JP4168870B2 - プレニルアルコールの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、クエン酸合成酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養することで、当該菌体又は細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール及びゲラニルリナロール等を意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも1種の生産性を向上することができる。
ゲラニルゲラニオール(geranylgeraniol;GGOH)
ゲラニルゲラニル二リン酸(geranylgeranyl diphosphate;GGPP)
ファルネシル二リン酸(farnesyl diphosphate;FPP)
イソペンテニル二リン酸(isopentenyl diphosphate;IPP)
ジメチルアリル二リン酸(dimethylallyl diphosphate;DMAPP)
ファルネソール(farnesol;FOH)
ネロリドール(nerolidol;NOH)
(1)クエン酸合成酵素欠損株を用いる
(2)クエン酸合成酵素遺伝子の転写を抑制する
(3)クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する
(4)TCAサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生を阻害する
(5)クエン酸合成酵素阻害剤を培地に添加する
方法が挙げられる。
本発明において、クエン酸合成酵素欠損株とは、生物によっては複数のクエン酸合成酵素遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも1のクエン酸合成酵素遺伝子を除く他のクエン酸合成酵素遺伝子を破壊した菌株を意味する。例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、本来的に、CIT1、CIT2及びCIT3と呼ばれる3つのクエン酸合成酵素遺伝子を有している。従って、例えば、クエン酸合成酵素欠損株としては、これらCIT1、CIT2及びCIT3のうち1つのみを破壊したサッカロミセス・セレビシエ、並びにCIT1、CIT2及びCIT3のうち任意の組合せの遺伝子を破壊したサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。なお、CIT1を欠損したサッカロミセス・セレビシエはATCC4005376として、CIT2を欠損したサッカロミセス・セレビシエはATCC4003485として、CIT3を欠損したサッカロミセス・セレビシエはATCC4002828としてAmerican Type Culture Collectionに寄託されている。
クエン酸合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる菌株又は細胞におけるクエン酸合成酵素遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該変異型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、GAL1遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
また、クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスRNAを用いる方法が挙げられる。すなわち、クエン酸合成酵素遺伝子のmRNAに対するアンチセンスRNAを転写する遺伝子を、菌体又は細胞のゲノムに組み込み、当該アンチセンスRNAを過剰発現させることで、クエン酸合成酵素遺伝子のmRNAの翻訳が抑制される。アンチセンスRNAに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳動物(マウス)、昆虫(線虫(Drosophila melanogaster))や被子植物(トマト)を宿主とした場合でも知られている(Mizuno et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1966−1970;Aiba et al.(1987)J.Bacteriol,169,3007−3012;Green et al.(1986)Annu.Rev.Biochem.,55,569−597;Harland et al.(1985)J.Cell.Biol.,101,1094−1099;Coleman et al.(1984)Cell,37,429−36;Han et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,4313−4317;Hackett et al.(2000)Plant Physiol.,124,1079−86)。
また、TCAサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生を阻害する方法としては、TCAサイクルにおける反応に関与する有機酸(以下、「TCAサイクル有機酸」ともいう)を培地中に添加し、菌体又は細胞を培養する方法が挙げられる。TCAサイクル有機酸としては、例えば、クエン酸、2−オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、ピルビン酸などが挙げられ、特にクエン酸が好ましい。
クエン酸合成酵素阻害剤としては、例えば、カルボキシメチル−CoA(Eur.J.Biochem.,120,155−160,1981)、フルオロアセチル−CoA(J.Biol.Chem.,217,213−224,1955)、パルミトイル−CoA(Biochim.Biophys.Acta.106,445−455,1965)、S−ヘプタデシル−CoA(Liebigs Ann.Chem.,828−841,1981)を挙げることができる。
テルペノイド:スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP
油脂:大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤:タージトール、トリトンX−305、スパン85、アデカノールLG−109(旭電化製)、アデカノールLG−294(旭電化製)、アデカノールLG−295S(旭電化製)、アデカノールLG−297(旭電化製)、アデカノールB−3009A(旭電化製)、アデカプロニックL−61(旭電化製)
本実施例においては、クエン酸合成酵素遺伝子欠損株を用いて、それらのプレニルアルコール産生能について試験した。クエン酸合成酵素遺伝子欠損株としては、サッカロミセス・セレビシエにおいてクエン酸合成酵素遺伝子(CIT1、CIT2、CIT3)が破壊されたCIT1欠損株(ATCC4005376)、CIT2欠損株(ATCC4003485)及びCIT3欠損株(ATCC4002828)を使用した。また、対照として、サッカロミセス・セレビシエの野生株ATCC201388を使用した。
インレット温度:250℃
ディテクター温度:260℃
MSゾーン温度
MS Quad:150℃
MS Source:230℃
スキャンパラメーター
Low Mass:35
High Mass:200
Threshold:40
インジェクションパラメーター
モード:自動インジェクション
サンプル量:2μl
洗浄回数:メタノールで3回、ヘキサンで2回
スプリット比:1:20
カラム:ヒューレットパッカード社製HP−5MS(0.25mm×30M、フィルム厚0.25μm)
キャリアーガス:1ヘリウム1.0ml/min
ソルベントディレイ:2min
オ一ブン昇温条件:l15℃、1.5分保持→70/分で250℃まで昇温、2分保持→70/分で300℃まで昇温、7分保持
ポストタイム:0
内部標準:1−ウンデカノール/エタノール溶液(1μl/ml)を各バイアルに10μ1添加
注入口ライナー:スプリット/スプリットレス ライナー
解析:TICを取り込んだ後、69マスをセレクションし1ウンデカノール(RT=3.39min)、ネロリドール(RT=3.86min)、ファルネソール(RT=4.23min)、ゲラニルゲラニオ一ル(RT=5.78min)のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
菌数(109/培地1l)=0.444×(0.06mm四方の菌体数)×希釈倍率
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表1に示す。
本実施例においては、TCAサイクルにおける反応に関与する有機酸(TCAサイクル有機酸)を培養開始時又は培養中に培地に添加してサッカロミセス・セレビシエを培養した場合のプレニルアルコールの生産量について試験した。
(1)培養開始時にTCAサイクル有機酸を添加した場合
最初に、培地を、20mg/Lエルゴステロールを含む2mlのYM培地(Difco社製)に、水酸化ナトリウムでpH6.5に調整した0.01%の有機酸(ピルビン酸、クエン酸、2−オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸又はオキサロ酢酸)を添加して調製した。この培地において、サッカロミセス・セレビシエATCC64031株(スクアレン合成酵素遺伝子erg9が欠失した変異酵母)を28℃にて4日間試験管培養した。培養後、培養液2mlにメタノール1.2ml及びペンタン2mlを添加して十分に撹拌し、ペンタン相を実施例1と同様にGC/MSで分析した。
次に、20mg/Lエルゴステロール、終濃度6%グルコース、終濃度1%大豆油を含むYM培地を用いてサッカロミセス・セレビシエATCC64031株を培養し、その培養2日目に0.01〜3%の各有機酸を添加して4日間培養を行った。上記と同様に、各実験区について培養物の成分分析を行った。その結果を表3に示す。
Claims (8)
- クエン酸合成酵素活性を低下させる条件下で酵母を培養し、
培養物中からプレニルアルコールを回収する
プレニルアルコールの製造方法。 - 上記酵母は、複数のクエン酸合成酵素遺伝子のうち、少なくとも1のクエン酸合成酵素遺伝子を除く他のクエン酸合成酵素遺伝子を破壊した株であることを特徴とする請求項1記載のプレニルアルコールの製造方法。
- クエン酸合成酵素遺伝子の発現を低下させることで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項1記載のプレニルアルコールの製造方法。
- クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳効率を低下させることで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項1記載のプレニルアルコールの製造方法。
- TCAサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生を阻害することで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項1記載のプレニルアルコールの製造方法。
- クエン酸合成酵素による生成物産生の阻害を、クエン酸、2−オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、及びピルビン酸からなる群より選択される少なくとも1のTCAサイクルにおける反応に関与する有機酸を添加した培地において上記酵母を培養することにより行う請求項1記載のプレニルアルコールの製造方法。
- クエン酸合成酵素阻害剤を培地に添加することで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項1記載のプレニルアルコールの製造方法。
- スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項1記載のプレニルアルコールの製造方法。
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