JP2010172333A - Juvenile hormone acid methyltransferase gene and utilization thereof - Google Patents

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Tetsuo Shinoda
徹郎 篠田
Tooru Itoyama
享 糸山
Tetsuzo Hamamura
徹三 浜村
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a highly safe insect growth regulator specifically acting to an insect. <P>SOLUTION: A Juvenile hormone acid methyltransferase gene is cloned from a cDNA originated from a corpus allatum of Bombyx mori by a differential display method. It is found that a recombinant protein expressed by the colon bacillus transformed by a vector DNA incorporated with the gene has Juvenile hormone acid methyltransferase activities. The Juvenile hormone acid methyltransferase genes originated from Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Spodoptera litura and Helicoverpa armigera are found based on the homology in the amino acid sequences. Also, it is found that the proteins encoded by the Juvenile hormone acid methyltransferase genes originated from the Drosophila melanogaster, the Anopheles gambiae, the Spodoptera litura and the Helicoverpa armigera have the Juvenile hormone acid methyltransferase activities. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質および該タンパク質をコードするDNA、並びにそれらの利用法に関するものである。   The present invention relates to juvenile hormone acid methyltransferase protein, DNA encoding the protein, and methods for using them.

幼若ホルモンは、セスキテルペン骨格を持つ特殊な構造をしたホルモンで、昆虫の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発育のみならず、多型、行動、寿命など多くの生理現象の調節に関与する重要な昆虫ホルモンである（非特許文献１、２）。   Juvenile hormone is a hormone with a special structure with a sesquiterpene skeleton, and is involved in the regulation of many physiological phenomena such as polymorphism, behavior, life span, as well as molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryo development of insects It is an important insect hormone (Non-Patent Documents 1 and 2).

したがって、昆虫体内の幼若ホルモンバランスを崩して昆虫の生存に必須な生理機能を撹乱することで、農林害虫や衛生害虫を防除することができると考えられる(非特許文献３、４)。これまでに、天然型幼若ホルモンより強い活性を示す合成幼若ホルモン活性物質が多数合成され、その一部は、安全性の高い害虫制御剤としてすでに実用化されている（非特許文献５、６)。   Therefore, it is considered that agricultural / forest pests and sanitary pests can be controlled by disrupting the immature hormone balance in the insect body and disturbing physiological functions essential for the survival of insects (Non-patent Documents 3 and 4). So far, many synthetic juvenile hormone active substances showing stronger activity than natural juvenile hormone have been synthesized, and some of them have already been put into practical use as highly safe pest control agents (Non-patent Document 5, 6).

また昆虫体内の幼若ホルモン量を適切に制御することで蚕等の有用昆虫の生育や休眠を制御し、その機能を強化することに利用できる。例えば、合成幼若ホルモン活性物質であるメトプレンは、蚕の増繭剤として利用されている（非特許文献７）。   In addition, by controlling the amount of juvenile hormone in the insect body, it can be used to control the growth and dormancy of useful insects such as moths and to strengthen their functions. For example, metoprene, which is a synthetic juvenile hormone active substance, is used as a thickener for sputum (Non-patent Document 7).

しかしながら、害虫防除への利用においては、幼若ホルモン活性物質は、昆虫体内の幼若ホルモン濃度の高い幼虫期には作用しないため、幼虫が加害ステージである農業害虫の多くに対しては、高い食害防止効果は期待できない。   However, when used for pest control, juvenile hormone active substances do not act during the larval stage when the juvenile hormone concentration in the insect body is high. It cannot be expected to prevent food damage.

より優れた防除手段として、幼若ホルモンの作用を遮断する、あるいは昆虫体内の幼若ホルモン濃度を下げることで、幼虫の摂食期間を短縮したり、早熟変態を促進することで、作物の被害を軽減する方法が考えられる。これまでに、抗幼若ホルモン物質としてプレコセンなど20種類以上の化合物が同定されているが、害虫防除に実用化されているものはない(非特許文献８)。また、遺伝子工学的な手法により、血中の幼若ホルモン濃度を人為的に低下させる試みもなされている。すなわち、血中に存在する幼若ホルモンを特異的に加水分解する幼若ホルモンエステラーゼの遺伝子を組み込んだ昆虫ウイルスを作成し、感染した昆虫体内で酵素活性を発現させ、虫体内の幼若ホルモンを分解しようというものである(非特許文献９)。しかし、この方法でも幼虫が早熟変態をするまでの効果は得られていない。   As a better control, damage to crops can be achieved by shortening the feeding period of larvae or promoting premature metamorphosis by blocking the action of juvenile hormone or lowering the concentration of juvenile hormone in the insect body. A method to reduce this is considered. So far, more than 20 kinds of compounds such as plecosene have been identified as anti-juvenile hormone substances, but none have been put to practical use for pest control (Non-patent Document 8). In addition, attempts have been made to artificially reduce the concentration of juvenile hormone in blood by genetic engineering techniques. In other words, an insect virus that incorporates a gene for juvenile hormone esterase that specifically hydrolyzes juvenile hormone in the blood is created, and the enzyme activity is expressed in the infected insect body. It is intended to be disassembled (Non-Patent Document 9). However, even this method has not been effective until the larva undergoes premature metamorphosis.

幼若ホルモンは昆虫特有の内分泌器官であるアラタ体で合成されて血中に分泌される。したがって、アラタ体での幼若ホルモンの合成を直接的に阻害できれば、昆虫体内の幼若ホルモンを低下させることが可能である。   Juvenile hormone is synthesized in the Arata body, an endocrine organ unique to insects, and secreted into the blood. Therefore, if the synthesis of juvenile hormone in the Arata body can be directly inhibited, the juvenile hormone in the insect body can be reduced.

幼若ホルモンの生合成の最終段階において、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素の作用によって不活性な前駆体である幼若ホルモン酸へS-アデノシルメチオニンのメチル基が転移することによって、活性型の幼若ホルモンが生じる(非特許文献１０)。この酵素活性が終齢幼虫になると低下する結果、幼若ホルモンの合成・分泌が停止し、血中の幼若ホルモンが消失し、変態が起こる。したがって、人為的にこの酵素活性を制御することで、昆虫体内の幼若ホルモン量を任意に改変し、害虫防除や有益昆虫の機能強化を行うことが可能と考えられる。   At the final stage of juvenile hormone biosynthesis, the methyl group of S-adenosylmethionine is transferred to the juvenile hormone acid, an inactive precursor, by the action of juvenile hormone acid methyltransferase, thereby Juvenile hormone is produced (Non-patent Document 10). As a result of this enzyme activity decreasing when it becomes an instar larva, the synthesis and secretion of juvenile hormone is stopped, the juvenile hormone in the blood disappears, and metamorphosis occurs. Therefore, by artificially controlling this enzyme activity, it is considered that the amount of juvenile hormone in the insect body can be arbitrarily modified to control pests and enhance the functions of beneficial insects.

しかしながら、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素は、ごく微細な組織であるアラタ体に微量しか存在しないため、同酵素に結合する化合物、同酵素の活性または発現を制御する化合物のスクリーニングに必要なタンパク質量を昆虫個体から調製するのはきわめて困難である。また、現在まで、該酵素のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は明らかにされていない。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。 However, juvenile hormone acid methyltransferase is present only in trace amounts in the Arata body, which is a very fine tissue, and is therefore a protein necessary for screening for compounds that bind to the enzyme and compounds that control the activity or expression of the enzyme. It is very difficult to prepare the amount from an insect individual. To date, the amino acid sequence of the enzyme and the base sequence of the gene encoding it have not been clarified.
Prior art document information related to the invention of the present application is shown below.

Nijhout, H.F.:Insect hormones, Princeton University Press, 267pp, 1994Nijhout, H.F .: Insect hormones, Princeton University Press, 267pp, 1994 Herman, W.&Tatar, M.: Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268:2509, 2001Herman, W. & Tatar, M .: Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268: 2509, 2001 Cusson, M&Palli, S.R.: Can.Entomol. 132:263, 2000Cusson, M & Palli, S.R .: Can.Entomol. 132: 263, 2000 深見浩：生物に学ぶ農薬の創製，ソフトサイエンス社、p.19-38,1986Hiroshi Fukami: Creation of pesticides learned from living organisms, Soft Science, p.19-38, 1986 江藤守総：生物に学ぶ農薬の創製，ソフトサイエンス社、p.1-18,1986Morito Eto: Creation of pesticides learned from living organisms, Soft Science, p.1-18, 1986 波多腰ら；住友化学、p.4-20,1997-IHata Koshi et al. Sumitomo Chemical, p.4-20, 1997-I 赤井弘：生理活性物質のバイオアッセイ, 講談社、p.383-388,1984Hiroshi Akai: Bioassay of bioactive substances, Kodansha, p.383-388, 1984 深見浩：生物に学ぶ農薬の創製，ソフトサイエンス社、p.19-38,1986Hiroshi Fukami: Creation of pesticides learned from living organisms, Soft Science, p.19-38, 1986 Hammock, B.D. et al.:US patent, 5098706, 1992Hammock, B.D. et al .: US patent, 5098706, 1992 Schooley, D.A.&Baker,F.C.:Comp.Insect Physiol.Biochem.Pharmacol.,Pergammon Press, Oxford, 7:368-379, 1985Schooley, D.A. & Baker, F.C.: Comp.Insect Physiol.Biochem.Pharmacol., Pergammon Press, Oxford, 7: 368-379, 1985

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質および該タンパク質をコードするDNA、並びにそれらの利用法を提供することにある。   The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide juvenile hormone acid methyltransferase protein, DNA encoding the protein, and methods for using them.

上記課題を解決するために、本発明者らは、鱗翅目昆虫のアラタ体において、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素の活性は終前齢幼虫期までは高いが、終齢幼虫初期以後はその活性が消失することに着目し、ディファレンシャル・ディスプレイ法により、カイコアラタ体由来のcDNAから、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子をクローニングした。該遺伝子を組み込んだベクターDNAを得た後、該ベクターDNAで形質転換した大腸菌で作成した組換えタンパク質が幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有することを見いだした。   In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have shown that the activity of juvenile hormone acid methyltransferase is high until the last larval stage in the lepidopteran insect Arata, but after the early stage of the last larval stage, Focusing on the disappearance of the activity, we cloned the juvenile hormone acid methyltransferase gene from the silkworm-derived cDNA by the differential display method. After obtaining the vector DNA into which the gene had been incorporated, it was found that the recombinant protein produced in E. coli transformed with the vector DNA had juvenile hormone acid methyltransferase activity.

さらに、アミノ酸配列の相同性に基づき、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、オオタバコガ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子を見出した。また、ショウジョウバエ、ハスモンヨトウ、オオタバコガ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子を組み込んだベクターDNAを得た後、該ベクターDNAで形質転換した大腸菌で作成した組換えタンパク質が幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有することを見いだした。これにより、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質を人為的に発現制御することが可能となった。   Furthermore, based on the homology of amino acid sequences, we found juvenile hormone acid methyltransferase genes from Drosophila, mosquitoes, Spodoptera litura, and Tobacco spp. In addition, after obtaining a vector DNA incorporating a juvenile hormone acid methyltransferase gene derived from Drosophila, Spodoptera litura, and Tobacco spp., A recombinant protein prepared by Escherichia coli transformed with the vector DNA was transformed into juvenile hormone acid methyltransferase. It was found to have enzyme activity. This has made it possible to artificially control juvenile hormone acid methyltransferase protein.

幼若ホルモンは、昆虫の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型、寿命などの多くの生理現象の調節に関与する。従って、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質を人為的に発現制御することにより、幼若ホルモンによって調節される昆虫の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型、寿命などを制御することが可能である。例えば、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質を人為的に制御することにより、害虫防除や有益昆虫の機能強化を行うことが可能である。また、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質は、該タンパク質に結合する化合物、該タンパク質の活性または発現を制御する化合物の製造やスクリーニングに利用できる。スクリーニングによって得られた化合物は、昆虫に特異的に作用する安全性の高い昆虫成長制御剤として利用できる。   Juvenile hormone is involved in the regulation of many physiological phenomena such as insect molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism, and longevity. Therefore, by controlling artificial expression of juvenile hormone acid methyltransferase protein, insect molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism, life span, etc. regulated by juvenile hormone are controlled. Is possible. For example, it is possible to artificially control the juvenile hormone acid methyltransferase protein to control pests and enhance the functions of beneficial insects. In addition, juvenile hormone acid methyltransferase protein can be used for the production and screening of a compound that binds to the protein and a compound that controls the activity or expression of the protein. The compound obtained by screening can be used as a highly safe insect growth regulator that acts specifically on insects.

即ち、本発明は、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質および該タンパク質をコードするDNA、並びにそれらの利用法に関し、以下の〔１〕〜〔２２〕を提供するものである。
〔１〕 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
（ａ）配列番号：２、４、６、８、または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、または９に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：２、４、６、８、または１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１、３、５、７、または９に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
〔２〕 〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔３〕 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）〔１〕に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
（ｂ）〔１〕に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
（ｃ）〔１〕に記載のDNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするDNA。
〔４〕 〔１〕または〔３〕に記載のDNAが挿入されたベクター。
〔５〕 〔１〕に記載のDNAまたは該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有する、節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤。
〔６〕 節足動物が昆虫である、〔５〕に記載の制御剤。
〔７〕 成虫に対する生殖成熟促進剤、休眠解除剤もしくは寿命短縮剤、幼虫および蛹に対する変態抑制剤、または、幼虫に対する休眠誘導剤である、〔６〕に記載の制御剤。
〔８〕 害虫防除剤または増繭剤である、〔６〕に記載の制御剤。
〔９〕 〔３〕に記載のDNAまたは該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有する、節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤。
〔１０〕 節足動物が昆虫である、〔９〕に記載の制御剤。
〔１１〕 成虫に対する生殖成熟抑制剤、休眠誘導剤もしくは寿命延長剤、または、幼虫に対する休眠抑制剤もしくは変態誘導剤である、〔１０〕に記載の制御剤。
〔１２〕 害虫防除剤である、〔１０〕に記載の制御剤。
〔１３〕 〔１〕もしくは〔３〕に記載のDNAまたは〔４〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔１４〕 〔１〕もしくは〔３〕に記載のDNAまたは〔４〕に記載のベクターで形質転換された個体。
〔１５〕 昆虫個体である、〔１４〕に記載の個体。
〔１６〕 〔２〕に記載のタンパク質に結合する抗体。
〔１７〕 モノクローナル抗体である、〔１６〕に記載の抗体。
〔１８〕 〔１〕に記載のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
〔１９〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔２〕に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該タンパク質と被験化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該タンパク質に結合する化合物を選択する工程
〔２０〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔２〕に記載のタンパク質の活性を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被験化合物を投与していない場合と比較して、該タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔２１〕 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）該タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被験化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔２２〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）昆虫個体または培養組織に被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該昆虫個体または該培養組織における〔２〕に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被験化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程 That is, the present invention relates to juvenile hormone acid methyltransferase protein, DNA encoding the protein, and methods for using them, and the following [1] to [22] are provided.
[1] DNA encoding a protein having juvenile hormone acid methyltransferase activity according to any one of (a) to (d) below.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10.
(B) DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10.
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9.
[2] A protein encoded by the DNA of [1].
[3] The DNA according to any one of the following (a) to (c).
(A) A DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA of [1].
(B) DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the DNA of [1].
(C) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the DNA according to [1] by an RNAi effect.
[4] A vector into which the DNA according to [1] or [3] is inserted.
[5] An arthropod molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism or life span control agent comprising the DNA according to [1] or a vector inserted with the DNA as an active ingredient.
[6] The control agent according to [5], wherein the arthropod is an insect.
[7] The control agent according to [6], which is a reproductive maturation promoter for adults, a dormancy release agent or a life shortening agent, a metamorphosis inhibitor for larvae and pupae, or a dormancy inducer for larvae.
[8] The control agent according to [6], which is a pest control agent or a thickener.
[9] A control agent for arthropod molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism or life span, comprising as an active ingredient the DNA of [3] or a vector into which the DNA has been inserted.
[10] The control agent according to [9], wherein the arthropod is an insect.
[11] The control agent according to [10], which is a reproductive maturation inhibitor, a dormancy inducer or a life extension agent for adults, or a dormancy inhibitor or a transformation inducer for larvae.
[12] The control agent according to [10], which is a pest control agent.
[13] A transformed cell carrying the DNA of [1] or [3] or the vector of [4].
[14] An individual transformed with the DNA according to [1] or [3] or the vector according to [4].
[15] The individual according to [14], which is an insect individual.
[16] An antibody that binds to the protein of [2].
[17] The antibody according to [16], which is a monoclonal antibody.
[18] An oligonucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to the DNA according to [1] or a complementary strand thereof.
[19] A screening method for a compound that binds to the protein of [2], comprising the following steps (a) to (c):
(A) A step of bringing the test compound into contact with the protein (b) A step of detecting the binding between the protein and the test compound (c) A step of selecting a compound that binds to the protein [20] The following (a) to ( The screening method of the compound which controls the activity of the protein as described in [2] including the process of c).
(A) a step of bringing the test compound into contact with the protein (b) a step of measuring the activity of the protein (c) a compound that increases or decreases the activity of the protein compared to a case where the test compound is not administered. Step of selecting [21] A method for screening a compound that controls the expression level of the gene encoding the protein of [2], comprising the following steps (a) to (d):
(A) a step of providing a cell or cell extract having DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of a promoter region of the gene encoding the protein (b) contacting a test compound with the cell or the cell extract (C) The step of measuring the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract (d) The expression level of the reporter gene is increased or decreased as compared with the case where the test compound is not administered. Step of selecting compound [22] A screening method for a compound that controls the expression level of the gene encoding the protein according to [2], comprising the following steps (a) to (c):
(A) a step of bringing a test compound into contact with an insect individual or a cultured tissue (b) a step of measuring an expression level of a gene encoding the protein according to [2] in the insect individual or the cultured tissue (c) a test compound A step of selecting a compound that increases or decreases the expression level of the gene as compared with the case where it is not administered.

本発明者らは、カイコ（Bombyx mori）、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、蚊（Anopheles gambiae）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、およびオオタバコガ（Helicoverpa armigera）において、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有するタンパク質（幼若ホルモン酸メチル基転移酵素(Juvenile hormone acid methyltransferase：JHAMT）をコードするDNAを単離することに成功した。本発明は、この知見に基づき、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質および該タンパク質をコードするDNAを提供するものである。   We have proteins with juvenile hormone acid methyltransferase activity in Bombyx mori, Drosophila melanogaster, mosquito (Anopheles gambiae), Spodoptera litura, and Helicoverpa armigera (Succeeded in isolating DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase (JHAMT). Based on this finding, the present invention is directed to juvenile hormone acid methyltransferase protein and It provides DNA encoding a protein.

配列番号：１、３、５、７、および９に、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、およびオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードする遺伝子（cDNA）の塩基配列をそれぞれ示した。また、配列番号：２、４、６、８、および１０に、上記昆虫の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素の予想されるアミノ酸配列をそれぞれ示した。   SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9 show the base sequences of the genes (cDNA) encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura and Tobacco moth, respectively. In addition, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, and 10 show the predicted amino acid sequences of the insect juvenile hormone acid methyltransferase, respectively.

本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素は、S-アデノシルメチオニンのメチル基をホルモン活性を持たない幼若ホルモン酸のカルボキシル基に転移し、活性型の幼若ホルモンを生じる活性を有する酵素である。よって、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素は、天然型幼若ホルモンの製造に利用できる。本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素によって製造された天然型幼若ホルモンは、合成幼若ホルモンと比べて、紫外線などにより分解しやすいため、残留毒性が低い点が長所である。   The juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention is an enzyme having the activity of transferring the methyl group of S-adenosylmethionine to the carboxyl group of juvenile hormone acid having no hormone activity to produce an active form of juvenile hormone It is. Therefore, the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can be used for the production of natural juvenile hormone. Since the natural juvenile hormone produced by the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention is more easily decomposed by ultraviolet rays or the like than the synthetic juvenile hormone, it has an advantage of low residual toxicity.

天然型幼若ホルモンは化学的にも複数の合成方法が確立されているが、かなり多数のステップを必要とする。これに対し、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素は、生理的な条件で天然型幼若ホルモンを製造できるという利点がある。例えば、実施例に記載の方法により、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を用いて天然型幼若ホルモンを製造することができる。また、一部の菌類ではファルネセン酸（farnesoic acid）を合成することが知られている（Oh, K.-B., H. Miyazawa, et al. (2001). Proc Natl Acad Sci U S A 98: 4664-4668.）。よって、そのような微生物に本発明の酵素遺伝子を導入することで天然型幼若ホルモン（ファルネセン酸メチル）を製造することもできる。また、上記の菌の他に、ショウジョウバエの培養細胞Kc cellsやラット肝臓抽出液が、ファルネシルピロリン酸およびファルネソールからファルネセン酸を合成することが知られていることから(Gonzalez-Pacanowska, D. et al., 1988: J.Biol.Chem., 1301-1306)、本発明の酵素遺伝子を導入することで天然型幼若ホルモンを製造することができる。また、ファルネソールは種々の植物精油に含まれる成分であり、それがさらに酸化されたファルネセン酸が含まれている植物であれば、本酵素遺伝子を植物に導入して天然型幼若ホルモンを製造することが可能である。   Although natural juvenile hormone has been chemically synthesized in several ways, it requires a considerable number of steps. In contrast, the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention has the advantage that natural juvenile hormone can be produced under physiological conditions. For example, natural juvenile hormone can be produced using the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention by the method described in the Examples. Some fungi are also known to synthesize farnesoic acid (Oh, K.-B., H. Miyazawa, et al. (2001). Proc Natl Acad Sci USA 98: 4664. -4668.) Therefore, natural juvenile hormone (methyl farnesate) can be produced by introducing the enzyme gene of the present invention into such a microorganism. In addition to the above bacteria, Drosophila cultured cells Kc cells and rat liver extract are known to synthesize farnesenoic acid from farnesyl pyrophosphate and farnesol (Gonzalez-Pacanowska, D. et al , 1988: J. Biol. Chem., 1301-1306), natural juvenile hormone can be produced by introducing the enzyme gene of the present invention. Farnesol is a component contained in various plant essential oils. If it is a plant that further contains oxidized farnesenoic acid, this enzyme gene is introduced into the plant to produce natural juvenile hormone. It is possible.

本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素によって製造された天然型幼若ホルモンは、当業者に周知の用途により利用できる。該天然型幼若ホルモンの用途を以下に例示するが、該天然型幼若ホルモンの用途はそれらに限定されない。   The natural juvenile hormone produced by the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can be used for applications well known to those skilled in the art. The use of the natural juvenile hormone is exemplified below, but the use of the natural juvenile hormone is not limited thereto.

本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素によって製造された天然型幼若ホルモンは、幼若ホルモン類縁物質と同様に、害虫防除剤や増繭剤として利用できる。また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素により製造された天然型幼若ホルモンを利用することで、昆虫の成長を制御できる。例えば、該天然型幼若ホルモンを、休眠したカメムシなどの成虫に投与することで、休眠を解除し、生殖成熟を促進できる。ミツバチの働き蜂では、加齢に伴って仕事の種類が変わることが知られている。これは加齢により幼若ホルモンの濃度が変わるために起こると考えられ、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素により製造された天然型幼若ホルモンを外部から投与することで仕事の種類を変化させることができる。また、ハチミツガの幼虫に、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素により製造された天然型幼若ホルモンを処理することにより、幼虫を大型化し釣果を高めると共に蛹化を阻止し幼虫を長期間使用できると考えられる（特許登録番号：２７０７６１７）。   The natural juvenile hormone produced by the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can be used as a pest control agent or a thickener, as well as juvenile hormone-related substances. In addition, the growth of insects can be controlled by using the natural juvenile hormone produced by the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention. For example, dormancy can be canceled and reproductive maturation can be promoted by administering the natural juvenile hormone to a dormant adult insect such as a stink bug. It is known that the type of work changes with aging in bees. This is thought to occur because the concentration of juvenile hormone changes with aging, and the type of work can be controlled by externally administering the natural juvenile hormone produced by the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention. Can be changed. In addition, by treating the honey larvae with the natural type juvenile hormone produced by the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention, the larvae are enlarged, the fishing results are increased and hatching is prevented, and the larvae are kept for a long time. It can be used (patent registration number: 2707617).

また、甲殻類においては、ファルネセン酸メチル（methyl farnesoate; メチルファルネソエート）が昆虫の幼若ホルモンに相同なホルモンであり、昆虫同様、甲殻類の成長と生殖の調節に重要であると考えられている（Homola, E and Chang, E.S; Comp. Biochem. Physiol. B, 117:347-356, 1997）。本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素は、甲殻類の幼若ホルモン前駆体であるファルネセン酸に対してメチル基を転移し、活性型ホルモンであるファルネセン酸メチルを生成する活性をも有する。図１に昆虫の主な幼若ホルモンであるJH I、JH II、JH IIIおよび甲殻類の幼若ホルモンであるファルネセン酸メチルと、それらの前駆体であるJH I酸、JH II酸、JH III酸およびファルネセン酸の構造、および本発明の酵素による幼若ホルモン酸から幼若ホルモンの合成反応を示している。よって、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素により製造された幼若ホルモンは、甲殻類の成長の制御にも利用できる。例えば、該幼若ホルモンは、フジツボ、また、食用として養殖されているエビ、カニ類の生育の改良あるいは採卵に利用できる。また、該幼若ホルモンは、甲殻類の一種であるフジツボの養殖にも利用できる（特開平11-018614）。   In crustaceans, methyl farnesoate (methyl farnesoate) is a hormone similar to the juvenile hormone of insects and, like insects, is thought to be important in regulating crustacean growth and reproduction. (Homola, E and Chang, ES; Comp. Biochem. Physiol. B, 117: 347-356, 1997). The juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention has an activity of transferring a methyl group to farnesenoic acid, which is a crustacean juvenile hormone precursor, to produce methylfarnesate, an active hormone. Fig. 1 shows JH I, JH II, JH III which are the main juvenile hormones of insects, methyl farnesenoate which is a juvenile hormone of crustaceans, and their precursors, JH I acid, JH II acid, JH III. The structure of acid and farnesenoic acid, and the synthesis reaction of juvenile hormone from juvenile hormone acid by the enzyme of the present invention are shown. Therefore, the juvenile hormone produced by the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can also be used for the control of crustacean growth. For example, the juvenile hormone can be used for improving growth or egg collection of barnacles, shrimp cultivated for food, and crabs. The juvenile hormone can also be used for culturing barnacles, a kind of crustaceans (Japanese Patent Laid-Open No. 11-018614).

幼若ホルモンは、昆虫の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型、寿命などの多面的な生理作用を有することが知られている。また、幼若ホルモンが、どのような生理作用を示すかは、同一種であっても、昆虫の発育ステージや生理状態によって大きく異なることが知られている。特に、幼虫期や蛹期には変態を抑制するのに対して、成虫になると逆に生殖成熟を促進するといった、一見相反するような作用を持つことが知られている。昆虫の休眠における幼若ホルモンの作用についても、休眠がどの発育ステージで起こるかによって異なる。例えば、幼虫休眠する昆虫（ニカメイガなど）では体内の幼若ホルモンが高く維持されるために休眠するが、成虫休眠する昆虫（ホソヘリカメムシなど）では逆に幼若ホルモンが低いため休眠する。よって、昆虫体内で本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAを誘導した場合、昆虫の種類、昆虫の発育ステージや生理状態によって、脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型、寿命に対する影響が異なり、促進的に作用することもあれば、抑制的に作用することもありうる。このように、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAは、昆虫の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤（促進剤または抑制剤）として広範囲な用途を有する。例えば、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAは、成虫に対する生殖成熟促進剤、休眠解除剤もしくは寿命短縮剤として、幼虫および蛹に対する変態抑制剤（幼虫・蛹形質の維持剤、好ましくは過剰脱皮剤）として、または、幼虫に対する休眠誘導剤として使用することができるが、これら用途に限定されるものではない。   Juvenile hormone is known to have multifaceted physiological actions such as insect molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism, and longevity. In addition, it is known that the physiological action of juvenile hormone varies greatly depending on the growth stage and physiological state of insects even in the same species. In particular, it is known to have a seemingly contradictory effect, such as suppressing metamorphosis in the larval stage and pupal stage, but conversely promoting reproductive maturity when adults become adults. The effects of juvenile hormone on insect diapause also depend on the developmental stage at which diapause occurs. For example, larval dormant insects (such as green moth) are dormant because the juvenile hormone in the body is maintained high, but adult diapause insects (such as the beetle beetle) are dormant because the juvenile hormone is low. Therefore, when the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention is induced in an insect body, the molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, depending on the type of insect, the developmental stage and physiological state of the insect The effects on polymorphism and lifespan are different and may act in an accelerated manner or act in a suppressive manner. Thus, the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention is a regulator (promoter or inhibitor) of insect molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism or life span. As a wide range of uses. For example, the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can be used as an agent for promoting reproductive maturity, a dormancy release agent, or a life shortening agent for adult larvae and a metamorphosis inhibitor for larvae and pupae. , Preferably an excessive molting agent) or as a dormancy inducer for larvae, but is not limited to these applications.

以下に、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの用途を例示するが、該DNAの用途はそれらに限定されない。
本来幼若ホルモンの合成が停止する終齢幼虫において、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、幼若ホルモンの合成・分泌を継続させ、過剰幼虫脱皮を起こすことが可能である。例えば、カイコの過剰脱皮を誘起すると、通常5齢幼虫で蛹になるところが、6齢幼虫を経て大きな蛹になることが知られている。したがって、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、大きな繭を得ることが可能である。すなわち、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAは増繭剤として利用できる。また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、他の昆虫でも通常より大型の昆虫が得られるので、より巨大で見栄えのする個体の作製に有用である。例えば、オオクワガタなどのペット昆虫や、美麗な蝶（トリバネアゲハなど）などの作製への応用が考えられる。また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、ミツバチが生産する蜜の生産量や品質の向上が可能である。 Examples of the use of DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention are shown below, but the use of the DNA is not limited thereto.
By inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention, it is possible to continue the synthesis and secretion of juvenile hormone and cause excessive larva molting in the infancy larvae that originally stop the synthesis of juvenile hormone It is. For example, when excessive molting of silkworms is induced, it is known that moths usually become 5th instar larvae but become large pupae after 6th instar larvae. Therefore, it is possible to obtain large wrinkles by inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention. That is, the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can be used as a thickening agent. In addition, by inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention, other insects can obtain larger insects than usual, which is useful for producing larger and more attractive individuals. For example, it can be applied to the production of pet insects such as large stag beetles and beautiful butterflies (such as birdwing swallowtail). Further, by inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention, it is possible to improve the production amount and quality of the honey produced by the bees.

また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAは害虫防除剤としても利用できる。例えば、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、ハエや蚊などの衛生害虫の防除が可能である。すなわち、昆虫体内の幼若ホルモンバランスを崩して昆虫の生存に必須な生理機能を撹乱することで、農林害虫や衛生害虫を防除することができる。また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、卵の孵化阻害（殺卵作用）、幼虫の変態阻害、蛹の羽化阻害とその後の生殖阻害、成虫の生殖阻害（雌の場合、産下卵数の減少、産下卵の孵化率の低下）を引き起こすことができる。また、胚発生の時期によっては、幼若ホルモンが誘導されていない時期がある。このような時期に、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、胚発生を抑制し、孵化阻害（殺卵作用）を引き起こすことができる。   The DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can also be used as a pest control agent. For example, it is possible to control sanitary pests such as flies and mosquitoes by inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention. That is, by destroying the immature hormone balance in the insect body and disrupting physiological functions essential for the survival of insects, agricultural and forestry pests and sanitary pests can be controlled. Further, by inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention, inhibition of egg hatching (ovulatory action), inhibition of larval transformation, inhibition of hatching and subsequent reproduction, inhibition of adult reproduction (female) In this case, the number of laying eggs can be reduced and the hatching rate of the laying eggs can be reduced). Also, depending on the stage of embryo development, there is a period when juvenile hormone is not induced. By inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention at such a time, embryo development can be suppressed and hatching inhibition (ovicidal action) can be caused.

また、アブラムシやウンカなどでは翅型に多型があり、無翅と有翅のものがいる。このような昆虫において、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を誘導することにより、無翅型化を引き起こすことが可能である。   In addition, aphids and planthoppers have many types of cocoons, and there are varieties of potatoes and potatoes. In such insects, it is possible to induce sterility by inducing the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention.

また、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAは、昆虫以外の節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤としても使用できる。該節足動物としては、甲殻類、蜘蛛類、多足類などが例示できるが、これらに限定されるものではない。   The DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can also be used as a regulator of molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism or life span of arthropods other than insects. . Examples of the arthropod include, but are not limited to, crustaceans, mosses, and polypods.

例えば、食用エビやカニの幼若ホルモン（ファルネセン酸メチル）量を増加することで、脱皮を促進して成長を早め養殖効率を高めることができる。同様に、雌雄の生殖成熟を促進し、従来採卵が困難なことから養殖の難しかった種についても養殖が可能になる。   For example, by increasing the amount of juvenile hormone (methyl farnesate) in edible shrimp and crab, it is possible to promote molting, accelerate growth and increase aquaculture efficiency. Similarly, reproductive maturation of males and females is promoted, and it is possible to cultivate species that have been difficult to cultivate due to the difficulty in egg collection.

また、JH IIIを合成する植物が知られている（Toong, Y. C., D. A. Schooley, et al. (1988). Isolation of insect juvenile hormone III from a plant. Nature 333: 170-171.）。該植物を食べたバッタは異常変態を起こすことから、JH を有する植物は昆虫抵抗性を有すると考えられる。よって、本発明の遺伝子は植物にJHを合成させ、昆虫抵抗性植物を作出する目的でも使用可能である。   In addition, plants that synthesize JH III are known (Toong, Y. C., DA Schooley, et al. (1988). Isolation of insect juvenile hormone III from a plant. Nature 333: 170-171.). The grasshopper that ate the plant undergoes abnormal metamorphosis, so that the plant with JH is considered to have insect resistance. Therefore, the gene of the present invention can also be used for the purpose of producing insect-resistant plants by synthesizing plants with JH.

本発明のDNAとしては、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNA（配列番号：１、３、５、７、および９）が例示できる。   Examples of the DNA of the present invention include DNAs (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9) encoding juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or Tobacco spp.

また、本発明のDNAには、配列番号：２、４、６、８、または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが包含される。このようなDNAには、例えば、配列番号：２、４、６、８、または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等をコードするDNA、または、配列番号：２、４、６、８、または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログであって、実施例７に記載のモチーフ領域を少なくとも１つ（好ましくは全て）有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素と同等の生物学的機能（生物学的性質）、生化学的機能（生化学的活性）を有することを指す。   The DNA of the present invention includes DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10. Such DNA includes, for example, DNA encoding a mutant, allele, variant, homolog, etc. of a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10, or SEQ ID NO: A protein variant, allele, variant or homologue consisting of the amino acid sequence described in 2, 4, 6, 8, or 10 and having at least one (preferably all) the motif region described in Example 7 DNA encoding is included. Here, “functionally equivalent” means that the target protein has a biological function (biological property) equivalent to that of juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura or Tobacco moth, It refers to having a biochemical function (biochemical activity).

あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNA配列もしくはその一部を利用して、これと相同性の高いDNAを単離することは、周知の技術である。   Other methods well known to those skilled in the art for preparing DNA encoding a protein functionally equivalent to a protein include hybridization techniques (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). That is, a person skilled in the art uses a DNA sequence encoding a juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or Tobacco spp. This is a well-known technique.

本発明には、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが含まれる。このようなDNAとしては、例えば、昆虫類、甲殻類、クモ類、ダニ類、多足類（ムカデ、ヤスデ、ゲジなど）由来のホモログが挙げられるが、これらに制限されない。   The present invention hybridizes under stringent conditions with a DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, fruit fly, mosquito, scallop, or giant moth, and is used in silkworm, fruit fly, mosquito, moth fly, or giant moth. DNA encoding a protein functionally equivalent to juvenile hormone acid methyltransferase is included. Examples of such DNA include, but are not limited to, homologs derived from insects, crustaceans, spiders, mites, and polypods (centipede, millipede, geji, etc.).

また、昆虫としては、特に制限はないが、有用昆虫としては、カイコ、野蚕類（ヤママユガ、エリ蚕、テグス蚕など）、ミツバチ、ペット昆虫として、カブトムシ、オオクワガタ等、天敵としては、ナミテントウムシ、ハナカメムシ、農業害虫としては、ハスモンヨトウ、オオタバコガ、コナガ、ヨトウガ、アブラムシ類（ワタアブラムシ、モモアカアブラムシなど）、コナジラミ類（オンシツコナジラミ、シルバーリーフコナジラミなど）、アザミウマ類（ミナミキイロアザミウマ、ミカンキイロアザミウマなど）、ハモグリバエ類（マメハモグリバエ、ナスハモグリバエなど）、カメムシ類（ホソヘリカメムシなど）、ウンカ類（トビイロウンカ、セジロウンカ、ヒメトビウンカ）、ヨコバイ類（ツマグロヨコバイなど）、カミキリムシ類、ウリミバエ、チチュウカイミバエなど、森林害虫としてはマツノマダラカミキリ、マツカレハガ、家畜害虫としてはアブ類（メクラアブ、ウシアブなど）、ハエ類（サシバエ、ノサシバエなど）、カ類、ブユ類、ヌカカ類、家屋害虫としてはシロアリ類、衛生害虫としては、カ類（アカイエカ、ヒトスジシマカなど）、ハエ類（ショウジョウバエ、イエバエ、クロバエ類、キンバエ類）、ゴキブリ類、ノミ類、シラミ類などが例示できる。   Insects are not particularly limited, but useful insects include silkworms, wild reptiles (Yamayuga, Eli moth, Tegu moth, etc.), bees, pet insects, beetles, stag beetles, etc. As for the bugs, the insect pests include Spodoptera litura, Giant Tobacco moth, Persian moth, Scarlet moth, Aphids (eg, cotton aphids, peach aphids), white lice (such as white spotted white flies, silver leaf whitefly), thrips (such as white thrips, thrips) ), Leafhoppers (eg, leafhoppers, eggplant leafworms), stink bugs (eg, leafhoppers), planthoppers (flying planthoppers, white-tailed planthoppers, leafhoppers), leafhoppers (eg, leafhoppers), beetles As forest pests, pine fly moths, pine moths, livestock pests such as flies (eg, clam abalone, bull fly), flies (eg, flies, horn flies), mosquitoes, flyfish, pests, house pests, etc. Examples of termites and sanitary pests include mosquitoes (Acaeka, Aedes albopictus, etc.), flies (Drosophila, houseflies, black flies, and flyflies), cockroaches, fleas, louses, and the like.

また、本発明における甲殻類としては、特に制限はなく、例えば食用とされているエビ、カニ類（クルマエビ、アメリカンロブスター、テナガエビなどのエビ類、ケガニ、ワタリガニ、タカアシガニ、アサヒガニなどのカニ類、シャコ類、ヤドカリ類、ヤシガニなど）などが挙げられる。   In addition, the crustaceans in the present invention are not particularly limited. For example, shrimp and crab that are considered to be edible (shrimps such as shrimp, American lobster, and lobster, crab, crab, crabs, crab, etc. , Hermit crabs, coconut crabs, etc.).

カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、ストリンジェントな条件が挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。本発明におけるストリンジェントな条件の一つの態様としては、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、5×SSC 、0.1％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、本発明におけるストリンジェントな条件の別の態様としては、例えば、99.5%以上であるような相同性が高い核酸同士はハイブリダイズするが、それより相同性が低い核酸同士はハイブリダイズしないような条件が挙げられる。   Those skilled in the art will appropriately select hybridization conditions for isolating a DNA encoding a protein functionally equivalent to the juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or Tobacco spp. be able to. Examples of hybridization conditions include stringent conditions. The “stringent conditions” referred to here are conditions under which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. One embodiment of the stringent conditions in the present invention includes low stringent conditions. Low stringent conditions are, for example, conditions of 42 ° C., 5 × SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C., 5 × SSC, 0.1% SDS in washing after hybridization. More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions. High stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 0.1 × SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. . In another embodiment of the stringent conditions in the present invention, for example, nucleic acids having high homology such as 99.5% or more hybridize, but nucleic acids having lower homology do not hybridize. Conditions.

また、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用して、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離することも可能である。   In addition, gene amplification methods using primers synthesized based on the sequence information of DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or Tobacco spp., Such as polymerase chain reaction (PCR) It is also possible to isolate DNA encoding a protein functionally equivalent to juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or Tobacco spp.

これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるDNAがコードする、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素と機能的に同等なタンパク質は、通常、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のタンパク質には、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素と機能的に同等であり、かつ該タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、より好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性、最も好ましくは98％以上の同一性を指し、塩基レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、より好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性、最も好ましくは98％以上の同一性を指す。   Proteins functionally equivalent to the juvenile hormone acid methyltransferases of silkworms, Drosophila, mosquitoes, Spodoptera litura, or Tobacco moth encoded by DNA isolated by these hybridization and gene amplification techniques are usually silkworms, Drosophila. It has a high homology in amino acid sequence with juvenile hormone acid methyltransferase of mosquito, squirrel moth, or moth. The protein of the present invention includes a protein that is functionally equivalent to the juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or tobacco moth, and has high homology with the amino acid sequence of the protein. . High homology is usually at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity, most at the amino acid level. Preferably, it indicates 98% or more identity, and at the base level, usually at least 50% or more identity, preferably 75% or more identity, more preferably 85% or more identity, more preferably 95% or more Identity, most preferably greater than 98% identity.

アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。   The identity of amino acid sequences and base sequences can be determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). When a base sequence is analyzed by BLASTN based on BLAST, parameters are set, for example, score = 100 and wordlength = 12. When an amino acid sequence is analyzed by BLASTX based on BLAST, parameters are set to score = 50 and wordlength = 3, for example. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific techniques for these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

また、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明に含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、アミノ酸が付加、欠失もしくは置換されるアミノ酸残基の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質の部位またはアミノ酸残基の脂累によってことなるが、好ましくは30個以内、より好ましくは2〜20個、さらに好ましくは2〜15個程度を指す。   It also consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been mutated in the amino acid sequence of juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or tobacco moth. Included in the invention. Such amino acid mutations can also occur in nature. The number of amino acids to be mutated varies depending on the position of the juvenile hormone acid methyltransferase protein of the amino acid residue to which the amino acid is added, deleted or substituted, but preferably within 30 or more, Preferably 2 to 20, more preferably about 2 to 15.

変異するアミノ酸部位としては、特に制限はないが、実施例に記載の特徴的なモチーフ部位、または保存性が高いアミノ酸部位以外の部位が変異されることが好ましい。実施例７や図５を参照することで、特徴的なモチーフ部位、または保存性が高いアミノ酸部位以外の部位を決定することができる。   The amino acid site to be mutated is not particularly limited, but it is preferable that a site other than the characteristic motif site described in the Examples or the amino acid site having high conservation is mutated. By referring to Example 7 and FIG. 5, it is possible to determine a site other than a characteristic motif site or a highly conserved amino acid site.

また、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。   In addition, the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain. For example, amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y), sulfur atom-containing side chains Amino acids with amino acids (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino groups with base-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (all parentheses represent single letter symbols of amino acids).

あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413、Bowie et al., Science (1990) 247, 1306-1310）。   It is already known that proteins having amino acid sequences modified by deletion, addition and / or substitution with other amino acids of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence maintain their biological activity. (Mark, DF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, MJ & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413, Bowie et al., Science (1990) 247, 1306-1310).

また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。   As a method well known to those skilled in the art for preparing a protein functionally equivalent to a certain protein, a method for introducing a mutation into the protein is known. For example, those skilled in the art will recognize site-directed mutagenesis (Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468 -500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766), etc., to the amino acid of juvenile hormone methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura A protein functionally equivalent to the protein can be prepared by appropriately introducing mutations.

また、本発明のDNAを有する細胞に変異処理を行い、該細胞から、例えばカイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAを選択することによっても改変されたDNAを得ることができる。   In addition, the cells having the DNA of the present invention are subjected to mutation treatment, and the cells are hybridized under stringent conditions with DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase of, for example, silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or Tobacco moth. Modified DNA can also be obtained by selecting soy DNA.

カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これらタンパク質と他のタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製するには、例えば、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAと他のタンパク質をコードするDNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。   Proteins in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura or Tobacco moth include fusion proteins containing these proteins. The fusion protein is a fusion of these proteins and other proteins and is included in the present invention. To create a fusion protein, for example, the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, or Tobacco sp. This can be introduced into an expression vector and expressed in a host. Other proteins to be subjected to fusion with the protein of the present invention are not particularly limited.

本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T 抗原の断片、lck tag 、α-tubulinの断片、B-tag 、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらタンパク質をコードするDNAを本発明のタンパク質をコードするDNAと融合させ、これにより調製された融合DNAを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。   Other peptides to be subjected to fusion with the protein of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and 6 His (histidine) residues. 6 × His, 10 × His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, p18HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck Known peptides such as tag, α-tubulin fragment, B-tag, protein C fragment and the like can be used. Examples of other proteins that are subjected to fusion with the protein of the present invention include GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, β-galactosidase, and MBP (maltose binding). Protein) and the like. A fusion protein can be prepared by fusing a commercially available DNA encoding these proteins with a DNA encoding the protein of the present invention and expressing the prepared fusion DNA.

本発明のDNAは、本発明のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。   The DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA. Moreover, as long as it can code the protein of this invention, DNA which has the arbitrary base sequences based on the degeneracy of a genetic code is contained.

本発明のDNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、昆虫のアラタ体、生殖腺、成虫原基、虫体全体もしくは頭部全体、また、甲殻類のファルネセン酸メチル合成器官である大顎器官（mandibular organ）、甲殻類全体もしくは頭部全体、また、クモ類、ダニ類、多足類の全体もしくは頭部全体よりcDNAライブラリーを作製し、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより天然由来のDNAが調製できる。また、昆虫のアラタ体、生殖腺、成虫原基、虫体全体もしくは頭部全体、また、甲殻類のファルネセン酸メチル合成器官である大顎器官（mandibular organ）、甲殻類全体もしくは頭部全体、また、クモ類、ダニ類、多足類の全体もしくは頭部全体よりRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAに基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、本発明のタンパク質をコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。   The DNA of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, the insect arata body, gonad, adult primordia, whole body or head, crustacean methyl farnesate synthesizing organ, mandibular organ, whole shell or head, A cDNA library is constructed from the whole or the head of spiders, mites, and polypods, and a part of the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura Naturally-derived DNA can be prepared by performing hybridization using as a probe. In addition, insect Arata body, gonad, adult primordia, whole body or head, crustacean methyl farnesate synthesizing organ, mandibular organ, whole crustacean or whole head, After preparing RNA from all of spiders, mites, polypods or whole heads, synthesizing cDNA with reverse transcriptase, transfer to juvenile hormone acid methyl group of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura or Tobacco moth It is also possible to synthesize oligo DNA based on DNA encoding the enzyme, perform PCR reaction using this as a primer, and amplify the cDNA encoding the protein of the present invention.

mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia社) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia社) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。   Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc., and then prepare total RNA and purify mRNA from the total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia) etc. Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).

得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業社)等を用いて行うこともできる。また、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) に従い、cDNAの合成および増幅を行うことができる。   CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA synthesis can also be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation). In addition, the 5'-RACE method (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (using the 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and polymerase chain reaction (PCR)) ( 1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), cDNA can be synthesized and amplified.

また、本発明は、上記本発明のDNAがコードするタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質が、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明のタンパク質を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のタンパク質のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明のタンパク質はこのようなタンパク質も包含する。   The present invention also provides a protein encoded by the DNA of the present invention. The protein of the present invention may differ in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence of sugar chain, form, etc., depending on the cell, host or purification method that produces it. However, so long as the obtained protein has a function equivalent to that of juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura or Tobacco moth, it is included in the present invention. For example, when the protein of the present invention is expressed in prokaryotic cells such as E. coli, a methionine residue is added to the N-terminus of the original amino acid sequence of the protein. The protein of the present invention includes such a protein.

本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするDNAを導入した宿主細胞（例えば大腸菌または酵母）、または該DNAを導入したリコンビナント・バキュロウイルスを感染させた昆虫培養細胞または昆虫体により、本発明のタンパク質を大量に発現させて回収するシステムを用いることが可能である。本発明のタンパク質は、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。   The protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or a natural protein by methods known to those skilled in the art. In the case of a recombinant protein, the present invention can be achieved by a host cell (for example, Escherichia coli or yeast) into which a DNA encoding the protein of the present invention has been introduced, or an insect culture cell or insect body infected with a recombinant baculovirus into which the DNA has been introduced. It is possible to use a system in which a large amount of the protein is expressed and recovered. The protein of the present invention is subjected to chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the protein of the present invention is immobilized on the column, or by further combining a plurality of these columns. It can be purified and prepared.

また、本発明のタンパク質をグルタチオン S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち、目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。   In addition, when the protein of the present invention is expressed in a host cell (for example, animal cell or E. coli) as a fusion protein with glutathione S-transferase protein or as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added, the protein is expressed. The recombinant protein can be purified using a glutathione column or a nickel column. After purification of the fusion protein, the region other than the target protein in the fusion protein can be cleaved and removed with thrombin or factor Xa as necessary.

天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、昆虫のアラタ体の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。   If it is a natural protein, it can be purified by a method well known to those skilled in the art, for example, by subjecting an insect Arata extract to an affinity column to which an antibody that binds to the protein of the present invention described later is bound and purified. Can be separated. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.

また、本発明は、上記幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を抑制するDNAを提供する。このようなDNAとしては、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAに対するアンチセンスRNAをコードするDNA、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするDNAなどを挙げることができる。   The present invention also provides DNA that suppresses the expression of DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase. Examples of such DNA include DNA encoding antisense RNA for DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase, and ribozyme that specifically cleaves transcripts of DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase. Examples thereof include DNA encoding RNA having activity, and DNA encoding RNA that suppresses the expression of DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase by the RNAi effect.

幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を抑制するDNAもまた、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAと同様に、節足動物（好ましくは昆虫）の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤として使用できる。すなわち、昆虫体内で幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を抑制するDNAを誘導した場合、昆虫の種類、昆虫の発育ステージや生理状態によって、脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型、寿命に対する影響が異なり、促進的に作用することもあれば、抑制的に作用することもありうる。例えば、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を抑制するDNAは、成虫に対する生殖成熟抑制剤、休眠誘導剤もしくは寿命延長剤、または、幼虫に対する休眠抑制剤もしくは変態誘導剤（好ましくは早期変態誘導剤）として使用できるが、これら用途に限定されるものではない。   The DNA that suppresses the expression of DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase is similar to the DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase, and molting and metamorphosis of arthropods (preferably insects), It can be used as a regulator of reproduction, dormancy, embryonic development, behavior, polymorphism or life span. In other words, when DNA that suppresses the expression of the DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase in the body of an insect is induced, molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryo, depending on the insect type, insect development stage and physiological state The effects on occurrence, behavior, polymorphism, and life span are different and may act in an accelerated manner or may act in an inhibitory manner. For example, a DNA that suppresses the expression of DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase is a reproductive / maturity inhibitor, a dormancy inducer or a life extension agent for adult worms, or a dormancy inhibitor or transformation inducer for larvae (preferably Can be used as an early transformation inducer), but is not limited to these applications.

以下に、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を抑制するDNAの用途を例示するが、該DNAの用途はそれらに限定されない。
幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性が終齢幼虫になると低下する結果、幼若ホルモンの合成・分泌が停止し、血中の幼若ホルモンが消失し、変態が起こることが知られている。よって、昆虫（完全変態昆虫、不完全変態昆虫のいずれも）の終齢以前の幼虫期において、上記DNAにより、幼若ホルモンの合成を抑制することで、早期変態を任意に誘導することができる。例えば、カイコでは幼若ホルモンの分泌器官であるアラタ体を摘出すると、早期変態が誘起され、通常5齢で蛹になるところが、4齢あるいは3齢で蛹になり、著しく小型の成虫が得られることがある。早期変態した成虫は、通常妊性がない。よって、上記DNAにより、害虫の幼若ホルモンの合成を抑制することで、次世代の害虫の駆除が可能となる。例えば、農業害虫、衛生害虫の幼虫に対して早期に変態を誘導して、加害時期を短縮することで、それら害虫の防除を行うことができる。また、成虫に対しては生殖成熟（卵形成など）を抑制することで農業害虫、衛星害虫の防除を行うことが可能である。このように本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を抑制するDNAは害虫防除剤として利用できる。 Examples of the use of DNA that suppresses the expression of DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention are shown below, but the use of the DNA is not limited thereto.
It is known that juvenile hormone acid methyltransferase activity decreases when it becomes an instar larva, resulting in the termination of synthesis and secretion of juvenile hormone, disappearance of juvenile hormone in blood, and metamorphosis. Therefore, early metamorphosis can be arbitrarily induced by suppressing the synthesis of juvenile hormone by the above DNA in the larval stage of the insects (both fully transformed insects and incompletely transformed insects) before the last age. . For example, in the silkworm, when the Arata body, the secretory organ of juvenile hormone, is extracted, early metamorphosis is induced, and it usually becomes a pupa at 5 years of age but becomes a pupa at 4 or 3 years of age, resulting in extremely small adults. Sometimes. Early transformed adults are usually not fertile. Therefore, it is possible to control the next generation of pests by suppressing the synthesis of juvenile hormones of the pests by the above DNA. For example, it is possible to control pests by inducing transformation at an early stage with respect to larvae of agricultural and hygienic pests and shortening the timing of the damage. Moreover, it is possible to control agricultural pests and satellite pests by suppressing reproductive maturation (eg, egg formation) for adults. Thus, the DNA that suppresses the expression of the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can be used as a pest control agent.

本発明における害虫としては、農業害虫としては、ハスモンヨトウ、オオタバコガ、コナガ、ヨトウガ、アブラムシ類（ワタアブラムシ、モモアカアブラムシなど）、コナジラミ類（オンシツコナジラミ、シルバーリーフコナジラミなど）、アザミウマ類（ミナミキイロアザミウマ、ミカンキイロアザミウマなど）、ハモグリバエ類（マメハモグリバエ、ナスハモグリバエなど）、カメムシ類（ホソヘリカメムシなど）、ウンカ類（トビイロウンカ、セジロウンカ、ヒメトビウンカ）、ヨコバイ類（ツマグロヨコバイなど）、カミキリムシ類、ウリミバエ、チチュウカイミバエなど、森林害虫としてはマツノマダラカミキリ、マツカレハガ、家畜害虫としてはアブ類（メクラアブ、ウシアブなど）、ハエ類（サシバエ、ノサシバエなど）、カ類、ブユ類、ヌカカ類、家屋害虫としてはシロアリ類、衛生害虫としては、カ類（アカイエカ、ヒトスジシマカなど）、ハエ類（ショウジョウバエ、イエバエ、クロバエ類、キンバエ類）、ゴキブリ類、ノミ類、シラミ類が例示できるが、これらに限定されるものではない。   As the pests in the present invention, as the agricultural pests, there are the followings: Lotus moth, Tobacco moth, moth, moth, aphids (such as cotton aphids, peach aphids), white lice (such as white spotted white lice, silver leaf white lice), thrips Citrus white thrips, etc.), leafhoppers (eg, leafhoppers, eggplant leaf flies), stink bugs (eg, leafhoppers), planthoppers (eg, leafhoppers, white-winged planthoppers, leafhoppers), leafhoppers (such as leafhoppers), leafworms, etc. Forest pests include pine-nosed beetle, pine moth, and livestock pests include flies (eg, Mekra abu and bull-fly), flies (eg, flies and flies), mosquitoes , Termites as house pests, hygiene pests as mosquitoes (Acacia, Drosophila, etc.), flies (Drosophila, houseflies, black flies, and fly flies), cockroaches, fleas, lice However, it is not limited to these.

また、カメムシなどの成虫においては、上記DNAにより、幼若ホルモンの合成を抑制することで、生殖成熟の抑制、休眠の誘導を引き起こすことが可能である。また、アブラムシやウンカなどでは翅型に多型があり、無翅と有翅のものがいる。本来、無翅型になるアブラムシ幼虫やウンカ幼虫に上記DNAを発現させることにより有翅型を作製できる。また、幼若ホルモンの分泌を成虫期に止めると、一種の休眠状態に入って生殖成熟がとまり、寿命が延びる現象がショウジョウバエやオオカバマダラといった昆虫で知られている。従って、これらの昆虫では、上記DNAにより、幼若ホルモンの合成を抑制することで、寿命を延長することが可能である。また、この現象を応用して、上記DNAにより、幼若ホルモンの合成を抑制することで、天敵昆虫（例えばテントウムシ）などを任意に休眠状態にして長期間貯蔵することが可能である。また、ミツバチの働き蜂では、加齢とともに幼若ホルモン濃度があがり、仕事の内容（行動）が変わることが知られている（笹川浩美（1999）環境昆虫学−行動・生理・化学生態 東京大学出版会 p143−172）。したがって、幼若ホルモンの合成を抑制すればミツバチの働き蜂の行動を制御できる。   Moreover, in adults such as stink bugs, it is possible to suppress reproductive maturation and induce dormancy by suppressing the synthesis of juvenile hormone by the above DNA. In addition, aphids and planthoppers have many types of cocoons, and there are varieties of potatoes and potatoes. A cocoon-shaped type can be produced by expressing the above DNA in aphid larvae and planthopper larvae that are originally sterile. In addition, when the secretion of juvenile hormone is stopped in the adult stage, it is known in insects such as Drosophila and Monarch butterfly that enter into a kind of dormancy, stop reproductive maturity, and extend lifespan. Therefore, in these insects, it is possible to extend the life span by suppressing the synthesis of juvenile hormone by the above DNA. In addition, by applying this phenomenon and suppressing the synthesis of juvenile hormone by the above DNA, natural enemy insects (for example, ladybirds) can be arbitrarily put into a dormant state and stored for a long time. Also, it is known that the concentration of juvenile hormone increases with age, and the content of the work (behavior) changes with bees in working bees (Hiromi Sasakawa (1999) Environmental Entomology-Behavior, Physiology, and Chemical Ecology The University of Tokyo Press Meeting p143-172). Therefore, if the synthesis of juvenile hormone is suppressed, the behavior of bees working bees can be controlled.

アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993）。   There are several factors as described below for the action of an antisense nucleic acid to suppress the expression of a target gene. Inhibition of transcription initiation by triplex formation, transcription inhibition by hybridization with a site where an open loop structure is locally created by RNA polymerase, transcription inhibition by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, intron and exon Splicing inhibition by hybridization at splice point, splicing inhibition by hybridization with spliceosome formation site, inhibition of translocation from nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA, hybridization with capping site and poly (A) addition site Inhibition of splicing, translation initiation inhibition by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation inhibition by hybridization with the ribosome binding site in the vicinity of the initiation codon, peptation by hybridization with the mRNA translation region and polysome binding site Elongation inhibition of de chain, and gene expression inhibition by hybrid formation at sites of interaction between nucleic acids and proteins, and the like. In this way, antisense nucleic acids suppress the expression of target genes by inhibiting various processes such as transcription, splicing, and translation (Hirashima and Inoue: Laboratory for Neonatal Chemistry 2 Nucleic Acid IV Gene Replication and Expression Pp.319-347, 1993).

本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法を用いることで、所望の生物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換される生物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。   The antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above. As one embodiment, if an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of the gene is designed, it is considered effective for inhibiting the translation of the gene. In addition, a sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. As described above, a DNA containing an antisense sequence of a non-translated region as well as a translated region of a gene is also included in the antisense DNA used in the present invention. The antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side. The DNA thus prepared can be transformed into a desired organism by using a known method. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence that is complementary to the endogenous gene or a part thereof that is possessed by the organism to be transformed, but is not completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. May be. The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, most preferably 95% or more, to the transcript of the target gene. In order to effectively suppress the expression of the target gene using the antisense sequence, the length of the antisense DNA is at least 15 bases, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. The length of the antisense DNA usually used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.

内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子: 蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990）。   Suppression of endogenous gene expression can also be performed using DNA encoding a ribozyme. A ribozyme refers to an RNA molecule having catalytic activity. Some ribozymes have a variety of activities, but research focusing on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner. Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as group I intron type and M1 RNA contained in RNase P, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type. (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka: Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191, 1990).

例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi M, et al: FEBS Lett 228: 228, 1988）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi M, et al: FEBS Lett 239: 285, 1988、小泉誠および大塚栄子: 蛋白質核酸酵素 35: 2191, 1990、 Koizumi M, et al: Nucl Acids Res 17: 7059, 1989）。例えば、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNA（配列番号：１、３、５、７、または９）中には、標的となり得る部位が複数存在する。   For example, the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves 3 ′ of C15 in the sequence G13U14C15, but base pairing between U14 and A9 is important for its activity, and instead of C15, A15 or U15 But it has been shown that it can be cleaved (Koizumi M, et al: FEBS Lett 228: 228, 1988). By designing a ribozyme whose substrate binding site is complementary to the RNA sequence in the vicinity of the target site, it is possible to create a restriction RNA-cleaving ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA (Koizumi M , et al: FEBS Lett 239: 285, 1988, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka: Protein Nucleic Acid Enzymes 35: 2191, 1990, Koizumi M, et al: Nucl Acids Res 17: 7059, 1989). For example, in DNA encoding juvenile hormone acid methyltransferase (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9), there are a plurality of sites that can be targets.

また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan JM: Nature 323: 349, 1986）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi Y & Sasaki N: Nucl Acids Res 19: 6751, 1991、菊池洋: 化学と生物 30: 112, 1992）。   Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. This ribozyme is found, for example, in the minus strand of tobacco ring spot virus satellite RNA (Buzayan JM: Nature 323: 349, 1986). It has been shown that a target-specific RNA-cleaving ribozyme can also be produced from a hairpin ribozyme (Kikuchi Y & Sasaki N: Nucl Acids Res 19: 6751, 1991, Hiroshi Kikuchi: Chemistry and Biology 30: 112, 1992).

標的を切断できるように設計されたリボザイムは、例えば、昆虫細胞中で任意の時期に転写されるように、ヒートショックプロモーターまたはテトラサイクリン応答性プロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたRNAの5'端や3'端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Taira K, et al: Protein Eng 3: 733, 1990、Dzianott AM & Bujarski JJ: Proc Natl Acad Sci USA 86: 4823, 1989、Grosshans CA & Cech TR: Nucl Acids Res 19: 3875, 1991、Taira K, et al: Nucl Acids Res 19: 5125, 1991）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Yuyama N, et al: Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。   A ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as a heat shock promoter or a tetracycline responsive promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed at any time in insect cells, for example. At this time, if an extra sequence is added to the 5 'or 3' end of the transcribed RNA, ribozyme activity may be lost. In such cases, RNA containing the transcribed ribozyme may be lost. It is also possible to place another trimming ribozyme that acts in cis on the 5 ′ side or 3 ′ side of the ribozyme portion in order to excise only the ribozyme portion from the protein (Taira K, et al: Protein Eng 3: 733, 1990, Dzianott AM & Bujarski JJ: Proc Natl Acad Sci USA 86: 4823, 1989, Grosshans CA & Cech TR: Nucl Acids Res 19: 3875, 1991, Taira K, et al: Nucl Acids Res 19: 5125, 1991). In addition, by arranging such structural units in tandem so that multiple sites within the target gene can be cleaved, the effect can be further enhanced (Yuyama N, et al: Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992). Thus, the expression of the gene can be suppressed by specifically cleaving the transcript of the target gene in the present invention using a ribozyme.

内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA interferance（RNAi）によっても行うことができる。RNAiとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。RNAiの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖RNAが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。RNAiは昆虫においても効果を奏することが知られている（Kennerdell, J.R. & Carthew, R.W.: Nat. Biotechnol. 18:896, 2000 ; Piccin, A. et al.: Nucleic Acid Res. 29:E55, 2001 ; Bettencourt, R. et al.: Insect Mol.Biol. 11:267, 2002 ; Hughes, C.L. & Kaufman, T.C.: Development 127:8683, 2000）。   Inhibition of endogenous gene expression can also be performed by RNA interferance (RNAi) using double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence. RNAi refers to a phenomenon in which, when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. Although the details of the RNAi mechanism are not clear, it is thought that the first introduced double-stranded RNA is decomposed into small pieces, and becomes an indicator of the target gene in some form, so that the target gene is decomposed. RNAi is also known to be effective in insects (Kennerdell, JR & Carthew, RW: Nat. Biotechnol. 18: 896, 2000; Piccin, A. et al .: Nucleic Acid Res. 29: E55, 2001 Bettencourt, R. et al .: Insect Mol. Biol. 11: 267, 2002; Hughes, CL & Kaufman, TC: Development 127: 8683, 2000).

本発明のDNAは、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary ‘hairpin’ RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A. et al. Nature, 407:319, 2000、Wesley, S.V. et al. Plant J. 27:581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001）として使用することが好ましい。   In the DNA of the present invention, an appropriate sequence (preferably an intron sequence) is inserted between inverted repeats of a target sequence to create a double-stranded RNA having a hairpin structure (self-complementary 'hairpin' RNA (hpRNA)). As a construct (Smith, NA et al. Nature, 407: 319, 2000, Wesley, SV et al. Plant J. 27: 581, 2001, Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29: E55, 2001) It is preferable to use it.

RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。   The DNA used for RNAi need not be completely identical to the target gene, but has at least 70%, preferably 80%, more preferably 90%, most preferably 95% or more sequence identity. . The sequence identity can be determined by the method described above.

本発明は、また、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。該ベクターとしては、例えば、任意の時期に誘導可能なプロモーターの下流に、本発明のDNAが結合した（機能的に結合した）ベクターが挙げられる。ここで、「機能的に結合した」とは、上記任意の時期に誘導可能なプロモーター領域に転写因子が結合することにより、本発明のDNAの発現が誘導されるように、上記任意の時期に誘導可能なプロモーター領域と本発明のDNAとが結合していることをいう。従って、本発明のDNAが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、上記任意の時期に誘導可能なプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。本発明のDNAが挿入されたベクターは、節足動物（好ましくは昆虫）の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤として利用することができる。   The present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted. Examples of the vector include a vector in which the DNA of the present invention is bound (functionally bound) downstream of a promoter that can be induced at any time. Here, the term “functionally linked” means that at any given time, the expression of the DNA of the present invention is induced by binding of a transcription factor to the promoter region that can be induced at any given time. It means that the inducible promoter region and the DNA of the present invention are bound. Therefore, even when the DNA of the present invention binds to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the transcription factor binds to the inducible promoter region at any time. If the expression of the fusion protein is induced by the above, it is included in the meaning of the above “functionally linked”. The vector into which the DNA of the present invention is inserted can be used as an agent for controlling molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism or life span of arthropods (preferably insects).

また、上記任意の時期に誘導可能なプロモーターとしては、例えば、ヒートショックプロモーターまたはテトラサイクリン応答性プロモーターなどが挙げられる。ヒートショックプロモーターまたはテトラサイクリン応答性プロモーターなど任意の時期に誘導可能なプロモーターの下流に、本発明のDNAが結合したベクターのコンストラクトは、文献（Uhlirova M et al. : Dev.Genes.Evol., 212:145-151、Bello, B. et al. : Development 125, 2193-2202, 1998）を参考に作製し、使用することができる。   Examples of promoters that can be induced at any time include heat shock promoters and tetracycline responsive promoters. A vector construct in which the DNA of the present invention is bound downstream of a promoter inducible at any time, such as a heat shock promoter or a tetracycline responsive promoter, is described in the literature (Uhlirova M et al .: Dev. Genes. Evol., 212: 145-151, Bello, B. et al .: Development 125, 2193-2202, 1998) and can be used.

また、本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のDNAを保持させたり、本発明のタンパク質を発現させるために利用することもできる。このようなベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。   The vector of the present invention can also be used to hold the DNA of the present invention in a host cell or to express the protein of the present invention. As such a vector, for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli in order to amplify it in large quantities in Escherichia coli (for example, JM109, DH5α, HB101, XL1Blue), etc. There is no particular limitation as long as it has a selected gene of E. coli that is transformed and has a selected gene (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)). .

ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。   Examples of vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like. In addition, for the purpose of subcloning and excision of cDNA, in addition to the above vector, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.

本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。   An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the protein of the present invention. As an expression vector, for example, for the purpose of expression in E. coli, in addition to the above characteristics that the vector is amplified in E. coli, the host is E. coli such as JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue, etc. In some cases, promoters that can be efficiently expressed in E. coli, such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al. , Science (1988) 240, 1041-1043), or the T7 promoter or the like. In addition to the above vectors, such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase). BL21 is preferred).

また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 ）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。   The vector may also contain a signal sequence for protein secretion. As a signal sequence for protein secretion, a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli. Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.

大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。   In addition to E. coli, for example, vectors for producing the protein of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), insect cell-derived expression vectors (eg, “Bac-to-BAC baculovairus expression system” (Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2) ), Animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia Expression Kit” (manufactured by Invitrogen), pNV11, SP-Q01), and an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50).

CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。   When intended for expression in animal cells such as CHO cells, COS cells, NIH3T3 cells, etc., a promoter necessary for expression in the cells, such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have MMLV-LTR promoter, EF1α promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells (for example, More preferably, it has a drug resistance gene that can be discriminated by a drug (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。   Furthermore, when the gene is stably expressed and the purpose is to amplify the copy number of the gene in the cell, a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway (for example, , PCHOI, etc.) and amplifying with methotrexate (MTX), and for the purpose of transient expression of the gene, COS having a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using cells. As the replication origin, those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used. Furthermore, for gene copy number amplification in host cell systems, the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.

一方、動物の生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdexlcw）やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo)などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning, 5.61-5.63）。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。   On the other hand, as a method for expressing the DNA of the present invention in the living body of an animal, the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, in vivo by a retrovirus method, a liposome method, a cationic liposome method, an adenovirus method, The method introduced into Examples of the vector to be used include, but are not limited to, an adenovirus vector (for example, pAdexlcw) and a retrovirus vector (for example, pZIPneo). General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to conventional methods (Molecular Cloning, 5.61-5.63). Administration to a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.

また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。   The present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced. The host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, E. coli and various animal cells can be used. The host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for production and expression of the protein of the present invention. Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.

真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。   When eukaryotic cells are used, for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as the host. Animal cells include mammalian cells such as CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells such as Xenopus eggs Mother cells (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9, Sf21, Tn5 are known. Examples of CHO cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO K-1 (Proc. Natl. Acad.), Which are CHO cells deficient in the DHFR gene. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be preferably used. In animal cells, CHO cells are particularly preferred for mass expression purposes. Introduction of a vector into a host cell can be performed by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), an electroporation method, a lipofection method, or the like.

植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。   As plant cells, for example, cells derived from Nicotiana tabacum are known as protein production systems, and these may be cultured in callus. As fungal cells, yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger, are known. .

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。   When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells. Examples of bacterial cells include E. coli, for example, JM109, DH5α, HB101, and others, and Bacillus subtilis is known.

これらの細胞を目的とするDNAにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。   These cells are transformed with the target DNA, and the proteins are obtained by culturing the transformed cells in vitro. The culture can be performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium for animal cells. At that time, a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed. The pH during culture is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.

一方、in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするDNAを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。   On the other hand, examples of systems that produce proteins in vivo include production systems that use animals and production systems that use plants. A target DNA is introduced into these animals or plants, and proteins are produced and collected in the animals or plants. The “host” in the present invention includes these animals and plants.

動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。   When animals are used, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, pigs, sheep, mice and cows can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Moreover, when using a mammal, a transgenic animal can be used.

例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。   For example, the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat β casein. Next, a DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat. The protein of interest can be obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that received the embryo or its offspring. Hormones may be used in transgenic goats as appropriate to increase the amount of milk containing proteins produced from transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702) .

また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。   Moreover, as an insect, a silkworm can be used, for example. When a silkworm is used, the target protein can be obtained from the body fluid of this silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which a DNA encoding the target protein is inserted (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望のタンパク質を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。   Furthermore, when using plants, for example, tobacco can be used. When tobacco is used, a DNA encoding a target protein is inserted into a plant expression vector, for example, pMON 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. This bacterium can be infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, to obtain the desired protein from the leaves of this tobacco (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. ( 1994) 24, 131-138).

これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。   The protein of the present invention thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (such as a medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein. The separation and purification of the protein may be performed using the separation and purification methods used in normal protein purification, and is not limited at all. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, proteins can be separated and purified.

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。   Examples of chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel). R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. The present invention also encompasses highly purified proteins using these purification methods.

なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。   In addition, the protein can be arbitrarily modified or the peptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification of the protein. Examples of protein modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase, and the like.

また、本発明は、本発明のDNAまたは本発明のベクターで形質転換された個体を提供する。このような個体としては、上述の個体が例示できるが、好ましくは形質転換された節足動物個体、より好ましくは昆虫個体が挙げられる。piggyBacなどの新しいトランスポゾンを使うことによって、色々な昆虫での形質転換が可能になっている（Handler A.M. Insect Biochem. Molec. Biol. 31:118-128., 2001、Atkinson, P.W. &James, A.A. Adv. Genet. 47:49-86.,2002.、Tamura, T. Nature Biotechnol. 18:81-84, 2000.）。   The present invention also provides an individual transformed with the DNA of the present invention or the vector of the present invention. Examples of such an individual include the above-mentioned individuals, preferably a transformed arthropod individual, more preferably an insect individual. By using new transposons such as piggyBac, transformation with various insects is possible (Handler AM Insect Biochem. Molec. Biol. 31: 118-128., 2001, Atkinson, PW & James, AA Adv. Genet. 47: 49-86., 2002., Tamura, T. Nature Biotechnol. 18: 81-84, 2000.).

例えば、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAをヒートショックプロモーターまたはテトラサイクリン応答性プロモーターなど任意の時期に誘導可能なプロモーターの下流に結合させたDNAが導入された形質転換昆虫を作成することで、該幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を任意に誘導することができる。これにより、本来幼若ホルモンの合成の停止する終齢幼虫において、幼若ホルモンの合成・分泌を継続させ、過剰幼虫脱皮を起こすことが可能である。   For example, a transformed insect introduced with a DNA in which the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention is introduced downstream of a promoter that can be induced at any time, such as a heat shock promoter or a tetracycline responsive promoter, is used. By making it, expression of DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase can be arbitrarily induced. As a result, it is possible to continue the synthesis and secretion of juvenile hormone in the infancy larvae, which originally stop the synthesis of juvenile hormone, and cause excessive larva molting.

また、例えば、本発明の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAに対するアンチセンス、センスまたはダブルストランドRNAをコードするDNAを、ヒートショックプロモーターまたはテトラサイクリン応答性プロモーターなどの任意の時期に誘導可能なプロモータの下流に結合させたDNAが導入された形質転換昆虫を作成することで、該幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードするDNAの発現を任意に停止し、これにより虫体内の幼若ホルモンの濃度を自在に低下できる。例えば、該形質転換昆虫の終齢以前の幼虫期において、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子の発現を抑制することで、幼若ホルモンの合成を抑制し、早期変態を任意に誘導できる。   In addition, for example, DNA encoding an antisense, sense or double-stranded RNA for the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase of the present invention can be induced at any time such as a heat shock promoter or a tetracycline responsive promoter. By creating a transformed insect introduced with DNA bound downstream of a promoter, the expression of the DNA encoding the juvenile hormone acid methyltransferase is arbitrarily stopped. The hormone concentration can be reduced freely. For example, by suppressing the expression of juvenile hormone acid methyltransferase gene in the larval stage before the final age of the transformed insect, the synthesis of juvenile hormone can be suppressed, and early metamorphosis can be arbitrarily induced.

また、本発明は、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体、これらの断片等が例示できる。   The present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention. Examples of the antibody of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody variants, and fragments thereof.

これらの抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、カイコ、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、またはオオタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。   These antibodies can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, a polyclonal antibody can be obtained as follows. Immunizing rabbits and other small animals with recombinant proteins expressed in microorganisms such as Escherichia coli as a fusion protein with juvenile hormone acid methyltransferase of silkworm, fruit fly, mosquito, scallop, or tobacco moth, or GST. Obtain serum. For example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera or juvenile hormone acid methyltransferase or synthetic peptide coupled with synthetic peptide, etc. Prepare by purifying by In the case of a monoclonal antibody, for example, immunization of a small animal such as a mouse with a juvenile hormone acid methyltransferase or a partial peptide thereof of silkworm, Drosophila, mosquito, Lotus moth, or tobacco moth, and the spleen is extracted from the mouse. Then, this is ground to separate the cells, and the cells and mouse myeloma cells are fused using a reagent such as polyethylene glycol. From the fused cells (hybridomas) formed thereby, silkworms, Drosophila, mosquitoes, Spodoptera litura, Alternatively, a clone producing an antibody that binds to the juvenile hormone acid methyltransferase of the tobacco tobacco is selected. Next, the obtained hybridoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, silkworm, Drosophila. It can be prepared by purification using an affinity column coupled with a juvenile hormone acid methyltransferase or a synthetic peptide of mosquito, scallop, or tobacco moth.

また、本発明において、「抗体変異体」とは、1またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、そして、最も好ましくは少なくとも95％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と100％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。   In the present invention, “antibody variant” refers to an amino acid sequence variant of an antibody in which one or more amino acid residues are modified. Any modified amino acid variant having the same binding specificity as the original antibody is included in the “antibody variant” of the present invention. Such variants are at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and most preferably the amino acid sequence of the variable domain of an antibody heavy or light chain Preferably it has less than 100% sequence homology or similarity with an amino acid sequence having at least 95% amino acid sequence homology or similarity.

本発明はまた、本発明のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。   The present invention also provides an oligonucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to the DNA of the present invention or a complementary strand thereof.

ここで「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの場合はU）、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80% 、より好ましくは90% 、さらに好ましくは95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。また、「オリゴヌクレオチド」にはポリヌクレオチドも含まれる。   Here, “complementary strand” refers to the other strand with respect to one strand of a double-stranded nucleic acid consisting of A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs. Further, the term “complementary” is not limited to the case where the sequence is completely complementary in at least 15 consecutive nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and even more preferably 95%. What is necessary is just to have the homology on the above base sequences. The algorithm described in the present specification may be used as an algorithm for determining homology. “Oligonucleotide” also includes polynucleotides.

本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該DNAの発現を検出するためのプローブやプライマーとして使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNAアレイの基板の形態で使用することができる。   The oligonucleotide of the present invention can be used as a probe or primer used for detection or amplification of DNA encoding the protein of the present invention, or as a probe or primer for detecting the expression of the DNA. Moreover, the oligonucleotide of the present invention can be used in the form of a substrate of a DNA array.

該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。   When the oligonucleotide is used as a primer, the length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp. The primer is not particularly limited as long as it can amplify at least part of the DNA of the present invention or its complementary strand. When used as a primer, the 3 ′ region can be complementary, and a restriction enzyme recognition sequence, a tag, or the like can be added to the 5 ′ side.

また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。   In addition, when the oligonucleotide is used as a probe, the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to at least a part of the DNA of the present invention or its complementary strand. The probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.

本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。 When the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after appropriately labeling. As a labeling method, a method of labeling by phosphorylating the 5 ′ end of the oligonucleotide with 32 P using T4 polynucleotide kinase, and a random hexamer oligonucleotide or the like using a DNA polymerase such as Klenow enzyme are used. Examples of the primer include a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin (random prime method or the like).

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。   The oligonucleotide of the present invention can be prepared, for example, by a commercially available oligonucleotide synthesizer. The probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.

本発明者らは、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子を単離した。これにより、該遺伝子を組み込んだプラスミド等のベクターDNAで形質転換した大腸菌、酵母などで組換えタンパク質を大量に合成し、それを利用して容易かつ安価に、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素に結合する化合物、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素の活性または発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことが可能となった。従って、本発明は、このような化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物は、節足動物（好ましくは昆虫）の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤として利用できる。また、スクリーニングにより、昆虫成長制御剤（「植物防疫講座第３版害虫・有害動物編 日本植物防疫協会 132ページ」や「農薬ハンドブック2001年度版、日本植物防疫協会 平成13年度 第11版、127ページ」）に該当する化合物も得られる。ここで、昆虫成長制御剤(Insect growth regulator; IGR)とは、昆虫に特異的に作用する薬剤であって、脱皮・変態をかく乱することにより、直接的に殺虫作用を示したり、また、殺卵作用や雌成虫の不妊化作用により次世代の虫数を減少させる作用を示す薬剤を意味するが、より詳細な定義は、上記文献を参照されたい。   We isolated the juvenile hormone acid methyltransferase gene. As a result, a large amount of recombinant protein was synthesized in Escherichia coli, yeast, etc. transformed with a vector DNA such as a plasmid incorporating the gene, and it was easily and inexpensively used to convert it into a juvenile hormone acid methyltransferase. It has become possible to screen for compounds that bind, and compounds that control the activity or expression of juvenile hormone acid methyltransferase. Accordingly, the present invention provides a screening method for such compounds. The compound obtained by the screening method of the present invention can be used as an agent for controlling molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryonic development, behavior, polymorphism or life span of arthropods (preferably insects). In addition, insect growth control agents ("Plant Protection Course 3rd Edition: Pests and Pests", page 132 of the Japanese Plant Protection Association) and "Agricultural Handbook 2001 Version, Japan Plant Protection Association 2001, 11th Edition, page 127 A compound corresponding to ")" is also obtained. Here, insect growth regulator (IGR) is an agent that acts specifically on insects, and shows direct insecticidal action by disrupting molting and metamorphosis. It means a drug that has the effect of reducing the number of next-generation insects by the action of eggs or the sterilization of adult females. For more detailed definitions, see the above-mentioned document.

本発明のスクリーニング方法の一つの態様は、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングに関するものである。このような方法としては、本発明のタンパク質に被験化合物を接触させ、該タンパク質と被験化合物との結合を検出し、そして本発明のタンパク質に結合する化合物を選択する工程を含む。   One embodiment of the screening method of the present invention relates to screening for compounds that bind to the protein of the present invention. Such a method includes the steps of bringing a test compound into contact with the protein of the present invention, detecting the binding between the protein and the test compound, and selecting a compound that binds to the protein of the present invention.

スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよいが、好ましくは組換えタンパク質である。また、スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質は部分ペプチドであってもよい。   The protein of the present invention used for screening may be a recombinant protein or a naturally derived protein, but is preferably a recombinant protein. The protein of the present invention used for screening may be a partial peptide.

被験化合物としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被験化合物を接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、可溶型タンパク質として、担体に結合させた形態として、他のタンパク質との融合タンパク質として被験化合物に接触させることができる。   There are no particular limitations on the test compound, for example, cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, non-peptidic compound, synthetic low molecular weight compound, Natural compounds are mentioned. The protein of the present invention to be contacted with the test compound can be contacted with the test compound as a purified protein, as a soluble protein, in a form bound to a carrier, or as a fusion protein with another protein.

本発明のタンパク質を用いて、これに結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードするDNAを、pSV2neo, pcDNA I, pCD8 などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては SV40 early promoter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol.3. Academic Press, London, p.83-141(1982))等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。   As a method for screening a protein that binds to the protein of the present invention, many methods known to those skilled in the art can be used. Such screening can be performed, for example, by immunoprecipitation. Specifically, it can be performed as follows. By inserting the DNA encoding the protein of the present invention into a vector for expressing a foreign gene such as pSV2neo, pcDNA I, or pCD8, the gene is expressed in an animal cell or the like. The promoter used for expression is SV40 early promoter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, London, p. 83-141 (1982)). Anything can be used.

動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法 (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987))、リン酸カルシウム法 (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、DEAEデキストラン法 (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985))、リポフェクチン法 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993))等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。   In order to express foreign genes by introducing genes into animal cells, electroporation (Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (1987)), calcium phosphate method (Chen, C and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987)), DEAE dextran method (Lopata, MA et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, DJ and Milman, G. Mol.Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985)), Lipofectin method (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, BT et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, SK et al. Science 259, 230-234 (1993)), etc., but any method may be used.

特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のタンパク質のN末またはC末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などとの融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。   By introducing a recognition site (epitope) of a monoclonal antibody whose specificity has been clarified into the N-terminus or C-terminus of the protein of the present invention, the protein of the present invention is expressed as a fusion protein having the recognition site of the monoclonal antibody. be able to. A commercially available epitope-antibody system can be used (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)). A vector capable of expressing a fusion protein with β-galactosidase, maltose binding protein, glutathione S-transferase, green fluorescent protein (GFP) and the like via a multicloning site is commercially available.

融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（His-tag）、インフルエンザ凝集素 HA、ヒトc-myc、FLAG、Vesicular stomatitis ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、T7 gene10 タンパク質（T7-tag）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（HSV-tag）、E-tag（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 13, 85-90 (1995)）。   In order to prevent the property of the protein of the present invention from changing as much as possible by using a fusion protein, a method for preparing a fusion protein by introducing only a small epitope consisting of several to a dozen amino acids has also been reported. Yes. For example, polyhistidine (His-tag), influenza agglutinin HA, human c-myc, FLAG, Vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-GP), T7 gene10 protein (T7-tag), human herpes simplex virus glycoprotein (HSV) -tag) and E-tag (epitope on monoclonal phage) and monoclonal antibodies that recognize them can be used as an epitope-antibody system for screening proteins that bind to the protein of the present invention (Experimental Medicine 13). , 85-90 (1995)).

免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のタンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。   In immunoprecipitation, an immune complex is formed by adding these antibodies to a cell lysate prepared using an appropriate surfactant. This immune complex comprises the protein of the present invention, a protein capable of binding to the protein, and an antibody. In addition to using an antibody against the above epitope, immunoprecipitation can be performed using an antibody against the protein of the present invention. The antibody against the protein of the present invention can be expressed, for example, by introducing a gene encoding the protein of the present invention into an appropriate E. coli expression vector and expressing it in E. coli, and purifying the expressed protein. It can be prepared by immunizing goats, chickens and the like. Moreover, it can also prepare by immunizing said animal with the synthetic | combination partial peptide of the protein of this invention.

免疫複合体は、例えば、抗体がマウスIgG 抗体であれば、Protein A SepharoseやProtein G Sepharoseを用いて沈降させることができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、GSTなどのエピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン-Sepharose 4Bなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。   For example, if the antibody is a mouse IgG antibody, the immune complex can be precipitated using Protein A Sepharose or Protein G Sepharose. In addition, when the protein of the present invention is prepared as a fusion protein with an epitope such as GST, for example, a substance that specifically binds to these epitopes such as glutathione-Sepharose 4B is used to Similar to the case of using an antibody, an immune complex can be formed.

免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Harlow,E. and Lane, D.: Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988) ）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。   For general methods of immunoprecipitation, for example, according to the method described in the literature (Harlow, E. and Lane, D .: Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)), or It may be done according to this.

免疫沈降されたタンパク質の解析にはSDS-PAGEが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明のタンパク質に結合したタンパク質は、クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である35S-メチオニンや35S-システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接SDS-ポリアクリルアミドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。 SDS-PAGE is generally used for the analysis of the immunoprecipitated protein. By using a gel with an appropriate concentration, the protein bound by the molecular weight of the protein can be analyzed. At this time, in general, the protein bound to the protein of the present invention is difficult to detect by ordinary protein staining methods such as Coomassie staining and silver staining, and therefore 35 S-methionine, which is a radioisotope, is used. Detection sensitivity can be improved by culturing cells in a culture medium containing 35 S-cysteine, labeling proteins in the cells, and detecting them. Once the molecular weight of the protein is known, the protein of interest can be purified directly from an SDS-polyacrylamide gel and its sequence determined.

また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に結合するタンパク質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Skolnik, E. Y. et al.,Cell (1991) 65, 83-90）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λgt11, ZAPなど）を用いたcDNAライブラリーを作製し、これをLB-アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、精製して標識した本発明のタンパク質と上記フィルターとを反応させ、本発明のタンパク質と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のタンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質に融合したタンパク質（例えばGSTなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。   Moreover, as a method for isolating a protein that binds to the protein of the present invention, for example, the West Western blotting method (Skolnik, EY et al., Cell (1991) 65, 83-90) is used. Can be done. That is, a cDNA library using a phage vector (λgt11, ZAP, etc.) is prepared from cells and tissues expected to express a protein that binds to the protein of the present invention and expressed on LB-agarose. Then, the protein expressed on the filter is fixed, purified and labeled with the protein of the present invention and the filter, and the plaque expressing the protein bound to the protein of the present invention is detected with the label. As a method for labeling the protein of the present invention, a method using the binding property of biotin and avidin, an antibody that specifically binds to the protein of the present invention or a protein fused to the protein of the present invention (for example, GST) is used. Examples thereof include a method, a method using a radioisotope, and a method using fluorescence.

また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた2-ハイブリッドシステム（Fields, S., and Sternglanz, R.,Trends. Genet. (1994) 10, 286-292、Dalton S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612、「MATCHMARKER Two-Hybrid System」,「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」,「MATCHMAKER One-Hybrid System」(いずれもクロンテック社製)、「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(ストラタジーン社製)）を用いて行う方法が挙げられる。   As another embodiment of the screening method of the present invention, a two-hybrid system using cells (Fields, S., and Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994) 10, 286-292, Dalton S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element.Cell 68, 597-612, MATCHMARKER Two-Hybrid System, Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit ”,“ MATCHMAKER One-Hybrid System ”(all manufactured by Clontech),“ HybriZAP Two-Hybrid Vector System ”(manufactured by Stratagene)).

2-ハイブリッドシステムにおいては、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをSRF DNA結合領域またはGAL4 DNA結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、VP16またはGAL4転写活性化領域と融合する形で発現するようなcDNAライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来cDNAを単離する（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したcDNAを大腸菌に導入して発現させることにより、該cDNAがコードするタンパク質を得ることができる。これにより本発明のタンパク質に結合するタンパク質またはその遺伝子を調製することが可能である。   In the 2-hybrid system, the protein of the present invention or a partial peptide thereof is fused with the SRF DNA binding region or GAL4 DNA binding region and expressed in yeast cells to express a protein that binds to the protein of the present invention. A cDNA library that can be expressed in a form fused with the VP16 or GAL4 transcriptional activation region is prepared from cells expected to be introduced into the yeast cell, and the library-derived cDNA is detected from the detected positive clone. (When a protein that binds to the protein of the present invention is expressed in yeast cells, the binding of the two activates the reporter gene, and a positive clone can be confirmed). By introducing the isolated cDNA into E. coli and expressing it, a protein encoded by the cDNA can be obtained. This makes it possible to prepare a protein that binds to the protein of the present invention or a gene thereof.

2-ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、HIS3遺伝子の他、Ade2遺伝子、LacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、PAI-1（Plasminogen activator inhibitor type1）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。2ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。   Examples of the reporter gene used in the 2-hybrid system include, but are not limited to, the HIS3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, luciferase gene, PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor type 1) gene, and the like. Not. Screening by the two-hybrid method can be performed by using mammalian cells in addition to yeast.

本発明のタンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のタンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される被験化合物を適用する。この場合の被験化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被験化合物を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製することができる。   Screening for a compound that binds to the protein of the present invention can also be performed using affinity chromatography. For example, a test compound that is expected to express a protein that binds to the protein of the present invention is applied to the protein of the present invention immobilized on a carrier of an affinity column. Examples of test compounds in this case include cell extracts and cell lysates. After applying the test compound, the column can be washed to prepare a protein bound to the protein of the present invention.

得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴDNAを合成し、該DNAをプローブとしてcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパク質をコードするDNAを得ることができる。   By analyzing the amino acid sequence of the obtained protein, synthesizing oligo DNA based on the amino acid sequence, and screening the cDNA library using the DNA as a probe, DNA encoding the protein can be obtained.

また、タンパク質に限らず、本発明のタンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法が当業者に公知である。   In addition, a method for isolating a compound that binds to the protein of the present invention is not limited to a protein. For example, a synthetic compound, a natural product bank, or a random phage peptide display library is allowed to act on the immobilized protein of the present invention. A person skilled in the art knows a method for screening a molecule that binds to the protein of the present invention and a screening method using high throughput by combinatorial chemistry technology.

本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段としては、例えば被験化合物に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明のタンパク質と被験化合物との間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばBIAcore、Pharmacia製）。したがって、BIAcore等のバイオセンサーを用いることにより本発明のタンパク質と被験化合物との結合を評価することが可能である。   In the present invention, the means for detecting or measuring the bound compound can be carried out, for example, by utilizing a label attached to the test compound. Examples of the type of label include a fluorescent label and a radiolabel. A biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can also be used. The biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can observe the interaction between the protein of the present invention and the test compound in real time as a surface plasmon resonance signal using a trace amount of protein and without labeling. There are (eg BIAcore, Pharmacia). Therefore, it is possible to evaluate the binding between the protein of the present invention and the test compound by using a biosensor such as BIAcore.

上記スクリーニングにより得られた化合物には、本発明のタンパク質の活性を制御する化合物や、本発明のDNAの発現を制御する化合物などが含まれる。本発明においては、上記スクリーニングにより得られた化合物を、後述のスクリーニング方法の被験化合物として使用することもできる。   The compounds obtained by the above screening include compounds that control the activity of the protein of the present invention, compounds that control the expression of the DNA of the present invention, and the like. In the present invention, the compound obtained by the above screening can also be used as a test compound for the screening method described later.

本発明におけるスクリーニング方法の別の態様は、本発明のタンパク質の活性を制御する化合物のスクリーニングに関するものである。このような方法としては、まず、本発明のタンパク質に被験化合物を接触させる。本発明のタンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。   Another embodiment of the screening method in the present invention relates to screening for compounds that regulate the activity of the protein of the present invention. As such a method, first, a test compound is brought into contact with the protein of the present invention. The state of the protein of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a purified state, a state expressed in a cell, a state expressed in a cell extract, or the like.

また、本発明のタンパク質が発現している細胞としては、内在性の本発明のタンパク質を発現している細胞、または外来性の本発明のタンパク質を発現している細胞が挙げられる。上記外来性の本発明のタンパク質を発現している細胞は、例えば、本発明のタンパク質をコードするDNAを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性の本発明のタンパク質を有する細胞は、例えば、本発明のタンパク質をコードするDNAを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性の本発明のタンパク質が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。   Examples of the cells expressing the protein of the present invention include cells expressing the endogenous protein of the present invention or cells expressing the foreign protein of the present invention. A cell expressing the exogenous protein of the present invention can be produced, for example, by introducing a vector containing DNA encoding the protein of the present invention into the cell. Introduction of a vector into a cell can be performed by a method common to those skilled in the art. In addition, a cell having the exogenous protein of the present invention can be prepared, for example, by inserting a DNA encoding the protein of the present invention into a chromosome by a gene transfer method utilizing homologous recombination. The biological species from which the cell into which such an exogenous protein of the present invention is introduced is derived is not particularly limited, and may be any biological species for which a technique for expressing the foreign protein in the cell has been established.

また、本発明のタンパク質が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、本発明のタンパク質をコードするDNAを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。   Examples of the cell extract in which the protein of the present invention is expressed include a cell extract obtained by adding a vector containing a DNA encoding the protein of the present invention to a cell extract contained in an in vitro transcription / translation system. it can. The in vitro transcription / translation system is not particularly limited, and a commercially available in vitro transcription / translation kit can be used.

また、本発明において「接触」は、本発明のタンパク質の状態に応じて行う。例えば、本発明のタンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被験化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、本発明のタンパク質が発現している細胞へ導入する、または該ベクターを本発明のタンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた2ハイブリッド法を利用することも可能である。   In the present invention, “contact” is performed according to the state of the protein of the present invention. For example, if the protein of the present invention is in a purified state, it can be carried out by adding a test compound to the purified preparation. Moreover, if it is the state expressed in the cell or the state expressed in the cell extract, it can be carried out by adding the test compound to the cell culture solution or the cell extract, respectively. When the test compound is a protein, for example, a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell in which the protein of the present invention is expressed, or a cell in which the protein of the present invention is expressed in the vector It can also be carried out by adding to the extract. Also, for example, a two-hybrid method using yeast or animal cells can be used.

別の態様では、次いで、上記本発明のタンパク質の活性を測定する。次いで、被験化合物を投与していない場合と比較して、該本発明のタンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する。   In another embodiment, the activity of the protein of the present invention is then measured. Next, a compound that increases or decreases the activity of the protein of the present invention is selected as compared with the case where the test compound is not administered.

本発明のタンパク質の活性としては、幼若ホルモン生成活性が挙げられる。例えば、実施例記載のように、JH I酸、JH II酸、JH III酸およびファルネセン酸などの幼若ホルモン酸を基質とした場合、反応液中にそれぞれに対応した活性型の幼若ホルモン、すなわち、JH I、JH II、JH IIIおよびファルネセン酸メチルの生成を確認することで、本発明のタンパク質の活性を測定できる。また、実施例に記載したHPLC分析の他、GC, GC/MS, LC/MS, RIA, 生物検定法等を利用して、本発明のタンパク質の活性を測定することもできる（大滝哲也、生理活性物質のバイオアッセイ、講談社、p.373-380.、1984; Rembold, H and Lackner, B.; J. Chromatogr. 323:355-361, 1985）。また、幼若ホルモン酸を含む反応液中のS-アデノシルメチオニンの減少量またはS-アデノシルホモシステインの生成量を各種の方法により測定することでも本発明のタンパク質の活性を測定できる。例えば、反応液中にアデノシルホモシステイン加水分解酵素(AdoHcy hydrolase）とアデノシンデアミナーゼ(adenosine deaminase)を共存させ、生成したS-アデノシルホモシステインを最終的にイノシンに変換し、S-アデノシルメチオニンからイノシンへの変換によって起こる265 nmでの吸光度の減少を測定することで行うことができる（Ogawa H. et al., 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85,694-698）。   The activity of the protein of the present invention includes juvenile hormone production activity. For example, as described in the examples, when juvenile hormone acids such as JH I acid, JH II acid, JH III acid and farnesenoic acid are used as substrates, the corresponding active juvenile hormone in the reaction solution, That is, the activity of the protein of the present invention can be measured by confirming the production of JH I, JH II, JH III, and methyl farnesate. In addition to the HPLC analysis described in the Examples, the activity of the protein of the present invention can also be measured using GC, GC / MS, LC / MS, RIA, bioassay, etc. (Tetsuya Otaki, Physiology Bioassays for active substances, Kodansha, p. 373-380., 1984; Rembold, H and Lackner, B .; J. Chromatogr. 323: 355-361, 1985). The activity of the protein of the present invention can also be measured by measuring the amount of S-adenosylmethionine decreased or the amount of S-adenosylhomocysteine produced in a reaction solution containing juvenile hormone acid by various methods. For example, in the reaction solution, adenosyl homocysteine hydrolase (AdoHcy hydrolase) and adenosine deaminase coexist, and the produced S-adenosyl homocysteine is finally converted into inosine, and S-adenosylmethionine This can be done by measuring the decrease in absorbance at 265 nm caused by the conversion of toinosine (Ogawa H. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 694-698).

上記スクリーニング方法としては、例えば、以下のような方法で実施できる。JH I酸、JH II酸、JH III酸またはファルネセン酸を含む反応液に被験化合物をあらかじめ混合して酵素反応を行い、反応後に生産された幼若ホルモン量を被験化合物を含まない場合と比較する。JH I酸、JH II酸、JH III酸またはファルネセン酸を含む反応液の組成は、実施例に記載しているものを使用することができる。   As the screening method, for example, the following method can be used. Test compounds are mixed in advance with a reaction solution containing JH I acid, JH II acid, JH III acid or farnesenoic acid, and an enzyme reaction is performed. The amount of juvenile hormone produced after the reaction is compared with the case where no test compound is contained. . As the composition of the reaction solution containing JH I acid, JH II acid, JH III acid or farnesenoic acid, those described in the Examples can be used.

本発明におけるスクリーニング方法の別の態様は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニングに関するものである。このような方法としては、まず、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ここで、「機能的に結合した」とは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。   Another embodiment of the screening method in the present invention relates to screening for compounds that control the expression level of the gene encoding the protein of the present invention. As such a method, first, a cell or a cell extract having DNA having a reporter gene operably linked downstream of the promoter region of the gene encoding the protein of the present invention is provided. Here, “functionally linked” means that the protein of the present invention is encoded such that expression of the reporter gene is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the gene encoding the protein of the present invention. It means that the promoter region of the gene to be linked to the reporter gene. Therefore, even when the reporter gene is bound to another gene and forms a fusion protein with another gene product, the transcription factor binds to the promoter region of the gene encoding the protein of the present invention. If the expression of the fusion protein is induced, it is included in the meaning of the above “functionally linked”.

上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、本発明のタンパク質をコードするDNAもまた含まれる。   The reporter gene is not particularly limited as long as its expression can be detected. For example, a CAT gene, a lacZ gene, a luciferase gene, a β-glucuronidase gene (GUS) and a GFP that are commonly used by those skilled in the art. A gene etc. can be mentioned. The reporter gene also includes DNA encoding the protein of the present invention.

別の態様においては、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。   In another embodiment, the test compound is then contacted with the cells or the cell extract. Next, the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract is measured. The expression level of the reporter gene can be measured by methods known to those skilled in the art depending on the type of reporter gene used. For example, when the reporter gene is a CAT gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting acetylation of chloramphenicol by the gene product. When the reporter gene is a lacZ gene, by detecting the color development of the dye compound catalyzed by the gene expression product, and when the reporter gene is a luciferase gene, the fluorescent compound catalyzed by the gene expression product By detecting fluorescence, and in the case of a β-glucuronidase gene (GUS), luminescence of Glucuron (ICN) or 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- By detecting the color development of β-glucuronide (X-Gluc), and in the case of a GFP gene, the expression level of the reporter gene can be measured by detecting fluorescence due to the GFP protein.

また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。   In addition, when the gene encoding the protein of the present invention is used as a reporter, the expression level of the gene can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, the transcription level of the gene can be measured by extracting mRNA of the gene according to a standard method and performing Northern hybridization or RT-PCR using the mRNA as a template. Furthermore, it is also possible to measure the expression level of the gene using DNA array technology.

また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子からコードされる本発明のタンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該本発明のタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、本発明のタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該本発明のタンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。   Further, a fraction containing the protein of the present invention encoded from the gene encoding the protein of the present invention is collected according to a standard method, and the expression of the protein of the present invention is detected by electrophoresis such as SDS-PAGE, It is also possible to measure the translation level of a gene. Moreover, it is also possible to measure the translation level of a gene by performing Western blotting using an antibody against the protein of the present invention and detecting the expression of the protein of the present invention.

別の態様においては、次いで、被験化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。   In another embodiment, a compound that increases or decreases the expression level of the reporter gene is then selected compared to when no test compound is administered.

本発明におけるスクリーニング方法のその他の態様としては、まず、昆虫個体または培養組織に被験化合物を接触させる。培養組織としては、アラタ体の培養組織が好適である。別の態様では、次いで、該昆虫個体または該培養組織における本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する。具体的には、被験化合物を接触させた昆虫個体または培養組織から、一定時間後にRNAを抽出し、該遺伝子の発現量を、定量的PCR、DNAマイクロアレイ、ノーザンなどで測定する。別の態様では、次いで、被験化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。   As another aspect of the screening method in the present invention, first, a test compound is brought into contact with an individual insect or a cultured tissue. As the cultured tissue, an Arata cultured tissue is preferable. In another embodiment, the expression level of the gene encoding the protein of the present invention in the insect individual or the cultured tissue is then measured. Specifically, RNA is extracted after a predetermined time from an insect individual or cultured tissue contacted with the test compound, and the expression level of the gene is measured by quantitative PCR, DNA microarray, Northern, or the like. In another embodiment, a compound that increases or decreases the expression level of the gene is then selected compared to when no test compound is administered.

図１は、昆虫および甲殻類に見られる幼若ホルモンとその前駆体の酸、および本発明による酵素の酵素反応を示す図である。JHAMTは幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を、AdoMetはS-アデノシルメチオニンを、AdoHcyはS-アデノシルホモシステインを示す。幼若ホルモン酸においてR1およびR2は、JH I酸ではR1＝CH3, R2＝CH3 、JH II酸ではR1＝CH3, R2＝H 、JH III酸ではR1＝H, R2＝H を示す。また、幼若ホルモンにおいてR1およびR2は、JH IではR1＝CH3, R2＝CH3 、JH IIではR1＝CH3, R2＝H 、JH IIIではR1＝H, R2＝H を示す。FIG. 1 is a diagram showing the enzymatic reaction of juvenile hormone and its precursor acid found in insects and crustaceans and the enzyme according to the present invention. JHAMT represents juvenile hormone acid methyltransferase, AdoMet represents S-adenosylmethionine, and AdoHcy represents S-adenosylhomocysteine. In juvenile hormone acids, R 1 and R 2 are R 1 = CH 3 , R 2 = CH 3 for JH I acid, R 1 = CH 3 , R 2 = H for JH II acid. In the case of JH III acid, R 1 = H, R 2 = H Indicates. In the juvenile hormone, R 1 and R 2 are R 1 = CH 3 , R 2 = CH 3 in JH I, and R 1 = CH 3 , R 2 = H in JH II. In JH III, R 1 = H, R 2 = H Indicates. 図２は、逆相HPLCによる幼若ホルモンの検出を示す図である。上から順に、JH III、JH II、JH I、ファルネセン酸メチルの検出を示す。FIG. 2 is a diagram showing detection of juvenile hormone by reversed-phase HPLC. In order from the top, detection of JH III, JH II, JH I and methyl farnesate is shown. 図３は、本発明による組換え酵素タンパク質のSDS電気泳動を示す写真である。レーン1及び4は、pET28aプラスミドで形質転換した大腸菌の粗抽出物可溶性画分（対照区）を示す。レーン2は、カイコ由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子を含むpET28aプラスミドで形質した大腸菌粗抽出物を示す。レーン3は、精製したカイコ由来組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質の可溶性画分を示す。レーン5は、ショウジョウバエ由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子を含むpET28aプラスミドで形質した大腸菌粗抽出物を示す。レーン6は精製したショウジョウバエ由来組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質を示す。矢印は、組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質を示す。FIG. 3 is a photograph showing SDS electrophoresis of the recombinant enzyme protein according to the present invention. Lanes 1 and 4 show the soluble fraction (control) of the crude extract of E. coli transformed with the pET28a plasmid. Lane 2 shows an E. coli crude extract transformed with the pET28a plasmid containing the silkworm-derived juvenile hormone acid methyltransferase gene. Lane 3 shows the soluble fraction of purified silkworm-derived recombinant juvenile hormone acid methyltransferase protein. Lane 5 shows an E. coli crude extract transformed with the pET28a plasmid containing the Drosophila-derived juvenile hormone acid methyltransferase gene. Lane 6 shows purified Drosophila-derived recombinant juvenile hormone acid methyltransferase protein. Arrow indicates recombinant juvenile hormone acid methyltransferase protein. 図４は、本発明による組み換えタンパク質の酵素活性を示す図である。Ｓは標準幼若ホルモン物質である。Ｊは、JH III酸(a)、JH II 酸(b)、JH I 酸(c)またはファルネセン酸(d)のいずれかとS-アデノシルメチオニンを基質としてカイコ由来組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素によって生じた反応産物である。それぞれの基質に対応した幼若ホルモン、すなわちJH III (a)、JH II (b)、JH I (c)、またはファルネセン酸メチル(d)の生成が認められる。Ｃは、Jと同じ基質を含む反応液中に酵素を加えない場合の反応産物である。幼若ホルモンの生成は全く起こらない。FIG. 4 is a diagram showing the enzyme activity of the recombinant protein according to the present invention. S is a standard juvenile hormone substance. J is a recombinant juvenile hormone acid methyl group derived from silkworm using JH III acid (a), JH II acid (b), JH I acid (c) or farnesenoic acid (d) and S-adenosylmethionine as a substrate. It is a reaction product produced by transferase. Production of juvenile hormones corresponding to each substrate, ie, JH III (a), JH II (b), JH I (c), or methyl farnesate (d) is observed. C is a reaction product when no enzyme is added to a reaction solution containing the same substrate as J. There is no generation of juvenile hormones. 図５は、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、オオタバコガ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列をマルチプルアライメントした結果を示す図である。図中Slはハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、Agは蚊（Anopheles gambiae）、Haはオオタバコガ（Helicoverpa armigera）、Bmはカイコ（Bombyx mori）、Dmはショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を示す。FIG. 5 is a diagram showing the results of multiple alignment of the amino acid sequences of juvenile hormone acid methyltransferases derived from Drosophila, mosquitoes, Spodoptera litura, and Tobacco spp. In the figure, Sl is Spodoptera litura, Ag is mosquito (Anopheles gambiae), Ha is Helicoverpa armigera, Bm is Bombyx mori, Dm is juvenile hormone methyl group transfer from Drosophila melanogaster Indicates enzyme.

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１） HPLCによる幼若ホルモン類の検出
逆相カラム（CAPCELL PAK C18 UG80 S-5, 3 x 150 mm, Shiseido）をHPLC装置（JASCO)に取り付け、紫外検出器で217 nmの吸光度を測定することにより、幼若ホルモン類の検出を行った。なお、この際流速は0.5 ml/min、カラム保持温度は40℃で、60％アセトニトリルまたは80％アセトニトリルで20分間サンプルを流した。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
(1) Detection of juvenile hormones by HPLC A reverse phase column (CAPCELL PAK C18 UG80 S-5, 3 x 150 mm, Shiseido) is attached to the HPLC system (JASCO), and the absorbance at 217 nm is measured with an ultraviolet detector. Thus, juvenile hormones were detected. At this time, the flow rate was 0.5 ml / min, the column holding temperature was 40 ° C., and the sample was allowed to flow for 20 minutes with 60% acetonitrile or 80% acetonitrile.

（実施例１） カイコの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のクローニング
アラタ体は極めて微細な組織なため（カイコの終齢幼虫でも直径0.1mm程度）、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のクローニングに必要な量のアラタ体由来RNAを得るために、多数の個体を解剖してアラタ体を集める必要がある。カイコは、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウやオオタバコガといった害虫に比べて大型で解剖がしやすく、また、アラタ体のサイズも大きい。さらに、人工飼料による大量飼育方法が確立されているので、実験に必要な発育ステージの揃った幼虫を大量に集めることが容易である。そこで、本発明者らは、まずカイコの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のクローニングを行った。 (Example 1) Cloning of silkworm juvenile hormone acid methyltransferase gene Since the Arata body is a very fine tissue (even silkworm larvae are about 0.1 mm in diameter), the juvenile hormone acid methyltransferase gene In order to obtain the amount of Arata-derived RNA necessary for cloning, it is necessary to dissect a large number of individuals and collect the Arata bodies. Silkworms are larger and easier to dissect than pests such as Drosophila, mosquitoes, Spodoptera litura, and Tobacco spp. Furthermore, since a large-scale breeding method using an artificial feed has been established, it is easy to collect a large amount of larvae having the same growth stage necessary for the experiment. Therefore, the present inventors first cloned a juvenile hormone acid methyltransferase gene of silkworm.

4齢初期〜蛹まで24段階の発育ステージ（1ステージにつき約40頭ｘ24ステージで、約1000頭解剖した）に分別したカイコのアラタ体から抽出したRNAを鋳型とし、5'末端をローダミンでラベルしたFP1プライマー(配列番号：１１)を用いた逆転写反応によって24種のcDNAを作成した。このcDNAを鋳型として、蛍光プライマーFP1と任意の配列を持つデカマー（合計24種を使用）を用いてPCR反応を行うことにより、蛍光ラベル化cDNAを増幅した。増幅したcDNAを変成アクリルアミドゲルで分離後、蛍光イメージアナライザー(FMBIO II, Takara社)でスキャンし、cDNAバンドを検出した。本発明者らは、さまざまな発育特異的発現パターンを示す約400本のcDNAバンドを調べた。その結果、プライマーFP1とプライマーUP1(配列番号：１２）との組み合わせで増幅したcDNAにおいて、4齢幼虫期には継続して発現するが、5齢幼虫の3日目以後に消失する1本の蛍光バンドを発見した。この蛍光バンドからcDNA断片を抽出し、その塩基配列を決定した。   RNA extracted from silkworm arata separated into 24 stages of development from early stage 4 to pupae (about 40 heads x 24 stages per stage, dissected about 1000 heads), and 5 'end labeled with rhodamine Twenty-four cDNAs were prepared by reverse transcription using the prepared FP1 primer (SEQ ID NO: 11). Using this cDNA as a template, a PCR reaction was performed using a fluorescent primer FP1 and a decamer having an arbitrary sequence (a total of 24 species were used) to amplify the fluorescently labeled cDNA. The amplified cDNA was separated on a modified acrylamide gel and then scanned with a fluorescence image analyzer (FMBIO II, Takara) to detect a cDNA band. The inventors examined approximately 400 cDNA bands exhibiting various development-specific expression patterns. As a result, in the cDNA amplified by the combination of the primer FP1 and the primer UP1 (SEQ ID NO: 12), one gene that is continuously expressed in the 4th instar larva stage but disappears after the 3rd day of the 5th instar larvae. A fluorescent band was found. A cDNA fragment was extracted from this fluorescent band, and its base sequence was determined.

決定した塩基配列に基づいてプライマーを設計し、さらにRT-PCRの変法の１種である5'RACEおよび3'RACEを、SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH社)を用いて行うことにより、このcDNAの全長をクローニングした。なお、3'-RACEにおいてはBM3Rプライマー（配列番号：１３）を用いて全塩基配列の1880〜2890番目の領域を増幅し、5'-RACEにおいてはBM5Rプライマー（配列番号：１４）を用いて全塩基配列の1〜1904番目の領域を増幅し、塩基配列を決定した（配列番号：１）。
以上のように、蛍光mRNAディファレンシャルディスプレイ法、5'-RACEおよび3'-RACEによりクローニングした領域を重ね合わせて、カイコの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のcDNAの全長を決定した。 Primers are designed based on the determined nucleotide sequence, and 5'RACE and 3'RACE, which are one of RT-PCR variants, are performed using SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH). The full length cDNA was cloned. In 3′-RACE, the BM3R primer (SEQ ID NO: 13) is used to amplify the 1880-2890th region of the entire base sequence, and in 5′-RACE, the BM5R primer (SEQ ID NO: 14) is used. The 1st to 1904th region of the entire base sequence was amplified and the base sequence was determined (SEQ ID NO: 1).
As described above, regions cloned by the fluorescent mRNA differential display method, 5′-RACE and 3′-RACE were overlapped to determine the total length of the silkworm juvenile hormone acid methyltransferase cDNA.

（実施例２） 幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターの作成
（実施例１）に記載の方法に従って単離した遺伝子のオープンリーディングフレームを含む領域を、カイコ4齢幼虫のアラタ体由来のcDNAを鋳型とし、BMJFプライマー（配列番号：１５）とBMJRプライマー（配列番号：１６）を用いたPCRによって増幅し、増幅されたDNAを制限酵素NdeIとBamHIで切断後、ヒスチジンタグ融合タンパク質作成用の大腸菌発現ベクターpET-28a(+)（Novagen社）のNdeI-BamHIサイトにクローニングした。 (Example 2) Preparation of expression vector incorporating juvenile hormone acid methyltransferase gene A region containing an open reading frame of a gene isolated according to the method described in (Example 1) Amplified by PCR using BMJF primer (SEQ ID NO: 15) and BMJR primer (SEQ ID NO: 16) using the body-derived cDNA as a template, cleaved the amplified DNA with restriction enzymes NdeI and BamHI, and then fused with histidine tag It was cloned into the NdeI-BamHI site of E. coli expression vector pET-28a (+) (Novagen) for protein production.

（実施例３） 組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質の調製
作成したプラスミドをエレクトロポレーション法により、大腸菌株BL21(DE3)に導入し、形質転換された大腸菌株を得た。この形質転換された大腸菌株をカナマイシン50μg/mlを含むLB培地（5ml）で37℃で一晩振とう培養し、その培養液0.2mlを、液体培地200 mlに加えて20℃で24時間、振とう培養した。培養液から増殖した菌体を遠心分離（3500rpm,10分、4℃）により回収し、-30℃で凍結した。凍結した菌体を室温で融解後、培養液50ml当たり5mlのバッファー（50 mM Tris-Cl, pH7.5）を加えてけん濁後、冷却条件下で超音波によって破砕した。これを遠心分離後（14000rpm, 15分,4℃）、上精を採取し、0.45μmのフィルターで濾過後、ヒスチジンタグ融合タンパク質精製キット（HiTrap Kit、Amersham社）によって組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素を精製した。溶出した組換えタンパク質は、脱塩カラム(PD-10、Amersham社）を用いて、イミダゾールを除去後、25 mM Tris-Clバッファー、pH7.5、50%グリセロール溶液として-30℃に保存した。収量は、培養液50mlから、約4mg（総液量7ml）であった（図３）。 (Example 3) Preparation of recombinant juvenile hormone acid methyltransferase protein The prepared plasmid was introduced into E. coli strain BL21 (DE3) by electroporation to obtain a transformed E. coli strain. This transformed Escherichia coli strain was cultured with shaking in LB medium (5 ml) containing kanamycin 50 μg / ml overnight at 37 ° C., and 0.2 ml of the culture solution was added to 200 ml of liquid medium for 24 hours at 20 ° C. Cultured with shaking. The cells grown from the culture were collected by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes, 4 ° C.) and frozen at −30 ° C. The frozen cells were thawed at room temperature, added with 5 ml of buffer (50 mM Tris-Cl, pH 7.5) per 50 ml of the culture solution, suspended, and disrupted by ultrasound under cooling conditions. After centrifugation (14000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.), the supernatant is collected, filtered through a 0.45 μm filter, and then recombined methyl methyl juvenile hormone using a histidine tag fusion protein purification kit (HiTrap Kit, Amersham). The transferase was purified. The eluted recombinant protein was stored at −30 ° C. as a 25 mM Tris-Cl buffer, pH 7.5, 50% glycerol solution after removing imidazole using a desalting column (PD-10, Amersham). The yield was about 4 mg (total liquid volume 7 ml) from 50 ml of the culture solution (FIG. 3).

（実施例４） 組換え幼若ホルモン酸メチル基転移酵素による幼若ホルモンの合成
シリコン処理したガラス試験管（10x150mm）に、トルエンに溶かしたJH I酸、JH II酸、JH III酸、またはファルネセン酸のいずれかの幼若ホルモン酸100μgをガラスキャピラリーで移し、窒素気流下、溶媒を除去する。これに、バッファー（50 mM Tris-Cl, pH7.5）800 μlおよび10 mM S-アデノシルメチオニン溶液100μlを加えてよく混合後、25℃の恒温水槽中で5分間放置する。これに、（実施例３）の方法で得られた組換えタンパク質液100μlを加え、酵素反応を開始した。10分後に、反応停止液（メタノール：水：濃アンモニア水、10：9：1）250μlを加えて酵素反応を停止した後、イソオクタン1mlを加えてよく混合後、遠心分離(2000rpm、15分、室温)によって有機溶媒相と水相を分離し、有機溶媒相100μlを小型のバイアルにグラスキャピラリーで移し、窒素気流により溶媒除去後、残さを100μlのアセトニトリルに溶解し、逆相HPLCを用いた方法により、合成された幼若ホルモンを分析した。その結果、JH I酸、JH II酸、JH III酸およびファルネセン酸を基質とした場合、反応液中にそれぞれに対応した活性型の幼若ホルモン、すなわち、JH I、JH II、JH IIIおよびファルネセン酸メチルが生成することが確認された（図４）。緩衝液：Tris-HCl（50 mM, pH7.5）、反応温度：25℃、基質：S-アデノシルメチオニン 1 mM、各JH酸 100μM条件下で測定した組換えカイコJHAMTのJHI酸、JHII酸、JHIII酸、ファルネセン酸に対する分子活性（１分間に酵素１分子が反応産物に変える基質の分子数）は、それぞれ、1.80±0.32, 1.65±0.23, 0.79±0.06, 0.48±0.07（平均値±標準偏差、n=3）であった。なお、飽和直鎖脂肪酸または不飽和直鎖脂肪酸を基質とした場合、本酵素によるメチルエステル化は認められず、本酵素の反応は幼若ホルモン酸に対して基質特異的であった。 (Example 4) Synthesis of juvenile hormone by recombinant juvenile hormone acid methyltransferase In a silicon-treated glass test tube (10 x 150 mm), JH I acid, JH II acid, JH III acid or farnesene dissolved in toluene 100 μg of juvenile hormone acid of any of the acids is transferred with a glass capillary and the solvent is removed under a nitrogen stream. To this, 800 μl of buffer (50 mM Tris-Cl, pH 7.5) and 100 μl of 10 mM S-adenosylmethionine solution are added and mixed well, then left in a constant temperature water bath at 25 ° C. for 5 minutes. To this was added 100 μl of the recombinant protein solution obtained by the method of (Example 3), and the enzyme reaction was started. After 10 minutes, 250 μl of reaction stop solution (methanol: water: concentrated aqueous ammonia, 10: 9: 1) was added to stop the enzyme reaction, 1 ml of isooctane was added and mixed well, and then centrifuged (2000 rpm, 15 minutes, The organic solvent phase is separated from the aqueous phase by room temperature), 100 μl of the organic solvent phase is transferred to a small vial with a glass capillary, the solvent is removed by a nitrogen stream, the residue is dissolved in 100 μl of acetonitrile, and the method using reverse phase HPLC Thus, the synthesized juvenile hormone was analyzed. As a result, when JH I acid, JH II acid, JH III acid and farnesenoic acid were used as substrates, the corresponding active juvenile hormones in the reaction solution, ie, JH I, JH II, JH III and farnesene, respectively. It was confirmed that methyl acid was formed (FIG. 4). Buffer: Tris-HCl (50 mM, pH 7.5), Reaction temperature: 25 ° C., Substrate: S-adenosylmethionine 1 mM, each JH acid JHI acid and JHII acid of JHAMT measured under 100 μM conditions , JHIII acid, and farnesenoic acid molecular activity (number of molecules of the substrate that one enzyme molecule converts into a reaction product per minute) are 1.80 ± 0.32, 1.65 ± 0.23, 0.79 ± 0.06, 0.48 ± 0.07, respectively (average value ± standard) Deviation, n = 3). When saturated linear fatty acid or unsaturated linear fatty acid was used as a substrate, methyl esterification by this enzyme was not observed, and the reaction of this enzyme was substrate-specific for juvenile hormone acid.

（実施例５） ショウジョウバエおよび蚊の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のクローニング
配列番号：２に示したカイコ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列を用いて、BLASTプログラムによってショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびマラリアの重要なベクターである蚊（Anopheles gambiae）の全ゲノムデータベースの検索を行った。その結果、ショウジョウバエゲノムからは、カイコ幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列（配列番号：２）と38％の一致率を示す配列番号：４に示すアミノ酸配列をコードするDNA（配列番号：３）を見いだした。 Example 5 Cloning of Drosophila and Mosquito Juvenile Hormone Methyltransferase Genes Using the amino acid sequence of the silkworm-derived juvenile hormone acid methyltransferase shown in SEQ ID NO: 2, Drosophila ( A genome-wide database of mosquitoes (Anopheles gambiae), an important vector of Drosophila melanogaster, and malaria was searched. As a result, from the Drosophila genome, a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 4) showing 38% identity with the amino acid sequence of the silkworm juvenile hormone acid methyltransferase (SEQ ID NO: 2). 3) I found it.

ショウジョウバエ成虫全体から抽出したRNAから逆転写反応により合成したcDNAを鋳型として、DMJFプライマー（配列番号：１７）とDMJRプライマー（配列番号：１８）を用いたPCRによってショウジョウバエ由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のコーディング領域を増幅し、(実施例２)と同様の方法によって作成した発現ベクターを用いて、(実施例３)と同様の方法によって作成した組換えタンパク質の活性を、(実施例４)と同様の方法によって調べることで、本遺伝子がコードするタンパク質が幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有することを確認した。緩衝液：Tris-HCl（50 mM, pH7.5）、反応温度：25℃、基質：S-アデノシルメチオニン 1 mM、各JH酸 100μM条件下で測定した組換えショウジョウバエJHAMTのJH I酸、JHII酸、JHIII酸、ファルネセン酸に対する分子活性は、それぞれ、2.67±0.44, 2.07±0.26, 1.76±0.13, 2.3±0.51（平均値±標準偏差、n=3）であった。   Drosophila-derived juvenile hormone acid methyl group transfer by PCR using DMJF primer (SEQ ID NO: 17) and DMJR primer (SEQ ID NO: 18) using cDNA synthesized by reverse transcription reaction from RNA extracted from all Drosophila adults as a template The activity of the recombinant protein prepared by the same method as in (Example 3) was amplified using the expression vector prepared by the same method as in (Example 2) after amplifying the coding region of the enzyme gene (Example 4). ), The protein encoded by this gene was confirmed to have juvenile hormone acid methyltransferase activity. Buffer: Tris-HCl (50 mM, pH 7.5), reaction temperature: 25 ° C., substrate: S-adenosylmethionine 1 mM, each JH acid measured under 100 μM JH I acid, JH I acid of JHAMT The molecular activities for acid, JHIII acid and farnesenoic acid were 2.67 ± 0.44, 2.07 ± 0.26, 1.76 ± 0.13, 2.3 ± 0.51 (mean ± standard deviation, n = 3), respectively.

また、本発明者は、データベースを用いて、蚊の全ゲノム配列中から、カイコ幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列と38％、ショウジョウバエの該酵素のアミノ酸配列と47％の一致率を示す配列番号：６に示すアミノ酸配列をコードする蚊由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素をコードする遺伝子（配列番号：５）を見いだした。幼若ホルモン酸メチル基転移酵素が昆虫の生存に必須で該遺伝子が蚊のゲノム中にも必ず存在すること、また蚊の全ゲノム中に他に類似の配列を持つ遺伝子は存在しないことから、本遺伝子が蚊の該酵素をコードすることは自明である。   In addition, the present inventor uses a database to calculate a concordance rate of 38% with the amino acid sequence of silkworm juvenile hormone acid methyltransferase and 47% with the amino acid sequence of Drosophila A gene (SEQ ID NO: 5) encoding a mosquito-derived juvenile hormone acid methyltransferase encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 was found. The juvenile hormone acid methyltransferase is essential for the survival of insects, and the gene is always present in the mosquito genome, and there are no other genes with similar sequences in the entire mosquito genome. It is obvious that this gene encodes the enzyme of mosquito.

（実施例６） 鱗翅目害虫の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子のクローニング
多くの農作物を加害する重要害虫であるハスモンヨトウ（Spodoptera litura）およびオオタバコガ（Helicoverpa armigera）の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素遺伝子は以下のようにしてクローニングした。 (Example 6) Cloning of juvenile hormone acid methyltransferase gene of lepidopterous pests Juvenile hormone acid methyltransferases of Spodoptera litura and Helicoverpa armigera, which are important insects that harm many crops The gene was cloned as follows.

配列番号：２に示したカイコ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列と、配列番号：４に示したショウジョウバエ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列を比較し、両者のよく保存されたアミノ酸配列領域に基づいて2種のディジェネレートプライマー、すなわち正方向のプライマーとしてDGJFプライマー（配列番号：１９；アミノ酸配列のMVKYANKHをコード）、および逆方向のプライマーとしてDGJRプライマー（配列番号：２０；アミノ酸配列のFDHVFSFYをコード）を作成した。これらのプライマーを用いてハスモンヨトウ終前齢幼虫またはオオタバコガ終前齢幼虫のアラタ体から抽出したRNAから逆転写反応により合成したcDNAを鋳型として、それぞれPCR反応を行い、約120bpのサイズを有するDNA断片を得、それらの塩基配列を決定した。決定した塩基配列に基づいて特異的プライマーを設計し、さらにRT-PCRの変法の１種である5'RACEおよび3'RACEを、SMART RACE cDNA Ampliffication Kit (CLONTECH社）を用いて行うことにより、ハスモンヨトウおよびオオタバコガ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のコーディング領域全体を含むcDNAをクローニングした。   The amino acid sequence of the silkworm-derived juvenile hormone acid methyltransferase shown in SEQ ID NO: 2 is compared with the amino acid sequence of the Drosophila-derived juvenile hormone acid methyltransferase shown in SEQ ID NO: 4. Two degenerate primers based on well-conserved amino acid sequence regions: DGJF primer (SEQ ID NO: 19; encodes amino acid sequence MVKYANKH) as a forward primer and DGJR primer (sequence) as a reverse primer No. 20: Coded FDHVFSFY of amino acid sequence). A DNA fragment having a size of about 120 bp by performing a PCR reaction using as a template a cDNA synthesized by reverse transcription from RNA extracted from the Arata body of the early larvae of the long-eared Spodoptera litura or the larvae of the last larva of Tobacco using these primers. And their nucleotide sequences were determined. By designing specific primers based on the determined nucleotide sequence, and further performing 5'RACE and 3'RACE, which are modified RT-PCR methods, using the SMART RACE cDNA Ampliffication Kit (CLONTECH) We cloned a cDNA containing the entire coding region of juvenile hormone acid methyltransferase from Spodoptera litura and Spodoptera litura.

なお、ハスモンヨトウ由来該遺伝子の3'-RACEにおいてはSL3Rプライマー（配列番号：２１）を用いて全塩基配列の366〜994の領域を増幅し、5'-RACEにおいてはSL5Rプライマー（配列番号：２２）を用いて全塩基配列の1〜393の領域を増幅し、両者を重ね合わせて全塩基配列を決定した。オオタバコガ由来該遺伝子の3'-RACEにおいてはHA3Rプライマー（配列番号：２３）を用いて全塩基配列の366〜1193の領域を増幅し、5'-RACEにおいてはHA5Rプライマー（配列番号：２４）を用いて全塩基配列の1〜391の領域を増幅し、塩基配列を決定した。   In addition, in 3'-RACE of the gene derived from Spodoptera litura, the SL3R primer (SEQ ID NO: 21) was used to amplify the region from 366 to 994 of the entire base sequence, and in 5'-RACE, the SL5R primer (SEQ ID NO: 22). ) Was used to amplify the region of 1 to 393 of the entire base sequence, and both were overlapped to determine the entire base sequence. In the 3′-RACE of the gene derived from tobacco tobacco, the HA3R primer (SEQ ID NO: 23) is used to amplify the region from 366 to 1193 of the entire base sequence, and in the 5′-RACE, the HA5R primer (SEQ ID NO: 24) is amplified. The region of 1 to 391 of the entire base sequence was amplified to determine the base sequence.

得られたcDNA配列（配列番号：７）から推定されたハスモンヨトウ由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列を配列番号：８に示した。カイコ由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素とのアミノ酸配列の一致率は48％であった。また、得られたcDNA配列（配列番号：９）から推定されたオオタバコガ由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列を配列番号：１０に示した。カイコ由来幼若ホルモン酸メチル基転移酵素とのアミノ酸配列の一致率は54％であった。   The amino acid sequence of the juvenile scallop-derived juvenile hormone acid methyltransferase deduced from the obtained cDNA sequence (SEQ ID NO: 7) is shown in SEQ ID NO: 8. The coincidence rate of amino acid sequence with silkworm-derived juvenile hormone acid methyltransferase was 48%. In addition, the amino acid sequence of juvenile hormone acid methyltransferase deduced from tobacco tobacco deduced from the obtained cDNA sequence (SEQ ID NO: 9) is shown in SEQ ID NO: 10. The concordance rate of the amino acid sequence with the silkworm-derived juvenile hormone acid methyltransferase was 54%.

ハスモンヨトウ前終齢幼虫のアラタ体から抽出したRNAから逆転写反応により合成したcDNAを鋳型として、コーディング領域を、プライマーSLJF（配列番号：２５）、SLJR（配列番号：２６）を用いたPCRによって増幅し、(実施例２)と同様の方法によって作成した発現ベクターを用いて、(実施例３)と同様の方法によって作成した組換えタンパク質の活性を、(実施例４)と同様の方法によって調べることで、本遺伝子がコードするタンパク質が幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有することを確認した。   Amplification by PCR using primers SLJF (SEQ ID NO: 25) and SLJR (SEQ ID NO: 26), using as a template a cDNA synthesized by reverse transcription from RNA extracted from the Arata body of the premature larvae of Spodoptera litura Then, using the expression vector prepared by the same method as in (Example 2), the activity of the recombinant protein prepared by the same method as in (Example 3) is examined by the same method as in (Example 4). Thus, it was confirmed that the protein encoded by this gene has juvenile hormone acid methyltransferase activity.

また、オオタバコガ前終齢幼虫のアラタ体から抽出したRNAから逆転写反応により合成したcDNAを鋳型として、コーディング領域を、HAJFプライマー（配列番号：２７）、およびHAJRプライマー（配列列番号：２８）を用いたPCRによって増幅し、(実施例２)と同様の方法によって作成した発現ベクターを用いて、(実施例３)と同様の方法によって作成した組換えタンパク質の活性を、(実施例４)と同様の方法によって調べることで、本遺伝子がコードするタンパク質が幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有することを確認した。   In addition, using a cDNA synthesized by reverse transcription reaction from RNA extracted from the Arata body of pre-old larvae of the tobacco tobacco as a template, the coding region was designated as HAJF primer (SEQ ID NO: 27), and HAJR primer (SEQ ID NO: 28). The activity of the recombinant protein produced by the same method as in (Example 3) using the expression vector produced by the same method as in (Example 2) amplified by the PCR used, and (Example 4) By examining by the same method, it was confirmed that the protein encoded by this gene has juvenile hormone acid methyltransferase activity.

（実施例７） 幼若ホルモン酸メチル基転移酵素の一次構造の比較
本発明者らは、ショウジョウバエ、蚊、ハスモンヨトウ、オオタバコガ由来の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸配列の比較を行った（図５）。その結果、保存されているアミノ酸配列として、以下の（１）〜（７）の7つのモチーフを見出した。このうち（２）は、メチルトランスフェラーゼのコンセンサス配列（S-アデノシルメチオニン結合配列の一部）（L(D/E)oGsGsG（配列番号：２９）; oは疎水性アミノ酸、sは低分子量中性アミノ酸；Gomi, T et al.,Int. J. Biochem. 24:1639, 1992; Kagan, R.M. &Clarke, S., Arch. Biochem.Biophys. 310:417, 1994; Vidgren, J. et al., Science, 368:354, 1994)と一致しており、 S-アデノシルメチオニンの結合に関与すると推定される。
（１）1 MNNAXLY(Q/E)(H/K/Q)ANSoQKRDA（配列番号：３０）
（２）38 (L/V/I)LD(L/V/I)GCGDG（配列番号：３１）
（３）62 (Q/R/K)L(L/V)GCDISE(Q/K)MV（配列番号：３２）
（４）104 FDHVFSFY(C/T/A)LHWV（配列番号：３３）
（５）145 P(V/I)FD(V/I/L)YR(I/V)L（配列番号：３４）
（６）165 DVE(K/R)YISPYHDS（配列番号：３５）
（７）263 YKL(I/V/L)VVYARK（配列番号：３６）
（１）〜（７）の先頭の番号は各モチーフに対応するカイコの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素のアミノ酸残基の番号である。 (Example 7) Comparison of primary structure of juvenile hormone acid methyltransferase We compared the amino acid sequences of juvenile hormone acid methyltransferases from Drosophila, mosquito, Spodoptera litura, and Tobacco spp. FIG. 5). As a result, the following seven motifs (1) to (7) were found as conserved amino acid sequences. Among these, (2) is methyltransferase consensus sequence (part of S-adenosylmethionine binding sequence) (L (D / E) oGsGsG (SEQ ID NO: 29); o is a hydrophobic amino acid, s is in low molecular weight Gomi, T et al., Int. J. Biochem. 24: 1639, 1992; Kagan, RM & Clarke, S., Arch. Biochem. Biophys. 310: 417, 1994; Vidgren, J. et al., Science, 368: 354, 1994) and presumed to be involved in the binding of S-adenosylmethionine.
(1) 1 MNNAXLY (Q / E) (H / K / Q) ANSoQKRDA (SEQ ID NO: 30)
(2) 38 (L / V / I) LD (L / V / I) GCGDG (SEQ ID NO: 31)
(3) 62 (Q / R / K) L (L / V) GCDISE (Q / K) MV (SEQ ID NO: 32)
(4) 104 FDHVFSFY (C / T / A) LHWV (SEQ ID NO: 33)
(5) 145 P (V / I) FD (V / I / L) YR (I / V) L (SEQ ID NO: 34)
(6) 165 DVE (K / R) YISPYHDS (SEQ ID NO: 35)
(7) 263 YKL (I / V / L) VVYARK (SEQ ID NO: 36)
The first number in (1) to (7) is the number of the amino acid residue of the silkworm juvenile hormone acid methyltransferase corresponding to each motif.

本発明によって、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質を人為的に制御することが可能となった。これにより、幼若ホルモンによって調節される昆虫などの節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型、寿命などを制御することが可能である。また、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質を人為的に制御することにより、害虫防除や有益昆虫の機能強化を行うことが可能である。また、幼若ホルモン酸メチル基転移酵素タンパク質は、該タンパク質に結合する化合物や該タンパク質の活性または発現を制御する化合物の製造やスクリーニングに利用できる。スクリーニングによって得られた化合物は、昆虫に特異的に作用する安全性の高い昆虫成長制御剤として利用できる。   The present invention has made it possible to artificially control juvenile hormone acid methyltransferase protein. This makes it possible to control molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism, life span, etc. of arthropods such as insects regulated by juvenile hormones. It is also possible to control insect pests and enhance the functions of beneficial insects by artificially controlling the juvenile hormone acid methyltransferase protein. In addition, juvenile hormone acid methyltransferase protein can be used for the production and screening of a compound that binds to the protein or a compound that controls the activity or expression of the protein. The compound obtained by screening can be used as a highly safe insect growth regulator that acts specifically on insects.

Claims (22)

以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
（ａ）配列番号：２、４、６、８、または１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、または９に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：２、４、６、８、または１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１、３、５、７、または９に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 DNA encoding a protein having juvenile hormone acid methyltransferase activity according to any one of the following (a) to (d).
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10.
(B) DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9.
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10.
(D) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9. 請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質。   A protein encoded by the DNA of claim 1. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）請求項１に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。
（ｂ）請求項１に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA。
（ｃ）請求項１に記載のDNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするDNA。 The DNA according to any one of the following (a) to (c).
(A) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcription product of the DNA of claim 1.
(B) DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the DNA of claim 1.
(C) DNA encoding an RNA that suppresses the expression of the DNA according to claim 1 by an RNAi effect. 請求項１または３に記載のDNAが挿入されたベクター。   A vector into which the DNA according to claim 1 or 3 is inserted. 請求項１に記載のDNAまたは該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有する、節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤。   An arthropod molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism or life span control agent comprising the DNA according to claim 1 or a vector inserted with the DNA as an active ingredient. 節足動物が昆虫である、請求項５に記載の制御剤。   The control agent according to claim 5, wherein the arthropod is an insect. 成虫に対する生殖成熟促進剤、休眠解除剤もしくは寿命短縮剤、幼虫および蛹に対する変態抑制剤、または、幼虫に対する休眠誘導剤である、請求項６に記載の制御剤。   The control agent according to claim 6, which is a reproductive maturation promoter for adults, a dormancy release agent or a life shortening agent, a metamorphosis inhibitor for larvae and pupae, or a dormancy inducer for larvae. 害虫防除剤または増繭剤である、請求項６に記載の制御剤。   The control agent according to claim 6, which is a pest control agent or a thickener. 請求項３に記載のDNAまたは該DNAが挿入されたベクターを有効成分として含有する、節足動物の脱皮・変態、生殖、休眠、胚発生、行動、多型または寿命の制御剤。   An arthropod molting / metamorphosis, reproduction, dormancy, embryogenesis, behavior, polymorphism or life span control agent comprising the DNA according to claim 3 or a vector into which the DNA has been inserted as an active ingredient. 節足動物が昆虫である、請求項９に記載の制御剤。   The control agent according to claim 9, wherein the arthropod is an insect. 成虫に対する生殖成熟抑制剤、休眠誘導剤もしくは寿命延長剤、または、幼虫に対する休眠抑制剤もしくは変態誘導剤である、請求項１０に記載の制御剤。   The control agent according to claim 10, which is a reproductive maturation inhibitor, a dormancy inducer or a life extension agent for adults, or a dormancy inhibitor or a transformation inducer for larvae. 害虫防除剤である、請求項１０に記載の制御剤。   The control agent according to claim 10, which is a pest control agent. 請求項１もしくは３に記載のDNAまたは請求項４に記載のベクターを保持する形質転換細胞。   A transformed cell carrying the DNA according to claim 1 or 3 or the vector according to claim 4. 請求項１もしくは３に記載のDNAまたは請求項４に記載のベクターで形質転換された個体。   An individual transformed with the DNA according to claim 1 or 3 or the vector according to claim 4. 昆虫個体である、請求項１４に記載の個体。   15. An individual according to claim 14, which is an insect individual. 請求項２に記載のタンパク質に結合する抗体。   An antibody that binds to the protein of claim 2. モノクローナル抗体である、請求項１６に記載の抗体。   The antibody according to claim 16, which is a monoclonal antibody. 請求項１に記載のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。   An oligonucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to the DNA of claim 1 or its complementary strand. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項２に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該タンパク質と被験化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該タンパク質に結合する化合物を選択する工程 The screening method of the compound couple | bonded with the protein of Claim 2 including the process of the following (a)-(c).
(A) contacting the test compound with the protein (b) detecting the binding between the protein and the test compound (c) selecting a compound that binds to the protein 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項２に記載のタンパク質の活性を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）該タンパク質に被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被験化合物を投与していない場合と比較して、該タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程 The screening method of the compound which controls the activity of the protein of Claim 2 including the process of the following (a)-(c).
(A) contacting the test compound with the protein (b) measuring the activity of the protein (c) a compound that increases or decreases the activity of the protein compared to when the test compound is not administered Process to select 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）該タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被験化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程 The screening method of the compound which controls the expression level of the gene which codes the protein of Claim 2 including the process of the following (a)-(d).
(A) a step of providing a cell or cell extract having DNA to which a reporter gene is operably linked downstream of a promoter region of the gene encoding the protein (b) contacting a test compound with the cell or the cell extract (C) measuring the expression level of the reporter gene in the cell or the cell extract (d) increasing or decreasing the expression level of the reporter gene compared to when no test compound is administered Step of selecting a compound 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）昆虫個体または培養組織に被験化合物を接触させる工程
（ｂ）該昆虫個体または該培養組織における請求項２に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被験化合物を投与していない場合と比較して、該遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程 The screening method of the compound which controls the expression level of the gene which codes the protein of Claim 2 including the process of the following (a)-(c).
(A) contacting the test compound with an insect individual or cultured tissue (b) measuring the expression level of the gene encoding the protein according to claim 2 in the insect individual or cultured tissue (c) A step of selecting a compound that increases or decreases the expression level of the gene as compared with the case where it is not administered.
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