JP4542810B2 - New screening method - Google Patents

Description

本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＲ３９）の用途に関する。   The present invention relates to the use of a G protein-coupled receptor protein (GPR39).

多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ペプチドホルモン、核酸、アミン、脂質等の生理活性物質の標的として、大変重要な役割を担っている。レセプター蛋白質は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質がまだ多く存在しているものと考えられ、それらのレセプター蛋白質に関しても、まだ同定されていないものが多く残っている。さらに、既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかや動物種差があるかどうかなど分かっていないことが多く残っている。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。またゲノム配列の解析から、未知の遺伝子を予測することも盛んに行われている。しかし、多くのＥＳＴやゲノム配列は配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
ヒト由来のＧＰＲ３９のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが報告されている（非特許文献１、特許文献１〜７）。しかしながら、これらのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能およびその生理的リガンドは解明されていなかった。 Many physiologically active substances such as hormones and neurotransmitters regulate biological functions through specific receptor proteins present in cell membranes. Many of these receptor proteins conduct intracellular signal transduction through the activation of conjugated guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as G protein). Since they have a common structure, they are collectively referred to as G protein-coupled receptor protein (GPCR) or 7-transmembrane receptor protein (7TMR).
G protein-coupled receptor protein is present on the surface of each functional cell in living cells and organs, and is used as a target for biologically active substances such as peptide hormones, nucleic acids, amines, and lipids that regulate the functions of these cells and organs. Has a very important role to play. The receptor protein transmits a signal into the cell through binding with a physiologically active substance, and various signals such as activation and inhibition of the cell are induced by this signal.
To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various living organisms and their specific receptor proteins, particularly G protein-coupled receptor proteins, And provide a very important tool for drug development closely related to their functions.
For example, in various organs of a living body, physiological functions are regulated under the regulation by many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In particular, physiologically active substances are present at various sites in the living body, and their physiological functions are regulated through the corresponding receptor proteins. It is thought that many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances still exist in the living body, and many of those receptor proteins that have not yet been identified remain. Furthermore, there are still many unknowns regarding whether or not there are subtypes in known receptor proteins and whether there are differences in animal species.
Clarifying the relationship between substances that regulate complex functions in living bodies and their specific receptor proteins is a very important tool for drug development. In addition, in order to efficiently screen for agonists and antagonists to receptor proteins and develop pharmaceuticals, it is necessary to elucidate the functions of the genes of receptor proteins expressed in vivo and to express them in an appropriate expression system. It was necessary.
In recent years, as a means of analyzing a gene expressed in a living body, research for analyzing a cDNA sequence at random has been actively conducted, and a cDNA fragment sequence thus obtained is expressed by an Expressed Sequence Tag (EST). ) Registered in the database and published. In addition, unknown genes are actively predicted from the analysis of genome sequences. However, many ESTs and genome sequences have only sequence information, and it is difficult to estimate their functions.
An amino acid sequence of human-derived GPR39 and a DNA encoding the same have been reported (Non-patent Document 1, Patent Documents 1 to 7). However, the function of these G protein coupled receptor proteins and their physiological ligands have not been elucidated.

Genomics 1997 Dec 15;46(3):426-34Genomics 1997 Dec 15; 46 (3): 426-34 ＷＯ２００２／６１０８７号WO2002 / 61087 ＵＳ２００２／００４４９１号US2002 / 004491 ＷＯ２００２／３９８８５号WO2002 / 39885 ＷＯ２００２／７１９２８号WO2002 / 71928 ＷＯ２００１／８１６３４号WO2001 / 81634 ＷＯ２００２／７９４９２号WO2002 / 79492 ＷＯ２００２／８６４４３号WO2002 / 86443

従来、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプター蛋白質の特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを決定することは、医薬品開発の標的ともなりうるアゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、現時点でもなお、機能未知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプター蛋白質が多数存在しており、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンド探索および機能解明が切望されている。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガンドが見出されなくても、該レセプター蛋白質の不活化実験（ノックアウト動物）から該レセプター蛋白質の生理作用を解析することにより、該レセプター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することも可能である。これら該レセプター蛋白質に対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全や機能亢進に関連する疾患の予防・治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の遺伝子変異に基づく、生体での該レセプター蛋白質の機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプター蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター蛋白質遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター蛋白質遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプター蛋白質の塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプター蛋白質の遺伝子は、該レセプター蛋白質の機能不全に関与する疾患の予防・治療薬や診断薬に応用することもできる。
本発明は、機能未知のオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ＧＰＲ３９に対するリガンドの決定および該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とそのリガンドの用途に関する。すなわち、本発明は、リガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩、およびリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）もしくは該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供することを目的とする。 Conventionally, substances that inhibit the binding between a G protein-coupled receptor protein and a physiologically active substance (that is, a ligand), or substances that bind to cause a signal transmission similar to that of a physiologically active substance (that is, a ligand) are those receptor proteins. As a specific antagonist or agonist, it has been utilized as a pharmaceutical agent for regulating biological functions. Therefore, determining a specific ligand of a G protein-coupled receptor protein is a very important means in finding agonists and antagonists that can be targets for drug development.
However, there are still many G protein-coupled receptor proteins whose functions are unknown and so-called orphan receptor proteins for which no corresponding ligand has been identified. Is anxious.
The G protein-coupled receptor protein is useful for searching for a new physiologically active substance (that is, a ligand) using its signal transduction action as an index, and for searching for an agonist or antagonist for the receptor protein. On the other hand, even if no physiological ligand is found, an agonist or antagonist for the receptor protein can be prepared by analyzing the physiological action of the receptor protein from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor protein. Is possible. These ligands, agonists or antagonists to the receptor protein can be expected to be used as preventive / therapeutic agents and diagnostic agents for diseases associated with dysfunction or hyperfunction of G protein-coupled receptor proteins.
Furthermore, there are many cases in which a reduction or advancement of the function of the receptor protein in a living body based on a gene mutation of a G protein-coupled receptor protein causes some disease. In this case, not only administration of an antagonist or agonist for the receptor protein, but also introduction of the receptor protein gene into a living body (or a specific organ) or introduction of an antisense nucleic acid to the receptor protein gene It can also be applied to treatment. In this case, the base sequence of the receptor protein is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the gene of the receptor protein is used to prevent diseases associated with dysfunction of the receptor protein.・ It can also be applied to therapeutic drugs and diagnostic drugs.
The present invention relates to determination of a ligand for orphan G protein-coupled receptor protein GPR39 whose function is unknown, and to the use of the G protein-coupled receptor protein and its ligand. That is, the present invention is obtained by using a screening method for the compound (antagonist, agonist) or a salt thereof that changes the binding property between the ligand and the G protein-coupled receptor protein, the screening kit, the screening method, or the screening kit. And a compound (antagonist, agonist) that changes the binding property between the ligand and the G protein-coupled receptor protein, or a salt thereof, and a compound that changes the binding property between the ligand and the G protein-coupled receptor protein Or a drug containing a compound or a salt thereof that changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein.

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト由来のＧＰＲ３９のリガンドが特定の金属元素またはその塩であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。   As a result of extensive research, the present inventors have found that a human-derived GPR39 ligand is a specific metal element or a salt thereof. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.

すなわち、本発明は、
〔１〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）イオン化可能な金属元素またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と該金属元素またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が配列番号：１、配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）イオン化可能な金属元素またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と該金属元素またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング用キット、
〔４〕上記〔１〕記載のスクリーニング方法または上記〔３〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、イオン化可能な金属元素またはその塩と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩、
〔５〕イオン化可能な金属元素またはその塩と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含有してなる医薬、
〔６〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔７〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔８〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔９〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔１０〕試験化合物もしくは元素またはその塩を配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストのスクリーニング方法、
〔１１〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とイオン化可能な金属元素またはその塩との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔１２〕（１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とイオン化可能な金属元素またはその塩との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
〔１３〕上記〔１１〕記載のスクリーニング方法または上記〔１２〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、
〔１４〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストを含有してなる医薬、
〔１５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔１６〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔１７〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔１８〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔１９〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の診断剤、
〔２０〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害、炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の診断剤、
〔２１〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔２２〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔２３〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の診断剤、
〔２４〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害、炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の診断剤、
〔２５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔２６〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔２７〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２８〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害を予防・治療する化合物またはその塩、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２９〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔３０〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる該レセプター蛋白質の発現量を変化させ、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害を予防・治療する化合物またはその塩、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療薬のスクリーニング用キット、
〔３１〕上記〔２７〕記載のスクリーニング方法または上記〔２９〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病を予防・治療する化合物またはその塩、
〔３２〕上記〔２８〕記載のスクリーニング方法または上記〔３０〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害を予防・治療する化合物またはその塩、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療する化合物またはその塩、
〔３３〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤、
〔３４〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤、
〔３５〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤、
〔３６〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤、
〔３７〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療方法、
〔３８〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療方法、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進方法、
〔３９〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療方法、
〔４０〕哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療方法、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制方法、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療方法、
〔４１〕発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
〔４２〕膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療剤またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩の使用、
〔４３〕腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用、および
〔４４〕過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療剤を製造するための（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニスト、または（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩の使用を提供する。 That is, the present invention
[1] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide or salt thereof, and (2) an ionizable metal element Or a method for screening a compound or element or a salt thereof that changes the binding or signal transduction between the receptor protein or a salt thereof and the metal element or a salt thereof, characterized by using a salt thereof,
[2] The screening method according to [1] above, wherein the G protein-coupled receptor protein is a G protein-coupled receptor protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8.
[3] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, its partial peptide or salt thereof, and (2) an ionizable metal element Or a kit for screening a compound or element or a salt thereof that changes the binding or signal transduction between the receptor protein or the salt thereof and the metal element or the salt thereof, characterized by containing the salt,
[4] Same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the ionizable metal element or salt thereof, which can be obtained using the screening method of [1] or the screening kit of [3]. A compound or element or a salt thereof that changes the binding property or signal transduction with a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same amino acid sequence,
[5] Binding or signal transduction with an ionizable metal element or salt thereof and a G protein-coupled receptor protein or salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A pharmaceutical comprising a compound or element or a salt thereof that changes
[6] Development failure, wound, burn, cooling property comprising an agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Decreased learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disorder, prostate enlargement, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, Hair loss, breathing disorder, digestive disorder, heart disorder, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[7] Low tension bladder based on a decrease in bladder perception comprising an agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or a prophylactic / therapeutic agent for hypotonic bladder due to bladder paralysis after surgical operation of the pelvic viscera, or a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter,
[8] Renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergy comprising an antagonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Preventive or therapeutic agent for dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease,
[9] Frequent urination due to overactive bladder comprising a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, nocturnal frequency Urinary, urinary cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse, bladder irritation, or various disorders caused by urolithiasis, cytokines ( Eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia ) Or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)),
[10] When a test compound or element or a salt thereof is contacted with a cell containing a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Intracellular Ca ²⁺ A method for screening an agonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises measuring a concentration increasing activity,
[11] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, its partial peptide or salt thereof, and (2) the receptor protein or its A method for screening an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, characterized by using a compound or element or a salt thereof that changes the binding property between a salt and an ionizable metal element or a salt thereof,
[12] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide or salt thereof, and (2) the receptor protein or its A kit for screening an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, comprising a compound or element or a salt thereof that changes the binding property between a salt and an ionizable metal element or a salt thereof;
[13] Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method of [11] or the screening kit of [12]. An agonist or antagonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof,
[14] A medicament comprising an agonist or antagonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[15] Growth failure, wound, burn comprising G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof Chilliness, decreased learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disturbance, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains Prevention, treatment of anemia, hair loss, respiratory disorder, digestive disorder, heart disorder, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[16] Based on reduction in bladder perception comprising a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof A prophylactic / therapeutic agent for hypotonic bladder due to bladder paralysis after surgical operation of hypotonic bladder or pelvic viscera, or a cytokine (eg, IL-8) secretagogue,
[17] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, Poor development, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disturbance, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, Cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[18] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, A hypotensive bladder or pelvic visceral surgery-based hypotensive bladder prevention / treatment agent or cytokine (eg, IL-8) secretion promoter,
[19] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, Poor development, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disturbance, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, Cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, breathing disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, menstrual irregular kidney dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, perception Diagnostic agent for neuropathy or Wilson disease,
[20] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, Hypotonic bladder based on decreased bladder perception, hypotonic bladder due to bladder numbness after surgical operation of the pelvic viscera, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy Urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, intercourse pain, bladder irritation, various disorders caused by urinary calculi, inflammatory diseases (eg, neurological disorders, diabetic complications such as macrovascular disorders; ulcerative colon Inflammatory bowel diseases such as inflammation; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) Diagnostic agent,
[21] Renal dysfunction comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Preventive or therapeutic agent for pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease,
[22] By overactive bladder comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Prevention of various disorders caused by frequent urination, nocturia, frequent urination due to cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, or urinary calculus Therapeutic agent, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; hypersensitivity Prophylactic / therapeutic agent for genital bowel syndrome; neuralgia) or allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)),
[23] Poor growth or wound comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof Burns, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorders, olfactory disorders, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes , Spots, anemia, hair loss, respiratory failure, digestive disorder, heart failure, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstrual flow, renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson Diagnostic agent for disease,
[24] by overactive bladder comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Urinary frequency, nocturia, urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation symptoms, various disorders caused by urinary stones, inflammatory diseases (Eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorders; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis) , Diagnostic agent for chronic obstructive pulmonary disease (COPD),
[25] Complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof A prophylactic / therapeutic agent for renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence or a part thereof;
[26] Complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof Frequent urination due to overactive bladder comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence or a part thereof, nocturia, nocturia due to cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvis Prophylactic / therapeutic agent for various disorders caused by visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, or urinary calculus, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, neuropathy, macrovascular disorder) Diabetic complications such as; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopy) Dermatitis, prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease (COPD)),
[27] Use of a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof. Change the expression level of the receptor protein characterized by poor development, wounds, burns, chilliness, decreased learning ability, sexual function decline, taste disorders, olfactory disorders, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, A compound or salt thereof that prevents or treats renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease Ningu way,
[28] Use of a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof. The expression level of the receptor protein is changed, hypotonic bladder based on decreased bladder perception, hypotonic bladder due to bladder sensation paralysis after surgical operation of pelvic viscera, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, Frequent urination due to cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, or various disorders caused by urinary stones or salts thereof, Cytokine (eg, IL-8) secretion regulators, or inflammatory diseases (eg, neuropathy, macrovascular disorders, etc .; diabetic complications; ulcerative colitis Screening for compounds or salts thereof that prevent or treat any inflammatory bowel disease; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) Method,
[29] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, Changes the expression level of the receptor protein, poor development, wounds, burns, coldness, learning ability decline, sexual function decline, taste disorder, olfactory disturbance, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation Decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, blemishes, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, renal function Screening for compounds or their salts that prevent or treat disorders, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease Kit,
[30] A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, Low tension bladder based on decreased bladder perception, hypotonic bladder due to bladder sensation paralysis after surgical operation of pelvic viscera, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, cystitis Urinary urinary frequency, urinary incontinence, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse, bladder irritation, or various disorders caused by urinary calculi or its salts, cytokines ( Eg, IL-8) secretory regulator, or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorder; inflammation such as ulcerative colitis) Bowel disease; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (e.g., asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) prophylactic or therapeutic drug screening kit of the)
[31] Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method of [27] or the screening kit of [29]. Changes the expression level of G protein-coupled receptor protein or its partial peptide, poor growth, wound, burn, coldness, decreased learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction , Stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, Compound or salt for preventing or treating depression, irregular menstruation, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease
[32] Contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which can be obtained using the screening method described in [28] or the screening kit described in [30]. Changes the expression level of G protein-coupled receptor protein or its partial peptide, hypotonic bladder based on decreased bladder perception, hypotonic bladder due to bladder sensation paralysis after surgical operation of pelvic viscera, frequent urination due to overactive bladder Prevent and treat various disorders caused by nocturia, nocturia, urinary cystitis, urinary frequency due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, or urinary calculus Compound or salt thereof, cytokine (eg, IL-8) secretion regulator, or inflammatory disease (eg, neurological disorder, diabetic complications such as macrovascular disorder; ulcerative Inflammatory bowel diseases such as enteritis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) or a compound or salt thereof ,
[33] containing a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof. Poor development, wounds, burns, coldness, decreased ability to learn, sexual function, taste disorders, olfactory disturbance, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, Cancer, dystocia, diabetes, blemishes, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[34] containing a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof. A hypotensive bladder or pelvic visceral surgery-based hypotensive bladder prevention / treatment agent or cytokine (eg, IL-8) secretion promoter,
[35] containing a compound or a salt thereof that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof. A preventive or therapeutic agent for renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease,
[36] containing a compound or a salt thereof that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof. Urinary frequency due to overactive bladder, nocturia, urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, or urinary tract stones Agents for the prevention / treatment of disorders, cytokines (eg, IL-8) secretion inhibitors, or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disease; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis) Cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)),
[37] For mammals, (i) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide or a salt thereof, ii) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof; (iii) a sequence An agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 1, or (iv) the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 1 Or a G protein-coupled receptor protein or a part thereof containing substantially the same amino acid sequence Poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteries characterized by administering an effective amount of a compound or its salt that increases the expression level of the peptide Sclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, Prevention and treatment of hypothyroidism, depression or irregular menstruation,
[38] For mammals, (i) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide or a salt thereof, ii) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof; (iii) a sequence An agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 1, or (iv) the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 1 Or a G protein-coupled receptor protein or a part thereof containing substantially the same amino acid sequence Prevention of hypotonic urinary bladder due to hypotonic bladder or pelvic visceral surgery after surgery of reduced urinary bladder perception, characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that increases the expression level of the peptide A method of treatment, or a method of promoting secretion of a cytokine (eg, IL-8),
[39] For mammals, (i) an antibody against a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide, or a salt thereof (Ii) complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof (Iii) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof Or (iv) the same or as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergy, characterized by administering an effective amount of a compound or salt thereof that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing a qualitatively identical amino acid sequence Dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease prevention / treatment method,
[40] For mammals, (i) an antibody against a G protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. (Ii) complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof (Iii) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof Or (iv) the same or as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Frequent urination due to overactive bladder, nocturnal frequent, characterized by administering an effective amount of a compound or salt thereof that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing a qualitatively identical amino acid sequence Urinary, urinary cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, or various disorders caused by urinary stones, cytokines ( Example, IL-8) Secretion suppression method, or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia ) Or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)),
[41] poor development, wound, burn, coldness, learning ability decline, sexual function decline, taste disorder, olfactory disorder, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, reduced resistance to infection, For the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation ( i) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide or salt thereof, and (ii) represented by SEQ ID NO: 1. A polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof (Iii) an agonist for a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (iv) SEQ ID NO: 1. Use of a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented, or a partial peptide thereof,
[42] To produce a prophylactic / therapeutic agent or cytokine (eg, IL-8) secretion promoter for hypotonic urinary bladder due to bladder sensation paralysis after surgical operation of hypotonic urinary bladder or pelvic viscera based on decreased bladder perception (I) a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its partial peptide or a salt thereof, and (ii) represented by SEQ ID NO: 1. A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof, (iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 For a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as Or (iv) a compound or salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. use,
[43] (i) for producing a prophylactic / therapeutic agent for renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson's disease. An antibody against a G protein-coupled receptor protein containing the same amino acid sequence, a partial peptide or a salt thereof, and (ii) a G containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof, or a part thereof, (iii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Protein-coupled receptor protein or salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as Or (iv) a compound or salt thereof that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof Use, and
[44] Frequent urination due to overactive bladder, nocturia due to cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, or urinary calculus Preventive / therapeutic agents for various disorders, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitors, or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disorder; inflammatory such as ulcerative colitis (I) Sequence for producing a prophylactic / therapeutic agent for enteric disease; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic disease (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) An antibody against a G protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 1: (ii) an amino acid represented by SEQ ID No. 1 It comprises a base sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the acid sequence or a partial peptide thereof, or a part thereof. A polynucleotide, (iii) an antagonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (iv) SEQ ID NO: 1 There is provided use of a compound or a salt thereof that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented.

さらに、本発明は、
〔４５〕（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、ＧＰＲ３９と略記する）、その部分ペプチドまたはその塩と、イオン化可能な金属元素（以下、金属元素と略記する）またはその塩とを接触させた場合と、（ii）ＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩と、金属元素またはその塩および試験化合物もしくは元素またはその塩とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４６〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素をＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素のＧＰＲ３９、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４７〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４８〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素をＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４９〕（ｉ）金属元素の放射性同位元素を、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、（ii）金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素のＧＰＲ３９に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５０〕（ｉ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩および試験化合物をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５１〕ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩を、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物もしくは元素またはその塩および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５２〕ＧＰＲ３９を活性化する元素がイオン化可能な金属元素である上記〔５０〕または〔５１〕記載のスクリーニング方法、
〔５３〕ＧＰＲ３９を含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記〔３〕または〔１０〕記載のスクリーニング用キット、
〔５４〕ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＧＰＲ３９を含有することを特徴とする上記〔３〕または〔１０〕記載のスクリーニング用キット、
〔５５〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
〔５６〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
〔５７〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱または月経不順の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
〔５８〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱または骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱の予防・治療薬またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
〔５９〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害またはウイルソン病の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
〔６０〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、または尿路結石によって起こる種々の障害の予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）またはアレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、および
〔６１〕各薬を該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、各薬と該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記〔５５〕〜〔６０〕記載の確認方法等を提供する。 Furthermore, the present invention provides
[45] (i) a G protein-coupled receptor protein (hereinafter abbreviated as GPR39) characterized by containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A partial peptide or a salt thereof and an ionizable metal element (hereinafter abbreviated as a metal element) or a salt thereof; and (ii) GPR39, the partial peptide or a salt thereof, and a metal element or a salt thereof And the screening method according to the above [1], which is compared with the case where the test compound or element or a salt thereof is contacted,
[46] (i) When a metal element radioisotope is brought into contact with GPR39, a partial peptide thereof or a salt thereof; and (ii) A metal element radioisotope and a test compound or element or a salt thereof is GPR39, a portion thereof. The screening method according to the above [1], wherein the amount of binding of a radioisotope of a metal element to GPR39, a partial peptide or a salt thereof is measured and compared when contacted with a peptide or a salt thereof,
[47] (i) When a radioisotope of a metal element is brought into contact with a cell containing GPR39, and (ii) A radioisotope of a metal element and a test compound or element or a salt thereof are brought into contact with a cell containing GPR39. A screening method according to the above [1], wherein the amount of binding of the radioisotope of the metal element to the cell is measured and compared,
[48] (i) When a radioisotope of a metal element is brought into contact with a membrane fraction of a cell containing GPR39; (ii) A radioisotope of a metal element and a test compound or element or a salt thereof contains GPR39. The screening method according to the above [1], wherein the amount of binding of the radioisotope of the metal element to the membrane fraction of the cell is measured when compared with the membrane fraction of the cell to be compared,
[49] (i) A radioisotope of a metal element was expressed on the cell membrane of the transformant by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing DNA containing DNA encoding GPR39. And (ii) the radioisotope of the metal element when the radioisotope of the metal element and the test compound or element or salt thereof are brought into contact with GPR39 expressed on the cell membrane of the transformant. The screening method according to [1] above, wherein the amount of binding to GPR39 is measured and compared,
[50] When (i) a compound or element that activates GPR39 or a salt thereof is contacted with a cell containing GPR39; and (ii) a compound or element that activates GPR39 or a salt thereof and a test compound The screening method of the above-mentioned [1], wherein the cell stimulating activity via GPR39 is measured and compared in the case of contacting with the contained cell,
[51] The cell membrane of the transformant is cultured by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing DNA containing GPR39-encoding compound or element or a salt thereof that activates GPR39. Measurement of GPR39-mediated cell stimulating activity when contacted with expressed GPR39 and when contacted with GPR39 expressed on the cell membrane of the transformant with a compound or element that activates GPR39, or a salt thereof, and a test compound And comparing the screening method according to the above [1],
[52] The screening method according to [50] or [51] above, wherein the element that activates GPR39 is an ionizable metal element,
[53] A screening kit according to [3] or [10] above, comprising a cell containing GPR39 or a membrane fraction thereof,
[54] The GPR39 expressed on the cell membrane of the transformant by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA containing a DNA encoding GPR39. 3] or [10] screening kit,
[55] Development failure, wound, burn, coldness, characterized by using a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof , Decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia , Hair loss, breathing disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, menstrual irregularities, renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease A method for confirming that a therapeutic agent binds to the receptor protein or a salt thereof;
[56] Low tension based on decreased bladder perception characterized by using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Low-tension bladder due to bladder paralysis after surgical operation of the bladder and pelvis, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvis Prophylaxis / treatment of various disorders caused by visceral pain, sexual intercourse, bladder irritation, or urinary calculus, cytokine (eg, IL-8) secretion regulator, or inflammatory disease (eg, neuropathy, macrovascular disorder) Inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease) How preventive and therapeutic agent to confirm that binding to the receptor protein or its salt (COPD)),
[57] Development failure, wound, burn, coldness characterized by using a G protein coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. , Decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia A method for confirming that a prophylactic / therapeutic agent for hair loss, breathing disorder, digestive disorder, heart disorder, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression or irregular menstruation is an agonist for the receptor protein or a salt thereof,
[58] Low tension based on decreased bladder perception, characterized by using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Method for confirming that a prophylactic / therapeutic agent for hypotonic bladder due to bladder paralysis after a surgical operation of the bladder or pelvis or a cytokine (eg, IL-8) secretagogue is an agonist for the receptor protein or a salt thereof ,
[59] Use of a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, A method for confirming that a prophylactic / therapeutic agent for allergic dermatitis, sensory neuropathy or Wilson disease is an antagonist to the receptor protein or a salt thereof,
[60] Frequent urination due to overactive bladder, nighttime, characterized by using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Frequent urine, frequent urination due to cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, intercourse pain, bladder irritation, or various disorders caused by urinary stones, cytokines (Eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; Neuralgia) or allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) are antagonists to the receptor protein or its salts And [61] measuring the binding amount of each drug to the receptor protein, its partial peptide or its salt when each drug is brought into contact with the receptor protein, its partial peptide or its salt. The confirmation method according to the above [55] to [60] is provided.

ＧＰＲ３９とリガンドであるカドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩とを用いることによって、該金属元素またはその塩とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。また、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、活性がより強いアゴニストを見出すことできる。
ＧＰＲ３９に対するアゴニストは、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
ＧＰＲ３９に対するアンタゴニストは、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。 By using GPR39 and ligands such as cadmium, zinc, copper and nickel which are ionizable metal elements or salts thereof, a compound which changes the binding property between the metal element or a salt thereof and GPR39 can be efficiently screened. Can do. Moreover, an agonist with stronger activity can be found by using the screening method of the present invention.
Agonists for GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, infection Reduced resistance, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart problems, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for metal deficiency such as hypotonic urinary bladder based on lowering, hypotensive urinary bladder due to bladder sensation paralysis after pelvic visceral surgery, or a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
Antagonists to GPR39 include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis including interstitial cystitis, Prophylaxis due to benign prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation symptoms, various disorders caused by urinary calculi, and other prophylactic / therapeutic agents, cytokines (eg, IL -8) Secretory inhibitors or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disorder; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergy It is useful as a preventive / therapeutic agent for sex diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).

本発明で使用されるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ＧＰＲ３９（以下、ＧＰＲ３９と略記する場合がある）は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
ＧＰＲ３９は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、腸管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋、膀胱など、特に、膀胱、中枢神経組織、下垂体、腎臓、胃・腸管組織、胎児脳、血管系初代培養細胞、腎臓系初代培養細胞または大腸がん細胞株に由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。 The G protein-coupled receptor protein GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as GPR39) used in the present invention is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is.
GPR39 is, for example, any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, pancreatic β cell, bone marrow cell) of a human or mammal (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.). Mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, favorable cells Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or of these cells Progenitor cells, stem cells or cancer cells) or blood cells, or any tissue in which these cells exist, such as the brain, brain regions (eg, olfactory bulb, buccal nucleus, basal sphere, Horse, thalamus, hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, nigra), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, Kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), intestine, blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, Prostate, testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, bladder, etc., especially bladder, central nervous tissue, pituitary gland, kidney, stomach / intestinal tissue, fetal brain, vascular primary culture cells, kidney It may be a protein derived from a primary cultured cell or a colorectal cancer cell line, or may be a synthetic protein.

配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。 The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 80% or more, preferably 90% or more, more preferably about 95% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. An amino acid sequence having the homology of
The protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention has, for example, the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
The homology of the amino acid sequence was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Alignment Search Tool), and the following conditions (expectation value = 10; allow gap; matrix = BLOSUM62; filtering = OFF) Can be calculated.
Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal information transmission action. “Substantially homogeneous” means that their activities are homogeneous in nature. Accordingly, the activities such as ligand binding activity and signal signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
Measurement of activities such as ligand binding activity and signal information transmission activity can be performed according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.

また、ＧＰＲ３９としては、ａ）配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。   Further, as GPR39, a) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 An amino acid sequence from which about several amino acids are deleted (preferably several (1 to 5)), b) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 An amino acid sequence to which the above (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are added, c) SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) in the amino acid sequence represented by 6 or SEQ ID NO: 8. Other amino acids The amino acid sequence are substituted with amino acids, or d) be such as protein containing the amino acid sequence comprising a combination thereof is used.

本明細書におけるＧＰＲ３９は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとするＧＰＲ３９は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ⁻)、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＧＰＲ３９がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明でいうＧＰＲ３９に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＧＰＲ３９には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
ＧＰＲ３９の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＧＰＲ３９、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＧＰＲ３９、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ＧＰＲ３９などが用いられる。ヒト由来ＧＰＲ３９は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７ Ｄｅｃ １５；４６（３）：４２６−３４、ＷＯ２００２／６１０８７号公報、ＵＳ２００２／００４４９１号公報、ＷＯ２００２／３９８８５号公報、ＷＯ２００２／７１９２８号公報、ＷＯ２００１／８１６３４号公報、ＷＯ２００２／７９４９２号公報、ＷＯ２００２／８６４４３号公報に記載されている公知の蛋白質である。 In the present specification, GPR39 is the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation. GPR39 including a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a C-terminal carboxyl group (—COOH), carboxylate (—COO ⁻ ), amide (—CONH ₂ ) or ester (—COOR). Any of these may be used.
Here, as R in the ester, for example, a C _1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C _3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, for example, phenyl C _6-12 aryl groups such as α-naphthyl, C _7- such as phenyl-C _1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or α-naphthyl-C _1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl _In addition to the ₁₄ aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group, which is widely used as an oral ester, is used.
When GPR39 has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in GPR39 as used in the present invention. As the ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.
Furthermore, in GPR39, the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, a C _1-6 acyl group such as a C _2-6 alkanoyl group such as formyl group or acetyl) in the above-mentioned protein. A glutamyl group produced by cleavage of the N-terminal side in vivo, pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, An indole group, a guanidino group, etc.) protected with an appropriate protecting group (for example, a C _1-6 acyl group such as a formyl group, a C _2-6 alkanoyl group such as acetyl), or a sugar chain is bound Complex proteins such as so-called glycoproteins are also included.
Specific examples of GPR39 include, for example, human-derived GPR39 composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, mouse-derived GPR39 composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8. Rat-derived GPR39 or the like is used. Human-derived GPR39 is described in Genomics, 1997 Dec 15; 46 (3): 426-34, WO2002 / 61087, US2002 / 004491, WO2002 / 39885, WO2002 / 71928, WO2001 / 81634, It is a known protein described in WO2002 / 79492 and WO2002 / 86443.

ＧＰＲ３９の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記したＧＰＲ３９の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＧＰＲ３９の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１：配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するＧＰＲ３９の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列の相同性は、前記と同様の相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、同様の条件にて計算することができる。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。 The partial peptide of GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as “partial peptide”) may be any peptide as long as it is a partial peptide of GPR39 as described above. And those having substantially the same receptor binding activity are used.
Specifically, as a partial peptide of GPR39 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis A peptide containing a portion that has been analyzed. In addition, a peptide partially including a hydrophobic site can be used as well. Peptides containing individual domains can also be used, but partial peptides containing multiple domains simultaneously may be used.
The number of amino acids of the partial peptide of the present invention is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more, among the constituent amino acid sequences of the receptor protein of the present invention described above. .
A substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having a homology of about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more with these amino acid sequences.
The homology of amino acid sequences can be calculated under the same conditions using the same homology calculation algorithm NCBI BLAST as described above.
Here, “substantially the same receptor activity” has the same meaning as described above. “Substantially the same receptor activity” can be measured in the same manner as described above.

また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＧＰＲ３９と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ＧＰＲ３９またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。 In the partial peptide of the present invention, one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acids One or more (preferably about 1 to 10, more preferably about several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the sequence may be substituted with other amino acids.
In the partial peptide of the present invention, the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁻ ), an amide (—CONH ₂ ), or an ester (—COOR). When the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.
Furthermore, in the partial peptide of the present invention, as in GPR39 described above, the amino group of the methionine residue at the N-terminus is protected with a protecting group, and the glutamyl group produced by cleavage of the N-terminal side in vivo is Also included are those that have been glutamine oxidized, those in which substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected with an appropriate protecting group, and complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
Examples of the salt of GPR39 or a partial peptide thereof include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.

ＧＰＲ３９またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載するＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。 GPR39 or a salt thereof can be produced from a human or mammalian cell or tissue as described above by a known method for purifying a receptor protein, or a transformant containing a DNA encoding GPR39 described later is cultured. Can also be manufactured. Moreover, it can also manufacture according to the protein synthesis method described later or this.
When producing from human or mammalian tissue or cells, the human or mammalian tissue or cells are homogenized and then extracted with acid, etc., and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.

ＧＰＲ３９もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢt、 ＨＯＯＢt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステルあるいはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。 For the synthesis of GPR39 or its partial peptide or its salt or its amide, a commercially available protein synthesis resin can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl. Examples include phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and further, intramolecular disulfide bond forming reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or its amide.
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimide, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric acid anhydride, HOBt ester, or HOBt ester. Can then be added to the resin.

保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。   The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide and the like Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for protein bond forming reaction, and is usually selected appropriately from a range of about -20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of a test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.

原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。 Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group is, for example, alkyl esterified (eg, linear, branched or cyclic alkyl ester such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc. ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxy It can be protected by carbonyl hydrazation, trityl hydrazation or the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include groups derived from carbonic acid such as lower alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl ₂ -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc, and the like.

原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用いられる。
原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。 Examples of the activated carboxyl group of the raw material include a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like.
As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro. Acid treatment with romethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about −20 to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4- Addition of a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.

原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。 The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the removal of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein, for example, first, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide (protein) chain is extended to the desired chain length on the amino group side. A protein from which only the N-terminal α-amino protecting group of the peptide chain is removed and a protein from which only the C-terminal carboxyl protecting group has been removed are prepared, and both proteins are mixed in a mixed solvent as described above. To condense. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-described method to obtain the desired crude protein. This crude protein can be purified using various known purification means, and the amide form of the desired protein can be obtained by lyophilizing the main fraction.
In order to obtain a protein ester, for example, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired protein ester is obtained in the same manner as the protein amide. be able to.

ＧＰＲ３９の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＧＰＲ３９を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ＧＰＲ３９を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
ｂ）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。 A partial peptide of GPR39 or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving GPR39 with an appropriate peptidase. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute GPR39 and the remaining part are condensed, and when the product has a protecting group, the target peptide can be produced by removing the protecting group. Examples of known condensation methods and protecting group elimination include the methods described in the following a) to e).
a) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
b) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
c) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
d) Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
e) Supervision by Yajima Haruaki, Development of follow-up medicines Volume 14: Peptide synthesis Hirokawa Shoten In addition, after the reaction, this is a combination of conventional purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. The partial peptide of the invention can be purified and isolated. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method. Can do.

ＧＰＲ３９をコードするポリヌクレオチドとしては、上記したＧＰＲ３９をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
ＧＰＲ３９をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、ＧＰＲ３９のｍＲＮＡを定量することができる。
ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるＧＰＲ３９と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。 The polynucleotide encoding GPR39 may be any polynucleotide as long as it contains the above-described base sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding GPR39. The polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding GPR39, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using a polynucleotide encoding GPR39, mRNA of GPR39 can be quantified, for example, by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its application” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
The DNA encoding GPR39 may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
Specifically, as a DNA encoding GPR39, for example, it hybridizes with a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under highly stringent conditions. Activity having substantially the same quality as GPR39 having a base sequence and consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, ligand binding activity, signal information transmission effect, cytokine (eg, IL-8) secretion promoting effect, etc.) Any DNA may be used as long as it encodes a receptor protein having the above.
The DNA capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. A DNA containing a nucleotide sequence having a property is used.

塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるラットＧＰＲ３９をコードするＤＮＡとしては、配列番号：９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ＧＰＲ３９遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＧＰＲ３９をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＧＰＲ３９遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＧＰＲ３９関連ＲＮＡとの相互作用を介してＧＰＲ３９遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＧＰＲ３９関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＧＰＲ３９関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＧＰＲ３９遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。ＧＰＲ３９遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ＧＰＲ３９遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 The homology of the base sequence was determined by using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Alignment Search Tool) and the following conditions (expectation value = 10; allow gap; filtering = ON; match score = 1; It can be calculated by mismatch score = -3).
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions.
The highly stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding human GPR39 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used. As the DNA encoding mouse GPR39 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, DNA composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 is used. As the DNA encoding rat GPR39 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 is used.
A polynucleotide containing a part of the base sequence of DNA encoding GPR39 or a part of the base sequence complementary to the DNA only includes DNA encoding the following partial peptide of the present invention. It is also used to include RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting GPR39 gene replication or expression is designed based on the cloned or determined DNA sequence information encoding GPR39, Can be synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the GPR39 gene, inhibit the synthesis or function of the RNA, or can express the expression of the GPR39 gene through interaction with the GPR39-related RNA. It can be adjusted and controlled. A polynucleotide complementary to a selected sequence of a GPR39-related RNA and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the GPR39-related RNA is used to regulate and control the expression of the GPR39 gene in vivo and in vitro. It is useful, and is also useful for treatment or diagnosis of diseases and the like. The term “corresponding” means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the instruction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . GPR39 gene 5 'end hairpin loop, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation initiation codon, 3' end untranslated region, 3 ' The end palindromic region and the 3 ′ end hairpin loop can be selected as preferred target regions, but any region within the GPR39 gene can be selected as the target.

目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。   It can be said that the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide capable of hybridizing complementary to at least a part of the target region is “antisense” with the target. Antisense polynucleotides include 2-deoxy-D-ribose-containing polydeoxyribonucleotides, D-ribose-containing polyribonucleotides, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Nucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages, provided that the polymer is found in DNA or RNA And a nucleotide having a configuration allowing base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and also unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), and more publicly known Modified, such as those with labels known in the art, capped, methylated, substituted one or more natural nucleotides with analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), For example, proteins (nucleases, nuclease inhibitors, and toxins) , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides), etc., side chain groups, intercurrent compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelates Compounds containing compounds (for example, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. As used herein, “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.

本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。 The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives and thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to increase the affinity for the target sense strand, and to be antitoxic if toxic Make sense nucleic acids less toxic.
Thus, many modifications are known in the art, such as J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Crooke et al. Ed ., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993, etc.
The antisense nucleic acid of the present invention may be altered or contain modified sugars, bases and bonds, provided in special forms such as liposomes, microspheres, applied by gene therapy, It can be given in an added form. In this way, the additional form includes polycationic substances such as polylysine that acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, lipids that enhance interaction with cell membranes and increase nucleic acid uptake ( For example, hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterols). Preferred lipids to be added include cholesterol and derivatives thereof (for example, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 ′ end or 5 ′ end of the nucleic acid and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Examples of the other group include a cap group specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid, which prevents degradation by a nuclease such as exonuclease or RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of G protein-coupled receptor protein. it can. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.

本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ＧＰＲ３９と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、前記した相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、同様の条件にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションの方法および条件は前記と同様である。 The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide of the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Moreover, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells / tissues described above.
Specifically, as the DNA encoding the partial peptide of the present invention, for example, (1) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) SEQ ID NO: 2 And has substantially the same activity as GPR39 (eg, ligand binding activity, signal transduction activity, cytokine (eg, IL-8)). A DNA having a partial base sequence of a DNA encoding a receptor protein having a secretion promoting action or the like is used.
The DNA capable of hybridizing to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. DNA containing a base sequence having
The homology of the base sequence can be calculated under the same conditions using the above-mentioned homology calculation algorithm NCBI BLAST.
Hybridization methods and conditions are the same as described above.

ＧＰＲ３９またはその部分ペプチド（以下、ＧＰＲ３９と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、ＧＰＲ３９の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＧＰＲ３９の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。   As a means of cloning DNA that completely encodes GPR39 or a partial peptide thereof (hereinafter sometimes abbreviated as GPR39), amplification is performed by a PCR method using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of GPR39, or DNA incorporated in an appropriate vector can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding part or all of GPR39 or labeled with synthetic DNA. The method of hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989), for example. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.

ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＧＰＲ３９をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
ＧＰＲ３９の発現ベクターは、例えば、（イ）ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 The DNA base sequence is converted by PCR or a known kit such as Mutan ^™ -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan ^™ -K (Takara Shuzo), etc. It can be carried out according to a method known per se, such as a Gapped duplex method, a Kunkel method or the like.
The cloned DNA encoding GPR39 can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker as desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
An expression vector for GPR39 can be produced by, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from DNA encoding GPR39 and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. it can.

ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。 Examples of vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as the host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Among these, it is preferable to use a CMV promoter, an SRα promoter, or the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, .lambda.P _L promoter, lpp promoter, etc. When the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter and penP promoter, the host is In the case of yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.

発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。 In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) and the like is used as desired. it can. Examples of selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp ^r ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo ^r, G418 resistance). In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using CHO (dhfr ⁻ ) cells, the target gene can be selected even in a medium not containing thymidine.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. When the host is Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA, signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. are used in yeast. In some cases, MFα • signal sequence, SUC2 • signal sequence, etc. When the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using a vector containing the DNA encoding GPR39 thus constructed.

宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。 As the host, for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
As a specific example of the genus Escherichia, Escherichia coli K12 / DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology]. 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. are used. .
Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis MI114 [Gen, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984). )] Etc. are used.
Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R ⁻ , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia It is done.

昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^ＴＭ細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。 As insect cells, for example, when the virus is AcNPV, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Sf cells), Trichoplusia ni midgut-derived MG1 cells, Trichoplusia ni egg-derived High Five ^™ Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, silkworm-derived cell lines (Bombyx mori N; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)).
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr ⁻ ) cells), mouse L Cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells and the like are used.

エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Gene），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。 To transform Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982), and the like.
Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences of The method can be performed according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
In order to transform animal cells, for example, cell engineering separate volume 8 new cell engineering experiment protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Vol. 52, 456 (1973).
In this way, a transformant transformed with an expression vector containing DNA encoding GPR39 is obtained.
When cultivating a transformant whose host is an Escherichia bacterium or Bacillus genus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, including a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean cake, and potato extract. Examples of inorganic or organic substances and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.

エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。 As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics] 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. In order to make the promoter work efficiently as necessary, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added.
When the host is Escherichia, the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When the host is Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
When cultivating a transformant whose host is yeast, examples of the medium include a Burkholder minimum medium [Bostian, KL et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of Science. The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proceedings of the National -Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. The culture is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.

宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., ネイチャー（Nature）, 195, 788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にＧＰＲ３９を生成せしめることができる。 When cultivating a transformant whose host is an insect cell or insect, 10% bovine serum that has been immobilized on Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)), etc. Those appropriately added with these additives may be used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The culture is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
When cultivating a transformant whose host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950)] is used. The pH is preferably about 6-8. The culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
As described above, GPR39 can be generated inside the cell, the cell membrane, or extracellularly of the transformant.

上記培養物からＧＰＲ３９を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
ＧＰＲ３９を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＧＰＲ３９の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＧＰＲ３９が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＧＰＲ３９の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 Separation and purification of GPR39 from the culture can be performed, for example, by the following method.
When GPR39 is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and cultured by ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw. Or after destroying a cell, the method of obtaining the rough extract of GPR39 by centrifugation or filtration etc. are used suitably. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ^™ . When GPR39 is secreted into the culture solution, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se after completion of the culture, and the supernatant is collected.
Purification of GPR39 contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method utilizing specific newness such as affinity chromatography, and difference in hydrophobicity such as reversed phase high performance liquid chromatography And a method using a difference in isoelectric point, such as isoelectric focusing method.

かくして得られるＧＰＲ３９が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＧＰＲ３９を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成するＧＰＲ３９の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。 When GPR39 thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, a method known per se or a method analogous thereto Can be converted to the free form or other salts.
The GPR39 produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification. Examples of the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
The activity of GPR39 thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.

ＧＰＲ３９に対する抗体は、ＧＰＲ３９を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
ＧＰＲ３９に対する抗体は、ＧＰＲ３９を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。 The antibody against GPR39 may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize GPR39.
An antibody against GPR39 can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se using GPR39 as an antigen.

〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＧＰＲ３９は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプター蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 [Production of monoclonal antibodies]
(A) Production of Monoclonal Antibody-Producing Cells GPR39 is administered to a mammal at a site where antibody production is possible by administration, or together with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with a confirmed antibody titer from a mouse, collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization, A monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained with myeloma cells. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein described later with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, etc., and P3U1 is preferably used. The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to be used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. The cell fusion can be efficiently carried out by incubating at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes.

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター蛋白質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which the antigen of the receptor protein is adsorbed directly or together with a carrier, and then radioactive. A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A; Examples include a method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, a receptor protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. .
Selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, but can usually be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal calf serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.

（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。 (B) Purification of monoclonal antibody Separation and purification of monoclonal antibodies are performed by separation and purification of immunoglobulins in the same manner as separation and purification of normal polyclonal antibodies [eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method. , Absorption / desorption method using ion exchanger (eg DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G, and collecting antibody alone to dissociate the antibody Specific purification method to obtain

〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＧＰＲ３９抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＧＰＲ３９に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。 [Preparation of polyclonal antibody]
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (GPR39 antigen) and a carrier protein is prepared, a mammal is immunized in the same manner as the above monoclonal antibody production method, and an antibody-containing substance against GPR39 is collected from the immunized animal, It can manufacture by performing isolation | separation purification.
Regarding the complex of immune antigen and carrier protein used to immunize mammals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten should be such that antibodies can be efficiently produced against haptens that are immunized by cross-linking to carriers. Any ratio may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin and the like are about 0.1 to 20 in weight ratio with respect to hapten 1. Preferably, a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
In addition, various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, and active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier and a diluent, at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration can usually be carried out about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of mammals immunized by the above method, preferably from blood.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the serum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.

ＧＰＲ３９のリガンドは、イオン化可能な金属元素またはその塩である。
イオン化可能な金属元素としては、例えば、亜鉛、銅、ニッケル、カドミウムなどが挙げられる。
これらの金属元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が用いられ、具体的には、塩化カドミウム、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、塩化銅、硫酸銅、塩化ニッケル、硫酸ニッケルなどが好ましく、特に塩化カドミウム、塩化亜鉛、塩化銅、塩化ニッケルが好ましい。
また、本願明細書においては、イオン化可能な金属元素には、（１）イオン状態の金属元素（例、亜鉛イオン、銅イオン、ニッケルイオン、カドミウムイオン）、（２）イオン化可能な金属元素を含む化合物（例、酸化亜鉛、酸化銅、酸化ニッケル、酸化カドミウムなどの酸化物など）なども含まれる。
以下、明細書中では、カドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩を単に「金属元素」と略記する。
ＧＰＲ３９、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、ＧＰＲ３９に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。 The ligand of GPR39 is an ionizable metal element or a salt thereof.
Examples of ionizable metal elements include zinc, copper, nickel, cadmium, and the like.
Examples of salts of these metal elements include salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and acetic acid. Specifically, cadmium chloride, zinc chloride, zinc acetate, copper chloride, copper sulfate, nickel chloride are used. Nickel sulfate is preferred, and cadmium chloride, zinc chloride, copper chloride, and nickel chloride are particularly preferred.
In the specification of the present application, the ionizable metal element includes (1) an ion state metal element (eg, zinc ion, copper ion, nickel ion, cadmium ion), and (2) an ionizable metal element. Compounds (eg, oxides such as zinc oxide, copper oxide, nickel oxide, cadmium oxide, etc.) are also included.
Hereinafter, in the specification, an ionizable metal element such as cadmium, zinc, copper and nickel or a salt thereof is simply abbreviated as “metal element”.
GPR39, DNA encoding GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention), antibody against GPR39 (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), antisense DNA against the DNA of the present invention (hereinafter referred to as the DNA of the present invention) , Which may be abbreviated as antisense DNA of the present invention) has the following uses.

（１）ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤
ａ）ＧＰＲ３９またはｂ）ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内においてＧＰＲ３９が減少しているために、リガンドである金属元素の生理作用が期待できない（ＧＰＲ３９の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）ＧＰＲ３９を該患者に投与し、該ＧＰＲ３９の量を補充したり、ｂ）（イ）ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、または（ロ）対象となる細胞にＧＰＲ３９をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＧＰＲ３９の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡは、安全で低毒性なＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
具体的には、ＧＰＲ３９または本発明のＤＮＡは、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として使用することができる。
ＧＰＲ３９を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）ＧＰＲ３９またはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）ＧＰＲ３９またはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。 (1) Prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with GPR39 dysfunction a) GPR39 or b) DNA encoding GPR39 can be used as a medicament for the prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with GPR39 dysfunction it can.
For example, when there is a patient who cannot expect a physiological action of a metal element as a ligand (GPR39 deficiency) because GPR39 is decreased in vivo, a) GPR39 is administered to the patient, and the amount of GPR39 Or b) (b) administering GPR39-encoding DNA to the patient and expressing it, or (b) inserting the GPR39-encoding DNA into the target cell and expressing the cell. The amount of GPR39 in the patient's body can be increased and the action of the ligand can be fully exerted. That is, DNA encoding GPR39 is useful as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for diseases associated with GPR39 dysfunction.
Specifically, GPR39 or the DNA of the present invention is, for example, poorly developed, wounded, burned, cold, learning ability decreased, sexual function decreased, taste disorder, olfactory disorder, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, Cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, blemishes, anemia, hair loss, respiratory distress, digestive disorders, cardiac disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, menstruation Prophylactic / therapeutic agent or cytokine (eg, IL-8) such as hypotonic bladder based on poor bladder perception due to irregularity, diabetes, etc., metal deficiency such as hypotonic bladder due to bladder perception after surgical operation of pelvic viscera It can be used as a secretagogue.
When GPR39 is used as the prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. It can be carried out according to the means. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting intake by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
For example, a) GPR39 or b) the DNA of the present invention may be orally administered as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, or water or other pharmaceutically acceptable if necessary. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with the liquid obtained or an injection such as a suspension. For example, a) GPR39 or b) DNA of the present invention may be required for generally recognized formulation practice with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. In a unit dosage form. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ^™ , HCO-50) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
ＧＰＲ３９の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The preventive / therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can do.
The dose of GPR39 varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like, but in the case of oral administration, for example, generally about 0.1 per day in cancer patients (with a body weight of 60 kg). -100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of an injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
The dose of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like, but in the case of oral administration, for example, generally in cancer patients (with a body weight of 60 kg) The amount is 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of an injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.

（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるＧＰＲ３９またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＧＰＲ３９の発現低下または発現過剰が検出された場合は、例えば、ＧＰＲ３９の機能不全または過剰作用に関連する疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患としては、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などが挙げられる。
ＧＰＲ３９の過剰作用に関連する疾患としては、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などが挙げられる。 (2) Gene diagnostic agent The DNA and antisense DNA of the present invention can be used as a probe in humans or mammals (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.). Abnormality (gene abnormality) of DNA or mRNA encoding GPR39 or a partial peptide thereof can be detected. For example, the DNA or mRNA is damaged, mutated or decreased, or the DNA or mRNA is increased or excessively expressed. It is useful as a genetic diagnostic agent.
The above gene diagnosis using the DNA or antisense DNA of the present invention is, for example, known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), processing. Of the National Academy of Sciences of USA, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) be able to.
For example, if a decrease or overexpression of GPR39 is detected by Northern hybridization, for example, it is diagnosed that the disease is likely to be a disease associated with GPR39 dysfunction or excessive action or likely to be affected in the future. be able to.
Diseases related to GPR39 dysfunction include, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, sexual dysfunction, taste disorders, olfactory disorders, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, Examples thereof include metal deficiency such as low tension bladder based on decreased bladder perception due to diabetes and the like, and low tension bladder due to bladder perception after surgical operation of the pelvic viscera.
Examples of diseases associated with excessive action of GPR39 include renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, intercourse pain, bladder irritation, various disorders caused by urinary stones, or inflammatory diseases ( Examples, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorders; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, Chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) and the like.

（３）ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量を測定することによる、ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 (3) Medicament containing a compound that changes the expression level of GPR39 or a salt thereof The DNA of the present invention can be used for screening a compound that changes the expression level of GPR39 or a salt thereof by using it as a probe.
That is, the present invention provides, for example, (i) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from the organ, or (ii) a GPR39 contained in a transformant. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the expression level of GPR39 by measuring the amount of mRNA is provided.

ＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には免疫不全モデルラット、マウス、ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ii）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。 Specifically, the amount of GPR39 mRNA is measured as follows.
(I) For normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, more specifically immunodeficient model rats, mice, rabbits, etc.) Applying a drug (for example, immunomodulator) or physical stress (for example, water stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.) Obtain tissue or cells isolated from liver, kidney, etc.) or organs.
GPR39 mRNA contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells and the like by a usual method and using a technique such as TaqMan PCR. It is also possible to analyze by performing.
(Ii) A transformant expressing GPR39 can be prepared according to the above-described method, and GPR39 mRNA contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.

ＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。 Screening for a compound that alters the expression level of GPR39 or a salt thereof,
(I) A predetermined time before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) Before to 6 hours) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably from 1 hour to 2 days, more preferably from 1 hour to 24 hours), or simultaneously with the drug or physical stress Quantitative analysis of the amount of GPR39 mRNA contained in the cells after a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) Can be done by
(Ii) When the transformant is cultured according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium and cultured for a certain time (after 1 day to 7 days, preferably after 1 day to 3 days, more preferably after 2 days to 3 days) ), And the amount of GPR39 mRNA contained in the transformant can be determined and analyzed.
Examples of test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like, and these compounds are novel compounds. It may be a known compound.
The test compound may form a salt, and as a salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used. Particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、ＧＰＲ３９の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）ＧＰＲ３９の発現量を増加させることにより、ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など、特に細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇活性（細胞内Ｃａ^２＋遊離活性）、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用）を増強させる化合物、（ロ）ＧＰＲ３９の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
ＧＰＲ３９のリガンドは、カドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩である。
したがって、上記スクリーニング方法で得られるＧＰＲ３９の発現量を変化させる化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患（例、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症）または過剰作用に関連する疾患（例、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症）の予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。
具体的には、ＧＰＲ３９の発現量を増加させる化合物またはその塩は、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として用いることができる。
一方、ＧＰＲ３９の発現量を減少させる化合物またはその塩は、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。 The compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the expression level of GPR39. Specifically, (i) cell stimulation via GPR39 is increased by increasing the expression level of GPR39. Activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, In particular, the activity of promoting or suppressing the decrease in pH, the activity of inhibiting the secretion of cytokine (eg, IL-8) and the like, the activity of increasing intracellular Ca ²⁺ concentration (intracellular Ca ²⁺ release activity), the cytokine (eg, IL-8) (B) a compound that enhances secretion-promoting action), and (b) reducing the expression level of GPR39, thereby Which is a compound that attenuates.
Examples of the compound obtained by using the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds. It may be.
As a salt of a compound obtained by using the screening method of the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used. The acid addition salts that are acceptable are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
The ligand of GPR39 is an ionizable metal element such as cadmium, zinc, copper and nickel or a salt thereof.
Therefore, a compound or a salt thereof that changes the expression level of GPR39 obtained by the screening method described above is a disease associated with GPR39 dysfunction (eg, poor development, wound, burn, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, Taste disorders, olfactory disorders, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory distress, digestive disorders, heart Metals such as hypotonic bladder due to impaired bladder perception due to disability, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc., hypotonic bladder due to bladder sensation paralysis after pelvic visceral surgery Deficiency) or diseases associated with excessive action (eg, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, overactive bladder) Urinary frequency, nocturia, urinary frequency including cystitis including interstitial cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, urinary calculus Prophylactic / therapeutic agent for excess metal diseases such as various disorders that occur, cytokine (eg, IL-8) secretion regulator, or inflammatory disease (eg, neuropathy, diabetic complications such as macrovascular disorder); ulcerative Used as a preventive or therapeutic agent for inflammatory bowel diseases such as colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) be able to.
Specifically, a compound or a salt thereof that increases the expression level of GPR39 is, for example, poor growth, wound, burn, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, Myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory distress, digestive disorders, heart failure, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, thyroid function Prophylactic / therapeutic agents such as hypotensive bladder based on decreased bladder perception due to decrease, depression, menstrual irregularity, diabetes, etc., hypotension bladder due to bladder sensation paralysis after surgery of pelvic viscera, etc., or cytokines (eg , IL-8) can be used as a secretagogue.
On the other hand, compounds or salts thereof that reduce the expression level of GPR39 are, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, interstitial Frequent urination due to cystitis including cystitis, frequent urination due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation symptoms, various disorders caused by urinary stones, etc. Prophylactic / therapeutic agent, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, neurological disorder, diabetic complications such as macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis Irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) and the like.

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 When the compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to conventional means.
For example, the compound or a salt thereof is sterilized orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as an aqueous solution or suspension. For example, the compound or salt thereof in a unit dosage form required for the practice of a generally accepted formulation together with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be produced by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ^™ , HCO-50) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９の発現量を増加させる化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９の発現量を増加させる化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The preventive / therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can do.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, generally in cancer patients (with a body weight of 60 kg) per day The compound or its salt that increases the expression level of GPR39 is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of an injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg) In addition, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of a compound that increases the expression level of GPR39 per day or a salt thereof is administered by intravenous injection. Is convenient. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.

（４）本発明の抗体を用いる診断方法
本発明の抗体は、ＧＰＲ３９を特異的に認識することができるので、被検液中のＧＰＲ３９の検出や中和に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＧＰＲ３９とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＧＰＲ３９の割合を測定することを特徴とする被検液中のＧＰＲ３９の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧＰＲ３９の定量法を提供する。 (4) Diagnostic method using the antibody of the present invention The antibody of the present invention can specifically recognize GPR39, and therefore can be used for detection or neutralization of GPR39 in a test solution.
That is, the present invention
(I) In a test solution characterized by competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution and labeled GPR39, and measuring the ratio of labeled GPR39 bound to the antibody And (ii) after reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled another antibody of the present invention simultaneously or successively, and then on the insolubilized carrier. Provided is a method for quantifying GPR39 in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent.

上記（ii）の定量法においては、一方の抗体がＧＰＲ３９のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がＧＰＲ３９のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、ＧＰＲ３９に対するモノクローナル抗体を用いてＧＰＲ３９の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')_２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＧＰＲ３９の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＧＰＲ３９量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 In the above quantification method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal portion of GPR39 and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal portion of GPR39.
In addition to quantification of GPR39 using a monoclonal antibody against GPR39, detection by tissue staining or the like can also be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) ₂ , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The method for quantifying GPR39 using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, amount of GPR39) in the solution to be measured is chemically determined. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method that is detected by a standard or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in view of sensitivity and specificity.

標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＧＰＲ３９あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧＰＲ３９量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. As the radioisotope, for example, [ ¹²⁵ I], [ ¹³¹ I], [ ³ H], [ ¹⁴ C] and the like are used. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
For insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize GPR39 or an enzyme or the like may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier. By measuring the activity of the labeling agent, the amount of GPR39 in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times. The labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be.

本発明のサンドイッチ法によるＧＰＲ３９の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、ＧＰＲ３９の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＧＰＲ３９のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧＰＲ３９の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、ＧＰＲ３９を感度良く定量することができる。 In the method for measuring GPR39 by the sandwich method of the present invention, antibodies having different GPR39 binding sites are preferably used as the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C end of GPR39, the antibody used in the primary reaction is preferably the C end. For example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like.
In the competition method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or As the first antibody, a soluble one is used, and a solid phase method using a solid phase antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated. Are reacted with an excess amount of labeled antibody, and then a solid phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system of GPR39, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Sequel Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53)), edited by Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (2nd edition) (Medical Shoin, published in 1982), edited by Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (3rd edition) (Medical Shoin, Showa) 62), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Id. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Id. Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Id. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) )) (Academic Press Issue) and the like can be referred to.
As described above, GPR39 can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.

さらには、本発明の抗体を用いてＧＰＲ３９の濃度を定量することによって、ＧＰＲ３９の濃度の減少が検出された場合、例えば、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＧＰＲ３９の濃度の増加が検出された場合には、例えば、ＧＰＲ３９の過剰作用に起因する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患としては、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などが挙げられる。
ＧＰＲ３９の過剰作用に関連する疾患としては、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などが挙げられる。 Furthermore, if a decrease in the concentration of GPR39 is detected by quantifying the concentration of GPR39 using the antibody of the present invention, for example, it may be a disease associated with GPR39 dysfunction or may be affected in the future. Can be diagnosed as high.
Further, when an increase in the concentration of GPR39 is detected, for example, it can be diagnosed that the disease is caused by an excessive action of GPR39, or that there is a high possibility of suffering in the future.
Diseases related to GPR39 dysfunction include, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, sexual dysfunction, taste disorders, olfactory disorders, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, Examples thereof include metal deficiency such as low tension bladder based on decreased bladder perception due to diabetes and the like, and low tension bladder due to bladder perception after surgical operation of the pelvic viscera.
Examples of diseases associated with excessive action of GPR39 include renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, intercourse pain, bladder irritation, various disorders caused by urinary stones, or inflammatory diseases ( Examples, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorders; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, Chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) and the like.

（５）ＧＰＲ３９に対するアゴニストのスクリーニング方法
リガンドである特定の金属元素がＧＰＲ３９に結合することによって、細胞内Ｃａ^２＋濃度の上昇やＩＬ−８分泌促進が見られることから、ＧＰＲ３９は、この細胞内シグナルを指標としてＧＰＲ３９に対する前記の金属元素以外のアゴニスト（天然リガンド、合成リガンド、元素を含む）を探索し、または決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇活性またはＩＬ−８分泌促進作用を測定することを特徴とするＧＰＲ３９に対するアゴニストの決定方法を提供する。
試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、低分子合成化合物などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをＧＰＲ３９に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
該試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験元素としては、例えば、周期表に記載されている元素、好ましくは金属元素などが用いられる。
該試験元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が挙げられる。 (5) Screening method of agonist for GPR39 Since a specific metal element as a ligand binds to GPR39, an increase in intracellular Ca ²⁺ concentration and IL-8 secretion promotion are observed. Therefore, GPR39 is an intracellular signal. It is useful as a reagent for searching for or determining agonists (including natural ligands, synthetic ligands, and elements) other than the above-described metal elements for GPR39 using as an index.
That is, the present invention is characterized by measuring intracellular Ca ²⁺ concentration increasing activity or IL-8 secretion promoting action via GPR39 when a test compound or element or a salt thereof is brought into contact with a cell containing GPR39. A method for determining an agonist for GPR39 is provided.
Test compounds include known ligands (eg, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP (eg, PACAP27, PACAP38), secretin, Glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (vasoactive intestinal and related polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide ), Leukotrienes, pancreasatins, prostaglandins, thromboxanes, adenosine, adrenaline Chemokine superfamily (eg, CXC chemokine subfamily such as IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, GCP-2, PF4, IP-10, Mig, PBSF / SDF-1; MCAF / MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, HCC-1, MIP-3α / LARC, MIP-3β / ELC, I-309, TARC CC chemokine subfamily such as MIF, MIPF-2 / eotaxin-2, MDC, DC-CK1 / PARC, SLC; C chemokine subfamily such as lymphactin; CX3C chemokine subfamily such as fractalkine), endothelin, entero Gust Histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine 1-phosphate, etc.), for example, humans or mammals (eg, mice, rats, pigs, Bovine, sheep, monkey, etc.) tissue extracts, cell culture supernatants, low molecular weight synthetic compounds and the like. For example, the tissue extract, cell culture supernatant and the like can be added to GPR39 and fractionated while measuring cell stimulating activity and the like, and finally a single ligand can be obtained.
As the salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly used. preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
As the test element, for example, an element described in the periodic table, preferably a metal element is used.
Examples of the salt of the test element include salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and acetic acid.

（６）ＧＰＲ３９と金属元素との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、およびＧＰＲ３９と金属元素との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含有する医薬
ＧＰＲ３９を用いるか、または組換え型ＧＰＲ３９の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドである金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）もしくは元素またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物もしくは元素またはその塩には、（イ）ＧＰＲ３９を介して細胞刺激活性を有する化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト）、（ロ）ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性を阻害する化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアンタゴニスト）、（ハ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩、あるいは（ニ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩などが含まれる。
すなわち、本発明は、（ｉ）ＧＰＲ３９と金属元素とを接触させた場合と（ii）ＧＰＲ３９と金属元素および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、ＧＰＲ３９に対する金属元素の結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離（細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇）、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、ＧＰＲ３９発現細胞ＵＭ−ＵＣ−３などからのサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用などが挙げられるが、なかでも細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇活性、ＧＰＲ３９発現細胞ＵＭ−ＵＣ−３などからのサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用などが好ましい。 (6) A screening method for a compound or element or its salt (agonist, antagonist, etc.) that changes the binding property or signal transmission between GPR39 and a metal element, and a compound or a signal that changes the binding property or signal transmission between GPR39 and a metal element A drug containing an element or a salt thereof GPR39 is used, or a recombinant GPR39 expression system is constructed, and a receptor binding assay system using the expression system is used to bind a metal element as a ligand to GPR39. A compound (for example, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or element or a salt thereof that changes sex or signal transduction can be efficiently screened.
Such a compound or element or a salt thereof inhibits (i) a compound or element having a cell stimulating activity via GPR39 or a salt thereof (so-called agonist for GPR39), or (b) a cell stimulating activity via GPR39. A compound or element or a salt thereof (so-called antagonist to GPR39), (c) a compound or element or salt thereof that enhances the binding force between a metal element and GPR39, or (d) a binding force between the metal element and GPR39 A compound or element or a salt thereof is included.
That is, the present invention provides a comparison between (i) a case where GPR39 is brought into contact with a metal element and (ii) a case where GPR39 is brought into contact with a metal element and a test compound. And a method for screening a compound or element or a salt thereof or a salt thereof that alters the binding property or signal transduction with the protein.
The screening method of the present invention is characterized in that, for example, in the cases (i) and (ii), the binding amount of the metal element to GPR39, the cell stimulating activity, etc. are measured and compared.
Examples of the cell stimulating activity include arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ release (intracellular Ca ²⁺ concentration increase), intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular Examples include protein phosphorylation, c-fos activation, activity for promoting or suppressing pH reduction, cytokine (eg, IL-8) secretion promoting effect from GPR39-expressing cells UM-UC-3, etc. Among them, intracellular Ca ²⁺ concentration increasing activity, cytokine (eg, IL-8) secretion promoting action from GPR39-expressing cells UM-UC-3 and the like are preferable.

より具体的には、本発明は、
ａ）金属元素の放射性同位元素を、ＧＰＲ３９に接触させた場合と、金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該ＧＰＲ３９に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）金属元素の放射性同位元素を、ＧＰＲ３９を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）金属元素の放射性同位元素を、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、金属元素の放射性同位元素および試験化合物もしくは元素またはその塩を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、金属元素の放射性同位元素の該ＧＰＲ３９に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法、 More specifically, the present invention provides:
a) When the radioisotope of a metal element is brought into contact with GPR39, and when the radioisotope of a metal element and a test compound or element or a salt thereof are brought into contact with GPR39, the GPR39 of the radioisotope of the metal element A method for screening a compound or element or a salt thereof that changes the binding property or signal transduction between a metal element and GPR39, characterized by measuring and comparing the binding amount to
b) When a radioisotope of a metal element is brought into contact with a cell containing GPR39 or a membrane fraction of the cell, a radioisotope of the metal element and a test compound or element or a salt thereof, or a cell containing GPR39 The binding amount of the metal element and GPR39, characterized by measuring and comparing the amount of binding of the radioisotope of the metal element to the cell or the membrane fraction when contacted with the membrane fraction of the cell A screening method for a compound or element that alters signal transduction or a salt thereof,
c) When a radioisotope of a metal element is brought into contact with GPR39 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, and a radioisotope of the metal element and a test compound or element or When the salt is brought into contact with GPR39 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, the binding amount of the radioisotope of the metal element to the GPR39 is measured and compared. A screening method for a compound or element or a salt thereof that changes the binding property or signal transmission between GPR39 and a metal element characterized by

ｄ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物（例えば、金属元素またはその放射性同位元素など）をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物および試験化合物もしくは元素またはその塩をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物、元素またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物（例えば、金属元素またはその放射性同位元素など）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物および試験化合物もしくは元素またはその塩を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ３９に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
さらに、ＧＰＲ３９に対するリガンドとして、前記の金属元素に代えて、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物、元素またはその塩（合成低分子化合物、特に合成低分子アゴニスト）を用いることもできる。この金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩は、例えば、リガンドとして金属元素を用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。以下のスクリーニング方法においては、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物もしくは元素またはその塩を含めて、単にリガンドと表記する。 d) When a compound that activates GPR39 (for example, a metal element or a radioisotope thereof) is brought into contact with a cell containing GPR39, and a compound that activates GPR39 and a test compound or element or salt thereof are added to GPR39. Screening of a compound, element or salt thereof that changes the binding or signal transduction between a metal element and GPR39, characterized by measuring and comparing cell stimulating activity via GPR39 when it is brought into contact with the contained cell And e) a compound that activates GPR39 (for example, a metal element or a radioisotope thereof) is contacted with GPR39 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. And compounds that activate GPR39 and test compounds or elements Alternatively, the cell stimulating activity via a receptor is measured and compared when the salt is brought into contact with GPR39 expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. Provided is a screening method for a compound or element or a salt thereof that changes the binding property or signal transduction between a metal element and GPR39.
Further, as a ligand for GPR39, a compound, element or a salt thereof (synthetic low molecular weight compound, particularly a synthetic low molecular weight agonist) that changes the binding property between the metal element and GPR39 can be used instead of the metal element. The compound or element that changes the binding property between the metal element and GPR39 or a salt thereof can be obtained, for example, by performing the screening method of the present invention described later using the metal element as a ligand. In the following screening method, a compound or element that changes the binding property between a metal element and GPR39 or a salt thereof is simply referred to as a ligand.

本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＧＰＲ３９としては、上記したＧＰＲ３９を含有するものであれば何れのものであってもよいが、ＧＰＲ３９を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のＧＰＲ３９などが適している。 A specific description of the screening method of the present invention will be given below.
First, GPR39 used in the screening method of the present invention may be any GPR39 as long as it contains GPR39 as described above, but a cell membrane fraction of a mammalian organ containing GPR39 is preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, human-derived GPR39 expressed in a large amount using a recombinant is suitable for use in screening.

ＧＰＲ３９を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ３９を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧＰＲ３９であってもよいし、該ＧＰＲ３９を含有する細胞を用いてもよく、また該ＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。 In order to produce GPR39, the above-mentioned method is used, but it is preferable to express the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells. Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto. For example, gene fragments or synthetic DNA may be used. In order to introduce a DNA fragment encoding GPR39 into a host animal cell and to express them efficiently, the DNA fragment of the nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to baculovirus using an insect as a host is used. The polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like are preferably incorporated downstream. The amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P. et al. Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
Therefore, in the screening method of the present invention, GPR39 may be GPR39 purified according to a method known per se, cells containing GPR39 may be used, and GPR39 is contained. A cell membrane fraction may be used.

本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ３９を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
ＧＰＲ３９を含有する細胞としては、該ＧＰＲ３９を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ３９と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＧＰＲ３９を含有する細胞や膜画分中のＧＰＲ３９の量は、１細胞当たり１０^３〜１０^８分子であるのが好ましく、１０^５〜１０^７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。 In the screening method of the present invention, when cells containing GPR39 are used, the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
A cell containing GPR39 refers to a host cell that expresses GPR39, and preferred host cells include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
The cell membrane fraction refers to a fraction containing a lot of cell membranes obtained by a method known per se after disrupting cells. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, and pressurizing with a French press while ejecting cells from a thin nozzle. Crushing by causing them to occur. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed GPR39 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of GPR39 in the GPR39-containing cells and membrane fraction is preferably 10 ³ to 10 ⁸ molecules per cell, and more preferably 10 ⁵ to 10 ⁷ molecules. In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large amount of samples in the same lot. .

リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当なＧＰＲ３９画分と、標識したリガンドが必要である。
ＧＰＲ３９画分としては、天然型のＧＰＲ３９画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＧＰＲ３９画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、カドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素の放射性同位元素が用いられる。例えば、亜鉛６５（^６５Ｚｎ）、ニッケル６３（^６３Ｎｉ）などが用いられ、なかでもニッケル６３（^６３Ｎｉ）が好ましい。
具体的には、リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニングを行なうには、まずＧＰＲ３９を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＧＰＲ３９標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとＧＰＲ３９との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０^−４Ｍ〜１０^−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ_０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ_０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 In order to carry out the above a) to c) for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property or signal transduction between the ligand and GPR39, for example, an appropriate GPR39 fraction and a labeled ligand are required. .
As the GPR39 fraction, a natural GPR39 fraction or a recombinant GPR39 fraction having an activity equivalent to that is desirable. Here, the equivalent activity indicates an equivalent ligand binding activity, a signal information transmission action, and the like.
As the labeled ligand, radioisotopes of ionizable metal elements such as cadmium, zinc, copper and nickel are used. For example, zinc ⁶⁵ (65 Zn), and nickel ^{63 (63} Ni) is used, inter alia nickel ^{63 (63} Ni) is preferable.
Specifically, in order to screen for a compound or element that alters the binding property or signal transduction between a ligand and GPR39 or a salt thereof, first, a cell containing GPR39 or a membrane fraction of the cell is used as a buffer suitable for screening. A GPR39 preparation is prepared by suspending in The buffer may be any buffer as long as it does not inhibit the binding of the ligand and GPR39, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a Tris-HCl buffer. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding, a surfactant such as CHAPS, Tween-80 ^™ (Kao-Atlas), digitonin, deoxycholate and the like can be added to the buffer. Furthermore, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Institute) and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by protease. A fixed amount (5,000 to 500,000 cpm) of labeled ligand is added to 0.01 to ¹⁰ ml of the receptor solution, and at the same time, 10 ⁻⁴ M to ^{10 −10} M of the test compound is allowed to coexist. In order to know the amount of non-specific binding (NSB), a reaction tube to which a large excess of unlabeled ligand is added is also prepared. The reaction is carried out at about 0-50 ° C., preferably about 4-37 ° C., for about 20 minutes-24 hours, preferably about 30 minutes-3 hours. After the reaction, the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. When the count (B ₀ -NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B ₀ ) when there is no antagonistic substance is 100%, the specific binding amount (B-NSB) is, for example, , 50% or less of the test compound can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.

リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、ＧＰＲ３９を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰ、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧＰＲ３９を発現した細胞が必要である。ＧＰＲ３９を発現した細胞としては、天然型のＧＰＲ３９を有する細胞株、上記の組換え型ＧＰＲ３９を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験元素としては、例えば、周期表に記載されている元素が用いられ、なかでも金属元素が好ましい。
該試験元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が挙げられる。
また、試験化合物としては、ＧＰＲ３９の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＧＰＲ３９の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行なうことができる。
リガンドとＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物がアゴニストかアンタゴニストであるかは、上記したＧＰＲ３９に対するアゴニストのスクリーニング方法を用いて確認することができる。
具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記ａ）〜ｃ）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアンタゴニストである。
（ii）（ａ）試験化合物をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させ、上記した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアゴニストである。
（ｂ）ＧＰＲ３９を活性化する化合物（例えば、金属元素）をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ３９を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ３９を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ３９を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＧＰＲ３９を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＧＰＲ３９に対するアンタゴニストである。 In order to carry out the above-mentioned methods d) to e) for screening a compound or element or a salt thereof that alters the binding property or signal transduction between a ligand and GPR39, for example, a cell stimulating activity via GPR39 is known. Or it can measure using a commercially available measuring kit.
Specifically, first, cells containing GPR39 are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compound, etc. and incubate for a certain period of time, then extract cells or collect supernatant and generate The product is quantified according to the respective method. When it is difficult to assay a substance (for example, cAMP, arachidonic acid, etc.) used as an index of cell stimulating activity by a degrading enzyme contained in a cell, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay. . Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on the cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing appropriate GPR39 are required. As a cell expressing GPR39, a cell line having natural GPR39, a cell line expressing the above-mentioned recombinant GPR39, and the like are desirable.
Examples of test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like, and these compounds are novel compounds. It may be a known compound.
As the salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly used. preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
As the test element, for example, elements described in the periodic table are used, and metal elements are particularly preferable.
Examples of the salt of the test element include salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and acetic acid.
As the test compound, a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of GPR39 and the position of the ligand binding pocket is preferably used. The atomic coordinates of the active site of GPR39 and the position of the ligand binding pocket can be measured using a known method or a method according thereto.
Whether the compound that changes the binding property between the ligand and GPR39 is an agonist or an antagonist can be confirmed using the above-described method for screening an agonist for GPR39.
A specific evaluation method may follow the following (i) or (ii).
(I) The binding assay shown by the screening methods a) to c) is performed to obtain a compound that changes the binding property between the metal element and GPR39 (in particular, inhibits binding), and then the compound is It is measured whether it has the cell-stimulating activity. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist for GPR39, and a compound having no such activity or a salt thereof is an antagonist for GPR39.
(Ii) (a) A test compound is contacted with a cell containing GPR39, and the above-mentioned cell stimulating activity is measured. A compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist for GPR39.
(B) When a compound that activates GPR39 (for example, a metal element) is brought into contact with a cell containing GPR39, and when a compound that activates GPR39 and a test compound are brought into contact with a cell containing GPR39, Cell stimulation activity via GPR39 is measured and compared. A compound or a salt thereof that can reduce the cell-stimulating activity by a compound that activates GPR39 is an antagonist to GPR39.

リガンドとＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ３９を含有する細胞、またはＧＰＲ３９を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）ＧＰＲ３９標品
ＧＰＲ３９を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０^５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識リガンド
亜鉛６５（^６５Ｚｎ）、ニッケル６３（^６３Ｎｉ）などの放射性同位元素
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて一定のカウントになるように希釈する。
ｄ）リガンド標準液
リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。 A screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property or signal transduction between a ligand and GPR39 includes GPR39, a cell containing GPR39, or a membrane fraction of a cell containing GPR39.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagents a) Measurement buffer and wash buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
b) GPR39 preparation A CHO cell in which GPR39 was expressed was subcultured at 5 × 10 ⁵ cells / well in a 12-well plate and cultured at 37 ° C., 5% CO ₂ , 95% air for 2 days.
c) labeled ligand zinc ^{65 (65} Zn), save those in the state of the radioactive isotope solution, such as nickel ^{63 (63} Ni) at 4 ° C. or -20 ° C., a constant count with a buffer for the measurement Dilute to
d) Ligand standard solution The ligand is dissolved to 1 mM with PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.

２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養したＧＰＲ３９発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０^−３〜１０^−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０^−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した放射性同位元素を０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ_０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ_０ ：最大結合量 2. Measurement method a) GPR39-expressing CHO cells cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and then 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
b) After 5 μl of a test compound solution of 10 ⁻³ to 10 ⁻¹⁰ M is added, 5 μl of a labeled ligand is added and reacted at room temperature for 1 hour. In order to know the amount of non-specific binding, 5 μl of 10 ⁻³ M ligand is added instead of the test compound.
c) Remove the reaction and wash 3 times with 1 ml of wash buffer. The radioisotope bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
d) Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B−NSB) / (B ₀ −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample is added NSB: Non-specific binding (non-specific binding amount)
B ₀ : Maximum amount of binding

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物もしくは元素またはその塩は、金属元素とＧＰＲ３９との結合性またはシグナル伝達を変化させる作用を有する化合物もしくは元素またはその塩であり、具体的には、（イ）ＧＰＲ３９を介して細胞刺激活性を有する化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物もしくは元素またはその塩（いわゆる、ＧＰＲ３９に対するアンタゴニスト）、（ハ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩、または（ニ）金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる元素としては、例えば、周期表に記載されている元素が用いられ、なかでも金属元素が好ましい。
該元素の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸などの酸との塩が挙げられる。
ＧＰＲ３９に対するアゴニストは、ＧＰＲ３９に対するリガンドである金属元素が有する生理活性と同様の作用を有しているので、金属元素が有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
ＧＰＲ３９に対するアンタゴニストは、ＧＰＲ３９に対するリガンドである金属元素が有する生理活性を抑制することができるので、金属元素の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩は、金属元素が有する生理活性を増強することができるので、金属元素が有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩は、金属元素が有する生理活性を減少させることができるので、金属元素の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト、金属元素とＧＰＲ３９との結合力を増強する化合物もしくは元素またはその塩は、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの疾患に対する予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
一方、ＧＰＲ３９に対するアンタゴニスト、金属元素とＧＰＲ３９との結合力を減少させる化合物もしくは元素またはその塩は、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの疾患に対する予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。 The compound or element or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is a compound or element or salt thereof having an action of changing the binding property or signal transduction between the metal element and GPR39. (B) a compound or element having a cell stimulating activity via GPR39 or a salt thereof (so-called agonist for GPR39), (b) a compound or element having no cell-stimulating activity or a salt thereof (so-called GPR39) An antagonist), (c) a compound or element or a salt thereof that enhances the binding force between the metal element and GPR39, or (d) a compound or element or a salt thereof that decreases the binding force between the metal element and GPR39.
Examples of the compound obtained using the screening method or screening kit of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products and the like, and these compounds may be novel compounds. A known compound may be used.
As a salt of the compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. . Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
As an element obtained by using the screening method or screening kit of the present invention, for example, an element described in the periodic table is used, and a metal element is particularly preferable.
Examples of the salt of the element include salts with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and acetic acid.
Since the agonist for GPR39 has the same action as the physiological activity of the metal element which is a ligand for GPR39, it is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical according to the physiological activity of the metal element.
Since antagonists to GPR39 can suppress the physiological activity of the metal element which is a ligand for GPR39, they are useful as safe and low-toxic drugs for suppressing the physiological activity of the metal element.
A compound or element that enhances the binding force between a metal element and GPR39, or a salt thereof, can enhance the physiological activity of the metal element, and is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical according to the physiological activity of the metal element. It is.
Since a compound or element or a salt thereof that reduces the binding force between a metal element and GPR39 can reduce the physiological activity of the metal element, it can be used as a safe and low-toxic pharmaceutical for suppressing the physiological activity of the metal element. Useful.
Specifically, an agonist for GPR39, a compound or element or a salt thereof that enhances the binding force between a metal element and GPR39, for example, poor development, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorders Olfactory disturbance, prostate enlargement, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory distress, digestive disorder, heart disorder, Metal deficiency such as white hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, hypotonic bladder based on decreased bladder perception due to depression, menstrual irregularities, diabetes, etc., low tension bladder due to bladder sensory paralysis after pelvic visceral surgery It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for other diseases or as a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
On the other hand, an antagonist to GPR39, a compound or element or a salt thereof that decreases the binding force between a metal element and GPR39, is caused by, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, overactive bladder Frequent urine, nocturia, frequent urinary cystitis including interstitial cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation, urinary calculus Prophylactic / therapeutic agents for diseases such as hypermetallopathy such as various disorders, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory diseases (eg, neurological disorders, diabetic complications such as macrovascular disorders); ulcers Inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) Which is useful as a prophylactic or therapeutic agent.

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物もしくは元素またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 When the compound or element obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be formulated according to conventional means.
For example, the compound or a salt thereof is sterilized orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as an aqueous solution or suspension. For example, the compound or salt thereof in a unit dosage form required for the practice of a generally accepted formulation together with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be produced by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ^™ , HCO-50) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物もしくは元素またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９に対するアゴニストを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＧＰＲ３９に対するアゴニストを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 The preventive / therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can do.
The dose of the compound or element or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg) The agonist for GPR39 per day is about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg) It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of an agonist for GPR39 by intravenous injection per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.

（７）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
ＧＰＲ３９を用いることによって、各種薬物がＧＰＲ３９を介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
（１）ＧＰＲ３９を用いることを特徴とする、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌調節薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療薬がＧＰＲ３９に結合することを確認する方法、
（２）ＧＰＲ３９を用いることを特徴とする、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療薬、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進薬がＧＰＲ３９に対するアゴニストであることを確認する方法、
（３）ＧＰＲ３９を用いることを特徴とする、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療薬、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制薬、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療薬がＧＰＲ３９に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（４）各薬をＧＰＲ３９に接触させた場合における、各薬とＧＰＲ３９との結合量を測定することを特徴とする上記（１）〜（３）記載のスクリーニング方法を提供する。
この確認方法は、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、金属元素とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がＧＰＲ３９を介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。 (7) Elucidation method of action mechanism of various drugs By using GPR39, it can be confirmed whether various drugs are exerting pharmacological effects via GPR39.
That is, the present invention
(1) characterized by using GPR39, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis , Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation Metal deficiency such as low tension bladder due to decreased bladder perception due to diabetes, etc., low tension bladder due to bladder perception due to pelvic visceral surgery, renal dysfunction, lung dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis including interstitial cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse, Prophylactic / therapeutic drugs such as bladder irritation symptoms, various disorders caused by urinary stones, etc., cytokine (eg, IL-8) secretion regulators, or inflammatory diseases (eg, neurological disorders, macrovascular disorders, etc.) Diabetic complications; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia); allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) A method for confirming that a prophylactic / therapeutic agent such as GPR39 binds,
(2) characterized by using GPR39, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis , Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation Prophylactic / therapeutic drugs for metal deficiency such as hypotonic bladder based on decreased bladder perception due to diabetes, etc., hypotonic bladder due to bladder perception after surgical operation of pelvic viscera, or cytokine (eg, IL-8) secretion A method for confirming that the promoter is an agonist for GPR39,
(3) characterized by using GPR39, such as renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Including urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, intercourse pain, bladder irritation, various disorders caused by urinary stones, etc. Drug, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorder; inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis; cystitis; hypersensitivity A method for confirming that prophylactic / therapeutic agents such as bowel syndrome (neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) are antagonists to GPR39,
(4) The screening method described in (1) to (3) above, wherein the amount of binding between each drug and GPR39 when each drug is brought into contact with GPR39 is provided.
This confirmation method can be carried out by using the above-mentioned drug in place of the test compound in the compound screening method for changing the binding property between the metal element and GPR39.
Moreover, the kit for the confirmation method of the present invention is a screening kit for a compound that changes the binding property between a metal element and GPR39, and contains the above-mentioned drug instead of the test compound.
Thus, by using the confirmation method of the present invention, it is possible to confirm that various drugs on the market or in development are exerting pharmacological effects via GPR39.

（８）細胞膜におけるＧＰＲ３９またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明の抗体は、ＧＰＲ３９を特異的に認識することができるので、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９を定量することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ii）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９を定量することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（iii）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
（iv）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 (8) A drug containing a compound or salt thereof that changes the amount of GPR39 or its partial peptide in the cell membrane Since the antibody of the present invention can specifically recognize GPR39, a compound that changes the amount of GPR39 in the cell membrane Or it can use for the screening of the salt.
That is, the present invention is, for example,
(I) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, etc., and then a cell membrane fraction is isolated, and GPR39 contained in the cell membrane fraction is quantified. A method for screening a compound or a salt thereof that changes the amount of GPR39 in a cell membrane,
(Ii) Screening of a compound or a salt thereof that alters the amount of GPR39 in the cell membrane by isolating the cell membrane fraction after destroying a transformant expressing GPR39, etc., and quantifying GPR39 contained in the cell membrane fraction Method,
(Iii) a) a blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from the organ, and then using the immunostaining method, the receptor on the cell surface Provided is a method for screening a compound or a salt thereof that changes the amount of GPR39 in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of protein staining.
(Iv) After sectioning a transformant expressing GPR39, etc., the protein on the cell membrane is confirmed by quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface by using immunostaining. To provide a method for screening a compound or a salt thereof that changes the amount of GPR39 in a cell membrane.

細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には免疫不全ラット、マウス、化ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００^ＴＭ、ツイーン２０^ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ３９と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ii）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９を定量することができる。 Specifically, GPR39 contained in the cell membrane fraction is quantified as follows.
(I) For normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, and more specifically, immunodeficient rats, mice, modified rabbits, etc.) Applying a drug (for example, an immunomodulator) or physical stress (for example, water stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.) Obtain tissues or cells isolated from liver, kidney, etc.) or organs. The obtained organ, tissue, or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hepes buffer, etc.) to destroy the organ, tissue, or cell, and the interface. A cell membrane fraction is obtained by using an activator (for example, Triton X100 ^™ , Tween 20 ^™, etc.), and further using techniques such as centrifugation, filtration, and column fractionation.
The cell membrane fraction refers to a fraction containing a lot of cell membranes obtained by a method known per se after disrupting cells. Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, disrupting with a Waring blender or polytron (Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, and pressurizing with a French press while ejecting cells from a thin nozzle. Crushing by causing them to occur. For fractionation of the cell membrane, a fractionation method using centrifugal force such as a fractional centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed GPR39 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
GPR39 contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
Such sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and Western blotting can be performed by means known per se.
(Ii) A transformant expressing GPR39 can be prepared according to the above method, and GPR39 contained in the cell membrane fraction can be quantified.

細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれるＧＰＲ３９の確認は具体的には以下のようにして行なう。
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には免疫不全モデルラット、マウス、ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を確認することができる。
（iv）ＧＰＲ３９を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。 Screening for compounds or salts thereof that alter the amount of GPR39 in the cell membrane
(I) A predetermined time before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) Before to 6 hours) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably from 1 hour to 2 days, more preferably from 1 hour to 24 hours), or simultaneously with the drug or physical stress Administration, and after lapse of a certain time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), by quantifying the amount of GPR39 in the cell membrane Can
(Ii) When the transformant is cultured according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium and cultured for a certain time (after 1 day to 7 days, preferably after 1 day to 3 days, more preferably after 2 days to 3 days) ), By quantifying the amount of GPR39 in the cell membrane.
The confirmation of GPR39 contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(Iii) For normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, more specifically immunodeficient model rats, mice, rabbits, etc.) Applying a drug (for example, immunomodulator) or physical stress (for example, water stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), and after a certain period of time, blood or a specific organ (for example, brain, Obtain tissues or cells isolated from liver, kidney, etc.) or organs. The obtained organ, tissue, cell or the like is made into a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention. By quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface layer, the amount of GPR39 in the cell membrane can be confirmed quantitatively or qualitatively by confirming the protein on the cell membrane.
(Iv) It can also be confirmed by taking the same means using a transformant expressing GPR39.
Examples of test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like, and these compounds are novel compounds. It may be a known compound.
The test compound may form a salt, and as a salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used. Particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.

本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させることにより、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介する細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩、（ロ）細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
具体的には、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させる化合物またはその塩は、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの疾患に対する予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
一方、細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を減少させる化合物またはその塩は、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの疾患に対する予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。 The compound or salt thereof obtained using the screening method of the present invention is a compound or salt thereof having an action of changing the amount of GPR39 in the cell membrane. Specifically, (a) the amount of GPR39 in the cell membrane is increased. Thus, a compound or a salt thereof that enhances cell stimulating activity via a G protein-coupled receptor, or (b) a compound or salt thereof that attenuates the cell stimulating activity by reducing the amount of GPR39 in the cell membrane.
Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
As a salt of the compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. . Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
A compound or a salt thereof that enhances cell stimulating activity by increasing the amount of GPR39 in the cell membrane is useful as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for diseases associated with GPR39 dysfunction.
A compound or a salt thereof that attenuates the cell stimulating activity by reducing the amount of GPR39 in the cell membrane is useful as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for diseases caused by excessive expression of GPR39.
Specifically, a compound or a salt thereof that increases the amount of GPR39 in a cell membrane is, for example, poor growth, wound, burn, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis , Myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, respiratory disorders, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, thyroid Prophylactic / therapeutic agent for diseases such as hypotonia due to decreased function, depression, irregular menstruation, decreased bladder perception due to diabetes, metal deficiency such as hypotonic bladder due to bladder sensation paralysis after pelvic visceral surgery, or It is useful as a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
On the other hand, compounds that reduce the amount of GPR39 in the cell membrane or salts thereof include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, stromal Urinary frequency including cystitis including cystitis, urinary frequency due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse, bladder irritation, various disorders caused by urinary stones, etc. Preventive / therapeutic agent for various diseases, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory disease (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disorder; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis Cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)), and the like.
When the compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to conventional means.
For example, the compound or a salt thereof is sterilized orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules or the like with sugar coating as necessary, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as an aqueous solution or suspension. For example, the compound or salt thereof in a unit dosage form required for the practice of a generally accepted formulation together with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be produced by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させる化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき細胞膜におけるＧＰＲ３９の量を増加させる化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavorings such as peppermint, red oil and cherry. When the dispensing unit form is a capsule, a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ^™ , HCO-50) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
The preventive / therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can do.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but in the case of oral administration, for example, generally in cancer patients (with a body weight of 60 kg), The compound or its salt that increases the amount of GPR39 in the cell membrane is about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of an injection, for example, in cancer patients (with a body weight of 60 kg) Intravenous injection of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of a compound or salt thereof that increases the amount of GPR39 in the cell membrane per day It is convenient to do. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.

（９）ＧＰＲ３９に対する抗体を含有してなる医薬
ＧＰＲ３９に対する抗体の中和活性とは、該ＧＰＲ３９の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該ＧＰＲ３９の関与するシグナル伝達、例えば、該ＧＰＲ３９を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用など、特に細胞内Ｃａ^２＋濃度上昇活性（細胞内Ｃａ^２＋遊離活性）、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進作用）を不活性化することができる。
したがって、ＧＰＲ３９に対する抗体（例、中和抗体）は、ＧＰＲ３９の過剰作用や金属元素過多などに起因する疾患、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。
上記予防・治療剤は、前記したＧＰＲ３９またはＧＰＲ３９に対するアンタゴニストを含有する医薬と同様にして製造し、使用することができる。 (9) Medicament comprising an antibody against GPR39 The neutralizing activity of an antibody against GPR39 means an activity that inactivates a signal transduction function involving the GPR39. Therefore, when the antibody has neutralizing activity, signal transmission involving the GPR39, for example, cell stimulating activity via the GPR39 (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ release, intracellular cAMP generation) , Activity to promote or suppress intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, cytokines (eg, IL-8) In particular, intracellular Ca ²⁺ concentration increasing activity (intracellular Ca ²⁺ release activity) and cytokine (eg, IL-8) secretion promoting effect) such as a secretion promoting action can be inactivated.
Therefore, an antibody against GPR39 (eg, neutralizing antibody) is used for diseases caused by excessive action of GPR39 or excessive metal elements, such as renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson's disease, excessive Frequent urination due to active bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis including interstitial cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, intercourse pain, bladder irritation, urinary tract Prophylactic / therapeutic agents such as excess metal diseases such as various disorders caused by stones, cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitors, or inflammatory diseases (eg, neurological disorders, diabetic complications such as macrovascular disorders); Prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) When It can be used Te.
The prophylactic / therapeutic agent can be produced and used in the same manner as the above-described pharmaceutical containing GPR39 or an antagonist to GPR39.

（１０）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、ＧＰＲ３９の過剰作用や金属元素過多などに起因する疾患、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として用いることができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。 (10) A pharmaceutical comprising the antisense DNA of the present invention The antisense DNA of the present invention is a disease caused by excessive action of GPR39 or excessive metal elements, such as renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis Sensory neuropathy, Wilson disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis including interstitial cystitis, frequent urination due to prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, Prophylactic / therapeutic agents such as sexual intercourse, bladder irritation symptoms, various disorders caused by urinary calculi, etc., cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor, or inflammatory diseases (eg, neuropathy, major Diabetic complications such as vascular disorders; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease ( CO PD)) and the like.
For example, when the antisense DNA is used, the antisense DNA can be carried out according to conventional means after being inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, or the like. The antisense DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting ingestion, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.

（１１）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、***およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。 (11) Preparation of DNA-transfected animal of the present invention The present invention is abbreviated as exogenous DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (abbreviated as exogenous mutant DNA of the present invention). A non-human mammal having (which may be present).
That is, the present invention
[1] A non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
[2] The animal according to [1], wherein the non-human mammal is a rodent
[3] An animal according to [2], wherein the rodent is a mouse or a rat, and [4] a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. Is.
A non-human mammal having an exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as a DNA-transferred animal of the present invention) can be used for embryos including unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa and primordial cells thereof. Preferably, at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the single cell or fertilized egg cell stage and generally prior to the 8-cell stage), the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, It can be produced by transferring the target DNA by the microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like. Further, by the DNA transfer method, the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and can be used for cell culture, tissue culture, etc. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with a cell fusion method known per se.
Examples of non-human mammals include cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like. Among them, rodents, especially mice (for example, C57BL / 6 strain, DBA2 strain, etc. as pure strains, etc.) that are relatively short in ontogenesis and biological cycle from the viewpoint of creating a disease animal model system and that are easy to reproduce As the system, B6C3F ₁ system, BDF ₁ system, B6D2F ₁ system, BALB / c system, ICR system, etc.) or rats (for example, Wistar, SD, etc.) are preferable.
Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in the mammal include humans and the like in addition to the above non-human mammals.

本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なＧＰＲ３９を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＧＰＲ３９の機能を抑制するＧＰＲ３９を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。 The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation or the like) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution to another base, etc. The resulting DNA is used, and abnormal DNA is also included.
The abnormal DNA means DNA that expresses abnormal GPR39. For example, DNA that expresses GPR39 that suppresses the function of normal GPR39 is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. For example, when transferring the human DNA of the present invention, the expression of DNA derived from various mammals (for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology with this. The DNA of the present invention is highly expressed by microinjecting a DNA construct (eg, a vector) conjugated with the human DNA of the present invention downstream of various promoters into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA transfer mammals can be created.

ＧＰＲ３９の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ii）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。 As an expression vector for GPR39, a plasmid derived from E. coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as λ phage, a retrovirus such as Moloney leukemia virus, an animal virus such as vaccinia virus or baculovirus, etc. are used. It is done. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis or plasmids derived from yeast are preferably used.
Examples of promoters that regulate DNA expression include (i) promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) ) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidity Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratin K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine triphosphate (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin , Prep Enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among these, the cytomegalovirus promoter capable of being highly expressed throughout the body, the human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, the human and chicken β-actin promoters, and the like are suitable.
The vector preferably has a sequence (generally referred to as a terminator) that terminates transcription of a target messenger RNA in a DNA-transferred mammal. For example, the sequence of each DNA derived from viruses and various mammals Preferably, a simian virus SV40 terminator or the like is used.

その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常なＧＰＲ３９の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＧＰＲ３９の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。 In addition, the splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or the translation region for the purpose of further expressing the target foreign DNA It is also possible to connect it 3 ′ downstream of the target.
Normal GPR39 translation regions include liver, kidney, thyroid cell, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and various commercially available genomes. Complementary DNA prepared by a known method can be obtained as a raw material from a DNA library as all or part of genomic DNA or from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblasts. In addition, exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal GPR39 translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by an ordinary DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
The transfer of the foreign DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal. The presence of the foreign DNA of the present invention in the embryo cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the foreign DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. .
The transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the embryo cells of the produced animal after the DNA transfer. This means that all the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. Means. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has an excess of the foreign DNA of the present invention in all germ cells and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA in excess.

本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＧＰＲ３９の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能亢進症や、ＧＰＲ３９が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、ＧＰＲ３９の増加症状を有することから、ＧＰＲ３９に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。 The non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present invention, and eventually develops GPR39 hyperfunction by promoting the function of the endogenous normal DNA. And can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the hyperfunction of GPR39 and the pathological mechanism of diseases related to GPR39 and to examine methods for treating these diseases.
Moreover, since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of GPR39, it can be used in screening tests for therapeutic agents for diseases associated with GPR39.
On the other hand, the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material. A DNA construct with a promoter can be prepared by a normal DNA engineering technique. The abnormal DNA transfer of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can be bred to have the DNA.

本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＧＰＲ３９の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症における本発明の異常ＧＰＲ３９による正常ＧＰＲ３９の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、ＧＰＲ３９の増加症状を有することから、ＧＰＲ３９またはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ii）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＧＰＲ３９組織を分析することによる、ＧＰＲ３９により特異的に発現あるいは活性化するＧＰＲ３９との関連性についての解析、
（iii）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（iv）上記（iii）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異ＧＰＲ３９を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症などを含む、ＧＰＲ３９に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、ＧＰＲ３９に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、ＧＰＲ３９産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、ＧＰＲ３９およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、ＧＰＲ３９の機能不活性型不応症を含む、ＧＰＲ３９に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、ＧＰＲ３９が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。 The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression of the abnormal DNA of the present invention, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA, thereby eventually causing a functional inactive refractory condition of GPR39. Can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathologic mechanism of GPR39 functional inactive refractory and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific applicability, the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention is a model for elucidating the function inhibition (dominant negative action) of normal GPR39 by the abnormal GPR39 of the present invention in GPR39 functional inactive refractory disease. It becomes.
Moreover, since the mammal which transferred the foreign abnormal DNA of this invention has the increase symptom of GPR39, it can be utilized for the therapeutic drug screening test with respect to GPR39 or a functional inactive type refractory.
Further, as other applicability of the above-mentioned two kinds of DNA transfer animals of the present invention, for example,
(I) use as a cell source for tissue culture;
(Ii) Association with GPR39 specifically expressed or activated by GPR39 by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or by analyzing GPR39 tissue expressed by DNA Sex analysis,
(Iii) culturing cells of a tissue having DNA by a standard tissue culture technique, and using them, studying the function of cells from tissues generally difficult to cultivate,
(Iv) Screening of drugs that enhance cell functions by using the cells described in (iii) above, and (v) isolation and purification of the mutant GPR39 of the present invention and production of antibodies thereof are conceivable.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of diseases related to GPR39, including functional inactive refractory of GPR39, etc., and in each organ of a disease model related to GPR39. More detailed pathological findings can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods and to the study and treatment of secondary diseases caused by the diseases.
Further, each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain a free DNA-transferred cell, culture it, or systematize the cultured cell with a protease such as trypsin. . Furthermore, it is possible to investigate GPR39-producing cells, their relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them, and investigate their abnormalities. It becomes.
Furthermore, in order to develop a therapeutic agent for diseases related to GPR39, including functional inactive refractory of GPR39, using the DNA-transferred animal of the present invention, using the above-described test method and quantitative method, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic drug for the disease. Moreover, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for diseases associated with GPR39 using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention.

（１２）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしているＧＰＲ３９の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的にＧＰＲ３９の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。 (12) Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
That is, the present invention
[1] A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated,
[2] The embryonic stem cell according to item [1], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli),
[3] The embryonic stem cell of [1], which is neomycin resistant,
[4] The embryonic stem cell of [1], wherein the non-human mammal is a rodent
[5] The embryonic stem cell according to item [4], wherein the rodent is a mouse,
[6] The DNA expression-deficient non-human mammal in which the DNA of the present invention is inactivated,
[7] The DNA can be inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention [6] The non-human mammal according to Item,
[8] The non-human mammal according to item [6], wherein the non-human mammal is a rodent.
[9] A test compound is administered to the non-human mammal according to [8] and [10] the animal according to [7], wherein the rodent is a mouse, and the expression of the reporter gene is detected. The screening method of the compound or its salt which promotes or inhibits the promoter activity with respect to DNA of this invention characterized by these is provided.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated refers to suppressing the DNA expression ability by artificially adding mutation to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, or By substantially losing the activity of GPR39 encoded by DNA, the DNA has substantially no ability to express GPR39 (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention). An embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell).
As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
As a method for artificially adding a mutation to the DNA of the present invention, for example, a part or all of the DNA sequence can be deleted or another DNA can be inserted or replaced by a genetic engineering technique. With these mutations, for example, the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of the promoter or exon.

本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) A DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl) Inserting a reporter gene typified by a transferase gene) or the like, or inserting a DNA sequence (for example, a polyA addition signal) that terminates the transcription of the gene into an intron between exons, By preventing the synthesis of complete messenger RNA As a result, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cell Southern hybridization analysis using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe or PCR method using the DNA sequence of the targeting vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as primers And can be obtained by sorting the knockout ES cells of the present invention.
Moreover, as the original ES cell for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method, for example, those already established as described above may be used, or according to the methods of known Evans and Kaufma. Newly established may be used. For example, in the case of mouse ES cells, currently 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, an alternative and purely immunological genetic background For example, C57BL / 6 mice and BDF ₁ mice (C57BL / 6 and DBA / 2 which have improved the number of eggs collected from C57BL / 6 by crossing with DBA / 2) are obtained. Those established using F ₁ ) can also be used favorably. BDF ₁ mice have the advantage of having a large number of eggs collected and strong eggs, and also have C57BL / 6 mice in the background, so ES cells obtained using these mice can be used to create pathological model mice. The genetic background can be advantageously replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.
In addition, when establishing ES cells, blastocysts on the 3.5th day after fertilization are generally used, but in addition to this, many blastocysts can be efficiently obtained by collecting 8-cell embryos and culturing them to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although both male and female ES cells may be used, male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.

ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけるＧＰＲ３９またはＧＰＲ３９の細胞生物学的検討において有用である。 One example of a method for determining the sex of an ES cell is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. If this method is used, the number of ES cells of about 1 colony (about 50) is sufficient as compared with the case where about 10 ⁶ cells were conventionally required for karyotype analysis. It is possible to perform primary selection of ES cells in the early stage by discriminating between males and females, and by allowing male cells to be selected at an early stage, labor in the initial stage of culture can be greatly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes of the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number. However, if it is difficult due to physical operations at the time of establishment, the gene of the ES cell is knocked out, and then normal cells (for example, chromosomes in mice) It is desirable to clone again into cells where the number is 2n = 40.
The embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative, but it tends to lose its ontogenic ability, so it needs to be subcultured carefully. For example, in a carbon dioxide incubator in the presence of LIF (1-10000 U / ml) on a suitable feeder cell such as STO fibroblast (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% Culturing is carried out by a method such as culturing at about 37 ° C. with carbon dioxide gas and 90% air, and at the time of passage, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, Preferably, the cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA, and seeded on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, the cells are observed, and if morphologically abnormal cells are observed, the cultured cells are desirably discarded.
ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985], ES cells of the present invention. The DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiation are useful for in vitro cell biology of GPR39 or GPR39.

本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＧＰＲ３９のヘテロ発現不全個体であり、ＧＰＲ３９のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＧＰＲ３９のホモ発現不全個体を得ることができる。 The DNA expression deficient non-human mammal of the present invention can be distinguished from normal animals by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly.
As the non-human mammal, those similar to the above can be used.
The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is a DNA in which, for example, a targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector of the present invention is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
A cell in which the DNA of the present invention is knocked out is obtained by analyzing the DNA sequence of the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence of or near the DNA of the present invention as a probe and the mouse used for the targeting vector of the present invention. It can be determined by analysis by a PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than DNA as a primer. When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is placed at a suitable time, for example, an 8-cell non-human mammal. It is injected into animal embryos or blastocysts, and the produced chimeric embryos are transplanted into the uterus of the non-human mammal that is pseudopregnant. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
When some of the germ cells of the chimeric animal have the mutated DNA locus of the present invention, all the tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by determining the coat color. The individuals thus obtained are usually individuals with GPR39 hetero-expression deficiency, and GPR39 hetero-expression deficiency individuals can be crossed to obtain GPR39 homo-expression deficiency individuals from their offspring.

卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＧＰＲ３９により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＧＰＲ３９の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。 When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into the chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by a microinjection method. Compared to mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination.
Thus, an individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be reared in a normal breeding environment after confirming that the individual animal obtained by mating has also been knocked out.
In addition, germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods. That is, a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained by mating male and female animals possessed by the inactivated DNA. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are 1 normal individual and multiple homozygous animals. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful for producing the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
Further, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by GPR39, it can be a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of GPR39. It is useful for investigating the cause of diseases and examining treatment methods.

（１２ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症）に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進薬のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物または試験元素を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
試験元素としては、例えば、周期表に記載されている元素が用いられ、なかでも金属元素が好ましい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物または試験元素で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物または試験元素の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物または試験元素で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物または試験元素の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物または試験元素の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。 (12a) Method for screening compound or salt thereof having therapeutic / preventive effect on diseases caused by deficiency or damage of DNA of the present invention The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is deficient in the DNA of the present invention Diseases such as poor development, wounds, burns, coldness, learning ability, sexual function decline, taste disorder, olfactory disturbance, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, Due to reduced resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc. Low-tension bladder based on decreased bladder perception, and metal deficiency such as low-tension bladder due to bladder sensation paralysis after pelvic visceral surgery) Alternatively, it can be used for screening a salt thereof, or a cytokine (eg, IL-8) secretagogue.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound or a test element to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring changes in the animal, such as a deficiency or damage of the DNA of the present invention A screening method for a compound having a therapeutic / prophylactic effect on a disease caused by the disease or a salt thereof is provided.
Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
As the salt of the test compound, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly used. preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
As the test element, for example, elements described in the periodic table are used, and metal elements are particularly preferable.
Specifically, the DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is treated with a test compound or a test element, and compared with an untreated control animal, changes in each animal organ, tissue, disease symptoms, etc. As an index, the therapeutic / preventive effect of a test compound or a test element can be tested.
As a method for treating a test animal with a test compound or a test element, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound or the test element, and the like. The dosage of the test compound or test element can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.

該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物または試験元素を投与した場合、該試験動物の上記疾患が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上治癒した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＧＰＲ３９の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症）に対する安全で低毒性な治療・予防剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＧＰＲ３９と金属元素との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物またはその塩を注射剤の形で通常、癌患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 In the screening method, when a test compound or a test element is administered to a test animal, the test disease is cured when the disease of the test animal is cured by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more. The compound can be selected as a compound having a therapeutic / prophylactic effect on the above diseases or a salt thereof.
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the test compounds described above, and is caused by a GPR39 deficiency or damage (for example, poor development, wound, burn, coldness, learning ability) Decreased, sexual function, taste disorder, olfactory disorder, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, spots, anemia, hair loss, Low tension bladder based on decreased bladder perception due to respiratory disorder, digestive disorder, heart disorder, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes, etc. Such as safe and low toxic treatment / prevention agents for low-tension bladder-related metal deficiencies), or cytokine (eg, IL-8) secretion promoters It can be used as. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
As a salt of a compound obtained by using the screening method, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid, etc.) or a base (eg, alkali metal, etc.) is used. Acceptable acid addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
The pharmaceutical containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the compound that changes the binding property or signal transduction between GPR39 and a metal element.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound or a salt thereof is administered orally, generally in cancer patients (with a body weight of 60 kg). The compound or a salt thereof is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, the compound or a salt thereof is usually in the form of an injection for cancer patients (body weight). About 60 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is administered by intravenous injection per day. It is convenient to do. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.

（１２ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、ＧＰＲ３９をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＧＰＲ３９の発現する組織で、ＧＰＲ３９の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＧＰＲ３９の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＧＰＲ３９欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。 (12b) Screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention In the present invention, the test compound is administered to the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention to express the reporter gene. Provided is a screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention.
In the above screening method, the DNA expression deficient non-human mammal of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene among the DNA deficient non-human mammals of the present invention described above, A gene capable of expressing the reporter gene under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound are the same as described above.
As the reporter gene, the same ones as described above are used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene, or the like is preferable.
In non-human mammals with deficient DNA expression of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, the reporter gene exists under the control of the promoter for the DNA of the present invention, so the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding GPR39 is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from E. coli, β-galactosidase is expressed instead of GPR39 in a tissue where GPR39 is originally expressed. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal), The expression state in the animal body can be observed. Specifically, GPR39-deficient mice or tissue sections thereof were fixed with glutaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at about room temperature or around 37 ° C. After reacting for 30 minutes to 1 hour, the tissue specimen is washed with a 1 mM EDTA / PBS solution to stop the β-galactosidase reaction and observe the coloration. Moreover, you may detect mRNA which codes lacZ according to a conventional method.
The compound obtained by using the screening method or a salt thereof is a compound selected from the above-described test compounds or a salt thereof, and is a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity for the DNA of the present invention.
As the salt of the compound obtained by the screening method, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid) or a base (eg, organic acid) is used, and particularly physiologically acceptable. The acid addition salts are preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.

本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の発現を促進し、ＧＰＲ３９の機能を促進することができるので、例えば、ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤などの医薬として有用である。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＧＰＲ３９の発現を阻害し、ＧＰＲ３９の機能を阻害することができるので、例えば、ＧＰＲ３９の機能過多に関連する疾患などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤などの医薬として有用である。
ＧＰＲ３９の機能不全に関連する疾患としては、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などが挙げられる。
ＧＰＲ３９の機能過多に関連する疾患としては、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などが挙げられる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 Since the compound or its salt that promotes the promoter activity for DNA of the present invention can promote the expression of GPR39 and promote the function of GPR39, for example, a prophylactic / therapeutic agent for diseases related to GPR39 dysfunction It is useful as a medicament such as a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
Since the compound or its salt that inhibits the promoter activity for DNA of the present invention can inhibit the expression of GPR39 and inhibit the function of GPR39, for example, a prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with excessive function of GPR39 It is useful as a medicament such as a cytokine (eg, IL-8) secretion inhibitor.
Diseases related to GPR39 dysfunction include, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, sexual dysfunction, taste disorders, olfactory disorders, prostate hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, Cholesterol accumulation, decreased resistance to infection, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart disorders, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, Examples thereof include metal deficiency such as low tension bladder based on decreased bladder perception due to diabetes and the like, and low tension bladder due to bladder perception after surgical operation of the pelvic viscera.
Examples of diseases associated with excessive function of GPR39 include renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, interstitial cystitis Urinary frequency due to cystitis, urinary frequency due to benign prostatic hyperplasia, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, intercourse pain, bladder irritation, various disorders caused by urinary stones, or inflammatory diseases ( Examples, diabetic complications such as neuropathy, macrovascular disorders; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergic diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, Chronic obstructive pulmonary disease (COPD)) and the like.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.

該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＧＰＲ３９またはその塩と金属元素との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常、癌患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、ＧＰＲ３９のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのＧＰＲ３９を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、ＧＰＲ３９そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。 The pharmaceutical containing the compound or salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the pharmaceutical containing the compound or salt thereof that changes the binding property between GPR39 or a salt thereof and a metal element. .
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when orally administering a compound or a salt thereof that promotes promoter activity against the DNA of the present invention, In cancer patients (with a body weight of 60 kg), the compound or a salt thereof is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, the compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is in the form of an injection. Usually, when administered to a cancer patient (with a body weight of 60 kg), the compound or a salt thereof is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient to administer the degree by intravenous injection. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
Thus, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful in screening for compounds or salts thereof that promote or inhibit the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused or the development of preventive / therapeutic drugs.
In addition, by using DNA containing the promoter region of GPR39 and linking genes encoding various proteins downstream thereof and injecting them into the egg cells of animals, so-called transgenic animals (gene transgenic animals) can be prepared. It is also possible to specifically synthesize GPR39 and to examine its action in the living body. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter part and a cell line in which it is expressed is established, a search system for a low molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of GPR39 itself in the body. Can be used as

本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine tri Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate

Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
＊ ：終止コドンに対応する
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Threonine Cys: Cysteine Met: Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys Argin P : Tryptophan Pro: Proline Asn: Asparagine Gln: Glutamine pGlu: Pyroglutamic acid *: Corresponding to stop codon Me: Methyl group Et: Ethyl group Bu: Butyl group Ph: Phenyl group TC: Thiazolidine-4 (R) -carboxamide group

また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記
する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃl_２Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl Cl ₂ Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: benzyloxymethyl Z: benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyl Oxycarbonyl Boc: t-butoxycarbonyl DNP: dinitrophenol Trt: trityl Bum: t-butoxymethyl Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy -4-oxo-
1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide

本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
ヒト由来ＧＰＲ３９のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
ヒト由来ＧＰＲ３９をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
以下の実施例３におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４
以下の実施例３におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：５
以下の実施例３におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：６
マウス由来ＧＰＲ３９のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７
マウス由来ＧＰＲ３９をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：８
ラット由来ＧＰＲ３９のアミノ酸配列を示す。
配列番号：９
ラット由来ＧＰＲ３９をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１０
以下の実施例７におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１１
以下の実施例７におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１２
以下の実施例７におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
配列番号：１３
以下の実施例９におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１４
以下の実施例９におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：１５
以下の実施例９におけるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。 The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
SEQ ID NO: 1
The amino acid sequence of human-derived GPR39 is shown.
SEQ ID NO: 2
The nucleotide sequence of cDNA encoding human-derived GPR39 is shown.
SEQ ID NO: 3
The base sequence of the primer used in TaqMan PCR reaction in Example 3 below is shown.
SEQ ID NO: 4
The base sequence of the primer used in TaqMan PCR reaction in Example 3 below is shown.
SEQ ID NO: 5
The base sequence of the probe used in TaqMan PCR reaction in Example 3 below is shown.
SEQ ID NO: 6
The amino acid sequence of mouse-derived GPR39 is shown.
SEQ ID NO: 7
The base sequence of cDNA encoding mouse-derived GPR39 is shown.
SEQ ID NO: 8
The amino acid sequence of rat-derived GPR39 is shown.
SEQ ID NO: 9
The nucleotide sequence of cDNA encoding rat-derived GPR39 is shown.
SEQ ID NO: 10
The base sequence of the primer used in TaqMan PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 11
The base sequence of the primer used in TaqMan PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 12
The base sequence of the probe used in TaqMan PCR reaction in Example 7 below is shown.
SEQ ID NO: 13
The base sequence of the primer used in TaqMan PCR reaction in Example 9 below is shown.
SEQ ID NO: 14
The base sequence of the primer used in TaqMan PCR reaction in Example 9 below is shown.
SEQ ID NO: 15
The base sequence of the probe used in TaqMan PCR reaction in Example 9 below is shown.

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。   EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, the gene using Escherichia coli followed the method described in the molecular cloning (Molecular cloning).

〔実施例１〕ヒト型ＧＰＲ３９−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の取得
ヒト型ＧＰＲ３９のＣ末端に翻訳のフレーム合わせてオワンクラゲより単離されたＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ） ｃＤＮＡをつないだ融合蛋白を発現させるための発現プラスミドを構築した。その際ＧＦＰ ｃＤＮＡにはＧＦＰの発現ベクターｐＱＢＩ２５（宝酒造）から切り出した断片を用いた。ＧＰＲ３９はＰＣＲ法によりその終止コドンを制限酵素ＮｈｅＩの認識配列に修正し、ここにＧＦＰ断片を連結して、動物細胞での発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｈｉｎｕｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１２１９，２５１−２５９，１９９４記載のｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈと同一のプラスミドベクター）に挿入した。このベクターを用いて自体公知の方法でＧＰＲ３９−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を取得した。 [Example 1] Acquisition of CHO cells expressing human GPR39-GFP fusion protein A fusion protein obtained by linking Green Fluorescent Protein (GFP) cDNA isolated from Aequorea jellyfish in the C-terminus of human GPR39 with a translation frame. An expression plasmid for expression was constructed. At that time, a fragment excised from the GFP expression vector pQBI25 (Takara Shuzo) was used as the GFP cDNA. In GPR39, the stop codon is corrected to the recognition sequence of the restriction enzyme NheI by PCR, and a GFP fragment is ligated thereto to express the vector pAKKO-111H for expression in animal cells (Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et. al., 1219, 251-259, 1994, the same plasmid vector as pAKKO-1.11H). Using this vector, CHO cells expressing GPR39-GFP fusion protein were obtained by a method known per se.

〔実施例２〕ＧＰＲ３９に対する金属元素のアゴニスト活性の検出
ＧＰＲ３９に対するアゴニストの探索を下記の方法で行った結果、特定の金属元素がＧＰＲ３９のアゴニストであることが判明した。
実施例１で作製したヒトＧＰＲ３９−ＧＦＰ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰ）を３ｘ１０^４個／１００μｌの細胞が含まれるように希釈し、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて一晩培養した。細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて以下の方法で測定した。Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ） ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファー［ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）を２０ｍｌ添加し、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらに上記のＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し調製する。］に加え、蛍光色素溶液を調製した。細胞プレートの培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄しＦＬＩＰＲにセットした。また細胞に添加する金属元素の化合物はアッセイバッファーを用いて各々の濃度に希釈し、リガンド用のプレートに分注しＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて金属元素添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定しアゴニスト作用の検討を行った。その結果、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ_２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２）、塩化銅（ＣｕＣｌ_２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ_２）を加えたときに、ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰの細胞内カルシウム濃度が用量依存的に上昇した（図１〜図４）。受容体を発現していないＣＨＯ細胞やＧＰＲ３９以外のＧＰＣＲを発現しているＣＨＯ細胞では、このような応答は見られなかった。従って、これらの金属塩（金属イオン）がＧＰＲ３９に対する特異的なアゴニストであることが判明した。 [Example 2] Detection of agonist activity of metal element for GPR39 As a result of searching for an agonist for GPR39 by the following method, it was found that a specific metal element was an agonist of GPR39.
The CHO cell line (CHO / hGPR39-GFP) introduced with the human GPR39-GFP expression vector prepared in Example 1 was diluted so that 3 × 10 ⁴ cells / 100 μl of cells were contained, and Black walled 96-well plate (Costar) After dispensing 100 μl per well, the cells were cultured overnight in a CO ₂ incubator. The fluctuation of intracellular calcium concentration was measured by the following method using FLIPR (Molecular Device). 50 μg of Fluo-3AM (DOJIN) was dissolved in 21 μl DMSO (DOJIN), and an equal amount of 20% pluronic acid (Molecular Probes) was added and mixed. 20 ml of 1M HEPES (pH 7.4) (DOJIN) was added to (Invitrogen), 710 mg of probenecid (Sigma) was dissolved in 5 ml of 1N NaOH, and then 5 ml of the above HBSS / HEPES solution was added and mixed. Prepare. In addition, a fluorescent dye solution was prepared. The medium of the cell plate was removed and the fluorescent dye solution was immediately dispensed at 100 μl per well and then cultured in a CO ₂ incubator for 1 hour to allow the cells to incorporate the fluorescent dye. The cultured cells were washed with the above assay buffer and set in FLIPR. The metal element compounds added to the cells were diluted to their respective concentrations using an assay buffer, dispensed onto a ligand plate, and set in the FLIPR. After the above pretreatment, the fluctuation of intracellular calcium concentration after addition of the metal element was measured by FLIPR, and the agonist action was examined. As a result, when cadmium chloride (CdCl ₂ ), zinc chloride (ZnCl ₂ ), copper chloride (CuCl ₂ ), nickel chloride (NiCl ₂ ) was added, the intracellular calcium concentration of CHO / hGPR39-GFP was dose-dependent. (FIGS. 1 to 4). Such a response was not observed in CHO cells not expressing the receptor or CHO cells expressing GPCRs other than GPR39. Therefore, it was found that these metal salts (metal ions) are specific agonists for GPR39.

〔実施例３〕ヒト型ＧＰＲ３９ｍＲＮＡ発現
ｍＲＮＡの発現量の定量にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。発現量の定量に用いるプライマー［５’−ＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＧＣＴ−３’（配列番号：３）、５’−ＣＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：４）］とプローブ［５’−ＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＴＣＡ−３’（配列番号：５）］は、ヒト型ＧＰＲ３９の塩基配列（配列番号：２）をもとにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ専用のソフトウエアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社）を利用してデザインした。鋳型となるｃＤＮＡは、ヒト各種組織、細胞由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇからランダムプライマーを用いて逆転写反応して合成したものを使用した。逆転写反応は逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を使用し、添付のプロトコールにしたがって行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒの反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を７．５μｌ、各プライマーを０．９μＭ、プローブを０．２５μＭ、ｃＤＮＡ溶液を混ぜ合わせ、蒸留水で１５μｌとして調製した。反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返して行った。
ヒト各種組織や細胞でのｍＲＮＡの発現を図５〜図７に示す。中枢神経組織、下垂体、腎臓、胃・腸管組織、胎児脳、血管系初代培養細胞、腎臓系初代培養細胞、あるいは大腸がん細胞株に高発現していた。 [Example 3] Expression of human GPR39 mRNA ABI PRISM 7900HT Sequence Detector (Applied Biosystems) was used for quantification of mRNA expression level. Primer [5′-TGTGACATTGGCCGTATGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 3), 5′-CAGTCGTGCTTGGGTTTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4)] and probe [5′-TGCCCAACCAGATTCGGAGGATCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5)] was designed on the basis of the base sequence of human GPR39 (SEQ ID NO: 2) by using software exclusive for ABI PRISM Sequence Detector (Applied Biosystems). As a template cDNA, a cDNA synthesized by reverse transcription reaction using random primers from 1 μg of total RNA derived from various human tissues and cells was used. The reverse transcription reaction was performed using SuperScript II (GIBCO BRL) as a reverse transcriptase according to the attached protocol. The reaction solution of ABI PRISM 7900HT Sequence Detector was prepared by mixing TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 7.5 μl, each primer 0.9 μM, probe 0.25 μM, and cDNA solution 15 μl. . The reaction was carried out by repeating 40 cycles of a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute after 2 minutes at 50 ° C. and 10 minutes at 95 ° C.
The expression of mRNA in various human tissues and cells is shown in FIGS. It was highly expressed in central nervous tissue, pituitary gland, kidney, stomach / intestinal tract tissue, fetal brain, primary vascular cultured cells, primary cultured kidney cells, or colon cancer cell lines.

〔参考例１〕ヒトＧＰＲ３９、ラットＧＰＲ３９、およびマウスＧＰＲ３９発現細胞の取得
ヒトＧＰＲ３９、ラットＧＰＲ３９、およびマウスＧＰＲ３９のｃＤＮＡは、それぞれ、ＡＦ０３４６３３．１（ヒト）、ＸＭ＿２２２５７８（ラット）、ＡＫ０１６８１７とＡＫ０８２９４１．１（マウス）の公知の配列を基にして、腸管を含むｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲで取得した。得られたＤＮＡ断片を動物細胞での発現用ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｈｉｎｕｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１２１９，２５１−２５９，１９９４記載のｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈと同一のプラスミドベクター）に挿入した。このベクターを用いて自体公知の方法でＧＰＲ３９を発現するＣＨＯ細胞を取得した。 [Reference Example 1] Acquisition of human GPR39, rat GPR39 and mouse GPR39-expressing cells The cDNAs of human GPR39, rat GPR39 and mouse GPR39 were AF034633.1 (human), XM — 222578 (rat), AK016817 and AK082941.1, respectively. Based on the known sequence of (mouse), it was obtained by RT-PCR from cDNA containing the intestinal tract. The obtained DNA fragment was transformed into an animal cell expression vector pAKKO-111H (the same plasmid vector as pAKKO-1.11H described in Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251-259, 1994). ). Using this vector, CHO cells expressing GPR39 were obtained by a method known per se.

〔実施例４〕サイトセンサーを用いたシグナルの検出
サイトセンサーを用いてリガンドによる細胞内シグナル伝達系の活性化を、細胞の物質代謝によるｐＨの変化を指標に測定した。
方法は、前日にヒトＧＰＲ３９発現ＣＨＯ細胞株を培養用フラスコにコンフルエントまで培養した後、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した後、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてはがし、遠心して回収した後、培地に懸濁し、３ｘ１０^５細胞／ｍｌに調整した。そして、サイトセンサーカプセルキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）のカプセルを１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）にセットし、その中に細胞懸濁液を１ｍｌ入れ、蓋をして３７℃インキュベーター内で翌日まで培養した。測定当日サイトセンサーを説明書通りに起動した後、サイトセンサーＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を調製し平衡化した後、前日に調製した細胞をまいたカプセル内にスペーサーを入れ、サイトセンサーにセットした。培地で平衡化した後、流露の切り替えによりサンプルを細胞に投与し、ｐＨの変化を測定した。
その結果、塩化ニッケルを添加したとき、ＧＰＲ３９を発現していないｍｏｃｋ細胞、および他の受容体であるＴＧＲ７では反応か検出されないのに対し、ＧＰＲ３９発現細胞ではニッケルに対する特異的な細胞応答が検出された（図８）。 [Example 4] Detection of signal using a site sensor Using a site sensor, activation of an intracellular signal transduction system by a ligand was measured using changes in pH due to cell metabolism as an index.
In the method, the human GPR39-expressing CHO cell line was cultured until confluent in the culture flask the day before, washed with PBS (Invitrogen), peeled off with trypsin (Invitrogen), collected by centrifugation, suspended in the medium. Adjusted to 3 × 10 ⁵ cells / ml. Then, the capsule of the cytosensor capsule kit (Molecular Device) was set in a 12-well plate (Coster), and 1 ml of the cell suspension was placed therein, covered, and cultured in a 37 ° C. incubator until next day. After starting the site sensor as instructed on the day of measurement, after preparing and equilibrating the site sensor RPMI 1640 medium (pH 7.4) (Invitrogen), place a spacer in the capsule containing the cells prepared the previous day, Set to sensor. After equilibration with the medium, the sample was administered to the cells by switching the flow and the change in pH was measured.
As a result, when nickel chloride was added, mock cells not expressing GPR39 and other receptors, TGR7, did not detect the reaction, whereas GPR39-expressing cells detected a specific cellular response to nickel. (FIG. 8).

〔実施例５〕ラット型ＧＰＲ３９に対する金属元素のアゴニスト活性の検出
ラット型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞株を用いてＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウムの上昇反応を指標に金属イオンのアゴニスト活性の検出を行った。用いたラット型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞株は１０％ 牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むハムαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。アッセイを行う前日にヒトＧＰＲ３９発現ＣＨＯ細胞株を培養用フラスコにコンフルエントまで培養した後、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンを用いてはがし、遠心して回収した後、培地に懸濁し、３ｘ１０^５細胞／ｍｌに調整する。そして、Ｂｌａｃｋ ｗａｌｌｅｄ ９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）に１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて一晩培養した。
アッセイ当日は前日に調製した、細胞に対し各種試験サンプルを添加し、この際の細胞内カルシウム濃度の変動をＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した。ＦＬＩＰＲにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処置を施した。まず、細胞に蛍光色素Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（ＤＯＪＩＮ）を添加するため、あるいはＦＬＩＰＲアッセイを行う直前に細胞を洗浄するためのアッセイバッファーを作成した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０００ｍｌに１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（ＤＯＪＩＮ）２０ｍｌを加えた溶液（以下、ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液）に、プロべネシド（Ｓｉｇｍａ）７１０ｍｇを１Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌに溶解後さらにＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液５ｍｌを加え混合した溶液１０ｍｌを添加し、この溶液をアッセイバッファーとした。次にＦｌｕｏ−３ＡＭ ５０μｇを２１μｌ ＤＭＳＯ（ＤＯＪＩＮ）に溶解し、さらに等量の２０％プルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え混合後、１０５μｌの牛胎児血清を添加した１０．６ｍｌのアッセイバッファーに加え、蛍光色素溶液を調製した。ヒト型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞の培地を除き、直ちに蛍光色素溶液を１穴あたり１００μｌずつ分注後、ＣＯ_２培養器にて１時間培養し、細胞に蛍光色素を取り込ませた。培養後の細胞は上記のアッセイバッファーを用いて洗浄した後、ＦＬＩＰＲにセットした。また、ラット型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞に添加する試験サンプルはアッセイバッファーを用いて調製し、同時にＦＬＩＰＲにセットした。以上の前処置を施した後、ＦＬＩＰＲにて各種試験サンプル添加後の細胞内カルシウム濃度の変動を測定した。その結果、塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ_２）、塩化銅（ＣｕＣｌ_２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２）、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ_２）を加えたときに、ＣＨＯ／ｒＧＰＲ３９の細胞内カルシウム濃度が用量依存的に上昇し、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト活性が検出された（図９〜図１３）。 [Example 5] Detection of metal element agonist activity against rat GPR39 Detection of metal ion agonist activity using CHO cell line stably expressing rat GPR39 as an indicator of the increase in intracellular calcium by FLIPR went. The CHO cell line stably expressing the rat GPR39 used was cultured using Ham's αMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (Invitrogen). The day before the assay, the human GPR39-expressing CHO cell line was cultured to confluence in a culture flask, washed with PBS, peeled off with trypsin, collected by centrifugation, suspended in the medium, and 3 × 10 ⁵ cells / ml. Adjust to. Then, 100 μl per well was dispensed into Black walled 96-well plate (Costar) and cultured overnight in a CO ₂ incubator.
On the day of the assay, various test samples prepared on the previous day were added to the cells, and the changes in intracellular calcium concentration were measured using FLIPR (Molecular Device). In order to measure the variation of intracellular calcium concentration by FLIPR, the following pretreatment was performed. First, an assay buffer was prepared for adding the fluorescent dye Fluo-3AM (DOJIN) to the cells or for washing the cells immediately before performing the FLIPR assay. 710 mg of probenecid (Sigma) was dissolved in 5 ml of 1N NaOH in a solution obtained by adding 20 ml of 1M HEPES (pH 7.4) (DOJIN) to 1000 ml of HBSS (Invitrogen). 10 ml of a solution mixed with 5 ml was added, and this solution was used as an assay buffer. Next, 50 μg of Fluo-3AM was dissolved in 21 μl DMSO (DOJIN), and an equal amount of 20% pluronic acid (Molecular Probes) was added and mixed, and then added to 10.6 ml of assay buffer supplemented with 105 μl of fetal calf serum. A fluorescent dye solution was prepared. The medium of CHO cells stably expressing human GPR39 was removed, and the fluorescent dye solution was immediately dispensed at 100 μl per well and then cultured in a CO ₂ incubator for 1 hour to allow the cells to incorporate the fluorescent dye. The cultured cells were washed with the above assay buffer and then set in FLIPR. In addition, a test sample to be added to CHO cells stably expressing rat GPR39 was prepared using an assay buffer and simultaneously set in FLIPR. After the above pretreatment, the fluctuation of intracellular calcium concentration after addition of various test samples was measured by FLIPR. As a result, when calcium chloride (CoCl ₂ ), nickel chloride (NiCl ₂ ), copper chloride (CuCl ₂ ), zinc chloride (ZnCl ₂ ), cadmium chloride (CdCl ₂ ) was added, intracellular calcium of CHO / rGPR39 The concentration increased in a dose-dependent manner, and agonist activity against GPR39 was detected (FIGS. 9-13).

〔実施例６〕マウス型ＧＰＲ３９に対する金属元素のアゴニスト活性の検出
マウス型ＧＰＲ３９を安定的に発現したＣＨＯ細胞株を用いてＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウムの上昇反応を指標に金属イオンのアゴニスト活性の検出を実施例５に記載の方法に従って行った。その結果、塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ_２）、塩化銅（ＣｕＣｌ_２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２）、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ_２）を加えたときに、ＣＨＯ／ｍＧＰＲ３９の細胞内カルシウム濃度が用量依存的に上昇し、ＧＰＲ３９に対するアゴニスト活性が検出された（図１４〜図１８）。 [Example 6] Detection of metal element agonist activity to mouse GPR39 Detection of metal ion agonist activity using FLIPR as an indicator of the increase in intracellular calcium by using a CHO cell line stably expressing mouse GPR39. The procedure was as described in Example 5. As a result, when calcium chloride (CoCl ₂ ), nickel chloride (NiCl ₂ ), copper chloride (CuCl ₂ ), zinc chloride (ZnCl ₂ ), cadmium chloride (CdCl ₂ ) was added, intracellular calcium of CHO / mGPR39 The concentration increased in a dose-dependent manner, and agonist activity against GPR39 was detected (FIGS. 14-18).

〔実施例７〕ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ３９ｍＲＮＡのラットにおける組織分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットより各種臓器を摘出し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）により、マニュアルにしたがって調製した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて、マニュアルに従いｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ換算で２５ｎｇ／μｌの溶液とし、以後のＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いた。 ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｉｓｍ ７９００（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴ−３’（配列番号：１０），５’−ＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＡ−３’（配列番号：１１）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−ＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：１２）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．１３５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを０．７５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を１μｌ加え、蒸留水で総反応液量を１５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたラット各種組織におけるＧＰＲ３９のｍＲＮＡ発現量はｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇあたりのコピー数として算出した（図１９）。 [Example 7] Examination of tissue distribution of GPR39 mRNA in rats by RT-PCR Various organs were excised from Wistar rats, and total RNA was prepared by Isogen (Nippon Gene) according to the manual. CDNA was synthesized from 1 μm of the obtained total RNA according to the manual using a random primer and SuperScript II reverse transcriptase (GIBCO BRL) as a reverse transcriptase. The synthesized cDNA was made into a 25 ng / μl solution in terms of total RNA and used as a template for subsequent RT-PCR. RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7900 (PE Biosystems), and 5′-CCCATGGAGTTCTACAGCATCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 10), 5′-TGTGGAGCTTTGCAGGGACAGA-3 ′ (sequence number) as a primer for amplification and detection. 11) and 5 ′-(Fam) -TGGAACCCCCTGACCACACCCA- (Tamura) -3 ′ (SEQ ID NO: 12) were used as TaqMan probes. RT-PCR reaction solution was added to 7.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems), 0.135 μl of 100 μM primer solution, 0.75 μl of 5 μM TaqMan probe, and 1 μl of the cDNA solution prepared above. The total reaction volume was made 15 μl with distilled water. In the PCR reaction, a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute was repeated 40 times after 50 ° C. for 2 minutes and 95 ° C. for 10 minutes. The amount of GPR39 mRNA expression in the various rat tissues obtained was calculated as the number of copies per 25 ng of total RNA (FIG. 19).

〔実施例８〕Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いた膀胱におけるＧＰＲ３９ｍＲＮＡの発現分布の検討
雄性Ｗｉｓｔａｒラットを屠殺し、膀胱を取り出しＰＢＳで洗浄した後、ＯＣＴコンパウンド中で液体窒素により凍結し、−８０℃で保存した。
ＧＰＲ３９アンチセンス、センスプローブは以下の方法で調製した。まず、プラスミドベクターｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）に自体公知の方法でラット型ＧＰＲ３９ｃＤＮＡを挿入した。このｃＤＮＡを、Ｍ１３プライマー（インビトロジェン社）・Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ ＰＣＲ ｋｉｔ（クロンテック社）を用いたＰＣＲにて増幅・直鎖化し、エタノール沈殿法により精製した。このｃＤＮＡから、ＤＩＧ ＲＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ＫＩＴ（ＳＰ６／Ｔ７）（ロッシュ社）にてＳＰ６もしくはＴ７によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを行い（４０μｌスケール）、エタノール沈殿により精製した後、蒸留水にて１００μｌに溶解した。ｃＤＮＡの挿入方向から、ＳＰ６により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがアンチセンスプローブ、Ｔ７により生成されたＤＩＧラベルリボプローブがセンスプローブであった。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションには新鮮凍結切片を使用した。まず前述した膀胱凍結組織をクライオスタットＣＭ３０５０（ライカ社）を用いてシランコートスライド上に８μｍの厚さで薄切した。切片を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにて１０分間固定した後、ＰＢＳにてよく洗い、０．２５％無水酢酸を含む０．１Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）による処理（室温・１０分）にてアセチル化を行った。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応には、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０％ホルムアミド，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，２００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ，１０％デキストラン硫酸，６００ｍＭ ＮａＣｌ，０．２５％ ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）でアンチセンスプローブもしくはセンスプローブを２００倍に希釈し、８５℃で１０分変性した後、切片に加え５０℃で１２時間以上反応させた。引き続き、非特異的にｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎしたプローブを洗浄するため以下の操作を行った。１）２×ＳＳＣ（ＳＳＣ；１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）／５０％ホルムアミド処理（６０℃・３０分・１回）、２）２×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・１回）、３）０．１×ＳＳＣ処理（６０℃・１５分・２回）。以上の操作を行った後、ＤＩＧラベルプローブを検出するための免疫組織化学を行った。まず、ＤＩＧ−１（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、１．５％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１による処理（３７℃・１時間）にて非特異反応のブロッキングを行い、ａｎｔｉ−ＤＩＧ ｆａｂ−ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ロッシュ社）を含むＤＩＧ−１（１：１０００）を室温で１時間反応させた。ＤＩＧ−１で十分洗浄した後、ＤＩＧ−３（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）でリンスし、０．１８ｍｇ／ｍｌ ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＢＣＩＰ）を含むジメチルホルムアミド、および０．３４ｍｇ／ｍｌ ４−ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）を含む７０％ジメチルホルムアミド、およびｐｏｌｙｖｉｎｙｌａｌｃｈｏｌを、ＤＩＧ−３ １０ｍｌにつきそれぞれ０．３５ｍｌ、０．４５ｍｌ、３％加えた溶液によって、室温にて発色反応を行った。適時に発色を流水洗浄により止めた後、９０％グリセロールを含むＰＢＳで封入し、光学顕微鏡で観察した。その結果、ＧＰＲ３９アンチセンスプローブにより、膀胱において移行上皮に陽性シグナルが観察された。これに対し、センスプローブによるシグナルはどの部位においても検出されなかった。粘膜固有層・筋層・血管内皮細胞にはアンチセンスプローブによるシグナルは検出されなかった。以上の結果から、膀胱においてＧＰＲ３９ｍＲＮＡは移行上皮に特異的に発現していることが判明した。 [Example 8] Examination of expression distribution of GPR39 mRNA in bladder using in situ hybridization method Male Wistar rats were sacrificed, the bladder was removed and washed with PBS, frozen in liquid nitrogen in an OCT compound, and -80 ° C. Saved with.
GPR39 antisense and sense probe were prepared by the following method. First, rat GPR39 cDNA was inserted into a plasmid vector pCRII TOPO (Invitrogen) by a method known per se. This cDNA was amplified and linearized by PCR using M13 primer (Invitrogen) / Advantage2 PCR kit (Clontech) and purified by ethanol precipitation. The cDNA was subjected to in vitro transcription with SP6 or T7 (40 μl scale) using DIG RNA Labeling KIT (SP6 / T7) (Roche), purified by ethanol precipitation, and dissolved in 100 μl with distilled water. From the direction of cDNA insertion, the DIG label riboprobe produced by SP6 was the antisense probe, and the DIG label riboprobe produced by T7 was the sense probe.
Fresh frozen sections were used for in situ hybridization. First, the above-mentioned frozen bladder tissue was sliced to a thickness of 8 μm on a silane-coated slide using a cryostat CM3050 (Leica). The section was fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde for 10 minutes, washed well with PBS, and treated with 0.1 M triethanolamine (pH 8.0) containing 0.25% acetic anhydride (room temperature, 10 minutes). Acetylation was performed at For the hybridization reaction, a hybridization buffer (50% formamide, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 × Denhardt's solution, 200 μg / ml tRNA, 10% dextran sulfate, 600 mM NaCl, 0.25% SDS, 1 mM EDTA) was used. Antisense probe or sense probe was diluted 200-fold, denatured at 85 ° C. for 10 minutes, added to the section, and reacted at 50 ° C. for 12 hours or longer. Subsequently, in order to wash the nonspecific hybridization probe, the following operation was performed. 1) 2 × SSC (SSC; 1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) / 50% formamide treatment (60 ° C., 30 minutes, once), 2) 2 × SSC treatment (60 ° C. 15 minutes, once) 3) 0.1 × SSC treatment (60 ° C., 15 minutes, twice). After the above operation, immunohistochemistry for detecting the DIG label probe was performed. First, after washing with DIG-1 (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20), treatment with DIG-1 containing 1.5% Blocking Reagent (Roche) (37 ° C./1 Time), a non-specific reaction was blocked, and DIG-1 (1: 1000) containing anti-DIG Fab-fragment antibody conjugated with alkaline phosphatase (Roche) was reacted at room temperature for 1 hour. After thoroughly washing with DIG-1, rinsing with DIG-3 (100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl ₂ ) and 0.18 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- Add dimethylformamide containing phosphate (BCIP), 70% dimethylformamide containing 0.34 mg / ml 4-nitroblue tetrazolium (NBT), and polyvinylalchol, 0.35 ml, 0.45 ml, and 3% for 10 ml of DIG-3, respectively. The color reaction was carried out at room temperature with the solution. The color development was stopped at an appropriate time by washing with running water, sealed with PBS containing 90% glycerol, and observed with an optical microscope. As a result, a positive signal was observed in the transitional epithelium in the bladder with the GPR39 antisense probe. In contrast, no signal from the sense probe was detected at any site. No signal from the antisense probe was detected in the lamina propria / muscle layer / vascular endothelial cells. From the above results, it was found that GPR39 mRNA was specifically expressed in the transitional epithelium in the bladder.

〔実施例９〕ＧＰＲ３９発現細胞株の選択
用いた細胞株は大日本製薬より購入し、培養方法は添付資料に従った。５６３７（ヒト由来）は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＨＴ−１１９７（ヒト由来）およびＨＴ−１３７６（ヒト由来）は１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＵＭ−ＵＣ−３（ヒト由来）およびＮＢＴ−ＩＩ（ラット由来）は１０％ＦＣＳ、１％ＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ、１ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｂａｔｅを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。Ｔ２４（ヒト由来）およびＭＢＴ−２（マウス由来）は１０％ＦＣＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。培養した細胞はＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ／ＥＤＴＡではがし、遠心して回収した後、−８０℃で保存した。ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成はＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ）のマニュアルに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出精製した。抽出したＲＮＡ １μｇはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマニュアルに従ってランダムを用いてｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成後エタノール沈殿してＴＥ １０μｌに溶解した。ＴａｑＭａｎ を用いた定量は細胞株由来ｃＤＮＡ（２５ ｎｇ ＲＮＡ相当）に対し、増幅反応試薬ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）、ＧＰＲ３９検出用ＴａｑＭａｎ（商標）プライマー−プローブセットを用いて行った。ヒト由来のサンプルは実施例３に記載のプライマー−プローブセットを用いた。ラット由来のサンプルは実施例７に記載のプライマー−プローブセットを用いた。また、マウス由来のサンプルについては、プライマーとして５’−ＧＴＡＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣ−３’（配列番号：１３），５’−ＴＡＴＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＴＣＧＴ−３’（配列番号：１４）およびＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−ＣＡＡＣＣＴＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：１５）を使用した。反応は１５μｌの合計反応液量で行った。各プライマー、プローブの最終濃度はマニュアルに従った。
ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期はＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）のマニュアルに従った。
増幅生成物の定量的ＴａｑＭａｎ解析は、７９００ＨＴ ＳＤＳソフトウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いて行った。コピー数の算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のｃＤＮＡ 断片（ＧＰＲ３９）またはＰｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ（ＧＰＲ３９）を用いた１０^７コピー／ｗｅｌｌから１０^２コピー／ｗｅｌｌまでの対数６点におけるＣ_Ｔ値から作成した。
その結果、５６３７、ＨＴ−１１９７、ＨＴ−１３７６、ＵＭ−ＵＣ−３、ＮＢＴ−ＩＩ、Ｔ２４およびＭＢＴ−２のすべての細胞株においてのＧＰＲ３９の発現が認められた（図２０）。 [Example 9] Selection of cell line expressing GPR39 The cell line used was purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., and the culture method was in accordance with the attached material. 5637 (derived from human) was cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 10% FCS until it became preconfluent. HT-1197 (human-derived) and HT-1376 (human-derived) are preconfluent in MINIMUM ESENTIAL MEDIAUM (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS. did. UM-UC-3 (human-derived) and NBT-II (rat-derived) are 10% FCS, 1% MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS, MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (WITH EARLE'S SALTS, WIT EARL'S SALTS, WIT It was cultured until it became preconfluent with GLUTAMINE). T24 (human-derived) and MBT-2 (mouse-derived) were cultured until they became preconfluent in MINIMUM ESSENTIAL MEDIAUM (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing 10% FCS. The cultured cells were washed with PBS, peeled off with PBS / EDTA, collected by centrifugation, and stored at −80 ° C. For RNA extraction and cDNA synthesis, total RNA was extracted and purified according to the manual of ISOGEN (Nippon gene). 1 μg of extracted RNA was synthesized with first strand cDNA using random according to the manual of SuperScript II (Invitrogen), ethanol precipitated, and dissolved in 10 μl of TE. Quantification using TaqMan was performed with respect to cell line-derived cDNA (corresponding to 25 ng RNA), amplification reaction reagent TaqMan (trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan), TaqMan (trademark) primer-probe set for GPR39 detection. It was performed using. The human-derived sample used the primer-probe set described in Example 3. The primer-probe set described in Example 7 was used for the rat-derived sample. Moreover, about the sample derived from a mouse | mouth, as a primer, 5'-GTACCCACTCACAAGGGACTCAAC-3 '(sequence number: 13), 5'-TATTGGAGTTCCAGGTTCATCGGT-3' (sequence number: 14) and TaqMan probe 5 '-(Fam) -CAACCCTCTTCGCACCCCC -(Tamura) -3 '(SEQ ID NO: 15) was used. The reaction was performed with a total reaction volume of 15 μl. The final concentration of each primer and probe was according to the manual.
TaqMan (trademark) PCR is performed by ABI PRISM (trademark) 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.), and the temperature cycle used is a manual of TaqMan (trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.). Followed.
Quantitative TaqMan analysis of the amplified product was performed using 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.). Calibration curve used for calculating the copy number in the logarithmic 6 points from 10 ⁷ copies / well using a known concentration of the cDNA fragment containing the amplified region full length (GPR39) or Plasmid DNA (GPR39) up to 10 ² copies / well Created from _CT values.
As a result, expression of GPR39 was observed in all cell lines 5637, HT-1197, HT-1376, UM-UC-3, NBT-II, T24 and MBT-2 (FIG. 20).

〔実施例１０〕ヒト膀胱癌細胞株での金属イオンに対する反応性の確認
用いた細胞株は大日本製薬より購入し、培養方法は添付資料に従った。５６３７は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＨＴ−１１９７およびＨＴ−１３７６は１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＵＭ−ＵＣ−３およびＮＢＴ−ＩＩは１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。Ｔ２４およびＭＢＴ−２は１０％ＦＣＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した。ＦＬＩＰＲを用いた細胞内カルシウム濃度の変動の測定は実施例５に記載の方法に従って行った。その結果、ＵＭ−ＵＣ−３およびＨＴ−１１９７においてニッケルによる反応が検出された。 [Example 10] Confirmation of reactivity to metal ions in human bladder cancer cell line The cell line used was purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., and the culture method followed the attached document. 5637 was cultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 10% FCS until it became preconfluent. HT-1197 and HT-1376 were cultured until preconfluent in MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS. UM-UC-3 and NBT-II were cultured until preconfluent in MINIMUM ESSENTIAL MEDIA (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS. T24 and MBT-2 were cultured until they became preconfluent in MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing 10% FCS. Measurement of the fluctuation of intracellular calcium concentration using FLIPR was performed according to the method described in Example 5. As a result, reaction with nickel was detected in UM-UC-3 and HT-1197.

〔実施例１１〕金属イオンによるＧＰＲ３９発現細胞ＵＭ−ＵＣ−３からのＩＬ−８の分泌促進
ＧＰＲ３９の発現細胞株であるＵＭ−ＵＣ−３を用いて、ＧＰＲ３９アゴニストである金属イオンの添加効果を検討した。
アッセイ前日にＵＭ−ＵＣ−３を１０％ＦＣＳおよびＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）でプレコンフルエントになるまで培養した後、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンを用いてはがし、遠心して回収した後、培地に懸濁し、１．５ｘ１０^５細胞／ｍｌに調整した。その後、６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ）に１穴あたり５ｍｌずつ分注し、ＣＯ_２培養器にて一晩培養した。
アッセイ当日は前日に調製した細胞の培地を除いた後、ＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）で洗浄、さらに５ｍｌずつ各ウェルに添加し、１時間ＣＯ_２培養器にて３７℃で培養した。その後、各種試験サンプルを添加したＭＥＭ ＮＯＮ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳを含むＭＩＮＩＭＵＭ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＭＥＤＩＵＭ（ＷＩＴＨ ＥＡＲＬＥ’Ｓ ＳＡＬＴＳ， ＷＩＴＨ Ｌ−ＧＬＵＴＡＭＩＮＥ）を５ｍｌずつ各ウェルに添加し、１２時間ＣＯ_２培養器にて３７℃で培養した。培養上清を回収した後、ＥＩＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、サンプル中に含まれるＩＬ−８を定量した結果、塩化銅１ｍＭ存在下では非存在下に対し、約２倍の蓄積量であることが確認され、ＧＰＲ３９の機能の一つとして、ＩＬ−８などのサイトカインの分泌を促進することが明らかになった。 [Example 11] Promotion of IL-8 secretion from GPR39-expressing cells UM-UC-3 by metal ions Using UM-UC-3, which is a cell line expressing GPR39, the effect of adding metal ions as GPR39 agonists was demonstrated. investigated.
The day before the assay, UM-UC-3 was incubated with MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing 10% FCS and MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS, and then washed with PBS. The sample was peeled off using trypsin, collected by centrifugation, suspended in a medium, and adjusted to 1.5 × 10 ⁵ cells / ml. Thereafter, 5 ml per well was dispensed into a 6-well plate (Falcon) and cultured overnight in a CO ₂ incubator.
On the day of the assay, the cell culture medium prepared on the previous day was removed, then washed with MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS, and 5 ml was added to each well. The cells were cultured at 37 ° C. for 1 hour in a CO ₂ incubator. Then, 5 ml of MINIMUM ESENTIAL MEDIAUM (WITH EARLE'S SALTS, WITH L-GLUTAMINE) containing MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACIDS to which various test samples were added was added to each well at 37 ° C. for 12 hours in a CO ₂ incubator. In culture. After collecting the culture supernatant, the amount of IL-8 contained in the sample was quantified by EIA (Amersham). As a result, it was confirmed that the accumulated amount was about twice that in the absence of 1 mM copper chloride. It was revealed that one of the functions of GPR39 promotes secretion of cytokines such as IL-8.

〔実施例１２〕覚醒ラットに対するＧＰＲ３９アゴニストの影響
９から１０週齡の雌性ＳＤラットにケタミン（５０ｍｇ／ｍＬ）とキシラジン（２０ｍｇ／ｍＬ）を５：１で混合した溶液を０．１ｍＬ／１００ｇで筋注することによって麻酔した。正中切開により膀胱を露出させ２０Ｇの注射針で穴を開けてポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０）を挿入し、木綿糸で膀胱に縫いつけた。膀胱に装着したポリエチレンチューブを１ｃｍほどの長さで切り、シリコンチューブ（Ｎｏ．００）に繋いで、皮下を通して背中に出した。動物は個別ケージで実験に供するまで飼育した。
手術１日後、動物をハロタン麻酔し、ボールマンケージに入れて動物を拘束した。膀胱に繋がったチューブに三方活栓を繋ぎ、生理食塩水注入用のチューブと膀胱内圧（注入抵抗）測定用のチューブを接続した。ボールマンケージの下に電子天秤を置き、排尿量を同時に記録した。麻酔が完全に覚めてから、膀胱内に生理食塩水の注入を開始し、膀胱内圧と排尿量をＡ−Ｄ変換器（ＭＰ−１００、ＢＩＯＰＡＣ ｓｙｓｔｅｍｓ）を介してパソコンに取り込み、専用ソフトウェア（ＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅ、ＢＩＯＰＡＣ ｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。
膀胱内に生理食塩水を６ｍＬ／ｈの速度で注入し、安定した排尿が記録できるまで、１〜２時間注入を続けた。膀胱への薬物の浸透性を高めるため、硫酸プロタミン（１０ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を１時間膀胱内に注入した（Ｃｈｕａｎｇ Ｙ，ｅｔ．ａｌ．，２００３，Ｕｒｏｌｏｇｙ ６３，ｐ．６６４−６７０）。プロタミンの注入によって、排尿間隔は、注入前とほとんど変化がなかった。その後、再び生理食塩水を膀胱内に注入し、プロタミンが完全に洗浄されるように２時間以上排尿を記録した。排尿間隔がほぼ一定になった時点で、ＧＰＲ３９アゴニストとして１ ｍＭの塩化第二銅（ＣｕＣｌ_２）生理食塩水溶液に切り替え、約１時間観察した。ＣｕＣｌ_２の注入を開始してから約３０分後から６０分後の間の平均排尿間隔を求め、ＣｕＣｌ_２を注入する前の約３０分間における平均排尿間隔に対する割合（％ ｏｆ ｐｒｅ−ｖａｌｕｅ）を求めた。
持続注入溶液を生理食塩水からＣｕＣｌ_２溶液に変えると、基底圧には影響がみられず、排尿間隔が短縮した。その割合は、注入前を１００％とすると４２．２±６．１％（ｎ＝４）に短縮した。従って、膀胱内に注入したＣｕＣｌ_２は、ＧＰＲ３９を介して頻尿状態にさせたことを示唆し、ＧＰＲ３９が排尿調節に関与していることが判明した。 Example 12 Effect of GPR39 Agonist on Awake Rats A 9 to 10 week old female SD rat mixed with ketamine (50 mg / mL) and xylazine (20 mg / mL) at a ratio of 5: 1 at 0.1 mL / 100 g Anesthesia was performed by intramuscular injection. The bladder was exposed through a midline incision, a hole was made with a 20G injection needle, a polyethylene tube (PE-50) was inserted, and the bladder was sewn with cotton thread. A polyethylene tube attached to the bladder was cut to a length of about 1 cm, connected to a silicone tube (No. 00), and exposed subcutaneously to the back. Animals were kept in individual cages until subjected to experiments.
One day after surgery, the animals were anesthetized with halothane and placed in a Ballman cage and restrained. A three-way stopcock was connected to a tube connected to the bladder, and a physiological saline injection tube and a bladder internal pressure (injection resistance) measurement tube were connected. An electronic balance was placed under the Ballman cage, and the amount of urination was recorded simultaneously. After anesthesia is completely awakened, physiological saline is injected into the bladder, and the intravesical pressure and urinary output are taken into a personal computer via an A / D converter (MP-100, BIOPAC systems), and dedicated software (AcqKnowledge) , BIOPAC systems).
Saline was infused into the bladder at a rate of 6 mL / h and infusion continued for 1-2 hours until stable urination was recorded. Protamine sulfate (10 mg / mL in PBS) was infused into the bladder for 1 hour to increase the permeability of the drug to the bladder (Chang Y, et. Al., 2003, Urology 63, p. 664-670). With the infusion of protamine, the urination interval was almost the same as before the infusion. Thereafter, physiological saline was again injected into the bladder, and urination was recorded for 2 hours or more so that protamine was completely washed. When the urination interval became almost constant, the GPR39 agonist was switched to a 1 mM cupric chloride (CuCl ₂ ) physiological saline solution and observed for about 1 hour. The average urination interval between about 30 minutes and 60 minutes after the start of the injection of CuCl ₂ was obtained, and the ratio (% of pre-value) to the average urination interval for about 30 minutes before the injection of CuCl ₂ Asked.
When the continuous infusion solution was changed from physiological saline to a CuCl ₂ solution, the basal pressure was not affected and the urination interval was shortened. The ratio was shortened to 42.2 ± 6.1% (n = 4) assuming that 100% before injection. Therefore, CuCl ₂ injected into the bladder suggested that a frequent urination was caused through GPR39, and it was found that GPR39 is involved in urination regulation.

ＧＰＲ３９とリガンドであるカドミウム、亜鉛、銅およびニッケルなどのイオン化可能な金属元素またはその塩とを用いることによって、該金属元素またはその塩とＧＰＲ３９との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。また、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、活性がより強いアゴニストを見出すことできる。
ＧＰＲ３９に対するアゴニストは、例えば、発育不良、傷、火傷、冷え性、学習能力の低下、性機能低下、味覚障害、嗅覚障害、前立腺肥大、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変、コレステロール蓄積、感染への抵抗力低下、痛風、癌、難産、糖尿病、シミ、貧血、脱毛、呼吸障害、消化障害、心臓障害、白髪、むくみ、しわ、たるみ、甲状腺機能低下、鬱、月経不順、糖尿病などによる膀胱知覚の低下に基づく低緊張膀胱、骨盤内臓の外科的手術後の膀胱知覚麻痺による低緊張膀胱などの金属欠乏症などの予防・治療剤、またはサイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌促進剤として有用である。
ＧＰＲ３９に対するアンタゴニストは、例えば、腎機能障害、肺機能障害、アレルギー皮膚炎、知覚神経障害、ウイルソン病、過活動膀胱による頻尿、夜間頻尿、間質性膀胱炎を含む膀胱炎による頻尿、前立腺肥大症による頻尿、尿失禁、尿意切迫感、骨盤内臓痛、***痛、膀胱刺激症状、尿路結石によって起こる種々の障害などの金属過剰症などの予防・治療剤、サイトカイン（例、ＩＬ−８）分泌抑制剤、または炎症性疾患（例、神経障害、大血管障害などの糖尿病性合併症；潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患；膀胱炎；過敏性腸症候群；神経痛）、アレルギー性疾患（例、喘息、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））などの予防・治療剤として有用である。 By using GPR39 and ligands such as cadmium, zinc, copper and nickel which are ionizable metal elements or salts thereof, a compound which changes the binding property between the metal element or a salt thereof and GPR39 can be efficiently screened. Can do. Moreover, an agonist with stronger activity can be found by using the screening method of the present invention.
Agonists for GPR39 include, for example, poor growth, wounds, burns, coldness, decreased learning ability, decreased sexual function, taste disorders, olfactory disorders, prostatic hypertrophy, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, cirrhosis, cholesterol accumulation, infection Reduced resistance, gout, cancer, dystocia, diabetes, stains, anemia, hair loss, respiratory problems, digestive disorders, heart problems, gray hair, swelling, wrinkles, sagging, hypothyroidism, depression, irregular menstruation, diabetes It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for metal deficiency such as hypotonic urinary bladder based on lowering, hypotensive urinary bladder due to bladder sensation paralysis after pelvic visceral surgery, or a cytokine (eg, IL-8) secretion promoter.
Antagonists to GPR39 include, for example, renal dysfunction, pulmonary dysfunction, allergic dermatitis, sensory neuropathy, Wilson disease, frequent urination due to overactive bladder, nocturia, frequent urination due to cystitis including interstitial cystitis, Prophylaxis due to benign prostatic hypertrophy, urinary incontinence, urgency, pelvic visceral pain, sexual intercourse pain, bladder irritation symptoms, various disorders caused by urinary calculi, and other prophylactic / therapeutic agents, cytokines (eg, IL -8) Secretory inhibitors or inflammatory diseases (eg, diabetic complications such as neuropathy and macrovascular disorder; inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis; cystitis; irritable bowel syndrome; neuralgia), allergy It is useful as a preventive / therapeutic agent for sex diseases (eg, asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD)).

ヒトＧＰＲ３９−ＧＦＰ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰ）に塩化カドミウムを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。□は３００μＭの塩化カドミウムを、△は１００μＭの塩化カドミウムを、○は１０μＭの塩化カドミウムを添加した場合を示す。The result of having investigated the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when cadmium chloride was added to the CHO cell line (CHO / hGPR39-GFP) which introduce | transduced the human GPR39-GFP expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. □ indicates that 300 μM cadmium chloride is added, Δ indicates that 100 μM cadmium chloride is added, and ○ indicates that 10 μM cadmium chloride is added. ヒトＧＰＲ３９−ＧＦＰ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰ）に塩化亜鉛を添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。□は３００μＭの塩化亜鉛を、△は１００μＭの塩化亜鉛を、○は１０μＭの塩化亜鉛を添加した場合を示す。The result of investigating the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when zinc chloride is added to the CHO cell line (CHO / hGPR39-GFP) which introduce | transduced the human GPR39-GFP expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. □ indicates the case where 300 μM zinc chloride is added, Δ indicates that 100 μM zinc chloride is added, and ○ indicates that 10 μM zinc chloride is added. ヒトＧＰＲ３９−ＧＦＰ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰ）に塩化銅を添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。□は３００μＭの塩化銅を、△は１００μＭの塩化銅を、○は１０μＭの塩化銅を添加した場合を示す。The result of having investigated the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when adding copper chloride to the CHO cell line (CHO / hGPR39-GFP) which introduce | transduced the human GPR39-GFP expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. □ indicates the case of adding 300 μM copper chloride, Δ indicates the addition of 100 μM copper chloride, and ◯ indicates the case of adding 10 μM copper chloride. ヒトＧＰＲ３９−ＧＦＰ発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９−ＧＦＰ）に塩化ニッケルを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。□は３００μＭの塩化ニッケルを、△は１００μＭの塩化ニッケルを、○は１０μＭの塩化ニッケルを添加した場合を示す。The result of investigating the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when nickel chloride is added to the CHO cell line (CHO / hGPR39-GFP) which introduce | transduced the human GPR39-GFP expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. □ indicates a case where 300 μM nickel chloride is added, Δ indicates a case where 100 μM nickel chloride is added, and ○ indicates a case where 10 μM nickel chloride is added. ＧＰＲ３９ ｍＲＮＡのヒト組織での発現分布を示す。コピー数／２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡは２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ当たりのコピー数を示す。The expression distribution in human tissue of GPR39 mRNA is shown. Copy number / 25 ng total RNA indicates the copy number per 25 ng total RNA. ＧＰＲ３９ ｍＲＮＡのヒト初代培養細胞での発現量を示す。コピー数／２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡは２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ当たりのコピー数を示す。The expression level of GPR39 mRNA in human primary cultured cells is shown. Copy number / 25 ng total RNA indicates the copy number per 25 ng total RNA. ＧＰＲ３９ ｍＲＮＡのヒト大腸がん細胞株での発現を示す。コピー数／２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡは２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ当たりのコピー数を示す。2 shows expression of GPR39 mRNA in a human colon cancer cell line. Copy number / 25 ng total RNA indicates the copy number per 25 ng total RNA. サイトセンサーを用いてヒトＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｈＧＰＲ３９）に塩化ニッケルを添加した時の細胞外液のｐＨの変化を調べた結果を示す。Ｃｙｃｌｅｓは添加後のｐＨ変化率の検出回数を示す。Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ Ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ（％）は細胞外液のｐＨの変化（酸性化率）を示し、細胞の呼吸速度を反映した値である。◆はＧＰＲ３９発現細胞を、▲はＴＧＲ７発現細胞を、□はｍｏｃｋ細胞を示す。The result of having investigated the change of pH of an extracellular fluid when nickel chloride was added to the CHO cell line (CHO / hGPR39) which introduce | transduced the human GPR39 expression vector using a site sensor is shown. Cycles indicates the number of detections of the rate of change in pH after addition. Change of Acidification Rate (%) indicates the change (acidification rate) of the pH of the extracellular fluid and is a value reflecting the respiration rate of the cells. ♦ indicates GPR39-expressing cells, ▲ indicates TGR7-expressing cells, and □ indicates mock cells. ラットＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｒＧＰＲ３９）に塩化コバルトを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は３０００μＭの塩化コバルトを、□は１０００μＭの塩化コバルトを、△は３００μＭの塩化コバルトを添加した場合を示す。The result of having investigated the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when cobalt chloride was added to the CHO cell line (CHO / rGPR39) which introduce | transduced the rat GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates the case of adding 3000 μM cobalt chloride, □ indicates the addition of 1000 μM cobalt chloride, and Δ indicates the case of adding 300 μM cobalt chloride. ラットＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｒＧＰＲ３９）に塩化ニッケルを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は１００μＭの塩化ニッケルを、□は３０μＭの塩化ニッケルを、△は１０μＭの塩化ニッケルを添加した場合を示す。The result of investigating the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when nickel chloride is added to the CHO cell line (CHO / rGPR39) which introduce | transduced the rat GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates the case where 100 μM nickel chloride is added, □ indicates the case where 30 μM nickel chloride is added, and Δ indicates the case where 10 μM nickel chloride is added. ラットＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｒＧＰＲ３９）に塩化銅を添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は１００μＭの塩化銅を、□は３０μＭの塩化銅を、△は１０μＭの塩化銅を添加した場合を示す。The result of investigating the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when adding copper chloride to the CHO cell line (CHO / rGPR39) which introduce | transduced the rat GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates that 100 μM copper chloride is added, □ indicates that 30 μM copper chloride is added, and Δ indicates that 10 μM copper chloride is added. ラットＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｒＧＰＲ３９）に塩化亜鉛を添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は１００μＭの塩化亜鉛を、□は３０μＭの塩化亜鉛を、△は１０μＭの塩化亜鉛を添加した場合を示す。The result of investigating the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when zinc chloride is added to the CHO cell line (CHO / rGPR39) which introduce | transduced the rat GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates that 100 μM zinc chloride is added, □ indicates that 30 μM zinc chloride is added, and Δ indicates that 10 μM zinc chloride is added. ラットＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｒＧＰＲ３９）に塩化カドミウムを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は３０００μＭの塩化カドミウムを、□は１０００μＭの塩化カドミウムを、△は３００μＭの塩化カドミウムを添加した場合を示す。The result of investigating the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when cadmium chloride is added to the CHO cell line (CHO / rGPR39) which introduce | transduced the rat GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates that 3000 μM cadmium chloride is added, □ indicates that 1000 μM cadmium chloride is added, and Δ indicates that 300 μM cadmium chloride is added. マウスＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｍＧＰＲ３９）に塩化ニッケルを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は３００μＭの塩化ニッケルを、□は１００μＭの塩化ニッケルを、△は３０μＭの塩化ニッケルを添加した場合を示す。The result of having investigated the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when nickel chloride was added to the CHO cell line (CHO / mGPR39) which introduce | transduced the mouse | mouth GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates the case where 300 μM nickel chloride is added, □ indicates the case where 100 μM nickel chloride is added, and Δ indicates the case where 30 μM nickel chloride is added. マウスＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｍＧＰＲ３９）に塩化コバルトを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は３０００μＭの塩化コバルトを、□は１０００μＭの塩化コバルトを、△は３００μＭの塩化コバルトを添加した場合を示す。The result of investigating the fluctuation | variation of intracellular calcium concentration when cobalt chloride is added to the CHO cell line (CHO / mGPR39) which introduce | transduced the mouse | mouth GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates the case of adding 3000 μM cobalt chloride, □ indicates the addition of 1000 μM cobalt chloride, and Δ indicates the case of adding 300 μM cobalt chloride. マウスＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｍＧＰＲ３９）に塩化銅を添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は３００μＭの塩化銅を、□は１００μＭの塩化銅を、△は３０μＭの塩化銅を添加した場合を示す。The result of having investigated the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when adding copper chloride to the CHO cell line (CHO / mGPR39) which introduce | transduced the mouse | mouth GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates 300 μM copper chloride, □ indicates 100 μM copper chloride, and Δ indicates 30 μM copper chloride. マウスＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｍＧＰＲ３９）に塩化亜鉛を添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は３００μＭの塩化亜鉛を、□は１００μＭの塩化亜鉛を、△は３０μＭの塩化亜鉛を添加した場合を示す。The result of having investigated the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when zinc chloride was added to the CHO cell line (CHO / mGPR39) which introduce | transduced the mouse | mouth GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates 300 μM zinc chloride, □ indicates 100 μM zinc chloride, and Δ indicates 30 μM zinc chloride. マウスＧＰＲ３９発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ｍＧＰＲ３９）に塩化カドミウムを添加した時の細胞内カルシウム濃度の変動を調べた結果を示す。Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ）は添加後の時間（秒）を示す。Ｃｏｕｎｔｓは細胞内カルシウム濃度の変化を示す。◇は３０００μＭの塩化カドミウムを、□は１０００μＭの塩化カドミウムを、△は３００μＭの塩化カドミウムを添加した場合を示す。The result of having investigated the fluctuation | variation of the intracellular calcium concentration when cadmium chloride was added to the CHO cell strain (CHO / mGPR39) which introduce | transduced the mouse | mouth GPR39 expression vector is shown. Time (sec) indicates the time (seconds) after the addition. Counts indicate changes in intracellular calcium concentration. ◇ indicates that 3000 μM cadmium chloride is added, □ indicates that 1000 μM cadmium chloride is added, and Δ indicates that 300 μM cadmium chloride is added. ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ３９ｍＲＮＡのラットにおける組織分布図を示す。ｃｏｐｉｅｓ／２５ｎｇ ＲＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ２５ｎｇ当たりのコピー数を示す。The tissue distribution map in rat of GPR39mRNA by RT-PCR is shown. copies / 25 ng RNA indicates the copy number per 25 ng of total RNA. ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ３９ｍＲＮＡの細胞株における発現量を示す。横軸のｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓは細胞株を示す。ｈｕｍａｎはヒト、ｍｏｕｓｅはマウス、ｒａｔはラットを示す。ｃｏｐｉｅｓ／２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ２５ｎｇ当たりのコピー数を示す。The expression level in the cell line of GPR39mRNA by RT-PCR is shown. The cell lines on the horizontal axis indicate cell lines. human represents human, mouse represents mouse, and rat represents rat. copies / 25 ng total RNA indicates the copy number per 25 ng of total RNA.

Claims (3)

Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、およびカドミウムからなる群から選択されるイオン化可能な金属元素またはその塩に対する結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング方法であって、
（１）
(i)前記蛋白質もしくはその塩と前記イオン化可能な金属元素もしくはその塩とを試験化合物の存在下および非存在下で接触させる工程、
(ii)前記イオン化可能な金属元素もしくはその塩の前記蛋白質もしくはその塩に対する結合量を測定する工程、および
(iii)前記試験化合物の存在下と非存在下との間で前記結合量を比較する工程、
または、
（２）
(i)前記蛋白質もしくはその塩と前記イオン化可能な金属元素もしくはその塩とを試験化合物の存在下および非存在下で接触させる工程、
(ii)前記蛋白質もしくはその塩の細胞刺激活性を測定する工程であって、前記細胞刺激活性が、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ ^２＋ 遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下を促進する活性もしくは抑制する活性、およびＧＰＲ３９発現細胞ＵＭ−ＵＣ−３からのサイトカイン分泌促進作用からなる群から選択される、工程、および
(iii)前記試験化合物の存在下と非存在下との間で前記細胞刺激活性を比較する工程、
または、
（３）
(i)前記蛋白質を含有する細胞と前記イオン化可能な金属元素もしくはその塩とを試験化合物の存在下および非存在下で接触させる工程、
(ii)前記細胞の細胞内Ｃａ ^２＋ 濃度を測定する工程、および
(iii)前記試験化合物の存在下と非存在下との間で前記細胞内Ｃａ ^２＋ 濃度を比較する工程、
を含み、
前記Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が、以下：
（a）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質；
（b）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含有し、リガンド結合活性またはシグナル情報伝達作用を有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質；または
（c）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、リガンド結合活性またはシグナル情報伝達作用を有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、のいずれかである、スクリーニング方法。 G protein-coupled receptor protein Shitsuma other salts, cobalt, nickel, copper, zinc, and binding to ionizable metal element or a salt thereof is selected from the group consisting of cadmium or a compound alters the signaling or A screening method for an element or a salt thereof ,
(1)
(i) contacting the protein or salt thereof with the ionizable metal element or salt thereof in the presence and absence of a test compound;
(ii) measuring the amount of binding of the ionizable metal element or salt thereof to the protein or salt thereof, and
(iii) comparing the amount of binding between the presence and absence of the test compound;
Or
(2)
(i) contacting the protein or salt thereof with the ionizable metal element or salt thereof in the presence and absence of a test compound;
(ii) said protein or a step of measuring the cell stimulating activity of the salt, the cell stimulating activity, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca ²⁺ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol From phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity promoting or suppressing pH reduction, and promoting action of cytokine secretion from GPR39-expressing cell UM-UC-3 A process selected from the group consisting of
(iii) comparing the cell stimulating activity between in the presence and absence of the test compound,
Or
(3)
(i) contacting the cell containing the protein with the ionizable metal element or salt thereof in the presence and absence of a test compound;
(ii) measuring the intracellular Ca ²⁺ concentration of the cells , and
step (iii) comparing the intracellular Ca ²⁺ concentration between presence and absence of said test compound,
Including
The G protein-coupled receptor protein is the following:
(A) a G protein-coupled receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a G protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, added, inserted or substituted, and having a ligand binding activity or a signal information transmission action A conjugated receptor protein; or
(C) One of G protein-coupled receptor proteins containing an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a ligand binding activity or a signal information transmission action A screening method . 該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が配列番号：１、配列番号：６または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質である請求項１記載のスクリーニング方法。 The G protein-coupled receptor protein is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 screening method of claim 1 Symbol mounting a G protein-coupled receptor protein comprising the amino acid sequence represented by. （１）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩および（２）コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、およびカドミウムからなる群から選択されるイオン化可能な金属元素またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩と該金属元素またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物もしくは元素またはその塩のスクリーニング用キットであって、
前記Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が、以下：
（a）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質；
（b）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含有し、リガンド結合活性またはシグナル情報伝達作用を有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質；または
（c）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、リガンド結合活性またはシグナル情報伝達作用を有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、
のいずれかである、スクリーニング用キット。 (1 ) a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof; and (2) an ionizable metal element selected from the group consisting of cobalt, nickel, copper, zinc, and cadmium or a salt thereof. A screening kit for a compound or element or a salt thereof that changes the binding or signal transduction between a receptor protein or a salt thereof and the metal element or a salt thereof ,
The G protein-coupled receptor protein is the following:
(A) a G protein-coupled receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(B) a G protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, added, inserted or substituted, and having a ligand binding activity or a signal information transmission action A conjugated receptor protein; or
(C) a G protein-coupled receptor protein comprising an amino acid sequence having a homology of 90% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and having a ligand binding activity or a signal information transmission action,
A screening kit .

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