー４（配列番号１２）：
【００７４】
【化１２】

プライマー５（配列番号１３）：
【００７５】
【化１３】

プライマー６（配列番号１４）：
【００７６】
【化１４】

最初のＰＣＲにおいて、プライマー２（またはＮ−末端ヒスチジンタグのためのプライマー２ａ）およびプライマー４を使用して、ＭＳＰ遺伝子の３’末端にリンカー（アミノ酸配列
【００７７】
【化１５】

（配列番号１５）をコードする）を付加し、ＭＳＰ−Ａを生成した。２回目のＰＣＲにおいて、リンカーを、ＭＳＰ遺伝子の５’末端に付加し、ＭＳＰ−Ｂを生成した。ＫｐｎＩを用いたＭＳＰ−ＡおよびＭＳＰ−Ｂの処理、および引き続く連結は、次の構築物：一方はリンカーを有し、もう一方はリンカーを有さないもの、を生成した。ＫｐｎＩ部位は、ＫｐｎＩでの制限および所望のリンカーをコードする二本鎖合成ＤＮＡとの再連結によって、任意の所望のリンカー配列を挿入する簡単な方法を提供する。図７Ａ〜７Ｂを参照のこと。
【００７８】
【化１６】

【００７９】
【化１７】

【００８０】
【化１８】

【００８１】
【化１９】

ヒンジ領域を除去するために、ヘリックス４および５の除去を、次のＰＣＲプライマーならびに鋳型としてＭＳＰ１コード配列のＳａｃ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメントを使用してＭＳＰ１のＣ末端部分を構成することによって実行した。
【００８２】
プライマーＡ（配列番号２０）：
【００８３】
【化２０】

プライマーＢ（配列番号２１）：
【００８４】
【化２１】

この増幅産物を、Ｓａｃ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、そして配列決定のためにｐＬｉｔｍｕｓ２８に連結した。ｐＥＴ ２８ベクターにおいてＳａｃ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理したヒスチジン化タグＭＳＰ１構築物を、ＭＳＰ１Ｄ４−５を生成するために上記の断片と連結した。
【００８５】
【化２２】

【００８６】
【化２３】

ヘリックス５および６の除去を、同じ様式で行なったが、以下のプライマーを用いた２つの別々のＰＣＲ工程を、１回目の反応（反応１、プライマーＣ：
【００８７】
【化２４】

配列番号２４；およびプライマーＤ：
【００８８】
【化２５】

配列番号２５）および２回目の反応（反応２、プライマーＥ：
【００８９】
【化２６】

配列番号２６；およびプライマーＦ：
【００９０】
【化２７】

配列番号２７）において使用した。
【００９１】
ＰＣＲ産物は、ヘリックス５および６の両方が欠失するＭＰＳのＮ末端部分およびＣ末端部分をコードし、そしてＮｈｅ Ｉ制限部位をそれぞれ含む。Ｎｈｅ Ｉ、Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを用いてのＰＣＲ生産物の消化後、フラグメントを、Ｎｃｏ Ｉ＋Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理したｐＥＴ ２８に連結し、ヘリックス５および６が欠失したＭＳＰ１Ｄ５−６のＤＮＡ配列を生成した。図９Ａ〜９Ｂを参照のこと。
【００９２】
【化２８】

【００９３】
【化２９】

（実施例２．合成ＭＳＰ遺伝子の構築）
ＭＳＰ１の合成遺伝子を、ＰＣＲを用いて補充された次の重複合成オリゴヌクレオチドを使用して作製した。コドン使用頻度を、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために至適化し、そして制限部位を、遺伝子のさらなる遺伝子操作のために導入した。
【００９４】
合成ヌクレオチドｔａｐｓ１ａ（配列番号３０）
【００９５】
【化３０】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ２ａ（配列番号３１）
【００９６】
【化３１】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ３ａ（配列番号３２）
【００９７】
【化３２】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ４ａ（配列番号３３）
【００９８】
【化３３】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ５ａ（配列番号３４）
【００９９】
【化３４】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ６ａ（配列番号３５）
【０１００】
【化３５】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ１ｂ（配列番号３６）
【０１０１】
【化３６】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ２ｂ（配列番号３７）
【０１０２】
【化３７】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ３ｂ（配列番号３８）
【０１０３】
【化３８】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ４ｂ（配列番号３９）
【０１０４】
【化３９】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ５ｂ（配列番号４０）
【０１０５】
【化４０】

合成ヌクレオチドｔａｐｓ６ｂ（配列番号４１）
【０１０６】
【化４１】

【０１０７】
【化４２】

以下は、半分の繰り返しが欠失したＭＳＰｐポリペプチドのアミノ酸配列である。
【０１０８】
【化４３】

【０１０９】
【化４４】

【０１１０】
【化４５】

容易に生成し得る他の構築物は、上記の置換（すなわち、以下：ヒンジ欠失、ヒンジ置換、半分の繰り返しの欠失、ヒスチジンタグ、ＭＳＰ２に対する異なるリンカーの任意の組み合わせを伴なう、ＭＳＰ１またはＭＳＰ２）を含む。
【０１１１】
（実施例３．組換えＭＳＰの発現）
ＭＳＰタンパク質を発現するために、核酸構築物を、ｐＥＴ２８発現ベクター中のＮｃｏ Ｉ部位とＨｉｎｄ ＩＩＩ部位との間に挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。形質転換体を、選抜のためにカナマイシンを使用したＬＢプレート上で増殖させた。コロニーを、３０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含むＬＢ培地で増殖させる５ｍｌの開始培養物を接種するために使用した。過剰発現のために、３０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む１００容量のＬＢ培地に１容量のオーバーナイト培養液を添加することによって、培養物を接種し、そして振盪フラスコ中、３７℃で増殖させた。６００ｎｍの吸光度で０．６〜０．８に達するときに、イソプロピル ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの濃度まで添加し、発現を誘導し、そして細胞を遠心分離で回収する前に３〜４時間以上増殖させた。細胞ペレットを、瞬間凍結し、そして−８０℃で保存した。
【０１１２】
（実施例４．組換えＭＳＰの精製）
ヒスチジンタグ化ＭＳＰの精製を、以下のように行なった。１リットルの発現培養液からの凍結細胞ペレットを、２５ミリリットルの、１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオリドを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に再懸濁した。Ｔｒｉｔｏｎ −Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を、１％の最終濃度になるように蒸留水中の１０％（ｗ／ｖ）ストックから添加した。再懸濁された細胞を、５０％デューティサイクル、５のパワーセッティングで、１分オン５分オフの４サイクル間、ブランソンプローブソニファー（Ｂｒａｎｓｏｎ ｐｒｏｂｅ ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて氷上で超音波処理した。生じた溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ ４５ ローターの超遠心分離機において、３０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。生じた上清を、０．２２ｍｍナイロンシリンジフィルターを通して濾過した。塩濃度を、水中の４Ｍ ＮａＣｌストックから０．５Ｍに調整し、そしてカラムに充填した５ｍｌ Ｈｉ−Ｔｒａｐニッケル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に適用した。
【０１１３】
６Ｈ−ＭＳＰ１のために、カラムを、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２０ｍｌ 緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５Ｍ ＮａＣｌ）、続いて、２０ｍｌ 緩衝液＋５０ｍＭ コール酸ナトリウム、次いで２０ｍｌ 緩衝液そして１００ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液２０ｍｌを用いて洗浄した。Ｈｉｓ−タグ化ポリペプチドを、０．５Ｍイミダゾール含む緩衝液１５ｍｌで溶出する。
【０１１４】
６Ｈ−ＭＳＰ２のために、カラムを１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２０ｍｌ 緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５Ｍ ＮａＣｌ）；２０ｍｌ 緩衝液＋５０ｍＭ コレート；２０ｍｌ 緩衝液；３５ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液２０ｍｌ用いて、洗浄した。次いで、Ｈｉｓ−タグ化ポリペプチドを、０．５Ｍイミダゾールを含む緩衝液１５ｍｌで溶出し、そして精製したタンパク質を、１０，０００ＭＷ カットオフのセルロース透析膜を用いて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌに対して透析する。
【０１１５】
（実施例６．ＭＳＰを含むナノスケール粒子の生成）
本発明のＭＳＰタンパク質を脂質を用いて再構成するために、精製ＭＳＰを、１０，０００ＭＷカットオフのフィルターを用いて加圧限外濾過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ）中で、約２〜６ｍｇタンパク質／ｍｌまで濃縮した。タンパク質の濃度を、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、または理論的な吸収係数を用いてＡ２８０の測定によって決定した。クロロホルムストック溶液中のリン脂質（この場合、ジパルミトイルホスファチジルコリンであるが、異なるホスファチジルコリンおよびホスファチジルコリンと他の脂質との混合物も使用し得る）を、窒素流下で乾燥し、そして真空下で終夜静置した。ホスフェート分析を実施して、クロロホルムストック溶液の濃度を決定した。乾燥させた脂質フィルムを、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび５０ｍＭコール酸ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０またはｐＨ７．５）の緩衝液に再懸濁し、２５ｍＭの最終脂質濃度を得た。懸濁液を、ボルテックスし、そして５０℃に加熱して透明な溶液を得た。リン脂質溶液を、ＭＳＰ１：脂質について２：２００のモル比およびＭＳＰ２：脂質について１：２００のモル比を得るように、ＭＳＰの溶液（２〜６ｍｇ／ｍｌタンパク質）に加えた。この混合物を、３７℃で一晩インキュベートし、次いでコレートを含まない１０００容量の緩衝液に対して、緩衝液を４回交換しながら２日〜３日かけて透析した。
【０１１６】
（実施例７．係留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）膜タンパク質の組み込み）
組織因子（ＴＦ）は、代表的な係留膜タンパク質である。この係留膜タンパク質に対するＭＳＰ技術の価値を実証するために、組換えヒトＴＦを、ＭＳＰ支持ナノディスク中に組み込んだ。この組換えタンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通アンカー、および短縮細胞質ゾルドメインから成る。短縮は、細菌酵素によってタンパク質分解を受けるタンパク質のＣ末端部分を取り除くことによって、タンパク質の均質性を増大させる。この改変は、ＴＦ活性に影響を与えない。タンパク質に対するさらなる改変としては、Ｎ末端輸送ペプチドおよびＨＰＣ４エピトープタグが挙げられる。この輸送ペプチドは、組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の膜間腔（ペプチド配列が切断される空間）に発現したタンパク質を指向する。ＨＰＣ４エピトープは、Ｃａ^２＋依存性抗体を用いたアフィニティー精製を可能にし（Ｒｅｚａｉｅら、１９９２）、そしてＴＦ活性に影響を与えない。
【０１１７】
８０％ホスファチジルコリンおよび２０％ホスファチジルセリンを含む２５ｍＭの脂質混合物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中の５０ｍＭ コレートで、可溶化した。ＴＦ、ＭＳＰ１および脂質（１：１０：１０００の比）を混合し、そして３７℃で一晩インキュベートした。次いで、サンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液（コール酸を含まない）に対して、２時間３７℃で（１０，０００ダルトン分子量カットオフの膜にて）透析した。次いで、透析を、さらに６時間、２時間ごとに緩衝液と交換しながら４℃で続けた。次いで、約１ｍｌのサンプルを、ＹＭ−１０遠心分離濃縮装置を用いて２５０μｌより下に濃縮し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ １０／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ ゲル濾過カラムに注入した。サンプルを、上記に記載するのと同一の緩衝液（コール酸を含まない）を用いて、０．５ｍｌ／分で溶出した。クロマトグラフィーからの画分を、８％〜２５％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで泳動し、外見上の大きさを決定し、次いで凝固活性について確認した。ＭＳＰ１ナノディスクの過剰集団中に組み込まれたＴＦの溶出を示すクロマトグラムを、図１６Ａ〜１６Ｂに示す。
【０１１８】
いくつかのディスク画分中のＴＦの活性を、ヒト血清を用いた凝固アッセイによって決定した。活性を、凝固時間の逆元として画分２５〜２８においてモニターした。活性は、４０ｈｒ^−１にて画分２５で最も高く、そして３０ｈｒ^−１にて画分２８を通して減少した。このことは、ナノディスクピークの先端がＭＳＰ支持二重層におけるＴＦの組み込みに起因してより大きい有効質量を有するという点で、サイズクロマトグラムから予想される。したがって、このアッセイは、ＴＦが活性なコンフォメーションでナノディスクに組み込まれること、およびナノディスクの膜環境がネイティブの膜系の環境を非常に模倣するということを実証する。
【０１１９】
シトクロムｂ５は、膜二重層を貫通する単一膜固着アンカードメインを有する、膜結合ヘムタンパク質である。そのネイティブな膜から可溶化されたシトクロムｂ５は、界面活性剤の非存在下で大きな凝集体として存在し、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動上での分離したバンドよりもスメアーに現れる。自己アセンブリプロセスを介したナノディスクの形成（ここで、シトクロムｂ５は、ＭＳＰおよび脂質の調製物に添加される）は、シトクロムｂ５のナノディスク構造への組み込みを生じる。これは、右のパネルの図１７Ｂを参照して、レーン４におけるナノディスクに対応するバンドの強力なヘム染色によって確認される。陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離されるシトクロムｂ５含有ナノディスクを、図１７Ｂのレーン５および６に示す。２つのピークを、３１０ｍＭ ＮａＣｌ付近および３７０ ＮａＣｌ付近にて、陰イオン交換カラムから溶出した。ディスク単独を３１０ｍＭ ＮａＣｌ付近で溶出し、シトクロムｂ５単独を４５０ｍＭ ＮａＣｌと７００ｍＭ ＮａＣｌとの間で溶出した。これらのデータは、シトクロムｂ５がＭＳＰ技術を用いて好首尾に可溶化され得ること、およびシトクロムｂ５を含むディスク複合体がクロマトグラフィーによって分離され得、そして所望されない凝集材料から精製され得ることを示す。精製材料のヘム発色団の光学吸収特性は、ネイティブコンフォメーションにおけるヘム活性部位を実証する。
【０１２０】
ナノディスクをまた、２０μｌのａｐｏ Ａ−Ｉ（１０ｍｇ／ｍｌ）、６．６μｌ シトクロムｂ５（０．５ｍＭ）および５０μｌ 卵ホスファチジルコリン／コール酸ナトリウム（１１．２卵ＰＣ、６．２ｍｇ／ｍｌ コール酸ナトリウム）を混合し、一晩４℃でインキュベートすることによって形成させ得、続いてコレートを除去するために透析した。精製を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ（ｐＨ８．０）中で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣ陰イオン交換カラムを用いて達成した。直線勾配を、０〜１Ｍ ＮａＣｌで２０分間、０．５ｍｌ／分にて実行した。
【０１２１】
（実施例８．包埋（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）膜タンパク質組み込み）
ウサギ肝臓ミクロソーム由来のシトクロムＰ４５０ ２Ｂ４、ヒト肝臓ミクロソーム中に天然に見出されるシトクロムＰ４５０ ３Ａ４、および昆虫ミクロソーム由来のシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１は、代表的な包埋膜タンパク質である。
【０１２２】
シトクロムＰ４５０ ２Ｂ４を、フェノバルビタールを用いた誘導後に、ウサギ肝臓ミクロソームから単離した。２Ｂ４ナノディスクの形成は、以下のようである。シトクロム Ｐ４５０ ２Ｂ４を、界面活性剤透析方法によってディスク中に再構成した。この緩衝液は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールからなる。ａｐｏ Ａ−Ｉ、コール酸およびリン脂質の混合物（１：２２０：１１０のモル比）を、３７℃で８時間インキュベートし、続いてＰ４５０（１：０．５、ａｐｏ Ａ−Ｉ：Ｐ４５０モル比）を添加し、室温で一晩インキュベートした。この混合物を、１０，０００ＭＷカットオフのｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて室温で２時間透析し、続いて、緩衝液を交換し、透析を４℃で続けた。Ｐ４５０含量の８２％がこれらの条件下で再生され得ることが見出された。透析後、この混合物を、再構成緩衝液中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上に注入し、室温で０．２５ｍｌ／分の流速にて０．５ｍｌの画分で収集した。画分を８〜２５％勾配のネイティブゲル上でのネイティブポリアクリルアミドゲル勾配ゲル電気泳動、およびＰｈａｓｔｇｅｌシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてクマシー染色を使用して、アッセイした。
【０１２３】
通常肝臓ミクロソーム由来のヒトシトクロムＰ４５０ ３Ａ４をまた、クローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、精製し、そしてＭＳＰ支持二重層ナノディスクに組み込んだ。１０ナノモルのＭＳＰ２、１マイクロモルの脂質、５ナノモルのシトクロムＰ４５０ ３Ａ４タンパク質および２マイクロモルのコール酸を、一緒に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、このインキュベートした混合物を、１０Ｋ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中で透析した。この透析は、１０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液を用いて実行した。サンプルを３７℃で６時間透析し、続いて緩衝液を交換し、そして１２時間間隔で２回緩衝液を交換しながら４℃で透析を続けた。次いで、サンプルを、透析緩衝液中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳＥ）上で、室温にて０．５ｍｌ／分の流速で分画した。
【０１２４】
４つのグラフ（図１８〜２０）は、カラムから溶出されるシトクロムＰ４５０ ３Ａ４（４１７ｎｍの吸光度で観察される）およびナノディスク（ＭＳＰおよび３Ａ４タンパク質の両方が吸収する２８０ｎｍにてモニターされる）の保持時間が同時（約２４分）であることを示す。この溶出時間はまた、ディスクタンパク質複合体の計算した保持時間と密接に相関する。このことを支持するさらなる証拠は、溶出粒子のサイズを直接測定するネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動である（図２１）。
【０１２５】
シトクロムＰ４５０ ６Ｂ１は、別のモデルの包埋膜タンパク質である。このシトクロムは、Ｐａｐｉｌｉｏ ｐｏｌｙｘｅｎｅｓ（黒アゲハ）から単離された。これらの蝶は、もっぱらフラノクマリン（ほとんどの生物に対して光毒性である植物代謝物）を産生する植物を餌とする。シトクロム６Ｂ１は、フラノクマリンの解毒を触媒する。
【０１２６】
本発明のＭＳＰ方法論の新規有用性を示すために、本発明者らは、膜タンパク質のレパートリーを含む単離された膜が、膜タンパク質をナノディスクに組み込むための供給源として求められ得ることを実証した。重要な例示的な実施形態は、異種発現系として広範に使用される、一般的な昆虫細胞（Ｓｆ９）−バキュロウイルス発現系の使用である。したがって、本発明者らは、ミクロソーム調製物が過剰発現された昆虫６Ｂ１および過剰発現された昆虫ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼも含むように、同時感染された昆虫細胞株を使用した。これらの実験において、本発明者らは、ＭＳＰナノディスクを使用して、別のシトクロムＰ４５０システムを可溶性単分散粒子に組み込み得ることを実証するだけでなく、このＰ４５０の供給源が単にこのタンパク質を含む膜全体であり得ることも実証する。
【０１２７】
標準的なバキュロウイルス発現系を使用して、過剰発現された昆虫シトクロム６Ｂ１および昆虫ＮＡＤＰＨ Ｐ４５０レダクターゼを有するミクロソーム調製物を得た。ミクロソーム調製物に含まれる脂質濃度に基づいて、ＭＳＰ技術を使用して、１１０：１：２２０の脂質：ＭＳＰ１：コレートの比率で用いて、ミクロソームタンパク質をナノ粒子ディスク中にアセンブリさせた。ミクロソームサンプルを、コレートを用いて界面活性剤で可溶化し、そしてＭＳＰ１と混合した。サンプルを４℃で２時間インキュベートした。界面活性剤を、透析または疎水性ビーズによって除去し得る。この実験において、ＢＩＯＢＥＡＤＳ（疎水性ビーズ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を過剰に添加し（１ｍｌのディスク混合物当たり０．２５ｇ）、４℃で２時間インキュベートして界面活性剤を除去した。サンプルをビーズから外し、Ｈｉｓ_６−タグ化ＭＳＰを、Ｎｉ^２＋樹脂を用いたバッチ精製方法を用いることによって単離した。次いで、ＭＳＰディスクを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイジングカラムクロマトグラフィーによって単離した（図２２）。Ｈｉｓ_６−タグ化ディスクへのＰ４５０の組み込みの後、ニッケルアフィニティーカラム精製した分画およびサイジングカラム精製した分画のＣＯ吸収分光法を行った（図２４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行して、ディスクへのシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１の組み込みを確認した（図２３）。
【０１２８】
シトクロムＰ４５０のレダクターゼに対する内因性（天然の）比率は、約１０〜２０である。ディスクへの再構成後のシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１の活性を得るために、過剰量のレダクターゼが再構成混合物に添加されることが好ましく、その結果、Ｐ４５０分子およびレダクターゼ分子の両方が、単一のディスクに分けられる。レダクターゼが外因性に添加されたミクロソーム調製物の追加が、好首尾に実証された。
【０１２９】
ミクロソーム調製物を用いてディスクを作製するためのプロトコルを、１ヶ所改変して使用した。コレートを用いたミクロソーム調製の可溶化工程後であって、かつＭＳＰ１の添加前に、外因性ラットレダクターゼを添加した。そうでなければ、同一のディスクアセンブリ手順および精製手順を続けた。サンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイジングカラムによって分離し、ここで、２８０ｎｍにおける吸光度は、ＭＳＰ１の存在を示し、４２０ｎｍおよび４５６ｎｍにおける吸光度は、鉄の種の存在を示し、そして４５６ｎｍにおける吸光度はまた、レダクターゼの存在を示す。４５６〜４２０ｎｍの比率プロットを作製した；これは、４５６ｎｍでの吸光度がシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１と関連する吸光度を超え、ゆえに、レダクターゼによる吸光度に寄与し得る、クロマトグラム上の位置を示し、。保持時間は、シトクロムＰ４５０ ６Ｂ１およびレダクターゼを含む１０ｎｍ粒子の存在を反映する（図２６）。
【０１３０】
精製されたタンパク質、膜フラグメントまたは破壊された膜を有するＭＳＰ支持ナノディスクを、例えば、高スループットのスクリーニングベンチャーに使用して、新規の医薬および他の生物学的に活性な分子を同定し得る。
【０１３１】
（実施例９．内在性膜タンパク質組み込み）
バクテリオロドプシンは、モデルの内在性膜タンパク質である。バクテリオロドプシンを、以下の手順を用いてナノスケール構造に組み込んだ。このプロトコルは、他のタンパク質に対しても有用である。バクテリオロドプシンを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から凍結乾燥した紫膜として得た。１ｍｇ ＢＲを、１ｍｌの２５ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．９）に懸濁した。同じ緩衝液中の１ｍｌの９０ｍＭ ｎ−オクチル Ｂ−Ｄ−グルコピラノシドを添加し、サンプルを暗所に２４℃で一晩静置した。この処理によって、界面活性剤で可溶化されたモノマー形態を生じる（Ｄｅｎｃｈｅｒら、１９８２）。ＢＲを定量し、５５０ｎｍにて６３，０００のモル吸光率と見積もった。ＢＲ（７．８μＭ）を、ＭＳＰ１（９７ｍＭ）またはＭＳＰ２（１１０ｍＭ）およびコレート（５０ｍＭ）と混合し、１０：１のＭＳＰ１：ＢＲまたは５：１のＭＳＰ２：ＢＲの最終モル比および約８ｍＭのコレート濃度を得た。リン脂質を用いた再構成のために、脂質を、５０ｍＭ コレートの存在下で上記のように可溶化し、１（ＭＳＰ１）：１１０（脂質）：０．１（ＢＲ）のモル比で、ＭＳＰ１と混合した。この混合物を室温で約３時間インキュベートし、続いて、１０，０００ＭＷカットオフの透析デバイス（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、１０００容量の緩衝液に対して一晩透析した。緩衝液を数回交換しながら、透析を４℃で２日間続けた。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を使用し得る。この緩衝液（ｐＨ７．５またはｐＨ８）もまた、好首尾に使用した。
【０１３２】
ヒト由来の５−ヒドロキシトリプタミン １Ａ Ｇタンパク質共役レセプターを、ＭＳＰ含有ナノ粒子に組み込んだ。市販の昆虫細胞発現系（これは、ヒト５−ヒドロキシトリプタミン １Ａ ＧＰＣＲを含有する膜画分を提供する）を、ＭＳＰ組成物を用いて支持した。簡単に言うと、５−ＨＴレセプター含有膜調製物を、４５：４５：１０の比でリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、ＭＳＰ１およびコレートと混合した。
【０１３３】
市販のＳｆ９昆虫細胞膜調製物（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で過剰発現される５−ＨＴ１Ａレセプターを、以下のプロトコルを用いて可溶化した。クロロホルム中のＰＯＰＣ、ＰＯＰＳ、およびＰＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）を、４５：１０：４５のモル比で混合し、窒素流下で乾燥させ、ついで、数時間減圧下に置いて、残留溶媒を除去した。リン脂質を、２５ｍＭ リン脂質濃度にて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ コール酸ナトリウムの緩衝液中に分散させた。５マイクロリットルのｓｆ９膜調製物（０．２ｍｇ／ｍｌ タンパク質）、緩衝液中の１．６２マイクロリットルのリン脂質、２．４マイクロリットルのＭＳＰ１（４．２ｍｇ／ｍｌ）および０．２８マイクロリットルの４Ｍ ＮａＣｌを混合し、氷上で１時間静置した。この混合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いて１００マイクロリットルの総容量に希釈し、４℃にて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）に対して、ｍｉｎｉ ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中で透析した（１リットルの緩衝液を２回交換）。ナノディスクに会合した５ＨＴ１Ａレセプター量を決定するために、放射性標識したリガンドをレセプターに結合させ、そしてディスク−レセプター−リガンド複合体を、以下のプロトコルに従って、ＭＳＰ１の存在下で６−ヒスチジンタグを用いて単離した。透析後、この混合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いて２００マイクロリットルの総容量に希釈した。９５マイクロリットルの希釈した混合物を、２つのチューブの各々に入れた。１０５マイクロリットルのストック試薬を添加して、最終容量２００マイクロリットル中、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ アスコルビン酸の最終濃度を得た。トリチウム標識した８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ（比放射能１３５０００Ｃｉ／モル）を各チューブに添加して、１．５ｎＭの濃度を得た。コントロールとして、標識していないメテルゴリン（最終濃度１００マイクロモル濃度）を競合リガンドとして一方のチューブに添加した。氷上で１時間後、この混合物を２００マイクロリットルのＮｉキレート樹脂に適用して、６ヒスチジンタグ化ＭＳＰ１ディスクと会合するレセプターに特異的に結合させた。この樹脂を０．５ｍｌの冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄し、非特異的に結合したリガンドを除去した。レセプター／ディスク複合体に結合した、特異的に結合した放射性標識８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＮａＣｌ中の０．５ｍｌの０．５モル濃度イミダゾールを用いて溶出した。シンチレーションカクテルを溶出物と混合し、特異的に結合した放射性リガンドを、シンチレーション計数によって決定した。ｓｆ９膜に最初に存在したレセプターのうち、５％と１５％との間のレセプターが、ＭＳＰ１ナノディスクと会合することが見出された。
【０１３４】
５−ＨＴ ＧＰＣＲが組み込まれる粒子を透析した。機能性（リガンド結合に関して）を、トリチウム化した８−ＯＨ−ＤＰＡＴ（このレセプターのアゴニスト）を含む緩衝液に対する透析を用いて試験した。次いで、その粒子をＮｉ−ＮＴＡカラムに流し、ＭＳＰ１上のヒスチジンタグを介して結合させ、その粒子に結合していない８−ＯＨ−ＤＰＡＴからその粒子を分離させ、次いで、カラムに結合した物質を溶出した。トリチウム標識したアゴニストの会合を実証し、これによって、組み込まれたＧＰＣＲがアゴニストに結合するというその能力を保持することを示した。
【０１３５】
（実施例１０．ＭＳＰ支持されたナノディスクリン脂質アセンブリの分析）
膜スカホールドタンパク質およびリン脂質の自己アセンブリから生じる、さらなる標的タンパク質を有するかまたは有さない粒子を、以下のように分析した。
【０１３６】
バクテリオロドプシン含有粒子を透析して、得られた混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入し、そして室温にて０．５ｍｌ／分で緩衝液を用いて溶出した。吸光度をタンパク質について２８０ｎｍでモニタリングし、ＢＲについて５５０ｎｍでモニタリングした。０．５ｍｌの画分を収集した。サイログロブリン（６６９ｋＤａ、ストークス直径１７０Ａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ、ストークス直径１２２Ａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ、ストークス直径９２Ａ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（１４０ｋＤａ、ストークス直径８２Ａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ、ストークス直径７１Ａ）、およびウマ心臓シトクロムｃ（１２．４ｋＤａ、ストークス直径３５．６Ａ）の混合物を使用してカラムを較正した。
【０１３７】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を、緩衝液下の鋭い硝酸ケイ素プローブを用いる接触モードで、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩａを用いて実行した。ＭＳＰ１およびＭＳＰ２のジパルミトイルホスファチジルコリン粒子を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２中、１：５０の第Ｘａ因子：ＭＳＰタンパク質（質量）で８時間処理した。２〜１０ｍｌのサンプルを、新たに切断した雲母表面上に、２０ｍｌの画像化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）と共に配置し、そして流体セル中にサンプルを載せる前に、３０分以上インキュベートした。数ｍｌの緩衝液を、流体セルを通して流して、未吸着の物質を除去した。
【０１３８】
ナノスケールの粒子のリン酸分析を、以下のように実行した。リン酸アッセイ手順は、Ｃｈｅｎら（１９５６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：１７５６−１７５８ならびにＦｉｓｋｅおよびＳｕｂｂａｒｏｗ（１９２５）から適合させた。ほぼ４０ｎｍｏｌのリン酸脂質を含有するサンプルを、ガラスチューブ中で乾燥させた。７５ｍｌの８．９Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を各チューブに添加し、そして２１０℃で３０分間加熱した。１滴の３０％ Ｈ_２Ｏ_２を各チューブに添加し、そして３０分間加熱した。チューブを冷却し、０．６５ｍｌのＨ_２Ｏを添加し、その後８３．３ｍｌの２．５％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウム四水和物を添加し、その後ボルテックスして、８３．３ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を添加した。混合後、チューブを沸騰水浴中に７分間配置した。吸光度を、８２０ｎｍで読み取った。吸光度を、０〜１００ｎｍｏｌのリン酸の、リン酸カリウム標準を使用して較正した。カラムクロマトグラフィーからの緩衝液ブランクを、ＭＳＰタンパク質について含んだ。
【０１３９】
（実施例１２．表面上のＭＳＰ支持された構造）
ＭＳＰおよび目的のタンパク質を含むナノディスクを、金表面上にアセンブルし得る。これの有用性は、溶液に対する、ナノディスクアセンブリ中に組み込まれた標的の、得られるエピタキシャル提示に関する。このことは、誘電性造影剤を用いて標的タンパク質にタグ化された他の高分子または低分子の結合を定量するための、理想的な系を提供する。このような測定を達成する一般的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用する。ＳＰＲは、表面での生体分子の相互作用をモニタリングするために使用される一般的な技術である。ＳＰＲが、金表面上の未標識タンパク質の相互作用を迅速に検出および定量する能力は、ディスク上の多様な膜タンパク質（包埋タンパク質および可溶化タンパク質）についての、高スループットチップアッセイを生み出すために有用である。
【０１４０】
さらなるチオール化脂質およびＭＳＰ１タンパク質を含むか、または含まないかのいずれかである、リン脂質ＤＰＰＣからなるディスクを、以下のように調製した。ホスファチジルコリンを含有する２５ｍＭの脂質混合物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ中５０ｍＭのコール酸塩で可溶化し、１５０ｍＭ ＮａＣｌをｐＨ８．０で合わせて、３７℃で一晩インキュベートした。チオール化ディスクについて、９０％のホスファチジルコリンおよび１０％のチオール化脂質（ＡＴＡ−ＴＥＧ−ＤＳＰＡ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を、チオール化脂質中のチオールを曝すために、３．３ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ、６６．７ｍＭのホウ酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中にｐＨ９．０で可溶化した。ＭＳＰ１および脂質（１：１００）を合わせて、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、このサンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液（コール酸を含まない）に対して３７℃で２時間透析した（１０，０００ＭＷのカットオフ膜）。次いで、透析を、２時間毎に緩衝液を交換して、さらに６時間４℃にて継続した。約１ｍｌのサンプルをＹＭ−１０遠心分離濃縮機を使用して２５０μｌ未満に濃縮し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａの１０／３０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲゲル濾過カラムに注入した。サンプルを、０．５ｍｌ／分の流速で、コール酸を含まない上記の緩衝液を使用して、このカラムから溶出した。クロマトグラフィーからの画分を、８〜２５％の勾配のポリアクリルアミドゲルを使用する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、見かけのサイズを決定した。
【０１４１】
記載されるように調製したナノディスクサンプル（３〜２０μＭ）を、ＳＰＲ機器に注入して、このディスクが金表面に結合するか否かを決定した。ＤＰＰＣおよび１０％チオール化脂質のディスクの両方が、金表面に吸着し、そして修飾された金表面は、単層のメチル終結チオール（ノナンチオール）またはカルボキシ終結チオール（１１−メルカプトウンデカン酸）で被覆された。チオール化ディスクを、３．３ｍＭ Ｔｒｉｓ、６６．７ｍＭ ホウ酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）からなる緩衝液を使用して注入した。ＤＰＰＣディスクを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５またはｐＨ８．０）を使用して注入した。全ての条件下で、このディスクは、過酷な条件（０．５Ｍ ＨＣｌ）でさえも、取り除かれなかった。表面被覆は、注入されたディスクの濃度の増加と共に増加することが示された（３μＭ 対 １９μＭ）。ディスクは、完全にパックされた単層を含まない；従って、表面被覆は、０．５４７の妨害制限（同一の非重複硬質スフィアとしての表面モデリングディスクへの、ランダムな連続的吸収に基づく、理論的最大被覆）によって制限される。ディスクの全単層についての被覆を、５．５ｎｍのディスク高さおよび１．４５と１．５との間の屈折率の仮定に基づいて算定した。全単層値に妨害制限を乗じて、最大被覆を決定し、次いで、この最大被覆を使用して、実験値に基づく被覆％を決定した。ディスク濃度が少なくとも１０μＭであった場合、この推定被覆は、約６２％と約１０３％の間であった。ナノディスクの金表面に対する会合を実証する得られたＳＲＰトレースは、図２７に示される。
【０１４２】
（文献の列挙）
【０１４３】
【表１】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、膜タンパク質を組み込む異なった型の脂質凝集を概略的に例示する。小さな円および三角形は、それぞれ、このレセプタータンパク質の細胞内ドメインおよび細胞外ドメインについてのリガンドを表す。
【図２】 図２は、αヘリックスのホイール構造を示し、このホイール構造は、αヘリックスにその両親媒性特性を与える、疎水性アミノ酸側鎖および親水性アミノ酸側鎖の配置を有する。
【図３】 図３Ａは、二重層のＭＳＰ安定化についての「ピケットフェンス（ｐｉｃｋｅｔ ｆｅｎｃｅ）」モデルの概略表示である。これらの円は、直径が約１．５ｎｍであり、そしてヘリックスの１回転当たり０．５４ｎｍ（１回転当たり３．６アミノ酸残基）である、単一のαヘリックスを表す。図３Ｂは、ＭＳＰに支持された二重層の「ベルト」モデルの概略を示す。これらの長方形は、約１．５ｎｍの直径および約３．９ｎｍのヘリックス長を有する、単一のαヘリックスを表す。
【図４】 図４は、親アポＡ−Ｉ分子についての、配列および２次構造予測を表す。星印は、ヘリックスの繰り返しの境界を示す。太字で、下線を引いた配列は、αヘリックス構造を示し、イタリック体は、β構造を示し、そしてプレーンテキストは、潜在的なターンを示す。
【図５】 図５Ａ〜図５Ｇは、種々の操作されたＭＳＰ構造を図解し、配列解析に基づいて、ピケットフェンストポロジーおよびヘリックスアサイメントで示される。図５Ａ：ＭＳＰ１は、ハーフリピート（半反復）の位置を示す。ハーフリピート１は、分子動力学シミュレーションに基づいて乱雑化される（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、１９９７）。図５Ｂ：ヒンジドメインの運動。図５Ｃ：ハーフリピートの除去。図５Ｄ：ヘリックス３およびヘリックス４とのヒンジドメインの置換。図５Ｅ：ＭＳＰ２、これは、ＭＳＰ１の配列のタンデムな重複を有する。図５Ｆ：ＭＳＰ１Δ１を作製するためのハーフリピート１の除去。図５Ｇ：ＭＳＰ２Δ１を形成するためのＭＳＰ１Δ１のタンデムリピート。
【図６】 図６Ａ〜図６Ｂは、人工ＭＳＰを増幅するために使用されるＰＣＲストラテジーを、図として例示する。
【図７】 図７Ａ〜図７Ｂは、長いリンカー配列を有するＭＳＰ２の線図（図７Ａ）およびこのリンカー配列を有さないＭＳＰ２の線図（図７Ｂ）を例示する。
【図８】 図８Ａ〜図８Ｂは、ヘリックス４およびヘリックス５を欠く、ＭＳＰ１誘導体をコードする人工配列を構築し、かつこれを発現するためのストラテジーを例示する。
【図９】 図９Ａ〜図９Ｂは、ヘリックス５よびヘリックス６を欠く、ＭＳＰ１誘導体をコードする人工配列を構築し、かつこれを発現するためのストラテジーを例示する。
【図１０】 図１０は、ＭＳＰ１構造へと再配置されたバクテリオロドプシンのゲル濾過溶出プロファイルを提供する。
【図１１】 図１１は、リン酸脂質の添加の非存在下でのＭＳＰ１によって可溶化されたバクテリオロドプシンのゲル濾過クロマトグラムを示す。バクテリオロドプシンは、５５０ｎｍでの吸光度によって検出されるが、一方、ＭＳＰ１とバクテリオロドプシンタンパク質とは、２８０ｎｍにおける吸光度によって検出される。
【図１２】 図１２は、リン酸脂質の添加の非存在下でのＭＳＰ２によって可溶化されたバクテリオロドプシンのゲル濾過クロマトグラムである。バクテリオロドプシンは、５５０ｎｍでの吸光度によって検出されるが、ＭＳＰ２とバクテリオロドプシンタンパク質とは、２８０ｎｍにおける吸光度によって検出される。
【図１３】 図１３は、ＭＳＰに対する脂質の比を変える、ナノスケール粒子の形成を例示する。粒子は、脂質 対 ＭＳＰの示されたモル比において形成され、そして、この粒子は、ネイティブの勾配ゲル電気泳動によって、分離された。右に示されるように、ＭＳＰ１は、直径が８．２ｎｍ、９．６ｎｍおよび１０．６ｎｍの粒子を形成する。ＭＳＰ２は、主に９．６ｎｍの粒子を形成する。
【図１４】 図１４は、トリプトファン蛍光によってモニターされたときの、ジパルミトイルホスファチジルコリンによる、複合体におけるＭＳＰ１およびＭＳＰ２の粒子（直径９ｎｍ）の化学変性の結果を示す。励起は２８０ｎｍで存在し、そしてこの緩衝剤は１０ｍＭ Ｈｅｐｅｐｓ Ｈ７．５；０．１５Ｍ ＮａＣｌであった。
【図１５】 図１５Ａ〜１５Ｂは、ディスクに組み込まれ、そして固相支持体に付着された、膜タンパク質を示す。図１５Ａ：金の上での、レセプター−標的複合体の、ディスク結合レセプターおよびリガンドにより誘導されるアセンブリ。図１５Ｂ：ゲルマトリクスにおけるディスク結合レセプター。
【図１６】 図１６Ａは、８ｎｍおよび１０ｎｍのサイズを示す保持時間および２５〜２８分での組織因子活性（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する、ナノディスク粒子のサイジングカラムおける、ＨＰＬＣの結果を示す。図１６Ｂは、８〜２５％勾配のゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す；ＨＰＬＣによって単離され、かつＴＦを含む、ＭＳＰ１に支持されたナノディスク二重層は予測された分子量を有する。
【図１７】 図１７Ａ〜図１７Ｂは、８〜２５％勾配ゲルを使用して、ネイティブＰＡＧＥによって決定されるようなディスクへのシトクロムｂ５の分離を示す。レーン１、分子量マーカー；レーン２、シトクロムｂ５；レーン３、ディスク；レーン４、ディスク／シトクロム５ｂ；レーン５およびレーン６、陰イオン交換カラムから溶出した２つのプ−ルを表すディスクにおける、陰イオン交換精製したシトクロムｂ５。図１７Ａは、クマシーブルーで染色されたタンパク質を示す。図１７Ｂは、ヘム特異的染色を示す。２３２ｋＤａマーカータンパク質（カタラーゼ）はまた、ヘムに対して染色されたことに留意のこと。
【図１８】 図１８は、８５％ＤＰＰＣ、１５％ＰＯＰＣからなる１０ｎｍの二重層ディスクへと組み込まれたシトクロムＰ４５０ ３Ａ４のクロマトグラムである。
【図１９】 図１９は、８５％ＤＰＰＣ、１５％ＰＯＰＳからなる１０ｎｍの二重層ディスクへと組み込まれたシトクロムＰ４５０ ３Ａ４のクロマトグラムである。
【図２０】 図２０は、１００％ＤＰＰＣからなる１０ｎｍ二重層ディスクへと組み込まれたシトクロムＰ４５０ ３Ａ４のクロマトグラムである。
【図２１】 図２１は、３つのディスクサンプルを用いた、８〜２５％勾配ゲルにおけるＰＡＧＥの結果であり、この結果はナノディスク粒子のサイズと相関する。
【図２２】 図２２は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイジングカラムにおける、ＭＳＰ可溶化シトクロムＰ４５０ ６Ｂ１のＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を例示する。保持時間は、約１個の６Ｂ１（４２０ｎｍトレース）を含むナノディスク粒子を示す。この流速は、０．２５ｍｌ／分である。
【図２３】 図２３は、サンプル１（シトクロムＰ４５０ ６Ｂ１およびＮＡＤＰＨ Ｐ４５０レダクターゼを同時発現する細胞由来のミクロソーム膜で調製したナノディスク）を用いたＰＡＧＥの結果を例示する。サンプル２は、コントロールミクロソームを含む。
【図２４】 図２４は、［ＣＯ−Ｆｅ^２＋−ＣＯ−Ｆｅ^３＋］光学的差スペクトルを提供する。ナノディスクに取りこまれた活性シトクロムＰ４５０ ６Ｂ１は、４５０ｎｍで吸光する。
【図２５】 図２５は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイジングカラムによって分離されたサンプルのクロマトグラムを示す。保持時間は、サイズが１０ｎｍのｒＨＤＬ粒子を示す。
【図２６】 図２６は、ＭＳＰナノディスクにおける、シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびシトクロムＰ４５０ ６Ｂ１の同時組み込みを例示する。４５６ｎｍでの吸光度（主に、レダクターゼ） 対 ４２０ｎｍでの吸光度（主に、Ｐ４５０）の比が、保持時間の関数としてプロットされる。約２６分でのピークは、レダクターゼとシトクロムとの両方を含むナノディスク集団を示す。
【図２７】 図２７は、表面プラズモン共鳴によってモニターされる、金表面への、カルボキシル末端化されたチオールを含むＤＰＰＣナノディスクの結合を例示する。
【配列表】

Claims (9)

1. 膜スカホールドタンパク質であって、該膜スカホールドタンパク質は、水性環境において、リン脂質の非存在下で自己アセンブルするか、またはリン脂質もしくはリン脂質の混合物とアセンブルして、直径５ｎｍと５００ｎｍとの間のナノスケールの粒子になり、ここで、該膜スカホールドタンパク質は、両親媒性であり、そして該膜スカホールドタンパク質は、少なくとも１つのαヘリックスを形成し、膜スカホールドタンパク質が、配列番号６および配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、膜スカホールドタンパク質。
2. 前記膜スカホールドタンパク質が、リン脂質またはリン脂質の混合物とアセンブルして、直径５ｎｍと５００ｎｍとの間のナノスケールの粒子になり、リン脂質二重層が形成される、請求項１に記載の膜スカホールドタンパク質。
3. 前記リン脂質二重層が、円盤状である、請求項２に記載の膜スカホールドタンパク質。
4. 前記膜スカホールドタンパク質が、少なくとも１つの疎水性または部分的に疎水性のタンパク質と一緒に自己アセンブルし、直径５ｎｍと５００ｎｍとの間のナノスケールの粒子を形成し、該ナノスケールの粒子は、該膜スカホールドタンパク質および少なくとも１つの疎水性または部分的に疎水性のタンパク質を含む、請求項１に記載の膜スカホールドタンパク質。
5. 前記膜スカホールドタンパク質が、リン脂質の非存在下で自己アセンブルして、直径５ｎｍと５００ｎｍとの間のナノスケールの粒子を形成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の膜スカホールドタンパク質。
6. 前記ナノスケールの粒子が、直径５〜１００ｎｍである、請求項５に記載の膜スカホールドタンパク質。
7. 前記ナノスケールの粒子が、直径５〜５０ｎｍである、請求項６に記載の膜スカホールドタンパク質。
8. 膜スカホールドタンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、該膜スカホールドタンパク質は、配列番号６および配列番号９からなるアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ分子。
9. 請求項８に記載のＤＮＡ分子を含む、組換え宿主細胞。

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