JP4229619B2 - Terephthalic acid decomposing enzyme composition and method for producing 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid using the same - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、テレフタル酸分解酵素組成物およびそれを用いたテレフタル酸の分解方法に関する。より詳しくは新規なアミノ酸配列を有するテレフタル酸分解酵素およびそれを用いてテレフタル酸を分解する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
テレフタル酸はポリエチレンテレフタレート(PET)に代表される芳香族ポリエステルの原料として工業的に大量に生産され、ポリマー製造などに主に利用されている。テレフタル酸より製造されるPETは繊維、フィルムやボトルなどに成型、加工され大量に消費されている。
【0003】
使用されたPETボトルなどは分別回収などにより再利用するシステムが構築されつつあるが、中には海洋に漂うPETボトルのように、野原や森林、海洋など自然界に廃棄されてしまうものも少なくない。この場合、PETの光分解や微生物分解の過程でテレフタル酸を生成することが十分考えられるが、テレフタル酸は自然界においてはやや難分解性である事が知られている。
【0004】
テレフタル酸を分解する微生物あるいはテレフタル酸を微生物により分解する方法は従来から検討されている。具体的には特開平10−42864号公報に記載のシュードモナス属細菌により分解する方法や、特開平10−327848号公報に記載のアルカリゲネス属細菌、ロドコッカス細菌により分解する方法が開示されている。これらの菌はとりわけ水酸化ナトリウムによるポリエステル繊維の減量加工工程より排出される廃液中のテレフタル酸を分解・浄化するのに有効であると開示されている。また、米国特許第5124479号記載のシュードモナス属細菌の変異株を用いてテレフタル酸より3,4−ジヒドロキシ−1,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸を製造する方法が開示されている。しかしながら、本発明に示すようなテレフタル酸分解酵素に関しては記載がなく検討もされていない。
【0005】
酵素によるテレフタル酸の分解経路については、Comamonas testosteroni菌より単離されたテレフタル酸1,2−ジオキシゲナーゼシステムに関して報告(Schlaefli, Hans R. らJ. Bacteriol. (1994), 176(21), 6644−52)がされている。この中ではテレフタル酸分解活性を有する酵素(テレフタル酸1,2−ジオキシゲナーゼ)はテレフタル酸を補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)と酸素の存在下、テレフタル酸から1,2−ジヒドロキシ−3,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸(DCD)に変換され、生成したDCDはDCDデヒドロゲナーゼによりプロトカテク酸に変換される経路が開示されている。また、上記テレフタル酸1,2−ジオキシゲナーゼは2つのサブユニット構造を有し、そのN末端側のアミノ酸配列についても記載がなされている。
【0006】
しかしながら、種々の工業廃液中に含まれるテレフタル酸を分解・浄化するという観点からすると、上記文献で開示されている酵素システムではプロトカテク酸という芳香族化合物が生成するため廃液処理工程への負荷を低減せしめるには不十分であり、紫外吸収を持たない脂肪族系の化合物に変換するのが好ましいと思われるが、このような酵素は見つかっていない。
【0007】
本発明の主な目的は、新規なテレフタル酸分解酵素を提供することにある。また本発明の他の目的は、酵素を用いたテレフタル酸の分解により3,4−ジヒドロキシ−1,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸の製造方法を提供することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記テレフタル酸を分解する酵素について、テレフタル酸を資化しうる菌およびそれより得られる分解酵素について鋭意検討した結果、既知の分解酵素テレフタル酸1,2−ジオキシゲナーゼとは、アミノ酸配列に関して相同性が無く、またこれまで報告されている反応様式とは異なる新規酵素であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち本発明は、次のとおりのものである。
1. Burkholderia gladioli 4−7−1(FERM P−18427)株により産生されるテレフタル酸分解酵素組成物から単離された、下記特性を有するテレフタル酸分解酵素A。
A.分子量およびサブユニット構造:
SDS−PAGEから求めた分子量は136KDaであり、2つのサブユニット構造を有する。1つは52KDaの分子量を有するユニット(α鎖)で、もう1つは16KDaの分子量を有するユニット(β鎖)である。質量分析から求められた分子量はそれぞれ128kDa、47kDa、17kDaである。
B.補酵素:
NADHを必要とする。
C.N末端側アミノ酸配列:
α: Asn−Val−Ile−Pro−Ile−Lys−Leu−Ala−Arg−Arg−Ala−Ser−Val−Ala−Trp−Pro−Glu−Glu−Gly−Leu−Thr−Arg−Val−Pro
β: Ala−Ala−Leu−Asp−Ile−His−Gln−Ala−Ile−Ala−Arg−Ala−(Gln)−(Ala)−Glu−Tyr−Val−Arg−(Arg/Ser)−Ile
(アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。)
D.部分アミノ酸配列:
α1: (Lys)−Asp−Ser−Tyr−His−Ala−Ser−Ile−Leu−His−Leu−Phe−Phe−Thr−Thr−Phe−Gln−Leu−Asn−Arg
α2: (Lys)−Leu−Arg−Val−Ala−Thr−Leu−His−Gly−Leu−Val−Phe−Gly−Ser−Phe―Ser―Asp−Asp−Val−Ala
(アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。)
E.等電点:
等電点は5.3である。
F.至適pH、至適温度:
至適pHは7.4から8、至適温度は20〜30℃である。
G.基質特異性:
テレフタル酸二ナトリウム、2,5−ジカルボキシピリジンを分解する。
H.金属イオン、キレート試薬による影響:
0.5mM塩化鉄(II)を添加することにより活性は上昇し、2価鉄イオン以外の各種金属イオンにより強く阻害される。また、各種キレート剤により阻害される。
2. (1)テレフタル酸を炭素源として含む培地においてBurkholderia gladioli 4−7−1株を培養し、(2)該菌株を破砕して得られた破砕液(粗酵素液)を、(3)ジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させ(緩衝液としては10%グリセリンおよび1mMのジチオスレイトール(DTT)を含む50mMの3−モルフォリノプロパンスルホン酸(MOPS)−水酸化カリウム緩衝液、pH=7.5を使用)、(4)該緩衝液の塩濃度を塩化ナトリウムにより高め、その塩化ナトリウム濃度が0.25〜0.33Mの緩衝液でイオン交換樹脂より脱離することにより得られるフラクションから得る、上記1に記載のテレフタル酸分解酵素Aの単離方法。
3. (1)テレフタル酸を炭素源として含む培地においてBurkholderia gladioli 4−7−1株を培養し、(2)該菌株を破砕して得られた破砕液(粗酵素液)を、(3)ジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させ緩衝液としては10%グリセリンおよび1mMのジチオスレイトール(DTT)を含む50mMの3−モルフォリノプロパンスルホン酸(MOPS)−水酸化カリウム緩衝液、pH=7.5を使用)、(4)該緩衝液の塩濃度を塩化ナトリウムにより高め、その塩化ナトリウム濃度が0.10以上0.25M未満の範囲でイオン交換樹脂より脱離することにより得られるフラクションから得る、テレフタル酸分解酵素分画物Bの製造方法。
4. 上記1に記載の分解酵素Aを用いてテレフタル酸を分解する3,4−ジヒドロキシ−1,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸の製造方法。
5. 上記3に記載の方法によって得られた分解酵素分画物Bを併用する、上記4記載の3,4−ジヒドロキシ−1,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸の製造方法。
6. 上記1に記載の分解酵素Aと上記3に記載の方法によって得られた分解酵素分画物Bとを含む、テレフタル酸分解酵素組成物。
【0010】
本発明の分解酵素による反応生成物は、3,4−ジヒドロキシ−1,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸であり、これをもとにヒドロキシテレフタル酸を容易に合成することが可能である。また、従来公知の酵素による反応とは異なり、副生成物としてプロトカテク酸を含まないため、反応生成物の精製が容易である。また、本発明の分解酵素を利用することにより、廃テレフタル酸を利用して生成物の化合物を製造することや、上記酵素を固定化したバイオリアクターなどへの利用が可能となり得る。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明のテレフタル酸分解酵素は、好気性細菌であるBurkholderia属の中のBurkholderia gladioli 4−7−1株により生産することができる。この菌は、通常自然界に広く存在するものと考えられる。
【0012】
本発明によれば、この菌はテレフタル酸を炭素源として生育、増殖することが可能であることが見いだされた。また、テレフタル酸ジメチルなどのエステル類も資化することが可能である。上記菌によって分解あるいは資化されるテレフタル酸は、液体培地や寒天培地などの培地中に溶解しているほうが菌による資化にとって好ましいため、ナトリウム塩などの金属塩やアンモニウム塩などのオニウム塩の形態であることが好ましい。
【0013】
この菌Burkholderia gladioli 4−7−1株を増殖せしめる方法としては、培地として通常の微生物実験に用いられる培地であればいかなるものを用いても構わないが、好ましくはテレフタル酸を培地組成に含んでおり、必要に応じて無機塩などのミネラルを含む培地で生育させることが酵素の生産にとって好ましい。より好ましくは無機塩として硫酸アンモニウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの金属塩を含むものが良い。炭素源としてはテレフタル酸以外にも必要に応じてグルコースやペプトン、麦芽汁、酵母エキス、肉汁などを用いてもかまわない。培地のpHを一定に保つため、緩衝液を利用することが好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液や3−モルフォリノプロパンスルホン酸(MOPS)−水酸化カリウム緩衝液などを利用できるがこれらに限定されない。また、生育温度としては20〜35℃の範囲で生育させるのが好ましく、培地のpHとしては6〜7の範囲が好ましい。
【0014】
この菌により生産されるテレフタル酸分解酵素は、菌体のいずれの部位にあってもかまわないが、好ましくは菌の内部にあるものを精製の対象とする。テレフタル酸分解酵素を抽出する過程においては好ましくは培養により増殖した菌体を破砕し得られた液全体より単離することが好ましい。このような方法で得られる菌体の破砕液や培養後の液は不純物として様々なタンパク質や老廃物を含むため、精製することが好ましい。
【0015】
テレフタル酸分解酵素を精製する方法としては特に制限されないが、好ましくは以下の方法により単離される。具体的にはジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するイオン交換樹脂、とりわけセルロースやデキストランなどの多糖誘導体が好ましいが、たとえばファルマシア社製のDEAEセファデックスを充填したカラムを用いて、イオン交換クロマトグラフィーによりその酵素の比活性が高められた酵素画分を得ることが出来る。このとき用いる緩衝液としてはリン酸緩衝液や3−モルフォリノプロパンスルホン酸(MOPS)−水酸化カリウム緩衝液が好ましいがこれらに限定されない。緩衝液の濃度としては、0.01Mから0.2Mが好ましく、より好ましくは0.02〜0.1Mである。
【0016】
操作は低温で行うことが好ましく、具体的には4℃前後で行うことが好ましい。また酵素の安定性を維持する目的でグリセリンやジチオスレイトール(DTT)などの添加剤を利用してもかまわない。イオン交換樹脂に吸着した酵素は、緩衝液中の塩濃度を高めることにより脱離し、回収することができる。このとき用いる塩としては、塩化ナトリウムや硫酸アンモニウムなどが好ましく利用される。塩濃度を高める方法はステップワイズ式でもグラジエント式でもよいが、酵素の純度、比活性を高める目的としてはグラジエント式が好ましい。
【0017】
精製操作を行うにあたって、テレフタル酸分解酵素の活性はテレフタル酸の減少を追跡することにより測定し得る。テレフタル酸の定量は、高速液体クロマトグラフィーなどの方法により分析することが出来る。
【0018】
テレフタル酸分解酵素を抽出する具体的な好ましい態様は次のとおりである。テレフタル酸及びBurkholderia gladioli 4−7−1株を含む培地において、培養により増殖した上記菌体を遠心分離操作により採集しこれを破砕する。得られた破砕液(粗酵素液)を、ジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するイオン交換樹脂に緩衝液中で吸着させる。このとき緩衝液として、10%グリセリンおよび1mMのジチオスレイトール(DTT)を含む50mMの3−モルフォリノプロパンスルホン酸(MOPS)−水酸化カリウム緩衝液(pH=7.5)を用いることができる。ついで、4℃前後において、グラジエント式によって、塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いてイオン交換樹脂に吸着した酵素を脱離させ、テレフタル酸分解酵素群を得る。
【0019】
このような方法により得られるテレフタル酸分解酵素群は、下記に示す2つの酵素活性を有するものを含むものである。1つは補酵素NADHと酵素分画物Bの存在下、テレフタル酸を分解する活性を有するもの(酵素A)と、もう1つはNADHの存在下でチトクロームCを還元する活性を有するもの(酵素分画物B)である。前者は酵素反応の性質からオキシゲナーゼと思われ、後者は酵素活性の性質からレダクターゼと思われる。本発明で開示しているこれらの酵素は、上記酵素Aと酵素分画物Bが共存するときにテレフタル酸分解活性が最も発現されやすく、どちらか一方でもその活性を欠いた場合はテレフタル酸分解能力が有意に低下する特徴を有する。共存する好ましい割合としては、酵素Aが1モルに対し、酵素分画物Bは0.1〜10モルである。なお、酵素A、酵素分画物Bはそれぞれ、上記条件においてその塩化ナトリウム濃度が0.10以上0.25M未満(酵素B)及び0.25〜0.33M(酵素A)の範囲で分画された成分中に主に含まれる。
【0020】
本発明によれば、テレフタル酸を酵素Aと酵素分画物Bの共存下で反応させた生成物は、3,4−ジヒドロキシ−1,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸であり、紫外可視吸収波長を持たないものが得られる。これまで公知のテレフタル酸1,2−ジオキシゲナーゼとDCDレダクターゼの組み合わせではテレフタル酸からプロトカテク酸が得られるものと記載されているが、本酵素群の生成物はプロトカテク酸とは異なるものであり、酵素反応の反応機構として新規な酵素であるといえる。
【0021】
また本発明における酵素群はプロトカテク酸を分解する活性は認められないため、公知のテレフタル酸1,2−ジオキシゲナーゼとDCDレダクターゼの組み合わせにプロトカテク酸を分解する何らしかの不純物が混入したものとは考えられず、新規な反応機構を有する酵素群であることがいえる。
【0022】
本発明の酵素の精製を進めるに従って、上記方法によれば上記酵素Aは赤い色を有する画分として得られ、酵素分画物Bは黄色を呈する画分として得られる。酵素溶液が着色している理由としては、この酵素は金属あるいはポルフィリンなどの補欠因子族を含む酵素であるものと推定される。
【0023】
酵素Aは精製を進めることにより、単一な酵素として単離することができる。この単一な酵素Aは以下の性状を有する。
A.分子量およびサブユニット構造
SDS−PAGEから求めた分子量は136KDaであり、2つのサブユニット構造を有する。1つは52KDaの分子量を有するユニット(α鎖)で、もう1つは16KDaの分子量を有するユニット(β鎖)である。質量分析から求められた分子量はそれぞれ128kDa、47kDa、17kDaである。
B.補酵素
NADHを必要とする。
C.アミノ酸配列
α鎖とβ鎖のN末端側のアミノ酸配列およびα鎖の2つの部分配列を後掲の表3に示す。アミノ酸配列的には既報の配列と相同性は無く、新規酵素であることがわかった。
【0024】
アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。
D.等電点
等電点は5.3である。
E.至適pH、至適温度
至適pHは7.4から8、至適温度は20〜30℃である。
F.基質特異性
テレフタル酸二ナトリウム、2,5−ジカルボキシピリジンを分解する。
G.金属イオン、キレート試薬による影響
0.5mM 塩化鉄(II)を添加することにより活性は上昇し、2価鉄イオン以外の各種金属イオンにより強く阻害される。また、各種キレート剤により阻害される。
【0025】
本発明におけるテレフタル酸分解酵素群、及びそれに含まれる新規酵素A及びBは、テレフタル酸を含む排水の分解・浄化に利用し得る。またテレフタル酸を原料として酵素反応により生成する化合物を製造することや、本酵素を固定化したバイオリアクターなどへの利用が可能となり得る。
【0026】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の目的を損なわない範囲において、これらに限定されない。
テレフタル酸分解活性の測定
テレフタル酸の分解酵素の分解活性は、その反応液のテレフタル酸の減少量を高速液体クロマトグラフィーで追跡した(定量し、算出された)。酵素反応の条件は以下の通りである。
【0027】
酵素溶液50μl、下記化合物を含むバッファー溶液200μlを混合し、30℃で15分間反応させた。反応溶液中の各化合物の最終濃度は以下の通りである。
【0028】
0.1mM NADH
0.1mM テレフタル酸二ナトリウム
0.02mM FeCl2
バッファーには50mM MOPS−水酸化カリウム(KOH)緩衝液(50mM、pH=7.5)を用いた。
【0029】
反応後、250μlのメタノールと100mMリン酸の混合溶媒(80/20の混合比)を加え、失活させたのち、遠心分離で得られた上清を高速液体クロマトグラフィーでテレフタル酸残存量を測定した。高速液体クロマトグラフィーは日立製作所製のL−7000シリーズ型装置を用い、カラムには資生堂CAPCELL PAK C18(UG120, 5μm サイズφ4.6mm×250mmを、溶媒にはメタノール/20mMリン酸水溶液=40/60を用いた。検出は紫外吸収(240nm)で行った。
全タンパク質量の測定
牛アルブミンタンパクを標準タンパクとし、BCA法を用いた測定結果より重量を算出した。
酵素の比活性
酵素の比活性は酵素活性を蛋白質量で割った値を用いた。全酵素活性は1molのテレフタル酸を30℃、1分で分解する活性を1katとして計算した。
【0030】
酵素の比活性は以下の計算式で算出した。
【0031】
【数1】
酵素の比活性=(全酵素活性;kat)/(全蛋白質量;重量)
全菌体数の測定
日立製のU−1100型紫外可視吸光光度計で測定した。測定波長は660nmで行った。
【0032】
[実施例1(テレフタル酸分解菌の単離)]
テレフタル酸を炭素源として生育可能な選択培地を用いて、産業排水などの90サンプルから集積培養を行った。単離に用いた培地の成分を以下に示す。水はイオン交換水を用いた。
【0033】
0.2% (NH4)2SO4
0.1% テレフタル酸ニナトリウム塩
0.01% 酵母エキス
0.001% FeSO4・7H2O
0.0001% CuSO4・5H2O
0.0001% MgSO4・5H2O
0.0001% MnSO4・5H2O
0.0001% ZnSO4・5H2O
50mM リン酸カリウムバッファー pH=6.0
その中で分解活性の高い菌を単離しスクリーニングを行った。その結果、もっとも分解活性の高い菌を単離した。その結果、本菌は、生理学的特性からBurkholderia gladioliであると同定された。この菌の特徴を表1に示す。
【0034】
【表1】
[実施例2(テレフタル酸分解酵素の単離)]
単離されたBurkholderia gladioli 4−7−1株の菌体を得るため、丸菱バイオエンジ(株)社製30L容のジャーファーメンターで培養を実施した。培地には実施例1で用いた培地のテレフタル酸濃度を0.2%に高めたものを用いた。培養液は20L用い30℃で通気攪拌培養を行った。培養後の菌体数は(A660)は0.7であった。培養液はすべて遠心分離を行い、菌体を採集した。その結果、菌体が濃縮された液(菌体数(A660)=40)350mlを得た。
【0035】
この菌体が濃縮された液150mlに、以下の化合物を添加した。
【0036】
ジチオスレイトール(DTT、最終濃度が1mM)
DNA分解酵素(最終濃度0.1mM)
4−アミジノフェニルメタンスルホン酸フルオリド(最終濃度0.01mM)
α−microbial alkaline protease inhibitor(最終濃度0.01mM)
pepstatin(最終濃度0.01mM)
これを氷冷下HEAT SYSTEM社製astorason ULTRA SONIC PROCESSORホモジェナイザーで破砕し、破砕液を得た。これを遠心分離で不溶部を除去し、粗酵素液(120ml)を得た。
【0037】
次に粗酵素液をイオン交換クロマトで精製した。DEAEセファロース(ファルマシア社製DEAE Sepharose FF)を緩衝液(10%グリセリンおよび1mMのDTTを含むMOPS−水酸化カリウム(KOH)緩衝液(50mM、pH=7.5))中で減圧下脱気、平衡化処理を行った。これに粗酵素液を添加し、4℃で1時間保持し、セファロース樹脂に酵素を吸着させた。これの全量をカラムに充填した(φ2.0cm×20cm)。このカラムに300mlの上記緩衝液を添加、洗浄し(4℃、流速31ml/hr)、不要なタンパク質を除去した。ついで塩濃度を高めることにより、吸着した酵素を脱離させた。塩濃度上昇には0.5M塩化ナトリウムを含む上記緩衝液150mlをグラジエントさせることで高めた。操作はすべて4℃で行い、カラムより出た画分はフラクションコレクターにより7.1mlずつ分画した。分画されたフラクションについて、全タンパク質量およびテレフタル酸分解活性を測定した結果、塩濃度0.25Mから0.33Mの画分にテレフタル酸分解活性を有する赤色の画分を得た。また赤色の画分よりも塩濃度が低い領域(0.1以上0.25M未満)で黄色い色を有するフラクションを得ることが出来た。
【0038】
このとき得られた赤色のフラクションをさらに疎水クロマトにより精製した。フェニルセファロース(ファルマシア社製Phenyl Sepharose CL−4B)を緩衝液(MOPS−KOH緩衝液(50mM、pH=7.5、10%グリセリン、1mMのDTTおよび1Mの硫酸アンモニウムを含むもの)中で脱気、平衡化し、上記赤色フラクション(70mL)を0.88Mの硫酸アンモニウムの存在下吸着させた。これをカラムに充填し(φ0.9cm×16cm)、150mlの硫酸アンモニウムを含む上記緩衝液で洗浄し、硫酸アンモニウム濃度を0.4M、0.2M、0Mと下げていくことにより(各50ml添加)酵素を脱離、フラクション(各3.5mL)を回収した。流速は68mL/hrであった。酵素活性を調べて分解活性の高かったフラクションを集め、ゲルろ過による精製を行った。
【0039】
ファルマシア社製Superdex200HR10/30をカラム(φ1.0cm×30cm)として用い、上記フラクション0.9mlを添加しゲルろ過クロマトを実施した。緩衝液には0.1Mの塩化ナトリウムを含むMOPS−KOH緩衝液(50mM、pH=7.5、10%グリセリンおよび1mMのDTTを含むもの)を用いた。その結果、比活性が340にまで高められた酵素Aを得た。
【0040】
酵素の精製段階と、その比活性についてまとめたデータを表2に示す。
【0041】
【表2】
各クロマトグラフィーで得られた酵素についてその純度を調べるため、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下アクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を行った。結果を図1に示す。
【0042】
ゲルろ過クロマトを行うことにより、ゲルろ過後の酵素Aは不純物のバンドが消失し、サブユニット構造による2つの分子鎖のバンドが確認された。
【0043】
[実施例3(テレフタル酸分解酵素(オキシゲナーゼ様画分)の諸性質)]
実施例2によりBurkholderia gladioli 4−7−1菌体より精製された酵素Aの諸性質を調べた。結果を表3に示す。
【0044】
【表3】
以上の結果から、今回精製された酵素AのN末端側のアミノ酸配列は公知のテレフタレート1,2−ジオキシゲナーゼと相同性はなく、新規酵素であると判断された。
【0045】
なお、至適pHの測定には、MOPS−KOH緩衝液のほかに、リン酸緩衝液、トリス(ジヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液を用いた。
【0046】
N末端側のアミノ酸配列は、アプライドバイオシステムズジャパン(株)マイクロシーケンスアナリシスシステム:ABI Model 476A で分析をし、Applied Biosystems 610A Data Analysis System Ver. 1.2で解析を行った。また、部分アミノ酸配列はlysyl endpeptidaseで消化した後、Tricine−SDS−PAGEにより精製されたペプチド断片について、N末端側のアミノ酸配列と同様に分析、解析を行った。
【0047】
[実施例4(酵素Aと黄色いフラクションの共反応)]
実施例2により単離された酵素Aについて、下記の実施条件により1)〜3)について調べた。結果を表4に示す。
(実施条件)
1)実施例2のDEAEセファロースカラムによる精製で得られた黄色いフラクションの存在下で反応させた場合の酵素活性
酵素A12.5μl、黄色画分12.5μl、50mM MOPS−KOH buffer pH=7.5 25μl、基質のバッファー溶液200μlを混合し、30℃で15分間反応させた。基質のバッファー溶液の最終組成は以下の通りである。
【0048】
0.1mM NADH
0.1mM テレフタル酸ナトリウム
0.02mM FeCl2
50mM MOPS−KOH buffer pH=7.5
反応後、250μlのメタノールと100mMリン酸の混合溶媒(80/20の混合比)を加え、失活させたのち、遠心分離で得られた上清を高速液体クロマトグラフィーでテレフタル酸残存量を測定した。
2)熱により失活させた黄色いフラクションの存在下での酵素活性
黄色いフラクションを100℃で10分間加熱処理し、失活したものを用いた以外は上記1)の方法と同様に行った。
3)熱により失活させた酵素Aと、失活してない黄色いフラクションが共存する場合の酵素活性
酵素Aを100℃で10分間加熱処理し、失活したものを用いた以外は上記1)の方法と同様に行った。
【0049】
【表4】
以上より、実施例2で単離された酵素Aは黄色いフラクション(酵素分画物B)の共存下でテレフタル酸を最も高く分解することから、テレフタル酸の分解には両方の活性がそろうことにより最大の効果が得られることがわかった。
【0050】
また、上記1)(酵素A+黄色いフラクション)の反応前と反応後の紫外可視吸収スペクトルを測定した。結果を図2に示す。
【0051】
反応前の紫外可視吸収スペクトルは基質であるテレフタル酸の吸収(240nm付近)、酵素タンパク質の吸収(220および280nm付近)、補酵素NADHの吸収(220nm付近)が重なって見られた。
【0052】
酵素反応と共にテレフタル酸が分解するにつれて240nmの吸収の減少、補酵素NADHが消費されること(すなわちNADHが酸化型のNAD+に変化すること)による340nmの減少が確認された。しかしその他の吸収スペクトルの変化は見られなかった。公知文献に記載のごとく、プロトカテク酸が生成する場合は、258nm付近に吸収極大の増加が観察されるが、本発明の酵素ではそのような変化は見られなかった。
【0053】
[実施例5(酵素の反応における各種化合物の影響)]
実施例2により単離された酵素A、酵素Bを用いて、下記の実施条件により、各金属イオン、キレート試薬の影響を調べた。結果を表5に示す。
(実施条件)
1) テレフタル酸分解酵素活性
酵素A12.5μl、黄色画分12.5μl、50mM MOPS−KOH buffer pH=7.5 25μl、基質のバッファー溶液200μlを混合し、30℃で15分間反応させた。基質のバッファー溶液の最終組成は以下の通りである。
【0054】
0.1mM NADH
0.1mM テレフタル酸ナトリウム
50mM MOPS−KOH buffer pH=7.5
0.5mM〜1mM 各キレート試薬、金属イオン
【0055】
【表5】
テレフタル酸分解活性はFeCl2により約2.7倍に増加したが、FeCl2以外の金属イオンでは強く阻害される。また、NaN3以外の各種キレート剤によっても阻害される。
【0056】
[実施例6(反応生成物)]
実施例2と同様の操作を実施することにより得られた粗酵素液をイオン交換クロマトで精製した。DEAEセファロース(ファルマシア社製DEAE Sepharose FF)を緩衝液(1mMのDTTを含むMOPS−水酸化カリウム(KOH)緩衝液(50mM、pH=7.5))中で減圧下脱気、平衡化処理を行った。これの全量をカラムに充填した(φ2.0cm×20cm)。4℃下で、これに粗酵素液40mlを添加し、セファロース樹脂に酵素を吸着させた。このカラムに200mlの上記緩衝液を添加、洗浄し(4℃、流速60ml/hr)、不要なタンパク質を除去した。ついで塩濃度を高めることにより、吸着した酵素を脱離させた。塩濃度上昇には0.5M塩化ナトリウムを含む上記緩衝液420mlをグラジエントさせることで高めた。操作はすべて4℃で行い、カラムより出た画分はフラクションコレクターにより4mlずつ分画した。分画されたフラクションについて、全タンパク質量およびテレフタル酸分解活性を測定した結果、塩濃度0.25Mから0.33Mの画分にテレフタル酸分解活性を有する赤色の画分を得た。また赤色の画分よりも塩濃度が低い領域(0.1以上0.25M未満)で黄色い色を有するフラクションを得ることが出来た。
【0057】
得られた赤色画分1ml、黄色画分1ml、基質溶液8mlを混合し、30℃で2時間反応させた。基質の溶液の最終組成は以下の通りである。
【0058】
1mM NADH
1mM テレフタル酸ナトリウム
0.02mM FeCl2
これより生成物として3,4−ジヒドロキシ−1,5−シクロヘキサジエン−1,4−ジカルボン酸を得た。この生成物の1H−核磁気共鳴スペクトル(1H−NMR)と13C−核磁気共鳴スペクトル(13C−NMR)は次の通りであった。また、プロトカテク酸は1H−NMRで6.82,7.33,7.38(ppm)にピークを持つが、反応溶液中からはこれらのピークは検出されなかった。
【0059】
1H−NMR(D2O)δ(ppm):4.99(1H),5.87(1H),6.46(1H),6.51(1H)
13C−NMR(D2O)δ(ppm):73.01,75.56,126.61,128.51,133.00,136.98,174.37,181.42
【0060】
【発明の効果】
本発明によれば、新規テレフタル酸分解酵素を提供することができる。本発明の酵素を用いることにより、テレフタル酸を紫外吸収の低い化合物に変化させることや、本発明の酵素を固定化したバイオリアクターなどへの応用が期待される。
【0061】
【配列表】
<110> 国立大学法人 京都工芸繊維大学
<110> 帝人株式会社
<120> テレフタル酸分解酵素組成物およびそれを用いた3,4-ジヒドロキシ-1,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルボン酸の製造方法
<130> P35682
<150> JP2001-84663
<151> 2001-3-23
<160> 6
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<400> 1
Asn Val Ile Pro Ile Lys LeuAla Arg Arg Ala Ser Val Ala Trp Pro
1 5 10 15
Glu Glu Gly LeuThr Arg Val Pro
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 13, 14, 19
<400> 2
Ala Ala Leu Asp IleHis Gln Ala Ile Ala Arg Ala Xaa XaaGlu Tyr
1 5 10 15
Val Arg Xaa Ile
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 1
<400> 3
Xaa Asp Ser Tyr His Ala Ser Ile Leu His Leu PhePhe Thr ThrPhe
1 5 10 15
Gln Leu Asn Arg
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 1
<400> 4
Xaa Leu Arg Val Ala Thr Leu His GlyLeu Val Phe Gly Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asp Asp Val Ala
20
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Comamonas testosteroni
<220>
<221> UNSURE
<222> 9
<400> 5
Met Gln Glu Ser IleIle Gln TrpXaa Gly Ala Thr Asn ThrArg Val
1 5 10 15
Pro
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Comamonas testosteroni
<400> 6
Met Ile Asn GluIle Gln IleAla Phe Asn Ala Ala Tyr Ala LysThr
1 5 10 15
Ile Asp Ser Asp Ala Met GluGln
20
【図面の簡単な説明】
【図1】 アクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による測定結果。
【図2】 実施例4の1)における酵素反応前と反応後の紫外可視吸収スペクトル。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a terephthalic acid decomposing enzyme composition and a method for decomposing terephthalic acid using the same. More specifically, the present invention relates to a terephthalic acid-degrading enzyme having a novel amino acid sequence and a method for decomposing terephthalic acid using the same.
[0002]
[Prior art]
Terephthalic acid is industrially produced in large quantities as a raw material for aromatic polyesters typified by polyethylene terephthalate (PET), and is mainly used for polymer production. PET produced from terephthalic acid is molded and processed into fibers, films, bottles, etc. and is consumed in large quantities.
[0003]
A system to recycle used PET bottles by separating and collecting is being built, but there are many things that are discarded in nature such as fields, forests, and oceans, like PET bottles floating in the ocean. . In this case, it can be considered that terephthalic acid is produced in the process of photolysis or microbial decomposition of PET, but terephthalic acid is known to be slightly difficult to decompose in nature.
[0004]
Microorganisms that decompose terephthalic acid or methods for decomposing terephthalic acid using microorganisms have been studied. Specifically, a method of degrading with Pseudomonas genus bacteria described in JP-A-10-42864, and a method of decomposing with Alkagenes genus bacteria and Rhodococcus bacteria described in JP-A-10-327848 are disclosed. These bacteria are disclosed to be particularly effective in decomposing and purifying terephthalic acid in the waste liquid discharged from the weight reduction process of polyester fiber with sodium hydroxide. In addition, a method for producing 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid from terephthalic acid using a mutant of the genus Pseudomonas described in US Pat. No. 5,124,479 is disclosed. However, the terephthalic acid-degrading enzyme as shown in the present invention is neither described nor studied.
[0005]
Regarding the degradation pathway of terephthalic acid by an enzyme, a terephthalic acid 1,2-dioxygenase system isolated from Comonas testosteroni was reported (Schlaefli, Hans R. et al., J. Bacteriol. (1994), 176 (21), 6644. -52). Among them, an enzyme having terephthalic acid decomposing activity (terephthalic acid 1,2-dioxygenase) is obtained by converting terephthalic acid into 1,2-dihydroxy-3 from terephthalic acid in the presence of coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and oxygen. , 5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid (DCD), and the resulting DCD is converted to protocatechuic acid by DCD dehydrogenase. The terephthalic acid 1,2-dioxygenase has two subunit structures, and the amino acid sequence on the N-terminal side is also described.
[0006]
However, from the viewpoint of decomposing and purifying terephthalic acid contained in various industrial waste liquids, the enzyme system disclosed in the above document generates an aromatic compound called protocatechuic acid, which reduces the burden on the waste liquid treatment process. Although it seems that it is preferable to convert it into an aliphatic compound that does not have ultraviolet absorption, it has not been found.
[0007]
The main object of the present invention is to provide a novel terephthalate degrading enzyme. Another object of the present invention is to provide a method for producing 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid by decomposing terephthalic acid using an enzyme.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive investigations on bacteria capable of assimilating terephthalic acid and degrading enzymes obtained therefrom, the present inventors have found that the known degrading enzyme terephthalic acid 1,2-dioxygenase is an amino acid. The present inventors have found that the enzyme is a novel enzyme having no sequence homology and different from the reaction modes reported so far, and has completed the present invention.
[0009]
That is, the present invention is as follows.
1. A terephthalic acid-degrading enzyme A having the following characteristics, isolated from a terephthalic acid-degrading enzyme composition produced by Burkholderia gladioli 4-7-1 (FERM P-18427) strain.
A. Molecular weight and subunit structure:
The molecular weight determined from SDS-PAGE is 136 KDa and has two subunit structures. One is a unit (α chain) having a molecular weight of 52 KDa, and the other is a unit (β chain) having a molecular weight of 16 KDa. The molecular weights determined from mass spectrometry are 128 kDa, 47 kDa, and 17 kDa, respectively.
B. Coenzyme:
Requires NADH.
C. N-terminal amino acid sequence:
α: Asn-Val-Ile-Pro-Ile-Lys-Leu-Ala-Arg-Arg-Ala-Ser-Val-Ala-Trp-Pro-Glu-Glu-Gly-Leu-Thr-Arg-Val-Pro
β: Ala-Ala-Leu-Asp-Ile-His-Gln-Ala-Ile-Ala-Arg-Ala- (Gln)-(Ala) -Glu-Tyr-Val-Arg- (Arg / Ser) -Ile
(Amino acids enclosed in parentheses in the amino acid sequence table are likely to be identified as amino acids almost as a result of amino acid sequence analysis, but indicate portions that cannot be reliably identified due to the influence of impurities, etc.)
D. Partial amino acid sequence:
α1: (Lys) -Asp-Ser-Tyr-His-Ala-Ser-Ile-Leu-His-Leu-Phe-Phe-Thr-Thr-Phe-Gln-Leu-Asn-Arg
α2: (Lys) -Leu-Arg-Val-Ala-Thr-Leu-His-Gly-Leu-Val-Phe-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Asp-Val-Ala
(Amino acids enclosed in parentheses in the amino acid sequence table are likely to be identified as amino acids almost as a result of amino acid sequence analysis, but indicate portions that cannot be reliably identified due to the influence of impurities, etc.)
E. Isoelectric point:
The isoelectric point is 5.3.
F. Optimum pH and temperature:
The optimum pH is 7.4 to 8, and the optimum temperature is 20-30 ° C.
G. Substrate specificity:
Decomposes disodium terephthalate, 2,5-dicarboxypyridine.
H. Effects of metal ions and chelating reagents:
By adding 0.5 mM iron (II) chloride, the activity increases and is strongly inhibited by various metal ions other than divalent iron ions. It is also inhibited by various chelating agents.
2. (1) Burkholderia gladioli 4-7-1 strain is cultured in a medium containing terephthalic acid as a carbon source, and (2) a crushed solution (crude enzyme solution) obtained by crushing the strain is obtained as (3) diethylaminoethyl. Adsorbed in an ion exchange resin having a (DEAE) group in a buffer solution (50 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) -hydroxylation containing 10% glycerin and 1 mM dithiothreitol (DTT) as the buffer solution) Potassium buffer, pH = 7.5 is used), (4) The salt concentration of the buffer is increased with sodium chloride, and the sodium chloride concentration is desorbed from the ion exchange resin with a buffer solution of 0.25 to 0.33M. 2. The method for isolating terephthalate-degrading enzyme A according to 1 above, obtained from a fraction obtained by
3. (1) Burkholderia gladioli 4-7-1 strain is cultured in a medium containing terephthalic acid as a carbon source, and (2) a crushed solution (crude enzyme solution) obtained by crushing the strain is obtained as (3) diethylaminoethyl. 50 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) -potassium hydroxide containing 10% glycerin and 1 mM dithiothreitol (DTT) as adsorbed on an ion exchange resin having a (DEAE) group in a buffer Buffer solution, pH = 7.5 is used), (4) The salt concentration of the buffer solution is increased with sodium chloride, and the sodium chloride concentration is desorbed from the ion exchange resin in the range of 0.10 to less than 0.25M. A method for producing a terephthalic acid-degrading enzyme fraction B obtained from a fraction obtained by
4). A method for producing 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid, which decomposes terephthalic acid using the degrading enzyme A described in 1 above.
5). 4. The method for producing 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid according to 4 above, wherein the degradation enzyme fraction B obtained by the method according to 3 above is used in combination.
6). A terephthalic acid decomposing enzyme composition comprising the decomposing enzyme A described in 1 and the decomposing enzyme fraction B obtained by the method described in 3 above.
[0010]
The reaction product of the decomposing enzyme of the present invention is 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid, and based on this, hydroxyterephthalic acid can be easily synthesized. is there. Moreover, unlike the reaction by a conventionally well-known enzyme, since the protocatechuic acid is not included as a by-product, purification of the reaction product is easy. In addition, by using the decomposing enzyme of the present invention, it is possible to produce a product compound using waste terephthalic acid, or to use it in a bioreactor in which the enzyme is immobilized.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The terephthalic acid-degrading enzyme of the present invention can be produced by Burkholderia gladioli 4-7-1 strain in the genus Burkholderia which is an aerobic bacterium. This bacterium is generally considered to exist widely in nature.
[0012]
According to the present invention, it has been found that this bacterium can grow and proliferate using terephthalic acid as a carbon source. It is also possible to assimilate esters such as dimethyl terephthalate. Since terephthalic acid decomposed or assimilated by the above-mentioned bacteria is preferably dissolved in a medium such as a liquid medium or an agar medium for assimilation by the bacteria, metal salts such as sodium salts and onium salts such as ammonium salts The form is preferred.
[0013]
Any method can be used for growing this Burkholderia gladioli strain 4-7-1 as long as it is a medium used in normal microorganism experiments. Preferably, terephthalic acid is included in the medium composition. It is preferable for the production of the enzyme to grow in a medium containing a mineral such as an inorganic salt as necessary. More preferably, inorganic salts containing metal salts such as ammonium sulfate, iron sulfate, copper sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, and zinc sulfate are preferable. As the carbon source, besides terephthalic acid, glucose, peptone, malt juice, yeast extract, gravy or the like may be used as necessary. In order to keep the pH of the medium constant, it is preferable to use a buffer. As the buffer solution, a phosphate buffer solution, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) -potassium hydroxide buffer solution and the like can be used, but are not limited thereto. Moreover, it is preferable to make it grow in the range of 20-35 degreeC as growth temperature, and the range of 6-7 is preferable as pH of a culture medium.
[0014]
The terephthalic acid-degrading enzyme produced by this bacterium may be in any part of the microbial cell, but preferably the terephthalic acid-degrading enzyme within the bacterium is the target of purification. In the process of extracting terephthalic acid-degrading enzyme, it is preferable to isolate from the whole liquid obtained by crushing the cells grown by culture. It is preferable to purify the microbial cell disruption solution and the culture solution obtained by such a method because they contain various proteins and waste products as impurities.
[0015]
The method for purifying terephthalic acid-degrading enzyme is not particularly limited, but it is preferably isolated by the following method. Specifically, an ion exchange resin having a diethylaminoethyl (DEAE) group, particularly a polysaccharide derivative such as cellulose or dextran, is preferable. For example, the ion exchange chromatography is performed by ion exchange chromatography using a column packed with DEAE Sephadex manufactured by Pharmacia. An enzyme fraction with an increased specific activity of the enzyme can be obtained. The buffer used at this time is preferably a phosphate buffer or 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) -potassium hydroxide buffer, but is not limited thereto. The concentration of the buffer is preferably 0.01M to 0.2M, more preferably 0.02 to 0.1M.
[0016]
The operation is preferably performed at a low temperature, specifically, preferably at about 4 ° C. Further, additives such as glycerin and dithiothreitol (DTT) may be used for the purpose of maintaining the stability of the enzyme. The enzyme adsorbed on the ion exchange resin can be desorbed and recovered by increasing the salt concentration in the buffer. As the salt used at this time, sodium chloride or ammonium sulfate is preferably used. The method for increasing the salt concentration may be either a stepwise method or a gradient method, but the gradient method is preferred for the purpose of increasing the purity and specific activity of the enzyme.
[0017]
In carrying out the purification operation, the activity of terephthalic acid degrading enzyme can be measured by following the decrease in terephthalic acid. The amount of terephthalic acid can be analyzed by a method such as high performance liquid chromatography.
[0018]
A specific preferred embodiment for extracting terephthalic acid degrading enzyme is as follows. In a medium containing terephthalic acid and Burkholderia gladioli 4-7-1, the cells grown by culture are collected by centrifugation and disrupted. The obtained crushed liquid (crude enzyme liquid) is adsorbed in an ion exchange resin having a diethylaminoethyl (DEAE) group in a buffer solution. At this time, 50 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) -potassium hydroxide buffer (pH = 7.5) containing 10% glycerin and 1 mM dithiothreitol (DTT) can be used as the buffer. . Next, at around 4 ° C., the enzyme adsorbed on the ion exchange resin is desorbed using a buffer solution containing sodium chloride by a gradient method to obtain a terephthalic acid degrading enzyme group.
[0019]
The terephthalic acid-degrading enzyme group obtained by such a method includes those having the following two enzyme activities. One having the activity of decomposing terephthalic acid in the presence of the coenzyme NADH and enzyme fraction B (enzyme A), and the other having the activity of reducing cytochrome C in the presence of NADH ( Enzyme fraction B). The former seems to be oxygenase due to the nature of the enzyme reaction, and the latter seems to be reductase due to the nature of the enzyme activity. These enzymes disclosed in the present invention are most likely to exhibit terephthalic acid decomposing activity when the enzyme A and the enzyme fraction B coexist, and when either of them lacks the activity, terephthalic acid decomposing activity It has the characteristic that ability is significantly reduced. As a preferable ratio of coexistence, 1 mol of enzyme A is 0.1 to 10 mol of enzyme fraction B. In addition, enzyme A and enzyme fraction B are fractionated in the ranges where the sodium chloride concentration is 0.10 or more and less than 0.25M (enzyme B) and 0.25 to 0.33M (enzyme A), respectively, under the above conditions. Mainly contained in the processed ingredients.
[0020]
According to the present invention, the product obtained by reacting terephthalic acid in the presence of enzyme A and enzyme fraction B is 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid, Those having no UV-visible absorption wavelength are obtained. Until now, it is described that protocatechuic acid can be obtained from terephthalic acid in a known combination of terephthalic acid 1,2-dioxygenase and DCD reductase, but the products of this enzyme group are different from protocatechuic acid, It can be said that it is a novel enzyme as a reaction mechanism of an enzyme reaction.
[0021]
In addition, since the enzyme group in the present invention does not have an activity of decomposing protocatechuic acid, the combination of a known terephthalic acid 1,2-dioxygenase and DCD reductase is mixed with any impurities that decompose protocatechuic acid. It is unthinkable and can be said to be an enzyme group having a novel reaction mechanism.
[0022]
As the enzyme of the present invention is further purified, according to the above method, the enzyme A is obtained as a fraction having a red color, and the enzyme fraction B is obtained as a yellow fraction. The reason why the enzyme solution is colored is presumed to be an enzyme containing a prosthetic group such as metal or porphyrin.
[0023]
Enzyme A can be isolated as a single enzyme by further purification. This single enzyme A has the following properties.
A. Molecular weight and subunit structure
The molecular weight determined from SDS-PAGE is 136 KDa and has two subunit structures. One is a unit (α chain) having a molecular weight of 52 KDa, and the other is a unit (β chain) having a molecular weight of 16 KDa. The molecular weights determined from mass spectrometry are 128 kDa, 47 kDa, and 17 kDa, respectively.
B. Coenzyme
Requires NADH.
C. Amino acid sequence
The amino acid sequences on the N-terminal side of the α chain and β chain and the two partial sequences of the α chain are shown in Table 3 below. The amino acid sequence was not homologous with the previously reported sequence and was found to be a novel enzyme.
[0024]
Amino acids enclosed in parentheses in the amino acid sequence table are likely to be identified as amino acids almost as a result of amino acid sequence analysis, but indicate portions that cannot be reliably identified due to the influence of impurities or the like.
D. Isoelectric point
The isoelectric point is 5.3.
E. Optimum pH and temperature
The optimum pH is 7.4 to 8, and the optimum temperature is 20-30 ° C.
F. Substrate specificity
Decomposes disodium terephthalate, 2,5-dicarboxypyridine.
G. Effects of metal ions and chelating reagents
The activity is increased by adding 0.5 mM iron (II) chloride and is strongly inhibited by various metal ions other than divalent iron ions. It is also inhibited by various chelating agents.
[0025]
The terephthalic acid decomposing enzyme group in the present invention and the novel enzymes A and B contained therein can be used for the decomposition and purification of waste water containing terephthalic acid. Further, it may be possible to produce a compound produced by an enzymatic reaction using terephthalic acid as a raw material, or to use it in a bioreactor in which the present enzyme is immobilized.
[0026]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, in the range which does not impair the objective of this invention, it is not limited to these.
Measurement of terephthalic acid degradation activity
The degradation activity of the terephthalic acid-degrading enzyme was monitored (high-performance liquid chromatography) for the amount of terephthalic acid decrease in the reaction mixture. The conditions for the enzyme reaction are as follows.
[0027]
50 μl of enzyme solution and 200 μl of a buffer solution containing the following compounds were mixed and reacted at 30 ° C. for 15 minutes. The final concentration of each compound in the reaction solution is as follows.
[0028]
0.1 mM NADH
0.1 mM disodium terephthalate
0.02 mM FeCl2
A 50 mM MOPS-potassium hydroxide (KOH) buffer (50 mM, pH = 7.5) was used as the buffer.
[0029]
After the reaction, 250 μl of methanol and 100 mM phosphoric acid mixed solvent (80/20 mixing ratio) was added to inactivate, and the supernatant obtained by centrifugation was measured for the residual amount of terephthalic acid by high performance liquid chromatography. did. The high performance liquid chromatography uses Hitachi L-7000 series type apparatus, Shiseido CAPCELL PAK C18 (UG120, 5 μm size φ4.6 mm × 250 mm for the column, methanol / 20 mM phosphoric acid aqueous solution = 40/60 for the solvent. Detection was performed by ultraviolet absorption (240 nm).
Measurement of total protein
Using bovine albumin protein as a standard protein, the weight was calculated from the measurement results using the BCA method.
Specific activity of the enzyme
The specific activity of the enzyme was obtained by dividing the enzyme activity by the protein mass. The total enzyme activity was calculated based on 1 kat as the activity of decomposing 1 mol of terephthalic acid at 30 ° C. for 1 minute.
[0030]
The specific activity of the enzyme was calculated by the following formula.
[0031]
[Expression 1]
Specific activity of enzyme = (total enzyme activity; kat) / (total protein mass; weight)
Measurement of total cell count
Measured with a U-1100 UV-Visible spectrophotometer manufactured by Hitachi. The measurement wavelength was 660 nm.
[0032]
[Example 1 (isolation of terephthalic acid degrading bacteria)]
Using a selective medium capable of growing using terephthalic acid as a carbon source, enrichment culture was performed from 90 samples such as industrial wastewater. The components of the medium used for isolation are shown below. Water used was ion exchange water.
[0033]
0.2% (NH4)2SO4
0.1% disodium terephthalate
0.01% yeast extract
0.001% FeSO4・ 7H2O
0.0001% CuSO4・ 5H2O
0.0001% MgSO4・ 5H2O
0.0001% MnSO4・ 5H2O
0.0001% ZnSO4・ 5H2O
50 mM potassium phosphate buffer pH = 6.0
Among them, bacteria with high degrading activity were isolated and screened. As a result, the bacteria with the highest degradation activity was isolated. As a result, this bacterium was identified as Burkholderia gladioli from its physiological characteristics. The characteristics of this bacterium are shown in Table 1.
[0034]
[Table 1]
[Example 2 (isolation of terephthalic acid-degrading enzyme)]
In order to obtain an isolated cell body of Burkholderia gladioli 4-7-1, culturing was carried out using a 30 L jar fermenter manufactured by Maruhishi Bioengineering Co., Ltd. The medium used was a medium used in Example 1 with the terephthalic acid concentration increased to 0.2%. The culture solution was aerated and stirred at 30 ° C. using 20 L. The number of cells after culture was 0.7 for (A660). All cultures were centrifuged and the cells were collected. As a result, 350 ml of a concentrated bacterial cell (the number of bacterial cells (A660) = 40) was obtained.
[0035]
The following compounds were added to 150 ml of the concentrated liquid.
[0036]
Dithiothreitol (DTT, final concentration 1 mM)
DNA-degrading enzyme (final concentration 0.1 mM)
4-Amidinophenylmethanesulfonic acid fluoride (final concentration 0.01 mM)
α-microal alkaline protease inhibitor (final concentration 0.01 mM)
pepstatin (final concentration 0.01 mM)
This was crushed with an asterason ULTRA SONIC PROCESSOR homogenizer manufactured by HEAT SYSTEM under ice cooling to obtain a crushed liquid. This was centrifuged to remove the insoluble part to obtain a crude enzyme solution (120 ml).
[0037]
Next, the crude enzyme solution was purified by ion exchange chromatography. DEAE Sepharose (DEAE Sepharose FF manufactured by Pharmacia) was degassed in a buffer (MOPS-potassium hydroxide (KOH) buffer (50 mM, pH = 7.5) containing 10% glycerin and 1 mM DTT) under reduced pressure. Equilibration treatment was performed. The crude enzyme solution was added to this, and kept at 4 ° C. for 1 hour to adsorb the enzyme to Sepharose resin. The entire amount was packed in a column (φ2.0 cm × 20 cm). 300 ml of the above buffer solution was added to this column and washed (4 ° C., flow rate 31 ml / hr) to remove unnecessary proteins. Subsequently, the adsorbed enzyme was desorbed by increasing the salt concentration. The increase in salt concentration was increased by grading 150 ml of the above buffer containing 0.5 M sodium chloride. All the operations were carried out at 4 ° C., and the fraction discharged from the column was fractionated by 7.1 ml by a fraction collector. As a result of measuring the total protein amount and terephthalic acid decomposing activity of the fractionated fraction, a red fraction having terephthalic acid decomposing activity was obtained in a fraction having a salt concentration of 0.25 M to 0.33 M. Moreover, the fraction which has a yellow color in the area | region (0.1 or more and less than 0.25M) where salt concentration is lower than a red fraction was able to be obtained.
[0038]
The red fraction obtained at this time was further purified by hydrophobic chromatography. Phenyl Sepharose (Pharmacia Phenyl Sepharose CL-4B) was degassed in buffer (MOPS-KOH buffer (containing 50 mM, pH = 7.5, 10% glycerin, 1 mM DTT and 1 M ammonium sulfate), After equilibration, the red fraction (70 mL) was adsorbed in the presence of 0.88 M ammonium sulfate, packed in a column (φ0.9 cm × 16 cm), washed with 150 ml ammonium sulfate in the above buffer, Was reduced to 0.4 M, 0.2 M, and 0 M (50 ml each added), the enzyme was desorbed, and fractions (3.5 mL each) were collected, and the flow rate was 68 mL / hr. Fractions with high degradation activity were collected and purified by gel filtration.
[0039]
Using Superdex 200HR10 / 30 manufactured by Pharmacia as a column (φ1.0 cm × 30 cm), 0.9 ml of the above fraction was added and gel filtration chromatography was performed. The buffer used was a MOPS-KOH buffer (50 mM, pH = 7.5, containing 10% glycerin and 1 mM DTT) containing 0.1 M sodium chloride. As a result, enzyme A having a specific activity increased to 340 was obtained.
[0040]
Table 2 shows a summary of the enzyme purification steps and their specific activity.
[0041]
[Table 2]
In order to examine the purity of the enzyme obtained by each chromatography, acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in the presence of sodium dodecyl sulfate. The results are shown in FIG.
[0042]
By performing gel filtration chromatography, the impurity band disappeared from enzyme A after gel filtration, and two molecular chain bands due to the subunit structure were confirmed.
[0043]
[Example 3 (Properties of terephthalic acid-degrading enzyme (oxygenase-like fraction)]]
Various properties of enzyme A purified from Burkholderia gladioli 4-7-1 cells according to Example 2 were examined. The results are shown in Table 3.
[0044]
[Table 3]
From the above results, the amino acid sequence on the N-terminal side of enzyme A purified this time has no homology with known terephthalate 1,2-dioxygenase, and was determined to be a novel enzyme.
[0045]
For the measurement of the optimum pH, a phosphate buffer, tris (dihydroxymethyl) aminomethane buffer, borate buffer, and citrate buffer were used in addition to the MOPS-KOH buffer.
[0046]
The amino acid sequence on the N-terminal side was analyzed with Applied Biosystems Japan Co., Ltd. Microsequence Analysis System: ABI Model 476A, and Applied Biosystems 610A Data Analysis System Ver. Analysis was performed in 1.2. In addition, the partial amino acid sequence was digested with lysyl endpeptidase, and then the peptide fragment purified by Tricine-SDS-PAGE was analyzed and analyzed in the same manner as the amino acid sequence on the N-terminal side.
[0047]
[Example 4 (co-reaction of enzyme A and yellow fraction)]
The enzyme A isolated in Example 2 was examined for 1) to 3) under the following conditions. The results are shown in Table 4.
(Implementation conditions)
1) Enzyme activity when reacted in the presence of yellow fraction obtained by purification using DEAE Sepharose column in Example 2
Enzyme A 12.5 μl, yellow fraction 12.5 μl, 50 mM MOPS-KOH buffer pH = 7.5 25 μl,
[0048]
0.1 mM NADH
0.1 mM sodium terephthalate
0.02 mM FeCl2
50 mM MOPS-KOH buffer pH = 7.5
After the reaction, 250 μl of methanol and 100 mM phosphoric acid mixed solvent (80/20 mixing ratio) was added to inactivate, and the supernatant obtained by centrifugation was measured for the residual amount of terephthalic acid by high performance liquid chromatography. did.
2) Enzyme activity in the presence of yellow fraction deactivated by heat
The yellow fraction was heat-treated at 100 ° C. for 10 minutes, and the same procedure as in 1) was performed except that the inactivated fraction was used.
3) Enzyme activity when enzyme A deactivated by heat and yellow fraction not deactivated coexist
The same procedure as in 1) above was performed except that enzyme A was heat-treated at 100 ° C. for 10 minutes and used after inactivation.
[0049]
[Table 4]
As mentioned above, since the enzyme A isolated in Example 2 decomposes terephthalic acid most in the presence of the yellow fraction (enzyme fraction B), the decomposition of terephthalic acid has both activities. It was found that the maximum effect was obtained.
[0050]
Moreover, the ultraviolet visible absorption spectrum before and after the reaction of 1) (Enzyme A + yellow fraction) was measured. The results are shown in FIG.
[0051]
In the UV-visible absorption spectrum before the reaction, the absorption of the substrate terephthalic acid (around 240 nm), the absorption of the enzyme protein (around 220 and 280 nm) and the absorption of the coenzyme NADH (around 220 nm) overlapped.
[0052]
As the terephthalic acid was decomposed along with the enzyme reaction, a decrease in absorption of 240 nm and a decrease of 340 nm due to consumption of the coenzyme NADH (ie, conversion of NADH to oxidized NAD +) were confirmed. However, no other change in absorption spectrum was observed. As described in the publicly known literature, when protocatechuic acid is produced, an increase in absorption maximum is observed around 258 nm, but such a change was not observed in the enzyme of the present invention.
[0053]
[Example 5 (Influence of various compounds in enzyme reaction)]
Using the enzyme A and enzyme B isolated in Example 2, the influence of each metal ion and chelating reagent was examined under the following conditions. The results are shown in Table 5.
(Implementation conditions)
1) Terephthalic acid degrading enzyme activity
Enzyme A 12.5 μl, yellow fraction 12.5 μl, 50 mM MOPS-KOH buffer pH = 7.5 25 μl,
[0054]
0.1 mM NADH
0.1 mM sodium terephthalate
50 mM MOPS-KOH buffer pH = 7.5
0.5 mM to 1 mM each chelating reagent, metal ion
[0055]
[Table 5]
Terephthalic acid decomposition activity is FeCl2Increased by about 2.7 times, but FeCl2Other metal ions are strongly inhibited. NaN3It is also inhibited by various chelating agents other than.
[0056]
[Example 6 (reaction product)]
The crude enzyme solution obtained by carrying out the same operation as in Example 2 was purified by ion exchange chromatography. DEAE Sepharose (Pharmacia DEAE Sepharose FF) was degassed and equilibrated under reduced pressure in a buffer solution (MOPS-potassium hydroxide (KOH) buffer solution (50 mM, pH = 7.5) containing 1 mM DTT). went. The entire amount was packed in a column (φ2.0 cm × 20 cm). Under 4 ° C., 40 ml of the crude enzyme solution was added thereto, and the enzyme was adsorbed on Sepharose resin. 200 ml of the above buffer was added to this column and washed (4 ° C., flow rate 60 ml / hr) to remove unnecessary proteins. Subsequently, the adsorbed enzyme was desorbed by increasing the salt concentration. The increase in salt concentration was increased by grading 420 ml of the above buffer containing 0.5 M sodium chloride. All the operations were performed at 4 ° C., and the fraction discharged from the column was fractionated by 4 ml by a fraction collector. As a result of measuring the total protein amount and terephthalic acid decomposing activity of the fractionated fraction, a red fraction having terephthalic acid decomposing activity was obtained in a fraction having a salt concentration of 0.25 M to 0.33 M. Moreover, the fraction which has a yellow color in the area | region (0.1 or more and less than 0.25M) where salt concentration is lower than a red fraction was able to be obtained.
[0057]
The obtained red fraction (1 ml), yellow fraction (1 ml) and substrate solution (8 ml) were mixed and reacted at 30 ° C. for 2 hours. The final composition of the substrate solution is as follows.
[0058]
1 mM NADH
1 mM sodium terephthalate
0.02 mM FeCl2
As a result, 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid was obtained as a product. Of this product1H-nuclear magnetic resonance spectrum (1H-NMR) and13C-nuclear magnetic resonance spectrum (13C-NMR) was as follows. Protocatechuic acid is1H-NMR had peaks at 6.82, 7.33, and 7.38 (ppm), but these peaks were not detected in the reaction solution.
[0059]
1H-NMR (D2O) δ (ppm): 4.99 (1H), 5.87 (1H), 6.46 (1H), 6.51 (1H)
13C-NMR (D2O) δ (ppm): 73.01, 75.56, 126.61, 128.51, 133.00, 136.98, 174.37, 181.42
[0060]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel terephthalic acid degrading enzyme can be provided. By using the enzyme of the present invention, terephthalic acid can be changed to a compound having low ultraviolet absorption, and application to a bioreactor in which the enzyme of the present invention is immobilized is expected.
[0061]
[Sequence Listing]
<110> Kyoto Institute of Technology
<110> Teijin Limited
<120> Terephthalic acid decomposing enzyme composition and method for producing 3,4-dihydroxy-1,5-cyclohexadiene-1,4-dicarboxylic acid using the same
<130> P35682
<150> JP2001-84663
<151> 2001-3-23
<160> 6
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<400> 1
Asn Val Ile Pro Ile Lys LeuAla Arg Arg Ala Ser Val Ala Trp Pro
1 5 10 15
Glu Glu Gly LeuThr Arg Val Pro
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 13, 14, 19
<400> 2
Ala Ala Leu Asp IleHis Gln Ala Ile Ala Arg Ala Xaa XaaGlu Tyr
1 5 10 15
Val Arg Xaa Ile
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 1
<400> 3
Xaa Asp Ser Tyr His Ala Ser Ile Leu His Leu PhePhe Thr ThrPhe
1 5 10 15
Gln Leu Asn Arg
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Burkholderia gladioli
<220>
<221> UNSURE
<222> 1
<400> 4
Xaa Leu Arg Val Ala Thr Leu His GlyLeu Val Phe Gly Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asp Asp Val Ala
20
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Comamonas testosteroni
<220>
<221> UNSURE
<222> 9
<400> 5
Met Gln Glu Ser IleIle Gln TrpXaa Gly Ala Thr Asn ThrArg Val
1 5 10 15
Pro
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Comamonas testosteroni
<400> 6
Met Ile Asn GluIle Gln IleAla Phe Asn Ala Ala Tyr Ala LysThr
1 5 10 15
Ile Asp Ser Asp Ala Met GluGln
20
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows measurement results by acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
FIG. 2 shows UV-visible absorption spectra before and after the enzyme reaction in 1) of Example 4.
Claims (6)
A.分子量およびサブユニット構造:
SDS−PAGEから求めた分子量は136KDaであり、2つのサブユニット構造を有する。1つは52KDaの分子量を有するユニット(α鎖)で、もう1つは16KDaの分子量を有するユニット(β鎖)である。質量分析から求められた分子量はそれぞれ128kDa、47kDa、17kDaである。
B.補酵素:
NADHを必要とする。
C.N末端側アミノ酸配列:
α: Asn−Val−Ile−Pro−Ile−Lys−Leu−Ala−Arg−Arg−Ala−Ser−Val−Ala−Trp−Pro−Glu−Glu−Gly−Leu−Thr−Arg−Val−Pro
β: Ala−Ala−Leu−Asp−Ile−His−Gln−Ala−Ile−Ala−Arg−Ala−(Gln)−(Ala)−Glu−Tyr−Val−Arg−(Arg/Ser)−Ile
(アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。)
D.部分アミノ酸配列:
α1: (Lys)−Asp−Ser−Tyr−His−Ala−Ser−Ile−Leu−His−Leu−Phe−Phe−Thr−Thr−Phe−Gln−Leu−Asn−Arg
α2: (Lys)−Leu−Arg−Val−Ala−Thr−Leu−His−Gly−Leu−Val−Phe−Gly−Ser−Phe―Ser―Asp−Asp−Val−Ala
(アミノ酸配列表中にカッコで囲まれたアミノ酸は、アミノ酸配列解析の結果ほぼ記載のアミノ酸に同定できるものと思われるが、不純物などの影響で確実に同定できない部分を示す。)
E.等電点:
等電点は5.3である。
F.至適pH、至適温度:
至適pHは7.4から8、至適温度は20〜30℃である。
G.基質特異性:
テレフタル酸二ナトリウム、2,5−ジカルボキシピリジンを分解する。
H.金属イオン、キレート試薬による影響:
0.5mM塩化鉄(II)を添加することにより活性は上昇し、2価鉄イオン以外の各種金属イオンにより強く阻害される。また、各種キレート剤により阻害される。A terephthalic acid-degrading enzyme A having the following characteristics, isolated from a terephthalic acid-degrading enzyme composition produced by Burkholderia gladioli 4-7-1 (FERM P-18427) strain.
A. Molecular weight and subunit structure:
The molecular weight determined from SDS-PAGE is 136 KDa and has two subunit structures. One is a unit (α chain) having a molecular weight of 52 KDa, and the other is a unit (β chain) having a molecular weight of 16 KDa. The molecular weights determined from mass spectrometry are 128 kDa, 47 kDa, and 17 kDa, respectively.
B. Coenzyme:
Requires NADH.
C. N-terminal amino acid sequence:
α: Asn-Val-Ile-Pro-Ile-Lys-Leu-Ala-Arg-Arg-Ala-Ser-Val-Ala-Trp-Pro-Glu-Glu-Gly-Leu-Thr-Arg-Val-Pro
β: Ala-Ala-Leu-Asp-Ile-His-Gln-Ala-Ile-Ala-Arg-Ala- (Gln)-(Ala) -Glu-Tyr-Val-Arg- (Arg / Ser) -Ile
(Amino acids enclosed in parentheses in the amino acid sequence table are likely to be identified as amino acids almost as a result of amino acid sequence analysis, but indicate portions that cannot be reliably identified due to the influence of impurities, etc.)
D. Partial amino acid sequence:
α1: (Lys) -Asp-Ser-Tyr-His-Ala-Ser-Ile-Leu-His-Leu-Phe-Phe-Thr-Thr-Phe-Gln-Leu-Asn-Arg
α2: (Lys) -Leu-Arg-Val-Ala-Thr-Leu-His-Gly-Leu-Val-Phe-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Asp-Val-Ala
(Amino acids enclosed in parentheses in the amino acid sequence table are likely to be identified as amino acids almost as a result of amino acid sequence analysis, but indicate portions that cannot be reliably identified due to the influence of impurities, etc.)
E. Isoelectric point:
The isoelectric point is 5.3.
F. Optimum pH and temperature:
The optimum pH is 7.4 to 8, and the optimum temperature is 20-30 ° C.
G. Substrate specificity:
Decomposes disodium terephthalate, 2,5-dicarboxypyridine.
H. Effects of metal ions and chelating reagents:
By adding 0.5 mM iron (II) chloride, the activity increases and is strongly inhibited by various metal ions other than divalent iron ions. It is also inhibited by various chelating agents.
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