JPH07108230B2 - 単純ヘルペスウイルス抗原の抽出または測定のための抽出組成物、抽出方法および診断試験キット - Google Patents
単純ヘルペスウイルス抗原の抽出または測定のための抽出組成物、抽出方法および診断試験キットInfo
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- JPH07108230B2 JPH07108230B2 JP2024560A JP2456090A JPH07108230B2 JP H07108230 B2 JPH07108230 B2 JP H07108230B2 JP 2024560 A JP2024560 A JP 2024560A JP 2456090 A JP2456090 A JP 2456090A JP H07108230 B2 JPH07108230 B2 JP H07108230B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、単純ヘルペスウイルス抗原の抽出および測
定に向けられる抽出組成物およびその使用に関する。こ
の発明は、また、その抽出組成物を含む診断試験キット
にも関する。本発明は、生物学的被検体中の単純ヘルペ
スウイルスを検出するための診断法において有用であ
る。
定に向けられる抽出組成物およびその使用に関する。こ
の発明は、また、その抽出組成物を含む診断試験キット
にも関する。本発明は、生物学的被検体中の単純ヘルペ
スウイルスを検出するための診断法において有用であ
る。
最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生体を検出しな
ければならない。これには殆どの場合に、生体に特有な
抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との反応が必
要である。商業的に成功するための試金石としては、さ
らに相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速であること
も必要である。
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生体を検出しな
ければならない。これには殆どの場合に、生体に特有な
抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との反応が必
要である。商業的に成功するための試金石としては、さ
らに相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速であること
も必要である。
イムノアッセイによって検出することができるかかる生
体の１つは、単純ヘルペスウイルスである。
体の１つは、単純ヘルペスウイルスである。
ワクチンや各種の抗ウイルス剤による各種ウイルスの抑
制が増大しているにもかかわらず、単純ヘルペスウイル
ス（以下「HSV」という）などの生体による感染には重
大な課題が残存する。
制が増大しているにもかかわらず、単純ヘルペスウイル
ス（以下「HSV」という）などの生体による感染には重
大な課題が残存する。
HSVには２つの型が存在し、第１の型は口の周辺で主に
生じ、第２の型は人体の性器周辺に主に生ずる。皮膚感
染およびウイルス性脳炎は、HSV感染によりもたらされ
る主な症例の単に２つの例にすぎない。
生じ、第２の型は人体の性器周辺に主に生ずる。皮膚感
染およびウイルス性脳炎は、HSV感染によりもたらされ
る主な症例の単に２つの例にすぎない。
ヘルペス感染の広く蔓延する性質のため、原因ウイルス
の検出のための迅速、簡便かつ信頼できる試験法を入手
することに相当な興味が存在する。しかしながら、既知
の診断法の使用では、しばしばHSVから区別できない類
似する数種のウイルスが存在する。従って、HSV−１ま
たはHSV−２について有用な診断試験は、これらのウイ
ルスにのみ特異的であり、EBウイルス、サイトメガロウ
イルス、出痘帯状疱疹ウイルスまたは他のすべてのウイ
ルス群に感受性を有しないものでなければならない。
の検出のための迅速、簡便かつ信頼できる試験法を入手
することに相当な興味が存在する。しかしながら、既知
の診断法の使用では、しばしばHSVから区別できない類
似する数種のウイルスが存在する。従って、HSV−１ま
たはHSV−２について有用な診断試験は、これらのウイ
ルスにのみ特異的であり、EBウイルス、サイトメガロウ
イルス、出痘帯状疱疹ウイルスまたは他のすべてのウイ
ルス群に感受性を有しないものでなければならない。
生物学的被検体中の生体からの抗原の抽出が、正確さ、
迅速さおよびアッセイ高感度が提供するのに重要事項と
なる。抽出には、超音波、加熱または遠心による細胞の
物理的な破砕を含む多種多様な方法が使用されている。
化学的な抽出組成物もまた開発されてきた。例えば、米
国特許第4,661,349号明細書は、ワクチンの調製に際し
て、HSVから90,000〜95,000ダルトンの分子量を有する
糖タンパク質Ｂの抽出および精製を記載する。抽出は、
中性pHでいくつかの非イオン界面活性剤またはアニオン
界面活性剤を使用して行われている。
迅速さおよびアッセイ高感度が提供するのに重要事項と
なる。抽出には、超音波、加熱または遠心による細胞の
物理的な破砕を含む多種多様な方法が使用されている。
化学的な抽出組成物もまた開発されてきた。例えば、米
国特許第4,661,349号明細書は、ワクチンの調製に際し
て、HSVから90,000〜95,000ダルトンの分子量を有する
糖タンパク質Ｂの抽出および精製を記載する。抽出は、
中性pHでいくつかの非イオン界面活性剤またはアニオン
界面活性剤を使用して行われている。
米国特許第4,430,437号明細書は、最初にpH8にてグリセ
リン、ノニデート（Nonidet）Ｐ−40非イオン界面活性
剤、デオキシコール酸ナトリウムおよびフェニルメチル
スルホニルフルオライドの混合物を使用し、次いでpH
8、100℃にてドデシル硫酸ナトリウム、メルカプトエタ
ノールで処理するHSVからヌクレオキャプシドタンパク
質の抽出を記載する。記載されている抽出方法には低い
pHと高い温度が重要である点が注目される。
リン、ノニデート（Nonidet）Ｐ−40非イオン界面活性
剤、デオキシコール酸ナトリウムおよびフェニルメチル
スルホニルフルオライドの混合物を使用し、次いでpH
8、100℃にてドデシル硫酸ナトリウム、メルカプトエタ
ノールで処理するHSVからヌクレオキャプシドタンパク
質の抽出を記載する。記載されている抽出方法には低い
pHと高い温度が重要である点が注目される。
当該技術分野では、単一試験装置に容易に適用できる感
度がよく、かつ迅速なアッセイを提供するための単純ヘ
ルペスウイルス抗原の抽出手段に対する需要が存在す
る。
度がよく、かつ迅速なアッセイを提供するための単純ヘ
ルペスウイルス抗原の抽出手段に対する需要が存在す
る。
本発明は、pH8.5〜12を有しそしてアルコールアミンも
しくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオキシド
との縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コール酸も
しくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン界面活
性剤を含んでなる単純ヘルペスウイルスから抗原を抽出
するのに有用な抽出組成物を提供する。
しくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオキシド
との縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コール酸も
しくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン界面活
性剤を含んでなる単純ヘルペスウイルスから抗原を抽出
するのに有用な抽出組成物を提供する。
さらに、単純ヘルペスウイルスを含有することが予期さ
れる被検体を前記抽出組成物と接触させることを特徴と
する単純ヘルペスウイルスからの抗原の抽出方法を提供
する。
れる被検体を前記抽出組成物と接触させることを特徴と
する単純ヘルペスウイルスからの抗原の抽出方法を提供
する。
また、この発明は、 A.前記抽出組成物で単純ヘルペスウイルスを含有するこ
とが予期される被検体から単純ヘルペスウイルス抗原を
抽出する工程、 B.抽出された抗原をそれに対する抗体と接触させて免疫
学的複合体を形成する工程、 C.被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標として
前記複合体の存在を測定する工程、を含んでなる単純ヘ
ルペスウイルスの測定方法も提供する。
とが予期される被検体から単純ヘルペスウイルス抗原を
抽出する工程、 B.抽出された抗原をそれに対する抗体と接触させて免疫
学的複合体を形成する工程、 C.被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標として
前記複合体の存在を測定する工程、を含んでなる単純ヘ
ルペスウイルスの測定方法も提供する。
さらに、前記抽出組成物を含んでなる単純ヘルペスウイ
ルスの測定に有用な診断試験キットを提供する。
ルスの測定に有用な診断試験キットを提供する。
好ましい態様では、本発明で使用される単純ヘルペスウ
イルス抗体がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（American Type Culture Collection;Rockvill
e,Maryland,U.S.）にHB−9684として寄託されているハ
イブリドーマ細胞系283−2A1−1D4−2C3に由来するモノ
クローナル抗体である。
イルス抗体がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（American Type Culture Collection;Rockvill
e,Maryland,U.S.）にHB−9684として寄託されているハ
イブリドーマ細胞系283−2A1−1D4−2C3に由来するモノ
クローナル抗体である。
本発明は、標準的な医療および微生物学的手法により患
者から得られた生物学的被検体中のHSVの存在を測定す
るための抽出組成物および抽出方法ならびにその測定方
法を含む。生物学的被検体としては、例えば、患者の頚
管、尿道、眼、咽喉または肛門に由来する被検体、なら
びに滑液または病巣由来の流体のごとき体液が含まれ
る。こうして得られる生物学的被検体は、測定される目
的の抗原を含むHSVまたはHSV感染細胞を含むことが予測
される。
者から得られた生物学的被検体中のHSVの存在を測定す
るための抽出組成物および抽出方法ならびにその測定方
法を含む。生物学的被検体としては、例えば、患者の頚
管、尿道、眼、咽喉または肛門に由来する被検体、なら
びに滑液または病巣由来の流体のごとき体液が含まれ
る。こうして得られる生物学的被検体は、測定される目
的の抗原を含むHSVまたはHSV感染細胞を含むことが予測
される。
従来技術の幾つかのアッセイは、ウイルス感染細胞その
ものの検出を目的として設計されているが、この発明の
利点はウイルスまたはウイルス感染細胞もしくは膜が効
率よく溶解され、比較的短時間で感度のよいアッセイを
提供するのに十分な抗原が抽出される点にある。抗原
は、試料中に存在する感染した宿主細胞そのものまたは
細胞膜、あるいはウイルス粒子から抽出されうる。
ものの検出を目的として設計されているが、この発明の
利点はウイルスまたはウイルス感染細胞もしくは膜が効
率よく溶解され、比較的短時間で感度のよいアッセイを
提供するのに十分な抗原が抽出される点にある。抗原
は、試料中に存在する感染した宿主細胞そのものまたは
細胞膜、あるいはウイルス粒子から抽出されうる。
本発明で検出可能な抗原は、HSV−１もしくはHSV−２ま
たはその両者のいずれかに存在する。ウイルス粒子の抗
原が抽出され、本発明により検出される。就中、糖タン
パク質抗原が容易に抽出され、本発明により検出され
る。
たはその両者のいずれかに存在する。ウイルス粒子の抗
原が抽出され、本発明により検出される。就中、糖タン
パク質抗原が容易に抽出され、本発明により検出され
る。
この発明の抽出組成物は、pH8.5〜12を有し、好ましく
はpH9〜11を有する。目的のpHは、適当な緩衝剤または
塩基を使用して得ることができる。ある種の緩衝剤は、
アルカリ条件ならびに緩衝能を提供するのに十分強い塩
基でもある。緩衝剤でない場合には、強塩基（例えば、
水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような水酸化
物）が目的のpHを得るのに使用され、次いでそのpHを維
持するのに緩衝剤が使用される。例えば、エタノールア
ミンの塩が緩衝剤として使用される場合には、強塩基を
使用してpH9.5を得る。
はpH9〜11を有する。目的のpHは、適当な緩衝剤または
塩基を使用して得ることができる。ある種の緩衝剤は、
アルカリ条件ならびに緩衝能を提供するのに十分強い塩
基でもある。緩衝剤でない場合には、強塩基（例えば、
水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような水酸化
物）が目的のpHを得るのに使用され、次いでそのpHを維
持するのに緩衝剤が使用される。例えば、エタノールア
ミンの塩が緩衝剤として使用される場合には、強塩基を
使用してpH9.5を得る。
本発明の組成物は、少なくとも0.05モル濃度、好ましく
は0.1〜１モル濃度の量で１種以上のアルコールアミン
類またはそれらの塩を含んでなる。使用できるアルコー
ルアミン類としては、エタノールアミン、ジエタノール
アミン、プロパノールアミン、トリエタノールアミンお
よびそれらの塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ピ
クリン酸塩および修酸塩）が挙げられる。その他は、当
業者にとって容易に明らかとなるであろう。場合によっ
て、アルコールアミン類またはそれらの塩の混合物を使
用してもよい。エタノールアミンまたはその塩が特に好
ましい。
は0.1〜１モル濃度の量で１種以上のアルコールアミン
類またはそれらの塩を含んでなる。使用できるアルコー
ルアミン類としては、エタノールアミン、ジエタノール
アミン、プロパノールアミン、トリエタノールアミンお
よびそれらの塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ピ
クリン酸塩および修酸塩）が挙げられる。その他は、当
業者にとって容易に明らかとなるであろう。場合によっ
て、アルコールアミン類またはそれらの塩の混合物を使
用してもよい。エタノールアミンまたはその塩が特に好
ましい。
本発明の組成物は、また、アルキルフェノールとエチレ
ンオキシドの縮合生成物である非イオン界面活性剤１種
以上を含む。好ましいアルキルフェノール類は、フェノ
ール上に炭素原子１〜20個の直鎖または分枝したアルキ
ル基を有する。オクチルフェノールが最も好ましい。一
般に、これらの化合物はエチレンオキシド基５〜35個を
有する。それらは、好ましくは７〜15個のエチレンオキ
シド基を有する。これらの非イオン界面活性剤は、既知
の方法と出発原料を使用して容易に製造されるが、多く
は市販されてもいる。最も好ましい界面活性剤は、商品
名Nonidet P−40の下で販売されている。
ンオキシドの縮合生成物である非イオン界面活性剤１種
以上を含む。好ましいアルキルフェノール類は、フェノ
ール上に炭素原子１〜20個の直鎖または分枝したアルキ
ル基を有する。オクチルフェノールが最も好ましい。一
般に、これらの化合物はエチレンオキシド基５〜35個を
有する。それらは、好ましくは７〜15個のエチレンオキ
シド基を有する。これらの非イオン界面活性剤は、既知
の方法と出発原料を使用して容易に製造されるが、多く
は市販されてもいる。最も好ましい界面活性剤は、商品
名Nonidet P−40の下で販売されている。
限定されるものでないが、その他の有用な非イオン界面
活性剤としては、商標Tritonの下で販売されている、例
えばTriton X−100およびTriton N101、または商標Brij
の下で販売されているもののようなポリオキシエチレン
エーテル類、商標Tween（例えば、Tween−20）の下で販
売されているもののようなポリオキシエチレンソルビタ
ン誘導体類、ならびに商標Tergitol（例えば、Tergitol
NPXおよNP−７）の下で販売されているもののようなポ
リグリコールエーテル類が挙げられる。他の有用な材料
は、特に界面活性剤の標準的な文献、McCutcheon's Emu
lsifiers and Detergents,1986編（McCutcheon Divisio
n,Publishing Co.,Glen Rock,N.J,U.S）を参考にした後
の当業者にとって容易に明らかであろう。
活性剤としては、商標Tritonの下で販売されている、例
えばTriton X−100およびTriton N101、または商標Brij
の下で販売されているもののようなポリオキシエチレン
エーテル類、商標Tween（例えば、Tween−20）の下で販
売されているもののようなポリオキシエチレンソルビタ
ン誘導体類、ならびに商標Tergitol（例えば、Tergitol
NPXおよNP−７）の下で販売されているもののようなポ
リグリコールエーテル類が挙げられる。他の有用な材料
は、特に界面活性剤の標準的な文献、McCutcheon's Emu
lsifiers and Detergents,1986編（McCutcheon Divisio
n,Publishing Co.,Glen Rock,N.J,U.S）を参考にした後
の当業者にとって容易に明らかであろう。
前記非イオン界面活性剤１種以上が、少なくとも１重量
％、好ましくは４〜10重量％（組成物の総重量当たり）
の量で本発明の抽出組成物中に存在する。
％、好ましくは４〜10重量％（組成物の総重量当たり）
の量で本発明の抽出組成物中に存在する。
この発明の抽出組成物の第３の重要な成分は、１種以上
のコール酸、その塩またはその誘導体である。限定され
るものではないが、使用可能な材料としては、コール
酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、デオキ
シコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸カリウ
ム、コール酸アンモニウムおよび当業者に容易に明らか
となる他の化合物が挙げられる。最も好ましいものはデ
オキシコール酸ナトリウムである。この成分は、少なく
とも0.2重量％、好ましくは0.5〜５重量％（組成物総重
量当たり）の量で組成物中に存在する。
のコール酸、その塩またはその誘導体である。限定され
るものではないが、使用可能な材料としては、コール
酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、デオキ
シコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸カリウ
ム、コール酸アンモニウムおよび当業者に容易に明らか
となる他の化合物が挙げられる。最も好ましいものはデ
オキシコール酸ナトリウムである。この成分は、少なく
とも0.2重量％、好ましくは0.5〜５重量％（組成物総重
量当たり）の量で組成物中に存在する。
本発明の組成物は、また、少なくとも0.1重量％、好ま
しくは0.2〜１重量％（組成物総重量当たり）の量でア
ニオン界面活性剤も含む。限定されるものでないが、使
用可能なアニオン界面活性剤としては、アルキル硫酸ア
ニオンとアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム
もしくはカリウム）カチオンまたはアンモニウムカチオ
ンからなり、アルキル基が炭素原子６〜20個を有する水
溶性または水分散性化合物が挙げられる。好ましくは、
アルキルが炭素原子６〜12個（例えば、直鎖または分枝
したヘキシル基、オクチル基、デシル基、２−メチルヘ
キシル基およびドデシル基）である。アリール核中に炭
素原子６〜10個を有するアリールスルホン酸類またはそ
れらの塩（前述のような）もまた使用可能である。アル
キル硫酸塩類が好ましく、デシル硫酸塩およびドデシル
硫酸塩が最も好ましいものである。代表的なアニオン界
面活性剤としては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、ドテシル硫酸ルビジウム、デシル硫
酸ナトリウム、ヘキシル硫酸リチウム、オクチル硫酸カ
リウムおよびデシル硫酸リチウムが挙げられる。最も好
ましい化合物は、デシル硫酸ナトリウムおよびドデシル
硫酸ナトリウムである。
しくは0.2〜１重量％（組成物総重量当たり）の量でア
ニオン界面活性剤も含む。限定されるものでないが、使
用可能なアニオン界面活性剤としては、アルキル硫酸ア
ニオンとアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム
もしくはカリウム）カチオンまたはアンモニウムカチオ
ンからなり、アルキル基が炭素原子６〜20個を有する水
溶性または水分散性化合物が挙げられる。好ましくは、
アルキルが炭素原子６〜12個（例えば、直鎖または分枝
したヘキシル基、オクチル基、デシル基、２−メチルヘ
キシル基およびドデシル基）である。アリール核中に炭
素原子６〜10個を有するアリールスルホン酸類またはそ
れらの塩（前述のような）もまた使用可能である。アル
キル硫酸塩類が好ましく、デシル硫酸塩およびドデシル
硫酸塩が最も好ましいものである。代表的なアニオン界
面活性剤としては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、ドテシル硫酸ルビジウム、デシル硫
酸ナトリウム、ヘキシル硫酸リチウム、オクチル硫酸カ
リウムおよびデシル硫酸リチウムが挙げられる。最も好
ましい化合物は、デシル硫酸ナトリウムおよびドデシル
硫酸ナトリウムである。
場合により重要になる抽出組成物成分は、アルカリ金属
塩、アンモニウム塩またはアルカリ土類金属塩のような
１種以上の無機塩である。限定されるものでないが、代
表的な塩としては、塩化ナトリウム（これが最も好まし
い）、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウ
ム、硫酸アンモニウム、硫酸バリウムおよび当業者に容
易に明らかとなる他の塩が挙げられる。この塩は、好ま
しくは少なくとも0.3モル濃度、より好ましくは0.5〜２
モル濃度の量で存在する。
塩、アンモニウム塩またはアルカリ土類金属塩のような
１種以上の無機塩である。限定されるものでないが、代
表的な塩としては、塩化ナトリウム（これが最も好まし
い）、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウ
ム、硫酸アンモニウム、硫酸バリウムおよび当業者に容
易に明らかとなる他の塩が挙げられる。この塩は、好ま
しくは少なくとも0.3モル濃度、より好ましくは0.5〜２
モル濃度の量で存在する。
必要があれば、防腐剤、還元剤、キレート剤消泡剤を包
含する他の添加剤を本発明の抽出組成物に含めることが
できる。
含する他の添加剤を本発明の抽出組成物に含めることが
できる。
抽出は、HSVまたはHSV感染細胞を含有することが予期さ
れる生物学的被検体を提供し、次いでこのものを、ウイ
ルスまたはそれを含有する細胞を溶解するのに十分な時
間適当な容器中でこの発明の抽出組成物と接触させ、そ
してアッセイ用の抗原を抽出することにより実施するこ
とができる。特定の被検体には長時間必要な場合もある
が、一般には、この抽出方法が２分未満で行われる。接
触は、室温（すなわち、18〜25℃）で行われるのが一般
であるが、場合により40℃までのより高い温度であって
もよい。しかしながら、従来技術で必要とされるより高
い温度は、この発明を実施することにより避けることが
できる。被検体の混合が必要な場合もある。好ましく
は、目的に応じて特別に設計されうる適当な抽出装置中
で抽出が実施される。多くのこのような装置が従来技術
文献中に示されている。
れる生物学的被検体を提供し、次いでこのものを、ウイ
ルスまたはそれを含有する細胞を溶解するのに十分な時
間適当な容器中でこの発明の抽出組成物と接触させ、そ
してアッセイ用の抗原を抽出することにより実施するこ
とができる。特定の被検体には長時間必要な場合もある
が、一般には、この抽出方法が２分未満で行われる。接
触は、室温（すなわち、18〜25℃）で行われるのが一般
であるが、場合により40℃までのより高い温度であって
もよい。しかしながら、従来技術で必要とされるより高
い温度は、この発明を実施することにより避けることが
できる。被検体の混合が必要な場合もある。好ましく
は、目的に応じて特別に設計されうる適当な抽出装置中
で抽出が実施される。多くのこのような装置が従来技術
文献中に示されている。
適当なインキュベーション後、必要があれば、抽出され
た抗原を含有する溶液は適当な酸で中和し、６〜８まで
pHを低下させることができる。ここでまた、内在性の過
酸化物を除去するために処理してもよい。生体から抗原
が抽出されると、必ずしも必要ではないが、次の処理の
前に前記溶液を予備濾過し、細胞残屑、粒状物および他
の不要物を除去することが望ましい。予備濾過は、ある
種のフィルターを備えた適当な容器中で行うことができ
る。
た抗原を含有する溶液は適当な酸で中和し、６〜８まで
pHを低下させることができる。ここでまた、内在性の過
酸化物を除去するために処理してもよい。生体から抗原
が抽出されると、必ずしも必要ではないが、次の処理の
前に前記溶液を予備濾過し、細胞残屑、粒状物および他
の不要物を除去することが望ましい。予備濾過は、ある
種のフィルターを備えた適当な容器中で行うことができ
る。
次に、濾過された被検体は、抽出された抗原の存在を測
定するために数種の分析方法のいずれかにかけられる。
これらの方法には、必ずしも好ましくはなく、特定の実
例において選ばれるだけのものもありうるが、培養法、
カウンター免疫電気泳動法および血清法が含まれる。
定するために数種の分析方法のいずれかにかけられる。
これらの方法には、必ずしも好ましくはなく、特定の実
例において選ばれるだけのものもありうるが、培養法、
カウンター免疫電気泳動法および血清法が含まれる。
好ましくは、抽出された抗原が１種以上の適当な抗体と
免疫学的に反応するイムノアッセイを使用して検出され
る、HSV−１もしくはHSV−２の両者またはいずれかに由
来する抗原が検出されうる。好ましくは両者が同時に検
出される。こうして得られた免疫複合体は、適当な放射
線測定法、比色法、蛍光法または酵素標識試薬を使用し
て検出される。ある場合には、試薬が抗原に対する標識
抗体であり、別の場合には、試薬が抗原と反応する未標
識抗体に向けられる標識抗−抗体である。このようなイ
ムノアッセイは、一般に、適当な手段で結合していない
物質から分離される検出可能な免疫複合体の形成を含
む。好ましい態様では、被覆されているかまたは被覆さ
れていないある種の固体支持体上に前記複合体が固定さ
れ、次いで適当な検出手段が構じられる。
免疫学的に反応するイムノアッセイを使用して検出され
る、HSV−１もしくはHSV−２の両者またはいずれかに由
来する抗原が検出されうる。好ましくは両者が同時に検
出される。こうして得られた免疫複合体は、適当な放射
線測定法、比色法、蛍光法または酵素標識試薬を使用し
て検出される。ある場合には、試薬が抗原に対する標識
抗体であり、別の場合には、試薬が抗原と反応する未標
識抗体に向けられる標識抗−抗体である。このようなイ
ムノアッセイは、一般に、適当な手段で結合していない
物質から分離される検出可能な免疫複合体の形成を含
む。好ましい態様では、被覆されているかまたは被覆さ
れていないある種の固体支持体上に前記複合体が固定さ
れ、次いで適当な検出手段が構じられる。
他のアッセイでは、前記複合体の少なくとも１種の反応
体（例えば、抗体）が、複合体形成中に共に凝集するあ
る種の標識粒子または未標識粒子に付着するとき、免疫
複合体の凝集を伴う。凝集アッセイはヨーロッパ特許公
開第183,215号公報（1986年６月４日付公表）に具体的
に記載されている。
体（例えば、抗体）が、複合体形成中に共に凝集するあ
る種の標識粒子または未標識粒子に付着するとき、免疫
複合体の凝集を伴う。凝集アッセイはヨーロッパ特許公
開第183,215号公報（1986年６月４日付公表）に具体的
に記載されている。
有用なアッセイ例としては、コンペティティブイムノア
ッセイ、ラジオイムノアッセイまたはエンザイム・リン
クド・イムノソルベント・アッセイ（ELISA）が挙げら
れる。使用されるHSV抗体は、生体から抽出されている
いずれかまたは数種の抗原に向けられるものであること
ができる。ある態様では、HSV−１またはHSV−２のいず
れか単一の糖タンパク質に抗体が向けられる。もう一つ
の態様では、HSV−１およびHSV−２の両者に由来する糖
タンパク質のような数種の抗原に数種の抗体混合物が向
けられる。さらに、第３の好ましい態様では、HSV−１
およびHSV−２の両者に由来する特異的な糖タンパク質
と反応性を有する単一の抗体が使用される。
ッセイ、ラジオイムノアッセイまたはエンザイム・リン
クド・イムノソルベント・アッセイ（ELISA）が挙げら
れる。使用されるHSV抗体は、生体から抽出されている
いずれかまたは数種の抗原に向けられるものであること
ができる。ある態様では、HSV−１またはHSV−２のいず
れか単一の糖タンパク質に抗体が向けられる。もう一つ
の態様では、HSV−１およびHSV−２の両者に由来する糖
タンパク質のような数種の抗原に数種の抗体混合物が向
けられる。さらに、第３の好ましい態様では、HSV−１
およびHSV−２の両者に由来する特異的な糖タンパク質
と反応性を有する単一の抗体が使用される。
このアッセイで使用される抗体は、市販されているかま
たは既知の方法を使用して調製することができるポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体であることができ
る。好ましい抗体は、HSV−１およびHSV−２の両者に由
来する糖タンパク質と反応性のモノクローナルである。
このようなモノクローナル抗体の一つは、ハイブリドー
マ細胞系283−2A1−1D4−2C3（ATCC寄託番号HB−9684）
から標準的な方法を使用して得られる。
たは既知の方法を使用して調製することができるポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体であることができ
る。好ましい抗体は、HSV−１およびHSV−２の両者に由
来する糖タンパク質と反応性のモノクローナルである。
このようなモノクローナル抗体の一つは、ハイブリドー
マ細胞系283−2A1−1D4−2C3（ATCC寄託番号HB−9684）
から標準的な方法を使用して得られる。
有用な固相イムノアッセイでは。抽出された抗原が、吸
着または遊離アミンもしくはスルフヒドリル基と反応す
る小さなポリマー粒子上の反応性基との共有結合生成反
応によりその粒子上に「捕捉」（または結合）される。
次に、捕捉された抗原は適当な抗体と反応してバインデ
ィングした免疫学的複合体を形成する。未複合化物質
は、同時係属中の出願により詳細に記載される微孔質膜
フィルターを使用して分離される。
着または遊離アミンもしくはスルフヒドリル基と反応す
る小さなポリマー粒子上の反応性基との共有結合生成反
応によりその粒子上に「捕捉」（または結合）される。
次に、捕捉された抗原は適当な抗体と反応してバインデ
ィングした免疫学的複合体を形成する。未複合化物質
は、同時係属中の出願により詳細に記載される微孔質膜
フィルターを使用して分離される。
好ましいイムノアッセイは、得られた免疫学的複合体か
ら未複合化物質を分離するためにも使用される被覆もし
くは未被覆微孔質膜フィルター上に抽出された抗原をバ
インディングすることにより実施される。もう一つのイ
ムノアッセイは、界面活性剤で被覆した微孔質膜を使用
して実施される。最も好ましくは、微孔質膜が下記例２
に示されるような未被覆または未処理ナイロン製品であ
る。
ら未複合化物質を分離するためにも使用される被覆もし
くは未被覆微孔質膜フィルター上に抽出された抗原をバ
インディングすることにより実施される。もう一つのイ
ムノアッセイは、界面活性剤で被覆した微孔質膜を使用
して実施される。最も好ましくは、微孔質膜が下記例２
に示されるような未被覆または未処理ナイロン製品であ
る。
一般に、ある種の固体支持体（好ましくは、前述のよう
な膜または粒子）を使用するこの発明のアッセイは、以
下のように実施される。抽出された抗原はガラス、セル
ロース系、セラミックス系またはポリマー系材料のよう
な固体支持体と接触される。好ましくは、この支持体は
過度なインキュベーションまたは他の条件を伴うことな
く抽出された抗原が迅速にバインディングしうるいずれ
かの天然または合成ポリマー材料から構成される。有用
なポリマーとしては、ポリエステル、ポリアミド、ポリ
カーボネート、ポリエチレンイミン、セルロース系材料
およびエチレン系不飽和ビニルモノマーから製造される
付加ポリマーならびに当該技術分野で既知の他の材料が
挙げられる。一般に、膜が正に荷電している場合には、
カチオン基が第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウ
ム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム塩、
第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウム塩
であり、第四級アンモニウム塩が好ましいものである。
な膜または粒子）を使用するこの発明のアッセイは、以
下のように実施される。抽出された抗原はガラス、セル
ロース系、セラミックス系またはポリマー系材料のよう
な固体支持体と接触される。好ましくは、この支持体は
過度なインキュベーションまたは他の条件を伴うことな
く抽出された抗原が迅速にバインディングしうるいずれ
かの天然または合成ポリマー材料から構成される。有用
なポリマーとしては、ポリエステル、ポリアミド、ポリ
カーボネート、ポリエチレンイミン、セルロース系材料
およびエチレン系不飽和ビニルモノマーから製造される
付加ポリマーならびに当該技術分野で既知の他の材料が
挙げられる。一般に、膜が正に荷電している場合には、
カチオン基が第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウ
ム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム塩、
第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウム塩
であり、第四級アンモニウム塩が好ましいものである。
好ましい態様の一つは、微孔質膜上の粒子を使用し、前
述のような膜および粒子で抽出された抗原を捕捉する。
述のような膜および粒子で抽出された抗原を捕捉する。
この支持体は、ビーズ、ゲル、フィルムまたは膜のよう
ないずれかの適当な形状で作製することができる。本明
細書で開示されるような微孔質膜が好ましい。
ないずれかの適当な形状で作製することができる。本明
細書で開示されるような微孔質膜が好ましい。
本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また一
方、好ましくは、アッセイを実施することができ、すべ
ての流体に適応できる使い捨て試験装置中に膜が固定さ
れる微孔質膜を支持体が有する。試験装置の有用な形状
は、当該技術分野で知られている。特に有用な装置は、
ヨーロッパ特許公開第280558号公報に記載されている。
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また一
方、好ましくは、アッセイを実施することができ、すべ
ての流体に適応できる使い捨て試験装置中に膜が固定さ
れる微孔質膜を支持体が有する。試験装置の有用な形状
は、当該技術分野で知られている。特に有用な装置は、
ヨーロッパ特許公開第280558号公報に記載されている。
この支持体に抗原が接触すると殆んど瞬間的に抗原がそ
れにバインディングされる。バインディングは、支持体
に付着されている結合性生物学的化合物（例えば、抗
体）を介して抗原が結合されるものでないことを意味す
る直接的な手段によるか、またはバインディングがかか
る結合性化合物を介して間接的なものであってもよい。
れにバインディングされる。バインディングは、支持体
に付着されている結合性生物学的化合物（例えば、抗
体）を介して抗原が結合されるものでないことを意味す
る直接的な手段によるか、またはバインディングがかか
る結合性化合物を介して間接的なものであってもよい。
従って、接触の10分以内、好ましくは10〜120秒の範囲
内でバインディングした抗原は、支持体上に免疫学的複
合体を形成するように、それらに対する適当な抗体（ま
たはその混合物）と接触される。アッセイが使い捨て試
験装置を使用して実施される場合には、支持体は、抗原
が膜にバインディングされると同時に被検体中の流体お
よび複合化しない物質が膜を通過する微孔質膜を有する
ことができる。
内でバインディングした抗原は、支持体上に免疫学的複
合体を形成するように、それらに対する適当な抗体（ま
たはその混合物）と接触される。アッセイが使い捨て試
験装置を使用して実施される場合には、支持体は、抗原
が膜にバインディングされると同時に被検体中の流体お
よび複合化しない物質が膜を通過する微孔質膜を有する
ことができる。
好ましい態様では、抗原に対する抗体は検出のために標
識される。有用な標識は、当該技術分野で既知であり、
適当な手段および装置を使用して直接的または間接的に
検出可能な化学または生物学的化合物、ならびに検出可
能な種を提供するさらなる化学または特異的バインディ
ング反応を介して検出しうる化合物を包含する。有用な
標識の例としては、放射性同位体、酵素、補酵素、蛍光
化合物、補因子、化学発光化合物、リン光化合物、ビオ
チンまたはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フ
ェリチン、磁性粒子、色素粒子および当業者に容易に明
らかとなる他の物質を挙げることができる。標識は、既
知の方法を使用して抗体に付着することができる。標識
が直接検出できない場合には、検出可能な反応または特
異的にバインディングする生成物を与えるのにさらなる
試薬または化合物が必要である。例えば、標識がビオチ
ンである場合、酸素と接合されているアビジンと反応さ
せ、検出可能な種を提供することができる。標識がグル
コースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼお
よびアルカリホスファターゼなどの酵素である場合に
は、基質と共に色素を提供する試験も必要である。
識される。有用な標識は、当該技術分野で既知であり、
適当な手段および装置を使用して直接的または間接的に
検出可能な化学または生物学的化合物、ならびに検出可
能な種を提供するさらなる化学または特異的バインディ
ング反応を介して検出しうる化合物を包含する。有用な
標識の例としては、放射性同位体、酵素、補酵素、蛍光
化合物、補因子、化学発光化合物、リン光化合物、ビオ
チンまたはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フ
ェリチン、磁性粒子、色素粒子および当業者に容易に明
らかとなる他の物質を挙げることができる。標識は、既
知の方法を使用して抗体に付着することができる。標識
が直接検出できない場合には、検出可能な反応または特
異的にバインディングする生成物を与えるのにさらなる
試薬または化合物が必要である。例えば、標識がビオチ
ンである場合、酸素と接合されているアビジンと反応さ
せ、検出可能な種を提供することができる。標識がグル
コースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼお
よびアルカリホスファターゼなどの酵素である場合に
は、基質と共に色素を提供する試験も必要である。
特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであ
り、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬が添加され、検出可能な色素が生ずる。例え
ば、有用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジ
ジン類およびそれらの誘導体、トリアリールイミダゾー
ルロイコ染料（米国特許第4,089,747号明細書に記載さ
れるような）のごときロイコ染料、あるいはペルオキシ
ダーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素を提供する
化合物（すなわち、ペルオキシダーゼの触媒作用により
色素を提供する化合物）が挙げられる。
り、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬が添加され、検出可能な色素が生ずる。例え
ば、有用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジ
ジン類およびそれらの誘導体、トリアリールイミダゾー
ルロイコ染料（米国特許第4,089,747号明細書に記載さ
れるような）のごときロイコ染料、あるいはペルオキシ
ダーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素を提供する
化合物（すなわち、ペルオキシダーゼの触媒作用により
色素を提供する化合物）が挙げられる。
もう一つの態様では、ヘルペス抗体が標識されておら
ず、支持体にバインディングし、形成された抗体−抗原
の複合体の検出が、前記HSV抗体に特異的で検出のため
に適当に標識されている（前述のように）第二の抗体を
使用して行われる。
ず、支持体にバインディングし、形成された抗体−抗原
の複合体の検出が、前記HSV抗体に特異的で検出のため
に適当に標識されている（前述のように）第二の抗体を
使用して行われる。
アッセイで使用される抗体は、支持体上で非特異的な相
互作用を減少させる１種以上のブロッキングタンパク質
との混合状態で供給することができる。有用なタンパク
質は周知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウ
シ胎児血清およびブタγ−グロブリンが挙げられる。一
の有用なブロッキング組成物は、非免疫学的なブロッキ
ングタンパク質および両性界面活性剤を含んでなる。
互作用を減少させる１種以上のブロッキングタンパク質
との混合状態で供給することができる。有用なタンパク
質は周知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウ
シ胎児血清およびブタγ−グロブリンが挙げられる。一
の有用なブロッキング組成物は、非免疫学的なブロッキ
ングタンパク質および両性界面活性剤を含んでなる。
支持体にバインディングする免疫学的複合体の形成を促
進するには、一般に、抗体と抗原が15〜30℃の温度で10
分未満インキュベーションされる。好ましくは、５分未
満室温でインキュベーションされる。
進するには、一般に、抗体と抗原が15〜30℃の温度で10
分未満インキュベーションされる。好ましくは、５分未
満室温でインキュベーションされる。
インキュベーション後、抗体−抗原接触の10分以内にバ
インディングされた複合体は、リン酸緩衝液、非イオン
界面活性剤の緩衝溶液および当該技術分野で既知の他の
溶液などの緩衝化洗液で１度以上洗浄される。
インディングされた複合体は、リン酸緩衝液、非イオン
界面活性剤の緩衝溶液および当該技術分野で既知の他の
溶液などの緩衝化洗液で１度以上洗浄される。
HSV抗体が標識されている前述の態様では、洗浄後のア
ッセイ手順が直接的または適当な試薬の添加後の間接的
な標識の検出となる。これは、バインディングした複合
体を洗浄した後、相当迅速に行われる。必要があり、試
薬類が許容する場合には、標識の検出がインキュベーシ
ョンにより促進される。次に、適当な時間後に標準的な
装置および方法を使用して標識が検出される。
ッセイ手順が直接的または適当な試薬の添加後の間接的
な標識の検出となる。これは、バインディングした複合
体を洗浄した後、相当迅速に行われる。必要があり、試
薬類が許容する場合には、標識の検出がインキュベーシ
ョンにより促進される。次に、適当な時間後に標準的な
装置および方法を使用して標識が検出される。
HSV抗体が標識されていない場合には、バインディング
した複合体を洗浄した後、それが標識されていない抗体
に対する抗体と接触される。この第２の抗体（すなわち
抗−抗体）は、前記標識のいずれかで適当に標識され、
前述のようなブロッキング組成物と共に供給することが
できる。この抗体はモノクローナルまたはポリクローナ
ルであってよく、市販のものか、または既知の方法を使
用して制御することもできる。
した複合体を洗浄した後、それが標識されていない抗体
に対する抗体と接触される。この第２の抗体（すなわち
抗−抗体）は、前記標識のいずれかで適当に標識され、
前述のようなブロッキング組成物と共に供給することが
できる。この抗体はモノクローナルまたはポリクローナ
ルであってよく、市販のものか、または既知の方法を使
用して制御することもできる。
この接触後、支持体にバインディングして得られた抗原
−抗体−抗体複合体は、15〜30℃の温度で10分未満イン
キュベーションされる。好ましくは、このインキュベー
ションは５分未満室温である。
−抗体−抗体複合体は、15〜30℃の温度で10分未満イン
キュベーションされる。好ましくは、このインキュベー
ションは５分未満室温である。
さらに洗浄が行われて未複合化物を除去し、次いで適当
な酵素基質または他の必要な試薬を添加して検出可能な
種を提供する。次に、バインディングした抗原−抗体−
標識抗体複合体は、標準的な放射能測定、比色法、蛍光
法または他の検出法を使用して支持体上で検出される。
な酵素基質または他の必要な試薬を添加して検出可能な
種を提供する。次に、バインディングした抗原−抗体−
標識抗体複合体は、標準的な放射能測定、比色法、蛍光
法または他の検出法を使用して支持体上で検出される。
この発明の抽出組成物は、必要があれば他の試薬、診断
装置の部品または他の有用な材料の１種以上を含んでな
る診断試験キットの一部として提供することができる。
一般に、キットは単純ヘルペスウイルス抗原に向けられ
る抗体（標識されたまたは標識されていない）少なくと
も１種を含む。それはまた、抗−抗体（必要があれ
ば）、洗液、抽出装置、試験装置、色素生成試薬もしく
は組成物、ピペット、説明書、綿棒およびアッセイを実
施するのに有用な他のいずれかの部材をも含めることが
できる。これらの部材は、いずれかの適当な形態で梱包
することができ、１以上の包装または容器で提供するこ
とができる。
装置の部品または他の有用な材料の１種以上を含んでな
る診断試験キットの一部として提供することができる。
一般に、キットは単純ヘルペスウイルス抗原に向けられ
る抗体（標識されたまたは標識されていない）少なくと
も１種を含む。それはまた、抗−抗体（必要があれ
ば）、洗液、抽出装置、試験装置、色素生成試薬もしく
は組成物、ピペット、説明書、綿棒およびアッセイを実
施するのに有用な他のいずれかの部材をも含めることが
できる。これらの部材は、いずれかの適当な形態で梱包
することができ、１以上の包装または容器で提供するこ
とができる。
下記の材料、組成物および溶液が以下の例で使用され、
例は具体的に示されるが本発明の範囲限定するものでな
い。
例は具体的に示されるが本発明の範囲限定するものでな
い。
抗体の調製 HSVに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細
胞は、ケラー（Ｋhler）らにより公表される既知の方
法（Nature,256,495〜497ページ、1975）を使用して調
製した。HSV−１とHSV−２の両方に共通する糖タンパク
質抗原上のエピトープに反応するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞系が得られた。このハイブ
リドーマ細胞系は、ATCC HB−9684として寄託された。
胞は、ケラー（Ｋhler）らにより公表される既知の方
法（Nature,256,495〜497ページ、1975）を使用して調
製した。HSV−１とHSV−２の両方に共通する糖タンパク
質抗原上のエピトープに反応するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞系が得られた。このハイブ
リドーマ細胞系は、ATCC HB−9684として寄託された。
抗原の調製 正対照として使用するための抗体を調製するために、HE
P−２細胞（ATCC CCL−23）中でHSV−1F株HSV−2G株を
個別に増殖させた。感染細胞を低速で遠心してペレット
化し、これらのペレットを50mlのコレックス（Corex）
チューブでリン酸緩衝溶液15mlに懸濁させた。この懸濁
細胞を超音波処理し、15分間アミノメチルトリオキサレ
ン（aminomethyltrioxsalen）（500mg/ml）にさらし、
次いで断え間なく攪拌しながら15分間紫外線を照射し
た。
P−２細胞（ATCC CCL−23）中でHSV−1F株HSV−2G株を
個別に増殖させた。感染細胞を低速で遠心してペレット
化し、これらのペレットを50mlのコレックス（Corex）
チューブでリン酸緩衝溶液15mlに懸濁させた。この懸濁
細胞を超音波処理し、15分間アミノメチルトリオキサレ
ン（aminomethyltrioxsalen）（500mg/ml）にさらし、
次いで断え間なく攪拌しながら15分間紫外線を照射し
た。
試験装置の正対照ウェルは、HSV−１およびHSV−２抗原
（UVで不活化しそして洗剤で溶解した）を含ませ、この
試験ウェルのフィルター膜上にウシ胎児アルブミン（0.
1重量％）と親水性ポリマー（５重量％）を混入させ
た。
（UVで不活化しそして洗剤で溶解した）を含ませ、この
試験ウェルのフィルター膜上にウシ胎児アルブミン（0.
1重量％）と親水性ポリマー（５重量％）を混入させ
た。
抗体接合体の調製 HSV（前述）に対するモノクローナル抗体を、ワサビペ
ルオキシダーゼにYoshitakeら〔Eur.J.Biochem.,101,39
5ページ（1979）〕に記載された方法を使用して接合さ
せた。得られた接合体を、α−カゼイン（0.5重量
％）、Tween20非イオン界面活性剤（0.1重量％）、チメ
ロサル防腐剤（0.01重量％）およびｐ−メトキシフェノ
ール（100ミリモル濃度）を含有するブロッキング組成
物と混合した。この溶液における最終抗体濃度は1.5μg
/mlであった。このものを、ウシ血清アルブミン（１重
量％）と共に保存した。試験装置の負対照ウェルのため
の接合体は、前記方法を使用して調製したクレアチンキ
ナーゼに対するペルオキシダーゼ標識抗体であった。
ルオキシダーゼにYoshitakeら〔Eur.J.Biochem.,101,39
5ページ（1979）〕に記載された方法を使用して接合さ
せた。得られた接合体を、α−カゼイン（0.5重量
％）、Tween20非イオン界面活性剤（0.1重量％）、チメ
ロサル防腐剤（0.01重量％）およびｐ−メトキシフェノ
ール（100ミリモル濃度）を含有するブロッキング組成
物と混合した。この溶液における最終抗体濃度は1.5μg
/mlであった。このものを、ウシ血清アルブミン（１重
量％）と共に保存した。試験装置の負対照ウェルのため
の接合体は、前記方法を使用して調製したクレアチンキ
ナーゼに対するペルオキシダーゼ標識抗体であった。
ロイコ色素生成組成物 この組成物は、過酸化水素（10ミリモル濃度）、２−
（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−4,5−ビ
ス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料
（0.005重量％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１重量
％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃
度）およびジエチレントリアミン五酢酸（10ミリモル濃
度）を含めた。
（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−4,5−ビ
ス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料
（0.005重量％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１重量
％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃
度）およびジエチレントリアミン五酢酸（10ミリモル濃
度）を含めた。
過酸化水素溶液 水溶液は、過酸化水素（10重量％）、ジエチレントリア
ミン五酢酸（0.005重量％）および防腐剤（0.01重量
％）を含むように調製した。
ミン五酢酸（0.005重量％）および防腐剤（0.01重量
％）を含むように調製した。
洗液 水性洗液は、Triton（商品名）Ｘ−100非イオン界面活
性剤（0.1重量％）、エタノールアミン塩酸塩（0.26モ
ル濃度）および防腐剤（0.01重量％）となるように調製
し、12N水酸化ナトリウムでpH10.75に調節した。
性剤（0.1重量％）、エタノールアミン塩酸塩（0.26モ
ル濃度）および防腐剤（0.01重量％）となるように調製
し、12N水酸化ナトリウムでpH10.75に調節した。
リン酸緩衝溶液 この溶液（0.05モル濃度）は、塩化ナトリウム（0.15モ
ル濃度）、リン酸二水素ナトリウム（0.01モル濃度）お
よびリン酸水素ナトリウム（pH7.2、0.04モル濃度）か
ら調製した。
ル濃度）、リン酸二水素ナトリウム（0.01モル濃度）お
よびリン酸水素ナトリウム（pH7.2、0.04モル濃度）か
ら調製した。
ブロッキング組成物 水性ブロッキング組成物は、α−カゼイン（0.5重量
％）、Tween20（0.1重量％）、ｐ−メトキシフェノール
（100ミリモル濃度）および防腐剤（0.01重量％）を含
むように調製した。
％）、Tween20（0.1重量％）、ｐ−メトキシフェノール
（100ミリモル濃度）および防腐剤（0.01重量％）を含
むように調製した。
３個の試験ウェルを有する使い捨て試験装置をアッセイ
で使用した。この試験装置は、各試験ウェル中に被覆
（塗布）されていないナイロン微孔質膜〔Biodyne（商
品名）、Pall Corp製〕を有していた。
で使用した。この試験装置は、各試験ウェル中に被覆
（塗布）されていないナイロン微孔質膜〔Biodyne（商
品名）、Pall Corp製〕を有していた。
例1:抽出組成物 本発明の抽出組成物は、水中で次の成分を混合すること
により調製した。
により調製した。
Nonidet NP−40非イオン界面活性剤（５重量％）、デオ
キシコール酸ナトリウム（0.75重量％）、ドデシル硫酸
ナトリウムアニオン界面活性剤（0.4重量％）および塩
化ナトリウム（１モル濃度）。この組成物のpHは、12N
水酸化ナトリウムで10.75に調節した。
キシコール酸ナトリウム（0.75重量％）、ドデシル硫酸
ナトリウムアニオン界面活性剤（0.4重量％）および塩
化ナトリウム（１モル濃度）。この組成物のpHは、12N
水酸化ナトリウムで10.75に調節した。
例2:HSV−１およびHSV−２についてのアッセイ この例は、HSV−１およびHSV−２の両方またはいずれか
を含有する患者の被検体を使用してこの発明を詳細に説
明する。
を含有する患者の被検体を使用してこの発明を詳細に説
明する。
被検体は、各患者について２つの綿棒を使用して医院お
よび病院の各種患者から得た。１つの綿棒は医院または
病院においてSurecell（商品名）試験装置でこの発明を
実施するために使用し、第二の綿棒は標準的な培養方法
を使用する確認試験について使用した。
よび病院の各種患者から得た。１つの綿棒は医院または
病院においてSurecell（商品名）試験装置でこの発明を
実施するために使用し、第二の綿棒は標準的な培養方法
を使用する確認試験について使用した。
各患者に由来する第１の綿棒を抽出チューブに入れ、例
１の組成物（1ml）を加えた。各綿棒を抽出溶液中で１
〜２分間渦を巻かせた後、フィルター装置〔上層として
ポリエステルプラグ、中間に10μｍのHDCおよび底面に
５μｍのLoprodyne（商品名）フィルターから成る〕を
通して得られた抽出物を予備濾過した。
１の組成物（1ml）を加えた。各綿棒を抽出溶液中で１
〜２分間渦を巻かせた後、フィルター装置〔上層として
ポリエステルプラグ、中間に10μｍのHDCおよび底面に
５μｍのLoprodyne（商品名）フィルターから成る〕を
通して得られた抽出物を予備濾過した。
次に、予備濾過した抽出物（200μ）を、各試験装置
の各ウェル中に入れ、ウェル中の膜にすべてのHSV抗原
を吸着させた。
の各ウェル中に入れ、ウェル中の膜にすべてのHSV抗原
を吸着させた。
各試験ウェルを、前記洗液（120μ）で洗浄し、次い
で前記過酸化水素溶液（120μ）を加えてすべての非
特異的オキシダーゼを除去した。各ウェルを、再度洗液
（120μ）で洗浄した。前記ブロッキング組成物中標
識した抗−クレアチンキナーゼ接合体の試料（40μ）
を、各試験装置の負対照ウェルに加えた。抗−HSV接合
体の試料（40μ）を、各装置の他の２つのウェルに加
えた。
で前記過酸化水素溶液（120μ）を加えてすべての非
特異的オキシダーゼを除去した。各ウェルを、再度洗液
（120μ）で洗浄した。前記ブロッキング組成物中標
識した抗−クレアチンキナーゼ接合体の試料（40μ）
を、各試験装置の負対照ウェルに加えた。抗−HSV接合
体の試料（40μ）を、各装置の他の２つのウェルに加
えた。
抗体−抗原複合体化を行うため室温で５分インキュベー
ション後、それぞれのウェルを前記洗液で（各毎に200
μ）で２度洗浄した。
ション後、それぞれのウェルを前記洗液で（各毎に200
μ）で２度洗浄した。
前記ロイコ染料組成物（40μ）を、各試験ウェルに加
え、室温で５分インキュベーション後、膜上の赤味がか
った色素の存在を被検体中のHSV抗原の存在を示すもの
として評価した。試験した患者の試料については、感度
（真の陽性数を、真の陽性数と偽の陰性数との総和で割
った値）が83％で、特異性（真の陰性数を真の陰性数と
偽の陽性数との総和で割った値）が100％であった。こ
の方法の陽性の結果のすべては、培養の結果により確認
された。
え、室温で５分インキュベーション後、膜上の赤味がか
った色素の存在を被検体中のHSV抗原の存在を示すもの
として評価した。試験した患者の試料については、感度
（真の陽性数を、真の陽性数と偽の陰性数との総和で割
った値）が83％で、特異性（真の陰性数を真の陰性数と
偽の陽性数との総和で割った値）が100％であった。こ
の方法の陽性の結果のすべては、培養の結果により確認
された。
例3:各種pHにおける比較例 この例は、抽出組成物が低いpH（8.5未満）に緩衝化し
た類似の方法と本発明の実施例を比較する。
た類似の方法と本発明の実施例を比較する。
材料： 各試験ウェルに５μｍのナイロン微孔質膜を含有するシ
ュアセル〔Surecell（商品名）〕試験装置を使用した。
ュアセル〔Surecell（商品名）〕試験装置を使用した。
この発明の水性抽出組成物は、エタノールアミン塩酸塩
（0.26モル濃度）中、ノニデット（Nonidet）NP40非イ
オン界面活性剤（５重量％）、ドデシル硫酸ナトリウム
（0.5重量％）およびデオキシコール酸ナトリウム（１
重量％）から調製した。これらの抽出組成物のpHは、９
〜12であった。pH7を有する対照の抽出組成物は、リン
酸緩衝溶液で調製した。
（0.26モル濃度）中、ノニデット（Nonidet）NP40非イ
オン界面活性剤（５重量％）、ドデシル硫酸ナトリウム
（0.5重量％）およびデオキシコール酸ナトリウム（１
重量％）から調製した。これらの抽出組成物のpHは、９
〜12であった。pH7を有する対照の抽出組成物は、リン
酸緩衝溶液で調製した。
洗液は、エタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）、ツ
ウィーン（Tween）20非イオン界面活性剤（0.1重量％）
および防腐剤（0.01重量％）を含むように調製した。12
N水酸化ナトリウムを使用してpH10.7まで上昇させた。
ウィーン（Tween）20非イオン界面活性剤（0.1重量％）
および防腐剤（0.01重量％）を含むように調製した。12
N水酸化ナトリウムを使用してpH10.7まで上昇させた。
その他の組成物および溶液は、前述したものを使用し
た。
た。
アッセイ： HSV−１抗原および妨害物質を含有する試料は、リン酸
緩衝溶液（0.1mg/mlウシ胎児血清、100μ）中、全血
（25μ）、HL−60細胞（５×107個細胞/ml、ATCC CCL
−240、50μ）、HEP−２細胞（104個細胞/ml、ATCC C
CL−23、５μ）、ブタのムチン（200μ）およびHSV
−１抗原から調製し、1:4000希釈物を各試験ウェルに加
えた。
緩衝溶液（0.1mg/mlウシ胎児血清、100μ）中、全血
（25μ）、HL−60細胞（５×107個細胞/ml、ATCC CCL
−240、50μ）、HEP−２細胞（104個細胞/ml、ATCC C
CL−23、５μ）、ブタのムチン（200μ）およびHSV
−１抗原から調製し、1:4000希釈物を各試験ウェルに加
えた。
バックグランド試料は、妨害物質だけを含むように調製
した。
した。
試験試料とバックグランド試料（65μ）の両者を、各
抽出組成物（925μ）と混合した。室温で１〜２分イ
ンキュベーションした後、溶液を予備濾過し、試験装置
の各試験ウェルに加えた（ウェル当たり200μ）。
抽出組成物（925μ）と混合した。室温で１〜２分イ
ンキュベーションした後、溶液を予備濾過し、試験装置
の各試験ウェルに加えた（ウェル当たり200μ）。
洗液（200μ）を各ウェルに加え、次いで過酸化水素
溶液（120μ）を加えた。次に、２度目の洗液（120μ
）を各ウェルに加えた。
溶液（120μ）を加えた。次に、２度目の洗液（120μ
）を各ウェルに加えた。
ブロッキング組成物中ペルオキシダーゼ標識抗HSV（1.8
μg/ml）を各ウェルに加え、次いで５分間室温でインキ
ュベーションした。もう一度洗浄（200μ）した後、
ロイコ色素生成組成物（40μ）を加えた。室温でさら
に５分インキュベーションした後、各膜上の色素を透過
濃度（DT）で測定した。結果は、下記の第Ｉ表に示す。
表は、低いpHの抽出組成物を使用すると何も試験装置の
膜を通過しないことを明らかにする。従って、アッセイ
は実施できなかった。しかしながら、pH9〜12を有する
この発明の抽出組成物では、良好な感度と通過が達成さ
れた。
μg/ml）を各ウェルに加え、次いで５分間室温でインキ
ュベーションした。もう一度洗浄（200μ）した後、
ロイコ色素生成組成物（40μ）を加えた。室温でさら
に５分インキュベーションした後、各膜上の色素を透過
濃度（DT）で測定した。結果は、下記の第Ｉ表に示す。
表は、低いpHの抽出組成物を使用すると何も試験装置の
膜を通過しないことを明らかにする。従って、アッセイ
は実施できなかった。しかしながら、pH9〜12を有する
この発明の抽出組成物では、良好な感度と通過が達成さ
れた。
例4:抽出組成物で各種界面活性剤を使用する比較例 この例は、ヘルペスアッセイで目的の膜通過性および感
度を得るには、本発明の抽出組成物を特徴付ける全成分
を有することが重要であることを例示する。
度を得るには、本発明の抽出組成物を特徴付ける全成分
を有することが重要であることを例示する。
材料： 試験ウェルに特定のポリマービーズ〔２μｍ、ポリ（ス
チレン−コ−ｍおよびｐ−クロロメチルスチレン）、リ
ン酸緩衝溶液中0.1％の固形分〕を付着して担持するSur
ecell（商品名）試験装置を使用した。
チレン−コ−ｍおよびｐ−クロロメチルスチレン）、リ
ン酸緩衝溶液中0.1％の固形分〕を付着して担持するSur
ecell（商品名）試験装置を使用した。
水性抽出組成物は次のように調製した： この発明の組成物は、ドデシル硫酸ナトリウム（0.1重
量％）、デオキシコール酸塩（0.2重量％）、Nonidet N
P40非イオン界面活性剤（１重量％）およびエタノール
アミン塩酸塩（0.26モル濃度）を含んでなり、そしてpH
9を有する。
量％）、デオキシコール酸塩（0.2重量％）、Nonidet N
P40非イオン界面活性剤（１重量％）およびエタノール
アミン塩酸塩（0.26モル濃度）を含んでなり、そしてpH
9を有する。
対照組成物Ａは、ドデシル硫酸ナトリウム（1.3重量
％）およびエタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）の
みを含んでなり、そしてpH9を有する。
％）およびエタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）の
みを含んでなり、そしてpH9を有する。
対照組成物Ｂは、デオキシコール酸塩（1.3重量％）お
よびエタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）のみを含
んでなり、そしてpH9を有する。
よびエタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）のみを含
んでなり、そしてpH9を有する。
対照組成物Ｃは、Nonidet NP40非イオン界面活性剤（1.
3重量％）およびエタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃
度）のみを含んでなり、そしてpH9を有する。
3重量％）およびエタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃
度）のみを含んでなり、そしてpH9を有する。
洗液は、エタノールアミン塩酸塩（0.26モル濃度）およ
びTween 20非イオン界面活性剤（１重量％）を有するよ
うに調製し、12N水酸化ナトリウムでpH10.4とした。
びTween 20非イオン界面活性剤（１重量％）を有するよ
うに調製し、12N水酸化ナトリウムでpH10.4とした。
抗原を含有する試験試料は、前述のHSV細胞溶解物（10
μ）から調製し、ウシ血清アルブミン含有（0.1mg/m
l）リン酸緩衝溶液で1:40に希釈した。各試験ウェルに
1:4000希釈物を加えた。
μ）から調製し、ウシ血清アルブミン含有（0.1mg/m
l）リン酸緩衝溶液で1:40に希釈した。各試験ウェルに
1:4000希釈物を加えた。
次の妨害物質を含有するバックグランド試料を調製し
た：リン酸緩衝溶液（抽出溶液1ml当たり80μ）化、
全血（25μ/ml）、ブタのムチン（20μ/ml）、HL−
60細胞（５μ/ml）およびHEP−２細胞（５μ/m
l）。
た：リン酸緩衝溶液（抽出溶液1ml当たり80μ）化、
全血（25μ/ml）、ブタのムチン（20μ/ml）、HL−
60細胞（５μ/ml）およびHEP−２細胞（５μ/m
l）。
他の溶液および組成物は前述の例１と同様なものを使用
した。
した。
アッセイ： 試験試料およびバックグランド試料（135μ）のそれ
ぞれを、各抽出組成物（865μ）に加え、５分間室温
で混合した。得られた混合物を予備濾過した後、各試料
（200μ）毎に各試験ウェルに加え、次いで洗浄（200
μ）した。次いで、各試験ウェルに過酸化水素溶液
（120μ）を加え、さらにもう一度洗浄（200μ）し
た。
ぞれを、各抽出組成物（865μ）に加え、５分間室温
で混合した。得られた混合物を予備濾過した後、各試料
（200μ）毎に各試験ウェルに加え、次いで洗浄（200
μ）した。次いで、各試験ウェルに過酸化水素溶液
（120μ）を加え、さらにもう一度洗浄（200μ）し
た。
ペルオキシダーゼ標識抗ヘルペス接合体（40μ）の添
加後、室温で５分間インキュベーションした。さらに洗
浄（400μ）を行い、ロイコ色素生成組成物（80μ
）を各試験ウェルに加えた。室温で５分間インキュベ
ーションを続けた。アジ化ナトリウム（80μ、0.1重
量％）を添加することにより色素生成を停止させ、DTを
測定した。結果を第II表に示す。これらの結果は、抽出
組成物中に本発明で特定した成分のすべてを有するもの
だけが良好な通過が可能で、かつ高感度が得られること
を示す。
加後、室温で５分間インキュベーションした。さらに洗
浄（400μ）を行い、ロイコ色素生成組成物（80μ
）を各試験ウェルに加えた。室温で５分間インキュベ
ーションを続けた。アジ化ナトリウム（80μ、0.1重
量％）を添加することにより色素生成を停止させ、DTを
測定した。結果を第II表に示す。これらの結果は、抽出
組成物中に本発明で特定した成分のすべてを有するもの
だけが良好な通過が可能で、かつ高感度が得られること
を示す。
〔発明の効果〕 この発明の抽出組成物は、迅速かつ効果的に生物学的被
検体中のHSVまたはHSV感染細胞を溶解して感度のよいア
ッセイのために十分な抗原を遊離させる。溶解は、一般
に２分未満で非常に迅速で、かつ標準的な装置を使用し
て室温で実施することができる。そのため。抽出段階で
高温が避けられる。一般に、オペレーターの熟練度は必
要でない。
検体中のHSVまたはHSV感染細胞を溶解して感度のよいア
ッセイのために十分な抗原を遊離させる。溶解は、一般
に２分未満で非常に迅速で、かつ標準的な装置を使用し
て室温で実施することができる。そのため。抽出段階で
高温が避けられる。一般に、オペレーターの熟練度は必
要でない。
目的のエピトープ部位を破壊することなく妨害物質が除
去される抽出組成物および抽出方法を使用する本発明に
よればHSVが効率よく検出される。
去される抽出組成物および抽出方法を使用する本発明に
よればHSVが効率よく検出される。
また、固体支持体（例えば、微孔質膜）および単一試験
装置を使用してこの発明のアッセイが効率よく実施でき
ることもわかった。既知の抽出組成を使用するアッセイ
と異なり、この発明は、前記試験装置を使用して可溶性
物質と不溶性物質の迅速な分離を提供する。
装置を使用してこの発明のアッセイが効率よく実施でき
ることもわかった。既知の抽出組成を使用するアッセイ
と異なり、この発明は、前記試験装置を使用して可溶性
物質と不溶性物質の迅速な分離を提供する。
これらの利点は、高pH（8.5〜12）に緩衝化されそして
アルコールアミンもしくはその塩、特殊の非イオン界面
活性剤、コール酸もしくはその誘導体もしくはその塩お
よびアニオン界面活性剤の特定の組み合わせを含むこの
発明の特殊な抽出組成物を使用することで達成される。
好ましい態様では、この組成物の特に有用な任意の成分
が無機塩である。それらの物質は前述されている。必要
な材料をより少なく含有する組成物は、目的の結果を提
供するのに有効でない（前記例３を参照のこと）。
アルコールアミンもしくはその塩、特殊の非イオン界面
活性剤、コール酸もしくはその誘導体もしくはその塩お
よびアニオン界面活性剤の特定の組み合わせを含むこの
発明の特殊な抽出組成物を使用することで達成される。
好ましい態様では、この組成物の特に有用な任意の成分
が無機塩である。それらの物質は前述されている。必要
な材料をより少なく含有する組成物は、目的の結果を提
供するのに有効でない（前記例３を参照のこと）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 シェリル サンフォード サリバン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14468, ヒルトン，ノース グリース ロード 343 (72)発明者 ランダール デビッド マドセン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94523, プレザント ヒル，デューク サークル 765 (72)発明者 ナンシー フェイム グリーン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，キャンドルウッド ドラ イブ 35 (56)参考文献 特開 昭62−50032（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−175489（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】pH8.5〜12を有し、そしてアルコールアミ
ンもしくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオキ
シドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コール
酸もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン界
面活性剤を含んでなる単純ヘルペスウイルスから抗原を
抽出するのに有用な抽出組成物。 - 【請求項２】単純ヘルペスウイルスを含有することが予
期される被検体を、pH8.5〜12を有し、そしてアルコー
ルアミンもしくはその塩、アルキルフェノールとエチレ
ンオキシドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、
コール酸もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニ
オン界面活性剤を含んでなる抽出組成物と接触させるこ
とを特徴とする単純ヘルペスウイルスからの糖タンパク
質抗原の抽出方法。 - 【請求項３】A.pH8.5〜12を有し、そしてアルコールア
ミンもしくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオ
キシドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コー
ル酸もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン
界面活性剤を含んでなる抽出組成物により単純ヘルペス
ウイルスを含有することが予期される被検体から単純ヘ
ルペスウイルス抗原を抽出する工程、 B.抽出された抗原をそれに対する抗体と接触させて免疫
学的複合体を形成する工程、ならびに C.被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標として
前記複合体の存在を測定する工程、を含んでなる単純ヘ
ルペスウイルスの測定方法。 - 【請求項４】pH8.5〜12を有し、そしてアルコールアミ
ンもしくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオキ
シドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コール
酸もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン界
面活性剤を含む抽出組成物を含んでなる単純ヘルペスウ
イルスの測定に有用な診断試験キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/308,841 US5081010A (en) | 1989-02-09 | 1989-02-09 | Extraction composition, test kit and their use to extract or determine herpes simplex viral antigen |
| US308841 | 1994-09-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0343094A JPH0343094A (ja) | 1991-02-25 |
| JPH07108230B2 true JPH07108230B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=23195610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2024560A Expired - Lifetime JPH07108230B2 (ja) | 1989-02-09 | 1990-02-05 | 単純ヘルペスウイルス抗原の抽出または測定のための抽出組成物、抽出方法および診断試験キット |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5081010A (ja) |
| EP (1) | EP0382519B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07108230B2 (ja) |
| KR (1) | KR920007686B1 (ja) |
| AT (1) | ATE105635T1 (ja) |
| CA (1) | CA2007733A1 (ja) |
| DE (1) | DE69008743T2 (ja) |
| FI (1) | FI900644A0 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6812233B1 (en) | 1991-03-06 | 2004-11-02 | Emory University | Therapeutic nucleosides |
| US5334503A (en) * | 1991-10-08 | 1994-08-02 | Eastman Kodak Company | Test kit and method for the detection of microorganisms associated with periodontal diseases using surfactant mixture as extraction composition |
| US5399484A (en) * | 1991-10-08 | 1995-03-21 | Eastman Kodak Company | Use of blocking protein with high pH extraction in method to determine a microorganism associated with periodontal disease and kit useful therefor |
| US5807752A (en) * | 1992-09-11 | 1998-09-15 | Boehringer Mannheim Corporation | Assay using an unblocked solid phase with immobilized analyte binding partner |
| US5384240A (en) * | 1992-11-25 | 1995-01-24 | Akzo Nobel, N.V. | Base dissociation assay |
| KR100523685B1 (ko) * | 1997-08-04 | 2005-10-26 | 가부시끼가이샤 센탈 세메 가가꾸 겐꾸쇼 | Ｃ형 간염 바이러스의 코어 영역의 아미노산 서열을 인지하는 모노클로날 항체 |
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