JP4244628B2 - Cell-free protein synthesis method and extract for the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する、新規な無細胞系のタンパク質合成方法およびそのための抽出液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成としては、たとえば、小麦胚芽の抽出液や大腸菌の抽出液を用いる方法が知られている。
【０００５】
しかし、小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成では、抽出液の抽出操作が一般に極めて煩雑であるという欠点がある。
小麦胚芽の抽出液の調製方法の一例として、たとえば、特許文献１には、以下のような手順が記載されている。小麦種子をミルに添加し、破砕した後、篩で粗胚芽画分を得、四塩化炭素とシクロヘキサン混液（四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．５：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を浮上する画分から回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去する。この胚芽画分に混在する種皮などの不純物を静電気帯電体を用いて吸着除去する。次に、この試料から小麦胚乳成分を完全に除去するため、非イオン性界面活性剤であるＮＰ４０の０．５％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返す。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄を行い、小麦胚芽を純化する。
このように小麦胚芽の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、抽出液の調製が煩雑であり、多大な時間と労力を要するという不具合がある。
【０００６】
また大腸菌の抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成では、大腸菌が原核生物であるため、タンパク質への糖鎖修飾を行うことができず、糖タンパク質を合成することができないという欠点がある。上記糖鎖修飾によりタンパク質に付加される糖鎖は、物質間や細胞間の認識や接着に関与するシグナルやリガンドとして、タンパク質自身の機能調節因子として、またはタンパク質の保護や安定化因子として機能しているものと考えられる。そのため、糖鎖修飾を受けるタンパク質について生体内の機能を解析するためには、糖鎖修飾を受けたタンパク質（糖タンパク質）を取得することが必要であり、タンパク質への翻訳の後に糖鎖修飾も行えるような無細胞系のタンパク質合成が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−２３６８９６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、反応液の調製が容易であり、糖タンパク質の合成も可能である無細胞系タンパク質合成方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、外来鋳型ＤＮＡとを少なくとも含有する抽出液を用い、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タンパク質合成方法であって、
カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、外来鋳型ＤＮＡとを少なくとも含有する抽出液は、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分にＲＮＡポリメラーゼ及び外来鋳型ＤＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成方法。
（２）上記抽出液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含有するものである、上記（１）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（３）上記抽出液に、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも添加してなる反応液を用いるものである、上記（１）または（２）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（４）カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する液状組成物を用い、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タンパク質合成方法であって、
カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する液状組成物は、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織をプロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、及び
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分にＲＮＡポリメラーゼを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成方法。
（５）上記液状組成物に、外来鋳型ＤＮＡ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも添加してなる反応液を用いるものである、上記（４）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（６）カイコ組織が、カイコ幼虫の絹糸腺を少なくとも含有する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（７）カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも含有する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（８）カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する上記（１）〜（５）のいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（９）カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する上記（６）に記載の無細胞系タンパク質合成方法。
（１０）カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、外来鋳型ＤＮＡとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分にＲＮＡポリメラーゼ及び外来鋳型ＤＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成用抽出液。
（１１）さらにプロテアーゼインヒビターを含有するものである、上記（１０）に記載の抽出液。
【００１０】
なお本明細書において「カイコ」は、カイコガ科に属する鱗翅目昆虫（絹糸昆虫）と同義であり、その一生において「卵（胚）」（産卵直後より孵化直前までの間）、「幼虫」（孵化直後から繭の形成終了直前（１齢期〜５齢期に分けられる））、「蛹」（繭の形成終了直前から羽化する直前までの間）、ならびに「成虫（蛾）」（羽化直後より死亡までの間）の各状態を経るものであり、その一生にわたる形態のいずれをも含むものとする。
カイコは、卵より孵化した後の幼虫の状態では、桑を食べて発育する期間（齢）と、食べずに脱皮の準備をする期間（眠）を交互に繰り返す。カイコの幼虫において、孵化してから１回目の脱皮までを１齢期、１回目の脱皮から２回目の脱皮までを２齢期といい、通常、４回脱皮して５齢期で成熟する（この成熟した状態のカイコ幼虫は「熟蚕」とも呼ばれる）。カイコの幼虫は、熟蚕になると体が透明になり絹糸を吐いて繭を形成し、蛹化する。蛹の後、羽化して成虫となる。
【００１１】
本明細書における「絹糸腺」は、カイコ幼虫の両体側において、頭部の下唇先端に位置する吐出口から盲管にまで連なる一対の管状の外分泌腺であり、前部絹糸腺、中部絹糸腺および後部絹糸腺に大きく分けられる。後部絹糸腺は、絹糸の中心部を為すフィブロインを分泌する。また中部絹糸腺は、セリシンを分泌する。フィブロインは中部絹糸腺に蓄積されるとともに、セリシンによってその外周を覆われて、ゲル状の絹物質となる。この絹物質は、前部絹糸腺を通って吐出口から排出され、固体化して絹糸となる。
【００１２】
本明細書における「脂肪体」は、カイコ幼虫において、体内の至るところに分布し、白色の柔らかい扁平な帯状、ひも状あるいは葉状の組織である。脂肪体は、ヒトの肝臓に似て栄養、エネルギー源を貯蔵する役目を果たしているので、細胞内には脂肪球、タンパク質、グリコーゲンその他の新陳代謝に関係する種々の物質を含んでいる。
【００１３】
本明細書における「胚」は、カイコの卵の状態の組織を指すものとする。
【００１４】
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、外来鋳型ＤＮＡよりｍＲＮＡを転写する転写工程と、該転写工程で得られたｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する翻訳工程とを含む、無細胞転写翻訳系によるタンパク質合成を指すものとする。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる抽出液に含有される「カイコ組織由来の抽出物」は、カイコの一生のうちのどの状態（卵、幼虫（１齢期〜５齢期）、蛹、成虫）のいずれの組織由来であってもよい。またカイコ組織は、単一の状態における単一の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺のみ）由来に限らず、単一の状態における複数の組織（たとえば、５齢期のカイコ幼虫における後部絹糸腺および脂肪体）由来であってもよく、複数の状態における単一の組織（たとえば、３齢期、４齢期、５齢期の各カイコ幼虫における後部絹糸腺）由来であってもよいものとする。無論、複数の状態における複数の組織由来であってもよい。
なお上記「カイコ組織由来の抽出物」は、カイコの組織の全体（たとえば、後部絹糸腺全体）からの抽出物である必要はない。
【００１６】
本発明における抽出液中のカイコ組織由来の抽出物の含有量に特に制限はないが、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有するものであるのが好ましく、中でも１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するものであるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しずらい虞があるためである。
【００１７】
なお上記範囲の量のカイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液は、抽出液のタンパク質濃度測定を利用して、調製できる。当該タンパク質濃度測定は、当分野において通常行われているように、たとえばＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ製）を使用し、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する、といった手順によって行う。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する。
【００１８】
上記カイコ組織としては、カイコ幼虫の絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれかを含有していることが望ましい。抽出液中にカイコ幼虫由来の絹糸腺、脂肪体およびカイコの胚から選ばれる少なくともいずれかが含有されているか否かは、たとえばアルドラーゼについてのアイソザイム解析を行うことによって判別することができる（Nagaokaら(1995)、Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-825）。
【００１９】
カイコ幼虫の絹糸腺由来の抽出物、特には後部絹糸腺由来の抽出物を少なくとも含有すると、短時間で大量のタンパク質が合成可能であるというような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。
【００２０】
カイコ幼虫の脂肪体由来の抽出物は、脂肪体が柔らかい組織であるために、すり潰す作業が短時間で済み、結果として容易に抽出液を調製できる、というような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。なお脂肪体については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて脂肪体由来のタンパク質であるＳＰ−１、ＳＰ−２などを検出することによっても、抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００２１】
カイコの胚由来の抽出物は、胚が１つの個体であるために、他の組織とは異なり摘出する作業を要さず、結果として容易に抽出液を調製できる、というような特に優れた利点を有する無細胞系タンパク質合成用抽出液を実現できる上で好ましい。なおカイコの胚については、上記アイソザイム解析以外に、抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて胚由来のタンパク質である３０Ｋ、ＥＳＰ、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｈ）、Ｖｉｔｅｌｌｉｎ（Ｌ）などを検出することによっても、抽出液中に含有されているか否かを判別することができる。
【００２２】
抽出物がカイコ幼虫の後部絹糸腺または脂肪体由来である場合、カイコ幼虫の１齢期〜５齢期のものであれば、特に制限なく本発明に使用できるが、当該後部絹糸腺または脂肪体は、５齢期のカイコ幼虫由来であるのが好ましい。これは、５齢期のカイコ幼虫においては、後部絹糸腺および脂肪体が１齢期〜５齢期のうちで最も成熟しており、これを用いることで他の齢期のものと比べて短時間で大量のタンパク質合成可能である、というような利点を有する。
中でも特に、絹糸の主成分である絹フィブロインを活発につくり、高いタンパク質合成能を有しているという観点から、本発明における抽出液は、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺、中でも５齢期の３日目〜７日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺からの抽出物を必須成分として含有していることが好ましい。
【００２３】
また本発明に使用する抽出液においては、外来鋳型ＤＮＡが、上記のカイコ組織由来の抽出物、及び後述のＲＮＡポリメラーゼとともに必須成分として含有される。外来鋳型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどの環状ＤＮＡであってもよいし、ＰＣＲ産物などの直鎖状ＤＮＡであってもよい。上記外来鋳型ＤＮＡは、カイコ組織に由来しない鋳型ＤＮＡを指し、目的タンパク質をコードする塩基配列と、その５’上流側に位置するプロモーター配列とを少なくとも有する。本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、カイコ組織に由来しない鋳型ＤＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、生細胞で細胞毒となるタンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよいし、また糖タンパク質をコードする塩基配列を有するものであってもよい。また本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡにおけるプロモーター配列としては、特に制限されるものではないが、たとえば、従来公知のＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列などが挙げられる。
なお本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば鋳型ＤＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来鋳型ＤＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。なお、抽出液において、含有される鋳型ＤＮＡが外来鋳型ＤＮＡであるかカイコ組織に由来する鋳型ＤＮＡであるかは、抽出液中より、フェノール−クロロホルム抽出を行ってその鋳型ＤＮＡを抽出し、その塩基配列を解析することによって判別することができる。
【００２４】
また、本発明に用いる外来鋳型ＤＮＡは、上記目的タンパク質をコードする塩基配列の３’下流側に転写を終結させる機能を有するターミネーター配列、および／または、合成されたｍＲＮＡの安定性などの観点からポリＡ配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、従来公知のＴ７ターミネーター配列、ＳＰ６ターミネーター配列、Ｔ３ターミネーター配列などが挙げられる。
【００２５】
また上記抽出液中において、外来鋳型ＤＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来鋳型ＤＮＡが１μｇ／ｍＬ未満の場合、該外来鋳型ＤＮＡが抽出液中で不安定となり、また１０ｍｇ／ｍＬを越える場合には、粘性があがり操作性が悪くなる。また、外来鋳型ＤＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０ｍｇ／ｍＬを越えると、これを用いたタンパク質合成の際にタンパク質合成の速度が低下する傾向にある。
【００２６】
このようなカイコ組織由来の抽出物と外来鋳型ＤＮＡと後述のＲＮＡポリメラーゼとを含有する抽出液を用いて、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成することによって、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間にて合成することが可能となる。また、真核生物であるカイコ由来の抽出物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。
さらに、本発明に用いる抽出液は、後述するように従来の小麦胚芽からの抽出液の調製と比較して格段に容易に調製することができ、効率的な無細胞系タンパク質合成を実現できる。
また本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、ＤＮＡをそのまま鋳型としてタンパク質合成反応に使用し転写工程をも無細胞系で行うものである。これにより本発明においては、従来一般的であった無細胞系での翻訳工程のみによってｍＲＮＡからタンパク質を合成する方法とは異なり、使用するｍＲＮＡの調製のための作業（たとえば、外来鋳型ＤＮＡを生細胞に導入しｍＲＮＡを合成させる、または、インビトロ転写系によりｍＲＮＡを合成した後、得られたｍＲＮＡを精製するなどの作業）が不要であり、容易に反応液の調製を行うことができる。またｍＲＮＡはＤＮＡと比較して分解され易く、これを用いた無細胞系タンパク質合成用の反応液は保存安定性に劣るが、本発明においては分解されにくく安定なＤＮＡを使用するので、安定な反応液を調製することができるという利点もある。
【００２７】
また本発明に使用する抽出液は、上記のカイコ組織由来の抽出物および外来鋳型ＤＮＡと、後述のＲＮＡポリメラーゼとに加えて、プロテアーゼインヒビターをさらに含有することが好ましい。プロテアーゼインヒビターをさらに含有することによって、調製が容易であり、タンパク質（糖タンパク質も含む）の合成を効率的に行うことができる。これは、プロテアーゼインヒビターによりカイコ組織由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパク質の不所望な分解を防止でき、結果としてカイコ組織由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるためであると考えられる。
【００２８】
このようなプロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、カイコ組織由来の抽出物を含有する抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でも、セリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。
また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類のプロテアーゼインヒビターの混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００２９】
プロテアーゼインヒビターは、上記抽出液中において、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３０】
本発明の無細胞系でのタンパク質合成においては、上記カイコ組織由来の抽出物と外来鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼとを少なくとも含有し、好ましくはプロテアーゼインヒビターをさらに含有する抽出液に、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも添加してなる反応液を用いて行うのが好ましい。
【００３１】
上記反応液は、上述した抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。
すなわち、上記反応液の全体において、カイコ組織由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、反応速度が低下する傾向にあるためである。
また、反応液の全体において、外来鋳型ＤＮＡは、０．１μｇ／ｍＬ〜８０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、３μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来鋳型ＤＮＡが０．１μｇ／ｍＬ未満または８０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００３２】
本発明に使用するＲＮＡポリメラーゼは、外来鋳型ＤＮＡが有するプロモーター配列に応じて適宜選択することができる。たとえば、外来鋳型ＤＮＡがＴ７プロモーター配列を有している場合は、その配列を認識するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。また、外来鋳型ＤＮＡが、ＳＰ６またはＴ３プロモーター配列を有している場合は、それぞれ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００３３】
ＲＮＡポリメラーゼは、当該反応液中において、ｍＲＮＡ合成の速度およびタンパク質合成の速度の観点から、０．０１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮＡポリメラーゼが０．０１Ｕ／μＬ未満であると、ｍＲＮＡの合成量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであり、またＲＮＡポリメラーゼが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００３４】
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３５】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００３６】
当該反応液中におけるシチジン５'−三リン酸（以下、「ＣＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＣＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３７】
当該反応液中におけるウリジン５'−三リン酸（以下、「ＵＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＵＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３８】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００３９】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４０】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜５００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４１】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００４２】
本発明における反応液は、さらに、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトール、ＲＮａｓｅインヒビター、スペルミジンおよび緩衝剤を含有するのが好ましい。
【００４３】
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００４４】
カリウム塩は、当該反応液中において、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００４５】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００４６】
マグネシウム塩は、当該反応液中において、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００４７】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜２０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１００ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００４８】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在するカイコ由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００４９】
上記スペルミジンは、転写における伸張反応を促進する目的で添加されるものであり、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。スペルミジンが０．０１ｍＭ未満であると、ｍＲＮＡの合成速度が低下し生成するｍＲＮＡの量が少なくなり、結果としてタンパク質合成の速度が低下するというような傾向にあるためであり、またスペルミジンが１００ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００５０】
上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出液のｐＨが好ましくは４〜１０、より好ましくは６〜８に保持されるようなものを使用するのが好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を使用するのが好ましい。
【００５１】
緩衝剤は、当該抽出液中において好適な緩衝能を保持するという観点から、１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、５ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が１ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００５２】
本発明に使用される反応液は、グリセロールを含有するのがより好ましい。グリセロールを添加すると、タンパク質合成反応においてタンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点があるためである。グリセロールを添加する場合、通常、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％となるように添加する。
【００５３】
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上述したプロテアーゼインヒビターを含む抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、さらに０．１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＣＴＰ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜５００μＭのアミノ酸成分、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含有するのが好ましい。さらには、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜２０ｍＭのＤＴＴ、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭのスペルミジン、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５（ｖ／ｖ）％〜２０（ｖ／ｖ）％のグリセロールを含有するように実現されるのが好ましい。
【００５４】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、上記のような本発明における抽出液を含有する反応液を用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。
【００５５】
転写工程の反応温度は、通常、１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の範囲内である。転写工程の反応温度が１０℃未満であると、転写の速度が低下する傾向にあり、また転写工程の反応温度が６０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
また翻訳工程の温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃の範囲内である。翻訳工程の反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また翻訳工程の反応温度が４０℃を越えると、反応に必須な成分が変性する傾向にあるためである。
本発明では、転写、翻訳工程を連続して実施し得るという観点から両工程に好適な２０℃〜３０℃の範囲で反応を行うことが特に好ましい。反応の時間は、全工程あわせて、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００５６】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【００５７】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法に使用する抽出液は、上述したようにカイコ組織由来の抽出物と、外来鋳型ＤＮＡと、ＲＮＡポリメラーゼとを少なくとも含有するものであるが、本発明は、この無細胞系タンパク質合成用の抽出液も提供するものである。本発明の抽出液は、上述した理由によりプロテアーゼインヒビターをさらに含有するものであるのが好ましい。さらには、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を含有すると、本発明の作用に必須な成分を安定に保つことができる、というような利点があるため好ましい。
【００５８】
当該抽出液中におけるカリウム塩としては、反応液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した反応液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該抽出液中に１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５９】
当該抽出液中におけるマグネシウム塩としては、反応液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した反応液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該抽出液中に０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６０】
当該抽出液中におけるＤＴＴは、上述した反応液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、当該抽出液中に０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６１】
抽出液に含有される緩衝剤としては、上述した反応液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した反応液における緩衝剤の場合と同様の観点から、当該抽出液中に５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００６２】
本発明の抽出液は、カイコ組織から抽出用液を用いて抽出したカイコ組織由来の抽出物に、外来鋳型ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼを添加して抽出液とする方法によって調製される。かかる調製方法においては、カイコ組織からの抽出を行う処理を少なくとも含有し、カイコ組織からの抽出後、精製を行う。具体的には、[1]このカイコ組織からの抽出を行う処理、[2][1]の処理で抽出して得られた液状物の上清をゲル濾過する処理、[3]ゲル濾過後の抽出液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する処理、を少なくとも含有する調製方法によって調製できる。
【００６３】
上記[1]の処理では、まず、常法にしたがって、たとえばハサミ、ピンセット、メスなどの器具を使用して、カイコより所望の組織を摘出する。この摘出によって得る後述の抽出に使用する組織量としては、特に制限はないが、通常、１ｇ〜１００ｇの範囲内である。
【００６４】
次に、摘出した組織を、たとえば液体窒素で凍結した後、−８０℃で凍結させた乳鉢を用いてすり潰し、抽出用液で抽出する。ここで使用する抽出用液は、従来公知の抽出に用いる緩衝液を特に制限なく使用することができるが、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤を含有するものを使用する。特に好ましくは、０．１ｍＭ〜１ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭ〜２００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を含有する抽出用液を使用する。
【００６５】
[2]の処理では、まず、上記[1]の処理で得た液状物を遠心分離にかける。当該遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１００００×ｇ〜５００００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行い上清を回収し、再度、上記の条件で行えばよい。遠心分離後、上清をゲル濾過する。ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液は、上記抽出用液にグリセロールを添加したものであることが好ましい。これにより、タンパク質合成に必須な成分を安定化できるというような利点がある。グリセロールは、通常、５（ｖ／ｖ）％〜４０（ｖ／ｖ）％（好ましくは、２０（ｖ／ｖ）％）となるように添加すればよい。
【００６６】
ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
【００６７】
[3]の処理では、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する。当該処理は、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、各画分について上記２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、この吸光度が１０以上の画分を分取する。このようにして得られる画分に外来鋳型ＤＮＡを添加して、抽出液を得る。外来鋳型ＤＮＡの添加は、外来鋳型ＤＮＡの含有量が上記した本発明の抽出液として好適な範囲内になるように実現される。すなわち、該抽出液中、外来鋳型ＤＮＡが好ましくは１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されるように添加される。なお本発明における抽出液は、上記２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の複数の画分を混合したものに外来鋳型ＤＮＡを添加したものであっても当然よい。
【００６８】
所望の量の上記抽出物を含有する抽出液を得るためには、通常、複数体のカイコより抽出する必要がある。抽出に供するカイコの数は、使用するカイコの状態や個体差によっても異なるが、カイコ幼虫については、繭の形成期に近づくにつれて組織の成熟に伴って、同量の抽出物を得るために要する数は少なくて済む。特に絹糸腺は、５齢期のカイコ幼虫において日を追うごとに著しく成熟するため、たとえば、５齢期の１日目で３０匹程度のカイコ幼虫からと同程度の量を５齢期の７日目では６匹〜７匹程度のカイコ幼虫から得ることができる。
【００６９】
なお本発明の抽出液は、上記の調製方法で得られると、上述したような利点を有する上で好ましいが、必ずしも上記調製方法で得られたものでなくともよい。
【００７０】
また本発明は、カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する液状組成物を用い、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タンパク質合成方法も提供する。この液状組成物に含有されるカイコ組織由来の抽出物、ＲＮＡポリメラーゼ及びプロテアーゼインヒビターは、本発明における抽出液について上述したのと同様である。また、本発明の液状組成物も、外来鋳型ＤＮＡを含有しない以外は上述したのと同様の含有量にて、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴおよび緩衝剤をさらに含有するのが好ましい。かかる液状組成物を用いた無細胞系タンパク質合成反応に際しては、反応液に外来鋳型ＤＮＡをさらに添加する以外は、上述した抽出液からの反応液の調製と同様にして行えばよい。
【００７１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１
（１）カイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出液の調製
５齢期４日目のカイコ幼虫１５匹よりハサミ、ピンセット、メスを使用して、後部絹糸腺３．０７ｇを摘出し、これを−８０℃で凍結させた乳鉢ですり潰し、下記組成の抽出用液を用いて、抽出を行った。
〔抽出用液の組成〕
・２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・２ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
抽出後、得られた液状物を遠心分離機（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３（日立工機社製）にて、３００００×ｇ、３０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。
遠心分離後、上清のみを単離し、再び３００００×ｇ、１０分間、４℃の条件にて遠心分離を行った。遠心分離後、上清のみを単離した。脱塩カラム ＰＤ−１０（アマシャム バイオサイエンス社製）に、２０％グリセロールを含む抽出用液を加えカラムを平衡化した後、上清を供給し、上記抽出用液にて溶出することによりゲル濾過を行った。
ゲル濾過後の濾液の画分を、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取して、これに４０μｇ／ｍＬの外来鋳型ＤＮＡを添加し、５齢期のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の無細胞系タンパク質合成用抽出液を得た。外来鋳型ＤＮＡとしては、下記（２）の手順にて調製したものを用いた。
得られた抽出液について、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、タンパク質濃度を測定した。まず反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、ＢＳＡを用い、検量線を作成した。
抽出液中におけるカイコ幼虫の後部絹糸腺の含有量は、タンパク質濃度で１７．５ｍｇ／ｍＬであった。
【００７２】
（２）外来鋳型ＤＮＡの調製
以下の手順にしたがって、外来鋳型ＤＮＡを調製した。
まず、ＴＮＴ Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）に付属のルシフェラーゼＴ７コントロールＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡績社製）を、常法に従い形質転換した。形質転換後の大腸菌をＬＢ培地８０ｍｌで３７℃、１２時間培養し、得られた菌体から、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プロトコルに従いプラスミドＤＮＡを調製した。
【００７３】
（３）無細胞系タンパク質合成
上記（１）で調製した抽出液を用いて、下記の組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来鋳型ＤＮＡ：２０μｇ／ｍＬ）
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１０ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．２ｍＭ ＡＴＰ
・０．２ｍＭ ＧＴＰ
・０．２ｍＭ ＵＴＰ
・０．２ｍＭ ＣＴＰ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・４００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・２００μＭ アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ スペルミジン
・１Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、ＣＴＰ（シグマ社製）、ＵＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度は２０℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ製）を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００７４】
図１は、実施例１についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図１において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
図１に示すように、５齢期４日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を含有する抽出液を用いた、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タンパク質合成反応では、反応時間３００分間で約２１ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００７５】
実施例２
外来鋳型ＤＮＡを８０μｇ／ｍＬ添加した以外は上記実施例１の（１）と同様にして調製した抽出液を用いて、下記の最適化した組成の反応液を調製した。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％ 抽出液（反応液中における外来鋳型ＤＮＡ：４０μｇ／ｍＬ）
・１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・１ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・１０（ｖ／ｖ）％ グリセロール
・０．２ｍＭ ＡＴＰ
・０．２ｍＭ ＧＴＰ
・０．２ｍＭ ＵＴＰ
・０．２ｍＭ ＣＴＰ
・２５ｍＭ クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ
・４０μＭ アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ スペルミジン
・２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ
・１Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、ＣＴＰ（シグマ社製）、ＵＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。
各々調製した反応液を用いて、反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用い、無細胞系のタンパク質（ルシフェラーゼ）の合成反応を行った。反応液量は２５μＬとした。反応温度は２０℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。
合成されたルシフェラーゼは、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ製）を用いて各々定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
【００７６】
図２は、実施例２についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図２において、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
図２に示すように、５齢期４日目のカイコ幼虫の後部絹糸腺由来の抽出物を含有し、最適化した組成の反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応では、反応時間４２０分間で約１４６ｎｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成されていた。
【００７７】
【発明の効果】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば、反応液の調製が容易であり、糖タンパク質の合成も可能である、転写工程を含む無細胞系タンパク質合成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。
【図２】実施例２についての、反応時間に対するルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は反応時間（分）を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel cell-free protein synthesis method for synthesizing a protein from foreign template DNA via transcription and translation, and an extract for the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, genetic information of many organisms including the human genome has been decoded. Under such circumstances, functional analysis of proteins corresponding to these genetic information and genome drug discovery are attracting attention as post-genome research. In order to apply and use proteins corresponding to these genetic information in medicines, it is necessary to synthesize huge types of proteins easily in a short time.
[0003]
At present, expression systems using living cells such as yeast and insect cells (hereinafter sometimes referred to as “cell systems”) are widely used as protein production methods by genetic recombination techniques. However, living cells tend to exclude foreign proteins in order to maintain self-function, and there are many proteins that are difficult to express, such as when cells express no cytotoxic proteins in living cells.
[0004]
On the other hand, as a protein production method that does not use a cell system, a genetic information translation system for organisms is prepared in a test tube by adding a substrate or an enzyme to a cell lysate or extract, and mRNA that encodes the target protein is used. Thus, cell-free protein synthesis is known in which a synthetic system capable of combining amino acids with the required number of residues in the desired order is reconstructed. Such cell-free protein synthesis is less subject to the limitations of the above-mentioned cell-based protein synthesis, and can synthesize proteins without losing the lives of living organisms. Since it is not accompanied, protein synthesis can be performed in a short time compared with the cell system. Furthermore, cell-free protein synthesis is expected to be a promising expression method because it enables mass production of proteins consisting of amino acid sequences that are not utilized by living organisms. As such cell-free protein synthesis, for example, a method using an extract of wheat germ or an extract of Escherichia coli is known.
[0005]
However, cell-free protein synthesis using an extract of wheat germ has a drawback that the extraction operation of the extract is generally very complicated.
As an example of a method for preparing an extract of wheat germ, for example, Patent Document 1 describes the following procedure. After adding wheat seeds to the mill and crushing, the crude germ fraction is obtained with a sieve, and the germination ability is increased by flotation using a mixture of carbon tetrachloride and cyclohexane (carbon tetrachloride: cyclohexane = 2.5: 1). The germs that have them are collected from the floating fraction, and the organic solvent is removed by drying at room temperature. Impurities such as seed coat mixed in the embryo fraction are adsorbed and removed using an electrostatically charged body. Next, in order to completely remove the wheat endosperm components from this sample, it is suspended in a 0.5% solution of NP40, which is a nonionic surfactant, and washed using an ultrasonic cleaner until the cleaning solution does not become cloudy. repeat. Ultrasonic cleaning is performed once again in the presence of distilled water to purify the wheat germ.
As described above, cell-free protein synthesis using an extract of wheat germ has a problem that the preparation of the extract is complicated and requires a lot of time and labor.
[0006]
In addition, cell-free protein synthesis using an E. coli extract has the disadvantage that since E. coli is a prokaryotic organism, sugar chain modification to the protein cannot be performed and glycoproteins cannot be synthesized. The sugar chain added to the protein by the above sugar chain modification functions as a signal or ligand involved in recognition and adhesion between substances or cells, as a function regulator of the protein itself, or as a protein protection or stabilization factor. It is thought that. Therefore, in order to analyze the in vivo function of a protein that undergoes sugar chain modification, it is necessary to obtain a protein that has undergone sugar chain modification (glycoprotein). Cell-free protein synthesis that can be performed is desired.
[0007]
[Patent Document 1]
JP 2000-236896 A
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in order to solve the above-described problems, and the object of the present invention is to provide a cell-free protein synthesis method in which a reaction solution can be easily prepared and glycoproteins can be synthesized. It is to be.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
  As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  (1) an extract derived from silkworm tissue;RNA polymerase,Cell-free protein synthesis method for synthesizing protein from foreign template DNA via transcription and translation using an extract containing at least foreign template DNABecause
An extract containing at least an extract derived from silkworm tissue, RNA polymerase, and foreign template DNA,
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
Cell-free protein synthesis method obtained by a preparation method comprising at least a step of adding RNA polymerase and foreign template DNA to the collected fraction.
  (2) The cell-free protein synthesis method according to (1), wherein the extract further contains a protease inhibitor.
  (3) In the above extractAA reaction solution comprising at least a denosin triphosphate, guanosine triphosphate, cytidine 5′-triphosphate, uridine 5′-triphosphate, creatine phosphate, creatine kinase, amino acid component and tRNA is used. The cell-free protein synthesis method according to (1) or (2) above.
  (4) an extract derived from silkworm tissue;RNA polymerase,Cell-free protein synthesis method using a liquid composition containing at least a protease inhibitor and synthesizing protein from foreign template DNA via transcription and translationBecause
A liquid composition containing at least an extract derived from silkworm tissue, an RNA polymerase, and a protease inhibitor,
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction solution containing a protease inhibitor to obtain a liquid containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant, and
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
Cell-free protein synthesis method obtained by a preparation method comprising at least a step of adding RNA polymerase to the collected fraction.
  (5) Foreign template DNA in the liquid compositionAA reaction solution comprising at least a denosin triphosphate, guanosine triphosphate, cytidine 5′-triphosphate, uridine 5′-triphosphate, creatine phosphate, creatine kinase, amino acid component and tRNA is used. The cell-free protein synthesis method according to (4) above.
  (6) The cell-free protein synthesis method according to any one of (1) to (5) above, wherein the silkworm tissue contains at least silkworm glands of silkworm larvae.
  (7) The cell-free protein synthesis method according to any one of (1) to (5), wherein the silkworm tissue contains at least a silkworm larvae fat body.
  (8) The cell-free protein synthesis method according to any one of the above (1) to (5), wherein the silkworm tissue contains at least silkworm embryos.
  (9) The cell-free protein synthesis method according to (6), wherein the silkworm tissue contains at least the posterior silk gland of a silkworm larva.
  (10) an extract derived from silkworm tissue;RNA polymerase,Cell-free protein synthesis extract containing at least a foreign template DNABecause
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
Extract for cell-free protein synthesis obtained by a preparation method comprising at least a step of adding RNA polymerase and foreign template DNA to the collected fraction.
  (11) The extract according to (10) above, which further contains a protease inhibitor.
[0010]
In the present specification, “silkworm” is synonymous with lepidopterous insects (silk insects) belonging to the family Bombycidae. In its lifetime, “egg (embryo)” (from just after spawning to just before hatching), “larva” ( Immediately after hatching, immediately before the end of wing formation (divided into 1st to 5th stage)), 蛹 (from the time immediately before wing formation to just before emergence), and "adult (wing)" (immediately after emergence) (Until death), and includes all of its life-long forms.
In the state of larvae after hatching from eggs, silkworms alternate between the period of growing by eating mulberry (age) and the period of preparing for molting without eating (sleeping). In the silkworm larvae, the period from hatching to the first molting is called the 1st instar period, and the period from the 1st molting to the 2nd molting is called the 2nd instar stage. This mature silkworm larva is also called "ripe". Silkworm larvae become transparent when they become mature and spit out silk to form cocoons and hatch. After the pupae, they emerge and become adults.
[0011]
The “silk gland” in the present specification is a pair of tubular exocrine glands that continue from the discharge port located at the tip of the lower lip of the head to the blind tube on both sides of the silkworm larvae. It is roughly divided into glands and posterior silk glands. The posterior silk gland secretes fibroin, which forms the center of the silk thread. The middle silk gland also secretes sericin. Fibroin accumulates in the middle silk gland, and its outer periphery is covered with sericin to form a gel-like silk substance. This silk substance is discharged from the outlet through the front silk gland and solidifies into a silk thread.
[0012]
In the present specification, the “fatty body” is a white soft flat band-like, string-like or leaf-like tissue that is distributed throughout the body in the silkworm larva. The fat body plays a role of storing nutrients and energy sources similar to the human liver, and therefore contains fat globules, proteins, glycogen, and other substances involved in metabolism in the cells.
[0013]
As used herein, “embryo” refers to a tissue in a silkworm egg state.
[0014]
“Cell-free protein synthesis” in the present specification includes a transcription step of transcribing mRNA from a foreign template DNA, and a translation step of synthesizing a protein by reading information on the mRNA obtained in the transcription step. It refers to protein synthesis by a transcription / translation system. Here, the “protein” synthesized in a cell-free system by the synthesis method of the present invention encompasses any molecular weight peptide composed of a plurality of amino acid residues, that is, any of low molecular weight peptides to high molecular weights. Shall. The “protein” as used herein also includes glycoproteins that are modified with a sugar chain.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The “extract derived from silkworm tissue” contained in the extract used for the cell-free protein synthesis method of the present invention is any state of the silkworm during its lifetime (egg, larvae (1st to 5th instar), cocoon , Adult tissue). The silkworm tissue is not limited to a single tissue in a single state (for example, only the posterior silk gland in a silkworm larva at the age of 5 years), but a plurality of tissues in a single state (for example, silkworms at the age of 5 years) Posterior silk gland and fat body in larvae), or derived from a single tissue in multiple states (eg, posterior silk gland in each silkworm larvae in 3rd, 4th, and 5th stages) It may be. Of course, it may be derived from a plurality of tissues in a plurality of states.
The “extract derived from silkworm tissue” does not need to be an extract from the whole silkworm tissue (for example, the entire posterior silk gland).
[0016]
Although there is no restriction | limiting in particular in content of the extract derived from the silkworm tissue in the extract in this invention, It is preferable that a protein concentration contains 1 mg / mL-200 mg / mL, and especially 10 mg / mL-100 mg / mL. It is more preferable to contain it. This is because if the content of the extract is less than 1 mg / mL in terms of protein concentration, the concentration of components essential for the action of the present invention will be low, and a sufficient synthesis reaction may not be possible. This is because if the protein content exceeds 200 mg / mL in protein concentration, the extract itself has a high viscosity and may be difficult to operate.
[0017]
An extract containing the silkworm tissue-derived extract in an amount within the above range can be prepared by measuring the protein concentration of the extract. The protein concentration is measured using, for example, BCA Protein assay Kit (manufactured by PIERCE), and 0.1 mL of the sample is added to 2 mL of the reaction reagent and reacted at 37 ° C. for 30 minutes, as is usually done in the art. , And measuring the absorbance at 562 nm. As a control, bovine serum albumin (BSA) is usually used.
[0018]
The silkworm tissue preferably contains at least one selected from silk glands of silkworm larvae, fat bodies and silkworm embryos. Whether or not at least one selected from silk glands derived from silkworm larvae, fat bodies and silkworm embryos is contained in the extract can be determined, for example, by performing isozyme analysis on aldolase (Nagaoka et al. (1995), Insect Biochem Mol Biol. 25, 819-825).
[0019]
For cell-free protein synthesis, which has a particularly excellent advantage that a large amount of protein can be synthesized in a short time when it contains at least an extract derived from the silk gland of silkworm larvae, especially an extract derived from the posterior silk gland It is preferable in that an extract can be realized.
[0020]
The extract derived from the fat body of the silkworm larvae has a particularly excellent advantage that the fat body is a soft tissue, so that the work of grinding can be done in a short time, and as a result, the extract can be easily prepared. It is preferable because an extract for cell-based protein synthesis can be realized. For fat bodies, in addition to the above isozyme analysis, the extract is subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to detect SP-1, SP-2, etc., which are proteins derived from fat bodies. It can also be determined whether or not it is contained in the extract.
[0021]
Extracts derived from silkworm embryos have a particularly excellent advantage that, since the embryo is one individual, it does not require extraction work unlike other tissues, and as a result, the extract can be easily prepared. It is preferable in that an extract for cell-free protein synthesis having the above can be realized. For silkworm embryos, in addition to the above isozyme analysis, the extract is subjected to SDS-PAGE to detect embryo-derived proteins 30K, ESP, Vitellin (H), Vitellin (L), etc. It can be discriminated whether or not it is contained.
[0022]
When the extract is derived from the posterior silk gland or fat body of the silkworm larvae, the silkworm larvae can be used in the present invention as long as they are from the 1st to 5th instar stages of the silkworm larvae. Is preferably derived from 5th instar silkworm larvae. In the silkworm larvae at the 5th instar stage, the posterior silk gland and the fat body are most matured among the 1st to 5th instar stages. It has the advantage that a large amount of protein can be synthesized in time.
In particular, from the viewpoint of actively producing silk fibroin, which is the main component of silk thread, and having a high protein synthesis ability, the extract in the present invention is the silk gland of the silkworm larvae at the 5th instar stage, especially 5th instar. It is preferable that an extract from the posterior silk gland of the silkworm larvae on the 3rd to 7th days of the season is contained as an essential component.
[0023]
  In the extract used in the present invention, the exogenous template DNA is an extract derived from the silkworm tissue described above., And RNA polymerase described belowIn addition, it is contained as an essential component. The foreign template DNA may be a circular DNA such as a plasmid DNA or a linear DNA such as a PCR product. The exogenous template DNA refers to a template DNA not derived from silkworm tissue, and has at least a base sequence encoding a target protein and a promoter sequence located 5 'upstream thereof. The foreign template DNA used in the present invention is not particularly limited as long as it is a template DNA not derived from silkworm tissue, and has a base sequence that encodes a protein that becomes a cytotoxic agent in a living cell. It may be one having a base sequence encoding a glycoprotein. Further, the promoter sequence in the exogenous template DNA used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known T7 promoter sequence, SP6 promoter sequence, T3 promoter sequence and the like.
  The foreign template DNA used in the present invention is not particularly limited in the number of bases, and all template DNAs may not have the same number of bases as long as the target protein can be synthesized. In addition, each foreign template DNA may have a plurality of bases deleted, substituted, inserted or added as long as the sequences are homologous to the extent that the target protein can be synthesized. In the extract, whether the template DNA contained is a foreign template DNA or a template DNA derived from silkworm tissue is extracted from the extract by phenol-chloroform extraction, and the template DNA is extracted. It can be determined by analyzing the base sequence.
[0024]
Further, the exogenous template DNA used in the present invention is a terminator sequence having a function of terminating transcription at the 3 ′ downstream side of the base sequence encoding the target protein and / or the stability of the synthesized mRNA. It preferably has a poly A sequence. Examples of the terminator sequence include conventionally known T7 terminator sequences, SP6 terminator sequences, T3 terminator sequences, and the like.
[0025]
In the above extract, the exogenous template DNA is preferably contained in an amount of 1 μg / mL to 10 mg / mL, more preferably 10 μg / mL to 1000 μg / mL, from the viewpoint of the rate of protein synthesis. When the exogenous template DNA is less than 1 μg / mL, the exogenous template DNA becomes unstable in the extract, and when it exceeds 10 mg / mL, the viscosity increases and the operability deteriorates. In addition, when the exogenous template DNA is less than 1 μg / mL or exceeds 10 mg / mL, the protein synthesis rate tends to decrease during protein synthesis using the template DNA.
[0026]
  Such a silkworm tissue-derived extract and foreign template DNAWith RNA polymerase described belowBy synthesizing a protein from exogenous template DNA through transcription and translation using an extract containing sucrose, it is possible to synthesize any protein, for example, a protein that becomes a cytotoxin in living cells in a short time. It becomes possible. In addition, because it uses an extract derived from the eukaryotic silkworm, it is possible to synthesize glycoproteins in a cell-free system, and many types of proteins can be synthesized without any particular limitation. .
  Furthermore, the extract used in the present invention can be prepared much more easily than the conventional preparation of an extract from wheat germ, as described later, and can realize efficient cell-free protein synthesis.
  In the cell-free protein synthesis method of the present invention, DNA is used as it is for a protein synthesis reaction as a template, and the transcription step is also performed in a cell-free system. Thus, in the present invention, unlike the conventional method of synthesizing a protein from mRNA only by a cell-free translation process, a work for preparing mRNA to be used (for example, production of foreign template DNA is performed). It is not necessary to introduce mRNA into a cell to synthesize mRNA, or to synthesize mRNA by an in vitro transcription system and then purify the obtained mRNA, and the reaction solution can be easily prepared. In addition, mRNA is more easily decomposed than DNA, and a reaction solution for cell-free protein synthesis using this is inferior in storage stability. However, in the present invention, stable DNA is used because it is difficult to decompose and is stable. There is also an advantage that a reaction solution can be prepared.
[0027]
  The extract used in the present invention is an extract derived from the silkworm tissue and a foreign template DNA.And RNA polymerase described belowIn addition, it is preferable to further contain a protease inhibitor. By further containing a protease inhibitor, preparation is easy and protein (including glycoproteins) can be efficiently synthesized. This is because the protease inhibitor inhibits the activity of the protease contained in the extract derived from silkworm tissue, and can prevent unwanted degradation of the active protein in the extract by the protease. As a result, the extract derived from silkworm tissue This is considered to be because the protein synthesis ability possessed can be effectively extracted.
[0028]
Such a protease inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of the protease. For example, phenylmethanesulfonyl fluoride (hereinafter sometimes referred to as “PMSF”), aprotinin, bestatin, leupeptin , Pepstatin A, E-64 (L-trans-epoxysuccinylleucylamide-4-guanidinobutane), ethylenediaminetetraacetic acid, phosphoramidon, etc. can be used, but the extract containing an extract derived from silkworm tissue can be used. Among these, it is preferable to use PMSF which acts as an inhibitor having high specificity for serine protease.
Further, not only one type of protease inhibitor but also a mixture of several types of protease inhibitors (protease inhibitor cocktail) may be used.
[0029]
The protease inhibitor is preferably contained in an amount of 1 mM to 50 mM, preferably 0.01 mM to 5 mM, from the viewpoint of suitably exhibiting the ability to inhibit the degradation of enzymes essential for the action of the present invention in the extract. Is more preferable. This is because if the protease inhibitor is less than 1 μM, the protease degradation activity tends not to be sufficiently suppressed, and if the protease inhibitor exceeds 50 mM, the protein synthesis reaction tends to be inhibited.
[0030]
  In the cell-free protein synthesis of the present invention, the silkworm tissue-derived extract and foreign template DNAWith RNA polymeraseIn an extract containing at least, preferably further containing a protease inhibitorAIt is carried out using a reaction solution comprising at least a denosin triphosphate, guanosine triphosphate, cytidine 5′-triphosphate, uridine 5′-triphosphate, creatine phosphate, creatine kinase, amino acid component and tRNA. Is preferred.
[0031]
The reaction solution is prepared so that the above-mentioned extract is contained in 10 (v / v)% to 80 (v / v)%, particularly 30 (v / v)% to 60 (v / v)%. It is preferable.
That is, it is preferable that the content of the silkworm tissue-derived extract is preferably 0.1 mg / mL to 160 mg / mL in terms of protein concentration in the whole reaction solution, and 3 mg / mL to 60 mg / mL. It is more preferable to prepare so that. This is because when the content of the extract is less than 0.1 mg / mL or exceeds 160 mg / mL in terms of protein concentration, the reaction rate tends to decrease.
Further, in the entire reaction solution, the exogenous template DNA is preferably contained in an amount of 0.1 μg / mL to 8000 μg / mL, and more preferably 3 μg / mL to 600 μg / mL. This is because if the exogenous template DNA is less than 0.1 μg / mL or exceeds 8000 μg / mL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
[0032]
The RNA polymerase used in the present invention can be appropriately selected according to the promoter sequence of the foreign template DNA. For example, when the foreign template DNA has a T7 promoter sequence, it is preferable to use T7 RNA polymerase that recognizes the sequence. In addition, when the foreign template DNA has an SP6 or T3 promoter sequence, it is preferable to use SP6 RNA polymerase or T3 RNA polymerase, respectively.
[0033]
The RNA polymerase is preferably contained in the reaction solution from the viewpoint of the rate of mRNA synthesis and the rate of protein synthesis, preferably 0.01 U / μL to 100 U / μL, and 0.1 U / μL to 10 U / μL. More preferably. This is because if RNA polymerase is less than 0.01 U / μL, the amount of mRNA synthesis decreases, and as a result, the rate of protein synthesis tends to decrease, and if RNA polymerase exceeds 100 U / μL, protein synthesis. This is because the reaction tends to be inhibited.
[0034]
Adenosine triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “ATP”) in the reaction solution is preferably contained in an amount of 0.01 mM to 10 mM in the reaction solution from the viewpoint of the rate of protein synthesis. It is more preferable to contain 1 mM-5 mM. This is because if ATP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the protein synthesis rate tends to decrease.
[0035]
From the viewpoint of the rate of protein synthesis, guanosine triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “GTP”) in the reaction solution is preferably contained in an amount of 0.01 mM to 10 mM. It is more preferable to contain 1 mM-5 mM. This is because if GTP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the rate of protein synthesis tends to decrease.
[0036]
Cytidine 5′-triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “CTP”) in the reaction solution is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.01 mM to 10 mM from the viewpoint of the rate of protein synthesis. More preferably, the content is 0.1 mM to 5 mM. This is because if the CTP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the protein synthesis rate tends to decrease.
[0037]
Uridine 5′-triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “UTP”) in the reaction solution is preferably contained in an amount of 0.01 mM to 10 mM in the reaction solution from the viewpoint of the rate of protein synthesis. More preferably, the content is 0.1 mM to 5 mM. This is because if the UTP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the protein synthesis rate tends to decrease.
[0038]
Creatine phosphate in the reaction solution is a component for continuously synthesizing proteins, and is blended for the purpose of regenerating ATP and GTP. From the viewpoint of protein synthesis rate, creatine phosphate is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 mM to 200 mM, more preferably 10 mM to 100 mM. This is because if creatine phosphate is less than 1 mM, sufficient amounts of ATP and GTP are difficult to regenerate, resulting in a tendency for the protein synthesis rate to decrease, and if creatine phosphate exceeds 200 mM, an inhibitory substance This is because the protein synthesis rate tends to decrease.
[0039]
Creatine kinase in the reaction solution is a component for continuously synthesizing proteins, and is formulated for the purpose of regenerating ATP and GTP together with creatine phosphate. From the viewpoint of protein synthesis rate, creatine kinase is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 μg / mL to 1000 μg / mL, and more preferably 10 μg / mL to 500 μg / mL. This is because when creatine kinase is less than 1 μg / mL, sufficient amounts of ATP and GTP are difficult to be regenerated, and as a result, the protein synthesis rate tends to decrease. When creatine kinase exceeds 1000 μg / mL, This is because it acts as an inhibitor and tends to decrease the rate of protein synthesis.
[0040]
The amino acid component in the reaction solution includes 20 types of amino acids, namely valine, methionine, glutamic acid, alanine, leucine, phenylalanine, glycine, proline, isoleucine, tryptophan, asparagine, serine, threonine, histidine, aspartic acid, tyrosine, lysine. , Glutamine, cystine and arginine at least. This amino acid also includes radioisotope labeled amino acids. Furthermore, you may contain the modified amino acid as needed. The amino acid component usually contains approximately equal amounts of each type of amino acid.
In the present invention, from the viewpoint of the rate of protein synthesis, the amino acid component is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 μM to 1000 μM, and more preferably 10 μM to 500 μM. This is because if the amino acid component is less than 1 μM or exceeds 1000 μM, the protein synthesis rate tends to decrease.
[0041]
The tRNA in the reaction solution contains approximately equal amounts of the tRNA types corresponding to the 20 amino acids. In the present invention, from the viewpoint of the rate of protein synthesis, the reaction solution preferably contains 1 μg / mL to 1000 μg / mL, more preferably 10 μg / mL to 500 μg / mL. This is because if the tRNA is less than 1 μg / mL or exceeds 1000 μg / mL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
[0042]
The reaction solution in the present invention preferably further contains a potassium salt, a magnesium salt, dithiothreitol, an RNase inhibitor, spermidine and a buffer.
[0043]
The potassium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention. For example, potassium acetate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen citrate, It can be used in a general form such as potassium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide, potassium phthalate, etc. Among them, potassium acetate is preferably used. Potassium salts act as cofactors in protein synthesis reactions.
[0044]
When the potassium salt is a monovalent potassium salt such as potassium acetate, for example, in the reaction solution, it is preferably contained in an amount of 10 mM to 500 mM, more preferably 50 mM to 150 mM. . This is because if the potassium salt is less than 10 mM or exceeds 500 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0045]
The magnesium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention. For example, magnesium acetate, magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium citrate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium iodide, magnesium lactate, It can be used in a general form such as magnesium nitrate and magnesium oxalate, and it is preferable to use magnesium acetate. Magnesium salts also act as cofactors in protein synthesis reactions.
[0046]
From the viewpoint of storage stability, the magnesium salt is preferably contained in a concentration of 0.1 mM to 10 mM, for example 0.5 mM to 3 mM, from the viewpoint of storage stability. Is more preferable. This is because if the magnesium salt is less than 0.1 mM or exceeds 10 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0047]
The dithiothreitol (hereinafter sometimes referred to as “DTT”) is blended for the purpose of preventing oxidation, and is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.1 mM to 100 mM, and 0.2 mM. More preferably, it is contained at 20 mM. This is because when DTT is less than 0.1 mM or more than 100 mM, components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0048]
The RNase inhibitor in the reaction solution prevents undesired digestion of mRNA and tRNA during the cell-free protein synthesis of the present invention by the silkworm-derived RNase mixed in the extract, thereby preventing protein synthesis. It is added for the purpose, and is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.1 U / μL to 100 U / μL, and more preferably 1 U / μL to 10 U / μL. If the RNase inhibitor is less than 0.1 U / μL, the degradation activity of RNase tends not to be sufficiently suppressed. If the RNase inhibitor exceeds 100 U / μL, the protein synthesis reaction tends to be inhibited. Because.
[0049]
The spermidine is added for the purpose of promoting an extension reaction in transcription, and is preferably contained in the reaction solution in an amount of 0.01 mM to 100 mM, and more preferably 0.05 mM to 10 mM. This is because when the spermidine is less than 0.01 mM, the mRNA synthesis rate decreases and the amount of mRNA produced decreases, and as a result, the protein synthesis rate tends to decrease, and spermidine reduces 100 mM. This is because exceeding the above range tends to inhibit the protein synthesis reaction.
[0050]
The buffering agent is blended for the purpose of imparting buffering capacity to the extract and preventing the denaturation of the extract due to a rapid change in the pH of the extract caused by, for example, addition of an acidic or basic substance. Such a buffer is not particularly limited, and for example, HEPES-KOH, Tris-HCl, acetic acid-sodium acetate, citric acid-sodium citrate, phosphoric acid, boric acid, MES, PIPES, etc. may be used. it can.
It is preferable to use a buffering agent that maintains the pH of the extract at 4 to 10, more preferably 6 to 8. This is because if the pH of the extract is less than 4 or exceeds 10, the components essential for the reaction of the present invention may be denatured. From such a viewpoint, it is preferable to use HEPES-KOH (pH 7.4) among the above.
[0051]
The buffer is preferably contained in an amount of 1 mM to 200 mM, and more preferably 5 mM to 50 mM, from the viewpoint of maintaining a suitable buffer capacity in the extract. This is because if the buffer is less than 1 mM, the pH tends to fluctuate due to the addition of an acidic or basic substance, and the extract tends to denature. If the buffer exceeds 200 mM, the salt concentration increases. This is because the components essential for protein synthesis tend to become unstable.
[0052]
The reaction solution used in the present invention more preferably contains glycerol. This is because the addition of glycerol has an advantage that components essential for protein synthesis can be stabilized in the protein synthesis reaction. When glycerol is added, it is usually added so as to be 5 (v / v)% to 20 (v / v)%.
[0053]
That is, the reaction solution used in the cell-free protein synthesis method of the present invention contains 30 (v / v)% to 60 (v / v)% of the extract containing the protease inhibitor described above, and further 0.1 U / μL-10 U / μL RNA polymerase, 0.1 mM-5 mM ATP, 0.1 mM-5 mM GTP, 0.1 mM-5 mM CTP, 0.1 mM-5 mM UTP, 10 mM-100 mM creatine phosphate, 10 μg Preferably, it contains creatine kinase / mL to 500 μg / mL, 10 μM to 500 μM amino acid component, 10 μg / mL to 500 μg / mL tRNA. Furthermore, 50 mM to 150 mM potassium acetate, 0.5 mM to 3 mM magnesium acetate, 0.2 mM to 20 mM DTT, 1 U / μL to 10 U / μL RNase inhibitor, 0.05 mM to 10 mM spermidine, 5 mM to 50 mM It is preferably realized to contain HEPES-KOH (pH 7.4), 5 (v / v)% to 20 (v / v)% glycerol.
[0054]
The cell-free protein synthesis method of the present invention is performed in a conventionally known, for example, low-temperature thermostat using the reaction solution containing the extract of the present invention as described above.
[0055]
The reaction temperature in the transfer step is usually in the range of 10 ° C to 60 ° C, preferably 20 ° C to 50 ° C. This is because if the reaction temperature in the transfer step is less than 10 ° C., the transfer speed tends to decrease, and if the reaction temperature in the transfer step exceeds 60 ° C., components essential for the reaction tend to denature. .
Moreover, the temperature of a translation process is 10 to 40 degreeC normally, Preferably it exists in the range of 20 to 30 degreeC. If the reaction temperature of the translation process is less than 10 ° C, the protein synthesis rate tends to decrease, and if the reaction temperature of the translation process exceeds 40 ° C, components essential for the reaction tend to denature. is there.
In the present invention, it is particularly preferable to carry out the reaction in the range of 20 ° C. to 30 ° C. suitable for both steps from the viewpoint that the transcription and translation steps can be carried out continuously. The reaction time is usually 1 hour to 72 hours, preferably 3 hours to 24 hours, in total for all steps.
[0056]
The amount of protein synthesized by the cell-free protein synthesis method of the present invention can be measured by measuring enzyme activity, SDS-PAGE, immunoassay, and the like. The protein that can be synthesized by the cell-free protein synthesis method of the present invention is not particularly limited.
[0057]
  As described above, the extract used for the cell-free protein synthesis method of the present invention comprises an extract derived from silkworm tissue, a foreign template DNA, and, With RNA polymeraseHowever, the present invention also provides an extract for cell-free protein synthesis. The extract of the present invention preferably further contains a protease inhibitor for the reasons described above. Furthermore, it is preferable to contain a potassium salt, a magnesium salt, DTT and a buffering agent because there is an advantage that components essential for the action of the present invention can be kept stable.
[0058]
As the potassium salt in the extract, various potassium salts described above as a component of the reaction solution, preferably potassium acetate, can be preferably used. The potassium salt is preferably contained in the extract from 10 mM to 500 mM, and more preferably from 50 mM to 200 mM, from the same viewpoint as in the case of the potassium salt in the reaction solution described above.
[0059]
As the magnesium salt in the extract, various magnesium salts described above as a component of the reaction solution, preferably magnesium acetate, can be preferably used. The magnesium salt is preferably contained in the extract from 0.1 mM to 10 mM, more preferably from 0.5 mM to 5 mM, from the same viewpoint as the magnesium salt in the reaction solution described above.
[0060]
The DTT in the extract is preferably contained in the extract from 0.1 mM to 10 mM, more preferably from 0.5 mM to 5 mM, from the same viewpoint as the DTT in the reaction solution described above. preferable.
[0061]
As the buffer contained in the extract, those similar to the above-mentioned reaction solution can be suitably used. For the same reason, it is preferable to use HEPES-KOH (pH 7.4). Moreover, it is preferable that 5 mM-200 mM are contained in the said extract, and it is more preferable that 10 mM-50 mM is contained in the said extract from the viewpoint similar to the case of the buffer in the reaction liquid mentioned above.
[0062]
  The extract of the present invention is prepared by adding an exogenous template DNA to an extract derived from a silkworm tissue extracted from a silkworm tissue using an extraction solution.And RNA polymeraseIt is prepared by the method of adding to make an extract. Such a preparation method includes at least a treatment for performing extraction from a silkworm tissue., MosquitoPurification is performed after extraction from the squid tissue. In particular,[1]Processing to extract from this silkworm tissue,[2] [1]A gel filtration of the liquid supernatant obtained by the extraction of[3]By a preparation method comprising at least a treatment for fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more from the extract after gel filtration.KeyCan be made.
[0063]
  the above[1]In this process, first, a desired tissue is extracted from a silkworm using an instrument such as scissors, tweezers, and a scalpel according to a conventional method. Although there is no restriction | limiting in particular as a tissue quantity used for the below-mentioned extraction obtained by this extraction, Usually, it exists in the range of 1g-100g.
[0064]
Next, the extracted tissue is frozen with, for example, liquid nitrogen, then ground using a mortar frozen at −80 ° C., and extracted with an extraction solution. As the extraction solution used here, a conventionally known buffer solution for extraction can be used without particular limitation, but preferably a solution containing a protease inhibitor, potassium salt, magnesium salt, DTT and a buffering agent is used. To do. Particularly preferably, 0.1 mM to 1 mM PMSF, 50 mM to 200 mM potassium acetate, 0.5 mM to 5 mM magnesium acetate, 0.5 mM to 5 mM DTT, 5 mM to 50 mM HEPES-KOH (pH 7.4) Use the extraction solution.
[0065]
  [2]First of all,[1]Centrifuge the liquid material obtained in the above process. The centrifugation is performed under the conditions normally performed in this field (10000 × g to 50000 × g, 0 ° C. to 10 ° C., 10 minutes to 60 minutes), and the supernatant is collected and again subjected to the above conditions. Just do it. After centrifugation, the supernatant is gel filtered. For gel filtration, for example, a desalting column PD-10 (Amersham Biosciences) can be suitably used. After equilibrating the column with a gel filtration buffer according to a conventional method, a sample is supplied. The gel filtration may be performed under such conditions as elution. The gel filtration buffer is preferably a solution obtained by adding glycerol to the extraction solution. Thereby, there exists an advantage that the component essential for protein synthesis can be stabilized. Glycerol is usually added so as to be 5 (v / v)% to 40 (v / v)% (preferably 20 (v / v)%).
[0066]
The filtrate obtained by gel filtration should be 0.1 mL to 1 mL as one fraction, as is done by normal gel filtration, and efficiently fractions having a high protein synthesis ability. From a viewpoint, it is preferable to make 0.4 mL-0.6 mL into 1 fraction.
[0067]
  [3]In this treatment, a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more is collected from the filtrate after gel filtration. In the treatment, for example, the absorbance at 280 nm is measured for each fraction using an instrument such as Ultraspec 3300pro (manufactured by Amersham Bioscience), and a fraction having this absorbance of 10 or more is collected. An exogenous template DNA is added to the fraction thus obtained to obtain an extract. The addition of the exogenous template DNA is realized so that the content of the exogenous template DNA falls within a range suitable for the above-described extract of the present invention. That is, the exogenous template DNA is added in the extract so as to contain preferably 1 μg / mL to 10 mg / mL, more preferably 10 μg / mL to 1000 μg / mL. The extract in the present invention may naturally be one obtained by adding a foreign template DNA to a mixture of a plurality of fractions having an absorbance at 280 nm of 10 or more.
[0068]
In order to obtain an extract containing a desired amount of the above extract, it is usually necessary to extract from a plurality of silkworms. The number of silkworms used for extraction varies depending on the condition of silkworms used and individual differences, but for silkworm larvae, it is necessary to obtain the same amount of extract as the tissue matures as it approaches the stage of silkworm formation. The number is small. In particular, the silk gland matures significantly every day in the 5th instar silkworm larvae. Therefore, for example, the same amount as about 30 silkworm larvae on the first day of the 5th instar, On the day, it can be obtained from about 6 to 7 silkworm larvae.
[0069]
It should be noted that the extract of the present invention is preferably obtained by the above-described preparation method in view of the advantages as described above, but is not necessarily obtained by the above-described preparation method.
[0070]
  The present invention also provides an extract derived from silkworm tissue,RNA polymerase,There is also provided a cell-free protein synthesis method for synthesizing a protein from foreign template DNA through transcription and translation using a liquid composition containing at least a protease inhibitor. Extract derived from silkworm tissue contained in this liquid compositionRNA polymerase andThe protease inhibitor is the same as described above for the extract in the present invention. In addition, the liquid composition of the present invention preferably further contains a potassium salt, a magnesium salt, DTT and a buffering agent in the same content as described above except that it does not contain foreign template DNA. The cell-free protein synthesis reaction using such a liquid composition may be performed in the same manner as the preparation of the reaction solution from the above-described extract solution, except that the exogenous template DNA is further added to the reaction solution.
[0071]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these are merely illustrative and do not limit the scope of the present invention.
Example 1
(1) Preparation of extract derived from silkworm gland of silkworm larvae
Using 15 scissors, tweezers, and scalpels from 15th silkworm larvae on the 4th day of 5th instar, 3.07 g of posterior silk gland was extracted and ground in a mortar frozen at −80 ° C. for extraction of the following composition Extraction was performed using the liquid.
[Composition of extraction liquid]
・ 20 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 2 mM magnesium acetate
・ 2 mM DTT
・ 0.5 mM PMSF
After extraction, the obtained liquid substance was centrifuged with a centrifuge (himacCR20B3 (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.) at 30000 × g for 30 minutes at 4 ° C.
After centrifugation, only the supernatant was isolated and centrifuged again at 30000 × g for 10 minutes at 4 ° C. Only the supernatant was isolated after centrifugation. A desalting column PD-10 (Amersham Biosciences) was added with an extraction solution containing 20% glycerol to equilibrate the column, then the supernatant was supplied and gel filtration was performed by elution with the extraction solution. Went.
Using a spectrophotometer (Ultraspec 3300pro, Amersham Biosciences), the fraction of the filtrate after gel filtration was fractionated with an absorbance at 280 nm of 10 or more, and 40 μg / mL of exogenous template DNA was obtained. Was added to obtain an extract for cell-free protein synthesis derived from the posterior silk gland of silkworm larvae at the age of 5 years. As the exogenous template DNA, one prepared by the following procedure (2) was used.
About the obtained extract, protein concentration was measured using BCA Protein assay Kit (made by PIERCE). First, 0.1 mL of a sample was added to 2 mL of the reaction reagent, reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and the absorbance at 562 nm was measured using a spectrophotometer (Ultratroc 3300pro, manufactured by Amersham Biosciences). A calibration curve was prepared using BSA as a control.
The content of the posterior silk gland of the silkworm larvae in the extract was 17.5 mg / mL in terms of protein concentration.
[0072]
(2) Preparation of exogenous template DNA
Exogenous template DNA was prepared according to the following procedure.
First, Escherichia coli JM109 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using a luciferase T7 control DNA attached to TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System (manufactured by Promega) according to a conventional method. The transformed Escherichia coli was cultured in 80 ml of LB medium at 37 ° C. for 12 hours, and plasmid DNA was prepared from the obtained cells using Plasmid Midi Kit (manufactured by QIAGEN) according to the protocol.
[0073]
(3) Cell-free protein synthesis
Using the extract prepared in (1) above, a reaction solution having the following composition was prepared.
[Composition of reaction solution]
50 (v / v)% extract (foreign template DNA in the reaction solution: 20 μg / mL)
・ 40 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 1 mM magnesium acetate
・ 10 mM DTT
・ 10 (v / v)% Glycerol
・ 0.2 mM ATP
・ 0.2 mM GTP
・ 0.2 mM UTP
・ 0.2 mM CTP
・ 25 mM creatine phosphate
・ 400μg / mL creatine kinase
・ 200μM amino acids (20 types)
・ 0.1 mM spermidine
・ 1U / μL RNase inhibitor
・ 200μg / mL tRNA
1U / μL T7 RNA polymerase
ATP (Sigma), GTP (Sigma), CTP (Sigma), UTP (Sigma), amino acids (20 types) (Sigma), T7 RNA polymerase (Promega), RNase inhibitor (Takara Shuzo) and tRNA (Roche Diagnostics) were used.
Using each prepared reaction solution, a cell-free protein (luciferase) was synthesized using a low-temperature aluminum block thermostatic chamber MG-1000 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) as a reaction apparatus. The reaction volume was 25 μL. The reaction temperature was 20 ° C., sampling was performed every reaction time, and the amount of synthesized luciferase was measured.
The synthesized luciferase was quantified using a luciferase assay kit (E-1500, manufactured by Promega). 2.5 μL of the reaction solution was added to 50 μL of the luciferase assay reagent, and luminescence by luciferase was measured using a luminometer (Turner Designs TD-20 / 20, manufactured by Promega).
[0074]
FIG. 1 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to reaction time for Example 1. In FIG. 1, the vertical axis indicates the amount of luciferase synthesis (ng / mL), and the horizontal axis indicates the reaction time (minutes).
As shown in FIG. 1, a cell-free protein that synthesizes protein from exogenous template DNA through transcription and translation using an extract containing an extract derived from the posterior silk gland of silkworm larvae on the 4th day of the 5th infancy In the synthesis reaction, about 21 ng / mL luciferase was synthesized in a reaction time of 300 minutes.
[0075]
Example 2
A reaction solution having the following optimized composition was prepared using the extract prepared in the same manner as in Example 1 (1) except that 80 μg / mL of exogenous template DNA was added.
[Composition of reaction solution]
50 (v / v)% extract (foreign template DNA in the reaction solution: 40 μg / mL)
・ 10 mM HEPES-KOH (pH 7.4)
・ 100 mM potassium acetate
・ 1 mM magnesium acetate
・ 1 mM DTT
・ 10 (v / v)% Glycerol
・ 0.2 mM ATP
・ 0.2 mM GTP
・ 0.2 mM UTP
・ 0.2 mM CTP
・ 25 mM creatine phosphate
・ 200μg / mL creatine kinase
・ 40μM amino acids (20 types)
・ 0.1 mM spermidine
・ 2U / μL RNase inhibitor
・ 200μg / mL tRNA
1U / μL T7 RNA polymerase
ATP (manufactured by Sigma), GTP (manufactured by Sigma), CTP (manufactured by Sigma), UTP (manufactured by Sigma), amino acids (20 types) (manufactured by Sigma), T7 RNA polymerase (manufactured by Promega), RNase inhibitor (Takara Shuzo) and tRNA (Roche Diagnostics) were used.
Using each prepared reaction solution, a cell-free protein (luciferase) was synthesized using a low-temperature aluminum block thermostatic chamber MG-1000 (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) as a reaction apparatus. The reaction volume was 25 μL. The reaction temperature was 20 ° C., sampling was performed every reaction time, and the amount of synthesized luciferase was measured.
The synthesized luciferase was quantified using a luciferase assay kit (E-1500, manufactured by Promega). 2.5 μL of the reaction solution was added to 50 μL of the luciferase assay reagent, and luminescence by luciferase was measured using a luminometer (Turner Designs TD-20 / 20, manufactured by Promega).
[0076]
FIG. 2 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to reaction time for Example 2. In FIG. 2, the vertical axis represents the amount of luciferase synthesis (ng / mL), and the horizontal axis represents the reaction time (minutes).
As shown in FIG. 2, in a cell-free protein synthesis reaction using an optimized reaction solution containing an extract derived from the posterior silk gland of silkworm larvae on the 4th day of the 5th infancy, the reaction time is 420 minutes. About 146 ng / mL luciferase was synthesized.
[0077]
【The invention's effect】
As is clear from the above description, according to the present invention, it is possible to provide a cell-free protein synthesis method including a transcription step, in which a reaction solution can be easily prepared and glycoproteins can be synthesized.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to reaction time for Example 1, the vertical axis shows the amount of luciferase synthesis (ng / mL), and the horizontal axis shows the reaction time (minutes).
FIG. 2 is a graph showing the amount of luciferase synthesized with respect to the reaction time for Example 2, with the vertical axis representing the amount of luciferase synthesized (ng / mL) and the horizontal axis representing the reaction time (minutes).

Claims (11)

カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、外来鋳型ＤＮＡとを少なくとも含有する抽出液を用い、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タンパク質合成方法であって、
カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、外来鋳型ＤＮＡとを少なくとも含有する抽出液は、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分にＲＮＡポリメラーゼ及び外来鋳型ＤＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成方法。A cell-free protein synthesis method for synthesizing a protein from foreign template DNA via transcription and translation using an extract containing at least an extract derived from silkworm tissue, RNA polymerase, and foreign template DNA ,
An extract containing at least an extract derived from silkworm tissue, RNA polymerase, and foreign template DNA,
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
A cell-free protein synthesis method obtained by a preparation method including at least a step of adding RNA polymerase and foreign template DNA to a collected fraction . 上記抽出液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含有するものである、請求項１に記載の無細胞系タンパク質合成方法。 The cell-free protein synthesis method according to claim 1, wherein the extract further contains a protease inhibitor. 上記抽出液に、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも添加してなる反応液を用いるものである、請求項１または２に記載の無細胞系タンパク質合成方法。In the extraction solution, A Denoshin triphosphate, guanosine triphosphate, cytidine 5'-triphosphate, uridine 5'-triphosphate, creatine phosphate, creatine kinase, at least added comprising reacting amino acid component and tRNA The cell-free protein synthesis method according to claim 1 or 2, wherein a solution is used. カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する液状組成物を用い、転写および翻訳を経て外来鋳型ＤＮＡからタンパク質を合成する無細胞系タンパク質合成方法であって、
カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、プロテアーゼインヒビターとを少なくとも含有する液状組成物は、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織をプロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、及び
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分にＲＮＡポリメラーゼを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成方法。A cell-free protein synthesis method for synthesizing a protein from foreign template DNA via transcription and translation using a liquid composition containing at least an extract derived from silkworm tissue, RNA polymerase, and a protease inhibitor ,
A liquid composition containing at least an extract derived from silkworm tissue, an RNA polymerase, and a protease inhibitor,
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction solution containing a protease inhibitor to obtain a liquid containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant, and
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
A cell-free protein synthesis method obtained by a preparation method comprising at least a step of adding RNA polymerase to a collected fraction . 上記液状組成物に、外来鋳型ＤＮＡ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン５'−三リン酸、ウリジン５'−三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分およびｔＲＮＡを少なくとも添加してなる反応液を用いるものである、請求項４に記載の無細胞系タンパク質合成方法。In the liquid composition, the foreign template DNA, A Denoshin triphosphate, guanosine triphosphate, cytidine 5'-triphosphate, uridine 5'-triphosphate, creatine phosphate, creatine kinase, amino acid component and tRNA at least The cell-free protein synthesis method according to claim 4, wherein the reaction solution is used. カイコ組織が、カイコ幼虫の絹糸腺を少なくとも含有する請求項１〜５のいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。 The cell-free protein synthesis method according to any one of claims 1 to 5, wherein the silkworm tissue contains at least silkworm glands of silkworm larvae. カイコ組織が、カイコ幼虫の脂肪体を少なくとも含有する請求項１〜５のいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。 The cell-free protein synthesis method according to any one of claims 1 to 5, wherein the silkworm tissue contains at least a silkworm larvae fat body. カイコ組織が、カイコの胚を少なくとも含有する請求項１〜５のいずれかに記載の無細胞系タンパク質合成方法。 The cell-free protein synthesis method according to any one of claims 1 to 5, wherein the silkworm tissue contains at least a silkworm embryo. カイコ組織が、カイコ幼虫の後部絹糸腺を少なくとも含有する請求項６に記載の無細胞系タンパク質合成方法。 The cell-free protein synthesis method according to claim 6, wherein the silkworm tissue contains at least a posterior silk gland of a silkworm larva. カイコ組織由来の抽出物と、ＲＮＡポリメラーゼと、外来鋳型ＤＮＡとを少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用抽出液であって、
カイコ組織を凍結する工程、
凍結したカイコ組織をすり潰す工程、
すり潰したカイコ組織を抽出用液で抽出し、カイコ組織からの抽出物を含有する液状物を得る工程、
得られた液状物を１００００×ｇ〜５００００×ｇで遠心分離し上清を得る工程、
得られた上清をゲル濾過し、２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分を分取する工程、及び
回収した画分にＲＮＡポリメラーゼ及び外来鋳型ＤＮＡを添加する工程を少なくとも含む調製法によって得られる、無細胞系タンパク質合成用抽出液。An extract for cell-free protein synthesis containing at least a silkworm tissue-derived extract, RNA polymerase, and foreign template DNA ,
Freezing the silkworm tissue,
Crushing the frozen silkworm tissue,
Extracting the ground silkworm tissue with an extraction liquid to obtain a liquid material containing an extract from the silkworm tissue;
A step of centrifuging the obtained liquid at 10,000 × g to 50000 × g to obtain a supernatant,
A step of gel filtration of the obtained supernatant and fractionating a fraction having an absorbance at 280 nm of 10 or more; and
An extract for cell-free protein synthesis obtained by a preparation method including at least a step of adding RNA polymerase and foreign template DNA to the collected fraction . さらにプロテアーゼインヒビターを含有するものである、請求項１０に記載の抽出液。 Furthermore, the extract of Claim 10 which contains a protease inhibitor.

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