JP4184697B2 - Screening method - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト脾臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩とリガンドであるコレステロール代謝関連物質とを用いるスクリーニング方法、マウス、ラット、ウシまたはウサギ由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのＤＮＡ、オーファンレセプターのリガンド決定方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプタータンパク質のうち多くは共役しているguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質あるいは７回膜貫通型レセプタータンパク質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプタータンパク質、特にはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプタータンパク質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプタータンパク質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプタータンパク質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプタータンパク質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプタータンパク質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質と生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標的ともなりうるＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を新規に見出し、その遺伝子（例えばｃＤＮＡ）をクローニングすることは、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の特異的リガンドや、アゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、Ｇタンパク質共役型レセプターはその全てが見出されているわけではなく、現時点でもなお、未知のＧタンパク質共役型レセプター、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数存在しており、新たなＧタンパク質共役型レセプターの探索および機能解明が切望されている。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガンドが見出されなくても、該レセプターの不活化実験（ノックアウト動物）から該レセプターの生理作用を解析することにより、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することも可能である。これら該レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇタンパク質共役型レセプターの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇタンパク質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプターに対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防および／または治療薬や診断薬に応用することもできる。
一方、従来のリガンド等の探索・決定方法では、例えば真核生物由来の細胞を用いて、レセプターに対する結合分子をスクリーニングする場合、従来は該レセプターを安定的に発現する、いわゆる安定細胞株（stable cell line）を樹立しなければならず、この細胞株の樹立には特別な細胞を必要とした。またスクリーニングには複数の測定の組合せが必要であり、試験化合物が複数存在すると、時間がかかるためにその実施が困難であった。つまり、従来のリガンド等の探索・決定方法には、（１）使用可能な細胞系が限定される、（２）該細胞系の樹立に時間がかかる、（３）複数の測定法を組み合わせるために、検体数が多くなるとその実施が困難になる等の問題があった。これらの問題を解決するための、各種の細胞系が使用でき、かつ短時間で測定等を実施できる方法の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、特別な細胞株を必要としないスクリーニング方法を見出した。さらに、ヒト脾臓由来のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のリガンドがコレステロール代謝関連物質であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［２］配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［３］配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［４］配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［５］配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩を用いる上記［１］記載のスクリーニング方法、
［６］（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を含有することを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［７］上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるコレステロール代謝関連物質と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
［８］上記［７］記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
［９］上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［１０］上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［１１］哺乳動物に対して、上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［１２］哺乳動物に対して、上記［１］記載のスクリーニング方法または請求項６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法，
［１３］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアゴニストの使用、
［１４］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための、上記［１］記載のスクリーニング方法または上記［６］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するアンタゴニストの使用、
［１５］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する化合物またはその塩を含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［１６］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［１７］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［１８］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法、
［１９］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を増加する化合物またはその塩の使用、
［２０］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の発現量を減少させる化合物またはその塩の使用、
［２１］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［２２］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤、
［２３］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬、
［２４］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［２５］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬、
［２６］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる免疫不全または感染症の予防および／または治療剤、
［２７］配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬、
［２８］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［２９］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療方法、
［３０］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法、
［３１］哺乳動物に対して、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする免疫不全または感染症の予防および／または治療方法、
［３２］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の使用、
［３３］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの使用、
［３４］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［３５］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤を製造するための、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチドの使用、
［３６］配列番号：５、配列番号：７、配列番号１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列（但し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を除く）を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、
［３７］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
［３８］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または上記［３７］記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
［３９］ＤＮＡである上記［３８］記載のポリヌクレオチド、
［４０］配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表される塩基配列を有する上記［３８］記載のポリヌクレオチド、
［４１］上記［３８］記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
［４２］上記［４１］記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
［４３］上記［４２］記載の形質転換体を培養し、上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめることを特徴とする上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の製造法、
［４４］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記［３７］記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
［４５］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記［４４］記載の抗体、
［４６］上記［４４］記載の抗体を含有してなる診断薬、
［４７］中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［４６］記載の診断薬、
［４８］上記［４４］記載の抗体を含有してなる医薬、
［４９］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤である上記［４８］記載の医薬、
［５０］上記［３６］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
［５１］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤である上記［５０］記載の医薬、
［５２］上記［３８］記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［５３］炎症性疾患または移植医療後の過剰免疫反応の予防および／または治療剤である上記［５２］記載の医薬、
［５４］上記［３８］記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断剤、
［５５］中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［５４］記載の診断薬、
［５６］上記［３８］記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、
［５７］上記［５６］記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［５８］免疫不全または感染症の予防および／または治療剤である上記［５７］記載の医薬、
［５９］上記［５６］記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断剤、
［６０］中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、呼吸器疾患、糖尿病、免疫系疾患、肝臓・胆のう疾患、消化管疾患、感染症、肥満または移植医療後の過剰免疫反応の診断薬である上記［５９］記載の診断薬、
［６１］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する動物細胞に、試験化合物を添加し、レポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする該レセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法、
［６２］（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する動物細胞を培養し、試験化合物を添加してレポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする上記［６１］記載の方法、
［６３］レセプタータンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質である上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６４］Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質が、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質である上記［６３］記載の方法、
［６５］プロモーターがＴＡＴＡ様配列である上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６６］レポータータンパク質がルシフェラーゼである上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６７］プラスミドがｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質をコードする遺伝子を連結したものである上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６８］動物細胞が、リガンドが決定されていない２種類以上のレセプタータンパク質を発現している上記［６１］または［６２］記載の方法、
［６９］細胞が抑制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉをコードする遺伝子を含有するプラスミドを含む上記［６１］または［６２］記載の方法、
［７０］さらにフォルスコリンを添加する上記［６１］または［６２］記載の方法、
［７１］２種類以上のレセプタータンパク質が類似の特徴を有することを特徴とする上記［６８］記載の方法、
［７２］類似の特徴がレポータータンパク質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量である上記［６８］記載の方法、
［７３］予め２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量を測定し、該レポータータンパク質の発現量が同程度である２種類以上のレセプタータンパク質を組み合わせて発現させることを特徴とする上記［６８］記載の方法等に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（以下、本発明のレセプタータンパク質と略記する場合がある）は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
本発明のレセプタータンパク質は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【０００８】
配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリーニング方法に従って測定することができる。
【０００９】
また、本発明のレセプタータンパク質としては、▲１▼配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
【００１０】
本明細書におけるレセプタータンパク質は、ペプチド表記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をはじめとする、本発明のレセプタータンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ^-)、アミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプタータンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のレセプタータンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のレセプタータンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_2-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質などが用いられる。
【００１１】
本発明のレセプタータンパク質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明のレセプタータンパク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するレセプタータンパク質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプタータンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１２】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ^-）であるが、上記した本発明のタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した本発明のレセプタータンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１３】
本発明のレセプタータンパク質またはその塩は、上記したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１４】
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１５】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００１６】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１７】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１８】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護、保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の手段から、また保護基は公知の基から、それぞれ適宜選択され、適用される。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００１９】
本発明のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, NewYork (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２０】
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプタータンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のレセプタータンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。
【００２１】
本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のレセプタータンパク質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
また配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】
本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＧタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＧタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’'端パリンドローム領域、および３’'端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２４】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、即ち対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２５】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸はまた公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００２６】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
【００２７】
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のレセプタータンパク質ペプチドと実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１３または配列番号：１５で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２８】
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド（以下、本発明のレセプタータンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のレセプタータンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のレセプタータンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２９】
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^TM−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造）、Ｍｕｔａｎ^TM−Ｋ（宝酒造）などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたレセプタータンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のレセプタータンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３０】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３１】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ^-、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
【００３２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。
【００３３】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３４】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）」が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３５】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめることができる。
【００３６】
上記培養物から本発明のレセプタータンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるレセプタータンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３７】
このようにして得られるレセプタータンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するレセプタータンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のレセプタータンパク質またはその塩の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３８】
以下に、本発明のスクリーニング方法について詳述する。
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法
特定のアミノ酸配列を含有する本発明のタンパク質（例えば、本発明のレセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある））を用いるか、または組換え型タンパク質等の発現系を構築し、該発現系を用いた結合アッセイ系を用いることによって、試験化合物（例えば、リガンドであるコレステロール代謝関連物質（例、胆汁酸（例、タウロリトコール酸、グリコリトコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、ノルデオキシコール酸、７−ケトリトコール酸、５β−プレグナン−３，２０−オン、コール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロケノデキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸）、エピアンドロステロン、（＋）−４−アンドロステン−３，１７−ジオン、シス−アンドロステロン、１１β−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコルチゾール、デヒドロイソアンドロステロン、３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オン、４−プレグネン−２０α−オール−３−オン、５α−デヒドロテストステロン、テストステロン、プロゲステロン、またはこれらの塩等））と本発明のタンパク質等との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような試験化合物には、（イ）あるタンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプター）を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニスト）、（ハ）生理活性物質（例えば、コレステロール代謝関連物質）と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）生理活性物質（例えば、コレステロール代謝関連物質）と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物などが含まれる（なお、上記（イ）の化合物は、後述のリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ましい）。
【００３９】
本発明では、（１）試験化合物１単独で結合活性を測定し、（２）さらに、試験化合物２について結合活性を測定し、（３）そして、（１）と（２）の結果を比較する。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、コレステロール代謝関連物質とを接触させた場合と（ｉｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、コレステロール代謝関連物質および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、該レセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質の結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
【００４０】
より具体的には、本発明は、
▲１▼標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したコレステロール代謝関連物質および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、標識したコレステロール代謝関連物質の該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したコレステロール代謝関連物質および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したコレステロール代謝関連物質の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識したコレステロール代謝関連物質を、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質等に接触させた場合と、標識したコレステロール代謝関連物質および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、標識したコレステロール代謝関連物質の該レセプタータンパク質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００４１】
▲４▼本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質など）を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を測定し、比較することを特徴とするコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質など）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合と、本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプタータンパク質等としては、上記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するものであれば何れのものであってもよいが、本発明のレセプタータンパク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のレセプタータンパク質等などが適している。
【００４２】
本発明のレセプタータンパク質等を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査は公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプタータンパク質等を含有するものとしては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプタータンパク質等を含有する細胞や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００４４】
コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、例えば、適当なレセプタータンパク質画分と、標識したコレステロール代謝関連物質が必要である。
レセプタータンパク質画分としては、天然型のレセプタータンパク質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプタータンパク質画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したコレステロール代謝関連物質としては、標識したコレステロール代謝関連物質、標識したコレステロール代謝関連物質アナログ化合物などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたコレステロール代謝関連物質などが用いられる。
具体的には、コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプタータンパク質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したコレステロール代謝関連物質を添加し、同時に１０^-4Ｍ〜１０^-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のコレステロール代謝関連物質を加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００４５】
コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物スクリーニングする上記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、例えば、レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なレセプタータンパク質を発現した細胞が必要である。本発明のレセプタータンパク質等を発現した細胞としては、天然型の本発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、上記の組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４６】
コレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のレセプタータンパク質等、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、または本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼Ｇタンパク質共役型レセプター標品
本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識コレステロール代謝関連物質
市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識したコレステロール代謝関連物質
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼コレステロール代謝関連物質標準液
コレステロール代謝関連物質を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４７】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識コレステロール代謝関連物質を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０^-3Ｍのコレステロール代謝関連物質を５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ₀ ：最大結合量
【００４８】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、リガンドであるコレステロール代謝関連物質と本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｇタンパク質共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、レポーター遺伝子の発現誘導活性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニスト）、（ハ）コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００４９】
本発明のレセプタータンパク質等に対するアゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該コレステロール代謝関連物質活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプタータンパク質等に対するアンタゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性を抑制することができるので、該コレステロール代謝関連物質活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
コレステロール代謝関連物質と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対するコレステロール代謝関連物質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を増強させる化合物（例、アゴニスト）が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を減少させる化合物（例、アンタゴニスト）が有効である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬（組成物）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
例えば、該化合物またはその塩を、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、該化合物またはその塩は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５１】
さらに、本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの定量法を以下に説明する。
本発明のレセプタータンパク質等は、コレステロール代謝関連物質（例、胆汁酸（例、タウロリトコール酸、グリコリトコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、ノルデオキシコール酸、７−ケトリトコール酸、５β−プレグナン−３，２０−オン、コール酸、コール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロケノデキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、エピアンドロステロン）、（＋）−４−アンドロステン−３，１７−ジオン、シス−アンドロステロン、１１β−ヒドロキシプロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコルチゾール、デヒドロイソアンドロステロン、３α−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オン、４−プレグネン−２０α−オール−３−オン、５α−デヒドロテストステロン、テストステロン、プロゲステロン、またはこれらの塩等）に対して結合性を有しているので、生体内におけるコレステロール代謝関連物質濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、例えば、競合法と組み合わせることによって用いることができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータンパク質等と接触させることによって被検体中のコレステロール代謝関連物質濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の▲１▼または▲２▼などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
▲１▼入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
▲２▼入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）
【００５２】
本発明の、リガンドが未知のレセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法について詳述する。
本発明のリガンドの決定方法は、（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質を発現し、かつエンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞に、試験化合物を添加し、発現誘導されるレポータータンパク質の活性を測定する方法、（２）（ｉ）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（ｉｉ）エンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞を培養し、試験化合物を添加し、発現誘導されるレポータータンパク質の活性を測定する方法などである。
該レセプタータンパク質としては、例えばＧタンパク質共役型レセプタータンパク質などが用いられる。具体例としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質や、ＷＯ９６／０５３０２、ＥＰ−Ａ−７１１８３１、ＥＰ−Ａ−７８９０７６、ＥＰ−Ａ−１１０３５６３、ＥＰ−Ａ−１１０３５６２、特開平８−１５４６８２号公報、特開平８−２８３２９５号公報、特開平８−１９６２７８号公報、特開平８−２４５６９７号公報、特開平８−２６６２８０号公報、特開平９−５１７９５号公報、特開平９−１２１８６５号公報、特開平９−２３８８６８６号公報、特開平１０−１４６１９２号公報に記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質などが挙げられる。
レセプター発現プラスミドとしては真核生物由来の細胞で該レセプタータンパク質を発現させるためのプロモーター、原核生物で増殖させる場合の選択マーカーとして用いる薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）などを含有するプラスミドがあげられる。
エンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを含む（真核生物由来）細胞に、導入可能なプラスミドとしては、市販のプラスミドなどのいかなるプラスミドでもよい。公知の方法にて酵素活性を検出できるような酵素遺伝子を含むようなプラスミドが好ましく用いられる。
エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０、パピローマウイルス等のウイルス由来のエンハンサー、レトロウイルスのＬＴＲ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ｃＡＭＰ応答配列）（ＣＲＥ）等が用いられ、好ましくはｃＡＭＰレスポンスエレメントである。
プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子のＴＡＴＡ様プロモーター等が用いられ、好ましくはＴＡＴＡ様プロモーターである。
レポータータンパク質遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が用いられる。
かかるプラスミドの具体例としては、ｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質（例、ルシフェラーゼ遺伝子）をコードする遺伝子を連結したプラスミド、例えばｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）などが用いられる。
上記で用いられる細胞としては、真核生物由来の細胞が挙げられ、好ましくは、動物細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞など）などが用いられる。
該細胞は、２種以上（好ましくは２〜３種）のレセプタータンパク質を発現していてもよい。
２種類以上のレセプタータンパク質を発現させる場合は、類似の特徴を有する２種類以上のレセプタータンパク質を選択するのが良い。
類似の特徴としては、例えば、２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク質の発現量などが挙げられる。具体的には、２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた場合における▲１▼レポータータンパク質の基礎発現量および（または）▲２▼フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量を指標として、各レセプタータンパク質の特徴を区別することができる。
すなわち、リガンドが決定されていない２種類以上のレセプタータンパク質を発現させてリガンドを決定する場合、あらかじめレポータータンパク質の基礎発現量が低いもの、中程度のもの、明らかに高いものなどに区分けをしたり、あるいはフォルスコリン添加によってレポータータンパク質の発現量が上昇しにくいレセプタータンパク質を明らかにしておくことが望ましい。なぜならば、例えばレポータータンパク質の基礎発現量が高いレセプタータンパク質とレポータータンパク質の基礎発現量が低いレセプターの２種類のレセプタータンパク質を発現させた場合、後者にリガンドがヒットした場合にレポータータンパク質発現量の上昇が見えにくくなるからである。したがって、得られた情報をもとに、
（１）レポータータンパク質の基礎発現量が高いレセプタータンパク質と低いレセプタータンパク質の混合は避けるのが好ましい、
（２）フォルスコリン添加によるレポータータンパク質の発現量の上昇が顕著なレセプタータンパク質とそうでないレセプタータンパク質は混合しないほうが好ましい、
（３）レポータータンパク質の基礎発現量が同程度であるレセプタータンパク質同士を組み合わせて発現させるのが好ましい。
このように類似の特徴を有するレセプタータンパク質の組み合わせとしては、例えば、ＡＰＪ（アペリンレセプター；ジーン（Gene）、第１３６巻、第３５５頁（1993年））とＴＧＲ−１（特開２００２−０７８４９２号）との組み合わせが挙げられる。
【００５３】
リガンドの決定方法の具体例を以下に記載する。
細胞を９６ウェルプレートに播種し、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで一晩培養する。ここで、例えば市販のトランスフェクションキットを用いて、レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドを同時に細胞に導入し、細胞をさらに一晩培養することにより、細胞内でレセプタータンパク質を一過性に発現させる。細胞を洗浄し、さらに培地を無血清化した後、試験化合物を添加する。エンハンサーがＣＲＥである場合、試験化合物と同時にフォルスコリンを添加してもよい。一定時間インキュベーションを行った後、細胞を溶解し、レポータータンパク質の活性を測定する。
前記の決定方法において、ベースラインが高く、シグナルの検出が困難な場合には、該ベースラインを低下させる手段を講じるとよい。例えばレセプタータンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）の場合、Ｇタンパク質のサブユニットであるＧαタンパク質のうち、ｃＡＭＰ抑制効果を示すＧｉタンパク質を添加することにより、シグナル検出が容易となる。Ｇｉタンパク質はまたＧｉタンパク質をコードするＤＮＡを発現するプラスミドとして、レセプタータンパク質プラスミドおよびレポータープラスミドと共に細胞に導入することができる。この場合、３種のプラスミド（レセプタープラスミド：レポータープラスミド：Ｇｉプラスミド）の混合比は、５〜１５：１：１〜６程度が好ましく、さらには７：１：３程度であるのが好ましい。
【００５４】
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００５５】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプタータンパク質等は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００５６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００５７】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００５８】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（レセプタータンパク質等の抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５９】
本発明の配列番号：５、配列番号：７、配列番号１４または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列（但し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を除く）を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、その部分ペプチドまたはその塩、および該レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは新規物質であり、（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤、（２）遺伝子診断剤、（３）本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（４）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの定量法、（５）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（６）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、（７）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（８）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体による中和、（９）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを有する非ヒト動物の作出などに用いることができる。
本発明のレセプタータンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある）、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）および本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）の用途について、以下に具体的に説明する。
【００６０】
（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドが有する作用に応じて、▲１▼本発明のレセプタータンパク質または▲２▼該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内において本発明のレセプタータンパク質が減少しているためにリガンドの生理作用が期待できない（該レセプタータンパク質の欠乏症）患者がいる場合に、▲１▼本発明のレセプタータンパク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量を補充したり、▲２▼（イ）本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるレセプタータンパク質の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として有用である。
本発明のレセプタータンパク質は、例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を増強させる化合物（例、アゴニスト）が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等を介した生理活性を減少させる化合物（例、アンタゴニスト）が有効である。
本発明のレセプタータンパク質を上記予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）を上記予防および／または治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、▲１▼本発明のレセプタータンパク質または▲２▼該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、▲１▼本発明のレセプタータンパク質または▲２▼該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６１】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００６２】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のレセプタータンパク質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６３】
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６４】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。より具体的には、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患(例えば、アレルギー、喘息、リュウマチなど)、循環器疾患(例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等)、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、肥満などの疾患の遺伝子診断診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
【００６５】
（３）本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患、例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現を促進する化合物が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現を阻害する化合物が有効である。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００６７】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】
（４）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの定量法
本発明のレセプタータンパク質等は、リガンドに対して結合性を有しているので、生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、例えば、競合法と組み合わせることによって用いることができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータンパク質等と接触させることによって被検体中のリガンド濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の▲１▼または▲２▼などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
▲１▼入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
▲２▼入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）
【００６９】
（５）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。従って、本発明のレセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００７０】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７１】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７２】
（６）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化レセプタータンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化レセプタータンパク質等の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法を提供する。
上記（ii）においては、一方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
【００７３】
本発明のレセプタータンパク質等に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のレセプタータンパク質等の測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、レセプタータンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００７４】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のレセプタータンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるレセプタータンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプタータンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、レセプタータンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００７５】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ)と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００７６】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(PartC))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のレセプタータンパク質またその塩を定量することによって、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のレセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセプタータンパク質等の検出、被検細胞内における本発明のレセプタータンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００７７】
（７）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患、例えば、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満、移植医療後の過剰免疫反応などの疾患の予防および／または治療剤として有用である。
これらの疾患のうち、免疫機能、マクロファージ機能などが亢進することに起因する疾患（例えば、炎症性疾患、移植医療後の過剰免疫反応など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現量を促進する化合物が有効である。
一方、免疫機能、マクロファージ機能などが抑制されることに起因する疾患（例えば、免疫不全、感染症など）には、特に本発明のレセプタータンパク質等の発現を阻害する化合物が有効である。
該化合物を本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００７８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７９】
また、上記予防および／または治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、高血圧症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８０】
（８）本発明のレセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による中和
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の、それらレセプタータンパク質などに対する中和活性とは、すなわち、該レセプタータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該レセプタータンパク質の関与するシグナル伝達、例えば、該レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不活性化することができる。したがって、該レセプタータンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予防および／または治療に用いることができる。
【００８１】
（９）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを有する動物の作出
本発明のＤＮＡを用いて、本発明のレセプタータンパク質等を発現するトランスジェニック動物を作出することができる。動物としては、非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）など（以下、動物と略記する場合がある）が挙げれるが、特に、マウス、ウサギなどが好適である。
本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のレセプタータンパク質等を高産生するＤＮＡ導入動物を作出できる。このプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
【００８２】
受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明のレセプタータンパク質等が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有する。
本発明のＤＮＡ導入動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明のＤＮＡが導入された動物は、本発明のレセプタータンパク質等が高発現させられているので、本発明のレセプタータンパク質等に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。
本発明のＤＮＡ導入動物を、組織培養のための細胞源として使用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ導入マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータンパク質が存在する組織を分析することにより、本発明のレセプタータンパク質等について分析することができる。本発明のレセプタータンパク質等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。また、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、本発明のレセプタータンパク質等を単離精製することも可能である。
【００８３】
（１０）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００８４】
本発明の「ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞」とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００８５】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ₁マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ₁）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ₁マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【００８６】
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０⁶個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００８７】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【００８８】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチドの細胞生物学的検討において有用である。
【００８９】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
【００９０】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
【００９１】
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００９２】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００９３】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００９４】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃｌ₂Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００９５】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
本発明で用いられるヒト由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
本発明で用いられるヒト由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：４
以下の参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：５
本発明のマウス心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｍＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６
本発明のマウス心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｍＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：７
本発明のラット心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｒＴＧＲ５アミノ酸配列を示す。
配列番号：８
本発明のラット心臓由来の新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｒＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：９
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：１０
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：１１
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー３の塩基配列を示す。
配列番号：１２
以下の実施例５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー４の塩基配列を示す。
配列番号：１３
ウシ型ＴＧＲ５のＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１４
ウシ型ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１５
ウサギ型ＴＧＲ５のＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１６
ウサギ型ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１７
以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用したｂＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１８
以下の実施例６におけるＰＣＲ反応で使用したｂＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１９
以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したｒａｂｂｉｔＦプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２０
以下の実施例７におけるＰＣＲ反応で使用したｒａｂｂｉｔＲプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２１
以下の実施例１１におけるＩＬ−１α ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２２
以下の実施例１１におけるＩＬ−１αｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２３
以下の実施例１１におけるＩＬ−１αｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：２４
以下の実施例１１におけるＩＬ−１β ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２５
以下の実施例１１におけるＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２６
以下の実施例１１におけるＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：２７
以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２８
以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：２９
以下の実施例１１におけるＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：３０
以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３１
以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３２
以下の実施例１１におけるＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：３３
以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３４
以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：３５
以下の実施例１１におけるＴＮＦα ｍＲＮＡ発現量の定量に使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：３６
ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３７
ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３８
ＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３９
ＧＰＲ７をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：４０
参考例４でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
配列番号：４１
参考例４でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
配列番号：４２
参考例２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４３
参考例２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００９６】
以下の参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＣＲ４−ｈＴＧＲ５は、平成１２（２０００）年４月３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１４として、平成１２（２０００）年３月２３日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６４１０として寄託されている。
以下の実施例５で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ−ｒＴＧＲ５は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７７として、平成１４（２００２）年１月１０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４５として寄託されている。
以下の実施例５で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ５は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７８として、平成１４（２００２）年１月１０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４６として寄託されている。
以下の実施例６で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＴＧＲ５−１は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７９として、平成１４（２００２）年１月１７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４７として寄託されている。
以下の実施例７で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＴＡｒａｂｂｉｔＴＧＲ５−１は、平成１４（２００２）年２月７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８８０として、平成１４（２００２）年１月１７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６７４８として寄託されている。
後述の参考例４で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４０として、２００１年６月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６６４４として寄託されている。
【００９７】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【００９８】
参考例１ ヒト脾臓のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clontech）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：３）およびプライマー２（配列番号：４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡを１／１０量鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Clontech）１／５０量、プライマー１（配列番号：３）およびプライマー２（配列番号：４）を各０.５μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および酵素に添付のバッファーを１／５量、ＧＣ Ｍｅｌｔを１／５量加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・５分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・２分のサイクルを３０回繰り返し、最後に６８℃・５分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ４（Invitrogen）へサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を得た。このｃＤＮＡにより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴＧＲ５と命名した。また配列番号：２で表わされるＤＮＡを含有する形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＣＲ４−ｈＴＧＲ５と命名した。
【００９９】
実施例１ ＴＧＲ５を一過性に発現させたＨＥＫ２９３細胞における、コレステロール代謝関連物質による活性の検出
コレステロール代謝関連物質によるＴＧＲ５特異的な刺激活性の検出は、ＣＲＥプロモーターの発現誘導によって産生されるレポーター遺伝子産物（ルシフェラーゼ）の発現量を指標に行った。
ＨＥＫ２９３細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（GibcoBRL）に１０％ウシ胎児血清（GibcoBRL）を添加したもの）に懸濁し、１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にてコラーゲンでコートされたＢｌａｃｋ ｗｅｌｌ ９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）にまいた。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した後、レポーター遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Clontech）と同時に、公知の方法により動物細胞での発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251-259, 1994記載のｐＡＫＫＯ−１．１１１Ｈと同一のプラスミドベクター）にＴＧＲ５遺伝子を挿入して作製した発現ベクタープラスミド、または、ＴＧＲ５遺伝子を含まないもとのｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを用いて細胞のトランスフェクションを以下のとおりに行った。
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ（GibcoBRL）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（GibcoBRL）を２４：１にて混合することにより、リポフェクトアミン希釈液を調製した。また、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ、ＴＧＲ５発現ベクタープラスミドまたはもとのベクタープラスミド（２４０ｎｇ／μｌ）およびｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（２４０ｎｇ／μｌ）を２４：０．９：０．１にて混合することによりＤＮＡ希釈液を調製した。リポフェクトアミン希釈液とＤＮＡ希釈液を等量混合し、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた後、上記のＨＥＫ２９３細胞を培養したプレートに２５μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をアッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミンを添加したもの）にて洗浄した後、アッセイ用培地にて希釈したリトコール酸（和光純薬）およびプロゲステロン（和光純薬）を２×１０^-5Ｍとなるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４時間培養した。培養上清を捨てて、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ製造株式会社）を５０μｌ添加し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Wallac社）を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。
その結果、配列番号：２で表される塩基配列を有するＴＧＲ５遺伝子を導入したＨＥＫ２９３細胞特異的に、リトコール酸、プロゲステロンによるルシフェラーゼ活性の上昇が認められた（図６）。
【０１００】
実施例２ Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドの宿主細胞への導入
公知の方法によって作製した各種Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｃＤＮＡ、すなわち甲状腺ホルモン刺激因子レセプター（ＴＲＨＲ）、ニューロメジンＵレセプター（ＦＭ−３およびＴＧＲ−１）、プロラクチン放出因子レセプター（ｈＧＲ３）、アペリンレセプター（ＡＰＪ）などを挿入した動物細胞用発現プラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロニーを単離・培養後、QIAGEN Plasmid Maxi Kit（キアゲン）を用いてプラスミドの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Clontech）のレポータープラスミドを同様にして調製した。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドを導入する宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞をコラーゲンタイプＩでコートした96-well黒色プレート（ベクトンディッキンソン社）に100,000 cells/well、培養液量１００μｌで播種し、一晩培養した。同じくＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞をpAKKO-111Hで形質転換したＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞をコスター社の９６−ｗｅｌｌ黒色プレートに40,000 cells/well、培養液量１００μｌで播種し、一晩培養した。いずれの細胞についても、プレートで培養するための培地はＤＭＥＭ（GibcoBRL社）に１０％のウシ胎児血清のみを添加したものを用いた。
各プラスミドを２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現プラスミド９μｌとレポータープラスミド１μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-I（GibcoBRL社）に添加した。これを、同じく２４０μｌのOpti-MEM-Iに１０μｌのリポフェクトアミン2000（GibcoBRL社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドの複合体を形成させた。また、効率的なスクリーニングの実施のためには、２４０ｎｇ／μｌの濃度で３種類のレセプター発現プラスミドを５μｌずつ添加し、他の試薬の比率は前出と同じものを調製した。これらを２５μｌ／ｗｅｌｌずつＨＥＫ２９３あるいはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞の培養液に添加し、３７℃で一晩培養してプラスミドの導入を行った。ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞については、プラスミド添加後４時間以降に培養液をアッセイバッファー（０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換し、無血清化をおこなった。
【０１０１】
実施例３ レポーターアッセイによるリガンド活性の検出
ＨＥＫ２９３細胞についてはアッセイの１時間前に培養液を実施例２に記載のアッセイバッファーに交換し、プレインキュベーションを行なった。アッセイバッファーにリガンドあるいはリガンド候補化合物を溶解したものを用意し、実施例２で準備したＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞に添加した。また、アッセイバッファーに終濃度２μＭのフォルスコリンを添加した条件でのアッセイも同様にして実施した。サンプルを添加後に４時間のインキュベーションを行ない、レセプターを介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、ピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）発光基質を５０μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する発光量を実施例１記載のプレートリーダーにて測定した。
実施例２および３に記載の方法に従って各種のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを用い、ＨＥＫ２９３細胞においてリガンド刺激によるレポーター遺伝子の発現誘導を測定した。レセプターを介して細胞内へシグナルを伝達するＧタンパク質αサブユニットの種類としてＧｓに共役するＣＲＦＲについては、フォルスコリン非添加、添加のいずれの条件においてもリガンド添加によるレポーター遺伝子の活性化が検出された。また、抑制性であるＧαｉに共役するＡＰＪについては、フォルスコリン添加条件において、リガンド添加によるレポーター遺伝子発現の抑制が検出された。また、Ｇｑに共役するレセプターＴＲＨＲ、ＦＭ−３、ＴＧＲ−１については、フォルスコリン添加条件においてレポーター遺伝子の発現の促進が検出された。ＧｑおよびＧｉの両方に共役するレセプターｈＧＲ３についても、同様にフォルスコリン添加条件においてレポーター遺伝子の発現の促進が検出された（図７）。
【０１０２】
実施例４ 抑制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉ発現プラスミドを用いたレポーターアッセイ
実施例２に示したＧタンパク質レセプター発現プラスミドと同様の方法によって抑制性Ｇタンパク質αサブユニット(Ｇｉ)プラスミドを作製、調製した（ここで、Ｇｉついては、動物種を問わない）。これを３μｌ、レセプター発現プラスミドを７μｌ、レポータープラスミドを１μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-Iに添加し、その他の条件は実施例２と同様の方法でＨＥＫ２９３あるいはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞にＤＮＡを導入した。これら３種のプラスミドの混合比は全体の量を１１μｌとした場合、Ｇｉが１から６、好ましくは１から３が適当である。これらを実施例３の方法に従ってアッセイを行いリガンド活性を検出した。
すなわち、Ｇｉを用いたＴＧＲ５のリトコール酸に対する反応を検出した結果、ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞を用いたＧタンパク質レセプターＴＧＲ５のアッセイにおいて、ＧｉをＴＧＲ５と同時に発現させることにより、リガンド非添加時（リガンド（−））のルシフェラーゼ活性を大幅に低下させることができ、その結果リガンド（リトコール酸、２×１０^-5Ｍ、リガンド（＋））による活性の上昇を検出することが可能となった（図８）。
【０１０３】
実施例５ マウスおよびラット型ＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
配列番号：９で表されるオリゴＤＮＡをセンス鎖プライマー１として、配列番号：１０で表されるオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマー２として、各々０．４μＭ、GC2 DNA Polymerase（CLONTECH社製）０．３μｌ、5x Buffer 6μｌ、GC-Melt 6μｌ、dNTP (TaKaRa社製)0.2 mM、鋳型ＤＮＡとしてMarathon-Ready Mouse cDNA library (CLONTECH社製)の心臓ｃＤＮＡ溶液３μｌ、滅菌水９．９μｌからなる混合液３０μｌを調製し、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）を用いて、最初に９４℃で２０秒間置いた後、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして３５サイクル、最後に６８℃で７分伸長反応させるタッチダウンＰＣＲのプログラムでＰＣＲ反応を行った。次に、反応終了液の一部をエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、ＵＶ照射のもと分子量マーカー換算で１ｋｂ付近の位置にＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡに対応するバンドを確認した。次に塩基配列を決定する為にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）を用いてＴＡクローニングし、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中から外来ＤＮＡ断片が挿入されていたプラスミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより選択し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するためにABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いたシーケンス反応を製品添付資料の条件にしたがって、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）で行った後、該反応試料をＤＮＡシーケンサーABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)で分析した。
その結果、ＰＣＲ産物から配列番号：６で表される９９０塩基の塩基配列からなり、配列番号：５で表される新規の３２９個のアミノ酸、すなわちＴＧＲ５に相同性のある構造遺伝子配列を決定できた。配列番号：５を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をｍＴＧＲ５と命名した。さらに、この形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ５と命名した。
配列番号：１１で表されるオリゴＤＮＡをセンス鎖プライマー３として、配列番号：１２で表されるオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマー４として、各々0.4 μＭ、Advantage2 DNA Polymerase (CLONTECH社製)0.3μｌ、10x Buffer 3μｌ、dNTP (TaKaRa社製)0.2 ｍＭ、鋳型ＤＮＡとしてMarathon-Ready Rat cDNAlibrary (CLONTECH社製)の心臓ｃＤＮＡ溶液3μｌ、滅菌水18.9μｌからなる混合液30μｌを調製し、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）を用いて、最初に９４℃で２０秒間置いた後、９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして５サイクル、続いて９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして３５サイクル、最後に６８℃で７分伸長反応させるタッチダウンＰＣＲのプログラムでＰＣＲ反応を行った。次に、反応終了液の一部をエチジウムブロマイドを含む１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動後、ＵＶ照射のもと分子量マーカー換算で１ｋｂ付近の位置にＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡに対応するバンドを確認した。次に塩基配列を決定する為にｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）を用いてＴＡクローニングし、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中から外来ＤＮＡ断片が挿入されていたプラスミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより選択し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定するためにABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いたシーケンス反応を製品添付資料の条件にしたがって、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems社製)）で行った後、該反応試料をＤＮＡシーケンサーABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)で分析した。
その結果、ＰＣＲ産物から配列番号：８で表される９９０塩基の塩基配列からなり、配列番号：７で表される新規の３２９個のアミノ酸、すなわちＴＧＲ５に相同性のある構造遺伝子配列を決定できた。配列番号：７を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をrＴＧＲ５と命名した。
次に、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに挿入したＤＮＡ断片を、プライマー３、プライマー４に付加された制限酵素ＳａｌＩ、ＳｐｅＩサイトで酵素消化し、切り出されたｒＴＧＲ５の配列を持つＤＮＡ断片を、発現プラスミドｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ（Hinuma, S., Hosoya, M., Ogi., Tanaka, H., Nagai, Y., and Onda, H.（1994）Biochim. Biophys. Acta 1129, 251-259）のＳａｌＩ、ＳｐｅＩサイトに挿入し、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルに導入した。アンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で出現するアンピシリン耐性形質転換株のコロニーの中からｒＴＧＲ５断片が挿入されていたプラスミドを保持していたクローンをコロニーＰＣＲにより選択した。さらに、この形質転換体をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ１．１１Ｈ−ｒＴＧＲ５と命名した。
【０１０４】
実施例６ ウシ脾臓ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定の取得
ウシ脾臓ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１７で表されるプライマーｂＦおよび配列番号：１８で表されるプライマーｂＲを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ ｂＦ（１０μＭ）、０．５μｌ ｂＲ（１０μＭ）、２．５μｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５μｌ Advantage2 DNA polymerase（クローンテック社）、１７．５μｌ蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液を、Thermal Cycler9600（ＡＢＩ社）を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃２分の変性の後、９８℃１０秒、６３℃２０秒、７２℃６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約１０００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQiagen PCR purification Kit（キアゲン社）を用いて精製し、直接配列決定を行ったところ配列番号：１３の配列が得られた。配列番号：１３のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAbTGR5-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAbTGR5-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型ＴＧＲ５遺伝子であることを確認した。
【０１０５】
実施例７ ウサギ脾臓ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＴＧＲ５タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定の取得
ウサギ脾臓ｃＤＮＡを鋳型として、配列番号：１９で表されるプライマーｒａｂｂｉｔＦおよび配列番号：２０で表されるプライマーｒａｂｂｉｔＲを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ ｒａｂｂｉｔＦ（１０μＭ）、０．５μｌ ｒａｂｂｉｔＲ（１０μＭ）、２．５μｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５μｌ Advantage2 DNA polymerase（クローンテック社）、１７．５μｌ蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液を、ThermalCycler9600（ＡＢＩ社）を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃２分の変性の後、９８℃１０秒、６３℃２０秒、７２℃６０秒のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約１０００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQiagen PCR purification Kit（キアゲン社）を用いて精製し、直接配列決定を行ったところ配列番号：１５で表される塩基配列がえられた。配列番号：１５で表されるＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：１６で示す。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTArabbitTGR5-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTArabbitTGR5-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウサギ型ＴＧＲ５遺伝子であることを確認した。
【０１０６】
実施例８ ヒト、ウサギ、ウシ、マウスおよびラット型ＴＧＲ５の胆汁酸刺激によるレポーター遺伝子の発現量上昇の検出
実施例１に示したのと同様の方法により、動物細胞での発現用ベクターpAKKO-111Hに、実施例５に示したマウスおよびラット型ＴＧＲ５遺伝子、実施例６に示したウシ型ＴＧＲ５遺伝子、および実施例７に示したウサギ型ＴＧＲ５遺伝子を挿入してそれぞれの遺伝子の発現ベクターを作製した。これらとインサートが挿入されていない元の発現ベクターおよび実施例１に示したヒト型ＴＧＲ５発現ベクターを実施例４に示した方法に従い、抑制性Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇｉ）、レポータープラスミドとともにＣＨＯ−Ｍｏｃｋ細胞に一過性に発現させた。これを実施例３の方法に従い胆汁酸の刺激によるレポータ遺伝子の発現量を検出した。胆汁酸としてはタウロリトコール酸（ＴＣＬＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、をそれぞれ１０μＭで使用した。またレポーター遺伝子発現のポジティブコントロールとしてはフォルスコリン（ＦＳＫ、２μＭ）を用いた。その結果いずれの動物種由来のＴＧＲ５を発現させても、胆汁酸添加区で胆汁酸を添加しない区（Ｂａｓｅ）より高いルシフェラーゼ活性が検出された（図９）。このことからヒト型ＴＧＲ５と同様にウサギ、ウシ、マウスおよびラット型ＴＧＲ５も胆汁酸のレセプターとして作用することが示された。
【０１０７】
実施例９ ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性に対するタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）の抑制作用
ウサギ（ＮＺＷ、メス、体重２．５−３．０ｋｇ前後）から麻酔下にて血清および肺を採取した。ＰＢＳ（phosphate-buffered saline）を気管より注入して洗浄することにより、肺内の肺胞マクロファージ細胞を含む懸濁液を回収した。得られた細胞をさらにＰＢＳで洗浄後、培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したもの。いずれもGibcoBRL社）に懸濁し、単核細胞分離液であるＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（アマシャムファルマシア社）上に重層・遠心処理し、赤血球を除いた。単核細胞を培地にて洗浄後、０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに播種し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。培地を除き、ＴＬＣＡ１００μＭを加えた培地、あるいはコントロールの培地を０．５ｍｌ添加して、さらに１６時間培養した。同じウサギより採取した血清５０μｌ、加熱により殺菌処理した酵母懸濁液０．８×１０⁸／ｍｌを３０μｌ添加し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で４０分間培養した。０．１％フクシン液（和光純薬社）を６０μｌ添加した後、細胞をはがして遠心し、懸濁液を顕微鏡にて観察した。フクシンにより酵母は染色されるが肺胞マクロファージにより貪食された酵母は染色されないことを利用して、貪食活性を示したマクロファージの算定を行った。その結果、図１０に示すとおり、ＴＬＣＡを添加した場合において、マクロファージの免疫機能のひとつである貪食活性の著明な低下が認められた。
【０１０８】
実施例１０ ウサギ肺胞マクロファージにおける、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌に対するＴＬＣＡの抑制効果
実施例９の方法で採取したウサギ肺胞マクロファージを０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈し２４ウェルプレートで一晩培養後、ＬＰＳ刺激で誘導されるＴＮＦα分泌に対する影響を検討した。ＴＬＣＡ５０μＭを含む培地あるいはコントロール培地０．５ｍｌに交換して１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコントロール培地にＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ 和光純薬）を加えたもの（添加時の濃度１ｎｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下でさらに１２時間培養した。培養後、上清を回収し、ＴＮＦ感受性細胞株Ｌ９２９（理化学研究所）に対する増殖抑制作用を指標にＴＮＦα量を測定した。Ｌ９２９細胞を１．２×１０⁴／ｗｅｌｌにて９６ウェルプレートに播種し３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養後、肺胞マクロファージ培養上清を適当に希釈し、２μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ（和光純薬社）存在下で一晩培養した。標準サンプルとしてはヒト組み換え型ＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を使用した。Ｌ９２９細胞の増殖はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（和光純薬社）によって測定した。その結果、図１１に示すように、ＴＬＣＡを添加することにより、顕著なＴＮＦα分泌量の低下が認められた。
【０１０９】
実施例１１ ウサギ肺胞マクロファージの各種サイトカインｍＲＮＡ発現量に対するタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）の抑制作用
実施例９の方法で採取したウサギ肺胞マクロファージを０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈し６ウェルプレートで一晩培養後、ＴＬＣＡ１００μＭを含む培地あるいはコントロール培地１．５ｍｌに交換して１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコントロール培地にＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４、和光純薬社）を加えたもの（添加時の濃度１ｎｇ／ｍｌ）１．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下でさらに２時間培養した。培地を除去後、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）３ｍｌを加え、マニュアルにしたがい全ＲＮＡを調製した。１μｇの全ＲＮＡを、SuperScriptII逆転写酵素（Gibco BRL社）を用いてマニュアルに従いｃＤＮＡを合成し、２５ｎｇ 全ＲＮＡ／μｌに相当するｃＤＮＡ溶液を調製した。各種サイトカインのｍＲＮＡ発現量定量はABI prism 7700 Sequence Detector（ABI社）を用いて行った。各反応には配列番号：２１から３５で表されるそれぞれのサイトカインに特異的なプライマー、プローブを設計し使用した。ＰＣＲ反応液はUniversal PCR master mix（ABI社）１２．５μｌ、それぞれのプライマーを各々１００μＭのものを０．２２５μｌずつ、５μＭのプローブを１．２５μｌ、上記で調製したｃＤＮＡ溶液１μｌを加え、全量を蒸留水で２５μｌとした。それぞれのサンプルは５０℃で２分間、９５℃で１０分間置いた後、９５℃で１５秒、６０℃で１分のサイクルを４０回繰り返し定量のための反応を行った。その結果、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８のいずれのサイトカインにおいてもＴＬＣＡの添加により明らかに発現量が低下し、ウサギ肺胞マクロファージに対するＴＬＣＡによる各種のサイトカインのｍＲＮＡ発現抑制作用が見出された（図１２）。
【０１１０】
実施例１２ ＴＧＲ５遺伝子導入ＴＨＰ−１細胞の作製
ヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ−１にＴＧＲ５遺伝子を導入することによりＴＧＲ５高発現細胞を樹立した。まず、定法に従いヒトＴＧＲ５のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen社）に組み込んだｐｃＤＮＡ−ＴＧＲ５を作製した。ＴＨＰ−１を培地（ＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＢＳ）にて培養し、定法に従い、リポフェクトアミン（GibcoBRL社）を用いてｐｃＤＮＡ−ＴＧＲ５を導入した。その後、Ｇ４１８（GibcoBRL社）を培地に添加して耐性株を選択し、安定的にＴＧＲ５を高発現する細胞株、ＴＨＰ−ＴＧＲ５を樹立した。
【０１１１】
実施例１３ ＴＨＰ−ＴＧＲ５における、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌およびｍＲＮＡ発現量に対するＴＬＣＡの抑制効果実施例１２で得たＴＨＰ−ＴＧＲ５あるいはもとのＴＨＰ−１細胞を０．５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度に希釈して１０^-8Ｍのホルボールエステル（和光純薬）存在下で２４ウェルプレートで一晩培養後、ＬＰＳ刺激で誘導されるＴＮＦα分泌に対する影響を検討した。ＴＬＣＡ１００μＭを加えた培地あるいはコントロール培地０．５ｍｌにて１時間培養後、同濃度のＴＬＣＡ含有培地あるいはコントロール培地にＬＰＳを加えたもの（添加時の濃度５０ｎｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養した。培養後、上清を回収し、実施例１０と同じようにＴＮＦα含量をＬ９２９の増殖抑制活性により定量した。またＴＨＰ−１とＴＨＰ−ＴＧＲ５の全ＲＮＡはＬＰＳ添加の２時間後に細胞から実施例１１と同様の方法で調製した。ヒト型ＴＮＦα ｍＲＮＡの発現量はTaqMan Cytokine Gene Expression plate I（ＡＢＩ社）を使用して求めた。定量値はＴＨＰ−１細胞のＬＰＳ、ＴＬＣＡをともに添加しなかった区値を１とした時の相対値で示した。その結果、図１３に示すように、ＴＨＰ−ＴＧＲ５ではＴＬＣＡ添加により顕著なＴＮＦα分泌量の低下が認められた、一方、もとのＴＨＰ−１では顕著なＴＮＦα分泌抑制作用は見られなかった。またｍＲＮＡも同様にＴＬＣＡ添加による顕著な発現量の低下が認められた。これらのことから、ウサギ肺胞マクロファージで認められたＴＮＦα分泌抑制効果は明らかにＴＧＲ５を介したものであることが確認され、生体内においてＴＧＲ５がこうした免疫機能の制御に関わることが示された。
【０１１２】
実施例１４ ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質のタウロリトコール酸添加による細胞内移行
ＴＧＲ５のＣ末端に翻訳のフレーム合わせてオワンクラゲより単離されたGreen Fluorescent Protein（ＧＦＰ）ｃＤＮＡをつないだ融合タンパク質を発現させるための発現プラスミドを構築した。その際ＧＦＰ ｃＤＮＡにはＧＦＰの発現ベクターｐＱＢＩ２５（宝酒造）から切り出した断片を用いた。ＴＧＲ５はＰＣＲ法によりその終止コドンを制限酵素ＮｈｅＩの認識配列に修正し、ここにＧＦＰ断片を連結して、実施例１に記載の発現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入した。このようにして得たＴＧＲ５とＧＦＰの融合タンパク質（以下、ＴＧＲ５-ＧＦＰ）発現ベクターのプラスミド を以下の方法でＣＨＯ-ｍｏｃｋ細胞にトランスフェクションした。ＣＨＯ-ｍｏｃｋ細胞は増殖培地［ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）に１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を添加したもの］に懸濁し、０．６×１０⁵ｃｅｌｌｓ／チャンバーの濃度にてチェンバー数４つのＬａｂ−ＴｅｋIIカバーグラスチェンバー（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ社）にまき、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した後にトランスフェクションした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（GIBCO BRL社）を用いた。まずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^TM ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ ２μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ−I（GIBCO BRL社）５０μｌを混合し、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた後、上記のＣＨＯ細胞を培養したチェンバーに１００μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養した。培地を共焦点顕微鏡観察用培地［Ｈａｎｋｓ' Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）に０．１％ウシ アルブミン（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｆｒｅｅ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を懸濁したもの］に置き換え、共焦点顕微鏡（ライカ社）でＧＦＰの蛍光像を観察した。その際、ＧＦＰの励起は４８８ｎｍで行った。
その結果ＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質は細胞膜に観察された（図１４）。この細胞にタウロリトコール酸を１０^-5Ｍとなるように培地に添加３０分後には、ＧＦＰの蛍光が細胞膜ではなく、細胞質に移動していることが見出された（図１５）。このことはＴＧＲ５が細胞膜に発現するＧタンパク質共役型のレセプターであるとともに、ＴＧＲ５がタウロリトコール酸に反応して細胞質へ移行、すなわちインタナリゼーションしたことを示していた。
【０１１３】
実施例１５ タウロリトコール酸添加によるＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞でのＭＡＰキナーゼ活性化
実施例１で作製したＴＧＲ５発現ベクターを用いて公知の方法で作製した安定的なＴＧＲ５発現ＣＨＯ（ＣＨＯ−ＴＧＲ５）またはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞を３×１０⁵／ｗｅｌｌの濃度で６ウェルプレートに撒いて、血清低濃度培地（核酸不含ＭＥＭα培地に０．５％の透析ウシ胎児血清を添加したもの）にて一晩培養し、さらに無血清培地（核酸不含ＭＥＭα培地に０．１％ウシ血清アルブミンを添加したもの）に交換して一晩培養した。新しい無血清培地に交換して３時間培養後、２μＭのタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）を添加した。０−２０分インキュベーションしたのち、サンプルバッファー（TEFCO社）で細胞を溶解・抽出しＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離を行った。その後PhosphoPlus p44/42 MAP kinase（Thr202/Tyr204）Antibody Kit（Cell Signaling Technology, Inc）を用いたウエスタンブロッテイングを行った。その結果、図１６に示す通り、ＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞でのみ、ＴＬＣＡ添加後５分をピークにＭＡＰキナーゼのリン酸化によって示される当該タンパク質の活性化が起こることが分かった。
【０１１４】
実施例１６ ＴＧＲ５発現ＣＨＯ細胞における各種胆汁酸のｃＡＭＰ産生上昇活性
ＣＨＯ−ＴＧＲ５を２×１０⁴／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに撒いて一晩培養後、ｃＡＭＰ産生量の測定に用いた。アッセイ用バッファー（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミン、0.2mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMXを添加したもの）で細胞を２回洗浄し、３０分プレインキュベーションした。細胞を２回洗浄した後、アッセイ用バッファーに希釈したサンプルを細胞に添加して２０分間インキュベーションした。培養上清を捨てて、cAMP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を測定した。ポジティブコントロールとして、リトコール酸（ＬＣＡ）１０μＭを用いた。ｃＡＭＰ産生量はポジティブコントロールを１００％とした場合の％値で表した。その結果、図１７に示す通りタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、コール酸（ＣＡ）の順で濃度依存的なｃＡＭＰ産生の上昇が観察された。また、２μＭの濃度でその他の胆汁酸やコレステロール代謝化合物などによるＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるｃＡＭＰ産生上昇活性を比較し、その結果を図１８に示した。ＬＣＡ、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡのそれぞれにおいて、タウリン抱合体（Ｔ）、グリシン抱合体（Ｇ）、非抱合体（Ｆ）のいずれもｃＡＭＰ産生上昇活性を有することが分かった。
【０１１５】
実施例１７ ヒトＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布解析
ｍＲＮＡの発現量の定量にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。発現量の定量に用いるプライマーとプローブは、ヒト型ＴＧＲ５の塩基配列（配列番号：２）をもとにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ専用のソフトウエアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社）を利用してデザインした。鋳型となるｃＤＮＡは、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）１μｇからランダムプライマーを用いて４２℃で合成した。逆転写反応にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って反応を行い、反応終了後エタノール沈殿して１００μｌに溶解した。また分画したヒト血球由来のｃＤＮＡとしてはＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＹＴＣ^TM）ｐａｎｅｌｓ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ (クロンテック社)を使用した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒの反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）のマニュアルにしたがい、マスターミックスを１２．５μｌ、プライマーを０．９μＭ、プローブを０．２５μＭ、各サンプルのｃＤＮＡ溶液を１μｌで混ぜ合わせ、蒸留水で２５μlとして調製した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒでの反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、９５℃ １５秒、６０℃ １分のサイクルを４０回繰り返して行った。
ヒト各種組織でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現分布を図１９に示す。胎盤、脾臓、肺など免疫に関与する組織での高発現が見出された。またヒト血球でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現量を図２０に示す。ＣＤ１４を発現している血球、すなわち単球・マクロファージでの高発現が見出された。
【０１１６】
実施例１８ ウサギＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布解析
実施例１７と同様の方法でウサギ型ＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現量を求めた。用いたプライマーとプローブはウサギＴＧＲ５（配列番号：１５）をもとにデザインした。ウサギの各種組織由来の全ＲＮＡは、北山ラベス社より購入したＮＺＷ雌性 体重２．５−３．０ｋｇ前後の個体より各組織を取得し、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）を用い、付属のマニュアルにしたがって調製した。ｃＤＮＡは調製した全ＲＮＡ １μｇから実施例１７と同様の方法で合成した。ただし逆転写反応後は４０μｌに溶解した。
ウサギ型ＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現は図２１に示したように、免疫に関与する脾臓、肺胞マクロファージや胸腺で高発現していた。
【０１１７】
実施例１９ ＴＬＣＡによるウサギ肺胞マクロファージのｃＡＭＰ産生上昇
実施例９の方法で調製したウサギ肺胞マクロファージを培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したもの）に懸濁し２×１０⁵／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに撒き一晩培養した。細胞をＤＭＥＭに０．１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＩＢＭＸを加えた培地で２回洗浄した後、同じ培地に希釈したＴＬＣＡ ２００μＭあるいは培地を添加して４分間インキュベーションした。cAMP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を測定した結果、図２２に示す通りＴＬＣＡ添加によりｃＡＭＰ産生量の上昇が認められた。
【０１１８】
実施例２０ ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性におよぼす各種胆汁酸の抑制効果
実施例９の方法に従い、ウサギ肺胞マクロファージを調製し、各種胆汁酸による貪食能抑制効果を検討した。その結果、図２３に示すとおり、ＴＬＣＡの他、ＧＬＣＡ、ＬＣＡを１００μＭにて添加した場合において、マクロファージの免疫機能のひとつである貪食活性の著明な低下が認められた。
【０１１９】
実施例２１ ウサギ肺胞マクロファージからのＴＮＦα分泌に対する胆汁酸の抑制効果
実施例９の方法で調製したウサギ肺胞マクロファージを培地（ＤＭＥＭに２％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したもの）に懸濁し０．２５×１０⁶／ｗｅｌｌの濃度で２４ウェルプレートに撒き一晩培養した。同じ培地を用いて胆汁酸を希釈してグラフに表示した濃度にて肺胞マクロファージに添加して１時間培養した。さらに、同じ濃度の胆汁酸サンプルにリポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ 和光純薬）を添加したものを追加して加え、１２時間培養した。ＬＰＳの濃度は１ｎｇ／ｍｌにて加えた。培養後、培養上清を回収し、実施例１０と同様に上清中のＴＮＦαを定量した。その結果、図２４に示す通り、ＴＧＲ５にアゴニスト活性を示す胆汁酸の添加により濃度依存的にＴＮＦα分泌量の抑制活性が認められた。
【０１２０】
実施例２２ ＴＧＲ５遺伝子を導入したＴＨＰ−１細胞におけるｃＡＭＰ産生上昇
ＴＨＰ−１あるいは実施例１２で得たＴＧＲ５高発現細胞株ＴＨＰ−ＴＧＲ５をアッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ ＢＳＡと１ｍＭ ＩＢＭＸを添加したもの）で洗浄後、１×１０⁵／ｗｅｌｌにて９６ウェルプレートに撒いた。上記アッセイ用培地にて希釈した胆汁酸を添加して２０分間インキュベーションした。その後cAMP Screen System（ＡＢＩ）によってｃＡＭＰ産生量を測定した結果、図２５に示す通りＴＨＰ−ＴＧＲ５においてＴＬＣＡ、ＬＣＡ、ＤＣＡ添加によるｃＡＭＰ産生量の上昇が認められた。一方ＴＨＰ−１ではＴＬＣＡによるｃＡＭＰ産生上昇は認められないことから、これらの胆汁酸によるｃＡＭＰ上昇はＴＧＲ５を介した反応であることが確かめられた。
【０１２１】
実施例２３ ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−ＴＧＲ５からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の抑制効果
実施例１３と同様にＴＨＰ−ＴＧＲ５あるいはＴＨＰ−１細胞を処理し、ＬＰＳで刺激されたＴＮＦα分泌に対する各種胆汁酸の抑制効果を検討した。ＬＰＳ刺激は１２時間とし、培養上清を回収後、実施例１３と同じく、バイオアッセイによるＴＮＦα含有量の測定を行った。その結果、図２６に示す通り、ＴＨＰ−ＴＧＲ５では胆汁酸の濃度依存性にＴＮＦα分泌量の低下が認められた。一方、ＴＨＰ−１では顕著なＴＮＦα分泌抑制作用は見られなかった（図２７）。これらのことから、ウサギ肺胞マクロファージで認められたＴＮＦα分泌抑制効果は明らかにＴＧＲ５を介したものであることが確認され、生体内においてＴＧＲ５がこうした免疫機能の制御に関わることが示された。
【０１２２】
参考例１ ヒト染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ７ ＤＮＡの増幅
ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、２種の合成プライマー（配列番号：４２および配列番号：４３）を用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行なった。合成プライマーはレセプタータンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されるように、５’側および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体ＤＮＡ（タカラ）0.5μg、合成DNAプライマー各1μM、0.8 mM dNTPs、1 mM MgCl₂、KODポリメラーゼ（トーヨーボー）1μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（タカラ）を用い、94℃・60秒の加熱の後、98℃・15秒、65℃・2秒、74℃・30秒のサイクルを35回繰り返した。増幅産物の確認は、0.8%アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【０１２３】
参考例２ ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ＤＮＡ配列の確認
参考例１で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。pCR-Script^TM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH5αcompetent cell（トーヨーボー）に導入して形質転換した後、ＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体E. coli DH5α/GPR7を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAwell 8 Plasmid Kit （キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部に対して制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩによる切断を行ない、挿入されているレセプターＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems社)を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：３９）。配列番号：３９で表わされる塩基配列を有するDNAを保持するpCR-Script Amp SK(+)プラスミドを、pCR-ScriptヒトGPR7と命名した。配列番号：３９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡがコードするヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を配列番号：３８に示した。ここで配列を決定したヒトＧＰＲ７のＤＮＡ配列はＯ’Ｄｏｗｄらの報告（O'Dowd, B. F. et al.、Genomics、28巻、84-91頁、1995年）にあるＤＮＡ配列とは２塩基が異なっていた。これらは配列番号：３９の８９３番目および８９４番目に当たり、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告ではそれぞれＣおよびＧであるが、本参考例ではＧおよびＣであった。これにより、翻訳されるアミノ酸配列において配列番号：３８の２９６番目のアミノ酸が、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告のＴｈｒが本実施例ではＳｅｒとなる。
【０１２４】
参考例３ ヒト全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガンド前駆体遺伝子の取得と発現プラスミドの構築
クローンテック社より購入したヒト全脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
GSF1: 5'-GTCGACATGGCCCGGTCCGCGACACTGGCGGCC-3'（配列番号：４０）
GSR2: 5'-GCTAGCAGCGGTGCCAGGAGAGGTCCGGGCTCA-3'（配列番号：４１）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１μｌ、０．５μｌ GSF1（10 μM）、０．５μｌ GSR2（１０μＭ）、２．５μｌ添付の１０×反応液、２．５μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５μｌ KlenTaq（クローンテック）、１７．５μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５μｌにした。反応液を、ThermalCycler9600を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５℃２分の変性の後、９８℃１０秒、６０℃２０、７２℃２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をQIAGEN PCR purification Kitを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２８（配列番号：３７）で示す配列がえられた。図２８のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図２９（配列番号：３６）に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌JM109/pTAhGPR7-1を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドpTAhGPR7-1をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図２８と同じヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡであることを確認した。次にそのプラスミドから制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化後約０．４ｋｂのヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡ断片を得た。さらに、動物細胞用の発現ベクターであるpAKKO-111Hはマルチクローニングサイト部分の制限酵素サイトＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の操作によって調製したヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡ断片および発現ベクターをライゲーションによって連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換してE.coli JM109/pAK-S64を得た。
形質転換体E.coli JM109/pAK-S64を培養し、プラスミドpAK-S64のDNAを大量に調製した。
【０１２５】
参考例４ ＧＰＲ７発現プラスミドおよびレポータープラスミドのチャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞での一過的な発現
参考例３で得たヒト型ＧＰＲ７ ＤＮＡを、公知の方法により動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ-111Ｈに挿入したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたコロニーを単離・培養後、QIAGEN Plasmid Maxi Kit（キアゲン社）を用いてＧＰＲ7発現プラスミドＤＮＡの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたpCRE-Luc（クロンテック社）のプラスミドＤＮＡを同様の方法で調製した。
ＧＰＲ７発現プラスミドおよびpCRE-Lucはレセプター遺伝子を挿入していない発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞に一過性に発現させた。ＣＨＯ細胞は９６−ウェルプレート（コーニングコースター社）に40,000 細胞/ウェル、培養液量１００μｌで播種し、３７℃で一晩培養した。プレート上での培養にはＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium, GibcoBRL社）に１０％のウシ胎児血清のみを添加した培地を用いた。
各プラスミドは240ng/μlの濃度に希釈し、ＧＰＲ７の発現プラスミド９μｌとpCRE-Luc １μｌの割合で２４０μｌのOpti-MEM-I（GibcoBRL社）に添加した。これを、同じく２４０μｌのOpti-MEM-Iに１０μｌのリポフェクトアミン2000（GibcoBRL社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドＤＮＡの複合体を形成させた。これを25μl/wellずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４時間後に培養液をアッセイバッファー（０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換して無血清化し、３７℃で一晩培養した。
【０１２６】
参考例５ リガンド遺伝子のＣＨＯ細胞での発現
参考例４で作製したヒト型リガンドｃＤＮＡを挿入した動物細胞用発現プラスミドpAK-S64を参考例５と同様の方法でCHO細胞に一過性に発現させた。ただし細胞は6-ウェルプレート（ファルコン社）に600,000細胞/ウェルで播種し、一晩培養の後、リガンド遺伝子プラスミドを導入した。240ng/μlの濃度に希釈したプラスミドを10 μlと240 μlのOpti-MEM-Iに添加し、これを、同じく240 μlのOpti-MEM-Iに10 μlのリポフェクトアミン2000を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン2000に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドDNAの複合体を形成させた。これを500μl/ウェルずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４時間後に培養液をアッセイバッファーに交換し、無血清化をおこなった。培地交換の１８時間後に各ウェルの培地を回収しリガンドペプチドを含むＣＨＯ細胞培養上清を得た。
【０１２７】
実施例２４ レポーターアッセイによるリガンド活性の検出
参考例４の方法に従いＧＰＲ７を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養液に、参考例５で調製したpAK-S64発現培養上清および終濃度2 μMとなるようにホルスコリンを添加した。またリガンド遺伝子を挿入していない空の発現ベクター（ｐAKKO-111H）を参考例５の方法で一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養上清も同様に添加した。その際発現上清はアッセイバッファーにて２倍、４倍、８倍、１６倍に希釈した。上清を添加してから４時間、３７℃でインキュベーションを行ない、レセプターを介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、PicaGene LT2.0 （東洋インキ社）発光基質を５０μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する発光量をプレートリーダー（ARVOsxマルチラベルカウンター、PerkinElmer社）を用いて測定した。その結果、ｐAK-S64の培養上清を添加した際にのみレポーター遺伝子の発現抑制がルシフェラーゼ活性の低下として検出された(図３０)。さらに、この抑制の程度はｐAK-S64の培養上清の濃度依存的であった。このことはpAK-S64に挿入されたプラスミドによって発現した産物が、ＧＰＲ７を介した細胞内のシグナルを伝達した、すなわちＧＰＲ７のリガンドとして作用したことを示している。
【０１２８】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法／キットを用いることにより、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とリガンドであるコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩が得られ、該化合物またはその塩は、中枢疾患(例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など)、炎症性疾患(例えば、アレルギー、喘息、リュウマチなど)、循環器疾患(例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等)、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、肥満などの予防および／または治療等の医薬等として用いることができる。
本発明の、リガンドが決定されていないレセプタータンパク質のリガンドの決定方法では、各種の細胞系が使用できるため簡便であり、かつ短時間で測定等を実施することができる。
【０１２９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す。
【図２】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す（図１に続く）。
【図３】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す（図２に続く）。
【図４】参考例１で得られたＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表記）を示す（図３に続く）。
【図５】ＴＧＲ５の疎水性プロット図である。
【図６】ＴＧＲ５発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（Ａ）およびもとのベクターのみを導入したＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）における、コレステロール代謝関連物質による活性の検出（ｎ＝２）の結果を示す。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞におけるリガンド刺激に対するレポーター遺伝子の発現誘導の結果を示す。
【図８】Ｇｉを用いたＴＧＲ５のリトコール酸に対する反応の結果を示す。
【図９】ヒト（Ｂ）、ウサギ（Ｃ）、ウシ（Ｄ）、マウス（Ｅ）およびラット（Ｆ）型ＴＧＲ５の胆汁酸刺激によるレポーター遺伝子の発現量上昇。胆汁酸はすべて１０μＭとなるように培地に添加した。Ａはコントロール（プラスミドのみ）を示す。
【図１０】ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性に対するＴＬＣＡ（１００μＭ）の抑制効果。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図１１】ウサギ肺胞マクロファージにおける、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌に対するＴＬＣＡ（５０μＭ）の抑制効果。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図１２】ウサギ肺胞マクロファージに対するＴＬＣＡによる各種のサイトカインのｍＲＮＡ発現抑制作用を示す。Ａ：ＴＮＦα；Ｂ：ＩＬ−１α；Ｃ：ＩＬ−１β；Ｄ：ＩＬ−６；Ｅ：ＩＬ−８のサイトカインの場合を表す。
【図１３】ＴＨＰ−ＴＧＲ５における、リポ多糖（ＬＰＳ）で誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの分泌およびｍＲＮＡ発現量に対するＴＬＣＡ（１００μＭ）の抑制効果。分泌量：ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。ｍＲＮＡ発現量：ｎ＝２の平均値。
【図１４】ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質の局在を示す。図中の白線は４μｍを示す。
【図１５】ＴＧＲ５−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞にＴＬＣＡを添加して３０分後の融合タンパク質の局在を示す。図中の白線は４μｍを示す。
【図１６】ＴＬＣＡによるＣＨＯ−ＴＧＲ５でのＭＡＰキナーゼ活性化の検出を表す。
【図１７】ＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるＴＬＣＡ、ＬＣＡ、ＤＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡのｃＡＭＰ産生上昇活性を表す。ｎ＝３の平均値。グラフ中の構造式は胆汁酸を示す。
【図１８】各種胆汁酸関連化合物（２μＭ）によるＣＨＯ−ＴＧＲ５におけるｃＡＭＰ産生上昇活性の比較を示す。ｎ＝３の平均値。ＴＴＮＰＢは（Ｅ）−［（テトラヒドロテトラメチルナフタレニル）プロピル］ベンゾイックアシッドの略称を表す。
【図１９】ヒト各組織でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布を示す。
【図２０】ヒト血球でのＴＧＲ５ ｍＲＮＡ発現分布を示す。
【図２１】ウサギＴＧＲ５ ｍＲＮＡの発現分布を示す。
【図２２】ＴＬＣＡによるウサギ肺胞マクロファージのｃＡＭＰ産生上昇を示す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２３】ウサギ肺胞マクロファージの貪食活性におよぼす各種胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２４】ウサギ肺胞マクロファージからのＴＮＦα分泌に対する胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２５】胆汁酸添加によるＴＨＰ−ＴＧＲ５細胞でのｃＡＭＰ産生上昇を示す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２６】ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−ＴＧＲ５からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の抑制効果を表す。ｎ＝３の平均値。＊＊，ｐ＜０．０１で有意。
【図２７】ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α分泌に対する各種胆汁酸の影響を表す。ｎ＝３の平均値。
【図２８】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図２９】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図３０】リガンド発現ベクターpAK-S64および空の発現ベクター(pAKKO-111H)を発現させたＣＨＯ細胞の培養上清を、ＧＰＲ７ ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培地にホルスコリン（ＦＳＫ）とともに添加し、リガンド刺激によるルシフェラーゼ活性の抑制を検出した結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a screening method using a novel G protein-coupled receptor protein derived from human spleen or a salt thereof and a cholesterol metabolism-related substance as a ligand, a novel G protein-coupled receptor protein derived from mouse, rat, bovine or rabbit and its The present invention relates to a method for determining ligands for DNA and orphan receptors.
[0002]
[Prior art]
Many physiologically active substances such as hormones and neurotransmitters regulate biological functions through specific receptor proteins present in cell membranes. Many of these receptor proteins perform intracellular signal transduction through activation of conjugated guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes referred to as G protein), and seven transmembrane regions Since they have a common structure, they are collectively referred to as G protein-coupled receptor protein or 7-transmembrane receptor protein (7TMR).
G protein-coupled receptor protein is present on the surface of each functional cell of living cells and organs and is physiologically used as a target for molecules, such as hormones, neurotransmitters and physiologically active substances, that regulate the functions of these cells and organs. It plays an important role. The receptor transmits a signal into the cell through binding with a physiologically active substance, and various signals such as activation and suppression of the cell are induced by this signal.
To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various living organisms and their specific receptor proteins, particularly G protein-coupled receptor proteins, And provide a very important tool for drug development closely related to their functions.
[0003]
For example, in various organs of a living body, physiological functions are regulated under the regulation by many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In particular, physiologically active substances are present at various sites in the living body, and their physiological functions are regulated through the corresponding receptor proteins. There are many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the body, and the structures of their receptor proteins have not been reported so far. In addition, many of the known receptor proteins do not know whether subtypes exist.
Clarifying the relationship between a substance that regulates a complex function in a living body and its specific receptor protein is a very important means for drug development. In addition, in order to efficiently screen for agonists and antagonists to receptor proteins and to develop pharmaceuticals, it is necessary to elucidate the functions of the receptor protein genes expressed in vivo and to express them in an appropriate expression system. It was necessary.
In recent years, as a means of analyzing a gene expressed in a living body, research for analyzing a cDNA sequence at random has been actively conducted, and a cDNA fragment sequence thus obtained is expressed by an Expressed Sequence Tag (EST). ) Registered in the database and published. However, many ESTs have only sequence information, and it is difficult to estimate their functions.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, substances that inhibit the binding between a G protein-coupled receptor protein and a physiologically active substance (that is, a ligand), or substances that bind to cause a signal transmission similar to that of a physiologically active substance (that is, a ligand) As specific antagonists or agonists, they have been utilized as pharmaceuticals that regulate biological functions. Therefore, the discovery of a novel G protein-coupled receptor protein that is not only important for physiological expression in vivo, but can also be a target for drug development, and cloning its gene (for example, cDNA) is novel. It becomes a very important means in finding specific ligands, agonists and antagonists of G protein-coupled receptor proteins.
However, not all G protein-coupled receptors have been found, and there are still many unknown G protein-coupled receptors and so-called orphan receptors for which no corresponding ligand has been identified. The search for new G protein-coupled receptors and the elucidation of their functions are eagerly desired.
The G protein-coupled receptor is useful for searching for a new physiologically active substance (that is, a ligand) using its signal transduction action as an index, and for searching for an agonist or antagonist for the receptor. On the other hand, even if a physiological ligand is not found, it is possible to produce an agonist or antagonist for the receptor by analyzing the physiological action of the receptor from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor. . These ligands, agonists or antagonists for the receptor can be expected to be used as preventive and / or therapeutic agents and diagnostic agents for diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptors.
Furthermore, a reduction or enhancement of the function of the receptor in a living body based on a gene mutation of a G protein-coupled receptor often causes some disease. In this case, not only administration of antagonists and agonists to the receptor, but also gene therapy by introducing the receptor gene into a living body (or a specific organ) or introducing an antisense nucleic acid to the receptor gene. You can also In this case, the base sequence of the receptor is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the gene of the receptor is used for prevention of diseases associated with dysfunction of the receptor and / or It can also be applied to therapeutic drugs and diagnostic drugs.
On the other hand, in the conventional method for searching and determining ligands and the like, for example, when screening for a binding molecule to a receptor using cells derived from eukaryotes, conventionally, a so-called stable cell line (stable cell) that stably expresses the receptor is used. cell line) had to be established, and special cells were required to establish this cell line. Moreover, a combination of a plurality of measurements is necessary for screening, and when there are a plurality of test compounds, it takes time, so that it is difficult to carry out. In other words, conventional methods for searching and determining ligands and the like are (1) limited cell lines that can be used, (2) it takes time to establish the cell lines, and (3) to combine multiple measurement methods. In addition, when the number of specimens increases, there are problems such as difficulty in implementation. In order to solve these problems, it is desired to develop a method capable of using various cell lines and performing measurement and the like in a short time.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of extensive research, the present inventors have found a screening method that does not require a special cell line. Furthermore, the present inventors have found that a ligand for a G protein-coupled receptor protein derived from human spleen is a substance related to cholesterol metabolism. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention
[1] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as that represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof, and (2) cholesterol A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and a cholesterol metabolism-related substance, characterized by using a metabolic related substance;
[2] The screening method according to [1] above, using a G protein-coupled receptor protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof,
[3] The screening method according to [1] above, using a G protein-coupled receptor protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof,
[4] The screening method according to [1] above, which uses a G protein-coupled receptor protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof,
[5] The screening method according to [1] above, which uses a G protein-coupled receptor protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof,
[6] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof, and (2) cholesterol A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the receptor protein or a salt thereof and a cholesterol metabolism-related substance, which comprises a metabolism-related substance;
[7] Amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with a cholesterol metabolism-related substance obtainable using the screening method of [1] above or the screening kit of [6] above A compound or a salt thereof that changes the binding property to a G protein-coupled receptor protein containing the sequence or a salt thereof,
[8] A medicament comprising the compound or salt thereof according to [7] above,
[9] Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method described in [1] above or the screening kit described in [6] above. A prophylactic and / or therapeutic agent for an inflammatory disease or hyperimmune reaction after transplantation, comprising an agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof,
[10] Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method described in [1] above or the screening kit described in [6] above. A prophylactic and / or therapeutic agent for immunodeficiency or infectious disease comprising an antagonist to G protein-coupled receptor protein or a salt thereof,
[11] Same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained for mammals using the screening method described in [1] above or the screening kit described in [6] above. A method for preventing and / or treating an inflammatory disease or hyperimmune reaction after transplantation medical treatment, which comprises administering an effective amount of an agonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the amino acid sequence of
[12] Same or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained for mammals using the screening method according to [1] above or the screening kit according to claim 6. A method for preventing and / or treating immunodeficiency or infection, comprising administering an effective amount of an antagonist to a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence or a salt thereof,
[13] Obtained using the screening method described in [1] above or the screening kit described in [6] above for producing an agent for preventing and / or treating hyperimmune reaction after inflammatory disease or transplantation medicine. Use of an agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
[14] SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method described in [1] above or the screening kit described in [6] above for producing an agent for preventing and / or treating immunodeficiency or infectious disease Use of an antagonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as represented by:
[15] Inflammation comprising a compound that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof Preventive and / or therapeutic agent for hyperimmune reaction after sexually transmitted disease or transplantation medicine,
[16] Immunity comprising a compound that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or a salt thereof Preventive and / or therapeutic agent for insufficiency or infection,
[17] A compound or salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for mammals A method for preventing and / or treating an inflammatory disease or hyperimmune reaction after transplantation, characterized by administering an effective amount of
[18] A compound or salt thereof that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for mammals A method for preventing and / or treating an immunodeficiency or infection characterized by administering an effective amount of
[19] G protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing a preventive and / or therapeutic agent for hyperimmune reaction after inflammatory disease or transplantation medicine Use of a compound or salt thereof that increases the expression level of a conjugated receptor protein or salt thereof,
[20] A G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic and / or therapeutic agent for immunodeficiency or infection Use of a compound or a salt thereof that reduces the expression level of the salt,
[21] After an inflammatory disease or transplantation medical treatment comprising a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide or a salt thereof Preventive and / or therapeutic agent for hyperimmune reaction of
[22] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof. Preventive and / or therapeutic agent for hyperimmune reaction after inflammatory disease or transplantation medicine,
[23] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof. Central diseases, inflammatory diseases, cardiovascular diseases, cancer, respiratory diseases, diabetes, immune system diseases, liver / gallbladder diseases, gastrointestinal diseases, infectious diseases, obesity or diagnostic agents for hyperimmunity after transplantation,
[24] An immunodeficiency or infectious disease comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Preventive and / or therapeutic agent for
[25] Central disease or inflammation comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1. Diseases, cardiovascular diseases, cancer, respiratory diseases, diabetes, immune system diseases, liver / gallbladder diseases, gastrointestinal diseases, infectious diseases, obesity or diagnostic agents for hyperimmunity after transplantation,
[26] A base complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof A prophylactic and / or therapeutic agent for immunodeficiency or infectious disease, comprising an antisense polynucleotide comprising the sequence or a part thereof;
[27] A base complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof Central disease, inflammatory disease, cardiovascular disease, cancer, respiratory disease, diabetes, immune system disease, liver / gallbladder disease, gastrointestinal disease comprising antisense polynucleotide comprising the sequence or a part thereof , Diagnostics of hyperimmune reaction after infection, obesity or transplantation medicine,
[28] An effective amount of a G protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is administered to a mammal A method for preventing and / or treating an inflammatory disease or hyperimmune reaction after transplantation,
[29] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for mammals A method for preventing and / or treating an inflammatory disease or hyperimmune reaction after transplantation, characterized by administering an effective amount of nucleotides;
[30] An effective amount of an antibody against a G protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for a mammal A method of preventing and / or treating an immunodeficiency or infection characterized by administration,
[31] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for mammals A method for preventing and / or treating immune deficiency or infection, comprising administering an effective amount of an antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide or a part thereof;
[32] G containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing an agent for preventing and / or treating hyperimmune reaction after inflammatory disease or transplantation medical treatment Use of a protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof;
[33] A G containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic and / or therapeutic agent for hyperimmune reaction after inflammatory disease or transplantation medicine Use of a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof,
[34] A G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic and / or therapeutic agent for immunodeficiency or infection, Use of an antibody against the partial peptide or a salt thereof,
[35] A G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing an agent for preventing and / or treating immunodeficiency or infection Use of an antisense polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the partial peptide or a part thereof,
[36] An amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 (provided that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, characterized by containing
[37] A partial peptide of the G protein-coupled receptor protein according to [36] or a salt thereof,
[38] A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the G protein-coupled receptor protein of [36] above or the partial peptide of [37] above,
[39] The polynucleotide according to [38] above, which is DNA,
[40] The polynucleotide according to [38] above, which has the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15,
[41] A recombinant vector containing the polynucleotide according to [38] above,
[42] A transformant transformed with the recombinant vector according to [41] above,
[43] The G protein-coupled receptor protein of the above-mentioned [36], which comprises culturing the transformant of the above-mentioned [42] and producing the G-protein-coupled receptor protein of the above-mentioned [36] Salt production method,
[44] An antibody against the G protein-coupled receptor protein of [36] above or the partial peptide of [37] above or a salt thereof,
[45] The antibody according to [44], which is a neutralizing antibody that inactivates signal transduction of the G protein-coupled receptor protein according to [36],
[46] A diagnostic agent comprising the antibody according to [44] above,
[47] Diagnostic agent for central disease, inflammatory disease, cardiovascular disease, cancer, respiratory disease, diabetes, immune system disease, liver / gallbladder disease, gastrointestinal disease, infection, obesity or hyperimmune reaction after transplantation The diagnostic agent according to the above [46],
[48] A medicament comprising the antibody according to [44] above,
[49] The medicament according to the above [48], which is a preventive and / or therapeutic agent for immunodeficiency or infectious disease,
[50] A medicament comprising the G protein-coupled receptor protein according to [36] above, a partial peptide thereof or a salt thereof,
[51] The medicament of the above-mentioned [50], which is a prophylactic and / or therapeutic agent for an inflammatory disease or a hyperimmune reaction after transplantation medicine,
[52] A medicament comprising the polynucleotide according to [38] above,
[53] The medicament according to the above [52], which is a prophylactic and / or therapeutic agent for an inflammatory disease or a hyperimmune reaction after transplantation medical care,
[54] A diagnostic agent comprising the polynucleotide according to [38] above,
[55] Diagnostic agent for central disease, inflammatory disease, cardiovascular disease, cancer, respiratory disease, diabetes, immune system disease, liver / gallbladder disease, gastrointestinal disease, infection, obesity or hyperimmune reaction after transplantation The diagnostic agent according to [54] above,
[56] An antisense polynucleotide comprising a base sequence complementary to the polynucleotide of [38] above or a part thereof,
[57] A medicament comprising the antisense polynucleotide according to [56] above,
[58] The medicament of the above-mentioned [57], which is a preventive and / or therapeutic agent for immunodeficiency or infectious disease,
[59] A diagnostic agent comprising the antisense polynucleotide according to [56] above,
[60] Diagnostic agents for central diseases, inflammatory diseases, cardiovascular diseases, cancer, respiratory diseases, diabetes, immune system diseases, liver / gallbladder diseases, gastrointestinal diseases, infections, obesity or hyperimmune reactions after transplantation The diagnostic agent according to [59] above,
[61] A test compound is added to an animal cell containing a plasmid that expresses a receptor protein for which a ligand has not been determined and contains a DNA encoding a reporter protein downstream of a cAMP response element / promoter, A method for determining a ligand for the receptor protein, comprising measuring the activity of
[62] An animal cell containing (1) a plasmid containing a DNA encoding a receptor protein whose ligand has not been determined, and (2) a plasmid in which a DNA encoding a reporter protein is linked downstream of the cAMP response element / promoter. Culturing, adding a test compound and measuring the activity of the reporter protein, [61]
[63] The method described in [61] or [62] above, wherein the receptor protein is a G protein-coupled receptor protein,
[64] G protein in which the G protein-coupled receptor protein contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16. The method according to [63] above, which is a conjugated receptor protein,
[65] The method according to [61] or [62] above, wherein the promoter is a TATA-like sequence,
[66] The method described in [61] or [62] above, wherein the reporter protein is luciferase,
[67] The method according to [61] or [62] above, wherein the plasmid is obtained by ligating a gene encoding a TATA-like promoter and a reporter protein downstream of the cAMP response element.
[68] The method according to [61] or [62] above, wherein the animal cell expresses two or more types of receptor proteins whose ligands have not been determined,
[69] The method according to [61] or [62] above, wherein the cell comprises a plasmid containing a gene encoding the inhibitory G protein α subunit Gi.
[70] The method of the above-mentioned [61] or [62], wherein forskolin is further added,
[71] The method described in [68] above, wherein two or more types of receptor proteins have similar characteristics,
[72] The method described in [68] above, wherein the similar characteristic is the basic expression level of the reporter protein and / or the expression level of the reporter protein when forskolin is added,
[73] The basic expression level of the reporter protein when each of two or more types of receptor proteins is expressed alone and / or the expression level of the reporter protein when forskolin is added are measured, and the expression level of the reporter protein is The present invention relates to the method described in [68] above, wherein two or more types of receptor proteins having the same level are expressed in combination.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The G protein-coupled receptor protein used in the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention) is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: : A receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 16.
The receptor protein of the present invention is, for example, any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, etc.) of a human or other mammal (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.). Pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer) Cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stroma Cells, or precursor cells of these cells, stem cells, cancer cells, etc.) or blood cells, or any tissue in which these cells exist, such as the brain, each part of the brain (eg, Sphere, cephalic nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, nigroplasm) , Spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular The protein may be derived from a gland, peripheral blood, peripheral blood cell, prostate, testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, or the like, or may be a synthetic protein.
[0008]
As an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, for example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16. Among them, an amino acid sequence having a homology of preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more is preferable.
Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 of the present invention include, for example, a sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, having substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, A protein having substantially the same quality of activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 is preferred.
Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal information transmission action. Substantially homogeneous means that their activities are homogeneous in nature. Accordingly, the activities such as ligand binding activity and signal signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
The measurement of activities such as ligand binding activity and signal information transmission activity can be performed according to a known method. For example, it can be measured according to a ligand determination method or a screening method described later.
[0009]
The receptor protein of the present invention includes (1) one or more of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 ( Preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acid sequences deleted. (2) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, 1 or 2 or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably number (1-5) amino acid sequences added, (3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 One more An amino acid sequence in which two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are substituted with other amino acids, or (4) ▼ Proteins containing amino acid sequences combining them are also used.
[0010]
The receptor protein in this specification has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide notation. The receptor protein of the present invention, including the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminus having a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ^- ), Amide (-CONH ₂ ) Or ester (—COOR).
Here, R in the ester is, for example, C such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. _1-6 Alkyl groups such as C, such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc. _3-8 A cycloalkyl group such as phenyl, α-naphthyl and the like _6-12 Aryl groups such as phenyl-C such as benzyl, phenethyl and the like _1-2 Alkyl groups or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl _1-2 C such as alkyl group _7-14 In addition to the aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group that is widely used as an oral ester is used.
When the receptor protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the receptor protein of the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
Furthermore, in the receptor protein of the present invention, the amino group of the N-terminal methionine residue is a protecting group (for example, a C-form such as formyl group, acetyl, etc.). _2-6 C such as alkanoyl group _1-6 An acyl group and the like, a glutamyl group produced by cleavage of the N-terminal side in vivo, pyroglutamine oxidized, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, C such as formyl group and acetyl). _2-6 C such as alkanoyl group _1-6 Examples thereof include those protected with an acyl group or the like, or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
Specific examples of the receptor protein of the present invention include a receptor protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, and the like. It is done.
[0011]
The partial peptide of the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as partial peptide) may be any peptide as long as it is a partial peptide of the receptor protein of the present invention described above. Among these receptor protein molecules, those exposed to the outside of the cell membrane and having substantially the same receptor binding activity are used.
Specifically, as a partial peptide of a receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, cells in hydrophobic plot analysis A peptide comprising a portion analyzed to be an outer region (hydrophilic site). In addition, a peptide partially including a hydrophobic site can be used as well. Peptides containing individual domains can also be used, but a peptide containing a portion containing a plurality of domains may be used.
The number of amino acids of the partial peptide of the present invention is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more, among the constituent amino acid sequences of the receptor protein of the present invention described above. . The substantially identical amino acid sequence is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, and particularly preferably about 90% or more with these amino acid sequences. Most preferably amino acid sequences having about 95% or more homology.
Here, “substantially the same receptor activity” has the same meaning as described above. The measurement of “substantially the same receptor activity” can be performed in the same manner as described above.
[0012]
In the partial peptide of the present invention, one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acids One or more (preferably about 1 to 10, more preferably about several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the sequence may be substituted with other amino acids.
In the partial peptide of the present invention, the C-terminus is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO). ^- However, as in the protein of the present invention described above, the C-terminus is an amide (-CONH ₂ ) Or ester (—COOR). When the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
Further, in the partial peptide of the present invention, as in the case of the receptor protein of the present invention described above, the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protective group, and the N-terminal side is cleaved in vivo. Also included are those obtained by pyroglutamine oxidation of Gln, those in which substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
Examples of the salt of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
[0013]
The receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or other mammalian cells or tissues by a known purification method of the receptor protein, or a DNA encoding the receptor protein of the present invention described later. It can also be produced by culturing a transformant containing. Moreover, it can also manufacture according to the protein synthesis method described later or this.
When producing from human or other mammalian tissue or cells, homogenize human or other mammalian tissue or cells, extract with acid, etc., and extract the resulting extract using reverse phase chromatography or ion exchange. It can be purified and isolated by combining chromatography such as chromatography.
[0014]
For the synthesis of the receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof, a salt thereof, or an amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Examples include phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid in which the α-amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target protein. At the end of the reaction, the protein is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond forming reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or its amide. For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimide, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or activation of the protected amino acid in advance as the corresponding acid anhydride, HOBt ester or HOBt ester is performed. Once done, it can be added to the resin.
[0015]
The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions. For example, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, acid amides such as N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide, etc. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for protein bond forming reactions, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
[0016]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group is, for example, alkyl esterified (eg, linear, branched or cyclic alkyl ester such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc. ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxy It can be protected by carbonyl hydrazation, trityl hydrazation or the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of the group suitable for esterification include a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl ₂ -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0017]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like. As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro. Acid treatment with romethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 ° C. to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4 Addition of a cation scavenger such as -butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0018]
Protection of functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, elimination of the protective groups, activation of functional groups involved in the reaction, etc. are appropriately selected from known means, and protective groups are appropriately selected from known groups and applied. Is done.
As another method for obtaining an amide form of a protein, for example, first, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide (protein) chain is extended to the desired chain length on the amino group side. A protein from which only the protecting group of the α-amino group at the N-terminus of the peptide chain is removed and a protein from which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus has been removed are prepared in a mixed solvent as described above. To condense. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by condensation, all the protecting groups are removed by the above-described method, and the desired crude protein can be obtained. This crude protein can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide form of the desired protein.
In order to obtain a protein ester, for example, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired protein ester is obtained in the same manner as the protein amide. be able to.
[0019]
The partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing the partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention and the remaining part, and removing the protecting group when the product has a protecting group. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in (1) to (5) below.
(1) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, NewYork (1965)
(3) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(4) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(5) Supervised by Haruaki Yajima, Development of follow-up medicines Volume 14 Peptide synthesis Hirokawa Shoten
Further, after the reaction, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method. Can do.
[0020]
The polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention may be any as long as it contains the base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the receptor protein of the present invention. The polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA, or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention, the receptor protein of the present invention can be obtained, for example, by the method described in the known experimental medicine extra number “New PCR and its application” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto. mRNA can be quantified.
[0021]
The DNA encoding the receptor protein of the present invention may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells or tissues described above, cDNA library derived from the cells or tissues described above, or synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be amplified directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells or tissues described above.
Specifically, the DNA encoding the receptor protein of the present invention contains, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15. DNA having a base sequence that hybridizes under highly stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15, Any DNA may be used as long as it encodes a receptor protein having substantially the same quality of activity as the receptor protein of the present invention (eg, ligand binding activity, signal signal transduction activity, etc.).
Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, and sequence. No. 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 with the base sequence represented by about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more For example, DNA containing the nucleotide sequence is used.
[0022]
Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
As the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is used.
As the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 is used.
As the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 is used.
As the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 is used.
[0023]
A polynucleotide containing a part of the base sequence of the DNA encoding the receptor protein of the present invention or a part of the base sequence complementary to the DNA is a DNA encoding the following partial peptide of the present invention. It is used not only to include but also to include RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of a G protein-coupled receptor protein gene is encoded by a cloned or determined G protein-coupled receptor protein. It can be designed and synthesized based on DNA base sequence information. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the G protein-coupled receptor protein gene, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the RNA associated with the G protein-coupled receptor protein. It is possible to regulate / control the expression of G protein-coupled receptor protein gene through the interaction. A polynucleotide complementary to a selected sequence of a G protein-coupled receptor protein-related RNA and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with a G protein-coupled receptor protein-related RNA are It is useful for regulating and controlling the expression of protein-coupled receptor protein genes, and is useful for the treatment or diagnosis of diseases and the like. The term “corresponding” means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the direction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . G protein-coupled receptor protein gene 5 'end hairpin loop, 5' end 6 base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation initiation codon, 3' end untranslated The region, the 3 ″ end palindromic region, and the 3 ″ end hairpin loop can be selected as preferred regions of interest, but any region within the G protein coupled receptor protein gene can be selected as the subject.
[0024]
The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region, that is, the relationship between the polynucleotide that can hybridize with the target object, can be said to be “antisense”. Antisense polynucleotides are polydeoxynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases Or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein, nucleic acid and synthetic sequence specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages, provided that the polymer is found in DNA or RNA And a nucleotide having a configuration allowing base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), and more Modified, such as those with labels known in the art, capped, methylated, one or more natural nucleotides replaced with analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, Synth, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides, etc.) and other side chain groups, and intercalate compounds (eg, acridine, psoralen, etc.) , Containing a chelate compound (eg, metal, radioactive metal, boron, oxidizing metal, etc.), containing an alkylating agent, having a modified bond (eg, α-anomeric nucleic acid) Etc.). Here, the “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
[0025]
The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives and thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to increase the affinity for the target sense strand, and to be antitoxic if toxic Make sense nucleic acids less toxic.
Many such modifications are known in the art, such as J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed ., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993, etc.
The antisense nucleic acid of the present invention may be altered or contain modified sugars, bases and bonds, provided in special forms such as liposomes, microspheres, applied by gene therapy, It can be given in an added form. In this way, the additional form includes polycationic substances such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, lipids that enhance interaction with cell membranes and increase nucleic acid uptake ( For example, hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterols). Preferred lipids to be added include cholesterol and derivatives thereof (for example, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 ′ end or 5 ′ end of the nucleic acid and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Examples of the other group include a cap group specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid, which prevents degradation by a nuclease such as exonuclease or RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the G protein-coupled receptor protein. it can. The nucleic acid can also be applied to cells by various known methods.
[0026]
The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by RT-PCR using mRNA fractions prepared from the cells / tissues described above.
[0027]
Specifically, examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include (1) a base represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15. DNA having a partial base sequence of DNA having a sequence, or (2) highly stringent with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15. A partial base sequence of DNA encoding a receptor protein having a base sequence that hybridizes under conditions and having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal signal transduction activity, etc.) as the receptor protein peptide of the present invention The DNA having
Examples of DNA that can be hybridized with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 include SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: : 8, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 has a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more. A DNA containing a base sequence is used.
[0028]
Synthetic DNA having a partial base sequence of the receptor protein of the present invention may be used as a means for cloning the DNA encoding the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention). Amplification by PCR using primers, or by hybridization with DNA that has been incorporated into an appropriate vector and labeled with a DNA fragment or synthetic DNA that encodes part or all of the receptor protein of the present invention Can be sorted. The method of hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
[0029]
The substitution of the DNA base sequence may be performed by PCR or a known kit such as Mutan ^TM -Super Express Km (Takara Shuzo), Mutan ^TM -K (Takara Shuzo) or the like can be used according to a known method such as the ODA-LA PCR method, the Gapped duplex method, the Kunkel method, or the like.
The cloned DNA encoding the receptor protein can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The receptor protein expression vector of the present invention is, for example, (a) excising a target DNA fragment from a DNA (eg, cDNA) containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention, and (b) appropriately using the DNA fragment. It can be produced by ligating downstream of a promoter in an expression vector.
Examples of vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Of these, the CMV promoter, SRα promoter and the like are preferably used. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λP _L When the host is a Bacillus genus such as a promoter, lpp promoter, etc., the SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc., and when the host is yeast, the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
[0030]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). ^r A neomycin resistance gene (hereinafter Neo) ^r G418 resistance) and the like. In particular, CHO (dhfr ^- ) When using the dhfr gene as a selection marker using cells, the target gene can also be selected using a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. When the host is Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. are used in yeast. In some cases, MFα • signal sequence, SUC2 • signal sequence, etc. When the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention thus constructed.
[0031]
As the host, for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
As a specific example of the genus Escherichia, Escherichia coli K12 / DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular Biology) ), 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. It is done.
Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis MI114 [Gen, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984). )] Etc. are used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22 and AH22R. ^- NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris, etc. are used.
[0032]
Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, Spodoptera frugiperda cell (Sf cell), Trichoplusia ni midgut-derived MG1 cells, Trichoplusia ni egg-derived High Five ^TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, silkworm-derived cell lines (Bombyx mori N; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)).
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter referred to as CHO (dhfr). ^- Abbreviated cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, human HEK293 cells and the like.
[0033]
To transform Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982), and the like.
Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences of -The method can be carried out according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
In order to transform animal cells, for example, cell engineering separate volume 8 new cell engineering experiment protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973).
In this way, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding a G protein-coupled receptor protein is obtained.
When culturing a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean cake, and potato extract. Examples of inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
[0034]
As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. In order to make the promoter work efficiently here, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added. When the host is an Escherichia bacterium, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When cultivating a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimal medium [Bostian, KL et al., “Procedures of the National Academy of Sciences of Science.・ The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980) ”and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al.,“ Procedures of the・ National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984) ”. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
[0035]
When cultivating a transformant whose host is an insect cell or insect, 10% bovine serum or the like immobilized to Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)) is added as a medium. What added the thing suitably is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] is used. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
As described above, the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane or outside of the transformant.
[0036]
Separation and purification of the receptor protein of the present invention from the culture can be performed, for example, by the following method.
When the receptor protein of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw. For example, a method of suitably obtaining a receptor protein crude extract by centrifugation or filtration after destroying cells or cells by, for example, is used. Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride in the buffer, Triton X-100 ^TM A surfactant such as may be contained. When the receptor protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the cells or cells and the supernatant are separated by a known method, and the supernatant is collected.
Purification of the receptor protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining known separation / purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method using a difference in isoelectric point, such as a method, isoelectric focusing method, or the like is used.
[0037]
When the receptor protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method similar thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, the known method or It can be converted to the free form or other salts by a similar method.
The receptor protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
The activity of the receptor protein of the present invention or a salt thereof thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
[0038]
Below, the screening method of this invention is explained in full detail.
Screening method for compounds (agonists, antagonists, etc.) that change the binding between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and a substance related to cholesterol metabolism
A protein of the present invention containing a specific amino acid sequence (for example, the receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention)) or recombination By constructing an expression system for a type protein and using a binding assay system using the expression system, a test compound (for example, a cholesterol metabolism-related substance as a ligand (eg, bile acid (eg, taurolithocholic acid, glycolithol) Acid, taurodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, nordeoxycholic acid, 7-ketritocholic acid, 5β-pregnan-3,20-one, cholic acid, lithocholic acid, deoxycholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, chenodeoxycholic acid Acid, ursodeoxycholic acid, taurochenodexico Acid, glycochenodeoxycholic acid), epiandrosterone, (+)-4-androstene-3,17-dione, cis-androsterone, 11β-hydroxyprogesterone, 17α-hydroxyprogesterone, 11-deoxycorticosterone, 11 -Deoxycortisol, dehydroisoandrosterone, 3α-hydroxy-5α-pregnan-20-one, 4-pregnen-20α-ol-3-one, 5α-dehydrotestosterone, testosterone, progesterone, or salts thereof)) A compound (for example, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or a salt thereof that changes the binding property with the protein of the present invention can be efficiently screened.
Such test compounds include (i) cell stimulating activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca through a protein (eg, G protein-coupled receptor)). ²⁺ Activity that promotes or suppresses release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, reporter gene (B) a compound not having the cell stimulating activity (so-called antagonist to the receptor protein of the present invention), and (c) a physiologically active substance. A compound that enhances the binding force between the G protein-coupled receptor protein of the present invention (for example, cholesterol metabolism-related substance) or (d) a physiologically active substance (for example, cholesterol metabolism-related substance) and the G protein-coupled type of the present invention Compounds that reduce the binding power to receptor proteins Etc. (Incidentally, the above-mentioned compounds (b) is preferably screened by the ligand determination method described below).
[0039]
In the present invention, (1) the binding activity of test compound 1 alone is measured, (2) the binding activity of test compound 2 is further measured, and (3) and the results of (1) and (2) are compared. . That is, the present invention includes (i) a case where the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof is contacted with a substance related to cholesterol metabolism, and (ii) a receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof. A compound that changes the binding between the cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof, characterized in that comparison is made with a case where a cholesterol metabolism-related substance and a test compound are contacted Methods for screening for the salts are provided.
The screening method of the present invention is characterized by measuring and comparing, for example, the amount of cholesterol metabolism-related substance binding to the receptor protein, cell stimulating activity, etc. in the cases (i) and (ii). .
[0040]
More specifically, the present invention provides:
(1) Labeled cholesterol when the labeled cholesterol metabolism-related substance is brought into contact with the receptor protein of the present invention and when the labeled cholesterol metabolism-related substance and the test compound are brought into contact with the receptor protein of the present invention A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between a cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention, wherein the binding amount of the metabolism-related substance to the receptor protein is measured and compared;
(2) When the labeled cholesterol metabolism-related substance is brought into contact with the cell containing the receptor protein of the present invention or the membrane fraction of the cell, the labeled cholesterol metabolism-related substance and the test compound are combined with the receptor protein of the present invention. Cholesterol metabolism-related, characterized by measuring and comparing the amount of labeled cholesterol metabolism-related substances bound to the cells or the membrane fraction when the cells are brought into contact with the cell-containing cells or the membrane fraction of the cells. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a substance and the receptor protein of the present invention;
(3) When the labeled cholesterol metabolism-related substance is brought into contact with a receptor protein or the like expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA of the present invention, and the labeled cholesterol metabolism-related substance and test compound The amount of labeled cholesterol metabolism-related substance bound to the receptor protein, etc. is measured by contacting the receptor protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention,
[0041]
(4) When a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention (for example, a substance related to cholesterol metabolism for the receptor protein or the like of the present invention) is contacted with a cell containing the receptor protein or the like of the present invention; Cell stimulating activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca, etc.) when a compound containing a receptor protein of the present invention and a test compound are contacted with a cell containing the receptor protein of the present invention. ²⁺ Activity that promotes or suppresses release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, reporter gene And the like, and a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention,
(5) A compound that activates the receptor protein of the present invention (for example, a cholesterol metabolism-related substance for the receptor protein of the present invention) is expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. And a compound that activates the receptor protein of the present invention and the test compound expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. Cell-stimulating activity via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca when contacted with the receptor protein of the invention) ²⁺ Activity that promotes or suppresses release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, reporter gene And a method for screening a compound or its salt that changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention.
First, the receptor protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the receptor protein of the present invention described above. The cell membrane fraction of mammalian organs contained is preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, human-derived receptor proteins and the like that are expressed in large quantities using recombinants are suitable for use in screening.
[0042]
In order to produce the receptor protein and the like of the present invention, the above-described method is used, but it is preferable to carry out the expression of the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells. Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto. For example, gene fragments or synthetic DNA may be used. In order to introduce a DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention into a host animal cell and to express them efficiently, the DNA fragment is a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using an insect as a host. NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like are preferably incorporated downstream. The amount and quality of the expressed receptor can be examined by a known method. For example, the literature [Nambi, P. et al. Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
Therefore, in the screening method of the present invention, the receptor protein or the like of the present invention may be a receptor protein purified according to a known method, or a cell containing the receptor protein or the like may be used. Alternatively, a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like may be used.
[0043]
In the screening method of the present invention, when cells containing the receptor protein of the present invention are used, the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
The cell containing the receptor protein or the like of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor protein or the like, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell or the like.
The cell membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after disrupting cells. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (manufactured by Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, and ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. Crushing by causing them to occur. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of receptor protein in cells or membrane fractions containing the receptor protein or the like is 10 per cell. ^Three -10 ⁸ Preferably it is a molecule. ^Five -10 ⁷ It is preferably a molecule. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large amount of samples in the same lot. .
[0044]
In order to carry out the above (1) to (3) for screening for a compound that changes the binding property between the cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention, for example, an appropriate receptor protein fraction is labeled. A substance related to cholesterol metabolism is required.
The receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having the same activity. Here, the equivalent activity indicates an equivalent ligand binding activity, a signal information transmission action, and the like.
As the labeled cholesterol metabolism-related substance, a labeled cholesterol metabolism-related substance, a labeled cholesterol metabolism-related substance analog compound, or the like is used. For example [ ^Three H], [ ¹²⁵ I], [ ¹⁴ C], [ ³⁵ A substance related to cholesterol metabolism labeled with S] or the like is used.
Specifically, in order to screen for a compound that changes the binding property between a cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention, first, a cell containing the receptor protein of the present invention or a membrane fraction of the cell A receptor protein preparation is prepared by suspending in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a Tris-HCl buffer. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding, CHAPS, Tween-80 ^TM (Kao-Atlas), surfactants such as digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by protease. To 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution, a certain amount (5000 cpm to 500000 cpm) of labeled cholesterol metabolism-related substance was added, ^-Four M-10 ^-Ten M test compound is allowed to coexist. In order to know the amount of non-specific binding (NSB), a reaction tube to which a large excess of unlabeled cholesterol metabolism-related substance is added is also prepared. The reaction is carried out at about 0 ° C. to 50 ° C., preferably about 4 ° C. to 37 ° C., for about 20 minutes to 24 hours, preferably about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the solution is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist (B ₀ ) Minus non-specific binding (NSB) (B ₀ When -NSB) is 100%, for example, a test compound with a specific binding amount (B-NSB) of 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
[0045]
In order to carry out the above methods (4) to (5) for screening a compound that changes the binding property between a cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (for example, Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Activity that promotes or suppresses release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, reporter gene Expression-inducing activity, etc.) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
Specifically, first, cells containing the receptor protein of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compound, etc. and incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant and generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid, etc.) used as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production inhibitory action on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing an appropriate receptor protein are required. The cells expressing the receptor protein of the present invention are preferably a cell line having a natural type of the receptor protein of the present invention, a cell line expressing the above-mentioned recombinant receptor protein, or the like.
Examples of test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like, and these compounds may be novel compounds. It may be a known compound.
[0046]
A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a cholesterol metabolism-related substance and the receptor protein of the present invention, or a cell containing the receptor protein of the present invention, the receptor protein of the present invention, or the like. Examples include those containing membrane fractions of cells containing receptor proteins and the like.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagents
(1) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(2) G protein-coupled receptor preparation
CHO cells expressing the receptor protein of the present invention are placed in a 12-well plate at 5 × 10 5 ^Five Passed by piece / hole, 37 ° C, 5% CO ₂ Cultivated at 95% air for 2 days.
(3) Labeled cholesterol metabolism-related substances
Commercially available [ ^Three H], [ ¹²⁵ I], [ ¹⁴ C], [ ³⁵ S] -related substances labeled with cholesterol metabolism
An aqueous solution is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer at the time of use.
(4) Cholesterol metabolism-related substance standard solution
A substance related to cholesterol metabolism is dissolved to 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
[0047]
2. Measurement method
{Circle around (1)} Receptor protein-expressing CHO cells of the present invention cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and then 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
▲ 2 ▼ 10 ^-3 -10 ^-Ten After 5 μl of the test compound solution of M is added, 5 μl of the labeled cholesterol metabolism-related substance is added and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 10 instead of the test compound ^-3 Add 5 μl of M cholesterol metabolism-related substance.
(3) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
{Circle around (4)} Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and the percent maximum binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B-NSB) / (B ₀ -NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample is added
NSB: Non-specific binding
B ₀ : Maximum binding amount
[0048]
A compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound having an action of changing the binding between a ligand related to cholesterol metabolism and the receptor protein of the present invention. (I) Cell stimulating activity (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca through a G protein-coupled receptor) ²⁺ Activity that promotes or suppresses release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, reporter gene (B) a compound not having the cell stimulating activity (so-called antagonist to the receptor protein of the present invention), (c) cholesterol metabolism-related A compound that enhances the binding force between the substance and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, or (d) a compound that decreases the binding force between the cholesterol metabolism-related substance and the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
[0049]
Since the agonist for the receptor protein of the present invention has the same action as the physiological activity of the cholesterol metabolism-related substance for the receptor protein of the present invention, it is safe and low toxic according to the cholesterol metabolism-related substance activity. It is useful as a medicine.
Since the antagonist for the receptor protein etc. of the present invention can suppress the physiological activity of the cholesterol metabolism-related substance for the receptor protein etc. of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical that suppresses the activity of the cholesterol metabolism-related substance. It is.
The compound that enhances the binding force between the cholesterol metabolism-related substance and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a safe and low-toxic pharmaceutical for enhancing the physiological activity of the cholesterol metabolism-related substance for the receptor protein of the present invention. Useful as.
The compound that decreases the binding force between the cholesterol metabolism-related substance and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a safe and low-toxic pharmaceutical for reducing the physiological activity of the cholesterol metabolism-related substance for the receptor protein of the present invention. Useful as.
For example, central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (eg, allergies, rheumatism, osteoarthritis, lupus erythematosus, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, narrowing) Heart disease, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), respiratory disease (eg, Pneumonia, bronchitis, asthma, pulmonary fibrosis, etc.), diabetes, immune system diseases (eg, Crohn's disease, atopic dermatitis, autoimmune disease, immunodeficiency, leukemia, etc.), liver / gallbladder diseases (eg, cirrhosis, hepatitis) , Liver failure, cholestasis, stones, etc.), gastrointestinal diseases (eg, ulcers, enteritis, malabsorption, etc.), infections, obesity, hyperimmune reactions after transplantation, etc. Is useful as
Among these diseases, diseases caused by enhanced immune function, macrophage function, etc. (for example, inflammatory diseases, hyperimmune reactions after transplantation medical treatment, etc.) are particularly physiologic via the receptor protein of the present invention. Compounds that enhance activity (eg, agonists) are effective.
On the other hand, for diseases caused by suppression of immune function, macrophage function, etc. (for example, immunodeficiency, infectious diseases, etc.), compounds that decrease physiological activity via the receptor protein of the present invention (eg, antagonists) ) Is effective.
[0050]
When the compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical (composition), it can be carried out according to conventional means.
For example, the compound or a salt thereof is sterilized orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as an aqueous solution or suspension. For example, the compound or a salt thereof together with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. Can be produced by mixing with. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) ^TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
In addition, the compound or a salt thereof includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is administered to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, in general, for hypertensive patients (as 60 kg), per day About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, in hypertensive patients (as 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0051]
Furthermore, a method for quantifying a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention will be described below.
The receptor protein and the like of the present invention include cholesterol metabolism-related substances (eg, bile acids (eg, taurolithocholic acid, glycolithocholic acid, taurodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, nordeoxycholic acid, 7-ketritocholic acid, 5β- Pregnane-3,20-one, cholic acid, cholic acid, lithocholic acid, deoxycholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, taurochenodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid, epiandrosterone) , (+)-4-androstene-3,17-dione, cis-androsterone, 11β-hydroxyprogesterone, 17α-hydroxyprogesterone, 11-deoxycorticosterone, 11-deoxycortisol, dehydroisoand Sterone, 3α-hydroxy-5α-pregnan-20-one, 4-pregnen-20α-ol-3-one, 5α-dehydrotestosterone, testosterone, progesterone, or a salt thereof) Therefore, the cholesterol metabolism-related substance concentration in the living body can be quantified with high sensitivity.
The quantitative method of the present invention can be used, for example, in combination with a competitive method. That is, the cholesterol metabolism-related substance concentration in the subject can be measured by bringing the subject into contact with the receptor protein of the present invention. Specifically, it can be used, for example, according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
▲ 1 Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, 1974)
▲ 2 Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1979)
[0052]
The method for determining a ligand for a receptor protein whose ligand is unknown will be described in detail.
The method for determining a ligand of the present invention comprises the following steps: (1) A test compound is introduced into a cell containing a plasmid that expresses a receptor protein for which no ligand has been determined and has a DNA encoding a reporter protein linked downstream of an enhancer / promoter. (2) (i) a plasmid containing a DNA encoding a receptor protein whose ligand has not been determined, and (ii) a reporter protein downstream of the enhancer / promoter. For example, a method comprising culturing cells containing a plasmid linked with DNA encoding, adding a test compound, and measuring the activity of a reporter protein whose expression is induced.
Examples of the receptor protein include G protein-coupled receptor protein. Specific examples include a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as that represented by SEQ ID NO: 1, WO96 / 05302, EP-A-711831, EP-A-789076. EP-A-1103563, EP-A-1103562, JP-A-8-154682, JP-A-8-283295, JP-A-8-196278, JP-A-8-245697, JP-A-8-266280 And G protein-coupled receptor proteins described in JP-A-9-51795, JP-A-9-121865, JP-A-9-2388686, and JP-A-10-146192.
Examples of receptor expression plasmids include plasmids containing a promoter for expressing the receptor protein in cells derived from eukaryotes, a drug resistance gene (for example, ampicillin resistance gene) used as a selection marker for growth in prokaryotes, and the like. It is done.
As a plasmid that can be introduced into a cell (derived from a eukaryote) containing DNA encoding a reporter protein downstream of an enhancer / promoter, any plasmid such as a commercially available plasmid may be used. A plasmid containing an enzyme gene whose enzyme activity can be detected by a known method is preferably used.
As the enhancer, for example, an enhancer derived from a virus such as SV40 or papilloma virus, a retrovirus LTR, a cAMP response element (cAMP response element) (CRE) or the like is used, and a cAMP response element is preferable.
As the promoter, for example, SV40 promoter, CMV promoter, TATA-like promoter of thymidine kinase gene of HSV, etc. are used, and TATA-like promoter is preferable.
As the reporter protein gene, for example, luciferase gene, β-galactosidase gene, GFP gene, alkaline phosphatase gene and the like are used.
Specific examples of such a plasmid include a plasmid in which a gene encoding a TATA-like promoter and a reporter protein (eg, luciferase gene) is linked downstream of the cAMP response element, such as pCRE-Luc (Clontech).
Examples of the cells used above include cells derived from eukaryotes, preferably animal cells (eg, monkey cell COS-7, Vero, CHO cell, CHO (dhfr). ^- ) Cells, mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, human HEK293 cells, etc.).
The cells may express two or more (preferably 2-3) receptor proteins.
When expressing two or more types of receptor proteins, it is preferable to select two or more types of receptor proteins having similar characteristics.
Similar characteristics include, for example, the expression level of a reporter protein when two or more types of receptor proteins are individually expressed. Specifically, (1) the basic expression level of the reporter protein and / or (2) the expression level of the reporter protein when forskolin is added when two or more types of receptor proteins are expressed alone, respectively, The characteristics of each receptor protein can be distinguished.
That is, when two or more types of receptor proteins whose ligands have not been determined are expressed and the ligand is determined, the reporter protein is categorized in advance as having a low basic expression level, a medium level, or a clearly high level. Alternatively, it is desirable to clarify a receptor protein in which the expression level of the reporter protein is unlikely to increase when forskolin is added. This is because, for example, when two types of receptor proteins, a receptor protein with a high basic expression level of reporter protein and a receptor with a low basic expression level of reporter protein, are expressed, and when the ligand hits the latter, the expression level of the reporter protein increases. This is because it becomes difficult to see. Therefore, based on the information obtained,
(1) It is preferable to avoid mixing a receptor protein having a high basic expression level of reporter protein and a receptor protein having a low basic expression level.
(2) It is preferable not to mix a receptor protein in which the expression level of the reporter protein is significantly increased by the addition of forskolin and a receptor protein that is not so.
(3) It is preferable to combine and express receptor proteins having the same basic expression level of reporter protein.
Examples of such combinations of receptor proteins having similar characteristics include APJ (Apelin Receptor; Gene, 136, 355 (1993)) and TGR-1 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-078492). ).
[0053]
Specific examples of the ligand determination method are described below.
Cells are seeded in 96-well plates and cultured overnight, for example, in DMEM containing 10% fetal calf serum. Here, for example, using a commercially available transfection kit, the receptor protein expression plasmid and the reporter plasmid are simultaneously introduced into the cells, and the cells are further cultured overnight, whereby the receptor protein is transiently expressed in the cells. The cells are washed and the medium is serum free before adding the test compound. When the enhancer is CRE, forskolin may be added simultaneously with the test compound. After incubation for a certain time, the cells are lysed and the activity of the reporter protein is measured.
In the determination method described above, when the baseline is high and it is difficult to detect a signal, a means for reducing the baseline may be taken. For example, when the receptor protein is a G protein-coupled receptor protein (GPCR), signal detection is facilitated by adding a Gi protein exhibiting a cAMP inhibitory effect among the Gα proteins that are subunits of the G protein. Gi protein can also be introduced into cells together with receptor protein plasmids and reporter plasmids as plasmids that express DNA encoding the Gi protein. In this case, the mixing ratio of the three types of plasmids (receptor plasmid: reporter plasmid: Gi plasmid) is preferably about 5-15: 1: 1 to 6, more preferably about 7: 1: 3.
[0054]
The antibody against the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof.
An antibody against the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention) is a known antibody or antiserum using the receptor protein of the present invention as an antigen. It can be manufactured according to the manufacturing method.
[0055]
[Production of monoclonal antibodies]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The receptor protein of the present invention is administered to a mammal at a site where antibody production is possible by administration, together with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with a confirmed antibody titer from a mouse, collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization, A monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained with myeloma cells. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein described below with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus. Preferably, PEG is used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, etc., and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. The cell fusion can be efficiently carried out by incubating at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes.
[0056]
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as a receptor protein is adsorbed directly or together with a carrier. A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A A method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding a receptor protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, etc. Can be mentioned.
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method similar thereto, but can usually be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal calf serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
[0057]
(B) Purification of monoclonal antibody
Separation and purification of monoclonal antibodies can be carried out in the same way as in the separation and purification of ordinary polyclonal antibodies (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method for obtaining an antibody by dissociating the binding using an active adsorbent such as protein A or protein G) Can be done according to
[0058]
[Preparation of polyclonal antibody]
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a receptor protein) and a carrier protein is prepared, and a mammal is immunized in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method, and the antibody against the receptor protein of the present invention is immunized from the immunized animal. It can be produced by collecting the contents and separating and purifying the antibody.
Regarding the complex of immune antigen and carrier protein used to immunize mammals, the kind of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten should be such that antibodies can be efficiently produced against hapten immunized by cross-linking to carrier. Any ratio may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin and the like are about 0.1 to 20 in weight ratio with respect to hapten 1. Preferably, a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
In addition, various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, but active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration can usually be carried out about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total. Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of mammals immunized by the above method, preferably from blood.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the serum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.
[0059]
An amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16 of the present invention (provided that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, a partial peptide or a salt thereof, and a DNA encoding the receptor protein or a partial peptide thereof are novel substances, and (1) the G protein-coupled type of the present invention Preventive and / or therapeutic agents for diseases associated with receptor protein dysfunction, (2) genetic diagnostic agents, and (3) prevention of various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof And / or therapeutic agent, (4) G protein-coupled receptor protein of the present invention (5) Prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, antagonist) that changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and the ligand, (6) (7) Prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases comprising a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane, (8) It can be used for neutralization by an antibody against the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (9) production of a non-human animal having DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
The receptor protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention), the DNA encoding the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter abbreviated as the DNA of the present invention). And the use of the antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) will be specifically described below.
[0060]
(1) Preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the G protein-coupled receptor protein of the present invention
According to the action of the ligand for the receptor protein of the present invention, (1) the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein is used to prevent diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention and It can be used as a medicine such as a therapeutic agent.
For example, when there is a patient who cannot expect the physiological action of the ligand (the receptor protein deficiency) because the receptor protein of the present invention is decreased in vivo, (1) the receptor protein of the present invention is administered to the patient. (2) (b) administering the DNA encoding the receptor protein of the present invention to the patient and expressing it, or (b) subjecting the cell of interest to the receptor of the present invention After inserting and expressing the DNA encoding the protein, the amount of the receptor protein in the patient's body can be increased by, for example, transplanting the cells to the patient, and the effect of the ligand can be fully exerted. That is, the DNA encoding the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low toxic preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
The receptor protein of the present invention includes, for example, central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (eg, allergies, rheumatism, osteoarthritis, lupus erythematosus, etc.), cardiovascular diseases (eg, Hypertension, cardiac hypertrophy, angina, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.) , Respiratory diseases (eg, pneumonia, bronchitis, asthma, pulmonary fibrosis), diabetes, immune system diseases (eg, Crohn's disease, atopic dermatitis, autoimmune disease, immunodeficiency, leukemia, etc.), liver / gallbladder Diseases (eg, cirrhosis, hepatitis, liver failure, cholestasis, stones, etc.), gastrointestinal diseases (eg, ulcers, enteritis, malabsorption), infections, obesity, hyperimmunity after transplantation, etc. Prevention and / Or are useful as therapeutic agents.
Among these diseases, diseases caused by enhanced immune function, macrophage function, etc. (for example, inflammatory diseases, hyperimmune reactions after transplantation medical treatment, etc.) are particularly physiologic via the receptor protein of the present invention. Compounds that enhance activity (eg, agonists) are effective.
On the other hand, for diseases caused by suppression of immune function, macrophage function, etc. (for example, immunodeficiency, infectious diseases, etc.), compounds that decrease physiological activity via the receptor protein of the present invention (eg, antagonists) ) Is effective.
When the receptor protein of the present invention is used as the prophylactic and / or therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when the DNA encoding the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention) is used as the preventive and / or therapeutic agent, the DNA of the present invention alone or a retroviral vector, After inserting into an appropriate vector such as an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector, it can be carried out according to conventional methods. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting intake by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
For example, (1) the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein is orally administered as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, which is sugar-coated as necessary. Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution with other pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension. For example, (1) the receptor protein of the present invention or (2) a DNA encoding the receptor protein together with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be prepared by mixing in unit dosage forms required for accepted formulation practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
[0061]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) ^TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0062]
The preventive and / or therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.), a stabilizer (eg, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is administered to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
The dose of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, generally in hypertensive patients (as 60 kg), per day. About 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, in hypertensive patients (as 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0063]
The dose of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in hypertensive patients (as 60 kg), about The amount is 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, in hypertensive patients (as 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0064]
(2) Gene diagnostic agent
By using the DNA of the present invention as a probe, the receptor protein of the present invention or a part thereof in humans or other mammals (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.) Abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA encoding the peptide can be detected. For example, genetic diagnosis such as damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, increase or excessive expression of the DNA or mRNA, etc. Useful as an agent. More specifically, central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (eg, allergies, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina) Disease, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), diabetes, immune system disease (eg, Autoimmune disease, immune deficiency, leukemia, etc.), liver / gallbladder disease (eg, cirrhosis, hepatitis, hepatic failure, cholestasis, stones, etc.), gastrointestinal disease (eg, ulcer, enteritis, malabsorption), It is useful as a genetic diagnostic diagnostic agent for diseases such as obesity.
The gene diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the -National Academy of Sciences of USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), Vol. 86, 2766-2770 (1989)).
[0065]
(3) Preventive and / or therapeutic agents for various diseases containing a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof
As described above, the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in the living body such as a central function. Therefore, a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is used for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, such as central diseases (for example, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.) , Inflammatory diseases (eg, allergies, rheumatism, osteoarthritis, lupus erythematosus, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina pectoris, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer) Ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), respiratory diseases (eg pneumonia, bronchitis, asthma, pulmonary fibrosis, etc.), diabetes, immune system Diseases (eg, Crohn's disease, atopic dermatitis, autoimmune diseases, immunodeficiency, leukemia, etc.), liver / cholestatic diseases (eg, cirrhosis, hepatitis, liver failure, cholestasis, Stone, etc.), gastrointestinal diseases (e.g., ulcers, colitis, malabsorption, etc.), infectious diseases, obesity, is useful as a preventive and / or therapeutic agent for diseases such as excessive immune reaction after transplantation medicine.
Among these diseases, for the diseases caused by enhanced immune function, macrophage function, etc. (for example, inflammatory disease, hyperimmune reaction after transplantation medical treatment, etc.), particularly the expression of the receptor protein of the present invention is promoted. Are effective.
On the other hand, compounds that inhibit the expression of the receptor protein of the present invention are particularly effective for diseases caused by suppression of immune function, macrophage function, etc. (for example, immunodeficiency, infection, etc.).
When the compound is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to conventional means.
For example, the compound may be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, sugar-coated as needed, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injection such as a suspension. For example, mixing the compound with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., in a unit dosage form as required for generally accepted formulation practice. Can be manufactured by. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
[0066]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) ^TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0067]
The preventive and / or therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.), a stabilizer (eg, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is administered to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, in general, for hypertensive patients (as 60 kg), per day About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, in hypertensive patients (as 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0068]
(4) Method for quantifying ligand for G protein-coupled receptor protein of the present invention
Since the receptor protein of the present invention has a binding property to a ligand, the ligand concentration in a living body can be quantified with high sensitivity.
The quantitative method of the present invention can be used, for example, in combination with a competitive method. That is, the ligand concentration in the specimen can be measured by bringing the specimen into contact with the receptor protein of the present invention. Specifically, it can be used, for example, according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
▲ 1 Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, 1974)
▲ 2 Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1979)
[0069]
(5) Preventive and / or therapeutic agents for various diseases containing a compound (agonist, antagonist) that changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and a ligand
As described above, it is considered that the receptor protein of the present invention plays some important role in vivo such as central function. Therefore, the compound (agonist or antagonist) that changes the binding property between the receptor protein of the present invention and the ligand can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
When the compound is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to conventional means.
For example, the compound may be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, sugar-coated as needed, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injection such as a suspension. For example, mixing the compound with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., in a unit dosage form as required for generally accepted formulation practice. Can be manufactured by. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
[0070]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) ^TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0071]
The preventive and / or therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.), a stabilizer (eg, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is administered to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, in general, for hypertensive patients (as 60 kg), per day About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, in hypertensive patients (as 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0072]
(6) Quantification of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof
Since the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention, it can be used for quantification of the receptor protein of the present invention in a test solution, particularly quantification by sandwich immunoassay. it can. That is, the present invention provides, for example,
(I) In a test solution, wherein the antibody of the present invention is reacted competitively with a test solution and a labeled receptor protein and the ratio of the labeled receptor protein bound to the antibody is measured. A method for quantifying the receptor protein of the present invention,
(Ii) measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier after reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled antibody of the present invention simultaneously or successively. Provided is a quantitative method of the receptor protein of the present invention in a test solution.
In the above (ii), it is preferable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the receptor protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the receptor protein of the present invention. .
[0073]
In addition to measurement of the receptor protein of the present invention using a monoclonal antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) of the antibody molecule. ₂ , Fab ′, or Fab fractions may be used. The measurement method using an antibody against the receptor protein or the like of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (for example, amount of receptor protein) in the solution to be measured. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method in which the amount is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. Examples of radioisotopes include [ ¹²⁵ I], [ ¹³¹ I], [ ^Three H], [ ¹⁴ C] and the like are used. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
[0074]
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize proteins or enzymes may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), the labeled monoclonal antibody of the present invention is further reacted (secondary reaction), and then the labeling agent on the insolubilized carrier. The amount of the receptor protein of the present invention in the test solution can be quantified by measuring the activity of. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilizing method can be based on those described above.
In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.
In the method for measuring receptor protein or the like by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having different binding sites for the receptor protein or the like. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal part of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal. For example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
[0075]
The monoclonal antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like. In the competition method, an antigen in a test solution and a labeled antigen are reacted competitively with an antibody, and then an unreacted labeled antigen, (F), and a labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, a B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble method is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
[0076]
In applying these individual immunological measurement methods to the measurement method of the present invention, special conditions, operations, and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measuring system of the receptor protein of this invention, or its salt, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation method in each method. For the details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books, etc. [For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1979), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Medical School, published in 1978), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Second Edition) (Medical School, 1982) Published by Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical Shoin, published in 1987), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A )), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Id.Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Id.Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), Id.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and Gene ral Immunoassay Methods)), Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (published by Academic Press).
As described above, the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
Furthermore, by quantifying the receptor protein of the present invention or a salt thereof in vivo using the antibody of the present invention, various diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention can be diagnosed.
The antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue. In addition, preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention, detection of the receptor protein of the present invention in each fraction during purification, behavior of the receptor protein of the present invention in a test cell Can be used for analysis etc.
[0077]
(7) Preventive and / or therapeutic agents for various diseases containing a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane
As described above, the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in the living body such as a central function. Therefore, a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in the cell membrane is used for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, such as central diseases (for example, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc. ), Inflammatory diseases (eg, allergies, rheumatism, osteoarthritis, lupus erythematosus, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina pectoris, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cells) Lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), respiratory diseases (eg pneumonia, bronchitis, asthma, pulmonary fibrosis, etc.), diabetes, immunity System diseases (eg, Crohn's disease, atopic dermatitis, autoimmune disease, immunodeficiency, leukemia, etc.), liver / gallbladder diseases (eg, cirrhosis, hepatitis, liver failure, bile) Tsu Todokosho, calculus, etc.), gastrointestinal diseases (e.g., ulcers, colitis, malabsorption, etc.), infectious diseases, obesity, is useful as a preventive and / or therapeutic agent for diseases such as excessive immune reaction after transplantation medicine.
Among these diseases, for diseases caused by enhanced immune function, macrophage function, etc. (for example, inflammatory diseases, hyperimmune reactions after transplantation medical treatment, etc.), the expression level of the receptor protein of the present invention is particularly high. Promoting compounds are effective.
On the other hand, compounds that inhibit the expression of the receptor protein of the present invention are particularly effective for diseases caused by suppression of immune function, macrophage function, etc. (for example, immunodeficiency, infection, etc.).
When the compound is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to conventional means.
For example, the compound may be used as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, sugar-coated as needed, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injection such as a suspension. For example, mixing the compound with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., in a unit dosage form as required for generally accepted formulation practice. Can be manufactured by. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
[0078]
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) ^TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0079]
The preventive and / or therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.), a stabilizer (eg, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, it is administered to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can do.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, in general, for hypertensive patients (as 60 kg), per day About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, in hypertensive patients (as 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0080]
(8) Neutralization by antibodies against the receptor protein of the present invention, partial peptides thereof or salts thereof
The neutralizing activity of the antibody against the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof with respect to the receptor protein or the like means the activity of inactivating the signal transduction function involved in the receptor protein. Accordingly, when the antibody has neutralizing activity, signal transduction involving the receptor protein, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ Release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity to promote or suppress pH reduction, etc.) Can be inactivated. Therefore, it can be used for prevention and / or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein.
[0081]
(9) Production of animals having DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention
Using the DNA of the present invention, a transgenic animal that expresses the receptor protein of the present invention can be produced. Examples of animals include non-human mammals (for example, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) (hereinafter sometimes abbreviated as animals). Rabbits and the like are preferred.
When introducing the DNA of the present invention into a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. For example, when the DNA of the present invention derived from rabbit is introduced, gene constructs bound to the downstream of various promoters that can express the DNA of the present invention derived from animals having high homology with animal cells, for example, rabbit fertilized eggs DNA-introduced animals that produce the receptor protein of the present invention at a high level can be produced by microinjection. As this promoter, for example, a ubiquitous expression promoter such as a virus-derived promoter or metallothionein can be used, but an NGF gene promoter or an enolase gene promoter that is specifically expressed in the brain is preferably used.
[0082]
The introduction of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject animal. The presence of the receptor protein of the present invention in the embryo cell of the produced animal after introduction of DNA means that all the progeny of the produced animal have the receptor protein of the present invention in all the germ cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that has inherited the gene has the receptor protein of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
The DNA-introduced animal of the present invention can be bred in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the gene is stably retained by mating. Further, by mating male and female animals carrying the target DNA, a homozygous animal having the transgene in both homologous chromosomes is obtained, and by mating the male and female animals, all the offspring have the DNA. Can be bred to passage. The animal introduced with the DNA of the present invention is useful as an animal for screening for agonists or antagonists to the receptor protein of the present invention because the receptor protein of the present invention is highly expressed.
The DNA-introduced animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture. For example, the receptor protein of the present invention is analyzed by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-introduced mouse of the present invention or by analyzing the tissue in which the receptor protein of the present invention expressed by a gene is present. can do. Culturing the cells of the tissue having the receptor protein of the present invention by a standard tissue culture technique and using these to study the function of cells from tissues that are generally difficult to cultivate, such as those derived from the brain and peripheral tissues. Can do. Further, by using the cells, for example, it is possible to select a medicine that enhances the functions of various tissues. In addition, if there is a high expression cell line, the receptor protein of the present invention can be isolated and purified from the cell line.
[0083]
(10) Knockout animal
The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention.
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated,
(2) The embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli),
(3) The embryonic stem cell according to (1), which is neomycin resistant,
(4) The embryonic stem cell according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent,
(5) The embryonic stem cell according to (4) above, wherein the rodent is a mouse,
(6) the DNA expression-deficient non-human mammal in which the DNA of the present invention is inactivated,
(7) The above (6), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention. The described non-human mammal,
(8) The non-human mammal according to (6) above, wherein the non-human mammal is a rodent
(9) The non-human mammal according to (8) above, wherein the rodent is a mouse, and
(10) A screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity against the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal according to (7) above and detecting the expression of a reporter gene. provide.
[0084]
The “non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA is inactivated” of the present invention refers to suppressing the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, Alternatively, by substantially losing the activity of the polypeptide of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the polypeptide of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention). This refers to embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells) of non-human mammals.
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
As a method for artificially adding a mutation to the DNA of the present invention, for example, a part or all of the DNA sequence can be deleted and another DNA can be inserted or replaced by a genetic engineering technique. With these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of the promoter or exon.
[0085]
Specific examples of non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) A DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl) Insertion of a reporter gene typified by a transferase gene) destroys the function of the exon, or inserts a DNA sequence (for example, a poly A addition signal) that terminates the transcription of the gene into an intron between exons. To make it impossible to synthesize complete messenger RNA Thus, an ES cell obtained by introducing a DNA strand (hereinafter abbreviated as a targeting vector) having a DNA sequence constructed so as to destroy the gene into the animal chromosome by, for example, homologous recombination. PCR using Southern hybridization analysis using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe or the DNA sequence of the targeting vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector It can be obtained by analyzing by the method and selecting the knockout ES cell of the present invention.
In addition, as the original ES cell for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or in accordance with the known Evans and Kaufman method. Or newly established. For example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative purely immunologically genetic background For example, for the purpose of obtaining ES cells with clear clarification, for example, B57 improved by reducing the number of eggs collected in C57BL / 6 mice and C57BL / 6 by crossing with DBA / 2 ₁ Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2 ₁ ) Can be used well. BDF ₁ In addition to the advantage that the number of eggs collected is high and the eggs are strong, the mouse has C57BL / 6 mice as a background. Therefore, when ES cells obtained using these mice are used to produce pathological model mice, C57BL / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be changed to C57BL / 6 mice by backcrossing.
[0086]
In addition, when establishing ES cells, blastocysts on the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, many blastocysts can be efficiently obtained by collecting 8-cell embryos and culturing them to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although both male and female ES cells may be used, male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.
One example of a method for determining the sex of an ES cell is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. Using this method, it has traditionally been about 10 times for karyotype analysis. ⁶ In contrast to the number of cells required, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient, so the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by male / female discrimination. Yes, the early labor of the culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
[0087]
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes of the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations at the time of establishment, the gene of the ES cell is knocked out, and then normal cells (for example, chromosomes in mice) It is desirable to clone again into cells where the number is 2n = 40.
The embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ontogenic ability, so it needs to be subcultured carefully. For example, in a carbon dioxide incubator in the presence of LIF (1-10000 U / ml) on a suitable feeder cell such as STO fibroblast (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% Culturing is carried out by a method such as culturing at about 37 ° C. with carbon dioxide gas, 90% air, and at the time of passage, for example, a trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, Preferably, the cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1-3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and when morphologically abnormal cells are found, the cultured cells should be discarded.
[0088]
ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embrology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985], ES cells of the present invention. The DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiation are useful for in vitro cell biology of the polypeptide of the present invention.
[0089]
The DNA expression deficient non-human mammal of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is a DNA in which, for example, a targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
A cell in which the DNA of the present invention is knocked out is obtained by analyzing the DNA sequence of the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe and the mouse used for the targeting vector of the present invention. It can be determined by analysis by a PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is placed at a suitable time, for example, an 8-cell non-human mammal. It is injected into animal embryos or blastocysts, and the produced chimeric embryos are transplanted into the uterus of the non-human mammal that is pseudopregnant. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
When some of the germ cells of the chimeric animal have the mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of the added cells having the DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color. The individuals thus obtained are usually individuals with deficient hetero-expression of the polypeptide of the present invention, and individuals having deficient hetero-expression of the polypeptide of the present invention are mated with each other, and the polypeptide of the present invention is derived from their offspring. Can be obtained.
[0090]
When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by a microinjection method. Compared to mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
Thus, an individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the animal individual obtained by mating has also been knocked out.
[0091]
In addition, germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained by mating male and female animals possessed by the inactivated DNA. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are one normal individual and a plurality of homozygous animals. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful for producing the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide of the present invention, diseases caused by inactivation of the biological activity of the polypeptide of the present invention Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and for examining therapeutic methods.
[0092]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or common abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there are optical isomers with respect to amino acids, L form is shown unless otherwise specified.
DNA: Deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: cytosine
RNA: Ribonucleic acid
mRNA: Messenger ribonucleic acid
dATP: Deoxyadenosine triphosphate
dTTP: Deoxythymidine triphosphate
dGTP: Deoxyguanosine triphosphate
dCTP: Deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: sodium dodecyl sulfate
[0093]
Gly: Glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: Cysteine
Met: Methionine
Glu: Glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: Lysine
Arg: Arginine
His: Histidine
Phe: Phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
[0094]
In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
Tos: p-toluenesulfonyl
CHO: Formyl
Bzl: benzyl
Cl ₂ Bzl: 2,6-dichlorobenzyl
Bom: benzyloxymethyl
Z: benzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butoxycarbonyl
DNP: dinitrophenol
Trt: Trityl
Bum: t-butoxymethyl
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine
HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
[0095]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
SEQ ID NO: 1
1 shows the amino acid sequence of a novel human-derived G protein-coupled receptor protein TGR5 used in the present invention.
SEQ ID NO: 2
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding a novel human-derived G protein-coupled receptor protein TGR5 used in the present invention.
SEQ ID NO: 3
The base sequence of primer 1 used in the PCR reaction in Reference Example 1 below is shown.
SEQ ID NO: 4
The base sequence of primer 2 used in the PCR reaction in Reference Example 1 below is shown.
SEQ ID NO: 5
2 shows the amino acid sequence of a novel G protein-coupled receptor protein mTGR5 derived from the mouse heart of the present invention.
SEQ ID NO: 6
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein mTGR5 derived from the mouse heart of the present invention.
SEQ ID NO: 7
1 shows the amino acid sequence of a novel G protein-coupled receptor protein rTGR5 derived from the rat heart of the present invention.
SEQ ID NO: 8
1 shows the base sequence of cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein rTGR5 derived from the rat heart of the present invention.
SEQ ID NO: 9
The base sequence of primer 1 used in the PCR reaction in Example 5 below is shown.
SEQ ID NO: 10
The base sequence of primer 2 used in the PCR reaction in Example 5 below is shown.
SEQ ID NO: 11
The base sequence of primer 3 used in the PCR reaction in Example 5 below is shown.
SEQ ID NO: 12
The base sequence of primer 4 used in the PCR reaction in Example 5 below is shown.
SEQ ID NO: 13
The DNA sequence of bovine TGR5 is shown.
SEQ ID NO: 14
The amino acid sequence of bovine TGR5 is shown.
SEQ ID NO: 15
The DNA sequence of rabbit type TGR5 is shown.
SEQ ID NO: 16
The amino acid sequence of rabbit type TGR5 is shown.
SEQ ID NO: 17
The base sequence of the bF primer used in the PCR reaction in Example 6 below is shown.
SEQ ID NO: 18
The base sequence of the bR primer used in the PCR reaction in Example 6 below is shown.
SEQ ID NO: 19
The base sequence of the rabbitF primer used in the PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 20
The base sequence of the rabbitR primer used in the PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 21
The base sequence of the primer used for the quantification of the IL-1α mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 22
The base sequence of the primer used for quantification of the expression level of IL-1α mRNA in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 23
The base sequence of the probe used for quantification of the IL-1α mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 24
The base sequence of the primer used for the quantification of the IL-1β mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 25
The base sequence of the primer used for the quantification of the expression level of IL-1β mRNA in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 26
The base sequence of the probe used for quantification of the IL-1β mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 27
The base sequence of the primer used for the quantification of the IL-6 mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 28
The base sequence of the primer used for the quantification of the IL-6 mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 29
The base sequence of the probe used for quantification of the IL-6 mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 30
The base sequence of the primer used for quantification of the IL-8 mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 31
The base sequence of the primer used for quantification of the IL-8 mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 32
The base sequence of the probe used for quantification of the IL-8 mRNA expression level in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 33
The base sequence of the primer used for quantification of the expression level of TNFα mRNA in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 34
The base sequence of the primer used for quantification of the expression level of TNFα mRNA in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 35
The base sequence of the probe used for quantification of the expression level of TNFα mRNA in Example 11 below is shown.
SEQ ID NO: 36
2 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand precursor H.
SEQ ID NO: 37
1 shows the base sequence of DNA encoding human GPR7 ligand precursor H.
SEQ ID NO: 38
The amino acid sequence of GPR7 is shown.
SEQ ID NO: 39
This shows the base sequence of DNA encoding GPR7.
SEQ ID NO: 40
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes the human type | mold GPR7 ligand precursor H in Reference Example 4 is shown.
SEQ ID NO: 41
The synthetic DNA used for the screening of cDNA which codes the human type | mold GPR7 ligand precursor H in Reference Example 4 is shown.
SEQ ID NO: 42
The base sequence of the primer used in Reference Example 2 is shown.
SEQ ID NO: 43
The base sequence of the primer used in Reference Example 2 is shown.
[0096]
The transformant Escherichia coli JM109 / pCR4-hTGR5 obtained in Reference Example 1 below is from the center of Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from April 3, 2000. The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIPH), the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (formerly the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Biotechnology, NIBH) has the deposit number FERM BP-7114, 2000 ) It has been deposited as deposit number IFO 16410 at the Foundation and Fermentation Research Institute (IFO), 2-17-85 Juzahoncho, Yodogawa-ku, Osaka City, Osaka, Japan since March 23rd.
The transformant Escherichia coli DH5α / pAKKO1.11H-rTGR5 obtained in Example 5 below was obtained from 1 February 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture from February 7, 2002. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) No. 6 (Postal Code 305-866) as Deposit No. FERM BP-7877 at the Patent Biological Depositary Center from January 10, 2002, Jusohoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka It is deposited under the deposit number IFO 16745 at the Institute for Fermentation Research (IFO), 2-chome 17-85 (postal code 532-8686).
The transformant Escherichia coli DH5α / pCR2.1-mTGR5 obtained in Example 5 below was obtained from Chubu Dai-ichi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture from February 7, 2002. No. 6 (Postal Code 305-866), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center as deposit number FERM BP-7878, from January 10, 2002, Jusohoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka It is deposited under the deposit number IFO 16746 at the Fermentation Research Institute (IFO) of 2-chome 17-85 (postal code 532-8686).
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAbTGR5-1 obtained in Example 6 below was obtained from 1 February 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture from February 7, 2002. As the deposit number FERM BP-7879 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), postal code 305-8565), from January 17, 2002, 2-13 Jusohoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka Prefecture It is deposited under the deposit number IFO 16747 at the foundation Fermentation Research Institute (IFO) of 17th No. 85 (zip code 532-8686).
The transformant Escherichia coli JM109 / pTArabitTGR5-1 obtained in Example 7 below was obtained from the center of Tsukuba City, Ibaraki Prefecture from February 7, 2002. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Biological Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, as deposit number FERM BP-7880, from January 17, 2002, Osaka It is deposited under the deposit number IFO 16748 at the Fermentation Research Institute (IFO) of No. 17 85 (zip code 532-8686).
The transformant Escherichia coli JM109 / pTAhGPR7-1 obtained in Reference Example 4 to be described later is Escherichia coli JM109 / pTAhGPR7L-1 from June 27, 2001, 1st Central, 1st Street, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Pref. No. 305-8666) As a deposit number FERM BP-7640 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, from June 19, 2001, 2-17-85 Juzahoncho, Ashikawa-ku, Osaka, Japan since June 19, 2001 Deposited under the deposit number IFO 16644 at the Institute for Fermentation (IFO) of the postal code 532-8686).
[0097]
【Example】
The following reference examples and examples illustrate the present invention in more detail, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, gene manipulation using E. coli was performed according to the method described in Molecular cloning.
[0098]
Reference Example 1 Cloning and sequencing of cDNA encoding human spleen G protein-coupled receptor protein
Using a human spleen cDNA (Clontech) as a template, PCR reaction was performed using two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4). The composition of the reaction solution in the reaction was 1/10 amount of the above cDNA as a template, Advantage-GC2 Polymerase Mix (Clontech) 1/50 amount, Primer 1 (SEQ ID NO: 3) and Primer 2 (SEQ ID NO: 4) 0.5 μM each, dNTPs 200 μM, and 1/5 volume of buffer attached to the enzyme and 1/5 volume of GC Melt were added to make a volume of 20 μl. The PCR reaction was performed at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes, and finally an extension reaction was performed at 68 ° C. for 5 minutes. The PCR reaction product was subcloned into the plasmid vector pCR4 (Invitrogen) according to the TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli JM109, and a clone having cDNA was selected in an LB agar medium containing ampicillin. As a result of analyzing the sequence of each clone, a cDNA sequence (SEQ ID NO: 2) encoding a novel G protein-coupled receptor protein was obtained. A novel G protein-coupled receptor protein having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) derived from this cDNA was named TGR5. The transformant containing the DNA represented by SEQ ID NO: 2 was named Escherichia coli JM109 / pCR4-hTGR5.
[0099]
Example 1 Detection of activity by cholesterol metabolism-related substances in HEK293 cells transiently expressing TGR5
Detection of TGR5-specific stimulating activity by a substance related to cholesterol metabolism was performed using the expression level of a reporter gene product (luciferase) produced by inducing expression of the CRE promoter as an index.
HEK293 cells are suspended in a growth medium (DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (GibcoBRL) supplemented with 10% fetal bovine serum (GibcoBRL)) and 1 × 10. ^Five Black well 96 well plates (Becton Dickinson) coated with collagen at a concentration of cells / well were plated. 37 ° C, 5% CO ₂ After overnight culture under conditions, a vector pAKKO-111H for expression in animal cells (Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S.) is used by a known method simultaneously with pCRE-Luc (Clontech) which is a plasmid containing a reporter gene. et al., 1219, 251-259, 1994, the same plasmid vector as pAKKO-1.111H), or an expression vector plasmid prepared by inserting the TGR5 gene, or the original pAKKO-111H not containing the TGR5 gene The cells were transfected as follows.
OPTI-MEM-I (GibcoBRL) and Lipofectamine ^TM Lipofectamine dilutions were prepared by mixing 2000 Reagent (GibcoBRL) at 24: 1. In addition, DNA dilution was performed by mixing OPTI-MEM-I, TGR5 expression vector plasmid or the original vector plasmid (240 ng / μl) and pCRE-Luc (240 ng / μl) at 24: 0.9: 0.1. A liquid was prepared. Equal volumes of Lipofectamine Diluent and DNA Diluent are mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to form a complex of DNA and Lipofectamine, and then 25 μl is added to the plate on which the HEK293 cells are cultured. And 37 ° C, 5% CO ₂ Cultured overnight under conditions.
The transfected HEK293 cells were washed with assay medium (DMEM supplemented with 0.1% bovine serum albumin) and then diluted with assay medium for lithocholic acid (Wako Pure Chemical) and progesterone (Wako Pure Chemical) ) 2 × 10 ^-Five Add to M, 37 ° C, 5% CO ₂ Cultured for 4 hours under conditions. Discard the culture supernatant, add 50 μl of Piccagene LT2.0 (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.), which is a substrate for measuring luciferase activity, and use a plate reader (ARVO sx multilabel counter, Wallac) to emit luciferase. Was measured.
As a result, an increase in luciferase activity by lithocholic acid and progesterone was observed specifically in HEK293 cells into which the TGR5 gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 was introduced (FIG. 6).
[0100]
Example 2 Introduction of a G protein-coupled receptor protein expression plasmid and a reporter plasmid into a host cell
Various G protein-coupled receptor protein cDNAs produced by known methods, namely thyroid hormone stimulating factor receptor (TRHR), neuromedin U receptor (FM-3 and TGR-1), prolactin releasing factor receptor (hGR3), apelin receptor (APJ) E. coli JM109 was transformed with an expression plasmid for animal cells into which, etc.) were inserted, and the resulting colonies were isolated and cultured, and then the plasmid was prepared using QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen). In addition, a reporter plasmid of pCRE-Luc (Clontech) in which a luciferase gene was linked as a reporter downstream of the cAMP response element (CRE) was prepared in the same manner.
As a host cell into which a G protein-coupled receptor protein expression plasmid and a reporter plasmid are introduced, HEK293 cells are seeded on a 96-well black plate (Becton Dickinson) coated with collagen type I at 100,000 cells / well and a culture volume of 100 μl. And cultured overnight. Similarly CHO (dhfr ^- ) CHO-mock cells obtained by transforming the cells with pAKKO-111H were seeded on a Coster 96-well black plate at 40,000 cells / well in a culture volume of 100 μl and cultured overnight. For all the cells, the medium used for culturing on the plate was DMEM (GibcoBRL) supplemented with only 10% fetal bovine serum.
Each plasmid was diluted to a concentration of 240 ng / μl and added to 240 μl of Opti-MEM-I (GibcoBRL) at a ratio of 9 μl of G protein-coupled receptor protein expression plasmid and 1 μl of reporter plasmid. This was mixed with an equivalent amount of 240 μl of Opti-MEM-I with 10 μl of Lipofectamine 2000 (GibcoBRL) and mixed with liposome according to the method described in the manual attached to Lipofectamine 2000. The body was formed. For efficient screening, 5 μl of 3 types of receptor expression plasmids were added at a concentration of 240 ng / μl, and the ratios of other reagents were the same as described above. These were added to the culture solution of HEK293 or CHO-mock cells at a rate of 25 μl / well and cultured overnight at 37 ° C. to introduce the plasmid. For CHO-mock cells, the culture broth was replaced with assay buffer (DMEM supplemented with 0.1% bovine serum albumin) after 4 hours from the addition of the plasmid, and serum-free.
[0101]
Example 3 Detection of Ligand Activity by Reporter Assay
For HEK293 cells, the culture medium was replaced with the assay buffer described in Example 2 one hour before the assay, and preincubation was performed. A solution in which a ligand or a ligand candidate compound was dissolved in an assay buffer was prepared and added to HEK293 cells or CHO-mock cells prepared in Example 2. In addition, the assay was performed in the same manner under the condition that forskolin having a final concentration of 2 μM was added to the assay buffer. After adding the sample, incubation was performed for 4 hours to induce the promotion or suppression of transcription / translation of the reporter gene derived from intracellular signal transduction induced by the agonist activity of the ligand via the receptor. After completion of the incubation, the assay buffer in each well was removed, and 50 μl of Pickergene LT2.0 (Toyo Ink) luminescent substrate was added. After the cells were lysed and mixed well with the substrate, the amount of luminescence derived from the expression induction amount of the reporter gene in each well was measured with the plate reader described in Example 1.
According to the methods described in Examples 2 and 3, expression plasmids inserted with various G protein-coupled receptor protein cDNAs were used to measure reporter gene expression induction by ligand stimulation in HEK293 cells. Regarding CRFR coupled to Gs as a kind of G protein α subunit that transmits a signal into a cell through a receptor, activation of a reporter gene by addition of a ligand is detected in both conditions of no forskolin addition and addition. It was. In addition, for APJ conjugated to Gαi, which is suppressive, suppression of reporter gene expression due to ligand addition was detected under the condition of forskolin. In addition, for the receptors TRHR, FM-3, and TGR-1 coupled to Gq, the promotion of reporter gene expression was detected under the condition of forskolin. For the receptor hGR3 coupled to both Gq and Gi, the promotion of reporter gene expression was similarly detected under the condition of forskolin (FIG. 7).
[0102]
Example 4 Reporter Assay Using Inhibitory G Protein α Subunit Gi Expression Plasmid
An inhibitory G protein α subunit (Gi) plasmid was prepared and prepared by the same method as that for the G protein receptor expression plasmid shown in Example 2 (Here, Gi is not limited to any animal species). DNA was introduced into HEK293 or CHO-mock cells in the same manner as in Example 2 except that 3 μl of this, 7 μl of receptor expression plasmid, and 1 μl of reporter plasmid were added to 240 μl of Opti-MEM-I. did. As for the mixing ratio of these three kinds of plasmids, Gi is 1 to 6, preferably 1 to 3, when the total amount is 11 μl. These were assayed according to the method of Example 3 to detect ligand activity.
That is, as a result of detecting the reaction of TGR5 to lithocholic acid using Gi, in the G protein receptor TGR5 assay using CHO-mock cells, Gi was expressed simultaneously with TGR5, so that no ligand was added (ligand (− )) Luciferase activity can be greatly reduced, resulting in a ligand (lithocholic acid, 2 × 10 ^-Five It was possible to detect an increase in activity due to M, ligand (+)) (FIG. 8).
[0103]
Example 5 Cloning and sequencing of cDNAs encoding mouse and rat TGR5 proteins
0.4 μM each of the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 9 as the sense strand primer 1 and the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 10 as the antisense strand primer 2, respectively, GC2 DNA Polymerase (manufactured by CLONTECH) 0. 3 μl, 5 × Buffer 6 μl, GC-Melt 6 μl, dNTP (TaKaRa) 0.2 mM, 3 μl of Marathon-Ready Mouse cDNA library (CLONTECH) heart cDNA solution as template DNA, sterilized water 9.9 μl Was first placed at 94 ° C. for 20 seconds using a thermal cycler (GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems)), then 94 ° C. for 30 seconds, 64 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 seconds. 5 cycles per minute, followed by 94 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 2 minutes per cycle, 5 cycles followed by 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C 2 minutes for 1 size The PCR reaction was performed in 35 cycles, touchdown PCR program for the last 68 ° C. 7 minute extension reaction as Le. Next, a portion of the reaction solution was electrophoresed on a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide, and the DNA amplified by PCR reaction was applied to a position near 1 kb in terms of molecular weight marker under UV irradiation. I confirmed the band to play. Next, in order to determine the nucleotide sequence, TA cloning was performed using pCR2.1-TOPO (Invitrogen), and the plasmid was introduced into a competent cell of E. coli DH5α strain. To select a clone carrying a plasmid into which a foreign DNA fragment has been inserted from among ampicillin resistant transformant colonies appearing on an ampicillin-containing LB agar medium by colony PCR, and to determine the base sequence of the inserted DNA After performing a sequencing reaction using ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) on a thermal cycler (GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems)) according to the conditions of the product attachment The reaction sample was analyzed with a DNA sequencer ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
As a result, a novel 329 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, that is, a structural gene sequence homologous to TGR5, can be determined from the PCR product consisting of the 990 base sequence represented by SEQ ID NO: 6. It was. A novel G protein-coupled receptor protein containing SEQ ID NO: 5 was named mTGR5. Furthermore, this transformant was named Escherichia coli DH5α / pCR2.1-mTGR5.
0.4 μM each of the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 11 as sense strand primer 3 and the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 12 as antisense strand primer 4, 0.3 μl of Advantage2 DNA Polymerase (manufactured by CLONTECH), Prepare 3 μl of 10x Buffer, 0.2 mM of dNTP (TaKaRa), 30 μl of a mixture consisting of 3 μl of heart cDNA solution of Marathon-Ready Rat cDNA library (CLONTECH) as template DNA and 18.9 μl of sterilized water. system model 9700 (Applied Biosystems)) was first placed at 94 ° C. for 20 seconds, followed by 5 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 64 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes. 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 2 minutes. The PCR reactions were performed in touchdown PCR program for the last 68 ° C. 7-minute extension reaction. Next, a portion of the reaction solution was electrophoresed on a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide, and the DNA amplified by PCR reaction was applied to a position near 1 kb in terms of molecular weight marker under UV irradiation. I confirmed the band to play. Next, in order to determine the nucleotide sequence, TA cloning was performed using pCR2.1-TOPO (Invitrogen), and the plasmid was introduced into a competent cell of E. coli DH5α strain. To select a clone carrying a plasmid into which a foreign DNA fragment has been inserted from among ampicillin resistant transformant colonies appearing on an ampicillin-containing LB agar medium by colony PCR, and to determine the base sequence of the inserted DNA After performing a sequencing reaction using ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) on a thermal cycler (GeneAmp PCR system model 9700 (Applied Biosystems)) according to the conditions of the product attachment The reaction sample was analyzed with a DNA sequencer ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
As a result, it is possible to determine a novel 329 amino acids represented by SEQ ID NO: 7, ie, a structural gene sequence having homology to TGR5, consisting of a 990-base nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 from the PCR product. It was. A novel G protein-coupled receptor protein containing SEQ ID NO: 7 was named rTGR5.
Next, the DNA fragment inserted into pCR2.1-TOPO was enzymatically digested with restriction enzyme SalI and SpeI sites added to primer 3 and primer 4, and the excised DNA fragment having the rTGR5 sequence was expressed in expression plasmid pAKKO1. SalI and SpeI sites of 11H (Hinuma, S., Hosoya, M., Ogi., Tanaka, H., Nagai, Y., and Onda, H. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1129, 251-259) The plasmid was introduced into a competent cell of E. coli DH5α strain. From the colonies of ampicillin resistant transformants appearing on the ampicillin-containing LB agar medium, clones retaining the plasmid with the rTGR5 fragment inserted were selected by colony PCR. Furthermore, this transformant was named Escherichia coli DH5α / pAKKO1.11H-rTGR5.
[0104]
Example 6 Cloning of cDNA encoding TGR5 protein and determination of nucleotide sequence from bovine spleen cDNA by PCR
PCR amplification was performed using bovine spleen cDNA as a template and primer bF represented by SEQ ID NO: 17 and primer bR represented by SEQ ID NO: 18.
PCR reaction solution was 1 μl of cDNA solution, 0.5 μl bF (10 μM), 0.5 μl bR (10 μM), 2.5 μl attached 10 × reaction solution, 2.5 μl dNTP (10 mM), 0.5 μl Advantage2 DNA polymerase ( (Clontech) 17.5 μl distilled water was added to make a total of 25 μl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using Thermal Cycler 9600 (ABI). PCR conditions were as follows: after denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 63 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 60 seconds was repeated 30 times. After confirming amplification of a PCR product of about 1000 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using Qiagen PCR purification Kit (Qiagen) and directly sequenced. SEQ ID NO: Thirteen sequences were obtained. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of SEQ ID NO: 13 is shown in SEQ ID NO: 14. Next, the PCR product collected from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAbTGR5-1. Plasmid pTAbTGR5-1 was extracted from Escherichia coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the base sequence of the inserted fragment was determined, and it was confirmed that the sequence was a bovine TGR5 gene.
[0105]
Example 7 Cloning of cDNA encoding TGR5 protein and acquisition of nucleotide sequence from rabbit spleen cDNA by PCR
Amplification by PCR was performed using rabbit spleen cDNA as a template and primer rabbitF represented by SEQ ID NO: 19 and primer rabbitR represented by SEQ ID NO: 20.
PCR reaction solution was 1 μl of cDNA solution, 0.5 μl rabitF (10 μM), 0.5 μl rabitR (10 μM), 2.5 μl attached 10 × reaction solution, 2.5 μl dNTP (10 mM), 0.5 μl Advantage2 DNA polymerase ( (Clontech) 17.5 μl distilled water was added to make a total of 25 μl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using ThermalCycler 9600 (ABI). PCR conditions were as follows: after denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 63 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 60 seconds was repeated 30 times. After confirming amplification of a PCR product of about 1000 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using Qiagen PCR purification Kit (Qiagen) and directly sequenced. SEQ ID NO: A base sequence represented by 15 was obtained. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 15 is represented by SEQ ID NO: 16. Next, the PCR product recovered from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTArabbitTGR5-1. Plasmid pTArabbitTGR5-1 was extracted from E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo Co., Ltd.), the base sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was confirmed to be a rabbit TGR5 gene.
[0106]
Example 8 Detection of reporter gene expression increase by bile acid stimulation of human, rabbit, bovine, mouse and rat TGR5
In the same manner as shown in Example 1, expression vector pAKKO-111H in animal cells was added to mouse and rat TGR5 gene shown in Example 5, bovine TGR5 gene shown in Example 6, and The rabbit TGR5 gene shown in Example 7 was inserted to prepare expression vectors for the respective genes. These and the original expression vector into which no insert is inserted and the human TGR5 expression vector shown in Example 1 are mixed with the inhibitory G protein α subunit (Gi) and the reporter plasmid in accordance with the method shown in Example 4. It was expressed transiently in Mock cells. This was followed by the method of Example 3 to detect the expression level of the reporter gene upon stimulation with bile acids. As bile acids, taurolithocholic acid (TCLA), lithocholic acid (LCA), deoxycholic acid (DCA), and chenodeoxycholic acid (CDCA) were used at 10 μM each. Forskolin (FSK, 2 μM) was used as a positive control for reporter gene expression. As a result, even when TGR5 derived from any animal species was expressed, higher luciferase activity was detected in the bile acid-added group than in the group not added with bile acid (Base) (FIG. 9). This indicates that, like human TGR5, rabbit, bovine, mouse and rat TGR5 act as receptors for bile acids.
[0107]
Example 9 Inhibitory effect of taurolithocholic acid (TLCA) on phagocytic activity of rabbit alveolar macrophages
Serum and lungs were collected from rabbits (NZW, female, body weight around 2.5-3.0 kg) under anesthesia. PBS (phosphate-buffered saline) was injected from the trachea and washed to collect a suspension containing alveolar macrophage cells in the lung. The obtained cells were further washed with PBS, and then the medium (DMEM supplemented with 2% FBS, 0.1 mM non-essential amino acid, 50 μg / ml streptomycin, 50 U / ml penicillin, 50 μg / ml gentamicin, all GibcoBRL) And then layered and centrifuged on Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia), which is a mononuclear cell separation solution, to remove erythrocytes. After washing the mononuclear cells with medium, 0.25 × 10 ⁶ / Well in a 24-well plate at 37 ° C., 5% CO ₂ Cultured overnight under conditions. The medium was removed, 0.5 ml of a medium supplemented with TLCA 100 μM or a control medium was added, and the cells were further cultured for 16 hours. 50 μl of serum collected from the same rabbit, 0.8 × 10 yeast suspension sterilized by heating ⁸ / Ml 30ml added at 37 ° C, 5% CO ₂ Incubated under conditions for 40 minutes. After adding 60 μl of 0.1% fuchsin solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the cells were peeled off and centrifuged, and the suspension was observed with a microscope. The macrophages that showed phagocytic activity were calculated using the fact that yeast stained with fuchsin but not stained with alveolar macrophages. As a result, as shown in FIG. 10, when TLCA was added, a marked decrease in phagocytic activity, which is one of the immune functions of macrophages, was observed.
[0108]
Example 10 Inhibitory effect of TLCA on secretion of tumor necrosis factor (TNF) α induced by lipopolysaccharide (LPS) in rabbit alveolar macrophages
Rabbit alveolar macrophages collected by the method of Example 9 were 0.25 × 10 ⁶ After being diluted to a concentration of / well and cultured overnight in a 24-well plate, the influence on LPS stimulation-induced TNFα secretion was examined. After replacing with 0.5 ml of TLCA medium or control medium 0.5 ml and culturing for 1 hour, LPS (E. coli O111: B4 Wako Pure Chemical Industries) was added to the same concentration of TLCA-containing medium or control medium (concentration at the time of addition) 1 ng / ml) 0.5 ml, 37 ° C., 5% CO ₂ The culture was further continued for 12 hours under the conditions. After the culture, the supernatant was collected, and the amount of TNFα was measured using the growth inhibitory action on the TNF-sensitive cell line L929 (RIKEN) as an index. L929 cells were 1.2 × 10 ^Four Seeded in a 96-well plate at 37 ° C, 5% CO ₂ After overnight culture under conditions, the alveolar macrophage culture supernatant was appropriately diluted and cultured overnight in the presence of 2 μg / ml actinomycin D (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a standard sample, human recombinant TNFα (Genzyme) was used. The proliferation of L929 cells was measured by Cell Counting Kit-8 (Wako Pure Chemical Industries). As a result, as shown in FIG. 11, a marked decrease in the amount of TNFα secretion was observed by adding TLCA.
[0109]
Example 11 Inhibitory effect of taurolithocholic acid (TLCA) on expression levels of various cytokine mRNAs in rabbit alveolar macrophages
Rabbit alveolar macrophages collected by the method of Example 9 were 0.25 × 10 ⁶ Diluted to a concentration of / well and cultured overnight in a 6-well plate, replaced with 1.5 ml of a medium containing 100 μM TLCA or control medium and cultured for 1 hour, and then LPS (E. coli) was added to a TLCA-containing medium or control medium having the same concentration. O111: B4, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) added (concentration at the time of addition 1 ng / ml) 1.5 ml was added, 37 ° C., 5% CO ₂ The culture was further continued for 2 hours under the conditions. After removing the medium, 3 ml of Isogen (Nippon Gene) was added and total RNA was prepared according to the manual. CDNA was synthesized from 1 μg of total RNA using SuperScriptII reverse transcriptase (Gibco BRL) according to the manual to prepare a cDNA solution corresponding to 25 ng total RNA / μl. The amount of mRNA expression of various cytokines was quantified using ABI prism 7700 Sequence Detector (ABI). In each reaction, primers and probes specific to the respective cytokines represented by SEQ ID NOs: 21 to 35 were designed and used. The PCR reaction solution is 12.5 μl of Universal PCR master mix (ABI), 0.225 μl of each primer is 100 μM, 1.25 μl of 5 μM probe, and 1 μl of the cDNA solution prepared above are added, and the total amount is added. Made up to 25 μl with distilled water. Each sample was placed at 50 ° C. for 2 minutes and at 95 ° C. for 10 minutes, and then a cycle for 15 seconds at 95 ° C. and 1 minute at 60 ° C. was repeated 40 times to perform a reaction for quantification. As a result, the expression level of TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, and IL-8 was clearly reduced by the addition of TLCA, and mRNA of various cytokines by TLCA on rabbit alveolar macrophages An expression suppressing action was found (FIG. 12).
[0110]
Example 12 Preparation of TGR5 gene-introduced THP-1 cells
TGR5 highly expressing cells were established by introducing the TGR5 gene into the human macrophage cell line THP-1. First, pcDNA-TGR5 was prepared by incorporating human TGR5 cDNA into pcDNA3.1 (Invitrogen) according to a conventional method. THP-1 was cultured in a medium (RPMI1640 10% FBS), and pcDNA-TGR5 was introduced using Lipofectamine (GibcoBRL) according to a conventional method. Thereafter, G418 (GibcoBRL) was added to the medium to select resistant strains, and a cell line, THP-TGR5, stably expressing high TGR5 was established.
[0111]
Example 13 THP-TGR5 Inhibitory Effect of TLCA on Lipopolysaccharide (LPS) -Induced Tumor Necrosis Factor (TNF) α Secretion and mRNA Expression Levels THP-TGR5 obtained in Example 12 or the original THP- 1 cell 0.5 × 10 ⁶ Diluted to a concentration of 10 / well and 10 ^-8 After overnight culture in a 24-well plate in the presence of M phorbol ester (Wako Pure Chemical Industries), the effect on LPS stimulation-induced TNFα secretion was examined. After culturing in 0.5 ml of a TLCA-added medium or control medium for 1 hour, 0.5 ml of LPS added to the same concentration of TLCA-containing medium or control medium (concentration at the time of addition of 50 ng / ml) was added, and 37 ℃ 5% CO ₂ It was cultured for 24 hours under the conditions. After the culture, the supernatant was collected, and the TNFα content was quantified by the growth inhibitory activity of L929 as in Example 10. Further, total RNA of THP-1 and THP-TGR5 was prepared from cells by the same method as in Example 11 2 hours after addition of LPS. The expression level of human-type TNFα mRNA was determined using TaqMan Cytokine Gene Expression plate I (ABI). The quantitative value was shown as a relative value when the value of the THP-1 cell LPS and TLCA not added was taken as 1. As a result, as shown in FIG. 13, in THP-TGR5, a significant decrease in the amount of TNFα secretion was observed with the addition of TLCA, while the original THP-1 did not have a significant TNFα secretion inhibitory effect. Similarly, a significant decrease in the expression level of mRNA due to the addition of TLCA was also observed. From these results, it was confirmed that the TNFα secretion inhibitory effect observed in rabbit alveolar macrophages was clearly mediated by TGR5, and it was shown that TGR5 is involved in the regulation of such immune functions in vivo.
[0112]
Example 14 Intracellular translocation of TGR5-GFP fusion protein expressed in CHO cells by addition of taurolithocholic acid
An expression plasmid was constructed to express a fusion protein in which Green Fluorescent Protein (GFP) cDNA isolated from Ewan jellyfish was connected to the C-terminus of TGR5 in translation frame. At that time, a fragment excised from the GFP expression vector pQBI25 (Takara Shuzo) was used as the GFP cDNA. In TGR5, the stop codon was corrected to the recognition sequence of the restriction enzyme NheI by the PCR method, and a GFP fragment was ligated thereto and inserted into the expression vector pAKKO-111H described in Example 1. The TGR5 and GFP fusion protein plasmid (hereinafter referred to as TGR5-GFP) expression vector plasmid thus obtained was transfected into CHO-mock cells by the following method. CHO-mock cells are suspended in a growth medium [DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (GIBCO BRL) supplemented with 10% fetal calf serum (GIBCO BRL)] and 0.6 × 10 6. ^Five Cell-chamber concentration in 4 Lab-TekII cover glass chambers (Nalgen Nunc) at 37 ° C, 5% CO ₂ Transfection was performed after overnight culture under conditions. Lipofectamine for transfection ^TM 2000 Reagent (GIBCO BRL) was used. First Lipofectamine ^TM A chamber in which 2 μl of 2000 Reagent and 50 μl of OPTI-MEM-I (GIBCO BRL) were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to form a complex of DNA and lipofectamine, and then the above CHO cells were cultured 100 μl is added to the solution, and further 37 ° C., 5% CO 2 ₂ Cultured overnight under conditions. The medium was replaced with a confocal microscope observation medium [hanks' balanced salt solution (GIBCO BRL) in which 0.1% bovine albumin (Essentially Fatty Acid Free, GIBCO BRL) was suspended]. ) Fluorescence images of GFP were observed. At that time, GFP was excited at 488 nm.
As a result, TGR5-GFP fusion protein was observed in the cell membrane (FIG. 14). Taurolithocholic acid is added to these cells. ^-Five It was found that GFP fluorescence migrated to the cytoplasm, not to the cell membrane, 30 minutes after addition to the medium so as to be M (FIG. 15). This indicates that TGR5 is a G protein-coupled receptor expressed in the cell membrane, and that TGR5 is translocated to the cytoplasm in response to taurolithocholic acid, that is, internalized.
[0113]
Example 15 Activation of MAP kinase in TGR5-expressing CHO cells by addition of taurolithocholic acid
A stable TGR5-expressing CHO (CHO-TGR5) or CHO-mock cell prepared by a known method using the TGR5 expression vector prepared in Example 1 was 3 × 10 ^Five / Well in a 6-well plate, cultured overnight in a low-concentration medium (a nucleic acid-free MEMα medium supplemented with 0.5% dialyzed fetal bovine serum), and further a serum-free medium (nucleic acid The medium was replaced with MEMα-free MEMα medium supplemented with 0.1% bovine serum albumin) and cultured overnight. After changing to a new serum-free medium and culturing for 3 hours, 2 μM taurolithocholic acid (TLCA) was added. After incubation for 0-20 minutes, the cells were lysed / extracted with sample buffer (TEFCO) and separated by SDS-PAGE. Thereafter, Western blotting was performed using PhosphoPlus p44 / 42 MAP kinase (Thr202 / Tyr204) Antibody Kit (Cell Signaling Technology, Inc). As a result, as shown in FIG. 16, it was found that activation of the protein indicated by phosphorylation of MAP kinase occurred only in TGR5-expressing CHO cells, with a peak at 5 minutes after TLCA addition.
[0114]
Example 16 cAMP production increasing activity of various bile acids in TGR5-expressing CHO cells
CHO-TGR5 2 × 10 ^Four After culturing overnight in a 96-well plate at a concentration of / well, it was used for measurement of cAMP production. Cells were washed twice with assay buffer (DMEM supplemented with 0.1% bovine serum albumin, 0.2 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX) and preincubated for 30 minutes. After the cells were washed twice, samples diluted in assay buffer were added to the cells and incubated for 20 minutes. The culture supernatant was discarded, and the amount of cAMP produced was measured by cAMP Screen System (ABI). As a positive control, 10 μM lithocholic acid (LCA) was used. The amount of cAMP produced was expressed as a percentage when the positive control was taken as 100%. As a result, as shown in FIG. 17, the concentration-dependent increase in cAMP production in the order of taurolithocholic acid (TLCA), lithocholic acid (LCA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), and cholic acid (CA). Was observed. Further, the cAMP production increasing activity in CHO-TGR5 by other bile acids and cholesterol metabolizing compounds at a concentration of 2 μM was compared, and the results are shown in FIG. In each of LCA, DCA, CDCA, and CA, it was found that any of taurine conjugate (T), glycine conjugate (G), and non-conjugated (F) had cAMP production increasing activity.
[0115]
Example 17 Human TGR5 mRNA expression distribution analysis
ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems) was used for quantification of mRNA expression level. Primers and probes used for the quantification of the expression level were designed based on the base sequence of human TGR5 (SEQ ID NO: 2), using software exclusive for ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). The template cDNA was synthesized at 42 ° C. using random primers from 1 μg of polyA + RNA (Clontech) derived from various human tissues. SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) was used for the reverse transcription reaction, and the reaction was carried out according to the attached manual. After completion of the reaction, ethanol precipitation was performed and dissolved in 100 μl. In addition, as a cDNA derived from the fractionated human blood cells, Multiple Tissue cDNA (MYTC) ^TM ) Panels Human Blood Fractions (Clontech) was used. The reaction solution of ABI PRISM 7700 Sequence Detector was in accordance with the manual of TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), master mix was 12.5 μl, primer was 0.9 μM, probe was 0.25 μM, and cDNA solution of each sample was 1 μl. To 25 μl with distilled water. The reaction with ABI PRISM 7700 Sequence Detector was performed by repeating 40 cycles of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, and then 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute.
The expression distribution of TGR5 mRNA in various human tissues is shown in FIG. High expression was found in tissues related to immunity such as placenta, spleen, and lung. Moreover, the expression level of TGR5 mRNA in human blood cells is shown in FIG. High expression was found in blood cells expressing CD14, that is, monocytes / macrophages.
[0116]
Example 18 Rabbit TGR5 mRNA Expression Distribution Analysis
The expression level of rabbit TGR5 mRNA was determined in the same manner as in Example 17. The primers and probe used were designed based on rabbit TGR5 (SEQ ID NO: 15). Total RNAs derived from various rabbit tissues were obtained from NZW females with a body weight of around 2.5-3.0 kg purchased from Kitayama Labes, and prepared according to the attached manual using Isogen (Nippon Gene). did. cDNA was synthesized from 1 μg of the prepared total RNA in the same manner as in Example 17. However, after reverse transcription reaction, it was dissolved in 40 μl.
As shown in FIG. 21, the expression of rabbit type TGR5 mRNA was highly expressed in the spleen, alveolar macrophages and thymus involved in immunity.
[0117]
Example 19 Increased cAMP production of rabbit alveolar macrophages by TLCA
Rabbit alveolar macrophages prepared by the method of Example 9 were suspended in medium (DMEM supplemented with 2% FBS, 0.1 mM non-essential amino acid, 50 μg / ml streptomycin, 50 U / ml penicillin, 50 μg / ml gentamicin). 2 × 10 ^Five The cells were seeded in a 96-well plate at a concentration of / well and cultured overnight. The cells were washed twice with a medium in which 0.1% BSA and 1 mM IBMX were added to DMEM, and then 200 μM of TLCA diluted in the same medium or a medium was added and incubated for 4 minutes. As a result of measuring cAMP production amount by cAMP Screen System (ABI), as shown in FIG. 22, increase of cAMP production amount was recognized by addition of TLCA.
[0118]
Example 20 Inhibitory effect of various bile acids on phagocytic activity of rabbit alveolar macrophages
In accordance with the method of Example 9, rabbit alveolar macrophages were prepared, and the phagocytic inhibitory effect of various bile acids was examined. As a result, as shown in FIG. 23, when GLCA and LCA were added at 100 μM in addition to TLCA, a marked decrease in phagocytic activity, which is one of the immune functions of macrophages, was observed.
[0119]
Example 21 Inhibitory effect of bile acids on TNFα secretion from rabbit alveolar macrophages
Rabbit alveolar macrophages prepared by the method of Example 9 were suspended in medium (DMEM supplemented with 2% FBS, 0.1 mM non-essential amino acid, 50 μg / ml streptomycin, 50 U / ml penicillin, 50 μg / ml gentamicin). 0.25 × 10 ⁶ The cells were seeded in a 24-well plate at a concentration of / well and cultured overnight. Bile acid was diluted using the same medium and added to alveolar macrophages at the concentration indicated in the graph and cultured for 1 hour. Further, a bile acid sample with the same concentration was added with lipopolysaccharide (LPS, E. coli O111: B4 Wako Pure Chemical Industries) and cultured for 12 hours. The concentration of LPS was added at 1 ng / ml. After the culture, the culture supernatant was collected, and TNFα in the supernatant was quantified in the same manner as in Example 10. As a result, as shown in FIG. 24, the inhibitory activity on the amount of TNFα secretion was confirmed in a concentration-dependent manner by the addition of bile acid exhibiting agonist activity to TGR5.
[0120]
Example 22 Increased cAMP production in THP-1 cells introduced with TGR5 gene
After washing THP-1 or the TGR5 highly expressing cell line THP-TGR5 obtained in Example 12 with assay medium (DMEM supplemented with 0.1% BSA and 1 mM IBMX), 1 × 10 ^Five / Well in 96-well plate. Bile acid diluted in the above assay medium was added and incubated for 20 minutes. Thereafter, the amount of cAMP produced was measured by cAMP Screen System (ABI). As a result, as shown in FIG. 25, an increase in the amount of cAMP produced by addition of TLCA, LCA, and DCA was observed in THP-TGR5. On the other hand, since no increase in cAMP production by TLCA was observed in THP-1, it was confirmed that the increase in cAMP by these bile acids was a reaction via TGR5.
[0121]
Example 23 Inhibitory effect of various bile acids on tumor necrosis factor (TNF) α secretion from THP-TGR5 stimulated with LPS
THP-TGR5 or THP-1 cells were treated in the same manner as in Example 13, and the inhibitory effect of various bile acids on TNFα secretion stimulated with LPS was examined. LPS stimulation was performed for 12 hours, and after collecting the culture supernatant, the TNFα content was measured by bioassay as in Example 13. As a result, as shown in FIG. 26, in THP-TGR5, a decrease in TNFα secretion was recognized depending on the concentration of bile acids. On the other hand, THP-1 did not show a significant TNFα secretion inhibitory effect (FIG. 27). From these results, it was confirmed that the TNFα secretion inhibitory effect observed in rabbit alveolar macrophages was clearly mediated by TGR5, and it was shown that TGR5 is involved in the regulation of such immune functions in vivo.
[0122]
Reference Example 1 Amplification of human GPR7 DNA by PCR using human chromosomal DNA
DNA amplification was performed by PCR using human chromosomal DNA as a template and two synthetic primers (SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43). The synthetic primer was constructed so that the gene in the region translated into the receptor protein was amplified. At this time, the base sequence recognized by the restriction enzyme ClaI was added to the 5 ′ side of the gene, and the restriction enzyme SpeI was added to the 3 ′ side. The recognition sequences for the respective restriction enzymes were added to the 5 ′ side and the 3 ′ side so that the base sequence recognized by (2) was added. The composition of the reaction solution is as follows: human chromosomal DNA (Takara) 0.5 μg, synthetic DNA primer 1 μM each, 0.8 mM dNTPs, 1 mM MgCl ₂ The total reaction volume was 50 μl with 1 μl of KOD polymerase (Toyobo) and the buffer attached to the enzyme. A cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Takara). After heating at 94 ° C for 60 seconds, a cycle of 98 ° C for 15 seconds, 65 ° C for 2 seconds, and 74 ° C for 30 seconds was repeated 35 times. The amplification product was confirmed by ethidium bromide staining after 0.8% agarose gel electrophoresis.
[0123]
Reference Example 2 Confirmation of amplified DNA sequence by subcloning of PCR product into plasmid vector and decoding of base sequence of inserted DNA
The PCR reaction solution performed in Reference Example 1 was separated by 0.8% low-melting point agarose gel electrophoresis, and the band portion was cut out with a razor, and then fragmented, phenol extracted, phenol / chloroform extracted, and ethanol precipitated. The operation was performed to recover DNA. pCR-Script ^TM The recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR-Script Amp SK (+) in accordance with the Amp SK (+) cloning kit (Stratagene). This is introduced into Escherichia coli DH5α competent cell (Toyobo) and transformed, and then a clone having a DNA insertion fragment is selected on an LB agar medium containing ampicillin, IPTG and X-gal and exhibits a white color. Only the clone was isolated using a sterilized toothpick to obtain a transformant E. coli DH5α / GPR7. Individual clones were cultured overnight in LB medium containing ampicillin, and plasmid DNA was prepared using QIAwell 8 Plasmid Kit (Qiagen). A portion of the prepared DNA was cleaved with restriction enzymes ClaI and SpeI, and the size of the inserted receptor DNA fragment was confirmed. The reaction for determining the base sequence was performed using DyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems) and decoded using a fluorescent automatic sequencer (SEQ ID NO: 39). The pCR-Script Amp SK (+) plasmid carrying the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 was designated as pCR-Script human GPR7. The amino acid sequence of human GPR7 encoded by the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 is shown in SEQ ID NO: 38. The DNA sequence of human GPR7 determined here is 2 bases from the DNA sequence described in O'Dowd et al. (O'Dowd, BF et al., Genomics, 28, 84-91, 1995). It was different. These correspond to positions 893 and 894 of SEQ ID NO: 39, which are C and G in the report of O'Dowd et al., But were G and C in this reference example. Thus, in the translated example, the 296th amino acid of SEQ ID NO: 38 in the translated amino acid sequence becomes Ser in the present example as Thr reported by O'Dowd et al.
[0124]
Reference Example 3 Acquisition of GPR7 ligand precursor gene from whole human brain cDNA by PCR and construction of expression plasmid
Using human whole brain cDNA purchased from Clontech as a template, PCR amplification was performed using the following two synthetic DNAs.
GSF1: 5'-GTCGACATGGCCCGGTCCGCGACACTGGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 40)
GSR2: 5'-GCTAGCAGCGGTGCCAGGAGAGGTCCGGGCTCA-3 '(SEQ ID NO: 41)
PCR reaction solution was 1 μl of cDNA solution, 0.5 μl GSF1 (10 μM), 0.5 μl GSR2 (10 μM), 2.5 μl attached 10 × reaction solution, 2.5 μl dNTP (10 mM), 0.5 μl KlenTaq (clone 17.5 μl Otsuka distilled water was added to make a total of 25 μl. The reaction solution was subjected to PCR reaction using ThermalCycler 9600. PCR conditions were as follows: denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. 20 and 72 ° C. for 20 seconds. After confirming amplification of a PCR product of about 400 bp by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was purified using a QIAGEN PCR purification Kit and directly sequenced. As a result, FIG. 28 (SEQ ID NO: 37) was obtained. ) Was obtained. The amino acid sequence predicted from the DNA sequence of FIG. 28 was as shown in FIG. 29 (SEQ ID NO: 36). Next, the PCR product collected from the gel was subcloned into E. coli JM109 using a TA cloning kit (Invitrogen) to obtain E. coli JM109 / pTAhGPR7-1. Plasmid pTAhGPR7-1 was extracted from E. coli obtained by subcloning using a plasmid extractor (Kurabo), the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was the same human GPR7 ligand cDNA as in FIG. confirmed. Next, a human GPR7 ligand cDNA fragment of about 0.4 kb was obtained from the plasmid after digestion with restriction enzymes SalI and NheI. Furthermore, pAKKO-111H, which is an expression vector for animal cells, was digested with restriction enzyme sites SalI and NheI in the multicloning site portion, followed by electrophoresis, and the vector portion was recovered. The human GPR7 ligand cDNA fragment and the expression vector prepared by the above operation were ligated by ligation, and E. coli JM109 / pAK-S64 was obtained by transforming E. coli JM109.
Transformant E. coli JM109 / pAK-S64 was cultured to prepare a large amount of plasmid pAK-S64 DNA.
[0125]
Reference Example 4 Transient expression of GPR7 expression plasmid and reporter plasmid in Chinese hamster ovary (CHO) cells
Escherichia coli JM109 was transformed with the plasmid obtained by inserting the human GPR7 DNA obtained in Reference Example 3 into an animal cell expression plasmid pAKKO-111H by a known method. After the obtained colonies were isolated and cultured, GPR7 expression plasmid DNA was prepared using QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Moreover, plasmid DNA of pCRE-Luc (Clontech) in which a luciferase gene was linked as a reporter downstream of the cAMP response element (CRE) was prepared in the same manner.
The GPR7 expression plasmid and pCRE-Luc were transiently expressed in CHO cells introduced with an expression vector into which no receptor gene was inserted. CHO cells were seeded in a 96-well plate (Corning Coaster) at 40,000 cells / well and a culture volume of 100 μl and cultured overnight at 37 ° C. For the culture on the plate, a medium in which only 10% fetal bovine serum was added to DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco BRL) was used.
Each plasmid was diluted to a concentration of 240 ng / μl and added to 240 μl of Opti-MEM-I (GibcoBRL) at a ratio of 9 μl of GPR7 expression plasmid and 1 μl of pCRE-Luc. This was mixed with an equivalent amount of 240 μl of Opti-MEM-I to which 10 μl of Lipofectamine 2000 (GibcoBRL) was added, and the liposome and plasmid DNA were mixed according to the method described in the manual attached to Lipofectamine 2000. A complex was formed. This was added at 25 μl / well to the culture medium of CHO cells, and 4 hours later, the culture medium was replaced with assay buffer (DMEM supplemented with 0.1% bovine serum albumin) to make it serum-free. Cultured overnight.
[0126]
Reference Example 5 Ligand gene expression in CHO cells
The animal cell expression plasmid pAK-S64 inserted with the human type ligand cDNA prepared in Reference Example 4 was transiently expressed in CHO cells in the same manner as in Reference Example 5. However, the cells were seeded in 6-well plates (Falcon) at 600,000 cells / well, and after overnight culture, the ligand gene plasmid was introduced. The plasmid diluted to a concentration of 240 ng / μl was added to 10 μl and 240 μl Opti-MEM-I, which was also added to 240 μl Opti-MEM-I plus 10 μl Lipofectamine 2000. Equal amounts were mixed to form a liposome-plasmid DNA complex according to the method described in the manual attached to Lipofectamine 2000. 500 μl / well of this was added to the culture solution of CHO cells, and 4 hours later, the culture solution was replaced with assay buffer to make serum-free. The medium in each well was collected 18 hours after the medium exchange to obtain a CHO cell culture supernatant containing the ligand peptide.
[0127]
Example 24 Detection of Ligand Activity by Reporter Assay
Forskolin was added to the culture medium of CHO cells in which GPR7 was transiently expressed according to the method of Reference Example 4 and the pAK-S64 expression culture supernatant prepared in Reference Example 5 and a final concentration of 2 μM. Similarly, a culture supernatant of CHO cells in which an empty expression vector (pAKKO-111H) into which no ligand gene was inserted was transiently expressed by the method of Reference Example 5 was also added. At that time, the expression supernatant was diluted 2 times, 4 times, 8 times and 16 times with the assay buffer. Incubate at 37 ° C for 4 hours after adding the supernatant to promote or suppress transcription / translation of the reporter (luciferase) gene derived from intracellular signal transduction induced by the agonist activity of the ligand via the receptor. Induced. After the completion of incubation, the assay buffer in each well was removed, and 50 μl of PicaGene LT2.0 (Toyo Ink) luminescent substrate was added. After the cells were lysed and thoroughly mixed with the substrate, the amount of luminescence derived from the expression induction amount of the reporter gene in each well was measured using a plate reader (ARVOsx multilabel counter, PerkinElmer). As a result, suppression of reporter gene expression was detected as a decrease in luciferase activity only when the culture supernatant of pAK-S64 was added (FIG. 30). Furthermore, the degree of this suppression was dependent on the concentration of the culture supernatant of pAK-S64. This indicates that the product expressed by the plasmid inserted into pAK-S64 transduced intracellular signals via GPR7, that is, acted as a ligand for GPR7.
[0128]
【The invention's effect】
By using the screening method / kit of the present invention, a novel G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof and a compound or a salt thereof that changes the binding property of a ligand related to cholesterol metabolism is obtained, The compound or a salt thereof is used for central diseases (for example, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (for example, allergies, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (for example, hypertension, cardiac hypertrophy, angina pectoris). Disease, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), diabetes, immune system disease (eg, Autoimmune disease, immune deficiency, leukemia, etc.), liver / cholestatic disease (eg, cirrhosis, hepatitis, liver failure, cholestasis, stones, etc.), gastrointestinal disease (eg, Ulcer, enteritis, malabsorption, etc.) can be used as medicaments such as prevention and / or treatment of obesity.
The method for determining a ligand of a receptor protein whose ligand has not been determined according to the present invention is simple because various cell systems can be used, and can perform measurement and the like in a short time.
[0129]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding TGR5 obtained in Reference Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (one-letter code).
FIG. 2 shows the base sequence of the cDNA encoding TGR5 obtained in Reference Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (one-letter code) (following FIG. 1).
FIG. 3 shows the base sequence of the cDNA encoding TGR5 obtained in Reference Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (one-letter code) (following FIG. 2).
FIG. 4 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding TGR5 obtained in Reference Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (one-letter code) (following FIG. 3).
FIG. 5 is a hydrophobicity plot of TGR5.
FIG. 6 shows the results of activity detection (n = 2) by cholesterol metabolism-related substances in HEK293 cells (A) introduced with a TGR5 expression vector and HEK293 cells (B) introduced only with the original vector.
FIG. 7 shows the results of induction of reporter gene expression upon ligand stimulation in HEK293 cells.
FIG. 8 shows the results of a reaction of TGR5 with lithocholic acid using Gi.
FIG. 9: Increased expression level of reporter gene by bile acid stimulation of human (B), rabbit (C), bovine (D), mouse (E) and rat (F) type TGR5. All bile acids were added to the culture medium to a concentration of 10 μM. A shows a control (plasmid only).
FIG. 10 shows the inhibitory effect of TLCA (100 μM) on the phagocytic activity of rabbit alveolar macrophages. Average value of n = 3. Significant at **, p <0.01.
FIG. 11 shows the inhibitory effect of TLCA (50 μM) on the secretion of lipopolysaccharide (LPS) -induced tumor necrosis factor (TNF) α in rabbit alveolar macrophages. Average value of n = 3. Significant at **, p <0.01.
FIG. 12 shows the mRNA expression inhibitory effect of various cytokines by TLCA on rabbit alveolar macrophages. A: TNFα; B: IL-1α; C: IL-1β; D: IL-6; E: IL-8.
FIG. 13 shows an inhibitory effect of TLCA (100 μM) on secretion of tumor necrosis factor (TNF) α induced by lipopolysaccharide (LPS) and mRNA expression level in THP-TGR5. Secretion amount: average value of n = 3. Significant at **, p <0.01. mRNA expression level: average value of n = 2.
FIG. 14 shows the localization of TGR5-GFP fusion protein expressed in CHO cells. The white line in the figure indicates 4 μm.
FIG. 15 shows the localization of the fusion protein 30 minutes after TLCA was added to CHO cells expressing TGR5-GFP. The white line in the figure indicates 4 μm.
FIG. 16 depicts detection of MAP kinase activation in CHO-TGR5 by TLCA.
FIG. 17 shows cAMP production increasing activity of TLCA, LCA, DCA, CDCA, CA in CHO-TGR5. Average value of n = 3. The structural formula in the graph indicates bile acid.
FIG. 18 shows a comparison of cAMP production increasing activity in CHO-TGR5 by various bile acid-related compounds (2 μM). Average value of n = 3. TTNPB is an abbreviation for (E)-[(tetrahydrotetramethylnaphthalenyl) propyl] benzoic acid.
FIG. 19 shows TGR5 mRNA expression distribution in human tissues.
FIG. 20 shows TGR5 mRNA expression distribution in human blood cells.
FIG. 21 shows the expression distribution of rabbit TGR5 mRNA.
FIG. 22 shows increased cAMP production of rabbit alveolar macrophages by TLCA. Average value of n = 3. Significant at **, p <0.01.
FIG. 23 shows the inhibitory effect of various bile acids on the phagocytic activity of rabbit alveolar macrophages. Average value of n = 3. Significant at **, p <0.01.
FIG. 24 shows the inhibitory effect of bile acids on TNFα secretion from rabbit alveolar macrophages. Average value of n = 3. Significant at **, p <0.01.
FIG. 25 shows an increase in cAMP production in THP-TGR5 cells by the addition of bile acids. Average value of n = 3. Significant at **, p <0.01.
FIG. 26 shows the inhibitory effect of various bile acids on tumor necrosis factor (TNF) α secretion from THP-TGR5 stimulated with LPS. Average value of n = 3. Significant at **, p <0.01.
FIG. 27 depicts the effect of various bile acids on LPS-stimulated tumor necrosis factor (TNF) α secretion from THP-1. Average value of n = 3.
FIG. 28 shows the DNA sequence of human GPR7 ligand precursor H.
29 shows the amino acid sequence of human GPR7 ligand precursor H. FIG.
FIG. 30 shows a culture supernatant of a CHO cell in which a ligand expression vector pAK-S64 and an empty expression vector (pAKKO-111H) are expressed, and a CHO cell in which an expression plasmid into which GPR7 cDNA is inserted is transiently expressed. The result of adding to the medium together with forskolin (FSK) and detecting suppression of luciferase activity by ligand stimulation is shown.

Claims (2)

（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。(1) SEQ ID NO: G protein-coupled receptor protein or partial peptide, or a salt thereof and (2) of the receptor protein containing the amino acid sequence represented by the receptor protein, which comprises using cholesterol metabolism-related substance Alternatively, a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a salt thereof and a substance related to cholesterol metabolism. （１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または該レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩および（２）コレステロール代謝関連物質を含有することを特徴とする該レセプタータンパク質またはその塩とコレステロール代謝関連物質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。(1) SEQ ID NO: partial peptide or a salt thereof of a G protein-coupled receptor protein or the receptor protein and containing the amino acid sequence represented by (2) the receptor, characterized in that it contains cholesterol metabolism-related substance A kit for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a protein or a salt thereof and a substance related to cholesterol metabolism.

Images