JPH11310596A - 骨髄間質細胞抗原結合蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 骨髄間質細胞抗原（BST-1）結合蛋白質を提
供する。 【解決手段】 配列番号１および２で示されるアミノ酸
配列を有するペプチドはBST-1結合能を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は骨髄間質細胞抗原−
１(BST-1)に結合する蛋白質、および該BST-1に結合し、
かつ、この抗原が有するADP（アデノシン二リン酸）リ
ボシルシクラーゼ活性を阻害するペプチドに関するもの
である。このペプチドは慢性関節リウマチ、多発性骨髄
腫の治療等に用いることができる。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リウマチ(RA)患者由来の骨髄間
質細胞株では、健常人由来のものと比較して間質細胞依
存性のマウスプレB細胞株であるDW34の増殖支持能が高
まっている[J. Immunol., 149, 4088-40958 (1992)]。
さらに健常人と比較すると、RAや多発性骨髄腫(MM)患者
の骨髄間質細胞のプレB細胞株の増殖支持能が亢進して
いることが見いだされ、RA や多発性骨髄腫(MM)患者の
骨髄間質細胞にはプレB細胞株の増殖支持能を促進する
分子が存在している、との推察から新規な骨髄間質細胞
抗原−１(Bone marrow stromal cell antigen ; BST-1)
が単離された[Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5325-5
329 (1994)]。BST-1はC末端側に疎水性のシグナルペプ
チドを有するグリコシルフォスファチジルイノシトール
(GPI) アンカー型膜蛋白であり、BST-1に対するポリク
ローナル抗体でBST-1を架橋刺激すると細胞内分子がリ
ン酸化あるいは脱リン酸化されることから、BST-1がシ
グナル伝達分子（レセプター）として機能していると考
えられている[Biochem. Biophys.Res. Commun., 228, 8
38-845 (1996)]。さらにヒトリンパ球抗原CD38とアミノ
酸で約30％の相同性を有しており、CD38と同様にADPリ
ボシルシクラーゼ活性と、cADPR（環状ADPリボース）ヒ
ドロラーゼ活性を有することが知られている[FEBS lett
ers, 356, 244 (1994)]。ADPリボシルシクラーゼ活性は
NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）をcADPR
に変換する酵素で、cADPRはイノシトール１,４,５−三
リン酸(IP3)とは異なった機構で細胞内Ca²⁺ストアからC
a²⁺をリリースさせるセカンドメッセンジャーとして注
目されている[Science, 253, 1143-1146 (1993)]。cADP
Rヒドロラーゼは、cADPRを加水分解して、ADPリボース
(ADPR)に変換する。CD38およびBST-1は、ともに酵素の
活性部位が細胞外に有り、cADPRが細胞膜を通過しにく
いことを考えると、この細胞外に存在する酵素活性がど
のようにして細胞内Ca²⁺ストアからCa²⁺をリリースさせ
るのかという機構に興味が持たれる。リウマチ患者の関
節間隙液には健常人と比較して有意に高い濃度の可溶性
型BST-1が存在することが示されており[Arthritis. Rhe
um., 39, 629-637(1996)]、この可溶性型BST-1の有する
ADPリボシルシクラーゼ活性と病態との関係が注目され
る。しかし今までADPリボシルシクラーゼ活性を特異的
に阻害するインヒビターが見いだされていないため、上
記の問題点を明らかにすることはできなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】既述したように、BST-
1は慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫患者の間質細胞か
ら単離された分子であり、該分子の発現と病態の関係が
示唆されるが、詳細は未だ明らかではない。さらに該分
子が有するADPリボシルシクラーゼ活性と病態との関係
も未だ明らかにされていない。そこで本発明者らは、該
分子が有するADPリボシルシクラーゼ活性と病態との関
係を明らかにするためには、この酵素活性を阻害する分
子を用いることが有用と考え、種々研究を重ねた結果、
BST-1に結合するペプチド、およびBST-1に結合し、かつ
ADPリボシルシクラーゼ活性を阻害する新規なペプチド
を得ることに成功した。すなわち本発明の目的は、BST-
1に結合するペプチド、およびBST-1に結合し、該分子が
有するADPリボシルシクラーゼ活性を阻害する低分子ペ
プチドを提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らはヒトBST-1を昆虫細胞で大量に発現さ
せ、精製蛋白を得た。さらにこの精製BST-1をターゲッ
トにして、ファージディスプレイペプチドライブラリー
（実験医学、1993年8月号、No.13、Vol.11、P95〜100）
からBST-1に結合する15残基のペプチドを２個選択し、
その内の１つはADPリボシルシクラーゼ活性を阻害する
ことを確認した。以下本発明についてさらに詳細に説明
する。ヒトBST-1蛋白は、例えば遺伝子組換え法を用い
て製造することができる。発現させる際の宿主細胞は大
腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。例え
ば昆虫細胞の場合は、ヒトBST-1 cDNA（Kaisho,T.ら(19
94), Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.91, p5325-532
9）を昆虫細胞で機能するプロモーター配列、例えばポ
リヘドリンプロモーターの下流に連結し、常法に従って
発現させることができる（King and Possee, The bacul
ovirus expression system, Chapman ＆Hall社）。発現
産物の精製には、例えば塩析、イオンクロマトグラフィ
ー、遠心分離等が使用できる。

【０００５】ヒトBST-1蛋白に結合するペプチドを得る
ためには、例えば以下に述べるペプチドライブラリー法
を用いることができる。ファージランダムペプチドライ
ブラリーを構築する方法は、例えばM13系ファージのコ
ートプロテイン（例えばgeneIII蛋白やIIIV蛋白）の遺
伝子にランダムな配列を有する合成遺伝子を連結し、作
製すればよい。その方法としては、例えばScience, 24
9,386 (1990),または Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
7, 6378 (1990)等に記載された方法を用いることができ
る。挿入する遺伝子の大きさは発現されるペプチドが安
定であれば特に制限はないが、作製したライブラリーが
より多くのランダムな配列を網羅し、さらにターゲット
分子であるヒトBST-1に結合能を有するために6から15ア
ミノ酸残基をコードするものが好ましいと考えられる。
目的のBST-1に結合するファージを選択するためには、
カラムやプレート上に精製したBST-1を直接あるいは抗
体等を介して固定化し、上記ライブラリーを接触させ、
非結合ファージは洗浄で洗い流す。洗浄後、結合してい
るファージを酸などで溶出、中和した後、大腸菌に感染
させ増幅させる。この操作を３回か４回繰り返すとBST-
1に親和性のあるファージが濃縮される。ここで単一な
クローンを得るためには、再度大腸菌にファージを感染
させ、抗生物質を含んだ寒天培地上でシングルコロニー
を形成させる。個々のコロニーを液体培地で培養した
後、上清中のファージをポリエチレングリコール等で沈
殿濃縮し、その塩基配列を決定すれば、ペプチドの構造
を知ることができる。ランダムなアミノ酸配列を有する
ペプチドライブラリーは、上記のファージを用いる方法
のほか、化学合成で作製することも可能である。その方
法としてはビーズを用いる方法[Nature, 354, 82 (199
1)]、液層フォーカシング法[Nature, 354, 84(1991)]、
マイクロプレート法[Science, 251, 767(1991)]等が挙
げられる。さらに、得られた配列を有するペプチドを大
量に調製するためには、人工的にペプチドを合成する方
法や、遺伝子組み換え技術を利用して大腸菌、酵母、昆
虫細胞、動物細胞などで発現させる方法が挙げられる。
前者の方法としては、一般的なペプチド合成法により容
易に行うことができ、例えば固相合成法で行うことが簡
便であり、後に詳述する様に、アミノ酸を変えた変異体
を作製することも容易である（細胞工学別冊、抗ペプチ
ド抗体実験プロトコール、p.26-p.46、秀潤社）。後者
の場合、得られたアミノ酸配列から、コドン使用頻度に
従ってDNA配列を設定し(Molecular Cloning ,Appendix
D1参照, マニアティスら；ColdSpring Habor Laborator
y社、1989）、宿主の細胞に導入することは、技術的に
確立されている。さらに、塩基配列に変異を導入するこ
とで、アミノ酸残基を他の残基に変換することも可能で
ある。例えば大腸菌で発現させる場合は、得られたDNA
配列をプロモーター配列、例えばトリプトファン合成酵
素オペロン(Trp)、ラクトースオペロン(lac)プロモータ
ーに結合し、リボゾーム結合配列、例えばシャインダル
ガルノ(SD)配列や転写終結因子認識部位を付加する事が
望ましい。作製した発現ベクターを大腸菌に導入する方
法等はMolecular Cloning (マニアティスら；Cold Spri
ng Habor Laboratory社、1989)記載の方法が使用でき
る。発現産物を精製する方法は、例えば各種クロマトグ
ラフィーを用いることができる。

【０００６】得られたペプチドがBST-1のADPリボシルシ
クラーゼ活性を阻害することは、ADPリボシルシクラー
ゼ活性を測定する際にこれらのペプチドを共存させたと
きの活性が非共存下と比較して減少することで確認でき
る。BST-1のADPリボシルシクラーゼ活性の測定法は、例
えば酵素反応によってNADからcADPRが生じるが、それぞ
れの基質を陰イオン交換クロマトグラフィーで分離して
定量することにより測定できる（HPLC法）[FEBS letter
s, 356, 244(1994)]。あるいはNADの代わりにNGD（ニコ
チンアミドグアニンジヌクレオチド）を基質として使用
し、酵素変換させると環状GDP（グアノシン５'−二リン
酸）リボース(cGDPR)が生成されるが、この分子は300nm
の波長で励起すると 410nm付近に蛍光を発することから
定量することができ、その生成速度はADPリボシルシク
ラーゼ活性を表している （NGD法）[J. Biol. Chem., 4
8, 30260 (1994)]。本発明に係る、BST-1に結合する新
規ペプチドは、担体に固定化し、体液中のBST-1除去装
置（体外循環装置）の構成要素として使用することもで
きる。以下、参考例および実施例を挙げて本発明をより
詳細に説明するが、本発明はこれらの参考例および実施
例によりなんら限定されるものではない。

【０００７】

【実施例】参考例１BST-1の発現および精製 既述した通り、BST-1 はGPIア
ンカー型の膜蛋白である[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
91, 5325(1994)]。可溶性のBST-1を昆虫細胞を用いて
大量に発現させるために、C末端側に存在する疎水性ド
メインの直前の298番目のスレオニンコドン(ACA)を終始
コドン(TGA)に変えたcDNAを昆虫細胞発現用プラスミドp
VL1393（pharmingen社）のSmaI、 XbaIサイトに連結し
た。得られたプラスミドを定法に従い(King and Posse
e, The baculovirus expression system, Chapman ＆Ha
ll社)、昆虫細胞Sf9（フナコシ社）にトランスフェクシ
ョンし、組換えウイルスを得た。この組換えウイルスを
昆虫細胞High five（Invitrogen社）に感染させ、定法
に従い(King and Possee, The baculovirus expression
system, Chapman ＆Hall社)、27℃で３日間培養し、培
地中に分泌された可溶性BST-1をウエスタンブロッテイ
ング法を用いて確認した。さらに可溶性BST-1を精製す
るため大量培養し、陽イオン交換クロマトグラフィー、
色素Blueカラムクロマトグラフィーを用いて95％以上に
精製した。得られた精製蛋白は上述のNGD法によりADPリ
ボシルシクラーゼ活性を持つことを確認した。その結果
を図１に示す。

【０００８】参考例２BST-1結合ファージの選択 15アミノ酸残基のランダム
な配列を有するファージライブラリーは、Biochemistr
y, 35, 10441(1996)記載の方法を用いて作製した。BST-
1を96穴マイクロプレートのウエルに固相化するため、
まずBST-1に対するモノクローナル抗体であるBEC7（Oku
yama，Y.ら(1996)、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2
28, p838-845）を10mM リン酸緩衝液(pH7.0)で希釈し、
１ウエルあたり3μgで４℃で一晩固相化した。さらに得
られた精製BST-1 を10mM リン酸緩衝液(pH7.0)で希釈
し、１ウエルあたり5 μgを加え、抗体を介して固相化
した。1％ ウシ血清アルブミンを含む10mM リン酸緩衝
液(pH7.0)で室温で１時間反応させ、緩衝液（１％ウシ
血清アルブミンを含む10mM リン酸緩衝液(pH7.0)、0.05
% Tween20) 100μlにファージライブラリーを約10¹²個
加え、室温で１時間反応させた。洗浄液（10mM リン酸
緩衝液(pH7.0)、0.05% Tween20)で10回洗浄し、非結合
ファージを除去し、グリシン緩衝液(pH2.2)で結合ファ
ージを溶出し、直ちに1M Tris-HCl (pH9.5)で中和し
た。溶出後、大腸菌Ｋ91kan（Missouri大学のDr. G.P.S
mithから入手）に感染させ、テトラサイクリンを含むLB
培地で一晩培養し、ファージを増幅した。培地上清中に
出てくるファージをポリエチレングリコールで沈殿濃縮
後、このファージを２回目の操作に用いた。この操作を
全部で３回行いBST-1に結合するファージを選択した。

【０００９】参考例３ELISAによるBST-1結合ファージの選択 参考例２で選択
したファージをもう一度大腸菌K91kanに感染させ、テト
ラサイクリンを含むLB 寒天培地上でシングルコロニー
を形成させた。各コロニーをテトラサイクリンを含むLB
培地で一晩培養し、翌日、上清中にあるファージをポ
リエチレングリコールで沈殿精製した。この得られたフ
ァージ液をあらかじめBST-1を固相化した96穴マイクロ
プレート（参考例２）の各ウエルに約10¹⁰個加え、室温
で１時間反応させた。洗浄液（10mM リン酸緩衝液(pH7.
0)、0.05% Tween20)で４回洗浄し、5000倍希釈した西洋
わさびペルオキシダーゼ標識抗M13ファージ抗体（ファ
ルマシア社）を室温で３０分反応させた。４回洗浄後、
基質である3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを加え、
室温で５分間発色させ、1M 硫酸で反応を停止後、マイ
クロプレートリーダーで450nm の吸光度を測定した。そ
の結果を図２に示す。

【００１０】参考例４塩基配列の決定 参考例３でBST-1と反応があったクロ
ーンについて塩基配列を決定した。各ファージをフェノ
ール、クロロホルム処理して除蛋白した後、エタノール
沈殿でDNAを精製し、塩基配列決定の鋳型とした。ベク
ターであるFuse5ヘ゛クター(Smith, G.P.およびScott, J.K.(1
993)、 Methods Enzymol. 217, p228-257）の配列を基に
してプライマーを設定し、サイクルシークエンス法で決
定した。その結果、２種類の配列を確認した（SN-1:配
列番号１、SN-16:配列番号２）。

【００１１】実施例１ペプチドの合成 塩基配列から推定されるアミノ酸配列
（配列番号1および2）を基にして、ペプチド自動合成装
置で15アミノ酸から成る２種類のペプチドを合成した。
配列番号１の合成ペプチドをSNP-1、配列番号２の合成
ペプチドをSNP-16と命名した。得られたペプチドは逆相
HPLCで精製し95％以上の純度であることを確認した。

【００１２】実施例２合成ペプチドによるBST-1のADPリボシルシクラーゼ活性
阻害の検討 合成ペプチドによるBST-1のADPリボシルシ
クラーゼ活性阻害は、既述したNGD法を用いて検討し
た。BST-1の濃度4μg/ml、基質NGD濃度を300μMとして
加え、25℃で300秒反応させ、蛍光強度が直線的に増加
することを確認した。300秒後、合成ペプチドSNP-1、お
よびコントロールとしてSNP-1の配列をC末端からN末端
の方向に逆に合成したペプチドを20μM加えた。コント
ロールペプチドを加えた場合は活性に全く影響しなかっ
たのに対して、SNP-1を20μM加えた場合は蛍光強度の増
加がなくなり、完全にADPリボシルシクラーゼ活性を阻
害することが確認された。その結果を図３に示す。

【００１３】実施例３合成ペプチドによるCD38のADPリボシルシクラーゼ活性
阻害の検討 ヒトのCD38は、BST-1と同様にADPリボシル
シクラーゼ活性を有することが知られている。そこで合
成ペプチドSNP-1が、CD38のADPリボシルシクラーゼ活性
を阻害することが可能かを調べた。可溶性CD38（濃度20
0ng/ml）に基質NGDを最終濃度2μMとなるように加え、2
5℃で300秒反応させ、蛍光強度が増加することを確認し
た。この系にSNP-1を20μM加えた場合は、全く反応を阻
害せず、従ってSNP-1は、BST-1のADPリボシルシクラー
ゼ活性を特異的に阻害することが示された。その結果を
図4に示す。

【００１４】実施例４変異体SNP-1とBST-1との結合の検討 SNP-1とBST-1の結
合に関わるアミノ酸残基を決定するため、化学合成によ
りSNP-1の各アミノ酸残基をAlaに変換した変異体を１４
本作製し（N末端側からアミノ酸残基を順次Alaに変換
し、例えば最初および最後から２番目の残基を変換した
ペプチドをそれぞれ＃１および＃１４と命名した。１５
番目の残基はAlaなので、＃１から＃１４、計１４本を
合成した。）、合成した１４本のペプチドとBST-1の結
合を調べた。まず、BIACORE（蛋白相互作用を解析する
バイオセンサー）（アマシャムファルマシアバイオテク
社製）のセンサーチップCM5に、BST-1をアミンカップ
リング法で2800レゾナンス単位(RU)固相化した。各ペプ
チドを500 nMの濃度に調製して、センサーチップに40μ
l/minの速度で流した。このときに結合した量(RU)を図
５に示す。＃１、＃３、＃６、＃１３、＃１４以外のペ
プチドでは、Alaに変換すると結合能が失われ、これら
アミノ酸残基が、結合に重要であることが示された。一
方＃１、＃３、＃６、＃１３、＃１４のペプチドは、結
合能を有していることから、これらのアミノ酸残基を変
異させても、BST-1に結合する性質は保たれることが示
された。

【００１５】実施例５SNP-1誘導体とBST-1との結合の検討 SNP-1のN末端側お
よびC末端側をビオチン化した場合のBST-1との結合能
を、プロトタイプであるSNP-1と比較検討した。SNP-1の
N末端側アミノ基に、ピアス社のSulfo-NHS-LC-Biotinを
結合させ、逆相HPLCで精製し、95％以上の純度であるこ
とを確認した。このペプチドをbSNP-1と命名した。SNP-
1のC末端側をビオチン化する場合には、まずSNP-1のC末
端側にLys残基を結合したペプチドを合成し、このLys残
基のアミノ基にビオチンを結合した。さらに、逆相HPLC
で精製し、95％以上の純度であることを確認した（SNPb
-1と命名）。BIACORE（アマシャムファルマシアバイオ
テク 社製）のセンサーチップCM5に、BST-1をアミンカ
ップリング法で2800レゾナンス単位(RU)固相化した。各
ペプチドを400nMから2000nMの濃度の範囲に調製して、
センサーチップに40 μl/minの速度で流した。各濃度で
平衡に達した結合値が得られ、この得られた結合値か
ら、スカチャードプロット法（Hulme, E.C. (1990), Re
ceptor-binding studies, a brief outline, in Recept
or Biochemistry: A Practical Approach,p303-315, IR
L press）にて乖離定数Kdを算出した。同時に行った陰
性コントロールである実施例２記載のコントロールペプ
チドは、この濃度範囲で全く結合を示さなかった。その
結果を図６に示す。得られた直線の傾きから、プロトタ
イプであるSNP-1、bSNP-1、SNPb-1の乖離定数Kdは、510
nM, 810nM, 530nMで、若干の結合値の違いはあるが、SN
P-1のN末端側およびC末端側を修飾しても、結合能は消
失しないことが示された。

【００１６】実施例６ペプチドによるBST-1のcADPRヒドロラーゼ活性阻害の検
討 BST-1は、ADPリボシルシクラーゼ活性のほかに、環
状ADPリボース(cADPR)を加水分解して、ADPリボース(AD
PR)に変換するcADPRヒドロラーゼ活性を有している。そ
こで、SNP-1がcADPRヒドロラーゼ活性阻害を示すことが
できるかを調べた。cADPRヒドロラーゼ活性は、FEBS le
tters, 356, 244 (1994)に記載の方法に従って行った。
BST-1の濃度50 μg/ml、基質cADPR濃度を20 μMとして
加え、37℃で４時間反応させた。４時間後に変換される
ADPR をHPLCで分離し、ピークの面積からADPRの生成の
割合を算出した。cADPRとADPRのピーク面積の総和を、
１００％として示している。反応の際、0.5μM 、2.0μ
M 、20μMの濃度のSNP-1と、20μMの濃度のコントロー
ルペプチド（実施例２記載と同じコントロールペプチ
ド）を加えて、活性阻害を調べた。その結果を、図７に
示す。20μMの濃度のコントロールペプチドは、加水分
解活性（酵素変換されて生じるADPRの量）に全く影響し
ていないのに対し、SNP-1は、濃度依存的にcADPRヒドロ
ラーゼ活性を阻害した。

【００１７】実施例７ 合成ビオチン化ペプチドによるBST-1の精製 Ｃ末端側をビオチン化したSNP-1とBST-1との結合能を利
用したアフィニティークロマトグラフィーによりBST-1
を精製した。実施例５に従って合成したSNPb-1を20mM M
ES緩衝液(pH6.0)中でウルトラアビジン-アガロースゲル
1mlあたり1×10^-7mol結合させ、アフィニティーカラム
を作製した。BST-1が分泌発現した培養液上清50mlを20m
M 酢酸緩衝液(pH5.0)を用いて5倍に希釈し、陽イオン交
換クロトグラフィーを用いて粗精製した後、20mM MES緩
衝液（pH6.0）に対して透析脱塩した。そのサンプルを
先述のアフィニティーカラム0.4mlを用いて、1M NaClを
含む20mM MES緩衝液(pH6.0)0.5mlで溶出し、BST-1を精製
した。

【００１８】製剤例１ 常法に従い、合成ペプチドSNP-1と賦形剤を混合し、カ
プセルに充填し、慢性関節リュウマチ治療用カプセルを
製造した。

【００１９】

【発明の効果】本発明により、骨髄間質細胞抗原(BST-
1)に結合し、かつBST-1のADPリボシルシクラーゼ活性を
特異的に阻害する能力を有するペプチドを提供すること
が可能となった。これらのペプチドは慢性関節リウマチ
や多発性骨髄腫の治療に使用することが可能である。

【００２０】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状配列の種類：ペプチド 配列 His Ser Gln Ile Ser Gly Lys Tyr Gln Arg Tyr Leu Lys Asp Ala 1 5 10 15

【００２１】 配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Asp Val Val Tyr Thr Asn Ile His Lys Trp Gly Arg Arg Glu 1 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】 ターゲットとして使用した精製BST-1のADPリ
ボシルシクラーゼ活性を基質NGDを用いて測定した１例
を示すグラフである。図中横軸は時間変化、縦軸は蛍光
強度を示している。精製BST-1(5ug/ml)を100uMNGDと混
合し、２５℃20分反応させ300nm波長で励起後410nm波長
の蛍光強度を測定した。基質のみ反応させた場合（100u
MNGDのみで表示）には、環状GDPリボース(cGDPR)が生成
せず蛍光強度が増加しないが、基質とBST-1を加えた場
合には蛍光強度が直線的に増加し、酵素活性が確認され
た。

【図２】 ファージディスプレイペプチドライブラリー
をBST-1でスクリーニングして得られたファージの反応
性をELISA法で調べた結果を示すグラフである。図中横
軸はファージのクローン名（SN1:配列表１のペプチドを
発現するファージ、SN16:配列表２のペプチドを発現す
るファージ、コントロールファージ:関係のない配列を
持つ陰性コントロールファージ)で縦軸は450nmの吸光度
を示している。SN1、SN16ともBST-1を抗体BEC7（Okuyam
a，Y.ら(1996)、Biochem. Biophys. Res. Commun. 228,
p838-845）を介して固相化したウエルには反応した
が、抗体BEC7のみあるいはBST-1のみあるいはBSA（ウシ
血清アルブミン）のみを固相化したウエルには反応せ
ず、BST-1に特異的に結合することが確認された。

【図３】 合成ペプチドSNP-1によるBST-1のADPリボシ
ルシクラーゼ活性阻害を示すグラフである。図中横軸は
時間変化、縦軸は蛍光強度を示している。精製BST-1(4u
g/ml)を300uMNGDと混合し、25℃で300秒間反応させ、そ
の後合成ペプチドSNP-1を20uMの濃度で加えた。SNP-1ペ
プチド添加後、蛍光強度の増加は完全に消失し、ADPリ
ボシルシクラーゼ活性を完全に阻害した。陰性コントロ
ールペプチドを20uMの濃度で加えた場合には、該ペプチ
ド添加後も蛍光強度の増加にはまったく変化を与えず、
阻害活性を示さなかった。インセットは 還元剤 DTT 10
mMでADPリボシルシクラーゼ活性が完全に消失する様子
を示している。

【図４】 合成ペプチドSNP-1は、CD38のADPリボシルシ
クラーゼ活性阻害を示さなかった。図中横軸は時間変
化、縦軸は蛍光強度を示している。精製CD38(200ng/ml)
を2uM NGDと混合し、25℃で300秒間反応させた。合成ペ
プチドSNP-1を20uMの濃度で加えた場合でも、蛍光強度
の増加にはまったく変化を与えず、阻害活性を示さなか
った。

【図５】 変異体SNP-1とBST-1との結合の結果を示すグ
ラフである。図中横軸はAlaに変換したペプチドの種
類、縦軸は、BIACOREシステムでの結合量を示してい
る。＃１、＃３、＃６、＃１３、＃１４のペプチドは、
結合能を有していたが、他の残基をAlaに変換すると結
合能が失われた。コントロールペプチドは、実施例２に
記載のペプチドである。

【図６】 SNP-1のN末端側および、C末端側をビオチン
化した場合のBST-1との結合の結果を示すグラフであ
る。図は左から、プロトタイプ（基本型）SNP-1、N末端
側にビオチンを結合したbSNP-1、C末端側をビオチン化
したSNPb-1のスカチャードプロットである。直線の傾き
から、SNP-1、bSNP-1、SNPb-1の乖離定数Kdは、510nM,
810nM, 530nMと求められ、SNP-1のN末端側および、C末
端側を修飾しても、結合能は消失しないことが示された
（図中、Reqはレゾナンス単位(RV)で表した平衡結合
値、Req/Cは平衡結合値をSNP-1濃度で割った値を示
す）。

【図７】 SNP-1によるBST-1のcADPRヒドロラーゼ活性
阻害の結果を示すグラフである。BST-1のcADPRヒドロラ
ーゼ活性反応によって、cADPRからADPRが生じる。これ
ら２つの物質をHPLCで分離し、ピークの面積からADPRの
生成の割合を算出した。cADPRとADPRの面積の総和を、
１００％として示している。20uMの濃度のコントロール
ペプチドは、生成してくるADPRに全く影響していないの
に対し、SNP-1は、濃度依存的に阻害した。バックグラ
ンドはBST-1を加えずに、基質cADPRのみを反応させたと
きの結果で、反応させることによる自然の加水分解を示
している。ペプチドなしとは、ペプチドを加えないで酵
素反応を行ったときの結果である。

【図８】 SNPb-1アフィニティーカラムを用いてBST-1
を精製した結果を示す電気泳動写真の模写図である。各
画分20μlをSDS-PAGE(7.5%)により解析し、銀染色によ
り検出した。精鋭前の培養液上清には様々な蚕白質がみ
られるが、SNPb-1アフィニティークロマトグラフィー後
の溶出画分では、BST-1はほぼ精製されたことが示され
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＧ 15/09 ＺＮＡ ＡＤＵ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列、もしくは該アミノ酸配列に１または複数個のアミノ
   酸残基の欠失、置換、または挿入を施すことにより得ら
   れるアミノ酸配列を含んでなる、骨髄間質細胞抗原（BS
   T-1）に結合能を有する蛋白質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
   列、もしくは該アミノ酸配列に１または複数個のアミノ
   酸残基の欠失、置換、または挿入を施すことにより得ら
   れるアミノ酸配列を含んでなる、骨髄間質細胞抗原（BS
   T-1）に結合能を有する蛋白質。
3. 【請求項３】 BST-1のADPリボシルシクラーゼ活性を特
   異的に阻害する請求項1の蛋白質。
4. 【請求項４】 BST-1のcADPRヒドロラーゼ活性を特異的
   に阻害する請求項1の蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項1に記載の蛋白質を含んでなる医
   薬組成物。
6. 【請求項６】 請求項1又は2に記載の蛋白質を含有する
   BST-1を検出するための診断薬。
7. 【請求項７】 請求項1又は2に記載の蛋白質を担体に固
   定化してなる吸着剤。
8. 【請求項８】 請求項７記載の吸着剤を用いるBST-1の
   精製方法。
9. 【請求項９】 BST-1の酵素反応を阻害することを特徴
   とする医療用体外循環装置。
10. 【請求項１０】 請求項1又は2に記載の蛋白質を用いる
    ことを特徴とする、BST-1と相互作用を有する物質のス
    クリーニング方法。