JP4184697B2 - スクリーニング方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト脾臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩とリガンドであるコレステロール代謝関連物質とを用いるスクリーニング方法、マウス、ラット、ウシまたはウサギ由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのＤＮＡ、オーファンレセプターのリガンド決定方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプタータンパク質のうち多くは共役しているguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質あるいは７回膜貫通型レセプタータンパク質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプタータンパク質、特にはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプタータンパク質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプタータンパク質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプタータンパク質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプタータンパク質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプタータンパク質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質と生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標的ともなりうるＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を新規に見出し、その遺伝子（例えばｃＤＮＡ）をクローニングすることは、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の特異的リガンドや、アゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、Ｇタンパク質共役型レセプターはその全てが見出されているわけではなく、現時点でもなお、未知のＧタンパク質共役型レセプター、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数存在しており、新たなＧタンパク質共役型レセプターの探索および機能解明が切望されている。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガンドが見出されなくても、該レセプターの不活化実験（ノックアウト動物）から該レセプターの生理作用を解析することにより、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することも可能である。これら該レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇタンパク質共役型レセプターの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇタンパク質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプターに対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防および／または治療薬や診断薬に応用することもできる。
一方、従来のリガンド等の探索・決定方法では、例えば真核生物由来の細胞を用いて、レセプターに対する結合分子をスクリーニングする場合、従来は該レセプターを安定的に発現する、いわゆる安定細胞株（stable cell line）を樹立しなければならず、この細胞株の樹立には特別な細胞を必要とした。またスクリーニングには複数の測定の組合せが必要であり、試験化合物が複数存在すると、時間がかかるためにその実施が困難であった。つまり、従来のリガンド等の探索・決定方法には、（１）使用可能な細胞系が限定される、（２）該細胞系の樹立に時間がかかる、（３）複数の測定法を組み合わせるために、検体数が多くなるとその実施が困難になる等の問題があった。これらの問題を解決するための、各種の細胞系が使用でき、かつ短時間で測定等を実施できる方法の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、特別な細胞株を必要としないスクリーニング方法を見出した。さらに、ヒト脾臓由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のリガンドがコレステロール代謝関連物質であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［２］配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［３］配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［４］配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［５］配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［６］（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を含有することを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［７］上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるコレステロール代謝関連物質と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
［８］上記［７］記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
［９］上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［１０］上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［１１］哺乳動物に対して、上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［１２］哺乳動物に対して、上記［１］記載のスクリーニング方法または請求項６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法，
［１３］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストの使用、
［１４］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための、上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアンタゴニストの使用、
［１５］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する化合物またはその塩を含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［１６］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［１７］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［１８］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法、
［１９］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する化合物またはその塩の使用、
［２０］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその塩の使用、
［２１］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［２２］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［２３］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬、
［２４］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［２５］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬、
［２６］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［２７］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬、
［２８］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［２９］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［３０］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法、
［３１］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法、
［３２］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の使用、
［３３］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの使用、
［３４］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［３５］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドの使用、
［３６］配列番号：５、配列番号：７、配列番号１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列（但し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を除く）を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、
［３７］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
［３８］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または上記［３７］記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
［３９］ＤＮＡである上記［３８］記載のポリヌクレオチド、
［４０］配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を有する上記［３８］記載のポリヌクレオチド、
［４１］上記［３８］記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
［４２］上記［４１］記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
［４３］上記［４２］記載の形質転換体を培養し、上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめることを特徴とする上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の製造法、
［４４］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記［３７］記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
［４５］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記［４４］記載の抗体、
［４６］上記［４４］記載の抗体を含有してなる診断薬、
［４７］中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［４６］記載の診断薬、
［４８］上記［４４］記載の抗体を含有してなる医薬、
［４９］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤である上記［４８］記載の医薬、
［５０］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
［５１］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤である上記［５０］記載の医薬、
［５２］上記［３８］記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［５３］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤である上記［５２］記載の医薬、
［５４］上記［３８］記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断剤、
［５５］中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［５４］記載の診断薬、
［５６］上記［３８］記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、
［５７］上記［５６］記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［５８］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤である上記［５７］記載の医薬、
［５９］上記［５６］記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断剤、
［６０］中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［５９］記載の診断薬、
［６１］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する動物細胞に、試験化合物を添加し、レポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする該レセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法、
［６２］（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する動物細胞を培養し、試験化合物を添加してレポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする上記［６１］記載の方法、
［６３］レセプタータンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質である上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６４］Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質が、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質である上記［６３］記載の方法、
［６５］プロモーターがＴＡＴＡ様配列である上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６６］レポータータンパク質がルシフェラーゼである上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６７］プラスミドがｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質をコードする遺伝子を連結したものである上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６８］動物細胞が、リガンドが決定されていない２種類以上のレセプタータンパク質を発現している上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６９］細胞が抑制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉをコードする遺伝子を含有するプラスミドを含む上記［６１］または［６２］記載の方法、
［７０］さらにフォルスコリンを添加する上記［６１］または［６２］記載の方法、
［７１］２種類以上のレセプタータンパク質が類似の特徴を有することを特徴とする上記［６８］記載の方法、
［７２］類似の特徴がレポータータンパク質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量である上記［６８］記載の方法、
［７３］予め２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量を測定し、該レポータータンパク質の発現量が同程度である２種類以上のレセプタータンパク質を組み合わせて発現させることを特徴とする上記［６８］記載の方法等に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（以下、本発明のレセプタータンパク質と略記する場合がある）は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
本発明のレセプタータンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【０００８】
配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリーニング方法に従って測定することができる。
【０００９】
また、本発明のレセプタータンパク質としては、▲１▼配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
【００１０】
本明細書におけるレセプタータンパク質は、ペプチド表記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をはじめとする、本発明のレセプタータンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ^-)、アミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプタータンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のレセプタータンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のレセプタータンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質などが用いられる。
【００１１】
本発明のレセプタータンパク質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明のレセプタータンパク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するレセプタータンパク質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプタータンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１２】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ^-）であるが、上記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した本発明のレセプタータンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１３】
本発明のレセプタータンパク質またはその塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１４】
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１５】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００１６】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１７】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１８】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護、保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の手段から、また保護基は公知の基から、それぞれ適宜選択され、適用される。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００１９】
本発明のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, NewYork (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２０】
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプタータンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のレセプタータンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。
【００２１】
本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のレセプタータンパク質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
また配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】
本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＧタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＧタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’'端パリンドローム領域、および３’'端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２４】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、即ち対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２５】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸はまた公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００２６】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
【００２７】
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のレセプタータンパク質ペプチドと実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２８】
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド（以下、本発明のレセプタータンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のレセプタータンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のレセプタータンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２９】
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^TM−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造）、Ｍｕｔａｎ^TM−Ｋ（宝酒造）などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたレセプタータンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のレセプタータンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３０】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３１】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ^-、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
【００３２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。
【００３３】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３４】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）」が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３５】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめることができる。
【００３６】
上記培養物から本発明のレセプタータンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるレセプタータンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３７】
このようにして得られるレセプタータンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するレセプタータンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のレセプタータンパク質またはその塩の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３８】
以下に、本発明のスクリーニング方法について詳述する。
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法
特定のアミノ酸配列を含有する本発明のタンパク質（例えば、本発明のレセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある））を用いるか、または組換え型タンパク質等の発現系を構築し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いることによって、試験化合物（例えば、リガンドであるコレステロール代謝関連物質（例、胆汁酸（例、タウロリトコール酸、グリコリトコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、ノルデオキシコール酸、７−ケトリトコール酸、５β−プレグナン−３，２０−オン、コール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロケノデキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸）、エピアンドロステロン、（＋）−４−アンドロステン−３，１７−ジオン、シス−アンドロステロン、１１β−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコルチゾール、デヒドロイソアンドロステロン、３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オン、４−プレグネン−２０α−オール−３−オン、５α−デヒドロテストステロン、テストステロン、プロゲステロン、またはこれらの塩等））と本発明のタンパク質等との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような試験化合物には、（イ）あるタンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプター）を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニスト）、（ハ）生理活性物質（例えば、コレステロール代謝関連物質）と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）生理活性物質（例えば、コレステロール代謝関連物質）と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物などが含まれる（なお、上記（イ）の化合物は、後述のリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい）。
【００３９】
本発明では、（１）試験化合物１単独で結合活性を測定し、（２）さらに、試験化合物２について結合活性を測定し、（３）そして、（１）と（２）の結果を比較する。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、コレステロール代謝関連物質とを接触させた場合と（ｉｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、コレステロール代謝関連物質および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、該レセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質の結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
【００４０】
より具体的には、本発明は、
▲１▼標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したコレステロール代謝関連物質および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、標識したコレステロール代謝関連物質の該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したコレステロール代謝関連物質および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したコレステロール代謝関連物質の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したコレステロール代謝関連物質および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、標識したコレステロール代謝関連物質の該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００４１】
▲４▼本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質など）を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質など）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプタータンパク質等としては、上記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、本発明のレセプタータンパク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプタータンパク質等などが適している。
【００４２】
本発明のレセプタータンパク質等を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査は公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプタータンパク質等を含有するものとしては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプタータンパク質等を含有する細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００４４】
コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、例えば、適当なレセプタータンパク質画分と、標識したコレステロール代謝関連物質が必要である。
レセプタータンパク質画分としては、天然型のレセプタータンパク質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプタータンパク質画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したコレステロール代謝関連物質としては、標識したコレステロール代謝関連物質、標識したコレステロール代謝関連物質アナログ化合物などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたコレステロール代謝関連物質などが用いられる。
具体的には、コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプタータンパク質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したコレステロール代謝関連物質を添加し、同時に１０^-4Ｍ〜１０^-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のコレステロール代謝関連物質を加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００４５】
コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物スクリーニングする上記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、例えば、レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なレセプタータンパク質を発現した細胞が必要である。本発明のレセプタータンパク質等を発現した細胞としては、天然型の本発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、上記の組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４６】
コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のレセプタータンパク質等、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、または本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼Ｇタンパク質共役型レセプター標品
本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識コレステロール代謝関連物質
市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識したコレステロール代謝関連物質
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼コレステロール代謝関連物質標準液
コレステロール代謝関連物質を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４７】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識コレステロール代謝関連物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０^-3Ｍのコレステロール代謝関連物質を５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ₀ ：最大結合量
【００４８】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、リガンドであるコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｇタンパク質共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニスト）、（ハ）コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４９】
本発明のレセプタータンパク質等に対するアゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該コレステロール代謝関連物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプタータンパク質等に対するアンタゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性を抑制することができるので、該コレステロール代謝関連物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を増強させる化合物（例、アゴニスト）が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を減少させる化合物（例、アンタゴニスト）が有効である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬（組成物）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
例えば、該化合物またはその塩を、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、該化合物またはその塩は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５１】
さらに、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの定量法を以下に説明する。
本発明のレセプタータンパク質等は、コレステロール代謝関連物質（例、胆汁酸（例、タウロリトコール酸、グリコリトコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、ノルデオキシコール酸、７−ケトリトコール酸、５β−プレグナン−３，２０−オン、コール酸、コール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロケノデキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、エピアンドロステロン）、（＋）−４−アンドロステン−３，１７−ジオン、シス−アンドロステロン、１１β−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコルチゾール、デヒドロイソアンドロステロン、３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オン、４−プレグネン−２０α−オール−３−オン、５α−デヒドロテストステロン、テストステロン、プロゲステロン、またはこれらの塩等）に対して結合性を有しているので、生体内におけるコレステロール代謝関連物質濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、例えば、競合法と組み合わせることによって用いることができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータンパク質等と接触させることによって被検体中のコレステロール代謝関連物質濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の▲１▼または▲２▼などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
▲１▼入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
▲２▼入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）
【００５２】
本発明の、リガンドが未知のレセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法について詳述する。
本発明のリガンドの決定方法は、（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質を発現し、かつエンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞に、試験化合物を添加し、発現誘導されるレポータータンパク質の活性を測定する方法、（２）（ｉ）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（ｉｉ）エンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞を培養し、試験化合物を添加し、発現誘導されるレポータータンパク質の活性を測定する方法などである。
該レセプタータンパク質としては、例えばＧタンパク質共役型レセプタータンパク質などが用いられる。具体例としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質や、ＷＯ９６／０５３０２、ＥＰ−Ａ−７１１８３１、ＥＰ−Ａ−７８９０７６、ＥＰ−Ａ−１１０３５６３、ＥＰ−Ａ−１１０３５６２、特開平８−１５４６８２号公報、特開平８−２８３２９５号公報、特開平８−１９６２７８号公報、特開平８−２４５６９７号公報、特開平８−２６６２８０号公報、特開平９−５１７９５号公報、特開平９−１２１８６５号公報、特開平９−２３８８６８６号公報、特開平１０−１４６１９２号公報に記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質などが挙げられる。
レセプター発現プラスミドとしては真核生物由来の細胞で該レセプタータンパク質を発現させるためのプロモーター、原核生物で増殖させる場合の選択マーカーとして用いる薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）などを含有するプラスミドがあげられる。
エンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む（真核生物由来）細胞に、導入可能なプラスミドとしては、市販のプラスミドなどのいかなるプラスミドでもよい。公知の方法にて酵素活性を検出できるような酵素遺伝子を含むようなプラスミドが好ましく用いられる。
エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０、パピローマウイルス等のウイルス由来のエンハンサー、レトロウイルスのＬＴＲ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ｃＡＭＰ応答配列）（ＣＲＥ）等が用いられ、好ましくはｃＡＭＰレスポンスエレメントである。
プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子のＴＡＴＡ様プロモーター等が用いられ、好ましくはＴＡＴＡ様プロモーターである。
レポータータンパク質遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が用いられる。
かかるプラスミドの具体例としては、ｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質（例、ルシフェラーゼ遺伝子）をコードする遺伝子を連結したプラスミド、例えばｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）などが用いられる。
上記で用いられる細胞としては、真核生物由来の細胞が挙げられ、好ましくは、動物細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞など）などが用いられる。
該細胞は、２種以上（好ましくは２〜３種）のレセプタータンパク質を発現していてもよい。
２種類以上のレセプタータンパク質を発現させる場合は、類似の特徴を有する２種類以上のレセプタータンパク質を選択するのが良い。
類似の特徴としては、例えば、２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク質の発現量などが挙げられる。具体的には、２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた場合における▲１▼レポータータンパク質の基礎発現量および（または）▲２▼フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量を指標として、各レセプタータンパク質の特徴を区別することができる。
すなわち、リガンドが決定されていない２種類以上のレセプタータンパク質を発現させてリガンドを決定する場合、あらかじめレポータータンパク質の基礎発現量が低いもの、中程度のもの、明らかに高いものなどに区分けをしたり、あるいはフォルスコリン添加によってレポータータンパク質の発現量が上昇しにくいレセプタータンパク質を明らかにしておくことが望ましい。なぜならば、例えばレポータータンパク質の基礎発現量が高いレセプタータンパク質とレポータータンパク質の基礎発現量が低いレセプターの２種類のレセプタータンパク質を発現させた場合、後者にリガンドがヒットした場合にレポータータンパク質発現量の上昇が見えにくくなるからである。したがって、得られた情報をもとに、
（１）レポータータンパク質の基礎発現量が高いレセプタータンパク質と低いレセプタータンパク質の混合は避けるのが好ましい、
（２）フォルスコリン添加によるレポータータンパク質の発現量の上昇が顕著なレセプタータンパク質とそうでないレセプタータンパク質は混合しないほうが好ましい、
（３）レポータータンパク質の基礎発現量が同程度であるレセプタータンパク質同士を組み合わせて発現させるのが好ましい。
このように類似の特徴を有するレセプタータンパク質の組み合わせとしては、例えば、ＡＰＪ（アペリンレセプター；ジーン（Gene）、第１３６巻、第３５５頁（1993年））とＴＧＲ−１（特開２００２−０７８４９２号）との組み合わせが挙げられる。
【００５３】
リガンドの決定方法の具体例を以下に記載する。
細胞を９６ウェルプレートに播種し、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで一晩培養する。ここで、例えば市販のトランスフェクションキットを用いて、レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドを同時に細胞に導入し、細胞をさらに一晩培養することにより、細胞内でレセプタータンパク質を一過性に発現させる。細胞を洗浄し、さらに培地を無血清化した後、試験化合物を添加する。エンハンサーがＣＲＥである場合、試験化合物と同時にフォルスコリンを添加してもよい。一定時間インキュベーションを行った後、細胞を溶解し、レポータータンパク質の活性を測定する。
前記の決定方法において、ベースラインが高く、シグナルの検出が困難な場合には、該ベースラインを低下させる手段を講じるとよい。例えばレセプタータンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）の場合、Ｇタンパク質のサブユニットであるＧαタンパク質のうち、ｃＡＭＰ抑制効果を示すＧｉタンパク質を添加することにより、シグナル検出が容易となる。Ｇｉタンパク質はまたＧｉタンパク質をコードするＤＮＡを発現するプラスミドとして、レセプタータンパク質プラスミドおよびレポータープラスミドと共に細胞に導入することができる。この場合、３種のプラスミド（レセプタープラスミド：レポータープラスミド：Ｇｉプラスミド）の混合比は、５〜１５：１：１〜６程度が好ましく、さらには７：１：３程度であるのが好ましい。
【００５４】
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００５５】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプタータンパク質等は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００５６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００５７】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００５８】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（レセプタータンパク質等の抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５９】
本発明の配列番号：５、配列番号：７、配列番号１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列（但し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を除く）を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、その部分ペプチドまたはその塩、および該レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは新規物質であり、（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤、（２）遺伝子診断剤、（３）本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（４）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの定量法、（５）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（６）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、（７）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（８）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体による中和、（９）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを有する非ヒト動物の作出などに用いることができる。
本発明のレセプタータンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある）、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）および本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）の用途について、以下に具体的に説明する。
【００６０】
（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドが有する作用に応じて、▲１▼本発明のレセプタータンパク質または▲２▼該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内において本発明のレセプタータンパク質が減少しているためにリガンドの生理作用が期待できない（該レセプタータンパク質の欠乏症）患者がいる場合に、▲１▼本発明のレセプタータンパク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量を補充したり、▲２▼（イ）本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるレセプタータンパク質の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として有用である。
本発明のレセプタータンパク質は、例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を増強させる化合物（例、アゴニスト）が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を減少させる化合物（例、アンタゴニスト）が有効である。
本発明のレセプタータンパク質を上記予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）を上記予防および／または治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、▲１▼本発明のレセプタータンパク質または▲２▼該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、▲１▼本発明のレセプタータンパク質または▲２▼該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６１】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００６２】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のレセプタータンパク質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６３】
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６４】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。より具体的には、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患(例えば、アレルギー、喘息、リュウマチなど)、循環器疾患(例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等)、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、肥満などの疾患の遺伝子診断診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
【００６５】
（３）本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患、例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現を促進する化合物が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現を阻害する化合物が有効である。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００６７】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】
（４）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの定量法
本発明のレセプタータンパク質等は、リガンドに対して結合性を有しているので、生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、例えば、競合法と組み合わせることによって用いることができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータンパク質等と接触させることによって被検体中のリガンド濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の▲１▼または▲２▼などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
▲１▼入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
▲２▼入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）
【００６９】
（５）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従って、本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００７０】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７１】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７２】
（６）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化レセプタータンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化レセプタータンパク質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法を提供する。
上記（ii）においては、一方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
【００７３】
本発明のレセプタータンパク質等に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のレセプタータンパク質等の測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、レセプタータンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００７４】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のレセプタータンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるレセプタータンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプタータンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、レセプタータンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００７５】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ)と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００７６】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(PartC))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のレセプタータンパク質またその塩を定量することによって、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のレセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセプタータンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のレセプタータンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００７７】
（７）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患、例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現量を促進する化合物が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現を阻害する化合物が有効である。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００７８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７９】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８０】
（８）本発明のレセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による中和
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の、それらレセプタータンパク質などに対する中和活性とは、すなわち、該レセプタータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該レセプタータンパク質の関与するシグナル伝達、例えば、該レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不活性化することができる。したがって、該レセプタータンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予防および／または治療に用いることができる。
【００８１】
（９）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを有する動物の作出
本発明のＤＮＡを用いて、本発明のレセプタータンパク質等を発現するトランスジェニック動物を作出することができる。動物としては、非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）など（以下、動物と略記する場合がある）が挙げれるが、特に、マウス、ウサギなどが好適である。
本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のレセプタータンパク質等を高産生するＤＮＡ導入動物を作出できる。このプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
【００８２】
受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明のレセプタータンパク質等が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有する。
本発明のＤＮＡ導入動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明のＤＮＡが導入された動物は、本発明のレセプタータンパク質等が高発現させられているので、本発明のレセプタータンパク質等に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。
本発明のＤＮＡ導入動物を、組織培養のための細胞源として使用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ導入マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータンパク質が存在する組織を分析することにより、本発明のレセプタータンパク質等について分析することができる。本発明のレセプタータンパク質等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。また、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、本発明のレセプタータンパク質等を単離精製することも可能である。
【００８３】
（１０）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００８４】
本発明の「ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞」とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００８５】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ₁マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ₁）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ₁マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【００８６】
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０⁶個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００８７】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【００８８】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチドの細胞生物学的検討において有用である。
【００８９】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
【００９０】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
【００９１】
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００９２】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００９３】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００９４】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃｌ₂Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００９５】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
本発明で用いられるヒト由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
本発明で用いられるヒト由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：４
以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：５
本発明のマウス心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｍＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６
本発明のマウス心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｍＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：７
本発明のラット心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｒＴＧＲ５アミノ酸配列を示す。
配列番号：８
本発明のラット心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｒＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：９
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：１０
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：１１
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー３の塩基配列を示す。
配列番号：１２
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー４の塩基配列を示す。
配列番号：１３
ウシ型ＴＧＲ５のＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１４
ウシ型ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１５
ウサギ型ＴＧＲ５のＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１６
ウサギ型ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１７
以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用したｂＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１８
以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用したｂＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１９
以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したｒａｂｂｉｔＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２０
以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したｒａｂｂｉｔＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２１
以下の実施例１１におけるＩＬ−１α ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２２
以下の実施例１１におけるＩＬ−１αｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２３
以下の実施例１１におけるＩＬ−１αｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：２４
以下の実施例１１におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２５
以下の実施例１１におけるＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２６
以下の実施例１１におけるＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：２７
以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２８
以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２９
以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：３０
以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３１
以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３２
以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：３３
以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３４
以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３５
以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：３６
ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３７
ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３８
ＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３９
ＧＰＲ７をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：４０
参考例４でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
配列番号：４１
参考例４でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
配列番号：４２
参考例２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４３
参考例２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９６】
以下の参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＣＲ４−ｈＴＧＲ５は、平成１２（２０００）年４月３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１４として、平成１２（２０００）年３月２３日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６４１０として寄託されている。
以下の実施例５で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ−ｒＴＧＲ５は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７７として、平成１４（２００２）年１月１０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４５として寄託されている。
以下の実施例５で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ５は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７８として、平成１４（２００２）年１月１０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４６として寄託されている。
以下の実施例６で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＴＧＲ５−１は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７９として、平成１４（２００２）年１月１７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４７として寄託されている。
以下の実施例７で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＴＡｒａｂｂｉｔＴＧＲ５−１は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８８０として、平成１４（２００２）年１月１７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４８として寄託されている。
後述の参考例４で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４０として、２００１年６月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６６４４として寄託されている。
【００９７】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【００９８】
参考例１ ヒト脾臓のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clontech）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：３）およびプライマー２（配列番号：４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡを１／１０量鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Clontech）１／５０量、プライマー１（配列番号：３）およびプライマー２（配列番号：４）を各０.５μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および酵素に添付のバッファーを１／５量、ＧＣ Ｍｅｌｔを１／５量加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・５分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・２分のサイクルを３０回繰り返し、最後に６８℃・５分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ４（Invitrogen）へサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を得た。このｃＤＮＡにより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴＧＲ５と命名した。また配列番号：２で表わされるＤＮＡを含有する形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＣＲ４−ｈＴＧＲ５と命名した。
【００９９】
実施例１ ＴＧＲ５を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞における、コレステロール代謝関連物質による活性の検出
コレステロール代謝関連物質によるＴＧＲ５特異的な刺激活性の検出は、ＣＲＥプロモーターの発現誘導によって産生されるレポーター遺伝子産物（ルシフェラーゼ）の発現量を指標に行った。
ＨＥＫ２９３細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（GibcoBRL）に１０％ウシ胎児血清（GibcoBRL）を添加したもの）に懸濁し、１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にてコラーゲンでコートされたＢｌａｃｋ ｗｅｌｌ ９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）にまいた。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した後、レポーター遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Clontech）と同時に、公知の方法により動物細胞での発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251-259, 1994記載のｐＡＫＫＯ−１．１１１Ｈと同一のプラスミドベクター）にＴＧＲ５遺伝子を挿入して作製した発現ベクタープラスミド、または、ＴＧＲ５遺伝子を含まないもとのｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを用いて細胞のトランスフェクションを以下のとおりに行った。
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ（GibcoBRL）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（GibcoBRL）を２４：１にて混合することにより、リポフェクトアミン希釈液を調製した。また、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ、ＴＧＲ５発現ベクタープラスミドまたはもとのベクタープラスミド（２４０ｎｇ／μｌ）およびｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（２４０ｎｇ／μｌ）を２４：０．９：０．１にて混合することによりＤＮＡ希釈液を調製した。リポフェクトアミン希釈液とＤＮＡ希釈液を等量混合し、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた後、上記のＨＥＫ２９３細胞を培養したプレートに２５μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をアッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミンを添加したもの）にて洗浄した後、アッセイ用培地にて希釈したリトコール酸（和光純薬）およびプロゲステロン（和光純薬）を２×１０^-5Ｍとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４時間培養した。培養上清を捨てて、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ製造株式会社）を５０μｌ添加し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Wallac社）を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。
その結果、配列番号：２で表される塩基配列を有するＴＧＲ５遺伝子を導入したＨＥＫ２９３細胞特異的に、リトコール酸、プロゲステロンによるルシフェラーゼ活性の上昇が認められた（図６）。
【０１００】
実施例２ Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドの宿主細胞への導入
公知の方法によって作製した各種Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｃＤＮＡ、すなわち甲状腺ホルモン刺激因子レセプター（ＴＲＨＲ）、ニューロメジンＵレセプター（ＦＭ−３およびＴＧＲ−１）、プロラクチン放出因子レセプター（ｈＧＲ３）、アペリンレセプター（ＡＰＪ）などを挿入した動物細胞用発現プラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロニーを単離・培養後、QIAGEN Plasmid Maxi Kit（キアゲン）を用いてプラスミドの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Clontech）のレポータープラスミドを同様にして調製した。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドを導入する宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞をコラーゲンタイプＩでコートした96-well黒色プレート（ベクトンディッキンソン社）に100,000 cells/well、培養液量１００μｌで播種し、一晩培養した。同じくＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞をpAKKO-111Hで形質転換したＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞をコスター社の９６−ｗｅｌｌ黒色プレートに40,000 cells/well、培養液量１００μｌで播種し、一晩培養した。いずれの細胞についても、プレートで培養するための培地はＤＭＥＭ（GibcoBRL社）に１０％のウシ胎児血清のみを添加したものを用いた。
各プラスミドを２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現プラスミド９μｌとレポータープラスミド１μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-I（GibcoBRL社）に添加した。これを、同じく２４０μｌのOpti-MEM-Iに１０μｌのリポフェクトアミン2000（GibcoBRL社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドの複合体を形成させた。また、効率的なスクリーニングの実施のためには、２４０ｎｇ／μｌの濃度で３種類のレセプター発現プラスミドを５μｌずつ添加し、他の試薬の比率は前出と同じものを調製した。これらを２５μｌ／ｗｅｌｌずつＨＥＫ２９３あるいはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞の培養液に添加し、３７℃で一晩培養してプラスミドの導入を行った。ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞については、プラスミド添加後４時間以降に培養液をアッセイバッファー（０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換し、無血清化をおこなった。
【０１０１】
実施例３ レポーターアッセイによるリガンド活性の検出
ＨＥＫ２９３細胞についてはアッセイの１時間前に培養液を実施例２に記載のアッセイバッファーに交換し、プレインキュベーションを行なった。アッセイバッファーにリガンドあるいはリガンド候補化合物を溶解したものを用意し、実施例２で準備したＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞に添加した。また、アッセイバッファーに終濃度２μＭのフォルスコリンを添加した条件でのアッセイも同様にして実施した。サンプルを添加後に４時間のインキュベーションを行ない、レセプターを介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、ピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）発光基質を５０μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する発光量を実施例１記載のプレートリーダーにて測定した。
実施例２および３に記載の方法に従って各種のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを用い、ＨＥＫ２９３細胞においてリガンド刺激によるレポーター遺伝子の発現誘導を測定した。レセプターを介して細胞内へシグナルを伝達するＧタンパク質αサブユニットの種類としてＧｓに共役するＣＲＦＲについては、フォルスコリン非添加、添加のいずれの条件においてもリガンド添加によるレポーター遺伝子の活性化が検出された。また、抑制性であるＧαｉに共役するＡＰＪについては、フォルスコリン添加条件において、リガンド添加によるレポーター遺伝子発現の抑制が検出された。また、Ｇｑに共役するレセプターＴＲＨＲ、ＦＭ−３、ＴＧＲ−１については、フォルスコリン添加条件においてレポーター遺伝子の発現の促進が検出された。ＧｑおよびＧｉの両方に共役するレセプターｈＧＲ３についても、同様にフォルスコリン添加条件においてレポーター遺伝子の発現の促進が検出された（図７）。
【０１０２】
実施例４ 抑制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉ発現プラスミドを用いたレポーターアッセイ
実施例２に示したＧタンパク質レセプター発現プラスミドと同様の方法によって抑制性Ｇタンパク質αサブユニット(Ｇｉ)プラスミドを作製、調製した（ここで、Ｇｉついては、動物種を問わない）。これを３μｌ、レセプター発現プラスミドを７μｌ、レポータープラスミドを１μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-Iに添加し、その他の条件は実施例２と同様の方法でＨＥＫ２９３あるいはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞にＤＮＡを導入した。これら３種のプラスミドの混合比は全体の量を１１μｌとした場合、Ｇｉが１から６、好ましくは１から３が適当である。これらを実施例３の方法に従ってアッセイを行いリガンド活性を検出した。
すなわち、Ｇｉを用いたＴＧＲ５のリトコール酸に対する反応を検出した結果、ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞を用いたＧタンパク質レセプターＴＧＲ５のアッセイにおいて、ＧｉをＴＧＲ５と同時に発現させることにより、リガンド非添加時（リガンド（−））のルシフェラーゼ活性を大幅に低下させることができ、その結果リガンド（リトコール酸、２×１０^-5Ｍ、リガンド（＋））による活性の上昇を検出することが可能となった（図８）。
【０１０３】
実施例５ マウスおよびラット型ＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
配列番号：９で表されるオリゴＤＮＡをセンス鎖プライマー１として、配列番号：１０で表されるオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマー２として、各々０．４μＭ、GC2 DNA Polymerase（CLONTECH社製）０．３μｌ、5x Buffer 6μｌ、GC-Melt 6μｌ、dNTP (TaKaRa社製)0.2 mM、鋳型ＤＮＡとしてMarathon-Ready Mouse cDNA library (CLONTECH社製)の心臓ｃＤＮＡ溶液３μｌ、滅菌水９．９μｌからなる混合液３０μｌを調製し、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）を用いて、最初に９４℃で２０秒間置いた後、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして３５サイクル、最後に６８℃で７分伸長反応させるタッチダウンＰＣＲのプログラムでＰＣＲ反応を行った。次に、反応終了液の一部をエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、ＵＶ照射のもと分子量マーカー換算で１ｋｂ付近の位置にＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡに対応するバンドを確認した。次に塩基配列を決定する為にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）を用いてＴＡクローニングし、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中から外来ＤＮＡ断片が挿入されていたプラスミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより選択し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するためにABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いたシーケンス反応を製品添付資料の条件にしたがって、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）で行った後、該反応試料をＤＮＡシーケンサーABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)で分析した。
その結果、ＰＣＲ産物から配列番号：６で表される９９０塩基の塩基配列からなり、配列番号：５で表される新規の３２９個のアミノ酸、すなわちＴＧＲ５に相同性のある構造遺伝子配列を決定できた。配列番号：５を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をｍＴＧＲ５と命名した。さらに、この形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ５と命名した。
配列番号：１１で表されるオリゴＤＮＡをセンス鎖プライマー３として、配列番号：１２で表されるオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマー４として、各々0.4 μＭ、Advantage2 DNA Polymerase (CLONTECH社製)0.3μｌ、10x Buffer 3μｌ、dNTP (TaKaRa社製)0.2 ｍＭ、鋳型ＤＮＡとしてMarathon-Ready Rat cDNAlibrary (CLONTECH社製)の心臓ｃＤＮＡ溶液3μｌ、滅菌水18.9μｌからなる混合液30μｌを調製し、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）を用いて、最初に９４℃で２０秒間置いた後、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして３５サイクル、最後に６８℃で７分伸長反応させるタッチダウンＰＣＲのプログラムでＰＣＲ反応を行った。次に、反応終了液の一部をエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、ＵＶ照射のもと分子量マーカー換算で１ｋｂ付近の位置にＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡに対応するバンドを確認した。次に塩基配列を決定する為にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）を用いてＴＡクローニングし、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中から外来ＤＮＡ断片が挿入されていたプラスミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより選択し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するためにABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いたシーケンス反応を製品添付資料の条件にしたがって、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）で行った後、該反応試料をＤＮＡシーケンサーABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)で分析した。
その結果、ＰＣＲ産物から配列番号：８で表される９９０塩基の塩基配列からなり、配列番号：７で表される新規の３２９個のアミノ酸、すなわちＴＧＲ５に相同性のある構造遺伝子配列を決定できた。配列番号：７を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をrＴＧＲ５と命名した。
次に、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに挿入したＤＮＡ断片を、プライマー３、プライマー４に付加された制限酵素ＳａｌＩ、ＳｐｅＩサイトで酵素消化し、切り出されたｒＴＧＲ５の配列を持つＤＮＡ断片を、発現プラスミドｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ（Hinuma, S., Hosoya, M., Ogi., Tanaka, H., Nagai, Y., and Onda, H.（1994）Biochim. Biophys. Acta 1129, 251-259）のＳａｌＩ、ＳｐｅＩサイトに挿入し、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中からｒＴＧＲ５断片が挿入されていたプラスミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより選択した。さらに、この形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ−ｒＴＧＲ５と命名した。
【０１０４】
実施例６ ウシ脾臓ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定の取得
ウシ脾臓ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１７で表されるプライマーｂＦおよび配列番号：１８で表されるプライマーｂＲを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ ｂＦ（１０μＭ）、０．５μｌ ｂＲ（１０μＭ）、２．５μｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５μｌ Advantage2 DNA polymerase（クローンテック社）、１７．５μｌ蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液を、Thermal Cycler9600（ＡＢＩ社）を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃２分の変性の後、９８℃１０秒、６３℃２０秒、７２℃６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約１０００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQiagen PCR purification Kit（キアゲン社）を用いて精製し、直接配列決定を行ったところ配列番号：１３の配列が得られた。配列番号：１３のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAbTGR5-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAbTGR5-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型ＴＧＲ５遺伝子であることを確認した。
【０１０５】
実施例７ ウサギ脾臓ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定の取得
ウサギ脾臓ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１９で表されるプライマーｒａｂｂｉｔＦおよび配列番号：２０で表されるプライマーｒａｂｂｉｔＲを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ ｒａｂｂｉｔＦ（１０μＭ）、０．５μｌ ｒａｂｂｉｔＲ（１０μＭ）、２．５μｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５μｌ Advantage2 DNA polymerase（クローンテック社）、１７．５μｌ蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液を、ThermalCycler9600（ＡＢＩ社）を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃２分の変性の後、９８℃１０秒、６３℃２０秒、７２℃６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約１０００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQiagen PCR purification Kit（キアゲン社）を用いて精製し、直接配列決定を行ったところ配列番号：１５で表される塩基配列がえられた。配列番号：１５で表されるＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：１６で示す。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTArabbitTGR5-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTArabbitTGR5-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウサギ型ＴＧＲ５遺伝子であることを確認した。
【０１０６】
実施例８ ヒト、ウサギ、ウシ、マウスおよびラット型ＴＧＲ５の胆汁酸刺激によるレポーター遺伝子の発現量上昇の検出
実施例１に示したのと同様の方法により、動物細胞での発現用ベクターpAKKO-111Hに、実施例５に示したマウスおよびラット型ＴＧＲ５遺伝子、実施例６に示したウシ型ＴＧＲ５遺伝子、および実施例７に示したウサギ型ＴＧＲ５遺伝子を挿入してそれぞれの遺伝子の発現ベクターを作製した。これらとインサートが挿入されていない元の発現ベクターおよび実施例１に示したヒト型ＴＧＲ５発現ベクターを実施例４に示した方法に従い、抑制性Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇｉ）、レポータープラスミドとともにＣＨＯ−Ｍｏｃｋ細胞に一過性に発現させた。これを実施例３の方法に従い胆汁酸の刺激によるレポータ遺伝子の発現量を検出した。胆汁酸としてはタウロリトコール酸（ＴＣＬＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、をそれぞれ１０μＭで使用した。またレポーター遺伝子発現のポジティブコントロールとしてはフォルスコリン（ＦＳＫ、２μＭ）を用いた。その結果いずれの動物種由来のＴＧＲ５を発現させても、胆汁酸添加区で胆汁酸を添加しない区（Ｂａｓｅ）より高いルシフェラーゼ活性が検出された（図９）。このことからヒト型ＴＧＲ５と同様にウサギ、ウシ、マウスおよびラット型ＴＧＲ５も胆汁酸のレセプターとして作用することが示された。
【０１０７】
実施例９ ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性に対するタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）の抑制作用
ウサギ（ＮＺＷ、メス、体重２．５−３．０ｋｇ前後）から麻酔下にて血清および肺を採取した。ＰＢＳ（phosphate-buffered saline）を気管より注入して洗浄することにより、肺内の肺胞マクロファージ細胞を含む懸濁液を回収した。得られた細胞をさらにＰＢＳで洗浄後、培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したもの。いずれもGibcoBRL社）に懸濁し、単核細胞分離液であるＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（アマシャムファルマシア社）上に重層・遠心処理し、赤血球を除いた。単核細胞を培地にて洗浄後、０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに播種し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。培地を除き、ＴＬＣＡ１００μＭを加えた培地、あるいはコントロールの培地を０．５ｍｌ添加して、さらに１６時間培養した。同じウサギより採取した血清５０μｌ、加熱により殺菌処理した酵母懸濁液０．８×１０⁸／ｍｌを３０μｌ添加し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４０分間培養した。０．１％フクシン液（和光純薬社）を６０μｌ添加した後、細胞をはがして遠心し、懸濁液を顕微鏡にて観察した。フクシンにより酵母は染色されるが肺胞マクロファージにより貪食された酵母は染色されないことを利用して、貪食活性を示したマクロファージの算定を行った。その結果、図１０に示すとおり、ＴＬＣＡを添加した場合において、マクロファージの免疫機能のひとつである貪食活性の著明な低下が認められた。
【０１０８】
実施例１０ ウサギ肺胞マクロファージにおける、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌に対するＴＬＣＡの抑制効果
実施例９の方法で採取したウサギ肺胞マクロファージを０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈し２４ウェルプレートで一晩培養後、ＬＰＳ刺激で誘導されるＴＮＦα分泌に対する影響を検討した。ＴＬＣＡ５０μＭを含む培地あるいはコントロール培地０．５ｍｌに交換して１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコントロール培地にＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ 和光純薬）を加えたもの（添加時の濃度１ｎｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下でさらに１２時間培養した。培養後、上清を回収し、ＴＮＦ感受性細胞株Ｌ９２９（理化学研究所）に対する増殖抑制作用を指標にＴＮＦα量を測定した。Ｌ９２９細胞を１．２×１０⁴／ｗｅｌｌにて９６ウェルプレートに播種し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養後、肺胞マクロファージ培養上清を適当に希釈し、２μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ（和光純薬社）存在下で一晩培養した。標準サンプルとしてはヒト組み換え型ＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を使用した。Ｌ９２９細胞の増殖はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（和光純薬社）によって測定した。その結果、図１１に示すように、ＴＬＣＡを添加することにより、顕著なＴＮＦα分泌量の低下が認められた。
【０１０９】
実施例１１ ウサギ肺胞マクロファージの各種サイトカインｍＲＮＡ発現量に対するタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）の抑制作用
実施例９の方法で採取したウサギ肺胞マクロファージを０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈し６ウェルプレートで一晩培養後、ＴＬＣＡ１００μＭを含む培地あるいはコントロール培地１．５ｍｌに交換して１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコントロール培地にＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４、和光純薬社）を加えたもの（添加時の濃度１ｎｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下でさらに２時間培養した。培地を除去後、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）３ｍｌを加え、マニュアルにしたがい全ＲＮＡを調製した。１μｇの全ＲＮＡを、SuperScriptII逆転写酵素（Gibco BRL社）を用いてマニュアルに従いｃＤＮＡを合成し、２５ｎｇ 全ＲＮＡ／μｌに相当するｃＤＮＡ溶液を調製した。各種サイトカインのｍＲＮＡ発現量定量はABI prism 7700 Sequence Detector（ABI社）を用いて行った。各反応には配列番号：２１から３５で表されるそれぞれのサイトカインに特異的なプライマー、プローブを設計し使用した。ＰＣＲ反応液はUniversal PCR master mix（ABI社）１２．５μｌ、それぞれのプライマーを各々１００μＭのものを０．２２５μｌずつ、５μＭのプローブを１．２５μｌ、上記で調製したｃＤＮＡ溶液１μｌを加え、全量を蒸留水で２５μｌとした。それぞれのサンプルは５０℃で２分間、９５℃で１０分間置いた後、９５℃で１５秒、６０℃で１分のサイクルを４０回繰り返し定量のための反応を行った。その結果、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８のいずれのサイトカインにおいてもＴＬＣＡの添加により明らかに発現量が低下し、ウサギ肺胞マクロファージに対するＴＬＣＡによる各種のサイトカインのｍＲＮＡ発現抑制作用が見出された（図１２）。
【０１１０】
実施例１２ ＴＧＲ５遺伝子導入ＴＨＰ−１細胞の作製
ヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ−１にＴＧＲ５遺伝子を導入することによりＴＧＲ５高発現細胞を樹立した。まず、定法に従いヒトＴＧＲ５のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen社）に組み込んだｐｃＤＮＡ−ＴＧＲ５を作製した。ＴＨＰ−１を培地（ＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳ）にて培養し、定法に従い、リポフェクトアミン（GibcoBRL社）を用いてｐｃＤＮＡ−ＴＧＲ５を導入した。その後、Ｇ４１８（GibcoBRL社）を培地に添加して耐性株を選択し、安定的にＴＧＲ５を高発現する細胞株、ＴＨＰ−ＴＧＲ５を樹立した。
【０１１１】
実施例１３ ＴＨＰ−ＴＧＲ５における、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌およびｍＲＮＡ発現量に対するＴＬＣＡの抑制効果実施例１２で得たＴＨＰ−ＴＧＲ５あるいはもとのＴＨＰ−１細胞を０．５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈して１０^-8Ｍのホルボールエステル（和光純薬）存在下で２４ウェルプレートで一晩培養後、ＬＰＳ刺激で誘導されるＴＮＦα分泌に対する影響を検討した。ＴＬＣＡ１００μＭを加えた培地あるいはコントロール培地０．５ｍｌにて１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコントロール培地にＬＰＳを加えたもの（添加時の濃度５０ｎｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養した。培養後、上清を回収し、実施例１０と同じようにＴＮＦα含量をＬ９２９の増殖抑制活性により定量した。またＴＨＰ−１とＴＨＰ−ＴＧＲ５の全ＲＮＡはＬＰＳ添加の２時間後に細胞から実施例１１と同様の方法で調製した。ヒト型ＴＮＦα ｍＲＮＡの発現量はTaqMan Cytokine Gene Expression plate I（ＡＢＩ社）を使用して求めた。定量値はＴＨＰ−１細胞のＬＰＳ、ＴＬＣＡをともに添加しなかった区値を１とした時の相対値で示した。その結果、図１３に示すように、ＴＨＰ−ＴＧＲ５ではＴＬＣＡ添加により顕著なＴＮＦα分泌量の低下が認められた、一方、もとのＴＨＰ−１では顕著なＴＮＦα分泌抑制作用は見られなかった。またｍＲＮＡも同様にＴＬＣＡ添加による顕著な発現量の低下が認められた。これらのことから、ウサギ肺胞マクロファージで認められたＴＮＦα分泌抑制効果は明らかにＴＧＲ５を介したものであることが確認され、生体内においてＴＧＲ５がこうした免疫機能の制御に関わることが示された。
【０１１２】
実施例１４ ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質のタウロリトコール酸添加による細胞内移行
ＴＧＲ５のＣ末端に翻訳のフレーム合わせてオワンクラゲより単離されたGreen Fluorescent Protein（ＧＦＰ）ｃＤＮＡをつないだ融合タンパク質を発現させるための発現プラスミドを構築した。その際ＧＦＰ ｃＤＮＡにはＧＦＰの発現ベクターｐＱＢＩ２５（宝酒造）から切り出した断片を用いた。ＴＧＲ５はＰＣＲ法によりその終止コドンを制限酵素ＮｈｅＩの認識配列に修正し、ここにＧＦＰ断片を連結して、実施例１に記載の発現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入した。このようにして得たＴＧＲ５とＧＦＰの融合タンパク質（以下、ＴＧＲ５-ＧＦＰ）発現ベクターのプラスミド を以下の方法でＣＨＯ-ｍｏｃｋ細胞にトランスフェクションした。ＣＨＯ-ｍｏｃｋ細胞は増殖培地［ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）に１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を添加したもの］に懸濁し、０．６×１０⁵ｃｅｌｌｓ／チャンバーの濃度にてチェンバー数４つのＬａｂ−ＴｅｋIIカバーグラスチェンバー（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ社）にまき、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した後にトランスフェクションした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（GIBCO BRL社）を用いた。まずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ−I（GIBCO BRL社）５０μｌを混合し、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた後、上記のＣＨＯ細胞を培養したチェンバーに１００μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。培地を共焦点顕微鏡観察用培地［Ｈａｎｋｓ' Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）に０．１％ウシ アルブミン（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を懸濁したもの］に置き換え、共焦点顕微鏡（ライカ社）でＧＦＰの蛍光像を観察した。その際、ＧＦＰの励起は４８８ｎｍで行った。
その結果ＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質は細胞膜に観察された（図１４）。この細胞にタウロリトコール酸を１０^-5Ｍとなるように培地に添加３０分後には、ＧＦＰの蛍光が細胞膜ではなく、細胞質に移動していることが見出された（図１５）。このことはＴＧＲ５が細胞膜に発現するＧタンパク質共役型のレセプターであるとともに、ＴＧＲ５がタウロリトコール酸に反応して細胞質へ移行、すなわちインタナリゼーションしたことを示していた。
【０１１３】
実施例１５ タウロリトコール酸添加によるＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞でのＭＡＰキナーゼ活性化
実施例１で作製したＴＧＲ５発現ベクターを用いて公知の方法で作製した安定的なＴＧＲ５発現ＣＨＯ（ＣＨＯ−ＴＧＲ５）またはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞を３×１０⁵／ｗｅｌｌの濃度で６ウェルプレートに撒いて、血清低濃度培地（核酸不含ＭＥＭα培地に０．５％の透析ウシ胎児血清を添加したもの）にて一晩培養し、さらに無血清培地（核酸不含ＭＥＭα培地に０．１％ウシ血清アルブミンを添加したもの）に交換して一晩培養した。新しい無血清培地に交換して３時間培養後、２μＭのタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）を添加した。０−２０分インキュベーションしたのち、サンプルバッファー（TEFCO社）で細胞を溶解・抽出しＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離を行った。その後PhosphoPlus p44/42 MAP kinase（Thr202/Tyr204）Antibody Kit（Cell Signaling Technology, Inc）を用いたウエスタンブロッテイングを行った。その結果、図１６に示す通り、ＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞でのみ、ＴＬＣＡ添加後５分をピークにＭＡＰキナーゼのリン酸化によって示される当該タンパク質の活性化が起こることが分かった。
【０１１４】
実施例１６ ＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞における各種胆汁酸のｃＡＭＰ産生上昇活性
ＣＨＯ−ＴＧＲ５を２×１０⁴／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに撒いて一晩培養後、ｃＡＭＰ産生量の測定に用いた。アッセイ用バッファー（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミン、0.2mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMXを添加したもの）で細胞を２回洗浄し、３０分プレインキュベーションした。細胞を２回洗浄した後、アッセイ用バッファーに希釈したサンプルを細胞に添加して２０分間インキュベーションした。培養上清を捨てて、cAMP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を測定した。ポジティブコントロールとして、リトコール酸（ＬＣＡ）１０μＭを用いた。ｃＡＭＰ産生量はポジティブコントロールを１００％とした場合の％値で表した。その結果、図１７に示す通りタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、コール酸（ＣＡ）の順で濃度依存的なｃＡＭＰ産生の上昇が観察された。また、２μＭの濃度でその他の胆汁酸やコレステロール代謝化合物などによるＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるｃＡＭＰ産生上昇活性を比較し、その結果を図１８に示した。ＬＣＡ、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡのそれぞれにおいて、タウリン抱合体（Ｔ）、グリシン抱合体（Ｇ）、非抱合体（Ｆ）のいずれもｃＡＭＰ産生上昇活性を有することが分かった。
【０１１５】
実施例１７ ヒトＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布解析
ｍＲＮＡの発現量の定量にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。発現量の定量に用いるプライマーとプローブは、ヒト型ＴＧＲ５の塩基配列（配列番号：２）をもとにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ専用のソフトウエアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社）を利用してデザインした。鋳型となるｃＤＮＡは、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）１μｇからランダムプライマーを用いて４２℃で合成した。逆転写反応にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って反応を行い、反応終了後エタノール沈殿して１００μｌに溶解した。また分画したヒト血球由来のｃＤＮＡとしてはＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＹＴＣ^TM）ｐａｎｅｌｓ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ (クロンテック社)を使用した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒの反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）のマニュアルにしたがい、マスターミックスを１２．５μｌ、プライマーを０．９μＭ、プローブを０．２５μＭ、各サンプルのｃＤＮＡ溶液を１μｌで混ぜ合わせ、蒸留水で２５μlとして調製した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒでの反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、９５℃ １５秒、６０℃ １分のサイクルを４０回繰り返して行った。
ヒト各種組織でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現分布を図１９に示す。胎盤、脾臓、肺など免疫に関与する組織での高発現が見出された。またヒト血球でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現量を図２０に示す。ＣＤ１４を発現している血球、すなわち単球・マクロファージでの高発現が見出された。
【０１１６】
実施例１８ ウサギＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布解析
実施例１７と同様の方法でウサギ型ＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現量を求めた。用いたプライマーとプローブはウサギＴＧＲ５（配列番号：１５）をもとにデザインした。ウサギの各種組織由来の全ＲＮＡは、北山ラベス社より購入したＮＺＷ雌性 体重２．５−３．０ｋｇ前後の個体より各組織を取得し、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）を用い、付属のマニュアルにしたがって調製した。ｃＤＮＡは調製した全ＲＮＡ １μｇから実施例１７と同様の方法で合成した。ただし逆転写反応後は４０μｌに溶解した。
ウサギ型ＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現は図２１に示したように、免疫に関与する脾臓、肺胞マクロファージや胸腺で高発現していた。
【０１１７】
実施例１９ ＴＬＣＡによるウサギ肺胞マクロファージのｃＡＭＰ産生上昇
実施例９の方法で調製したウサギ肺胞マクロファージを培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したもの）に懸濁し２×１０⁵／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに撒き一晩培養した。細胞をＤＭＥＭに０．１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＩＢＭＸを加えた培地で２回洗浄した後、同じ培地に希釈したＴＬＣＡ ２００μＭあるいは培地を添加して４分間インキュベーションした。cAMP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を測定した結果、図２２に示す通りＴＬＣＡ添加によりｃＡＭＰ産生量の上昇が認められた。
【０１１８】
実施例２０ ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性におよぼす各種胆汁酸の抑制効果
実施例９の方法に従い、ウサギ肺胞マクロファージを調製し、各種胆汁酸による貪食能抑制効果を検討した。その結果、図２３に示すとおり、ＴＬＣＡの他、ＧＬＣＡ、ＬＣＡを１００μＭにて添加した場合において、マクロファージの免疫機能のひとつである貪食活性の著明な低下が認められた。
【０１１９】
実施例２１ ウサギ肺胞マクロファージからのＴＮＦα分泌に対する胆汁酸の抑制効果
実施例９の方法で調製したウサギ肺胞マクロファージを培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したもの）に懸濁し０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに撒き一晩培養した。同じ培地を用いて胆汁酸を希釈してグラフに表示した濃度にて肺胞マクロファージに添加して１時間培養した。さらに、同じ濃度の胆汁酸サンプルにリポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ 和光純薬）を添加したものを追加して加え、１２時間培養した。ＬＰＳの濃度は１ｎｇ／ｍｌにて加えた。培養後、培養上清を回収し、実施例１０と同様に上清中のＴＮＦαを定量した。その結果、図２４に示す通り、ＴＧＲ５にアゴニスト活性を示す胆汁酸の添加により濃度依存的にＴＮＦα分泌量の抑制活性が認められた。
【０１２０】
実施例２２ ＴＧＲ５遺伝子を導入したＴＨＰ−１細胞におけるｃＡＭＰ産生上昇
ＴＨＰ−１あるいは実施例１２で得たＴＧＲ５高発現細胞株ＴＨＰ−ＴＧＲ５をアッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ ＢＳＡと１ｍＭ ＩＢＭＸを添加したもの）で洗浄後、１×１０⁵／ｗｅｌｌにて９６ウェルプレートに撒いた。上記アッセイ用培地にて希釈した胆汁酸を添加して２０分間インキュベーションした。その後cAMP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を測定した結果、図２５に示す通りＴＨＰ−ＴＧＲ５においてＴＬＣＡ、ＬＣＡ、ＤＣＡ添加によるｃＡＭＰ産生量の上昇が認められた。一方ＴＨＰ−１ではＴＬＣＡによるｃＡＭＰ産生上昇は認められないことから、これらの胆汁酸によるｃＡＭＰ上昇はＴＧＲ５を介した反応であることが確かめられた。
【０１２１】
実施例２３ ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−ＴＧＲ５からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の抑制効果
実施例１３と同様にＴＨＰ−ＴＧＲ５あるいはＴＨＰ−１細胞を処理し、ＬＰＳで刺激されたＴＮＦα分泌に対する各種胆汁酸の抑制効果を検討した。ＬＰＳ刺激は１２時間とし、培養上清を回収後、実施例１３と同じく、バイオアッセイによるＴＮＦα含有量の測定を行った。その結果、図２６に示す通り、ＴＨＰ−ＴＧＲ５では胆汁酸の濃度依存性にＴＮＦα分泌量の低下が認められた。一方、ＴＨＰ−１では顕著なＴＮＦα分泌抑制作用は見られなかった（図２７）。これらのことから、ウサギ肺胞マクロファージで認められたＴＮＦα分泌抑制効果は明らかにＴＧＲ５を介したものであることが確認され、生体内においてＴＧＲ５がこうした免疫機能の制御に関わることが示された。
【０１２２】
参考例１ ヒト染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ７ ＤＮＡの増幅
ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、２種の合成プライマー（配列番号：４２および配列番号：４３）を用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行なった。合成プライマーはレセプタータンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されるように、５’側および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体ＤＮＡ（タカラ）0.5μg、合成DNAプライマー各1μM、0.8 mM dNTPs、1 mM MgCl₂、KODポリメラーゼ（トーヨーボー）1μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（タカラ）を用い、94℃・60秒の加熱の後、98℃・15秒、65℃・2秒、74℃・30秒のサイクルを35回繰り返した。増幅産物の確認は、0.8%アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【０１２３】
参考例２ ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ＤＮＡ配列の確認
参考例１で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。pCR-Script^TM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH5αcompetent cell（トーヨーボー）に導入して形質転換した後、ＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体E. coli DH5α/GPR7を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部に対して制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩによる切断を行ない、挿入されているレセプターＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems社)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：３９）。配列番号：３９で表わされる塩基配列を有するDNAを保持するpCR-Script Amp SK(+)プラスミドを、pCR-ScriptヒトGPR7と命名した。配列番号：３９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡがコードするヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を配列番号：３８に示した。ここで配列を決定したヒトＧＰＲ７のＤＮＡ配列はＯ’Ｄｏｗｄらの報告（O'Dowd, B. F. et al.、Genomics、28巻、84-91頁、1995年）にあるＤＮＡ配列とは２塩基が異なっていた。これらは配列番号：３９の８９３番目および８９４番目に当たり、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告ではそれぞれＣおよびＧであるが、本参考例ではＧおよびＣであった。これにより、翻訳されるアミノ酸配列において配列番号：３８の２９６番目のアミノ酸が、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告のＴｈｒが本実施例ではＳｅｒとなる。
【０１２４】
参考例３ ヒト全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガンド前駆体遺伝子の取得と発現プラスミドの構築
クローンテック社より購入したヒト全脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
GSF1: 5'-GTCGACATGGCCCGGTCCGCGACACTGGCGGCC-3'（配列番号：４０）
GSR2: 5'-GCTAGCAGCGGTGCCAGGAGAGGTCCGGGCTCA-3'（配列番号：４１）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ GSF1（10 μM）、０．５μｌ GSR2（１０μＭ）、２．５μｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５μｌ KlenTaq（クローンテック）、１７．５μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液を、ThermalCycler9600を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃２分の変性の後、９８℃１０秒、６０℃２０、７２℃２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQIAGEN PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２８（配列番号：３７）で示す配列がえられた。図２８のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図２９（配列番号：３６）に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAhGPR7-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAhGPR7-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図２８と同じヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡであることを確認した。次にそのプラスミドから制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化後約０．４ｋｂのヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡ断片を得た。さらに、動物細胞用の発現ベクターであるpAKKO-111Hはマルチクローニングサイト部分の制限酵素サイトＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の操作によって調製したヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡ断片および発現ベクターをライゲーションによって連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換してE.coli JM109/pAK-S64を得た。
形質転換体E.coli JM109/pAK-S64を培養し、プラスミドpAK-S64のDNAを大量に調製した。
【０１２５】
参考例４ ＧＰＲ７発現プラスミドおよびレポータープラスミドのチャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞での一過的な発現
参考例３で得たヒト型ＧＰＲ７ ＤＮＡを、公知の方法により動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ-111Ｈに挿入したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたコロニーを単離・培養後、QIAGEN Plasmid Maxi Kit（キアゲン社）を用いてＧＰＲ7発現プラスミドＤＮＡの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたpCRE-Luc（クロンテック社）のプラスミドＤＮＡを同様の方法で調製した。
ＧＰＲ７発現プラスミドおよびpCRE-Lucはレセプター遺伝子を挿入していない発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞に一過性に発現させた。ＣＨＯ細胞は９６−ウェルプレート（コーニングコースター社）に40,000 細胞/ウェル、培養液量１００μｌで播種し、３７℃で一晩培養した。プレート上での培養にはＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium, GibcoBRL社）に１０％のウシ胎児血清のみを添加した培地を用いた。
各プラスミドは240ng/μlの濃度に希釈し、ＧＰＲ７の発現プラスミド９μｌとpCRE-Luc １μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-I（GibcoBRL社）に添加した。これを、同じく２４０μｌのOpti-MEM-Iに１０μｌのリポフェクトアミン2000（GibcoBRL社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドＤＮＡの複合体を形成させた。これを25μl/wellずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４時間後に培養液をアッセイバッファー（０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換して無血清化し、３７℃で一晩培養した。
【０１２６】
参考例５ リガンド遺伝子のＣＨＯ細胞での発現
参考例４で作製したヒト型リガンドｃＤＮＡを挿入した動物細胞用発現プラスミドpAK-S64を参考例５と同様の方法でCHO細胞に一過性に発現させた。ただし細胞は6-ウェルプレート（ファルコン社）に600,000細胞/ウェルで播種し、一晩培養の後、リガンド遺伝子プラスミドを導入した。240ng/μlの濃度に希釈したプラスミドを10 μlと240 μlのOpti-MEM-Iに添加し、これを、同じく240 μlのOpti-MEM-Iに10 μlのリポフェクトアミン2000を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドDNAの複合体を形成させた。これを500μl/ウェルずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４時間後に培養液をアッセイバッファーに交換し、無血清化をおこなった。培地交換の１８時間後に各ウェルの培地を回収しリガンドペプチドを含むＣＨＯ細胞培養上清を得た。
【０１２７】
実施例２４ レポーターアッセイによるリガンド活性の検出
参考例４の方法に従いＧＰＲ７を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養液に、参考例５で調製したpAK-S64発現培養上清および終濃度2 μMとなるようにホルスコリンを添加した。またリガンド遺伝子を挿入していない空の発現ベクター（ｐAKKO-111H）を参考例５の方法で一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養上清も同様に添加した。その際発現上清はアッセイバッファーにて２倍、４倍、８倍、１６倍に希釈した。上清を添加してから４時間、３７℃でインキュベーションを行ない、レセプターを介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、PicaGene LT2.0 （東洋インキ社）発光基質を５０μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する発光量をプレートリーダー（ARVOsxマルチラベルカウンター、PerkinElmer社）を用いて測定した。その結果、ｐAK-S64の培養上清を添加した際にのみレポーター遺伝子の発現抑制がルシフェラーゼ活性の低下として検出された(図３０)。さらに、この抑制の程度はｐAK-S64の培養上清の濃度依存的であった。このことはpAK-S64に挿入されたプラスミドによって発現した産物が、ＧＰＲ７を介した細胞内のシグナルを伝達した、すなわちＧＰＲ７のリガンドとして作用したことを示している。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法／キットを用いることにより、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とリガンドであるコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩が得られ、該化合物またはその塩は、中枢疾患(例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など)、炎症性疾患(例えば、アレルギー、喘息、リュウマチなど)、循環器疾患(例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等)、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、肥満などの予防および／または治療等の医薬等として用いることができる。
本発明の、リガンドが決定されていないレセプタータンパク質のリガンドの決定方法では、各種の細胞系が使用できるため簡便であり、かつ短時間で測定等を実施することができる。
【０１２９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す。
【図２】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す（図１に続く）。
【図３】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す（図２に続く）。
【図４】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す（図３に続く）。
【図５】ＴＧＲ５の疎水性プロット図である。
【図６】ＴＧＲ５発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（Ａ）およびもとのベクターのみを導入したＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）における、コレステロール代謝関連物質による活性の検出（ｎ＝２）の結果を示す。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞におけるリガンド刺激に対するレポーター遺伝子の発現誘導の結果を示す。
【図８】Ｇｉを用いたＴＧＲ５のリトコール酸に対する反応の結果を示す。
【図９】ヒト（Ｂ）、ウサギ（Ｃ）、ウシ（Ｄ）、マウス（Ｅ）およびラット（Ｆ）型ＴＧＲ５の胆汁酸刺激によるレポーター遺伝子の発現量上昇。胆汁酸はすべて１０μＭとなるように培地に添加した。Ａはコントロール（プラスミドのみ）を示す。
【図１０】ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性に対するＴＬＣＡ（１００μＭ）の抑制効果。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図１１】ウサギ肺胞マクロファージにおける、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌に対するＴＬＣＡ（５０μＭ）の抑制効果。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図１２】ウサギ肺胞マクロファージに対するＴＬＣＡによる各種のサイトカインのｍＲＮＡ発現抑制作用を示す。Ａ：ＴＮＦα；Ｂ：ＩＬ−１α；Ｃ：ＩＬ−１β；Ｄ：ＩＬ−６；Ｅ：ＩＬ−８のサイトカインの場合を表す。
【図１３】ＴＨＰ−ＴＧＲ５における、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌およびｍＲＮＡ発現量に対するＴＬＣＡ（１００μＭ）の抑制効果。分泌量：ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。ｍＲＮＡ発現量：ｎ＝２の平均値。
【図１４】ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質の局在を示す。図中の白線は４μｍを示す。
【図１５】ＴＧＲ５−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞にＴＬＣＡを添加して３０分後の融合タンパク質の局在を示す。図中の白線は４μｍを示す。
【図１６】ＴＬＣＡによるＣＨＯ−ＴＧＲ５でのＭＡＰキナーゼ活性化の検出を表す。
【図１７】ＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるＴＬＣＡ、ＬＣＡ、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡのｃＡＭＰ産生上昇活性を表す。ｎ＝３の平均値。グラフ中の構造式は胆汁酸を示す。
【図１８】各種胆汁酸関連化合物（２μＭ）によるＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるｃＡＭＰ産生上昇活性の比較を示す。ｎ＝３の平均値。ＴＴＮＰＢは（Ｅ）−［（テトラヒドロテトラメチルナフタレニル）プロピル］ベンゾイックアシッドの略称を表す。
【図１９】ヒト各組織でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布を示す。
【図２０】ヒト血球でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布を示す。
【図２１】ウサギＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現分布を示す。
【図２２】ＴＬＣＡによるウサギ肺胞マクロファージのｃＡＭＰ産生上昇を示す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２３】ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性におよぼす各種胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２４】ウサギ肺胞マクロファージからのＴＮＦα分泌に対する胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２５】胆汁酸添加によるＴＨＰ−ＴＧＲ５細胞でのｃＡＭＰ産生上昇を示す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２６】ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−ＴＧＲ５からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２７】ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の影響を表す。ｎ＝３の平均値。
【図２８】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図２９】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図３０】リガンド発現ベクターpAK-S64および空の発現ベクター(pAKKO-111H)を発現させたＣＨＯ細胞の培養上清を、ＧＰＲ７ ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培地にホルスコリン（ＦＳＫ）とともに添加し、リガンド刺激によるルシフェラーゼ活性の抑制を検出した結果を示す。

Claims (2)

1. （１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2. （１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を含有することを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。

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