JP4274584B2 - インターロイキン−１β変換酵素のインヒビター - Google Patents
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Description
発明の技術分野
本発明は、インターロイキン-１β変換酵素（「ICE」）のインヒビターである新規な種類の化合物に関する。本発明はまた、これらの化合物を含有する薬学的組成物に関する。本発明の化合物および薬学的組成物は、ICE活性を阻害するのに特によく適合し、結果として、インターロイキン-1（「IL-1」）、アポトーシス-、インターフェロン-γ誘導因子-（IGIF）、インターフェロン-γ-（「IFN-γ」）が媒介する疾患、食事性アルコール過摂取疾患、またはウイルス性疾患（炎症性疾患、自己免疫性疾患、骨破壊疾患、増殖性障害、感染性疾患、および退行性疾患を含めて）に対する薬剤として有利に利用され得る。本発明はまた、本発明の化合物および組成物を用いて、ICE活性を阻害しIGIF産生およびIFN-γ産生を減少する方法、ならびにインターロイキン-１、アポトーシス-およびインターフェロン-γが媒介する疾患を処置する方法に関する。本発明はまた、本発明の化合物を調製する方法に関する。
発明の背景
インターロイキン１（「IL-1」）は、線維芽細胞の分化および増殖、滑膜細胞および軟骨細胞によるプロスタグランジン、コラゲナーゼおよびホスホリパーゼの産生、好塩基球および好酸球の脱顆粒ならびに好中球の活性化を刺激する主要な前炎症性（proinflammatory）タンパク質および免疫調節タンパク質である。Oppenheim，J.H.ら、Immunology Today，７，45-56頁（1986）。このように、インターロイキン-１は、慢性および急性の炎症性および自己免疫性疾患の病因に関与する。例えば、慢性関節リウマチにおいて、IL-1は、炎症性症候の媒介体および侵された関節における軟骨プロテオグリカンの破壊の媒介体の両方である。Wood，D.D.ら、Arthritis Rheum．，26，975頁（1983）；Pettipher，E.J.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．，71，295頁（1986）；Arend，W.P.およびDayer，J.M.，Arthritis Rheum．，38，151頁（1995）。IL-1はまた、非常に強力な骨再吸収因子である。Jandiski，J.J.，J．Oral Path；17，145頁（1988）；Dewhirst，F.E.ら、J．Immunol．，８，2562頁（1985）。これは、骨関節症および多発性骨髄腫のような骨破壊疾患において「破骨細胞活性化因子」とも呼ばれる。Bataille，R.ら、Int．J．Clin．Lab．Res．，21（4），283頁（1992）。急性骨髄性白血病および多発性骨髄腫のような、特定の増殖性障害において、IL-1は、腫瘍細胞増殖および接着を促進し得る。Bani，M.R.，J．Natl．Cancer Inst．，83，123頁（1991）；Vidal-Vanaclocha，F.，Cancer Res．，54 2667頁（1994）。これらの疾患において、IL-1はまた、他のサイトカイン（例えば、腫瘍発生を調節し得るIL-6）の産生を刺激する（Tartourら、Cancer Res．，54，6243頁（1994））。IL-1は、炎症応答の一部として末梢血液単球により主に生産され、そして２つの異なるアゴニスト形態（IL-1αおよびIL-1β）で存在する。Mosely，B.S.ら、Proc．Nat．Acad．Sci．，84，4572-4576頁（1987）；Lonnemann，G.ら、Eur．J．Immunol．，19,1531-1536頁（1989）。
IL-1βは、生物学的に不活性な前駆体であるpIL-1βとして合成される。pIL-1βは、従来のリーダー配列を欠き、そしてシグナルペプチダーゼによりプロセシングされない。March，C.J.，Nature，315，641-647頁（1985）。その代わり、pIL-1βは、Asp-116とAla-117との間でインターロイキン-１β変換酵素（「ICE」）により切断され、ヒト血清および滑液中に見出される生物学的に活性なＣ末端フラグメントを産生する。Sleath，P.R.ら、J．Biol．Chem．，265，14526-14528頁（1992）；Howard，A.D.ら、J．Immunol．，147，2964-2969頁（1991）。ICEは、主に単球に局在するシステインプロテアーゼである。これは、前駆体IL-1βを成熟形態に変換する。Black，R.A.ら、FEBS Lett．，247，386-390頁（1989）；Kostura，M.J.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．，86，5227-5231頁（1989）。ICEによるプロセシングはまた、細胞膜を通しての成熟IL-1βの輸送に必要である。
ICEまたはそのホモログはまた、プログラムされた細胞死またはアポトーシスの調節に関与するようである。Yuan，J.ら、Cell，75，641-652頁（1993）；Miura，M.ら、Cell，75，653-660頁（1993）；Nett-Fiordalisi，M.A.ら、J．Cell Biochem．，17B，117頁（1993）。特に、ICEまたはICEホモログは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経退行性疾患におけるアポトーシスの調節に関連すると考えられる。Marx，J.およびBaringa，M.，Science，259，760-762頁（1993）；Gagliardini，V.ら、Science，263，826-828頁（1994）。アポトーシスの阻害のための治療的適用は、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、心筋梗塞、脊髄萎縮、および老化の処置を含み得る。
ICEは、特定の組織型においてアポトーシス（プログラムされた細胞死）を媒介することが実証されている。Steller，H.，Science，267，1445頁（1995）；Whyte，M.およびEvan，G.，Nature，376，17頁（1995）；Martin，S.J.およびGreen，D.R.，Cell，82，349頁（1995）；Alnemri，E.S.ら、J．Biol．Chem．，270，4312頁（1995）；Yuan，J．Curr．Opin．Cell Biol．，７，211頁（1995）。ICE遺伝子を破壊されたトランスジェニックマウスは、Fas媒介されたアポトーシスにおいて欠陥がある（Kuida，K.ら、Science，267，2000頁（1995））。ICEのこの活性は、プロIL-1βについてのプロセシング酵素としてのその役割と区別される。これは、特定の組織型において、ICEの阻害は成熟IL-1βの分泌に影響し得ないが、しかしアポトーシスを阻害し得ると考えられる。
酵素学的に活性なICEは、２つのサブユニットp20およびp10（それぞれ、分子量20kDaおよび10kDa）からなるヘテロダイマーとして以前に記載されている。これらのサブユニットは、自己触媒性である活性化機構を介してp30形態を経由することによって、45kDaのプロ酵素（p45）から誘導される。Thornberry，N.A.ら、Nature，356，768-774頁（1992）。ICEプロ酵素はいくつかの機能的ドメインに分けられている：プロドメイン（p14）、p22/20サブユニット、ポリペプチドリンカーおよびp10サブユニットである。Thornberryら、前出；Casanoら、Genomics，20，474-481頁（1994）。
全長p45はそのcDNAおよびアミノ酸配列により特徴付けられている。PCT特許出願第WO 91/15577号および同第WO 94/00154号。p20およびp10のcDNAおよびアミノ酸配列もまた、公知である。Thornberryら、前出。マウスICEおよびラットICEもまた、配列決定され、そしてクローン化されている。これらは、ヒトICEに対して高いアミノ酸配列相同性および核酸配列相同性を有する。Miller，D.K.ら、Ann．N．Y．Acad．Sci．，696，133-148頁（1993）；Molineaux，S.M.ら、Proc．Nat．Acad．Sci．，90，1809-1813頁（1993）。ICEの３次元構造は、Ｘ線結晶学により原子的解像度で決定された。Wilson，K.P.ら、Nature，370，270-275頁（1994）。活性酵素は、２つのp20および２つのp10サブユニットの４量体として存在する。
さらに、酵素の活性部位領域において配列類似性を有するICEのヒトホモログが存在する。そのようなホモログは、TX（またはICErel-IIもしくはICH-2）（Faucheuら、EMBO J．，14，1914頁（1995）；Kamens J.ら、J．Biol．Chem．，270，15250頁（1995）；Nicholsonら、J．Biol．Chem．，270，15870頁（1995））、TY（またはICErel-III）（Nicholsonら、J．Biol．Chem．，270，15870頁（1995））、ICH-1（またはNedd-2）（Wang，Lら、Cell，78，739頁（1994））、MCH-2（Fernandes-Alnemri，T．ら、Cancer Res．，55，2737頁（1995）、CPP32（またはYAMAもしくはアポペイン）（Fernandes-Alnemri，T．ら、J．Biol．Chem．，269，30761頁（1994）；Nicholson，D.W.ら、Nature，376,37頁（1995））、およびCMH-1（またはMCH-3）（Lippkeら、J．Biol．Chem．，（1996）；Fernandes-Alnemri，T．ら、Cancer Res．，（1995））を含む。これらICEホモログの各々、ならびにICE自体は、トランスフェクトされる細胞株において過剰発現される場合、アポトーシスを誘導し得る。ペプチジルICEインヒビターTyr-Val-Ala-Asp-クロロメチルケトンでのこれらのホモログの１つ以上の阻害は、初代細胞または細胞株におけるアポトーシスの阻害を生じる。Lazebnikら、Nature，371，346頁（1994）。本明細書中に記載される化合物はまた、１つ以上のICEのホモログを阻害し得る。従って、これらの化合物は、ICEホモログを含む組織型におけるアポトーシスの阻害のために用いられ得る。
インターフェロンγ誘導因子（IGIF）は、インターフェロンγ（IFN-γ）のＴ細胞産生を刺激する約18kDaのポリペプチドである。IGIFは活性化クッパー細胞およびマクロファージによってインビボで産生され、内毒素刺激の際にこのような細胞から放出される。従って、IGIF産生を減少させる化合物はこのようなＴ細胞刺激のインヒビターとして有用であり、これは順に、それらの細胞によるIFN-γ産生のレベルを減少させる。
IFN-γは、様々な免疫細胞に免疫調節効果を有するサイトカインである。特に、IFN-γはマクロファージ活性化およびTh1細胞選択に関与する（Belardelli，F．APMIS，103，161頁（1995））。IFN-γはSTATおよびIRF経路を介した遺伝子の発現を調節することによって、部分的にその効果を及ぼす（Schindler，C.およびDarnell，J.E.、Ann．Rev．Biochem．，64，621頁（1995）；Taniguchi，T.、J．Cancer Res．Clin．Oncol．，121，516頁（1995））。
IFN-γまたはそのレセプターを欠損しているマウスは、免疫細胞機能に複数の欠陥があり、内毒素ショックに耐性がある（Huang，S.ら、Science，259，1742頁（1993）；Dalton，D.ら、Science，259，1739頁（1993）；Car，B.D.ら、J．Exp．Med．，179，1437頁（1994））。IL-12と共に、IGIFはＴ細胞によるIFN-γ産生の強力なインデューサーであるようである（Okamura，H.ら、Infection and Immunity，63，3966頁（1995）；Okamura，Hら、Nature，378，88頁（1995）；Ushio，S.ら、J．Immunol．，156，4274頁（1996））。
IFN-γは様々な炎症性、感染性および自己免疫性障害または疾患と関連する症状に寄与することが示されている。従って、IFN-γ産生を減少させ得る化合物はIFN-γ関連症状の影響を寛解させるのに有用である。
IGIFは前駆体タンパク質として合成され、「プロIGIF」と呼ばれる。近年、ICEおよびICE／CED-3ファミリーの他のメンバーが、インビボでのプロIGIFのIGIFへの変換またはIFN-γ産生に関連されている（PCT特許出願第WO 97/22619号を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される）。
従って、プロIGIFからIGIFへの変換を調節し得る組成物および方法がインビボでのIGIFおよびIFN-γ産生の減少に有用であり、よってヒトの障害および疾患に寄与するこれらのタンパク質の有害な影響を寛解させるのに有用である。
ICEインヒビターは、炎症またはアポトーシスあるいはその両方の制御に有用なクラスの化合物を表す。ICEのペプチドインヒビターまたはペプチジルインヒビターが記載されている。PCT特許出願第WO 91/15577号；同第WO 93/05071号；同第WO 93/09135号；同第WO 93/14777号および同第WO 93/16710号；および欧州特許出願第0 547 699号。そのようなICEのペプチジルインヒビターは、炎症のマウスモデル（以下を参照のこと）において成熟IL-1βの産生をブロックすること、およびインビトロにおいて白血病細胞の増殖を抑制することが観察されている（Estrovら、Blood 84，380a頁（1994））。しかしながら、これらのペプチド性の性質により、このようなインヒビターは典型的には所望でない薬理学的特性（例えば、乏しい細胞浸透および細胞活性、乏しい経口吸収、乏しい安定性ならびに急速な代謝）によって特徴づけられる。Plattner，J.J.およびNorbeck，D.W.、Drug Discovery Technologies、Clark，C.R.およびMoos，W.H.編（Ellis Horwood、Chichester、England、1990）、92-126頁。これは有効な薬物へのこれらの発展を妨害する。
非ペプチジル化合物はまた、インビトロでICEを阻害すると報告されている。PCT特許出願第WO 95/26958号；米国特許第5,552,400号；Dolleら、J．Med．Chem．，39，2438-2440頁（1996）。しかしながら、これらの化合物が治療的に有用である適切な薬理学的プロフィールを有するか否かははっきりしていない。
さらに、このような化合物の調製の現在の方法は有利なものではない。これらの方法は、水素化トリブチルスズ（毒性の、水分感受性試薬）を使用する。従って、これらの方法は実行するのに不便であり、健康の危険を引き起こし、そして毒性廃棄物処理問題を引き起こす。さらに、これらの方法によって調製される化合物を精製することは困難である。化合物（例えば、本発明のICEインヒビター）を調製する好ましい方法は、PCT特許出願第WO 97/22619号に記載されており、これは本明細書中で参照として援用される。
従って、慢性および急性形態のIL-1媒介疾患、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γ媒介疾患、ならびに炎症性、自己免疫性、骨破壊性、増殖性、感染性、または退行性疾患を予防および処置する薬剤として使用するためには、インビボでのICEの作用を効果的に阻害し得る化合物が必要とされている。このような化合物の調製法もまた必要とされている。
発明の要旨
本発明は、ICEのインヒビターとして有用な新規な種類の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な誘導体を提供する。これらの化合物は、単独で、または他の治療剤または予防剤（例えば、抗生物質、免疫調節剤または他の抗炎症性薬剤）と組み合わせて、IL-1、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γにより媒介される疾患の処置または予防に使用され得る。好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は、ICEの活性部位と結合し得、かつその酵素の活性を阻害し得る。さらに、これらはペプチジルICEインヒビターに比べ、改良された細胞潜在能力、改良された薬物動態、および/または改良された経口バイオアベイラビリティーを有する。
本発明の主要な目的は、新規な種類の、次式により表されるICEインヒビターである化合物を提供することである：
ここで、種々の置換基が本明細書中に記載される。
本発明のさらなる目的は、本発明の化合物および関連化合物を調製する新規の方法を提供することである。
発明の詳細な説明
本明細書中に記載される本発明が、より十分に理解され得る様に、以下の詳細な説明を記載する。
以下の略語および定義は、本願の全体にわたって用いられる。
略語
Ac2O 無水酢酸
n-Bu ノルマル-ブチル
DMF ジメチルホルムアミド
DIEA N,N-ジイソプロピルエチルアミン
EDC 1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩
Et2O ジエチルエーテル
EtOAc 酢酸エチル
Fmoc ９-フルオレニルメトキシカルボニル（9-fluorenylmethyoxycarbonyl）
HBTU O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBT １-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
MeOH メタノール
TFA トリフルオロ酢酸
用語「HBV」、「HCV」および「HGV」は、それぞれＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＧ型肝炎ウイルスを意味する。
用語「Ki」は、ある化合物が、標的酵素（例えば、ICE）の活性を阻害する有効性の数値を意味する。Kiの値がより低いことは、より高い有効性を反映している。このKi値は、実験的に決定した速度データを標準酵素速度式に適合させることにより、導き出される（Segel，I.H.、Enzyme Kinetics，Wiley-Interscience，1975を参照のこと）。
用語「インターフェロンγ誘導因子」または「IGIF」は、IFN-γの内因性産生を刺激し得る因子を意味する。
用語「ICEインヒビター」は、ICEおよびICEホモログからなる群から選択される１つ以上の酵素を阻害し得る化合物を意味する。ICE阻害は、本明細書中で参考として記載され、援用される方法を用いて決定され得る。当業者はインビボICEインヒビターが必ずしもインビトロICEインヒビターでないことを理解している。例えば、プロドラッグの形態の化合物は典型的には、インビトロアッセイにおいて活性をほとんどまたは全く示さない。このようなプロドラッグ形態は患者の代謝または他の生化学的プロセスにより変化され、インビボICEインヒビターを提供し得る。
用語「サイトカイン」は、細胞間の相互作用を媒介する分子を意味する。
用語「状態」は、被験体において有害な生化学的結果を引き起こす任意の疾患、障害または影響を意味する。
用語「被験体」は、動物、または動物に由来する１つ以上の細胞を意味する。好ましくは、この動物は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。細胞は任意の形態であり得、これは組織内に維持された細胞、細胞クラスタ、不死化された細胞、トランスフェクトされるかまたは形質転換された細胞、および物理的または表現型的に改変された動物由来の細胞を包含するが、これらに限定されない。
本願において用いられる用語「患者」は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
用語「アルキル」は、１個から６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝、飽和脂肪族炭化水素を意味する。
用語「アルケニル」は、２個から６個の炭素を含む直鎖または分枝不飽和炭化水素を意味する。
用語「シクロアルキル」は、環系に不飽和結合を任意で含み得る、単環式または多環式、非芳香族、炭化水素環系を意味する。例としては、シクロヘキシル、アダマンチルおよびノルボルニルが挙げられる。
用語「アリール」は、６、10、12または14個の炭素を含み、ここで環系の少なくとも１つ以上の環が芳香族性である、単環式または多環式環系を意味する。本発明のアリール基は任意にR17で単一または複数で置換される。アリール環系の例としては、フェニル、ナフチル、およびテトラヒドロナフチルが挙げられる。
用語「ヘテロアリール」は、１個から15個の炭素原子および１個から４個のヘテロ原子を含む単環式または多環式環系を意味し、ここで環系の少なくとも１つの環が芳香族性である。ヘテロ原子は、硫黄、窒素または酸素である。本発明のヘテロアリール基は任意にR17で単一または複数で置換される。
用語「ヘテロ環式」は、１個から１５個の炭素原子および１個から４個のヘテロ原子を含む単環式または多環式環系を意味し、ここで単環式または多環式環系は任意で不飽和結合を含むが、芳香族性でない。ヘテロ原子は、独立して、硫黄、窒素、または酸素である。
用語「アルキルアリール」は、アルキル基の水素原子がアリールラジカルで置換されている、アルキル基を意味する。
用語「アルキルヘテロアリール」は、アルキル基の水素原子がヘテロアリールラジカルで置換されている、アルキル基を意味する。
用語「置換」は、化合物の水素原子の置換基での置換を意味する。
用語「直鎖」は、共有結合原子の継続した枝状に分かれていない列を意味する。直鎖は置換され得るが、これらの置換基は直鎖の一部でない。
本願で用いられる用語「患者」は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
化学式において、括弧は分子内または基内の結合性を示すのに本明細書中で用いられる。特に、括弧は以下を示すのに用いられる：１）１つより多い原子または基が特定の原子に結合されていること；または２）分枝部位（すなわち、開き括弧の直前の原子が、括弧内の原子または基および閉じ括弧の直後の原子または基の両方に結合されている）。第１の使用例は「-N（アルキル）2」であり、これは２つのアルキル基がＮ原子に結合していることを示す。第２の使用例は「-C（O）NH2」であり、これはカルボニル基およびアミノ（「NH2」）基の両方が、指し示された炭素原子に結合していることを示す。-C（O）NH2」基は、以下の構造を含む他の方法で表され得る：
他の定義は、必要な場合に本明細書中に記載する。
本発明の化合物
本発明の１実施態様（Ａ）の化合物は、以下の式（I）の化合物である：
ここで：
Ｙは
であり、
但し、R5が-OHの場合、Ｙはまた以下であり得：
Ｃはアリールまたはヘテロアリール環であり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じて-R4で置換され；
R1は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R2は結合、-C（O）-、-C（O）C（O）-、−S（O）2-、-OC（O）-、-N（H）C（O）-、-N（H）S（O）2-、-N（H）C（O）（O）-、-CH=CHC（O）-、-OCH2C（O）-、-N（H）CH2C（O）-、-N（R19）C（O）-、-N（R19）S（O）2-、-N（R19）C（O）C（O）-、または-N（R19）CH2C（O）-であり、但しR2が結合でない場合、R2は７員環に結合したNHにカルボニルまたはスルホニルを介して結合され；
R3は-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキル、-N（アルキル）2、
であり；
R4は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）（アルキル）、-N（アルキル）2、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O）2アルキル-、または-C（O）アルキルであり；
R5は-OH、-OR8、または-N（H）OHであり；
R6は-H、-CH2OR9、-CH2SR10、-CH2N（H）R9、-CH2N（R9）R12、-C（H）N2、-CH2F、-CH2Cl、-C（O）N（R11）R12、-R13、または-R14であり；
R8は-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、またはアルキルヘテロ環であり；
R9は-H、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-P（O）R15R16であり；
R10は-アルキルアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
各R11およびR12は独立して、-H、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R13は-アルキルアリール、-アルケニルアリール、-アルキニルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R14は
であり、ここで、（i）に結合する任意の水素は必要に応じてR17と置換され、および（ii）に結合する任意の水素は必要に応じてR17、R18またはR20と置換され；
各R15およびR16は独立して、-H、-OH、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-Ｏアルキル、-Ｏアリール、-Ｏヘテロアリール、-Ｏアルキルアリール、または-Ｏアルキルヘテロアリールであり；
R17は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-SO2NH2、-C（O）H、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）アルキル、-N（アルキル）2、-CO2アルキル、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S（O）2N（H）アルキル、-S（O）2N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル、または-C（O）アルキルであり；
R18は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-O-アリール、-O-ヘテロアリール、-O-アルキルアリール、-O-アルキルヘテロアリール、-N（H）アリール、N-（アリール）2、-N（H）ヘテロアリール、-N（ヘテロアリール）2、-N（H）アルキルアリール、-N（アルキルアリール）2、-N（H）アルキルヘテロアリール、-N（アルキルヘテロアリール）2、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-S-アルキルアリール、-S-アルキルヘテロアリール、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-CO2アリール、-CO2ヘテロアリール、-CO2アルキルアリール、-CO2アルキルヘテロアリール、-C（O）N（H）アリール、-C（O）N（アリール）2、-C（O）N（H）ヘテロアリール、-C（O）N（ヘテロアリール）2、-C（O）N（H）アルキルアリール、-C（O）N（アルキルアリール）2、-C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-C（O）N（アルキルヘテロアリール）2、-S（O）2アリール、-S（O）2ヘテロアリール、-S（O）2アルキルアリール、-S（O）2アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（H）アリール、-S（O2）N（H）ヘテロアリール、-S（O2）N（H）アルキルアリール、-S（O）2N（H）アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（アリール）2、-S（O）2N（ヘテロアリール）2、-S（O）2N（アルキルアリール）2、-S（O）2N（アルキルヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（H）アリール、-N（H）C（O）N（H）ヘテロアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-N（H）C（O）N（アリール）2、-N（H）C（O）N（ヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルヘテロアリール）2であり；
R19は-H、-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、または-アルキルヘテロ環であり；
R20は-アルキル-R18であり；
ｍは０または１であり；そして
ＸはＯまたはＳである。
本発明の別の実施態様（Ｂ）の化合物は、以下の式（II）の化合物である：
ここでＹは、以下の式であり：
R7は-C（O）アルキル、-C（O）シクロアルキル、-C（O）アルキニル（alkyenyl）、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-C（O）ヘテロ環、または-C（O）アルキルヘテロ環であり；そして他の置換基は上記のように定義される。
実施態様（Ａ）および（Ｂ）の好ましい化合物は、以下のものである：
Ｃはベンゾ、ピリド、チエノ、ピロロ、フロ、イミダゾ、チアゾロ、オキサゾロ、ピラゾロ、イソチアゾロ、イソキサゾロ、またはトリアゾロであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素が必要に応じてR4で置換される。
実施態様（Ａ）および（Ｂ）のさらに好ましい化合物は、以下のものである：
Ｙは
であり；
Ｃはベンゾであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じてR4で置換され；
R1は-フェニル、-ナフチル、または-イソキノリニルであり、ここでR17は-OH、-NH2、-Cl、-F、-Ｏアルキル、または-N（アルキル）2であり；
R2は-C（O）-、-S（O2）-、-C（O）C（O）-、または-CH2C（O）-であり；
R3は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-フェニル、-2-ピリジニル、-3-ピリジニル、-4-ピリジニル、または-チアゾリルであり；
R4は-フルオロまたは-クロロであり；
R5は-OHであり；
R6は：
-H；または
-R14であり、ここでＸ＝Ｏであり、但し、-R14が（i）の場合、R17は-Ｏアルキル、-Fまたは-Clであり、そして但し、-R14が（ii）の場合、R18は-アリールであり、ここでアリールはフェニルであり；
R7は-C（O）アルキルであり；
R8は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-シクロペンチル、-フェネチル、または-ベンジルであり；
Ｘ＝Ｏであり；あるいは
ｍ＝０である。
本発明の実施態様（Ａ）の好ましい化合物は以下のものを含むが、これに限定されない：
本発明者らはここで実施態様（Ｃ）および（Ｄ）の化合物を選択する。本発明の実施態様（Ｃ）の化合物は以下の式（III）の化合物である：
ここで：
Ｙは
であり、
但し、R5が-OHの場合、Ｙはまた以下であり得：
Ｃはアリールまたはヘテロアリール環であり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じて-R4で置換され；
R1は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R2は結合、-C（O）-、-C（O）C（O）-、-S（O）2-、-OC（O）-、-N（H）C（O）-、-N（H）S（O）2-、-N（H）C（O）C（O）-、-CH=CHC（O）-、-OCH2C（O）-、-N（H）CH2C（O）-、-N（R19）C（O）-、-N（R19）S（O）2-、-N（R19）C（O）C（O）-、-N（R19）CH2C（O）-、または-C（O）C（=NOR11）-であり、但しR2が結合でない場合、R2は７員環NH基にカルボニルまたはスルホニルを介して結合され；
R3は-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキル、-N（アルキル）2、
であり；
R4は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）（アルキル）、-N（アルキル）2、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル-、-C（O）アルキル、-CH2NH2、-CH2N（H）アルキル、またはCH2N（アルキル）2であり；
R5は-OH、-OR8、または-N（H）OHであり；
R6は-H、-CH2OR9、-CH2SR10、-CH2NHR9、-CH2N（R9）R12、-CHN2、-CH2F、-CH2Cl、-C（O）N（R11）R12、-R13、または-R14であり；
R8は-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、またはアルキルヘテロ環であり；
R9は-H、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-P（O）R15R16であり；
R10は-アルキルアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
各R11およびR12は独立して、-H、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R13は-アルキルアリール、-アルケニルアリール、-アルキニルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R14は
であり、ここで、（i）に結合する任意の水素は必要に応じてR17と置換され、および（ii）に結合する任意の水素は必要に応じてR17、R18またはR20と置換され；
各R15およびR16は独立して、-H、-OH、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-Ｏアルキル、-Ｏアリール、-Ｏヘテロアリール、-Ｏアルキルアリール、または-Ｏアルキルヘテロアリールであり；
R17は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-S（O）2NH2、-C（O）H、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）アルキル、-N（アルキル）2、-CO2アルキル、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S（O）2N（H）アルキル、-S（O）2N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル、または-C（O）アルキルであり；
R18は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-O-アリール、-O-ヘテロアリール、-O-アルキルアリール、-O-アルキルヘテロアリール、-N（H）アリール、-N（アリール）2、-N（H）ヘテロアリール、-N（ヘテロアリール）2、-N（H）アルキルアリール、-N（アルキルアリール）2、-N（H）アルキルヘテロアリール、-N（アルキルヘテロアリール）2、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-S-アルキルアリール、-S-アルキルヘテロアリール、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-CO2アリール、-CO2ヘテロアリール、-CO2アルキルアリール、-CO2アルキルヘテロアリール、-C（O）N（H）アリール、-C（O）N（アリール）2、-C（O）N（H）ヘテロアリール、-C（O）N（ヘテロアリール）2、-C（O）N（H）アルキルアリール、-C（O）N（アルキルアリール）2、-C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-C（O）N（アルキルヘテロアリール）2、-S（O）2-アリール、-S（O）2-ヘテロアリール、-S（O）2-アルキルアリール、-S（O）2アルキルヘテロアリール、-S（O）2NH-アリール、-S（O2）NH-ヘテロアリール、-S（O）2N（H）アルキルアリール、-S（O）2N（H）アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（アリール）2、-S（O）2N（H）ヘテロアリール）2、-SO2N（アルキルアリール）2、-SO2N（アルキルヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（H）アリール、-N（H）C（O）N（H）ヘテロアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-N（H）C（O）N（アリール）2、-N（H）C（O）N（H）ヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルヘテロアリール）2であり；
R19は-H、-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、または-アルキルヘテロ環であり；
R20は-アルキル-R18であり；
ｍは０または１であり；そして
ＸはＯまたはＳである。
本発明の実施態様（Ｄ）の化合物は以下の式（IV）の化合物である：
ここでＹは、以下の式であり：
R7は-C（O）アルキル、-C（O）シクロアルキル、-C（O）アルキニル（alkyenyl）、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-C（O）ヘテロ環、または-C（O）アルキルヘテロ環であり；そして他の置換基は上記のように定義される。
上記の実施態様において、R8およびR19はまた独立して、ヘテロシクリルまたはアルキルシクロアルキルから選択される。
実施態様（Ｂ）および（Ｄ）において、Ｙはまた以下から選択される：
実施態様（Ｃ）および（Ｄ）の好ましい化合物は以下のものである：
Ｃはベンゾ、ピリド、チエノ、ピロロ、フロ、イミダゾ、チアゾロ、オキサゾロ、ピラゾロ、イソチアゾロ、イソキサゾロ、またはトリアゾロであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素が必要に応じてR4で置換される。
実施態様（Ｃ）および（Ｄ）のさらに好ましい化合物は以下のものである：
Ｙは
であり；
Ｃはベンゾであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じてR4で置換され；
R1は-フェニル、-ナフチル、または-イソキノリニルであり、ここでR17は-OH、-NH2、-Cl、-F、-Ｏアルキル、または-N（アルキル）2であり；
R2は-C（O）-、-S（O）2-、-C（O）C（O）-、または-CH2C（O）-であり；
R3は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-フェニル、-2-ピリジニル、-3-ピリジニル、-4-ピリジニル、または-チアゾリルであり；
R4は-フルオロまたは-クロロであり；
R5は-OHであり；
R6は：
-H；または
-R14であり、ここでＸ＝Ｏであり、但し、-R14が（i）の場合、R17は-Ｏアルキル、-Fまたは-Clであり、そして但し、-R14が（ii）の場合、R18は-アリールであり、ここでアリールはフェニルであり；
R7は-C（O）アルキルであり；
R8は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-シクロペンチル、-フェネチル、または-ベンジルであり；
Ｘ＝Ｏであり；または
ｍ＝０である。
実施態様（Ｂ）および（Ｄ）の他のさらに好ましい化合物は、Ｙが以下のものであり：
そしてその他の置換基は上記のように定義される。
本発明の好ましい化合物は以下のものを含むが、これらに限定されない：
本発明の別の好ましい化合物は以下のものを含むが、これらに限定されない：
本発明のICEインヒビターは１つ以上の「不斉の」炭素原子を含有し、従って、ラセミ体およびラセミ混合物、単一エナンチオマー、ジアステレオマー混合物および個々のジアステレオマーとして生じ得る。これらの化合物の全てのこの異性体は本発明に明白に包含される。各不斉炭素は、ＲまたはＳ配置であり得る。本願に例示される特定の化合物および骨格（scaffold）は特定の立体化学配置で描写され得るが、任意の所定のキラル中心で逆の立体化学またはこれらの混合物のいずれかを有する化合物および骨格もまた、想像される。
ICEインヒビターは任意で、炭素、窒素または他の原子において、様々な置換基により置換され得る。複合的に置換される場合、置換基の組合せが安定な化合物の形成を生じる限り、各置換基は任意の他の置換基から独立して選択され得る。
本発明により想像される置換基および改変体の組合せは、安定な化合物の形成を生じるもののみである。用語「安定な」は、本明細書中で用いられる場合、製造および当業者に公知の方法による哺乳動物への投与を許容するのに十分な安定性を有する化合物を意味する。典型的には、このような化合物は40℃またはそれ未満の温度で、水分または他の化学的反応性条件の非存在下、少なくとも１週間、安定である。
置換基は様々な形態で表され得る。これらの様々な形態は当業者に公知であり、互換的に用いられ得る。例えば、フェニル環上のメチル置換基は、以下の形態のいずれかで表され得る：
様々な形態のメチルのような置換基が、本明細書中で互換的に用いられ得る。
本発明の化合物は、約700ダルトン未満またはこれに等しい分子量を有し、より好ましくは約400ダルトンと600ダルトンとの間の分子量を有する。これらの好ましい化合物は経口投与時、患者の血流により容易に吸収され得る。この経口利用能により、このような化合物は、IL-1、アポトーシス、IGIF、またはIFN-γ媒介疾患に対する、経口投与処置および予防レジメンの優秀な薬剤となる。
本発明の化合物は、溶媒の選択、pH、および当業者に公知の他のものを含めた条件に依存して、種々の平衡形態で存在し得ることを理解するべきである。これらの化合物のこのような形態の全ては、明らかに、本発明に包含される。特に、本発明の多くの化合物（特に、R3にアルデヒド基またはケトン基を含有し、そしてＴにカルボン酸基を含有するもの）は、ヘミケタール（またはヘミアセタール）形態または水和形態をとり得る。例えば、Ｙが以下である場合、実施態様（Ａ）の化合物はヘミアセタールまたはヘミケタール形態をとる：
溶媒の選択および当業者に公知の他の条件に依存して、本発明の化合物はまた、水和、アシルオキシケタール、アシルオキシアセタール、ケタール、アセタールまたはエノール形態をとり得る。例えば、実施態様（Ｂ）において、Ｙが以下である場合、本発明の化合物は水和形態をとり：
そしてR8がＨであり；
Ｙが以下である場合、アルコキシケタールまたはアシルオキシアセタール形態をとり：
Ｙが以下である場合、ケタールまたはアセタール形態をとり：
そして、Ｙが以下である場合、エノール形態をとる：
さらに、本発明の化合物の平衡形態は、互変異性形態を包含し得ることを理解すべきである。これらの化合物のこのような形態の全ては、明らかに、本発明に包含される。
本発明の化合物は、選択的な生物学的特性を高めるために、適切な官能基により、改変できることを理解すべきである。このような改変は、当該技術分野で公知であり、これには、所定の生体系（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生体浸透性を高めるもの、経口適用性を高めるもの、注射による投与を可能にするために溶解性を高めるもの、代謝を変えるもの、および排出速度を変えるものが挙げられる。さらに、この化合物は、プロドラッグに対する代謝または他の生化学過程の作用の結果として、所望の化合物が患者の体内で形成されるように、プロドラッグ形態に変えることができる。このようなプロドラッグ形態は、代表的には、インビトロアッセイにおいて活性をほとんどまたは全く示さない。プロドラッグ形態のいくつかの例には、ケトン基またはアルデヒド基を含有する化合物のケタール、アセタール、オキシム、イミンおよびヒドラゾン形態が包含され、この場合、特に、それらの形態は、本発明の化合物のR3基で生じる。プロドラッグ形態の他の例として、本明細書中に記載される、ヘミケタール、ヘミアセタール、アシルオキシケタール、アシルオキシアセタール、ケタール、アセタールおよびエノール形態が挙げられる。
組成物および方法
本発明の化合物は、ICEに対する優れたリガンドである。従って、これらの化合物は、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF-媒介疾患およびIFN-γ媒介疾患における事象を標的および阻害し得、それにより、炎症性疾患、自己免疫性疾患、破壊性骨障害、増殖性障害、感染性疾患、および変性疾患におけるそのタンパクの最終的な活性を標的および阻害し得る。例えば、本発明の化合物は、ICEを阻害することにより前駆体IL-1βの成熟IL-1βへの転化を阻害する。ICEは、成熟IL-1の生成に必須なために、その酵素の阻害は、成熟IL-1の生成を阻害することにより、IL-1が媒介する生理学的な作用および症状（例えば、炎症）の開始を効果的にブロックする。それゆえ、IL-1β前駆体の活性を阻害することにより、本発明の化合物は、IL-1インヒビターとして、効果的に機能する。
本発明の化合物はまた、ICEを阻害することによりpro-IGIFの活性な、成熟IGIFへの転化を阻害する。ICEは、成熟IGIFの生成に必須なために、ICEの阻害は、成熟IGIFの生成を阻害することにより、IGIFが媒介する生理学的な効果および症状の開始を効果的にブロックする。順番に、IGIFはIFN-γの生成に必須である。それゆえ、ICEは、成熟IGIFの生成、従ってIFN-γの生成を阻害することにより、IFN-γが媒介する生理学的な効果および症状の開始を効果的にブロックする。
従って、本発明の薬学的組成物および方法は、インビボにおけるICE活性の制御に有用である。本発明の組成物および方法は、従ってインビボにおけるIL-1、IGIFもしくはIFN-γレベルの制御、およびIL-1媒介、アポトーシス媒介、IGIF媒介もしくはIFN-γ媒介状態（疾患、障害もしくは影響を含む）の進行、重篤度または影響の処置もしくは軽減に有用である。
従って、本発明の一つの実施態様は、治療有効量のICEインヒビター、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を被験体へ投与する工程を含む、被験体のIGIF産生を減少させる方法を提供する。
本発明の他の実施態様は、治療有効量のICEインヒビター、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を被験体へ投与する工程を含む、被験体のIFN-γ産生を減少させる方法を提供する。
他の実施態様において、本発明の方法は、ICE関連プロテアーゼのインヒビター（pro-IGIFを活性IGIFへ開裂可能）および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を被験体へ投与する工程を含む。１つのそのようなICE関連プロテアーゼは、上述のようにTXである。このように本発明は、TXインヒビターの投与による、IGIFおよびIFN-γレベルの制御のための方法および薬学的組成物を提供する。
pro-IGIFを活性IGIF型へプロセッシング可能な、他のICE関連プロテアーゼもまた見出され得る。このように、これら酵素のインヒビターは当業者によって同定され得、そしてまた本発明の範囲内にあることは想像される。
本発明の薬学的組成物は、ICEインヒビターまたはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを包含する。そのような組成物は任意にさらなる治療剤を含有し得る。そのような薬剤には抗炎症剤、マトリックス金属プロテアーゼインヒビター、リポキシゲナーゼインヒビター、サイトカインアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗ガン剤、抗ウイルス剤、サイトカイン、成長因子、免疫調節剤、プロスタグランジン、もしくは抗血管過剰増殖化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
薬学的組成物が活性成分としてICEインヒビターのみを含有する場合、そのような方法は追加的な薬剤を被験体へ投与する工程を、追加的に包含し得る。そのような薬剤には抗炎症剤、マトリックス金属プロテアーゼインヒビター、リポキシゲナーゼインヒビター、サイトカインアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗ガン剤、抗ウイルス剤、サイトカイン、成長因子、免疫調節剤、プロスタグランジン、もしくは抗血管過剰増殖化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
用語「薬学的有効量」は、患者におけるIL-1、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γ媒介疾患を処置するか、または改善する際に有効な量を意味する。用語「予防的有効量」とは、患者におけるIL-1、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γ媒介疾患を予防するか実質的に緩和するのに有効な量を意味する。
用語「薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバント」は、本発明の化合物と共に患者に投与され得る非毒性のキャリアまたはアジュバントであって、これらの化合物の薬理学的な活性を損なわないものを意味する。
用語「薬学的に受容可能な誘導体」は、本発明の化合物または任意の他の化合物の任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、またはこのようなエステルの塩であって、レシピエントに投与した際、本発明の化合物またはそれらの抗ICE活性代謝物または残留物を（直接的または間接的に）提供できるものを意味する。
本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩には、例えば、薬学的に受容可能な無機酸および有機の酸および塩基から誘導したものが挙げられる。適切な酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸およびベンゼンスルホン酸が包含される。他の酸（例えば、シュウ酸）は、それ自体薬学的に受容可能ではないものの、本発明の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な酸の付加塩を得る際に、中間体として有用な塩の調製に使用され得る。適切な塩基由来の塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム塩およびN-（C1-4アルキル）4 +塩が挙げられる。
本発明はまた、本明細書中で開示された化合物のいずれかの塩基性窒素含有基の「四級化」を想定している。この塩基性窒素は、当業者に公知の任意の試薬で四級化され得、これらの試薬には、例えば、ハロゲン化低級アルキル（例えば、塩化、臭化およびヨウ化メチル、塩化、臭化およびヨウ化エチル、塩化、臭化およびヨウ化プロピルならびに塩化、臭化およびヨウ化ブチル）；硫酸ジアルキル（硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチルおよび硫酸ジアミルを含む）；長鎖ハライド（例えば、塩化、臭化およびヨウ化デシル、塩化、臭化およびヨウ化ラウリル、塩化、臭化およびヨウ化ミリスチルならびに塩化、臭化およびヨウ化ステアリル）；およびハロゲン化アラルキル（臭化ベンジルおよび臭化フェネチルを含む）が挙げられる。水溶性または油溶性、あるいは分散性の生成物は、このような四級化により得られ得る。
本発明の化合物は、従来の様式にて、インビボにおけるIGIFおよびIFN-γレベルの制御、ならびにIL-1媒介、アポトーシス媒介、IGIF媒介もしくはIFN-γにより媒介される疾患の処置または影響の進行、もしくは重篤度の軽減に使用され得る。このような処置方法、それらの用量レベルおよび必要条件は、利用可能な方法および技術から当業者により選択され得る。
例えば、本発明の化合物は、薬学的に受容可能な様式およびその疾患の重篤度を弱めるのに有効な量で、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患を罹っている患者に対し投与するための薬学的に受容可能なアジュバントと組み合わせ得る。
あるいは、本発明の化合物は、長時間にわたって、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患に対して個体を処置するか保護するための組成物および方法において使用され得る。化合物は、このような組成物において、薬学的組成物におけるICEインヒビターの従来の利用に一致する様式で、単独で、または本発明の他の化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の化合物は、通常ワクチンで使用され、そしてIL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患に対し長期間にわたって個体を保護する予防的有効量で投与される、薬学的に受容可能なアジュバントと組み合わせ得る。
本発明の化合物はまた、種々のIL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患に対する治療または予防の効果を高めるために、他のICEインヒビターと同時投与し得る。
さらに、本発明の化合物は、従来の抗炎症剤か、またはマトリックス金属プロテアーゼインヒビター、リポキシゲナーゼインヒビター、およびIL-1β以外のサイトカインのアンタゴニストのいずれかと組合わせて使用され得る。
本発明の化合物はまた、IL-1媒介疾患症状（例えば、炎症）を予防するかまたは格闘（combat）するために、免疫調節剤（例えば、ブロピリミン、抗ヒトαインターフェロン抗体、IL-2、GM−CSF、メチオニンエンケファリン、インターフェロンα、ジエチルジチオカーバメート、腫瘍壊死因子、ナルトレキソンおよびEPO）と組み合わせるか、またはプロスタグランジンと共に、もしくは抗ウイルス剤（例えば、3TC、ポリサルファイトポリサッカライド、ガンシクロビル（ganiclovir）、リバビリン、アシクロビル（acyclovir）、αインターフェロン、トリメトトレキセート（trimethotrexate）およびファンシクロビル（fancyclovir））と共に、もしくはこれらのプロドラッグ、または関連物質が投与され得る。
本発明の化合物を、他の薬剤との組み合わせ治療において投与する場合、それらは、患者に連続的にまたは同時に投与され得る。あるいは、本発明に従った薬学的組成物または予防的組成物は、本発明のICEインヒビターおよび別の治療剤または予防剤の組合を含む。
本発明の薬学的組成物に使用され得る、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルにはイオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝液基質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロック重合体、羊毛脂および自己乳化（self-emulsifying）薬物送達システム（SEDDS）（例えば、α-トコフェロール、ポリエチレングリコール1000スクシネート、もしくは他の類似のポリマー性送達マトリックス）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の薬学的組成物は、経口的、非経口的に、吸入噴霧により、局所的に、直腸から、鼻から、頬から、膣から、または移植したリザーバーを介して、投与され得る。経口投与が好ましい。本発明の薬学的組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含有し得る。いくつかの場合、処方物のpHは、処方された化合物もしくはその送達形態の安定性を強化するために、薬学的に受容可能な酸、塩基もしくは緩衝液で調節され得る。本明細書で使用する用語、非経口的は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内および頭蓋内の注射技術または注入技術を含む。
薬学的組成物は、例えば、無菌の注射可能な水性懸濁液または油性懸濁液として、無菌の注射可能な調製物の形態であり得る。この懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤（例えば、Tween 80）および懸濁剤を用いて、当該技術分野で公知の技術に従って、処方され得る。この無菌の注射可能な調製物はまた、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒には、マンニトール、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定化油は、溶媒または懸濁媒体として、従来使用されている。この目的には、任意のブランドの不揮発性油も使用でき、これには、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。脂肪酸（例えば、オレイン酸）およびそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に受容可能なオイル（例えば、オリーブ油またはひまし油、特に、それらのポリオキシエチル化した型）と同様に、注射可能物の調製に有用である。これらのオイル溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤（例えば、Pharmacopeia Helvetica，Ph. Helvに記載または類似のアルコール）を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、任意の経口的に受容可能な投薬形態（これには、カプセル、錠剤、および水性懸濁液および水性溶液が含まれるが、それらに限定されない）で、経口的に投与され得る。経口用途に対する錠剤の場合には、通常使用されるキャリアには、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）もまた、代表的には、添加される。カプセル形態の経口投与に有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液を経口投与する場合、その活性成分は、乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。所望の場合、所定の甘味料および/または香料および/または着色剤が添加され得る。
本発明の薬学的組成物はまた、直腸投与のための座剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、本発明の化合物と、適切な非刺激性の賦形剤（これは、室温で固体であるが、直腸温度では液体であり、従って、直腸で融けて活性成分を放出する）とを混合することにより、調製され得る。このような物質には、ココアバター、蜜ロウおよびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
所望の治療が、局所的な適用により容易にアクセスできる領域または器官を包含するとき、本発明の薬学的組成物の局所投与は、特に有用である。皮膚への局所的適用のために、この薬学的組成物は、キャリアに懸濁するかまたは溶解した活性成分を含む適切な軟膏で、処方すべきである。本発明の化合物の局所投与用のキャリアには、鉱油、液化石油、ホワイト石油（white petroleum）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、この薬学的組成物は、キャリアに懸濁するかまたは溶解した活性化合物を含む適切なローションまたはクリームで処方できる。適切なキャリアには、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリール（cetearyl）アルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物はまた、直腸座剤処方物により、または適切な洗腸処方物にて、下部腸管に局所的に適用され得る。局所的に投与される経皮パッチもまた、本発明に含まれる。
本発明の薬学的組成物は、鼻エアロゾルまたは鼻吸入により、投与され得る。このような組成物は、薬学的処方の当該技術分野で周知の技術に従って調製され、そして生理食塩液中の溶液として、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または当該技術分野で公知の他の可溶化剤または分散剤を使用して調製され得る。
活性成分化合物の１日あたり約0.01〜約100mg/kg体重、好ましくは１日あたり0.5〜75mg/kg体重、最も好ましくは約１〜約50mg/kg体重の投薬レベルは、以下を含むIL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF-媒介疾患およびIFN-γ媒介疾患の予防および処置のための単独治療に有用である：炎症疾患、自己免疫性疾患、破壊性骨障害、増殖性障害、感染性疾患、変性疾患、壊死性疾患、骨関節炎、急性膵炎、慢性膵炎、喘息、成人呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーヴス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、慢性活性肝炎、重症筋無力症、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、移植片対宿主病、骨粗鬆症、多発性骨髄腫関連骨疾患、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、敗血症、敗血症ショック、細菌性赤痢、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、心筋虚血、棘筋萎縮症、多発性硬化症、AIDS関連脳炎、HIV関連脳炎、老化、脱毛症、脳卒中による神経学的損傷、潰瘍性大腸炎（collitis）、感染性肝炎、若年性糖尿病、扁平苔癬、急性皮膚筋炎、湿疹、原発性肝硬変、ブドウ膜病、ベーチェット病、アトピー性皮膚炎、赤芽球ろう、再生不良性貧血、筋萎縮性側索硬化、ネフローゼ症候群、および全身疾患、もしくは肝臓もしくは他の器官に局所化した、炎症性もしくはアポトーシス構成要素を有する影響を与える、食物アルコールの過剰な摂取もしくはウイルス（例えばHBV、HCV、HGV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、および日本脳炎ウイルス）によって引き起こされる疾患。
代表的には、本発明の薬学的組成物は、１日あたり約１〜５回、あるいは連続注入として投与される。このような投与は、慢性治療または急性治療として使用され得る。単回用量形態を生じるためにキャリア物質と組合わせされ得る活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与形態に依存して変化する。代表的な調製物は、約５％〜約95％の活性化合物（w/w）を含む。好ましくは、このような調製物は、約20〜約80％の活性化合物を含む。
本発明の組成物がICEインヒビターおよび一つもしくはそれ以上の、追加的な治療剤もしくは予防剤との組み合わせを含む場合、ICEインヒビターおよび追加的な薬剤の両方が、単独治療の処置レジメにおいて通常投与される投薬量の約10％〜約80％の投薬レベルで存在するべきである。
患者の状態の改善の際に、必要であれば、本発明の化合物、組成物、またはその組合せの維持用量が投与され得る。続いて、投与の投薬量もしくは頻度、またはその両方は、症候が所望のレベルに軽減され、処置を止めるべき場合に、改善された状態が保持されるレベルまで、症候の関数として低減され得る。しかし、患者は、いずれの再発または疾患症候の長期基礎に対する断続的処置を必要とし得る。
当業者が認識するように、上記の用量より低いまたは高い用量が必要とされ得る。あらゆる特定の患者のための特定の投薬量および処置レジメは、種々の因子（使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事制限、投与時間、***率、薬物の組合せ、疾患の重篤度および経過、および患者の疾患に対する素因、および処置する医師の判断を含む）に依存する。
本発明の化合物により処置もしくは予防され得るIL-1媒介疾患には、炎症性疾患、自己免疫性疾患、増殖性障害、感染性疾患および変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物によって処置もしくは予防され得るアポトーシス媒介疾患には、変性疾患が挙げられる。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介炎症性疾患には、骨関節炎、急性膵炎、慢性膵炎、喘息および成人呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい炎症性疾患は、骨関節炎もしくは急性膵炎である。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介自己免疫性疾患には、糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、慢性活性肝炎、重症筋無力症、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬および移植片対宿主病が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい自己免疫性疾患は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病または乾癬である。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介破壊性骨障害には、骨粗鬆症および多発性骨髄腫関連骨疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介増殖性疾患には、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポジ肉腫および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介感染性疾患には、敗血症、敗血症ショックおよび細菌性赤痢が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の化合物により処置または予防され得るIL-1媒介変性疾患またはIL-1媒介壊死性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、および心筋虚血が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい変性疾患は、アルツハイマー病である。
本発明の化合物により処置または予防され得るアポトーシス媒介変性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、心筋虚血、棘筋萎縮症、多発性硬化症、AIDS関連脳炎、HIV関連脳炎、老化、脱毛症、および脳卒中による神経学的損傷が挙げられるが、これらに限定されない。
炎症性もしくはアポトーシス構成要素を有する他の疾患は、本発明の化合物により処置もしくは予防され得る。そのような疾患は全身疾患もしくは肝臓もしくは他の器官に局所化した影響を有する疾患であり得る。また、例えば、食物アルコールの過剰な摂取もしくはウイルス（例えばHBV、HCV、HGV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、および日本脳炎ウイルス）によって引き起こされ得る。
本発明の化合物により処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介疾患には、炎症性、感染性、自己免疫性、増殖性、神経変性および壊死性状態が挙げられるが、これらに限定されない。
処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介炎症性疾患には、骨関節炎、急性膵炎、慢性膵炎、喘息、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳性虚血、心筋虚血および成人呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、炎症性疾患は、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎もしくは成人呼吸窮迫症候群である。
処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介感染性疾患には、感染性肝炎、敗血症、敗血症ショックおよび細菌性赤痢が挙げられるが、これらに限定されない。
処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介自己免疫性疾患には、糸球体腎炎、全身エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、若年性糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、扁平苔癬、移植片対宿主病、急性皮膚筋炎、湿疹、原発性肝硬変、肝炎、ブドウ膜炎、ベーチェット病、アトピー性皮膚炎、赤芽球ろう、再生不良性貧血、筋萎縮性側索硬化およびネフローゼ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、自己免疫性疾患は、糸球体腎炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、若年性糖尿病、乾癬、移植片対宿主病もしくは肝炎である。
本発明は、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF-媒介疾患およびIFN-γ媒介疾患を予防し処置するために、本明細書で開示の化合物の使用に焦点をあてているが、本発明の化合物はまた、他のシステインプロテアーゼのインヒビター剤として使用され得る。
本発明の化合物はまた、ICEまたは他のシステインプロテアーゼに効果的に結合する市販試薬として、有用である。市販試薬としては、本発明の化合物およびそれらの誘導体は、生化学における標的ペプチドのタンパク質分解を阻止もしくはICEおよびICEホモログについての細胞アッセイのために使用され得るか、または誘導体化されて、アフィニティークロマトグラフィー用の拘束基質として、安定な樹脂に結合され得る。市販のシステインプロテアーゼインヒビターを特徴づけるこれらの用途および他の用途は、当業者に明らかである。
N-アシルアミノ化合物の調製プロセス
本発明のICEインヒビターは従来の手法を用いて合成され得る。都合よく、これらの化合物は容易に入手し得る出発物質から便利に合成される。
本発明の化合物は、ICEインヒビターとして公知の中で最も容易に合成される。前述のICEインヒビターの多くは、４もしくはそれ以上のキラル中心および極めて多数のペプチド結合を含む。本発明の化合物が比較的容易に合成され得るということは、これらの化合物の大規模生産という利点を意味する。
例えば、本発明の化合物は本明細書中に述べられたプロセスを用いて調製され得る。当業者によって理解され得るように、これらのプロセスが本出願において記載されたおよび請求された化合物を合成し得る唯一の方法ではない。さらなる方法は当業者に明らかである。加えて、本明細書中で述べられた種々の合成工程は、所望の化合物を得るための別の連続もしくは順序で実行され得る。
本発明のN-アシルアミノ化合物の好ましい調製方法は、以下の工程を包含する：
a）カルボン酸とN-alloc保護アミンとを不活性溶媒、トリフェニルホスフィン（triphenylphoshine）、求核スカベンジャーおよびテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（0）の存在下、周囲温度で不活性雰囲気下で混合する工程；および
b）工程a）の混合物に、HOBTおよびEDCを添加する工程；および、必要に応じて以下の更なる工程を包含する：
c）酸およびH2Oをを含する溶液の存在下、工程b）の混合物を加水分解する工程、ここで工程b）の混合物を加水分解前に任意で濃縮する。
好ましくは、不活性溶媒はCH2Cl2、DMFもしくはCH2Cl2およびDMFの混合物である。
好ましくは、求核スカベンジャーはジメドン（dimedone）、モルフォリン、トリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。より好ましくは、求核スカベンジャーはトリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。
好ましくは、溶液はトリフルオロ酢酸を約１〜90％重量含む。より好ましくは、溶液はトリフルオロ酢酸を約20〜50％重量含む。
あるいは、溶液は塩酸を約0.1〜30重量％含む。より好ましくは、溶液は塩酸を約５〜15重量％含む。
より好ましくは、上記のプロセスにおいて、不活性溶媒はCH2Cl2、DMFもしくはCH2Cl2およびDMFの混合物であり、および求核スカベンジャーは、ジメドン、モルフォリン、トリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。
最も好ましくは、上記のプロセスにおいて、不活性溶媒はCH2Cl2、DMFもしくはCH2Cl2およびDMFの混合物であり、および求核スカベンジャーはトリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。
好ましいプロセス例において、N-アシルアミノ化合物は式（V）で表される：
ここで：
R21は：
であり；
R22は：
もしくは
であり；
ｍはｌであり；および
R23は-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリールもしくはアルキルヘテロ環および上記で述べたような他の置換基である。
好ましくは、カルボン酸はR22-OHであり、N-alloc保護アミンは：
（IV）：
であり、ここでR23およびｍは上記で定義されたものである。
本発明をさらに充分に理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示の目的だけのものであり、いずれの様式でも、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１
（3S）-3-［3（R,S）-1,3-ジヒドロ-2-オキソ-5-フェニル（（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）-2H-1,4-ベンゾジアゼピン-1-アセチルアミノ］-4-オキソ酪酸
工程１．１（2.4ｇ 6.22mmol；SherrillおよびSugg、J．Org．Chem．、60、730〜734頁（1995）に記載のように調製）の０℃のTHF溶液（30ml）をNaH（240mg、6.00mmolの60％油分散体）で処理した。０℃で１時間反応系を撹拌した後、メチルブロモアセテート（0.6ml、6.32mmol）を反応系に加え、そして室温まで昇温させた。反応系を水（10ml）および水性10％NaHSO4（１ml）でクエンチし、そして酢酸エチルで抽出した（２×）。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥し、そして減圧濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、10〜３％の塩化メチレン／酢酸エチル溶離液）により2.15ｇ（76％）の２を得た。
工程２．1Nの水性NaOH（3.5ml、3.5mmol）を、メタノールおよびTHF（１：１で６ml）中の２（340mg、0.74mmol）の溶液に加えた。反応系を室温で18時間撹拌した。反応系をエバポレートし、水に溶解し、そして10％の水性NaHSO4でpH３まで酸性にした。水層を酢酸エチルで抽出し（３×）、そして合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥し、そして減圧濃縮して210mg（64％）の３を得た。
工程３．（3S）3-（1-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ）-4-オキソ酪酸tert-ブチルエステルセミカルバゾン（４；226mg、0.5mmol；Graybillら、Int．J．Protein Res．、44、173〜82頁（1994）に記載されるベンジルオキシカルボニル類似体と同様な方法で調製）を10mlのアセトニトリル（20ml）に溶解し、そしてジエチルアミン（２ml）を溶液に加えた。反応系を２時間撹拌し、減圧濃縮し、生成物をアセトニトリルに溶解し、そして再び減圧濃縮して（3S）3-アミノ-4-オキソ酪酸tert-ブチルエステルセミカルバゾンを得た。５℃のセミカルバゾンおよび３（188mg、0.424mmol）の塩化メチレン／DMF（１：１で６ml）溶液を、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt；57mg、0.424mmol）および1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC；115mg、0.6mmol）で処理し、そして反応系を室温で16時間撹拌した。反応系を酢酸エチル（100ml）で希釈し、そして水、水性飽和NaHCO3、および水性飽和NaClで洗い、無水Na2SO4で乾燥し、そして減圧濃縮した。クロマトグラフィー（SiO2、５％水酸化アンモニウム／５％メタノール／塩化メチレン溶離液）により250mgの５を得た。
工程４．セミカルバゾン5（250mg）を25％TFA／塩化メチレン（10ml）に溶解し、室温で５時間撹拌して黄色発泡体を得、これを５mlのMeOH、１mlの酢酸、および１mlの37％水性ホルムアルデヒドに溶解し、室温で18時間撹拌した。反応系を減圧濃縮し、そして生成したゴムをクロマトグラフィー（SiO2、１％ギ酸／２％メタノール／塩化メチレン溶離液）により精製して化合物３から69mg（30％）の実施例１を得た。1H-NMR（CD3OD）δ2.42-2.54（m、１Ｈ）；2.60-2.76（m、１Ｈ）；4.22-4.38（m、１Ｈ）；4.39-4.48（m、0.5Ｈ）；4.5-4.75（m、2.5Ｈ）；5.15（s、２Ｈ）；5.32（br．s、１Ｈ）；7.2-7.86（m、14Ｈ）。
実施例２
実施例２についてのさらなるデータを表１に示す。
（3S）-3-［3（R,S）-1,3-ジヒドロ-2-オキソ-5-フェニル-（（3,5-ジクロロ-4-メトキシベンゾイル）アミノ）-2H-1,4-ベンゾジアゼピン-1-アセチルアミノ］-4-オキソ酪酸
工程１．MBHA樹脂（0.63mmol／ｇ、4.14ｇ、2.61mmol）をジメチルアセトアミド（20mL）に懸濁させ、続いて６（2.37ｇ、4.0mmol、A．M．Murphyら、J．Am．Chem．Soc．、114、3156〜3157（1992）に従い（3S）3-（フルオレニルメチルオキシカルボニル）-4-オキソ酪酸t-ブチルエステルから調製）、O-ベンゾトリアゾール-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム（tetramethyluronium）ヘキサフルオロホスフェート（HBTU；1.53ｇ、4.04mmol）、およびDIEA（1.75mL、10.0mmol）を加えた。反応混合物を、リストアーム（wrist arm）攪拌機を使用して室温で３時間振盪した。樹脂を、焼結（sintered）ガラス漏斗で吸引濾過により単離し、そしてジメチルアセトアミドで洗った（６×20mL）。次いで、未反応のアミン基を、直接漏斗中で、樹脂を20％（v／v）の無水酢酸／ジメチルホルムアミド（２×25ml）と反応させる（10分洗浄）ことによりキャップした。樹脂を、ジメチルホルムアミド（３×50ml）、ジクロロメタン（３×50ml）およびメタノール（３×20mL）で洗い、それから真空で一晩乾燥して７を得た（5.33ｇ、0.35mmol／ｇ、1.86mmol、71％）。
工程２．樹脂７（4.0ｇ、0.35mmol／ｇ、1.4mmol）を、焼結ガラス漏斗中ジメチルホルムアミド（３×25mL）で洗うことにより膨潤（swelled）させた。次いで、Fmoc保護基を、25％（v／v）のピペリジン／ジメチルホルムアミド（25mL）で10分間（断続的に撹拌）、次いで新しいピペリジン試薬（25ml）で20分間で切断した。次いで、樹脂をジメチルホルムアミド（３×25ml）で洗い、続いてN-メチルピロリドン（２×25mL）で洗った。樹脂を100mLフラスコに移した後、N-メチルピロリドンを加えてスラリーを得、続いて８（0.958ｇ、2.1mmol）、HOBT・H2O（0.321ｇ、2.1mmol）、HBTU（0.796ｇ、2.1mmol）、およびDIEA（0.732mL、4.2mmol）を加えた。反応混合物を、リストアーム攪拌機を使用して、室温で一晩振盪した。樹脂の後処理を、７について記載したように行い９を得た（4.17ｇ、0.27mmol／ｇ、1.12mmol、80％）。
工程３．Advanced ChemTech 396多重ペプチド合成機を使用して、樹脂９（0.17ｇ、0.047mmol）からこの化合物を調製した。自動化サイクルは、ジメチルホルムアミド（３×１mL）での樹脂の洗浄、ジメチルホルムアミド（１mL）中３分間、25％（v／v）ピペリジンでの脱保護、続いて新しい試薬（１mL）で10分間脱保護、からなった。樹脂10を、ジメチルホルムアミド（３×１mL）およびN-メチルピロリドン（３×１mL）で洗った。
工程４．樹脂10を、0.4Mの3,5-ジクロロ-4-メトキシ安息香酸および0.4ＭのHOBTのN-メチルピロリドン（0.5mL）溶液、0.4ＭのHBTUのN-メチルピロリドン（0.5mL)溶液、ならびに1.6ＭのDIEAのN-メチルピロリドン（0.25mL）溶液でアシル化し、反応系を室温で２時間撹拌した。アシル化の工程を繰り返した。最後に、樹脂をジメチルホルムアミド（３×１mL）、ジクロロメタン（３×１mL）で洗い、そして真空で乾燥して樹脂11を得た。
工程５．樹脂11からアルデヒドを切断し、そして室温で30分間、95％TFA／５％H2O（v／v、1.5mL）で処理して全体的に脱保護した。樹脂を切断試薬（１mL）で洗った後、合わせた濾液をSavant AES2000 SpeedVacで乾固するまで濃縮した。得られるペレットを50％アセトニトリル／50％H2O／0.1％TFA（５mL）に溶解し、そして凍結乾燥して粗生成物をオフホワイトの固体として得た。化合物を、Waters DeltaPak C8 300Aカラム（15μ、30×300mm）を用い、22mL／分で45分かけて0.1％TFA（v／v）を含むアセトニトリルを直線状に勾配（20％〜70％）させて溶出させる半分取（semi-prep）RP-HPLCにより精製した。所望の生成物を含む画分を集め、そして凍結乾燥して実施例２（14.1mg、23.1μmol、49％）を得た。
実施例３
実施例３についてのさらなるデータを表１に示す。
（3S）-3-［3（R,S）-1,3-ジヒドロ-2-オキソ-5-フェニル（ベンゾイルアミノ）-2H-1,4-ベンゾジアゼピン-1-アセチルアミノ］-4-オキソ酪酸
工程４．方法１と同様の手順に従い、樹脂５を室温で３時間、N-メチルピロリドン（１mL）中の0.5Ｍの塩化ベンゾイルおよびN-メチルピロリドン（0.35mL）中の1.6ＭのDIEAでアシル化した。アシル化の工程を繰り返して樹脂12を得た。この同じ方法を、塩化ベンゾイルを塩化スルホニルで置き換えることにより、スルホニルアミノ化合物の調製にも応用した。この同じ方法を、塩化ベンゾイルを適切なイソシアネートで置き換えることにより、ウレア化合物の調製にも応用した。
工程５．樹脂12からアルデヒドを切断し、そして後処理して実施例３を得た（31.6mg）。
実施例４〜27
実施例４〜27を、実施例２または３を調製するために使用した方法と同様な方法により調製した（表１を参照のこと）。
実施例28
ICE阻害
本発明者らは、以下に記載する３つの方法（実施例28および31）を使用して、本発明の化合物について阻害定数（Ki）およびIC50値を得た。表２に、実施例１〜20および21〜27についてこのデータを列挙する。
１．UV−可視基質を用いる酵素アッセイ
スクシニル−Tyr−Val−Ala−Asp−p−ニトロアニリド基質を使用してこのアッセイを行う。類似の基質の合成は、Reiter，L．A．Int．J．Peptide Protein Res．、43、87〜96頁（1994）に記載されている。アッセイ混合物は、以下を含む：
65 μl 緩衝液（10mMのTris、１mMのDTT、0.1％のCHAPS（pH8.1にて））
10 μl ICE（最終濃度50nMで、約１mOD/分の速度を与える）
5 μl DMSO/インヒビター混合物
20 μl 400μMの基質（最終濃度80μM）
100μl 反応総体積
可視ICEアッセイを96−ウェルマイクロタイタープレートで行う。緩衝液、ICE、およびDMSO（インヒビターが存在する場合）を、列挙した順にウェルに加える。成分を室温で15分間インキュベートし、その開始時には全成分が全ウェルに存在する。マイクロタイタープレートリーダーを設置して37℃でインキュベートする。15分間インキュベートした後、基質を直接ウェルに添加し、そして37℃で20分間405〜603nmにおいて発色団（pNA）の放出を追跡することによって反応をモニターする。データの線形最適化（linear fit）を行い、そしてmOD／分で速度を計算する。DMSOは、インヒビターを含む実験の間のみ存在し、緩衝液はその他の実験において体積を100μlにするために使用する。
２．蛍光基質を用いる酵素アッセイ
このアッセイを、本質的にThornberryら、Nature 356、768〜774頁（1992）に従い、その文献中に参照されている基質17を使用して行う。基質は、アセチル−Tyr−Val−Ala−Asp−アミノ−4−メチルクマリン（AMC）である。以下の成分を混合する：
65 μl 緩衝液（10mMのTris、１mMのDTT、0.1％のCHAPS（pH8.1にて））
10 μl ICE（最終濃度２〜10nM）
5 μl DMSO/インヒビター溶液
20 μl 150μMの基質（最終30μM）
100μl 反応総体積
アッセイを96−ウェルマイクロタイタープレートで行う。緩衝液およびICEを、ウェルに加える。成分を、温度制御ウェルプレート中、37℃で15分間インキュベートする。15分間インキュベートした後、基質を直接ウェルに添加することにより反応を開始し、そして37℃で30分間、380nmに対する励起波長および460nmの発光波長を使用して、AMC蛍光団の放出を追跡することによってモニターする。各ウェルについてデータの線形最適化を行い、そして１秒あたりの蛍光ユニットで速度を計算する。
酵素阻害定数（Ki）または阻害の様式（競合的、不競合的、または非競合的）の決定のために、酵素アッセイにおいて種々のインヒビター濃度で決定された速度データを、標準酵素速度平衡についてコンピューター最適化する（I．H．Segel、Enzyme Kinetics、Wiley-Interscience、1975を参照のこと）。
不可逆的インヒビターの二次速度定数の決定を、Morrisonの進行平衡について蛍光対時間のデータを最適化することにより行った。Morrison、J．F．、Mol．Cell．Biophys．、２、347〜368頁（1985）。Thornberryらは、ICEの不可逆的インヒビターの速度定数を測定するためのこれらの方法の記述を出版した。Thornberry、N．A．ら、Biochemistry、33、3923〜3940頁（1994）。前複合体（prior complex）形成が速度論的に観察され得ない化合物について、二次速度定数（Kinact）は、Kobs対インヒビター濃度［I］の線形プロットの傾きに直接由来する。酵素との前複合体形成が検出され得る化合物について、Kobs対［I］の双曲線（hyperbolic）プロットを、一次生成するKiおよびK’に対する飽和速度平衡に対して最適化する。次いで、二次速度定数KinactをK’／Kiにより得る。
３．PBMC細胞アッセイ
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）または富化付着単核細胞の混合集団（mixed population）によるIL-1βアッセイ
ICEによるpre-IL-1βのプロセシングは、種々の細胞源を使用する細胞培養において測定され得る。健康なドナーから得られたヒトPBMCは、多くの種類の生理学的刺激に応答してインターロイキンおよびサイトカインのスペクトルを生成するリンパ球サブタイプおよび単核細胞の混合集団を提供する。PBMC由来の付着単核細胞は、活性化細胞によるサイトカイン生成の選択的研究のための正常単球の富化供給源を提供する。
実験手順：
最初に試験化合物のDMSOまたはエタノールでの希釈溶液のシリーズを調製し、続いてそれぞれRPMI-10％FBS培地（2mMのL-グルタミン、10mMのHEPES、50Uおよび50ug／mlのpen／strepを含む）中に希釈して、４×の最終試験濃度で0.4％のDMSOまたは0.4％のエタノールを含む薬物を得る。DMSOの最終濃度は、全ての薬物希釈物について0.1％である。ICE阻害アッセイにおいて決定された試験化合物についての見かけ上のKiの限界を定める（bracket）濃度滴定を、一般に、化合物の一次スクリーニングに使用する。
一般に、５〜６個の化合物の希釈物を試験し、アッセイの細胞質成分を複製して、各細胞培養の上清において複製ELISA測定を行う。
PBMC単離およびIL-1アッセイ：
１パイントのヒト血液から単離した軟膜細胞（血漿と細胞とを合わせて最終的な体積40〜45mlで得る）を、培地で80mlに希釈し、そしてLeukoPREP分離管（Becton Dickinson）に10mlの細胞懸濁液をそれぞれ重層する。1500〜1800×gで15分遠心分離した後、血漿／培地層を吸引し、次いで単核細胞層をパスツールピペットで収集し、そして15mlコニカル遠心分離管（Corning）に移す。培地を加えて体積を15mlにし、上下反転することにより細胞を穏やかに混合し、そして300×gで15分間遠心分離した。PBMCペレットを少量の培地中に再懸濁し、細胞を計数して６×106細胞／mlに調整した。
細胞質アッセイのために、1.0mlの細胞懸濁液、0.5mlの試験化合物希釈物および0.5mlのLPS溶液（Sigma #L-3012；完全RPIM培地で調製した20ng／ml溶液；最終LPS濃度５ng／ml）を24-ウェル平底組織培養プレート（Corning）の各ウェルに添加した。通常、試験化合物およびLPSの0.5mlの添加は、ウェルの内容物の混合に十分足りる。１つの実験あたり３つのコントロール混合物を、LPS単独、溶媒ビヒクルコントロール、および／または最終培養体積を2.0mlに調製するために付加する培地で行う。細胞培養物を５％のCO2の存在下37℃で16〜18時間インキュベートする。
インキュベーション期間の終わりに、細胞を収集し、そして15mlのコニカル遠心分離管に移す。200×gで10分間遠心分離した後、上清を収集し、そして1.5mlのエッペンドルフ管に移す。細胞ペレットを、ウェスタンブロットもしくはpre-IL-1β特異的抗血清を用いるELISAによるサイトゾル抽出物中のpre-IL-1βおよび／または成熟IL-1β含有量の生化学的評価のために使用し得ることが注記され得る。
付着単核細胞の単離：
上記に記載したようにPBMCを単離および調製する。最初に培地（1.0ml）をウェルに添加し、続いて0.5mlのPBMC懸濁液を添加する。１時間インキュベーションした後、プレートを穏やかに撹拌し、そして非付着細胞を各ウェルから吸引する。次いで、ウェルを1.0mlの培地で３回穏やかに洗浄し、そして最後に1.0mlの培地に再懸濁する。一般に、付着細胞の富化により、１ウェルあたり2.5〜3.0×105の細胞を得る。試験化合物の添加、LPS、細胞のインキュベーション条件、および上清の処理は、上記に記載したように行う。
ELISA：
本発明者らは、成熟IL-1βの測定のために、Quantikineキット（R&D Systems）を使用した。アッセイを製造者の説明書に従い行う。PBMCおよび接着単核細胞ポジティブコントロールの両方において約１〜３ng／mlの成熟IL-1βレベルを観測する。ELISAアッセイを、LPS-ポジティブコントロールからの上清の、１：５、１：10、および１：20の希釈物について行い、試験パネルにおける上清の最適希釈を選択する。
化合物の阻害有効性は、IC50値により表され得、これはポジティブコントロールと比較して上清中に50％の成熟IL-1βが検出されるインヒビターの濃度である。
当業者は、本明細書中で記載されるもののような細胞アッセイにおいて得られた値が、多数の要因に依存し得ることを理解する。この値は、必ずしも十分に定量的な結果を示す必要はない。
実施例29
マウスにおける薬物動態研究
ペプチジルICEインヒビターは、100μ／分／kgよりも大きいクリアランス速度で速やかに浄化される。より低いクリアランス速度の化合物は、ペプチジルICEインヒビターと比較して薬物動態的性質を改善した。
本発明の化合物に対するクリアランス速度（μ／分／kg）は、以下に記載される方法を使用して得られ得る。
サンプル調製および投薬
化合物を2.5mg／mlの濃度で滅菌TRIS溶液（0.02Ｍまたは0.05Ｍ）に溶解する。確実に完全な溶液にすることが必要である場合、最初にサンプルを最小量のジメチルアセトアミド（最大で総溶液体積の５％）に溶解し、次いでTRIS溶液で希釈する。
薬物溶液を、例えば、25mg／kgの薬物投薬を与えるように10ml／kgの投薬体積で、尾静脈を介してCD-1マウス（Charles River Laboratories-26〜31ｇ）に投与する。
マウスには、各時点（通常２分から２時間）において群（例えば、５個体）で投薬してもよく、次いで適切な時間で、動物をハロタンで麻酔をかけ、そして血液を頸静脈切断（severance）により個々のヘパリン処理した管に収集する。血液サンプルを０℃まで冷却し、次いで血漿を分離して、そしてアッセイするまで-20℃で保存する。
バイオアッセイ
血漿サンプル中の薬物濃度を、UVまたはMS（ESP）検出を用いてHPLC分析により測定する。C１〜C18の種々の結合相を使用し、水性緩衝液／アセトニトリル混合物からなる溶離液で、定組成（isocratic）条件下で行う逆相クロマトグラフィーを用いる。
定量は、0.5〜50μg／mlの範囲の濃度を与える薬物溶液で血漿をスパイクすることにより構成される検量線を用いる外部標準法による。
分析の前に、血漿サンプルを、アセトニトリル、メタノール、トリクロロ酢酸または過塩素酸を添加し、続いて10,000gで10分間遠心分離することにより、脱タンパク質化する。20μl〜50μlの量のサンプルを、分析のために注入する。
代表的な投薬およびサンプリング手順
薬物を滅菌0.02Ｍ Trisに溶解して2.5mg／ml溶液とし、これを雄性CD-1マウス５個体からなる11群に25mg／kgの用量で尾静脈を介して投与する。以下の各時点：２、５、10、15、20、30、45、60、90、および120分において、動物の一群を麻酔し、そして血液をヘパリン化した管に収集する。血漿を分離した後、アッセイするまで-20℃で保存する。
代表的なアッセイ
血漿（150μl）のアリコートを５％過塩素酸（５μl）で処理し、次いでかき混ぜて混合し、そして遠心分離の前に90分間放置する。得られる上清を分離し、そして20μlをHPLC分析にかける。
代表的なHPLC条件
実施例30
ペプチジルICEインヒビターは、80ml／分／kgよりも大きいクリアランス速度で、速やかにクリアランスされる。より遅いクリアランス速度を有する化合物は、ペプチジルICEインヒビターと比較して、薬物動態的性質を改善した。
本発明の化合物に対するラットでのクリアランス速度（ml／分／kg）は、以下に記載される方法を使用して得られ得る：
インビボでのラットクリアランスアッセイ
代表的な手順
麻酔下でラットの頸静脈および頸動脈管へのカニューレ挿入を、薬物動態的研究の１日前に行う。Free、M．J．およびJaffee、R．A．；「血液およびその他の体液採取のためのカニューレ挿入技術」；Animal Models；480〜495頁；Alexander、N．J．、編；Academic Press；（1978）より。薬物（10mg／mL）をビヒクル（通常は、１：１の比で100mMの炭酸水素ナトリウムを含む、プロピレングリコール／生理食塩水からなる）中で頸静脈を介して投与する。動物に、10〜20mgの薬物／kgを投与し、そして血液サンプルを０、２、５、７、10、15、20、30、60、および90分の時点で、内在する頸動脈カテーテルから吸い出す。血液から血漿を遠心分離し、そして分析するまで-20℃で保存する。データの薬物動態的分析を、RStrip（MicroMath Software、UT）および／またはPcnonlin（SCI Software、NC）のような標準的なソフトウェアを使用して非線形回帰（regression）により行い、クリアランス値を得る。
代表的な分析：
ラット血漿を等体積のアセトニトリル（0.1％のTFAを含有）で抽出する。次いで、サンプルを約1,000×gで遠心分離し、そして上清を勾配HPLCにより分析する。代表的なアッセイ手順を以下に記載する。
200μLの血漿を、200μLのアセトニトリル中0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）および10μLの塩化亜鉛50％水溶液で沈殿させ、ボルテックスし、次いで約1000×gで遠心分離し、そして上清を収集してHPLCにより分析する。
標準曲線を、20、10、５、２、および１μg／mLの濃度で引く。
実施例31
IL-1β産生に対する全血アッセイ
本発明の化合物に対する全血アッセイのIC50値を、以下に記載される方法を使用して得る：
目的：
全血アッセイは、IL-1β（または他のサイトカイン）の産生および潜在的なインヒビターの活性を測定するための簡潔な方法である。このアッセイ系の複雑性（complexity）は、リンパの全（full）補体（complement）および炎症性細胞型の、血漿タンパク質および赤血球のスペクトルと合わせて、理想的なヒトのインビボでの生理学的状態のインビトロでの代表（representation）である。
材料：
発熱物質を含まない注射器（約30cc）
発熱物質を含まない、凍結乾燥したNa2EDTA（4.5mg／10ml管）を含む滅菌真空管
ヒト全血サンプル（約30〜50cc）
1.5mlのエッペンドルフチューブ
試験化合物のストック溶液（DMSOまたは他の溶媒中約25mM）
エンドトキシンを含まない塩化ナトリウム溶液（0.9％）およびHBSS中１mg／mlでのHBSSリポ多糖類（Sigma；Cat．# L-3012）ストック溶液
IL-1β ELISAキット（R&D Systems；Cat # DLB50）
TNFα ELISAキット（R&D Systems；Cat # DTA50）
水浴槽またはインキュベーター
全血アッセイ実験手順：
インキュベーターまたは水浴槽を30℃に設定する。血液の0.25mlのアリコートを1.5mlのエッペンドルフチューブに入れ、２つのアリコートごとに、全血サンプル管を必ず反転させる。細胞が沈降し、そして均一に懸濁していない場合、複製における差異を生じ得る。ポジティブ置換ピペットの使用もまた、複製アリコート間の差異を最小化する。
発熱物質を含まない滅菌生理食塩水による薬物の希釈液を連続希釈により調製する。ICE阻害アッセイにおいて決定された試験化合物に対する見かけのKiの限界を定める（bracket）一連の希釈液は、通常、化合物の一次スクリーニングに使用される。きわめて疎水性の化合物については、同一の血液ドナーから得られる新しい血漿によるか、または溶解性を上げるために５％のDMSOを含有するPBSによる、化合物希釈溶液を調製する。
25μlの試験化合物希釈液またはビヒクルコントロールを添加し、そしてサンプルを穏やかに混合する。次いで、5.0μlのLPS溶液（新しく調製されて保存した250ng／ml：5.0ng／mlのLPSの最終濃度）を添加し、そして再び混合する。水浴中30℃で16〜18時間、時々混合しながら管をインキュベートする。あるいは、同じインキュベーション期間、４rpmに設定した回転機（rotator）に管を設置し得る。このアッセイは、以下のコントロールとともに、二連または三連に設定するべきである：ネガティブコントロール−LPS無し；ポジティブコントロール−試験インヒビター無し；ビヒクルコントロール−最高濃度のDMSOまたは実験において使用された化合物溶媒。さらに生理食塩水を全てのコントロール管に添加して、コントロールおよび実験の全血試験サンプルの両方について、体積を規格化する。
インキュベーション期間の後、全血サンプルを微量遠心機（microfuge）中、約2000rpmで10分間遠心分離し、必要であれば、血漿を新しい微量遠心管に移し、そして1000×gで遠心分離して残余の血小板をペレットにする。血漿サンプルは、ELISAによりサイトカインのレベルについてアッセイするまで-70℃で冷凍保存され得る。
ELISA：
R & D Systems（614 McKinley Place N．E．Minneapolis、MN 55413）Quantikineキットを、IL-1βおよびTNF-αの測定のために使用し得る。アッセイを製造者の指示に従い行う。個体の１つの範囲の中のポジティブコントロールにおいて約１〜５ng／mlのIL-1βレベルが観測され得る。全てのサンプルについて血漿の１：200の希釈物は、通常、ELISAについて実験の結果がELISA標準曲線の線形範囲になるのに十分である。全血アッセイにおいて差異が観測される場合、標準希釈を最適化することが必要であり得る。Nerad、J．L．ら、J．Leukocyte Biol．、52、687〜692頁（1992）。
実施例32
ICEホモログの阻害
１．ICEホモログの単離
バキュロウイルス発現系を使用する昆虫細胞におけるTXの発現
Tx cDNA（C．Faucheuら、EMBO、14、1914頁（1995））を改変pVL1393移入ファーベクターにサブクローンし、得られるプラスミド（pVL1393／TX）をウイルスDNAとともに昆虫細胞に同時トランスフェクトし、そして組換えバキュロウイルスを同定する。高力価の組換えウイルスストックを生成した後、可視ICEアッセイを使用してTX活性について培地を試験する。代表的には、Spodoptera fruqiperda（Sf9）昆虫細胞の、５のMOIでの組換えウイルスストックによる感染が、4.7μg／mlで48時間後に最大の発現となる。ICEをこのアッセイにおける標準として使用する。
ICEまたはTXのアミノ末端にT7タグをつけたバージョン（version）も発現される。本質的に、組換えタンパク質の同定および精製を補助するために設計された、種々の構築物もまた、異なるホモログにより経験されるアポトーシスの異なるレベルの発現および相対レベルについての試験を可能にする。感染したSf9細胞（Trypan Blue除外アッセイを使用して試験される）におけるアポトーシスは、ウイルスDNA単独に感染した細胞と比較して、ICEまたはTXを発現する株において増加する。
E．coli．におけるN-末端（His） 6 -タグ化CPP32の発現および精製
Ser（29）で開始するCPP32（Fernandes-Alnemriら、前出、1994）ポリペプチドをコードするcDNAは、インフレームXhoI部位をcDNAの5’および3’末端の両方に加えたプライマーでPCR増幅され、そして得られたXhoIフラグメントは、Xho I-切断pET-15b発現ベクターに結合して、融合タンパク質のN-末端において（his）6タグとのインフレーム融合を起こす。予測組換えタンパク質は、アミノ酸配列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLEで開始し、ここでLVPRGSはトロンビン切断部位を表し、Ser（29）で開始するCPP32が続く。プラスミドを運ぶE．coli BL21（DE3）を、30℃で対数期まで増殖させ、次いで0.8mMのIPTGで誘導する。IPTG添加後２時間で細胞を回収する。溶解物を調製し、そして可溶性タンパク質をNi-アガロースクロマトグラフィーにより精製する。発現したCPP32タンパク質は全てプロセシングを受けた型である。N-末端配列決定分析は、プロセシングがAsp（175）とSer（176）との間の実部（authentic site）で生じていることを示すはずである。約50μgのCPP32タンパク質を200mlの培養物から得ることが可能である。活性部位滴定により決定されるように、精製されたタンパク質は、完全に活性である。プロテアーゼ調製物もまた、合成DEVD-AMC基質と同様PARPの切断において、インビトロで非常に活性である（Nicholsonら、1995）。
２．ICEホモログの阻害
ICEホモログに対する可逆的インヒビターのパネルの選択性が得られ得る。ICE酵素アッセイを、YVAD-AMC基質（Thornberryら、1992）を使用して、Wilsonら（1994）に従い行う。TX活性のアッセイを、ICEについて理想的な条件下で、ICE基質を使用して行う。CPP32のアッセイを、DEVD-AMC基質（Nicholsonら、1995）を使用して行う。
ICEおよびICEホモログの不可逆的インヒビターを用いる不活性化に対する二次速度定数を得る。
実施例33
アポトーシスの阻害
U937細胞におけるFas-誘導アポトーシス
化合物は、その抗-Fas-誘導アポトーシスをブロックする能力について評価され得る。RT-PCRを使用して、刺激されていないU937細胞中の、ICE、TX、ICH-1、CPP32、およびCMH-1をコードするmRNAを検出し得る。この細胞株は、アポトーシス研究に使用され得る。例えば、U937細胞を１×105細胞／mlで培地に播種し、そして約５×106細胞／mlまで増殖させる。アポトーシス実験のため、２×106細胞を1mlのRPMI-1640-10％のFBS中で、24-ウェル組織培養プレートにプレーティングし、そして100ng／mlの抗-Fas-抗原抗体（Medical and Biological Laboratories、Ltd．）で刺激する。37℃で24時間インキュベーションした後、アポトーシス細胞の割合を、ApoTag試薬を使用してFACS分析により測定する。
最初に全ての化合物を20μMで試験し、そして活性化合物で滴定を行いIC50値を決定する。
実施例34
抗炎症剤としての有効性に対するインビボ急性（acute）アッセイ
LPS-誘導IL-1β産生
LPS（20mg／kg IP）でチャレンジしたCD1マウス（例えば、１条件あたりn=6）で有効性を評価する。試験化合物を、オリーブ油：DMSO：エタノール（90：５：５）中で調製し、そしてLPSの１時間後IP注射により投与する。LPSチャレンジの７時間後、血液を採取する。血清のIL-1βレベルをELISAにより測定する。
また吸収を評価するために経口胃管栄養（gavage）により化合物を投与し得る。経口的に投与されたIL-1βの分泌を阻害する化合物は、これらの化合物のICEインヒビターとしての、そしてそれゆえに抗炎症剤としての経口での有効性の可能性を示す。
実施例35
プロドラッグの血中レベルの測定
マウスに、p．o．（経口）用量の、0.5％カルボキシメチルセルロース中で調製した化合物（例えば、50mg／kg）を投与する。血液サンプルを、投与の１時間後および７時間後に採取する。血清を、等体積の２％ギ酸含有アセトニトリルによる沈殿および続く遠心分離により抽出する。上清を、0.03〜３μg／mlの検出レベルで、液体クロマトグラフィー−質量分析（ESI-MS）により分析する。検出可能な血液レベルをこのように決定する。
実施例36
ICE阻害アッセイ-IGIF
IGIFは、実施例28で記載されたICE阻害アッセイにおいてIL-1で置換され得る。従って、ICEインヒビターのIGIF産生を減少させる能力を測定し得る。
例えば、ヒトPBMCアッセイを行うために、ヒト軟膜細胞を、血液ドナーおよびLeukoPrep管（Becton-Dickinson、Lincoln Park、NJ）での遠心分離により単離された末梢血単核球（PBMC）から得ることができる。PBMCを、24ウェルCorning組織培養プレートに添加（３×106／ウェル）し、そして37℃で１時間インキュベーションした後、穏やかに洗浄して非付着細胞を除去する。付着単核球を、２mlのRPMI-1640-10％のFBS中で、ICEインヒビターとともに、またはICEインヒビターなしで、LPS（１μg／ml）で刺激する。37℃で16〜18時間インキュベーションした後、IGIFおよびIFN-を、培養上清中ELISAにより定量する。
実施例37
化合物の抗ウイルス効果は、種々のインビトロおよびインビボアッセイにより評価され得る。例えば、化合物は、インビトロウイルス複製アッセイにおいて試験し得る。インビトロアッセイは、全細胞または単離された細胞成分を採用し得る。インビボアッセイは、ウイルス疾患に対する動物モデルを含む。そのような動物モデルの例は、HBVまたはHCV感染に対するげっ歯類（rodent）モデル、HBV感染に対するウッドチャック（Woodchuck）モデル、およびHCV感染に対するチンパンジーモデルを含むが、これらに限定されない。
ICEインヒビターもまた、食事性アルコール誘導疾患に対する動物モデルにおいて評価され得る。
実施例38〜59
実施例38〜56（表３）を、実施例２または３を調製するために使用した方法と同様の方法により調製した。実施例57〜59（表３）を、実施例１を調製するために使用した方法と同様の方法により調製した。
実施例60
ICE阻害
本明細書中に記載する方法を使用して、本発明の化合物について阻害定数（Ki）およびIC50値を得た（実施例28および31を参照）。表４に、実施例11、38〜56および58〜59についてこのデータを列挙する。
実施例61
マウスカラゲナン腹膜炎
代表的手順
0.5mlの生理食塩水中の10mgのカラゲナンを腹膜腔内（IP）注射してマウスに炎症を誘導する（Griswoldら、Inflammation、13、727〜739頁（1989））。薬物を、エタノール／PEG／水、β-シクロデキストリン、ラブロゾール（labrosol）／水、またはクレモフォア（cremophor）／水ビヒクル中、経口胃管栄養により投与する。カラゲナン投与の４時間後、マウスを屠殺し、次いで２mlの５U／mlヘパリン含有生理食塩水のIP注射する。腹膜を穏やかにマッサージした後、小さい切り込みを入れ、収集した内容物および体積を記録する。サンプルを、遠心分離（４℃で、130xg、８分）するまで氷上で保持し、細胞物質を除去し、そして得られる上清を-20℃で保存する。腹膜内液中のIL-1βレベルをELISAにより測定する。
実施例62
II型コラーゲン-誘導関節炎
代表的手順
II型コラーゲン誘導-関節炎は、WooleyおよびGeigerの記載によりオスのDBA／１Jマウスにおいて確立されている（Wooley、P．H．、Methods in Enzymology、162、361〜373頁（1988）およびGeiger、T．、Clinical and Experimental Rheumatology、11、515〜522頁（1993））。ひな鳥胸骨II型コラーゲン（10mM酢酸中4mg／kg）を、等体積のFreund完全アジュバント（FCA）で、16ゲージの二重ハブ針で２つの10mlガラスシリンジの間を繰り返し通す（400）ことにより乳化する。マウスを、尾付け根の反対側面に、21日後にコラーゲン乳濁液の皮内注射（501；１マウスあたり1001のCII）により免疫化する。薬物を、約７時間離して１日に２回（10、25、および50mg／kg）経口胃管栄養により投与する。使用され得るビヒクルとしては、エタノール／PEG／水、β-シクロデキストリン、ラブロゾール／水、またはクレモフォア／水が挙げられる。薬物処理は、CII追加免疫化の２時間以内に開始する。炎症について、２本の前足における症状の重篤度の増加を１から４のスケールで記録し、記録を足して最終的な記録にする。
実施例63
インビボバイオアベイラビリティー決定
代表的手順
薬物（10〜100mg／kg）を、エタノール／PEG／水、β-シクロデキストリン、ラブロゾール／水、またはクレモフォア／水中で、ラットに経口投与する（10mL／kg）。血液サンプルを、投与の0.25、0.50、１、1.5、２、３、４、６、８時間後に、頸動脈から抜き取り、血漿を遠心分離し、そして分析するまで-70℃で保存する。酵素的アッセイを使用してアルデヒドの濃度を測定する。データの薬物動態的分析を、RStrip（MicroMath Software、UT）を使用して非線形回帰により行う。薬物アベイラビリティー値を以下のように決定する：（経口プロドラッグ投与後におけるAUC／薬物のi.v.投与後におけるAUC）×（i.v.投与／p.o.投与）×100％
上記の実施例のデータは、本発明による化合物がIL-1β転換酵素に対して阻害活性を示すことおよびICEがIGIFおよびIFN-γレベルを制御することを実証する。
本発明の化合物がインビトロでICEを阻害し得、そしてさらに経口で哺乳動物に送達され得る限りにおいて、それらは明らかにIL-1-、アポトーシス-、IGIF-、およびIFN-γ-媒介疾患の処置に臨床的に有用である。これらの試験は、化合物のインビボでのICEを阻害する能力の予測となる。
本発明者は、本発明の多数の実施態様を記載してきたが、本発明の製品およびプロセスを利用する他の実施態様を提供するために本発明の基本的な構成を変更しえることが、明らかである。
本発明は、インターロイキン-１β変換酵素（「ICE」）のインヒビターである新規な種類の化合物に関する。本発明はまた、これらの化合物を含有する薬学的組成物に関する。本発明の化合物および薬学的組成物は、ICE活性を阻害するのに特によく適合し、結果として、インターロイキン-1（「IL-1」）、アポトーシス-、インターフェロン-γ誘導因子-（IGIF）、インターフェロン-γ-（「IFN-γ」）が媒介する疾患、食事性アルコール過摂取疾患、またはウイルス性疾患（炎症性疾患、自己免疫性疾患、骨破壊疾患、増殖性障害、感染性疾患、および退行性疾患を含めて）に対する薬剤として有利に利用され得る。本発明はまた、本発明の化合物および組成物を用いて、ICE活性を阻害しIGIF産生およびIFN-γ産生を減少する方法、ならびにインターロイキン-１、アポトーシス-およびインターフェロン-γが媒介する疾患を処置する方法に関する。本発明はまた、本発明の化合物を調製する方法に関する。
発明の背景
インターロイキン１（「IL-1」）は、線維芽細胞の分化および増殖、滑膜細胞および軟骨細胞によるプロスタグランジン、コラゲナーゼおよびホスホリパーゼの産生、好塩基球および好酸球の脱顆粒ならびに好中球の活性化を刺激する主要な前炎症性（proinflammatory）タンパク質および免疫調節タンパク質である。Oppenheim，J.H.ら、Immunology Today，７，45-56頁（1986）。このように、インターロイキン-１は、慢性および急性の炎症性および自己免疫性疾患の病因に関与する。例えば、慢性関節リウマチにおいて、IL-1は、炎症性症候の媒介体および侵された関節における軟骨プロテオグリカンの破壊の媒介体の両方である。Wood，D.D.ら、Arthritis Rheum．，26，975頁（1983）；Pettipher，E.J.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．，71，295頁（1986）；Arend，W.P.およびDayer，J.M.，Arthritis Rheum．，38，151頁（1995）。IL-1はまた、非常に強力な骨再吸収因子である。Jandiski，J.J.，J．Oral Path；17，145頁（1988）；Dewhirst，F.E.ら、J．Immunol．，８，2562頁（1985）。これは、骨関節症および多発性骨髄腫のような骨破壊疾患において「破骨細胞活性化因子」とも呼ばれる。Bataille，R.ら、Int．J．Clin．Lab．Res．，21（4），283頁（1992）。急性骨髄性白血病および多発性骨髄腫のような、特定の増殖性障害において、IL-1は、腫瘍細胞増殖および接着を促進し得る。Bani，M.R.，J．Natl．Cancer Inst．，83，123頁（1991）；Vidal-Vanaclocha，F.，Cancer Res．，54 2667頁（1994）。これらの疾患において、IL-1はまた、他のサイトカイン（例えば、腫瘍発生を調節し得るIL-6）の産生を刺激する（Tartourら、Cancer Res．，54，6243頁（1994））。IL-1は、炎症応答の一部として末梢血液単球により主に生産され、そして２つの異なるアゴニスト形態（IL-1αおよびIL-1β）で存在する。Mosely，B.S.ら、Proc．Nat．Acad．Sci．，84，4572-4576頁（1987）；Lonnemann，G.ら、Eur．J．Immunol．，19,1531-1536頁（1989）。
IL-1βは、生物学的に不活性な前駆体であるpIL-1βとして合成される。pIL-1βは、従来のリーダー配列を欠き、そしてシグナルペプチダーゼによりプロセシングされない。March，C.J.，Nature，315，641-647頁（1985）。その代わり、pIL-1βは、Asp-116とAla-117との間でインターロイキン-１β変換酵素（「ICE」）により切断され、ヒト血清および滑液中に見出される生物学的に活性なＣ末端フラグメントを産生する。Sleath，P.R.ら、J．Biol．Chem．，265，14526-14528頁（1992）；Howard，A.D.ら、J．Immunol．，147，2964-2969頁（1991）。ICEは、主に単球に局在するシステインプロテアーゼである。これは、前駆体IL-1βを成熟形態に変換する。Black，R.A.ら、FEBS Lett．，247，386-390頁（1989）；Kostura，M.J.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．，86，5227-5231頁（1989）。ICEによるプロセシングはまた、細胞膜を通しての成熟IL-1βの輸送に必要である。
ICEまたはそのホモログはまた、プログラムされた細胞死またはアポトーシスの調節に関与するようである。Yuan，J.ら、Cell，75，641-652頁（1993）；Miura，M.ら、Cell，75，653-660頁（1993）；Nett-Fiordalisi，M.A.ら、J．Cell Biochem．，17B，117頁（1993）。特に、ICEまたはICEホモログは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経退行性疾患におけるアポトーシスの調節に関連すると考えられる。Marx，J.およびBaringa，M.，Science，259，760-762頁（1993）；Gagliardini，V.ら、Science，263，826-828頁（1994）。アポトーシスの阻害のための治療的適用は、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、心筋梗塞、脊髄萎縮、および老化の処置を含み得る。
ICEは、特定の組織型においてアポトーシス（プログラムされた細胞死）を媒介することが実証されている。Steller，H.，Science，267，1445頁（1995）；Whyte，M.およびEvan，G.，Nature，376，17頁（1995）；Martin，S.J.およびGreen，D.R.，Cell，82，349頁（1995）；Alnemri，E.S.ら、J．Biol．Chem．，270，4312頁（1995）；Yuan，J．Curr．Opin．Cell Biol．，７，211頁（1995）。ICE遺伝子を破壊されたトランスジェニックマウスは、Fas媒介されたアポトーシスにおいて欠陥がある（Kuida，K.ら、Science，267，2000頁（1995））。ICEのこの活性は、プロIL-1βについてのプロセシング酵素としてのその役割と区別される。これは、特定の組織型において、ICEの阻害は成熟IL-1βの分泌に影響し得ないが、しかしアポトーシスを阻害し得ると考えられる。
酵素学的に活性なICEは、２つのサブユニットp20およびp10（それぞれ、分子量20kDaおよび10kDa）からなるヘテロダイマーとして以前に記載されている。これらのサブユニットは、自己触媒性である活性化機構を介してp30形態を経由することによって、45kDaのプロ酵素（p45）から誘導される。Thornberry，N.A.ら、Nature，356，768-774頁（1992）。ICEプロ酵素はいくつかの機能的ドメインに分けられている：プロドメイン（p14）、p22/20サブユニット、ポリペプチドリンカーおよびp10サブユニットである。Thornberryら、前出；Casanoら、Genomics，20，474-481頁（1994）。
全長p45はそのcDNAおよびアミノ酸配列により特徴付けられている。PCT特許出願第WO 91/15577号および同第WO 94/00154号。p20およびp10のcDNAおよびアミノ酸配列もまた、公知である。Thornberryら、前出。マウスICEおよびラットICEもまた、配列決定され、そしてクローン化されている。これらは、ヒトICEに対して高いアミノ酸配列相同性および核酸配列相同性を有する。Miller，D.K.ら、Ann．N．Y．Acad．Sci．，696，133-148頁（1993）；Molineaux，S.M.ら、Proc．Nat．Acad．Sci．，90，1809-1813頁（1993）。ICEの３次元構造は、Ｘ線結晶学により原子的解像度で決定された。Wilson，K.P.ら、Nature，370，270-275頁（1994）。活性酵素は、２つのp20および２つのp10サブユニットの４量体として存在する。
さらに、酵素の活性部位領域において配列類似性を有するICEのヒトホモログが存在する。そのようなホモログは、TX（またはICErel-IIもしくはICH-2）（Faucheuら、EMBO J．，14，1914頁（1995）；Kamens J.ら、J．Biol．Chem．，270，15250頁（1995）；Nicholsonら、J．Biol．Chem．，270，15870頁（1995））、TY（またはICErel-III）（Nicholsonら、J．Biol．Chem．，270，15870頁（1995））、ICH-1（またはNedd-2）（Wang，Lら、Cell，78，739頁（1994））、MCH-2（Fernandes-Alnemri，T．ら、Cancer Res．，55，2737頁（1995）、CPP32（またはYAMAもしくはアポペイン）（Fernandes-Alnemri，T．ら、J．Biol．Chem．，269，30761頁（1994）；Nicholson，D.W.ら、Nature，376,37頁（1995））、およびCMH-1（またはMCH-3）（Lippkeら、J．Biol．Chem．，（1996）；Fernandes-Alnemri，T．ら、Cancer Res．，（1995））を含む。これらICEホモログの各々、ならびにICE自体は、トランスフェクトされる細胞株において過剰発現される場合、アポトーシスを誘導し得る。ペプチジルICEインヒビターTyr-Val-Ala-Asp-クロロメチルケトンでのこれらのホモログの１つ以上の阻害は、初代細胞または細胞株におけるアポトーシスの阻害を生じる。Lazebnikら、Nature，371，346頁（1994）。本明細書中に記載される化合物はまた、１つ以上のICEのホモログを阻害し得る。従って、これらの化合物は、ICEホモログを含む組織型におけるアポトーシスの阻害のために用いられ得る。
インターフェロンγ誘導因子（IGIF）は、インターフェロンγ（IFN-γ）のＴ細胞産生を刺激する約18kDaのポリペプチドである。IGIFは活性化クッパー細胞およびマクロファージによってインビボで産生され、内毒素刺激の際にこのような細胞から放出される。従って、IGIF産生を減少させる化合物はこのようなＴ細胞刺激のインヒビターとして有用であり、これは順に、それらの細胞によるIFN-γ産生のレベルを減少させる。
IFN-γは、様々な免疫細胞に免疫調節効果を有するサイトカインである。特に、IFN-γはマクロファージ活性化およびTh1細胞選択に関与する（Belardelli，F．APMIS，103，161頁（1995））。IFN-γはSTATおよびIRF経路を介した遺伝子の発現を調節することによって、部分的にその効果を及ぼす（Schindler，C.およびDarnell，J.E.、Ann．Rev．Biochem．，64，621頁（1995）；Taniguchi，T.、J．Cancer Res．Clin．Oncol．，121，516頁（1995））。
IFN-γまたはそのレセプターを欠損しているマウスは、免疫細胞機能に複数の欠陥があり、内毒素ショックに耐性がある（Huang，S.ら、Science，259，1742頁（1993）；Dalton，D.ら、Science，259，1739頁（1993）；Car，B.D.ら、J．Exp．Med．，179，1437頁（1994））。IL-12と共に、IGIFはＴ細胞によるIFN-γ産生の強力なインデューサーであるようである（Okamura，H.ら、Infection and Immunity，63，3966頁（1995）；Okamura，Hら、Nature，378，88頁（1995）；Ushio，S.ら、J．Immunol．，156，4274頁（1996））。
IFN-γは様々な炎症性、感染性および自己免疫性障害または疾患と関連する症状に寄与することが示されている。従って、IFN-γ産生を減少させ得る化合物はIFN-γ関連症状の影響を寛解させるのに有用である。
IGIFは前駆体タンパク質として合成され、「プロIGIF」と呼ばれる。近年、ICEおよびICE／CED-3ファミリーの他のメンバーが、インビボでのプロIGIFのIGIFへの変換またはIFN-γ産生に関連されている（PCT特許出願第WO 97/22619号を参照のこと、これは本明細書中で参考として援用される）。
従って、プロIGIFからIGIFへの変換を調節し得る組成物および方法がインビボでのIGIFおよびIFN-γ産生の減少に有用であり、よってヒトの障害および疾患に寄与するこれらのタンパク質の有害な影響を寛解させるのに有用である。
ICEインヒビターは、炎症またはアポトーシスあるいはその両方の制御に有用なクラスの化合物を表す。ICEのペプチドインヒビターまたはペプチジルインヒビターが記載されている。PCT特許出願第WO 91/15577号；同第WO 93/05071号；同第WO 93/09135号；同第WO 93/14777号および同第WO 93/16710号；および欧州特許出願第0 547 699号。そのようなICEのペプチジルインヒビターは、炎症のマウスモデル（以下を参照のこと）において成熟IL-1βの産生をブロックすること、およびインビトロにおいて白血病細胞の増殖を抑制することが観察されている（Estrovら、Blood 84，380a頁（1994））。しかしながら、これらのペプチド性の性質により、このようなインヒビターは典型的には所望でない薬理学的特性（例えば、乏しい細胞浸透および細胞活性、乏しい経口吸収、乏しい安定性ならびに急速な代謝）によって特徴づけられる。Plattner，J.J.およびNorbeck，D.W.、Drug Discovery Technologies、Clark，C.R.およびMoos，W.H.編（Ellis Horwood、Chichester、England、1990）、92-126頁。これは有効な薬物へのこれらの発展を妨害する。
非ペプチジル化合物はまた、インビトロでICEを阻害すると報告されている。PCT特許出願第WO 95/26958号；米国特許第5,552,400号；Dolleら、J．Med．Chem．，39，2438-2440頁（1996）。しかしながら、これらの化合物が治療的に有用である適切な薬理学的プロフィールを有するか否かははっきりしていない。
さらに、このような化合物の調製の現在の方法は有利なものではない。これらの方法は、水素化トリブチルスズ（毒性の、水分感受性試薬）を使用する。従って、これらの方法は実行するのに不便であり、健康の危険を引き起こし、そして毒性廃棄物処理問題を引き起こす。さらに、これらの方法によって調製される化合物を精製することは困難である。化合物（例えば、本発明のICEインヒビター）を調製する好ましい方法は、PCT特許出願第WO 97/22619号に記載されており、これは本明細書中で参照として援用される。
従って、慢性および急性形態のIL-1媒介疾患、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γ媒介疾患、ならびに炎症性、自己免疫性、骨破壊性、増殖性、感染性、または退行性疾患を予防および処置する薬剤として使用するためには、インビボでのICEの作用を効果的に阻害し得る化合物が必要とされている。このような化合物の調製法もまた必要とされている。
発明の要旨
本発明は、ICEのインヒビターとして有用な新規な種類の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な誘導体を提供する。これらの化合物は、単独で、または他の治療剤または予防剤（例えば、抗生物質、免疫調節剤または他の抗炎症性薬剤）と組み合わせて、IL-1、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γにより媒介される疾患の処置または予防に使用され得る。好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は、ICEの活性部位と結合し得、かつその酵素の活性を阻害し得る。さらに、これらはペプチジルICEインヒビターに比べ、改良された細胞潜在能力、改良された薬物動態、および/または改良された経口バイオアベイラビリティーを有する。
本発明の主要な目的は、新規な種類の、次式により表されるICEインヒビターである化合物を提供することである：
本発明のさらなる目的は、本発明の化合物および関連化合物を調製する新規の方法を提供することである。
発明の詳細な説明
本明細書中に記載される本発明が、より十分に理解され得る様に、以下の詳細な説明を記載する。
以下の略語および定義は、本願の全体にわたって用いられる。
略語
Ac2O 無水酢酸
n-Bu ノルマル-ブチル
DMF ジメチルホルムアミド
DIEA N,N-ジイソプロピルエチルアミン
EDC 1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩
Et2O ジエチルエーテル
EtOAc 酢酸エチル
Fmoc ９-フルオレニルメトキシカルボニル（9-fluorenylmethyoxycarbonyl）
HBTU O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBT １-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
MeOH メタノール
TFA トリフルオロ酢酸
用語「HBV」、「HCV」および「HGV」は、それぞれＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＧ型肝炎ウイルスを意味する。
用語「Ki」は、ある化合物が、標的酵素（例えば、ICE）の活性を阻害する有効性の数値を意味する。Kiの値がより低いことは、より高い有効性を反映している。このKi値は、実験的に決定した速度データを標準酵素速度式に適合させることにより、導き出される（Segel，I.H.、Enzyme Kinetics，Wiley-Interscience，1975を参照のこと）。
用語「インターフェロンγ誘導因子」または「IGIF」は、IFN-γの内因性産生を刺激し得る因子を意味する。
用語「ICEインヒビター」は、ICEおよびICEホモログからなる群から選択される１つ以上の酵素を阻害し得る化合物を意味する。ICE阻害は、本明細書中で参考として記載され、援用される方法を用いて決定され得る。当業者はインビボICEインヒビターが必ずしもインビトロICEインヒビターでないことを理解している。例えば、プロドラッグの形態の化合物は典型的には、インビトロアッセイにおいて活性をほとんどまたは全く示さない。このようなプロドラッグ形態は患者の代謝または他の生化学的プロセスにより変化され、インビボICEインヒビターを提供し得る。
用語「サイトカイン」は、細胞間の相互作用を媒介する分子を意味する。
用語「状態」は、被験体において有害な生化学的結果を引き起こす任意の疾患、障害または影響を意味する。
用語「被験体」は、動物、または動物に由来する１つ以上の細胞を意味する。好ましくは、この動物は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。細胞は任意の形態であり得、これは組織内に維持された細胞、細胞クラスタ、不死化された細胞、トランスフェクトされるかまたは形質転換された細胞、および物理的または表現型的に改変された動物由来の細胞を包含するが、これらに限定されない。
本願において用いられる用語「患者」は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
用語「アルキル」は、１個から６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝、飽和脂肪族炭化水素を意味する。
用語「アルケニル」は、２個から６個の炭素を含む直鎖または分枝不飽和炭化水素を意味する。
用語「シクロアルキル」は、環系に不飽和結合を任意で含み得る、単環式または多環式、非芳香族、炭化水素環系を意味する。例としては、シクロヘキシル、アダマンチルおよびノルボルニルが挙げられる。
用語「アリール」は、６、10、12または14個の炭素を含み、ここで環系の少なくとも１つ以上の環が芳香族性である、単環式または多環式環系を意味する。本発明のアリール基は任意にR17で単一または複数で置換される。アリール環系の例としては、フェニル、ナフチル、およびテトラヒドロナフチルが挙げられる。
用語「ヘテロアリール」は、１個から15個の炭素原子および１個から４個のヘテロ原子を含む単環式または多環式環系を意味し、ここで環系の少なくとも１つの環が芳香族性である。ヘテロ原子は、硫黄、窒素または酸素である。本発明のヘテロアリール基は任意にR17で単一または複数で置換される。
用語「ヘテロ環式」は、１個から１５個の炭素原子および１個から４個のヘテロ原子を含む単環式または多環式環系を意味し、ここで単環式または多環式環系は任意で不飽和結合を含むが、芳香族性でない。ヘテロ原子は、独立して、硫黄、窒素、または酸素である。
用語「アルキルアリール」は、アルキル基の水素原子がアリールラジカルで置換されている、アルキル基を意味する。
用語「アルキルヘテロアリール」は、アルキル基の水素原子がヘテロアリールラジカルで置換されている、アルキル基を意味する。
用語「置換」は、化合物の水素原子の置換基での置換を意味する。
用語「直鎖」は、共有結合原子の継続した枝状に分かれていない列を意味する。直鎖は置換され得るが、これらの置換基は直鎖の一部でない。
本願で用いられる用語「患者」は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
化学式において、括弧は分子内または基内の結合性を示すのに本明細書中で用いられる。特に、括弧は以下を示すのに用いられる：１）１つより多い原子または基が特定の原子に結合されていること；または２）分枝部位（すなわち、開き括弧の直前の原子が、括弧内の原子または基および閉じ括弧の直後の原子または基の両方に結合されている）。第１の使用例は「-N（アルキル）2」であり、これは２つのアルキル基がＮ原子に結合していることを示す。第２の使用例は「-C（O）NH2」であり、これはカルボニル基およびアミノ（「NH2」）基の両方が、指し示された炭素原子に結合していることを示す。-C（O）NH2」基は、以下の構造を含む他の方法で表され得る：
本発明の化合物
本発明の１実施態様（Ａ）の化合物は、以下の式（I）の化合物である：
Ｙは
但し、R5が-OHの場合、Ｙはまた以下であり得：
R1は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R2は結合、-C（O）-、-C（O）C（O）-、−S（O）2-、-OC（O）-、-N（H）C（O）-、-N（H）S（O）2-、-N（H）C（O）（O）-、-CH=CHC（O）-、-OCH2C（O）-、-N（H）CH2C（O）-、-N（R19）C（O）-、-N（R19）S（O）2-、-N（R19）C（O）C（O）-、または-N（R19）CH2C（O）-であり、但しR2が結合でない場合、R2は７員環に結合したNHにカルボニルまたはスルホニルを介して結合され；
R3は-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキル、-N（アルキル）2、
R4は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）（アルキル）、-N（アルキル）2、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O）2アルキル-、または-C（O）アルキルであり；
R5は-OH、-OR8、または-N（H）OHであり；
R6は-H、-CH2OR9、-CH2SR10、-CH2N（H）R9、-CH2N（R9）R12、-C（H）N2、-CH2F、-CH2Cl、-C（O）N（R11）R12、-R13、または-R14であり；
R8は-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、またはアルキルヘテロ環であり；
R9は-H、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-P（O）R15R16であり；
R10は-アルキルアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
各R11およびR12は独立して、-H、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R13は-アルキルアリール、-アルケニルアリール、-アルキニルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R14は
各R15およびR16は独立して、-H、-OH、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-Ｏアルキル、-Ｏアリール、-Ｏヘテロアリール、-Ｏアルキルアリール、または-Ｏアルキルヘテロアリールであり；
R17は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-SO2NH2、-C（O）H、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）アルキル、-N（アルキル）2、-CO2アルキル、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S（O）2N（H）アルキル、-S（O）2N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル、または-C（O）アルキルであり；
R18は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-O-アリール、-O-ヘテロアリール、-O-アルキルアリール、-O-アルキルヘテロアリール、-N（H）アリール、N-（アリール）2、-N（H）ヘテロアリール、-N（ヘテロアリール）2、-N（H）アルキルアリール、-N（アルキルアリール）2、-N（H）アルキルヘテロアリール、-N（アルキルヘテロアリール）2、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-S-アルキルアリール、-S-アルキルヘテロアリール、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-CO2アリール、-CO2ヘテロアリール、-CO2アルキルアリール、-CO2アルキルヘテロアリール、-C（O）N（H）アリール、-C（O）N（アリール）2、-C（O）N（H）ヘテロアリール、-C（O）N（ヘテロアリール）2、-C（O）N（H）アルキルアリール、-C（O）N（アルキルアリール）2、-C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-C（O）N（アルキルヘテロアリール）2、-S（O）2アリール、-S（O）2ヘテロアリール、-S（O）2アルキルアリール、-S（O）2アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（H）アリール、-S（O2）N（H）ヘテロアリール、-S（O2）N（H）アルキルアリール、-S（O）2N（H）アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（アリール）2、-S（O）2N（ヘテロアリール）2、-S（O）2N（アルキルアリール）2、-S（O）2N（アルキルヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（H）アリール、-N（H）C（O）N（H）ヘテロアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-N（H）C（O）N（アリール）2、-N（H）C（O）N（ヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルヘテロアリール）2であり；
R19は-H、-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、または-アルキルヘテロ環であり；
R20は-アルキル-R18であり；
ｍは０または１であり；そして
ＸはＯまたはＳである。
本発明の別の実施態様（Ｂ）の化合物は、以下の式（II）の化合物である：
実施態様（Ａ）および（Ｂ）の好ましい化合物は、以下のものである：
Ｃはベンゾ、ピリド、チエノ、ピロロ、フロ、イミダゾ、チアゾロ、オキサゾロ、ピラゾロ、イソチアゾロ、イソキサゾロ、またはトリアゾロであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素が必要に応じてR4で置換される。
実施態様（Ａ）および（Ｂ）のさらに好ましい化合物は、以下のものである：
Ｙは
Ｃはベンゾであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じてR4で置換され；
R1は-フェニル、-ナフチル、または-イソキノリニルであり、ここでR17は-OH、-NH2、-Cl、-F、-Ｏアルキル、または-N（アルキル）2であり；
R2は-C（O）-、-S（O2）-、-C（O）C（O）-、または-CH2C（O）-であり；
R3は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-フェニル、-2-ピリジニル、-3-ピリジニル、-4-ピリジニル、または-チアゾリルであり；
R4は-フルオロまたは-クロロであり；
R5は-OHであり；
R6は：
-H；または
-R14であり、ここでＸ＝Ｏであり、但し、-R14が（i）の場合、R17は-Ｏアルキル、-Fまたは-Clであり、そして但し、-R14が（ii）の場合、R18は-アリールであり、ここでアリールはフェニルであり；
R7は-C（O）アルキルであり；
R8は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-シクロペンチル、-フェネチル、または-ベンジルであり；
Ｘ＝Ｏであり；あるいは
ｍ＝０である。
本発明の実施態様（Ａ）の好ましい化合物は以下のものを含むが、これに限定されない：
Ｙは
但し、R5が-OHの場合、Ｙはまた以下であり得：
R1は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R2は結合、-C（O）-、-C（O）C（O）-、-S（O）2-、-OC（O）-、-N（H）C（O）-、-N（H）S（O）2-、-N（H）C（O）C（O）-、-CH=CHC（O）-、-OCH2C（O）-、-N（H）CH2C（O）-、-N（R19）C（O）-、-N（R19）S（O）2-、-N（R19）C（O）C（O）-、-N（R19）CH2C（O）-、または-C（O）C（=NOR11）-であり、但しR2が結合でない場合、R2は７員環NH基にカルボニルまたはスルホニルを介して結合され；
R3は-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキル、-N（アルキル）2、
R4は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）（アルキル）、-N（アルキル）2、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル-、-C（O）アルキル、-CH2NH2、-CH2N（H）アルキル、またはCH2N（アルキル）2であり；
R5は-OH、-OR8、または-N（H）OHであり；
R6は-H、-CH2OR9、-CH2SR10、-CH2NHR9、-CH2N（R9）R12、-CHN2、-CH2F、-CH2Cl、-C（O）N（R11）R12、-R13、または-R14であり；
R8は-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、またはアルキルヘテロ環であり；
R9は-H、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-P（O）R15R16であり；
R10は-アルキルアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
各R11およびR12は独立して、-H、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R13は-アルキルアリール、-アルケニルアリール、-アルキニルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R14は
各R15およびR16は独立して、-H、-OH、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-Ｏアルキル、-Ｏアリール、-Ｏヘテロアリール、-Ｏアルキルアリール、または-Ｏアルキルヘテロアリールであり；
R17は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-S（O）2NH2、-C（O）H、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）アルキル、-N（アルキル）2、-CO2アルキル、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S（O）2N（H）アルキル、-S（O）2N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル、または-C（O）アルキルであり；
R18は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-O-アリール、-O-ヘテロアリール、-O-アルキルアリール、-O-アルキルヘテロアリール、-N（H）アリール、-N（アリール）2、-N（H）ヘテロアリール、-N（ヘテロアリール）2、-N（H）アルキルアリール、-N（アルキルアリール）2、-N（H）アルキルヘテロアリール、-N（アルキルヘテロアリール）2、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-S-アルキルアリール、-S-アルキルヘテロアリール、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-CO2アリール、-CO2ヘテロアリール、-CO2アルキルアリール、-CO2アルキルヘテロアリール、-C（O）N（H）アリール、-C（O）N（アリール）2、-C（O）N（H）ヘテロアリール、-C（O）N（ヘテロアリール）2、-C（O）N（H）アルキルアリール、-C（O）N（アルキルアリール）2、-C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-C（O）N（アルキルヘテロアリール）2、-S（O）2-アリール、-S（O）2-ヘテロアリール、-S（O）2-アルキルアリール、-S（O）2アルキルヘテロアリール、-S（O）2NH-アリール、-S（O2）NH-ヘテロアリール、-S（O）2N（H）アルキルアリール、-S（O）2N（H）アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（アリール）2、-S（O）2N（H）ヘテロアリール）2、-SO2N（アルキルアリール）2、-SO2N（アルキルヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（H）アリール、-N（H）C（O）N（H）ヘテロアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-N（H）C（O）N（アリール）2、-N（H）C（O）N（H）ヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルヘテロアリール）2であり；
R19は-H、-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、または-アルキルヘテロ環であり；
R20は-アルキル-R18であり；
ｍは０または１であり；そして
ＸはＯまたはＳである。
本発明の実施態様（Ｄ）の化合物は以下の式（IV）の化合物である：
上記の実施態様において、R8およびR19はまた独立して、ヘテロシクリルまたはアルキルシクロアルキルから選択される。
実施態様（Ｂ）および（Ｄ）において、Ｙはまた以下から選択される：
Ｃはベンゾ、ピリド、チエノ、ピロロ、フロ、イミダゾ、チアゾロ、オキサゾロ、ピラゾロ、イソチアゾロ、イソキサゾロ、またはトリアゾロであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素が必要に応じてR4で置換される。
実施態様（Ｃ）および（Ｄ）のさらに好ましい化合物は以下のものである：
Ｙは
Ｃはベンゾであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じてR4で置換され；
R1は-フェニル、-ナフチル、または-イソキノリニルであり、ここでR17は-OH、-NH2、-Cl、-F、-Ｏアルキル、または-N（アルキル）2であり；
R2は-C（O）-、-S（O）2-、-C（O）C（O）-、または-CH2C（O）-であり；
R3は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-フェニル、-2-ピリジニル、-3-ピリジニル、-4-ピリジニル、または-チアゾリルであり；
R4は-フルオロまたは-クロロであり；
R5は-OHであり；
R6は：
-H；または
-R14であり、ここでＸ＝Ｏであり、但し、-R14が（i）の場合、R17は-Ｏアルキル、-Fまたは-Clであり、そして但し、-R14が（ii）の場合、R18は-アリールであり、ここでアリールはフェニルであり；
R7は-C（O）アルキルであり；
R8は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-シクロペンチル、-フェネチル、または-ベンジルであり；
Ｘ＝Ｏであり；または
ｍ＝０である。
実施態様（Ｂ）および（Ｄ）の他のさらに好ましい化合物は、Ｙが以下のものであり：
本発明の好ましい化合物は以下のものを含むが、これらに限定されない：
ICEインヒビターは任意で、炭素、窒素または他の原子において、様々な置換基により置換され得る。複合的に置換される場合、置換基の組合せが安定な化合物の形成を生じる限り、各置換基は任意の他の置換基から独立して選択され得る。
本発明により想像される置換基および改変体の組合せは、安定な化合物の形成を生じるもののみである。用語「安定な」は、本明細書中で用いられる場合、製造および当業者に公知の方法による哺乳動物への投与を許容するのに十分な安定性を有する化合物を意味する。典型的には、このような化合物は40℃またはそれ未満の温度で、水分または他の化学的反応性条件の非存在下、少なくとも１週間、安定である。
置換基は様々な形態で表され得る。これらの様々な形態は当業者に公知であり、互換的に用いられ得る。例えば、フェニル環上のメチル置換基は、以下の形態のいずれかで表され得る：
本発明の化合物は、約700ダルトン未満またはこれに等しい分子量を有し、より好ましくは約400ダルトンと600ダルトンとの間の分子量を有する。これらの好ましい化合物は経口投与時、患者の血流により容易に吸収され得る。この経口利用能により、このような化合物は、IL-1、アポトーシス、IGIF、またはIFN-γ媒介疾患に対する、経口投与処置および予防レジメンの優秀な薬剤となる。
本発明の化合物は、溶媒の選択、pH、および当業者に公知の他のものを含めた条件に依存して、種々の平衡形態で存在し得ることを理解するべきである。これらの化合物のこのような形態の全ては、明らかに、本発明に包含される。特に、本発明の多くの化合物（特に、R3にアルデヒド基またはケトン基を含有し、そしてＴにカルボン酸基を含有するもの）は、ヘミケタール（またはヘミアセタール）形態または水和形態をとり得る。例えば、Ｙが以下である場合、実施態様（Ａ）の化合物はヘミアセタールまたはヘミケタール形態をとる：
Ｙが以下である場合、アルコキシケタールまたはアシルオキシアセタール形態をとり：
本発明の化合物は、選択的な生物学的特性を高めるために、適切な官能基により、改変できることを理解すべきである。このような改変は、当該技術分野で公知であり、これには、所定の生体系（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生体浸透性を高めるもの、経口適用性を高めるもの、注射による投与を可能にするために溶解性を高めるもの、代謝を変えるもの、および排出速度を変えるものが挙げられる。さらに、この化合物は、プロドラッグに対する代謝または他の生化学過程の作用の結果として、所望の化合物が患者の体内で形成されるように、プロドラッグ形態に変えることができる。このようなプロドラッグ形態は、代表的には、インビトロアッセイにおいて活性をほとんどまたは全く示さない。プロドラッグ形態のいくつかの例には、ケトン基またはアルデヒド基を含有する化合物のケタール、アセタール、オキシム、イミンおよびヒドラゾン形態が包含され、この場合、特に、それらの形態は、本発明の化合物のR3基で生じる。プロドラッグ形態の他の例として、本明細書中に記載される、ヘミケタール、ヘミアセタール、アシルオキシケタール、アシルオキシアセタール、ケタール、アセタールおよびエノール形態が挙げられる。
組成物および方法
本発明の化合物は、ICEに対する優れたリガンドである。従って、これらの化合物は、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF-媒介疾患およびIFN-γ媒介疾患における事象を標的および阻害し得、それにより、炎症性疾患、自己免疫性疾患、破壊性骨障害、増殖性障害、感染性疾患、および変性疾患におけるそのタンパクの最終的な活性を標的および阻害し得る。例えば、本発明の化合物は、ICEを阻害することにより前駆体IL-1βの成熟IL-1βへの転化を阻害する。ICEは、成熟IL-1の生成に必須なために、その酵素の阻害は、成熟IL-1の生成を阻害することにより、IL-1が媒介する生理学的な作用および症状（例えば、炎症）の開始を効果的にブロックする。それゆえ、IL-1β前駆体の活性を阻害することにより、本発明の化合物は、IL-1インヒビターとして、効果的に機能する。
本発明の化合物はまた、ICEを阻害することによりpro-IGIFの活性な、成熟IGIFへの転化を阻害する。ICEは、成熟IGIFの生成に必須なために、ICEの阻害は、成熟IGIFの生成を阻害することにより、IGIFが媒介する生理学的な効果および症状の開始を効果的にブロックする。順番に、IGIFはIFN-γの生成に必須である。それゆえ、ICEは、成熟IGIFの生成、従ってIFN-γの生成を阻害することにより、IFN-γが媒介する生理学的な効果および症状の開始を効果的にブロックする。
従って、本発明の薬学的組成物および方法は、インビボにおけるICE活性の制御に有用である。本発明の組成物および方法は、従ってインビボにおけるIL-1、IGIFもしくはIFN-γレベルの制御、およびIL-1媒介、アポトーシス媒介、IGIF媒介もしくはIFN-γ媒介状態（疾患、障害もしくは影響を含む）の進行、重篤度または影響の処置もしくは軽減に有用である。
従って、本発明の一つの実施態様は、治療有効量のICEインヒビター、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を被験体へ投与する工程を含む、被験体のIGIF産生を減少させる方法を提供する。
本発明の他の実施態様は、治療有効量のICEインヒビター、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を被験体へ投与する工程を含む、被験体のIFN-γ産生を減少させる方法を提供する。
他の実施態様において、本発明の方法は、ICE関連プロテアーゼのインヒビター（pro-IGIFを活性IGIFへ開裂可能）および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を被験体へ投与する工程を含む。１つのそのようなICE関連プロテアーゼは、上述のようにTXである。このように本発明は、TXインヒビターの投与による、IGIFおよびIFN-γレベルの制御のための方法および薬学的組成物を提供する。
pro-IGIFを活性IGIF型へプロセッシング可能な、他のICE関連プロテアーゼもまた見出され得る。このように、これら酵素のインヒビターは当業者によって同定され得、そしてまた本発明の範囲内にあることは想像される。
本発明の薬学的組成物は、ICEインヒビターまたはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを包含する。そのような組成物は任意にさらなる治療剤を含有し得る。そのような薬剤には抗炎症剤、マトリックス金属プロテアーゼインヒビター、リポキシゲナーゼインヒビター、サイトカインアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗ガン剤、抗ウイルス剤、サイトカイン、成長因子、免疫調節剤、プロスタグランジン、もしくは抗血管過剰増殖化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
薬学的組成物が活性成分としてICEインヒビターのみを含有する場合、そのような方法は追加的な薬剤を被験体へ投与する工程を、追加的に包含し得る。そのような薬剤には抗炎症剤、マトリックス金属プロテアーゼインヒビター、リポキシゲナーゼインヒビター、サイトカインアンタゴニスト、免疫抑制剤、抗ガン剤、抗ウイルス剤、サイトカイン、成長因子、免疫調節剤、プロスタグランジン、もしくは抗血管過剰増殖化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
用語「薬学的有効量」は、患者におけるIL-1、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γ媒介疾患を処置するか、または改善する際に有効な量を意味する。用語「予防的有効量」とは、患者におけるIL-1、アポトーシス、IGIFまたはIFN-γ媒介疾患を予防するか実質的に緩和するのに有効な量を意味する。
用語「薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバント」は、本発明の化合物と共に患者に投与され得る非毒性のキャリアまたはアジュバントであって、これらの化合物の薬理学的な活性を損なわないものを意味する。
用語「薬学的に受容可能な誘導体」は、本発明の化合物または任意の他の化合物の任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、またはこのようなエステルの塩であって、レシピエントに投与した際、本発明の化合物またはそれらの抗ICE活性代謝物または残留物を（直接的または間接的に）提供できるものを意味する。
本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩には、例えば、薬学的に受容可能な無機酸および有機の酸および塩基から誘導したものが挙げられる。適切な酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸およびベンゼンスルホン酸が包含される。他の酸（例えば、シュウ酸）は、それ自体薬学的に受容可能ではないものの、本発明の化合物およびそれらの薬学的に受容可能な酸の付加塩を得る際に、中間体として有用な塩の調製に使用され得る。適切な塩基由来の塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウム塩およびN-（C1-4アルキル）4 +塩が挙げられる。
本発明はまた、本明細書中で開示された化合物のいずれかの塩基性窒素含有基の「四級化」を想定している。この塩基性窒素は、当業者に公知の任意の試薬で四級化され得、これらの試薬には、例えば、ハロゲン化低級アルキル（例えば、塩化、臭化およびヨウ化メチル、塩化、臭化およびヨウ化エチル、塩化、臭化およびヨウ化プロピルならびに塩化、臭化およびヨウ化ブチル）；硫酸ジアルキル（硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチルおよび硫酸ジアミルを含む）；長鎖ハライド（例えば、塩化、臭化およびヨウ化デシル、塩化、臭化およびヨウ化ラウリル、塩化、臭化およびヨウ化ミリスチルならびに塩化、臭化およびヨウ化ステアリル）；およびハロゲン化アラルキル（臭化ベンジルおよび臭化フェネチルを含む）が挙げられる。水溶性または油溶性、あるいは分散性の生成物は、このような四級化により得られ得る。
本発明の化合物は、従来の様式にて、インビボにおけるIGIFおよびIFN-γレベルの制御、ならびにIL-1媒介、アポトーシス媒介、IGIF媒介もしくはIFN-γにより媒介される疾患の処置または影響の進行、もしくは重篤度の軽減に使用され得る。このような処置方法、それらの用量レベルおよび必要条件は、利用可能な方法および技術から当業者により選択され得る。
例えば、本発明の化合物は、薬学的に受容可能な様式およびその疾患の重篤度を弱めるのに有効な量で、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患を罹っている患者に対し投与するための薬学的に受容可能なアジュバントと組み合わせ得る。
あるいは、本発明の化合物は、長時間にわたって、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患に対して個体を処置するか保護するための組成物および方法において使用され得る。化合物は、このような組成物において、薬学的組成物におけるICEインヒビターの従来の利用に一致する様式で、単独で、または本発明の他の化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の化合物は、通常ワクチンで使用され、そしてIL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患に対し長期間にわたって個体を保護する予防的有効量で投与される、薬学的に受容可能なアジュバントと組み合わせ得る。
本発明の化合物はまた、種々のIL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF媒介疾患またはIFN-γ-媒介疾患に対する治療または予防の効果を高めるために、他のICEインヒビターと同時投与し得る。
さらに、本発明の化合物は、従来の抗炎症剤か、またはマトリックス金属プロテアーゼインヒビター、リポキシゲナーゼインヒビター、およびIL-1β以外のサイトカインのアンタゴニストのいずれかと組合わせて使用され得る。
本発明の化合物はまた、IL-1媒介疾患症状（例えば、炎症）を予防するかまたは格闘（combat）するために、免疫調節剤（例えば、ブロピリミン、抗ヒトαインターフェロン抗体、IL-2、GM−CSF、メチオニンエンケファリン、インターフェロンα、ジエチルジチオカーバメート、腫瘍壊死因子、ナルトレキソンおよびEPO）と組み合わせるか、またはプロスタグランジンと共に、もしくは抗ウイルス剤（例えば、3TC、ポリサルファイトポリサッカライド、ガンシクロビル（ganiclovir）、リバビリン、アシクロビル（acyclovir）、αインターフェロン、トリメトトレキセート（trimethotrexate）およびファンシクロビル（fancyclovir））と共に、もしくはこれらのプロドラッグ、または関連物質が投与され得る。
本発明の化合物を、他の薬剤との組み合わせ治療において投与する場合、それらは、患者に連続的にまたは同時に投与され得る。あるいは、本発明に従った薬学的組成物または予防的組成物は、本発明のICEインヒビターおよび別の治療剤または予防剤の組合を含む。
本発明の薬学的組成物に使用され得る、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルにはイオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝液基質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロック重合体、羊毛脂および自己乳化（self-emulsifying）薬物送達システム（SEDDS）（例えば、α-トコフェロール、ポリエチレングリコール1000スクシネート、もしくは他の類似のポリマー性送達マトリックス）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の薬学的組成物は、経口的、非経口的に、吸入噴霧により、局所的に、直腸から、鼻から、頬から、膣から、または移植したリザーバーを介して、投与され得る。経口投与が好ましい。本発明の薬学的組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含有し得る。いくつかの場合、処方物のpHは、処方された化合物もしくはその送達形態の安定性を強化するために、薬学的に受容可能な酸、塩基もしくは緩衝液で調節され得る。本明細書で使用する用語、非経口的は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内および頭蓋内の注射技術または注入技術を含む。
薬学的組成物は、例えば、無菌の注射可能な水性懸濁液または油性懸濁液として、無菌の注射可能な調製物の形態であり得る。この懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤（例えば、Tween 80）および懸濁剤を用いて、当該技術分野で公知の技術に従って、処方され得る。この無菌の注射可能な調製物はまた、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒には、マンニトール、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定化油は、溶媒または懸濁媒体として、従来使用されている。この目的には、任意のブランドの不揮発性油も使用でき、これには、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。脂肪酸（例えば、オレイン酸）およびそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に受容可能なオイル（例えば、オリーブ油またはひまし油、特に、それらのポリオキシエチル化した型）と同様に、注射可能物の調製に有用である。これらのオイル溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤（例えば、Pharmacopeia Helvetica，Ph. Helvに記載または類似のアルコール）を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、任意の経口的に受容可能な投薬形態（これには、カプセル、錠剤、および水性懸濁液および水性溶液が含まれるが、それらに限定されない）で、経口的に投与され得る。経口用途に対する錠剤の場合には、通常使用されるキャリアには、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）もまた、代表的には、添加される。カプセル形態の経口投与に有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液を経口投与する場合、その活性成分は、乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。所望の場合、所定の甘味料および/または香料および/または着色剤が添加され得る。
本発明の薬学的組成物はまた、直腸投与のための座剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、本発明の化合物と、適切な非刺激性の賦形剤（これは、室温で固体であるが、直腸温度では液体であり、従って、直腸で融けて活性成分を放出する）とを混合することにより、調製され得る。このような物質には、ココアバター、蜜ロウおよびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
所望の治療が、局所的な適用により容易にアクセスできる領域または器官を包含するとき、本発明の薬学的組成物の局所投与は、特に有用である。皮膚への局所的適用のために、この薬学的組成物は、キャリアに懸濁するかまたは溶解した活性成分を含む適切な軟膏で、処方すべきである。本発明の化合物の局所投与用のキャリアには、鉱油、液化石油、ホワイト石油（white petroleum）、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、この薬学的組成物は、キャリアに懸濁するかまたは溶解した活性化合物を含む適切なローションまたはクリームで処方できる。適切なキャリアには、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリール（cetearyl）アルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物はまた、直腸座剤処方物により、または適切な洗腸処方物にて、下部腸管に局所的に適用され得る。局所的に投与される経皮パッチもまた、本発明に含まれる。
本発明の薬学的組成物は、鼻エアロゾルまたは鼻吸入により、投与され得る。このような組成物は、薬学的処方の当該技術分野で周知の技術に従って調製され、そして生理食塩液中の溶液として、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または当該技術分野で公知の他の可溶化剤または分散剤を使用して調製され得る。
活性成分化合物の１日あたり約0.01〜約100mg/kg体重、好ましくは１日あたり0.5〜75mg/kg体重、最も好ましくは約１〜約50mg/kg体重の投薬レベルは、以下を含むIL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF-媒介疾患およびIFN-γ媒介疾患の予防および処置のための単独治療に有用である：炎症疾患、自己免疫性疾患、破壊性骨障害、増殖性障害、感染性疾患、変性疾患、壊死性疾患、骨関節炎、急性膵炎、慢性膵炎、喘息、成人呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーヴス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、慢性活性肝炎、重症筋無力症、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、移植片対宿主病、骨粗鬆症、多発性骨髄腫関連骨疾患、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、敗血症、敗血症ショック、細菌性赤痢、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、心筋虚血、棘筋萎縮症、多発性硬化症、AIDS関連脳炎、HIV関連脳炎、老化、脱毛症、脳卒中による神経学的損傷、潰瘍性大腸炎（collitis）、感染性肝炎、若年性糖尿病、扁平苔癬、急性皮膚筋炎、湿疹、原発性肝硬変、ブドウ膜病、ベーチェット病、アトピー性皮膚炎、赤芽球ろう、再生不良性貧血、筋萎縮性側索硬化、ネフローゼ症候群、および全身疾患、もしくは肝臓もしくは他の器官に局所化した、炎症性もしくはアポトーシス構成要素を有する影響を与える、食物アルコールの過剰な摂取もしくはウイルス（例えばHBV、HCV、HGV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、および日本脳炎ウイルス）によって引き起こされる疾患。
代表的には、本発明の薬学的組成物は、１日あたり約１〜５回、あるいは連続注入として投与される。このような投与は、慢性治療または急性治療として使用され得る。単回用量形態を生じるためにキャリア物質と組合わせされ得る活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与形態に依存して変化する。代表的な調製物は、約５％〜約95％の活性化合物（w/w）を含む。好ましくは、このような調製物は、約20〜約80％の活性化合物を含む。
本発明の組成物がICEインヒビターおよび一つもしくはそれ以上の、追加的な治療剤もしくは予防剤との組み合わせを含む場合、ICEインヒビターおよび追加的な薬剤の両方が、単独治療の処置レジメにおいて通常投与される投薬量の約10％〜約80％の投薬レベルで存在するべきである。
患者の状態の改善の際に、必要であれば、本発明の化合物、組成物、またはその組合せの維持用量が投与され得る。続いて、投与の投薬量もしくは頻度、またはその両方は、症候が所望のレベルに軽減され、処置を止めるべき場合に、改善された状態が保持されるレベルまで、症候の関数として低減され得る。しかし、患者は、いずれの再発または疾患症候の長期基礎に対する断続的処置を必要とし得る。
当業者が認識するように、上記の用量より低いまたは高い用量が必要とされ得る。あらゆる特定の患者のための特定の投薬量および処置レジメは、種々の因子（使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事制限、投与時間、***率、薬物の組合せ、疾患の重篤度および経過、および患者の疾患に対する素因、および処置する医師の判断を含む）に依存する。
本発明の化合物により処置もしくは予防され得るIL-1媒介疾患には、炎症性疾患、自己免疫性疾患、増殖性障害、感染性疾患および変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物によって処置もしくは予防され得るアポトーシス媒介疾患には、変性疾患が挙げられる。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介炎症性疾患には、骨関節炎、急性膵炎、慢性膵炎、喘息および成人呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい炎症性疾患は、骨関節炎もしくは急性膵炎である。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介自己免疫性疾患には、糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、慢性活性肝炎、重症筋無力症、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬および移植片対宿主病が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい自己免疫性疾患は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病または乾癬である。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介破壊性骨障害には、骨粗鬆症および多発性骨髄腫関連骨疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介増殖性疾患には、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポジ肉腫および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
処置もしくは予防され得るIL-1媒介感染性疾患には、敗血症、敗血症ショックおよび細菌性赤痢が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の化合物により処置または予防され得るIL-1媒介変性疾患またはIL-1媒介壊死性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、および心筋虚血が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい変性疾患は、アルツハイマー病である。
本発明の化合物により処置または予防され得るアポトーシス媒介変性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、心筋虚血、棘筋萎縮症、多発性硬化症、AIDS関連脳炎、HIV関連脳炎、老化、脱毛症、および脳卒中による神経学的損傷が挙げられるが、これらに限定されない。
炎症性もしくはアポトーシス構成要素を有する他の疾患は、本発明の化合物により処置もしくは予防され得る。そのような疾患は全身疾患もしくは肝臓もしくは他の器官に局所化した影響を有する疾患であり得る。また、例えば、食物アルコールの過剰な摂取もしくはウイルス（例えばHBV、HCV、HGV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、および日本脳炎ウイルス）によって引き起こされ得る。
本発明の化合物により処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介疾患には、炎症性、感染性、自己免疫性、増殖性、神経変性および壊死性状態が挙げられるが、これらに限定されない。
処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介炎症性疾患には、骨関節炎、急性膵炎、慢性膵炎、喘息、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳性虚血、心筋虚血および成人呼吸窮迫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、炎症性疾患は、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎もしくは成人呼吸窮迫症候群である。
処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介感染性疾患には、感染性肝炎、敗血症、敗血症ショックおよび細菌性赤痢が挙げられるが、これらに限定されない。
処置または予防され得るIGIFもしくはIFN-γ媒介自己免疫性疾患には、糸球体腎炎、全身エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、若年性糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、扁平苔癬、移植片対宿主病、急性皮膚筋炎、湿疹、原発性肝硬変、肝炎、ブドウ膜炎、ベーチェット病、アトピー性皮膚炎、赤芽球ろう、再生不良性貧血、筋萎縮性側索硬化およびネフローゼ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、自己免疫性疾患は、糸球体腎炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、若年性糖尿病、乾癬、移植片対宿主病もしくは肝炎である。
本発明は、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、IGIF-媒介疾患およびIFN-γ媒介疾患を予防し処置するために、本明細書で開示の化合物の使用に焦点をあてているが、本発明の化合物はまた、他のシステインプロテアーゼのインヒビター剤として使用され得る。
本発明の化合物はまた、ICEまたは他のシステインプロテアーゼに効果的に結合する市販試薬として、有用である。市販試薬としては、本発明の化合物およびそれらの誘導体は、生化学における標的ペプチドのタンパク質分解を阻止もしくはICEおよびICEホモログについての細胞アッセイのために使用され得るか、または誘導体化されて、アフィニティークロマトグラフィー用の拘束基質として、安定な樹脂に結合され得る。市販のシステインプロテアーゼインヒビターを特徴づけるこれらの用途および他の用途は、当業者に明らかである。
N-アシルアミノ化合物の調製プロセス
本発明のICEインヒビターは従来の手法を用いて合成され得る。都合よく、これらの化合物は容易に入手し得る出発物質から便利に合成される。
本発明の化合物は、ICEインヒビターとして公知の中で最も容易に合成される。前述のICEインヒビターの多くは、４もしくはそれ以上のキラル中心および極めて多数のペプチド結合を含む。本発明の化合物が比較的容易に合成され得るということは、これらの化合物の大規模生産という利点を意味する。
例えば、本発明の化合物は本明細書中に述べられたプロセスを用いて調製され得る。当業者によって理解され得るように、これらのプロセスが本出願において記載されたおよび請求された化合物を合成し得る唯一の方法ではない。さらなる方法は当業者に明らかである。加えて、本明細書中で述べられた種々の合成工程は、所望の化合物を得るための別の連続もしくは順序で実行され得る。
本発明のN-アシルアミノ化合物の好ましい調製方法は、以下の工程を包含する：
a）カルボン酸とN-alloc保護アミンとを不活性溶媒、トリフェニルホスフィン（triphenylphoshine）、求核スカベンジャーおよびテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（0）の存在下、周囲温度で不活性雰囲気下で混合する工程；および
b）工程a）の混合物に、HOBTおよびEDCを添加する工程；および、必要に応じて以下の更なる工程を包含する：
c）酸およびH2Oをを含する溶液の存在下、工程b）の混合物を加水分解する工程、ここで工程b）の混合物を加水分解前に任意で濃縮する。
好ましくは、不活性溶媒はCH2Cl2、DMFもしくはCH2Cl2およびDMFの混合物である。
好ましくは、求核スカベンジャーはジメドン（dimedone）、モルフォリン、トリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。より好ましくは、求核スカベンジャーはトリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。
好ましくは、溶液はトリフルオロ酢酸を約１〜90％重量含む。より好ましくは、溶液はトリフルオロ酢酸を約20〜50％重量含む。
あるいは、溶液は塩酸を約0.1〜30重量％含む。より好ましくは、溶液は塩酸を約５〜15重量％含む。
より好ましくは、上記のプロセスにおいて、不活性溶媒はCH2Cl2、DMFもしくはCH2Cl2およびDMFの混合物であり、および求核スカベンジャーは、ジメドン、モルフォリン、トリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。
最も好ましくは、上記のプロセスにおいて、不活性溶媒はCH2Cl2、DMFもしくはCH2Cl2およびDMFの混合物であり、および求核スカベンジャーはトリメチルシリルジメチルアミンもしくはジメチルバルビツール酸である。
好ましいプロセス例において、N-アシルアミノ化合物は式（V）で表される：
R21は：
R22は：
ｍはｌであり；および
R23は-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリールもしくはアルキルヘテロ環および上記で述べたような他の置換基である。
好ましくは、カルボン酸はR22-OHであり、N-alloc保護アミンは：
（IV）：
本発明をさらに充分に理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示の目的だけのものであり、いずれの様式でも、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１
実施例２
実施例２についてのさらなるデータを表１に示す。
実施例３
実施例３についてのさらなるデータを表１に示す。
実施例４〜27
実施例４〜27を、実施例２または３を調製するために使用した方法と同様な方法により調製した（表１を参照のこと）。
ICE阻害
本発明者らは、以下に記載する３つの方法（実施例28および31）を使用して、本発明の化合物について阻害定数（Ki）およびIC50値を得た。表２に、実施例１〜20および21〜27についてこのデータを列挙する。
スクシニル−Tyr−Val−Ala−Asp−p−ニトロアニリド基質を使用してこのアッセイを行う。類似の基質の合成は、Reiter，L．A．Int．J．Peptide Protein Res．、43、87〜96頁（1994）に記載されている。アッセイ混合物は、以下を含む：
65 μl 緩衝液（10mMのTris、１mMのDTT、0.1％のCHAPS（pH8.1にて））
10 μl ICE（最終濃度50nMで、約１mOD/分の速度を与える）
5 μl DMSO/インヒビター混合物
20 μl 400μMの基質（最終濃度80μM）
100μl 反応総体積
可視ICEアッセイを96−ウェルマイクロタイタープレートで行う。緩衝液、ICE、およびDMSO（インヒビターが存在する場合）を、列挙した順にウェルに加える。成分を室温で15分間インキュベートし、その開始時には全成分が全ウェルに存在する。マイクロタイタープレートリーダーを設置して37℃でインキュベートする。15分間インキュベートした後、基質を直接ウェルに添加し、そして37℃で20分間405〜603nmにおいて発色団（pNA）の放出を追跡することによって反応をモニターする。データの線形最適化（linear fit）を行い、そしてmOD／分で速度を計算する。DMSOは、インヒビターを含む実験の間のみ存在し、緩衝液はその他の実験において体積を100μlにするために使用する。
２．蛍光基質を用いる酵素アッセイ
このアッセイを、本質的にThornberryら、Nature 356、768〜774頁（1992）に従い、その文献中に参照されている基質17を使用して行う。基質は、アセチル−Tyr−Val−Ala−Asp−アミノ−4−メチルクマリン（AMC）である。以下の成分を混合する：
65 μl 緩衝液（10mMのTris、１mMのDTT、0.1％のCHAPS（pH8.1にて））
10 μl ICE（最終濃度２〜10nM）
5 μl DMSO/インヒビター溶液
20 μl 150μMの基質（最終30μM）
100μl 反応総体積
アッセイを96−ウェルマイクロタイタープレートで行う。緩衝液およびICEを、ウェルに加える。成分を、温度制御ウェルプレート中、37℃で15分間インキュベートする。15分間インキュベートした後、基質を直接ウェルに添加することにより反応を開始し、そして37℃で30分間、380nmに対する励起波長および460nmの発光波長を使用して、AMC蛍光団の放出を追跡することによってモニターする。各ウェルについてデータの線形最適化を行い、そして１秒あたりの蛍光ユニットで速度を計算する。
酵素阻害定数（Ki）または阻害の様式（競合的、不競合的、または非競合的）の決定のために、酵素アッセイにおいて種々のインヒビター濃度で決定された速度データを、標準酵素速度平衡についてコンピューター最適化する（I．H．Segel、Enzyme Kinetics、Wiley-Interscience、1975を参照のこと）。
不可逆的インヒビターの二次速度定数の決定を、Morrisonの進行平衡について蛍光対時間のデータを最適化することにより行った。Morrison、J．F．、Mol．Cell．Biophys．、２、347〜368頁（1985）。Thornberryらは、ICEの不可逆的インヒビターの速度定数を測定するためのこれらの方法の記述を出版した。Thornberry、N．A．ら、Biochemistry、33、3923〜3940頁（1994）。前複合体（prior complex）形成が速度論的に観察され得ない化合物について、二次速度定数（Kinact）は、Kobs対インヒビター濃度［I］の線形プロットの傾きに直接由来する。酵素との前複合体形成が検出され得る化合物について、Kobs対［I］の双曲線（hyperbolic）プロットを、一次生成するKiおよびK’に対する飽和速度平衡に対して最適化する。次いで、二次速度定数KinactをK’／Kiにより得る。
３．PBMC細胞アッセイ
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）または富化付着単核細胞の混合集団（mixed population）によるIL-1βアッセイ
ICEによるpre-IL-1βのプロセシングは、種々の細胞源を使用する細胞培養において測定され得る。健康なドナーから得られたヒトPBMCは、多くの種類の生理学的刺激に応答してインターロイキンおよびサイトカインのスペクトルを生成するリンパ球サブタイプおよび単核細胞の混合集団を提供する。PBMC由来の付着単核細胞は、活性化細胞によるサイトカイン生成の選択的研究のための正常単球の富化供給源を提供する。
実験手順：
最初に試験化合物のDMSOまたはエタノールでの希釈溶液のシリーズを調製し、続いてそれぞれRPMI-10％FBS培地（2mMのL-グルタミン、10mMのHEPES、50Uおよび50ug／mlのpen／strepを含む）中に希釈して、４×の最終試験濃度で0.4％のDMSOまたは0.4％のエタノールを含む薬物を得る。DMSOの最終濃度は、全ての薬物希釈物について0.1％である。ICE阻害アッセイにおいて決定された試験化合物についての見かけ上のKiの限界を定める（bracket）濃度滴定を、一般に、化合物の一次スクリーニングに使用する。
一般に、５〜６個の化合物の希釈物を試験し、アッセイの細胞質成分を複製して、各細胞培養の上清において複製ELISA測定を行う。
PBMC単離およびIL-1アッセイ：
１パイントのヒト血液から単離した軟膜細胞（血漿と細胞とを合わせて最終的な体積40〜45mlで得る）を、培地で80mlに希釈し、そしてLeukoPREP分離管（Becton Dickinson）に10mlの細胞懸濁液をそれぞれ重層する。1500〜1800×gで15分遠心分離した後、血漿／培地層を吸引し、次いで単核細胞層をパスツールピペットで収集し、そして15mlコニカル遠心分離管（Corning）に移す。培地を加えて体積を15mlにし、上下反転することにより細胞を穏やかに混合し、そして300×gで15分間遠心分離した。PBMCペレットを少量の培地中に再懸濁し、細胞を計数して６×106細胞／mlに調整した。
細胞質アッセイのために、1.0mlの細胞懸濁液、0.5mlの試験化合物希釈物および0.5mlのLPS溶液（Sigma #L-3012；完全RPIM培地で調製した20ng／ml溶液；最終LPS濃度５ng／ml）を24-ウェル平底組織培養プレート（Corning）の各ウェルに添加した。通常、試験化合物およびLPSの0.5mlの添加は、ウェルの内容物の混合に十分足りる。１つの実験あたり３つのコントロール混合物を、LPS単独、溶媒ビヒクルコントロール、および／または最終培養体積を2.0mlに調製するために付加する培地で行う。細胞培養物を５％のCO2の存在下37℃で16〜18時間インキュベートする。
インキュベーション期間の終わりに、細胞を収集し、そして15mlのコニカル遠心分離管に移す。200×gで10分間遠心分離した後、上清を収集し、そして1.5mlのエッペンドルフ管に移す。細胞ペレットを、ウェスタンブロットもしくはpre-IL-1β特異的抗血清を用いるELISAによるサイトゾル抽出物中のpre-IL-1βおよび／または成熟IL-1β含有量の生化学的評価のために使用し得ることが注記され得る。
付着単核細胞の単離：
上記に記載したようにPBMCを単離および調製する。最初に培地（1.0ml）をウェルに添加し、続いて0.5mlのPBMC懸濁液を添加する。１時間インキュベーションした後、プレートを穏やかに撹拌し、そして非付着細胞を各ウェルから吸引する。次いで、ウェルを1.0mlの培地で３回穏やかに洗浄し、そして最後に1.0mlの培地に再懸濁する。一般に、付着細胞の富化により、１ウェルあたり2.5〜3.0×105の細胞を得る。試験化合物の添加、LPS、細胞のインキュベーション条件、および上清の処理は、上記に記載したように行う。
ELISA：
本発明者らは、成熟IL-1βの測定のために、Quantikineキット（R&D Systems）を使用した。アッセイを製造者の説明書に従い行う。PBMCおよび接着単核細胞ポジティブコントロールの両方において約１〜３ng／mlの成熟IL-1βレベルを観測する。ELISAアッセイを、LPS-ポジティブコントロールからの上清の、１：５、１：10、および１：20の希釈物について行い、試験パネルにおける上清の最適希釈を選択する。
化合物の阻害有効性は、IC50値により表され得、これはポジティブコントロールと比較して上清中に50％の成熟IL-1βが検出されるインヒビターの濃度である。
当業者は、本明細書中で記載されるもののような細胞アッセイにおいて得られた値が、多数の要因に依存し得ることを理解する。この値は、必ずしも十分に定量的な結果を示す必要はない。
実施例29
マウスにおける薬物動態研究
ペプチジルICEインヒビターは、100μ／分／kgよりも大きいクリアランス速度で速やかに浄化される。より低いクリアランス速度の化合物は、ペプチジルICEインヒビターと比較して薬物動態的性質を改善した。
本発明の化合物に対するクリアランス速度（μ／分／kg）は、以下に記載される方法を使用して得られ得る。
サンプル調製および投薬
化合物を2.5mg／mlの濃度で滅菌TRIS溶液（0.02Ｍまたは0.05Ｍ）に溶解する。確実に完全な溶液にすることが必要である場合、最初にサンプルを最小量のジメチルアセトアミド（最大で総溶液体積の５％）に溶解し、次いでTRIS溶液で希釈する。
薬物溶液を、例えば、25mg／kgの薬物投薬を与えるように10ml／kgの投薬体積で、尾静脈を介してCD-1マウス（Charles River Laboratories-26〜31ｇ）に投与する。
マウスには、各時点（通常２分から２時間）において群（例えば、５個体）で投薬してもよく、次いで適切な時間で、動物をハロタンで麻酔をかけ、そして血液を頸静脈切断（severance）により個々のヘパリン処理した管に収集する。血液サンプルを０℃まで冷却し、次いで血漿を分離して、そしてアッセイするまで-20℃で保存する。
バイオアッセイ
血漿サンプル中の薬物濃度を、UVまたはMS（ESP）検出を用いてHPLC分析により測定する。C１〜C18の種々の結合相を使用し、水性緩衝液／アセトニトリル混合物からなる溶離液で、定組成（isocratic）条件下で行う逆相クロマトグラフィーを用いる。
定量は、0.5〜50μg／mlの範囲の濃度を与える薬物溶液で血漿をスパイクすることにより構成される検量線を用いる外部標準法による。
分析の前に、血漿サンプルを、アセトニトリル、メタノール、トリクロロ酢酸または過塩素酸を添加し、続いて10,000gで10分間遠心分離することにより、脱タンパク質化する。20μl〜50μlの量のサンプルを、分析のために注入する。
代表的な投薬およびサンプリング手順
薬物を滅菌0.02Ｍ Trisに溶解して2.5mg／ml溶液とし、これを雄性CD-1マウス５個体からなる11群に25mg／kgの用量で尾静脈を介して投与する。以下の各時点：２、５、10、15、20、30、45、60、90、および120分において、動物の一群を麻酔し、そして血液をヘパリン化した管に収集する。血漿を分離した後、アッセイするまで-20℃で保存する。
代表的なアッセイ
血漿（150μl）のアリコートを５％過塩素酸（５μl）で処理し、次いでかき混ぜて混合し、そして遠心分離の前に90分間放置する。得られる上清を分離し、そして20μlをHPLC分析にかける。
代表的なHPLC条件
ペプチジルICEインヒビターは、80ml／分／kgよりも大きいクリアランス速度で、速やかにクリアランスされる。より遅いクリアランス速度を有する化合物は、ペプチジルICEインヒビターと比較して、薬物動態的性質を改善した。
本発明の化合物に対するラットでのクリアランス速度（ml／分／kg）は、以下に記載される方法を使用して得られ得る：
インビボでのラットクリアランスアッセイ
代表的な手順
麻酔下でラットの頸静脈および頸動脈管へのカニューレ挿入を、薬物動態的研究の１日前に行う。Free、M．J．およびJaffee、R．A．；「血液およびその他の体液採取のためのカニューレ挿入技術」；Animal Models；480〜495頁；Alexander、N．J．、編；Academic Press；（1978）より。薬物（10mg／mL）をビヒクル（通常は、１：１の比で100mMの炭酸水素ナトリウムを含む、プロピレングリコール／生理食塩水からなる）中で頸静脈を介して投与する。動物に、10〜20mgの薬物／kgを投与し、そして血液サンプルを０、２、５、７、10、15、20、30、60、および90分の時点で、内在する頸動脈カテーテルから吸い出す。血液から血漿を遠心分離し、そして分析するまで-20℃で保存する。データの薬物動態的分析を、RStrip（MicroMath Software、UT）および／またはPcnonlin（SCI Software、NC）のような標準的なソフトウェアを使用して非線形回帰（regression）により行い、クリアランス値を得る。
代表的な分析：
ラット血漿を等体積のアセトニトリル（0.1％のTFAを含有）で抽出する。次いで、サンプルを約1,000×gで遠心分離し、そして上清を勾配HPLCにより分析する。代表的なアッセイ手順を以下に記載する。
200μLの血漿を、200μLのアセトニトリル中0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）および10μLの塩化亜鉛50％水溶液で沈殿させ、ボルテックスし、次いで約1000×gで遠心分離し、そして上清を収集してHPLCにより分析する。
実施例31
IL-1β産生に対する全血アッセイ
本発明の化合物に対する全血アッセイのIC50値を、以下に記載される方法を使用して得る：
目的：
全血アッセイは、IL-1β（または他のサイトカイン）の産生および潜在的なインヒビターの活性を測定するための簡潔な方法である。このアッセイ系の複雑性（complexity）は、リンパの全（full）補体（complement）および炎症性細胞型の、血漿タンパク質および赤血球のスペクトルと合わせて、理想的なヒトのインビボでの生理学的状態のインビトロでの代表（representation）である。
材料：
発熱物質を含まない注射器（約30cc）
発熱物質を含まない、凍結乾燥したNa2EDTA（4.5mg／10ml管）を含む滅菌真空管
ヒト全血サンプル（約30〜50cc）
1.5mlのエッペンドルフチューブ
試験化合物のストック溶液（DMSOまたは他の溶媒中約25mM）
エンドトキシンを含まない塩化ナトリウム溶液（0.9％）およびHBSS中１mg／mlでのHBSSリポ多糖類（Sigma；Cat．# L-3012）ストック溶液
IL-1β ELISAキット（R&D Systems；Cat # DLB50）
TNFα ELISAキット（R&D Systems；Cat # DTA50）
水浴槽またはインキュベーター
全血アッセイ実験手順：
インキュベーターまたは水浴槽を30℃に設定する。血液の0.25mlのアリコートを1.5mlのエッペンドルフチューブに入れ、２つのアリコートごとに、全血サンプル管を必ず反転させる。細胞が沈降し、そして均一に懸濁していない場合、複製における差異を生じ得る。ポジティブ置換ピペットの使用もまた、複製アリコート間の差異を最小化する。
発熱物質を含まない滅菌生理食塩水による薬物の希釈液を連続希釈により調製する。ICE阻害アッセイにおいて決定された試験化合物に対する見かけのKiの限界を定める（bracket）一連の希釈液は、通常、化合物の一次スクリーニングに使用される。きわめて疎水性の化合物については、同一の血液ドナーから得られる新しい血漿によるか、または溶解性を上げるために５％のDMSOを含有するPBSによる、化合物希釈溶液を調製する。
25μlの試験化合物希釈液またはビヒクルコントロールを添加し、そしてサンプルを穏やかに混合する。次いで、5.0μlのLPS溶液（新しく調製されて保存した250ng／ml：5.0ng／mlのLPSの最終濃度）を添加し、そして再び混合する。水浴中30℃で16〜18時間、時々混合しながら管をインキュベートする。あるいは、同じインキュベーション期間、４rpmに設定した回転機（rotator）に管を設置し得る。このアッセイは、以下のコントロールとともに、二連または三連に設定するべきである：ネガティブコントロール−LPS無し；ポジティブコントロール−試験インヒビター無し；ビヒクルコントロール−最高濃度のDMSOまたは実験において使用された化合物溶媒。さらに生理食塩水を全てのコントロール管に添加して、コントロールおよび実験の全血試験サンプルの両方について、体積を規格化する。
インキュベーション期間の後、全血サンプルを微量遠心機（microfuge）中、約2000rpmで10分間遠心分離し、必要であれば、血漿を新しい微量遠心管に移し、そして1000×gで遠心分離して残余の血小板をペレットにする。血漿サンプルは、ELISAによりサイトカインのレベルについてアッセイするまで-70℃で冷凍保存され得る。
ELISA：
R & D Systems（614 McKinley Place N．E．Minneapolis、MN 55413）Quantikineキットを、IL-1βおよびTNF-αの測定のために使用し得る。アッセイを製造者の指示に従い行う。個体の１つの範囲の中のポジティブコントロールにおいて約１〜５ng／mlのIL-1βレベルが観測され得る。全てのサンプルについて血漿の１：200の希釈物は、通常、ELISAについて実験の結果がELISA標準曲線の線形範囲になるのに十分である。全血アッセイにおいて差異が観測される場合、標準希釈を最適化することが必要であり得る。Nerad、J．L．ら、J．Leukocyte Biol．、52、687〜692頁（1992）。
実施例32
ICEホモログの阻害
１．ICEホモログの単離
バキュロウイルス発現系を使用する昆虫細胞におけるTXの発現
Tx cDNA（C．Faucheuら、EMBO、14、1914頁（1995））を改変pVL1393移入ファーベクターにサブクローンし、得られるプラスミド（pVL1393／TX）をウイルスDNAとともに昆虫細胞に同時トランスフェクトし、そして組換えバキュロウイルスを同定する。高力価の組換えウイルスストックを生成した後、可視ICEアッセイを使用してTX活性について培地を試験する。代表的には、Spodoptera fruqiperda（Sf9）昆虫細胞の、５のMOIでの組換えウイルスストックによる感染が、4.7μg／mlで48時間後に最大の発現となる。ICEをこのアッセイにおける標準として使用する。
ICEまたはTXのアミノ末端にT7タグをつけたバージョン（version）も発現される。本質的に、組換えタンパク質の同定および精製を補助するために設計された、種々の構築物もまた、異なるホモログにより経験されるアポトーシスの異なるレベルの発現および相対レベルについての試験を可能にする。感染したSf9細胞（Trypan Blue除外アッセイを使用して試験される）におけるアポトーシスは、ウイルスDNA単独に感染した細胞と比較して、ICEまたはTXを発現する株において増加する。
E．coli．におけるN-末端（His） 6 -タグ化CPP32の発現および精製
Ser（29）で開始するCPP32（Fernandes-Alnemriら、前出、1994）ポリペプチドをコードするcDNAは、インフレームXhoI部位をcDNAの5’および3’末端の両方に加えたプライマーでPCR増幅され、そして得られたXhoIフラグメントは、Xho I-切断pET-15b発現ベクターに結合して、融合タンパク質のN-末端において（his）6タグとのインフレーム融合を起こす。予測組換えタンパク質は、アミノ酸配列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLEで開始し、ここでLVPRGSはトロンビン切断部位を表し、Ser（29）で開始するCPP32が続く。プラスミドを運ぶE．coli BL21（DE3）を、30℃で対数期まで増殖させ、次いで0.8mMのIPTGで誘導する。IPTG添加後２時間で細胞を回収する。溶解物を調製し、そして可溶性タンパク質をNi-アガロースクロマトグラフィーにより精製する。発現したCPP32タンパク質は全てプロセシングを受けた型である。N-末端配列決定分析は、プロセシングがAsp（175）とSer（176）との間の実部（authentic site）で生じていることを示すはずである。約50μgのCPP32タンパク質を200mlの培養物から得ることが可能である。活性部位滴定により決定されるように、精製されたタンパク質は、完全に活性である。プロテアーゼ調製物もまた、合成DEVD-AMC基質と同様PARPの切断において、インビトロで非常に活性である（Nicholsonら、1995）。
２．ICEホモログの阻害
ICEホモログに対する可逆的インヒビターのパネルの選択性が得られ得る。ICE酵素アッセイを、YVAD-AMC基質（Thornberryら、1992）を使用して、Wilsonら（1994）に従い行う。TX活性のアッセイを、ICEについて理想的な条件下で、ICE基質を使用して行う。CPP32のアッセイを、DEVD-AMC基質（Nicholsonら、1995）を使用して行う。
ICEおよびICEホモログの不可逆的インヒビターを用いる不活性化に対する二次速度定数を得る。
実施例33
アポトーシスの阻害
U937細胞におけるFas-誘導アポトーシス
化合物は、その抗-Fas-誘導アポトーシスをブロックする能力について評価され得る。RT-PCRを使用して、刺激されていないU937細胞中の、ICE、TX、ICH-1、CPP32、およびCMH-1をコードするmRNAを検出し得る。この細胞株は、アポトーシス研究に使用され得る。例えば、U937細胞を１×105細胞／mlで培地に播種し、そして約５×106細胞／mlまで増殖させる。アポトーシス実験のため、２×106細胞を1mlのRPMI-1640-10％のFBS中で、24-ウェル組織培養プレートにプレーティングし、そして100ng／mlの抗-Fas-抗原抗体（Medical and Biological Laboratories、Ltd．）で刺激する。37℃で24時間インキュベーションした後、アポトーシス細胞の割合を、ApoTag試薬を使用してFACS分析により測定する。
最初に全ての化合物を20μMで試験し、そして活性化合物で滴定を行いIC50値を決定する。
実施例34
抗炎症剤としての有効性に対するインビボ急性（acute）アッセイ
LPS-誘導IL-1β産生
LPS（20mg／kg IP）でチャレンジしたCD1マウス（例えば、１条件あたりn=6）で有効性を評価する。試験化合物を、オリーブ油：DMSO：エタノール（90：５：５）中で調製し、そしてLPSの１時間後IP注射により投与する。LPSチャレンジの７時間後、血液を採取する。血清のIL-1βレベルをELISAにより測定する。
また吸収を評価するために経口胃管栄養（gavage）により化合物を投与し得る。経口的に投与されたIL-1βの分泌を阻害する化合物は、これらの化合物のICEインヒビターとしての、そしてそれゆえに抗炎症剤としての経口での有効性の可能性を示す。
実施例35
プロドラッグの血中レベルの測定
マウスに、p．o．（経口）用量の、0.5％カルボキシメチルセルロース中で調製した化合物（例えば、50mg／kg）を投与する。血液サンプルを、投与の１時間後および７時間後に採取する。血清を、等体積の２％ギ酸含有アセトニトリルによる沈殿および続く遠心分離により抽出する。上清を、0.03〜３μg／mlの検出レベルで、液体クロマトグラフィー−質量分析（ESI-MS）により分析する。検出可能な血液レベルをこのように決定する。
実施例36
ICE阻害アッセイ-IGIF
IGIFは、実施例28で記載されたICE阻害アッセイにおいてIL-1で置換され得る。従って、ICEインヒビターのIGIF産生を減少させる能力を測定し得る。
例えば、ヒトPBMCアッセイを行うために、ヒト軟膜細胞を、血液ドナーおよびLeukoPrep管（Becton-Dickinson、Lincoln Park、NJ）での遠心分離により単離された末梢血単核球（PBMC）から得ることができる。PBMCを、24ウェルCorning組織培養プレートに添加（３×106／ウェル）し、そして37℃で１時間インキュベーションした後、穏やかに洗浄して非付着細胞を除去する。付着単核球を、２mlのRPMI-1640-10％のFBS中で、ICEインヒビターとともに、またはICEインヒビターなしで、LPS（１μg／ml）で刺激する。37℃で16〜18時間インキュベーションした後、IGIFおよびIFN-を、培養上清中ELISAにより定量する。
実施例37
化合物の抗ウイルス効果は、種々のインビトロおよびインビボアッセイにより評価され得る。例えば、化合物は、インビトロウイルス複製アッセイにおいて試験し得る。インビトロアッセイは、全細胞または単離された細胞成分を採用し得る。インビボアッセイは、ウイルス疾患に対する動物モデルを含む。そのような動物モデルの例は、HBVまたはHCV感染に対するげっ歯類（rodent）モデル、HBV感染に対するウッドチャック（Woodchuck）モデル、およびHCV感染に対するチンパンジーモデルを含むが、これらに限定されない。
ICEインヒビターもまた、食事性アルコール誘導疾患に対する動物モデルにおいて評価され得る。
実施例38〜59
実施例38〜56（表３）を、実施例２または３を調製するために使用した方法と同様の方法により調製した。実施例57〜59（表３）を、実施例１を調製するために使用した方法と同様の方法により調製した。
ICE阻害
本明細書中に記載する方法を使用して、本発明の化合物について阻害定数（Ki）およびIC50値を得た（実施例28および31を参照）。表４に、実施例11、38〜56および58〜59についてこのデータを列挙する。
マウスカラゲナン腹膜炎
代表的手順
0.5mlの生理食塩水中の10mgのカラゲナンを腹膜腔内（IP）注射してマウスに炎症を誘導する（Griswoldら、Inflammation、13、727〜739頁（1989））。薬物を、エタノール／PEG／水、β-シクロデキストリン、ラブロゾール（labrosol）／水、またはクレモフォア（cremophor）／水ビヒクル中、経口胃管栄養により投与する。カラゲナン投与の４時間後、マウスを屠殺し、次いで２mlの５U／mlヘパリン含有生理食塩水のIP注射する。腹膜を穏やかにマッサージした後、小さい切り込みを入れ、収集した内容物および体積を記録する。サンプルを、遠心分離（４℃で、130xg、８分）するまで氷上で保持し、細胞物質を除去し、そして得られる上清を-20℃で保存する。腹膜内液中のIL-1βレベルをELISAにより測定する。
実施例62
II型コラーゲン-誘導関節炎
代表的手順
II型コラーゲン誘導-関節炎は、WooleyおよびGeigerの記載によりオスのDBA／１Jマウスにおいて確立されている（Wooley、P．H．、Methods in Enzymology、162、361〜373頁（1988）およびGeiger、T．、Clinical and Experimental Rheumatology、11、515〜522頁（1993））。ひな鳥胸骨II型コラーゲン（10mM酢酸中4mg／kg）を、等体積のFreund完全アジュバント（FCA）で、16ゲージの二重ハブ針で２つの10mlガラスシリンジの間を繰り返し通す（400）ことにより乳化する。マウスを、尾付け根の反対側面に、21日後にコラーゲン乳濁液の皮内注射（501；１マウスあたり1001のCII）により免疫化する。薬物を、約７時間離して１日に２回（10、25、および50mg／kg）経口胃管栄養により投与する。使用され得るビヒクルとしては、エタノール／PEG／水、β-シクロデキストリン、ラブロゾール／水、またはクレモフォア／水が挙げられる。薬物処理は、CII追加免疫化の２時間以内に開始する。炎症について、２本の前足における症状の重篤度の増加を１から４のスケールで記録し、記録を足して最終的な記録にする。
実施例63
インビボバイオアベイラビリティー決定
代表的手順
薬物（10〜100mg／kg）を、エタノール／PEG／水、β-シクロデキストリン、ラブロゾール／水、またはクレモフォア／水中で、ラットに経口投与する（10mL／kg）。血液サンプルを、投与の0.25、0.50、１、1.5、２、３、４、６、８時間後に、頸動脈から抜き取り、血漿を遠心分離し、そして分析するまで-70℃で保存する。酵素的アッセイを使用してアルデヒドの濃度を測定する。データの薬物動態的分析を、RStrip（MicroMath Software、UT）を使用して非線形回帰により行う。薬物アベイラビリティー値を以下のように決定する：（経口プロドラッグ投与後におけるAUC／薬物のi.v.投与後におけるAUC）×（i.v.投与／p.o.投与）×100％
上記の実施例のデータは、本発明による化合物がIL-1β転換酵素に対して阻害活性を示すことおよびICEがIGIFおよびIFN-γレベルを制御することを実証する。
本発明の化合物がインビトロでICEを阻害し得、そしてさらに経口で哺乳動物に送達され得る限りにおいて、それらは明らかにIL-1-、アポトーシス-、IGIF-、およびIFN-γ-媒介疾患の処置に臨床的に有用である。これらの試験は、化合物のインビボでのICEを阻害する能力の予測となる。
本発明者は、本発明の多数の実施態様を記載してきたが、本発明の製品およびプロセスを利用する他の実施態様を提供するために本発明の基本的な構成を変更しえることが、明らかである。
Claims (30)
- 以下の式（III）で表される化合物であって：
ここで：
Ｙは
であり；
但し、R5が-OHの場合、Ｙはまた：
であり得；
Ｃはアリールまたはヘテロアリール環であり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じて-R4で置換され；
R1は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R2は結合、-C（O）-、-C（O）C（O）-、-S（O）2-、-OC（O）-、-N（H）C（O）-、-N（H）S（O）2-、-N（H）C（O）C（O）-、-CH=CHC（O）-、-OCH2C（O）-、-N（H）CH2C（O）-、-N（R19）C（O）-、-N（R19）S（O）2-、-N（R19）C（O）C（O）-、-N（R19）CH2C（O）-、または-C（O）C（=NOR11）-であり、但しR2が結合でない場合、R2は７員環NH基にカルボニルまたはスルホニルを介して結合され；
R3は-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキル、-N（アルキル）2、
であり；
R4は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）（アルキル）、-N（アルキル）2、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル-、-C（O）アルキル、-CH2NH2、-CH2N（H）アルキル、またはCH2N（アルキル）2であり；
R5は-OH、-OR8、または-N（H）OHであり；
R6は-H、-CH2OR9、-CH2OR9、-CH2SR10、-CH2NHR9、-CH2N（R9）R12、-C（H）N2、-CH2F、-CH2Cl、-C（O）N（R11）R12、-R13、または-R14であり；
R8は-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、またはアルキルヘテロ環であり；
R9は-H、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-P（O）R15R16であり；
R10は-アルキルアリール、-アリール、-ヘテロアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
各R11およびR12は独立して、-H、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R13は-アルキルアリール、-アルケニルアリール、-アルキニルアリール、または-アルキルヘテロアリールであり；
R14は
ここで、（i）に結合する任意の水素は必要に応じてR17と置換され、そして（ii）に結合する任意の水素は必要に応じてR17、R18またはR20と置換され；
各R15およびR16は独立して、-H、-OH、-アルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-シクロアルキル、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-Ｏアルキル、-Ｏアリール、-Ｏヘテロアリール、-Ｏアルキルアリール、または-Ｏアルキルヘテロアリールであり；
R17は-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-CN、-NH2、-CO2H、-C（O）NH2、-N（H）C（O）H、-N（H）C（O）NH2、-S（O）2NH2、-C（O）H、-アルキル、-シクロアルキル、-パーフルオロアルキル、-O-アルキル、-N（H）アルキル、-N（アルキル）2、-CO2アルキル、-C（O）N（H）アルキル、-C（O）N（アルキル）2、-N（H）C（O）アルキル、-N（H）C（O）N（H）アルキル、-N（H）C（O）N（アルキル）2、-S（O）2N（H）アルキル、-S（O）2N（アルキル）2、-S-アルキル、-S（O2）アルキル、または-C（O）アルキルであり；
R18は-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、-O-アリール、-O-ヘテロアリール、-O-アルキルアリール、-O-アルキルヘテロアリール、-N（H）アリール、-N（アリール）2、-N（H）ヘテロアリール、-N（ヘテロアリール）2、-N（H）アルキルアリール、-N（アルキルアリール）2、-N（H）アルキルヘテロアリール、-N（アルキルヘテロアリール）2、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-S-アルキルアリール、-S-アルキルヘテロアリール、-C（O）アリール、-C（O）ヘテロアリール、-C（O）アルキルアリール、-C（O）アルキルヘテロアリール、-CO2アリール、-CO2ヘテロアリール、-CO2アルキルアリール、-CO2アルキルヘテロアリール、-C（O）N（H）アリール、-C（O）N（アリール）2、-C（O）N（H）ヘテロアリール、-C（O）N（ヘテロアリール）2、-C（O）N（H）アルキルアリール、-C（O）N（アルキルアリール）2、-C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-C（O）N（アルキルヘテロアリール）2、-S（O）2-アリール、-S（O）2-ヘテロアリール、-S（O）2-アルキルアリール、-S（O）2アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（H）アリール、-S（O2）N（H）ヘテロアリール、-S（O2）N（H）アルキルアリール、-SO）2N（H）アルキルヘテロアリール、-S（O）2N（アリール）2、-S（O）2N（H）（ヘテロアリール）2、-S（O）2N（アルキルアリール）2、-S（O）2N（アルキルヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（H）アリール、-N（H）C（O）N（H）ヘテロアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルアリール、-N（H）C（O）N（H）アルキルヘテロアリール、-N（H）C（O）N（アリール）2、-N（H）C（O）N（ヘテロアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルアリール）2、-N（H）C（O）N（アルキルヘテロアリール）2であり；
R19は-H、-アルキル、-シクロアルキル、-アリール、-ヘテロアリール、-アルキルアリール、-アルキルヘテロアリール、または-アルキルヘテロ環であり；
R20は-アルキル-R18であり；
ｍは０または１であり；そして
ＸはＯまたはＳである、化合物。 - 請求項１に記載の化合物であって、
ここで：
Ｃはベンゾ、ピリド、チエノ、ピロロ、フロ、イミダゾ、チアゾロ、オキサゾロ、ピラゾロ、イソチアゾロ、イソキサゾロ、またはトリアゾロであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素が必要に応じてR4で置換される、化合物。 - 請求項２に記載の化合物であって、
ここで：
Ｙは
であり；
Ｃはベンゾであり、ここで任意の環原子に結合した任意の水素は必要に応じてR4で置換され；
R1は-フェニル、-ナフチル、または-イソキノリニルであり、ここでR17は-OH、-NH2、-Cl、-F、-Ｏアルキル、または-N（アルキル）2であり；
R2は-C（O）-、-S（O）2-、-C（O）C（O）-、または-CH2C（O）-であり；
R3は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-フェニル、-2-ピリジニル、-3-ピリジニル、-4-ピリジニル、または-チアゾリルであり；
R4は-フルオロまたは-クロロであり；
R5は-OHであり；
R6は-Hまたは-R14であり、ここでＸ＝Ｏであり；
但し、-R14が（i）の場合、R17は-Ｏアルキル、-Fまたは-Clであり、そして
但し、-R14が（ii）の場合、R18は-アリールであり、ここでアリールはフェニルであり；
R7は-C（O）アルキルであり；
R8は-メチル、-エチル、-n-プロピル、-イソプロピル、-シクロペンチル、-フェネチル、または-ベンジルであり；
Ｘ＝Ｏであり；
ｍ＝０である、化合物。 - 以下の式から選択される請求項３に記載の化合物：
- IL-1媒介疾患を処置または予防するために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含有する薬学的組成物。
- 前記IL-１媒介疾患が骨関節炎、急性膵炎、慢性膵炎、喘息、および成人呼吸窮迫症候群からなる群から選択される炎症性疾患である、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記炎症性疾患が骨関節炎または急性膵炎である、請求項６に記載の薬学的組成物。
- 前記IL-1媒介疾患が、糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーヴス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、慢性活性肝炎、重症筋無力症、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、および対宿主性移植片病からなる群から選択される自己免疫性疾患である、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記自己免疫性疾患が、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、またはクローン病、または乾癬である、請求項８に記載の薬学的組成物。
- 前記IL-1媒介疾患が骨粗鬆症または多発性骨髄腫関連骨疾患からなる群から選択される骨破壊疾患である、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記IL-1媒介疾患が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポジ肉腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される増殖性障害である、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記IL-1媒介疾患が、敗血症、敗血症ショック、および細菌性赤痢からなる群から選択される感染性疾患である、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記IL-1媒介疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血および心筋虚血からなる群から選択される変性または壊死性疾患である、請求項５に記載の薬学的組成物。
- 前記変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
- アポトーシス媒介疾患を処置または予防するために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含有する薬学的組成物。
- 前記アポトーシス媒介疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、心筋虚血、棘筋萎縮症、多発性硬化症、AIDS関連脳炎、HIV関連脳炎、老化、脱毛症、および脳卒中による神経学的損傷からなる群から選択される変性疾患である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
- ICE媒介機能を阻害するために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- IGIF産生を減少させるために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- IFN-γ産生を減少させるために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 食事性アルコール過摂取（excess dietary alcohol intake）により媒介される疾患を処置または予防するために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- ウイルスにより媒介される疾患を処置または予防するために有効な量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 前記ウイルスがHBV、HCV、HGV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、または日本脳炎ウイルスである、請求項２１に記載の薬学的組成物。
- 患者における、IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、炎症性疾患、自己免疫性疾患、骨破壊疾患、増殖性障害、感染性疾患、変性疾患、壊死性疾患、食事性アルコール過摂取疾患、ウイルス媒介疾患、骨関節炎、膵炎、喘息、成人呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーヴス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、慢性活性肝炎、重症筋無力症、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、対宿主性移植片病、骨粗鬆症、多発性骨髄腫関連骨障害、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、敗血症、敗血症ショック、細菌性赤痢、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、心筋虚血、脊椎筋萎縮症、多発性硬化症、AIDS関連脳炎、HIV関連脳炎、老化、脱毛症、脳卒中による神経学的損傷、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｇ型肝炎、黄熱、デング熱、または日本脳炎から選択される疾患の処置または予防のための、請求項５〜１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
- 前記疾患が骨関節炎、急性膵炎、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、またはアルツハイマー病である、請求項２３に記載の組成物。
- 患者におけるICE媒介機能を阻害するための、請求項１７に記載の薬学的組成物。
- 患者におけるIGIFまたはIFN-γ産生を減少させるための、請求項１８または１９に記載の薬学的組成物。
- 以下から選択される疾患を処置または予防するのに使用する医薬の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用：IL-1媒介疾患、アポトーシス媒介疾患、炎症性疾患、自己免疫性疾患、骨破壊疾患、増殖性障害、感染性疾患、変性疾患、壊死性疾患、食事性アルコール過摂取疾患、ウイルス媒介疾患、骨関節炎、膵炎、喘息、成人呼吸窮迫症候群、糸球体腎炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、硬皮症、慢性甲状腺炎、グレーヴス病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、血小板減少症、慢性活性肝炎、重症筋無力症、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、対宿主性移植片病、骨粗鬆症、多発性骨髄腫関連骨障害、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、転移性メラノーマ、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、敗血症、敗血症ショック、細菌性赤痢、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性虚血、心筋虚血、脊椎筋萎縮症、多発性硬化症、AIDS関連脳炎、HIV関連脳炎、老化、脱毛症、脳卒中による神経学的損傷、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｇ型肝炎、黄熱、デング熱、または日本脳炎。
- 前記疾患が骨関節炎、急性膵炎、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、またはアルツハイマー病である、請求項２７に記載の使用。
- 患者におけるICE媒介機能を阻害する医薬の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
- 患者におけるIGIFまたはIFN-γ産生を減少させる医薬の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
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