JP4168870B2 - プレニルアルコールの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法に関する。

プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチル−ＣｏＡとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレニルアルコールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な種々のテルペノイドの他、トコフェノール、カロチノイドをはじめとするビタミン類の合成出発物質としてもまた重要な物質である。

従来、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みとしては、上述した代謝経路の酵素を強化したり、変異導入して酵素の特異性を改変するといった手法が取られてきた。例えば、特許文献１及び２には、スクアレン合成酵素活性を低下させ、プレニルアルコールを製造する方法が記載されている。この方法は、生物の細胞膜に多く含まれるステロール類がスクアレンから合成されるため、このスクアレン合成活性を阻害剤、遺伝子破壊等を利用して低下させることによりプレニルアルコールの生産が増加することに基づくものである。しかし、細胞内に蓄積した過剰のプレニル二リン酸類はプレニルアルコール合成以外にプレニルタンパク、ドリコール合成等の原料として使われるため必ずしも効率的にプレニルアルコールを製造できるものではなかった。

また、特許文献３には、カウレン合成酵素阻害剤を含む培地でジベレリン生産菌を培養しプレニルアルコールを製造方法が記載されている。特許文献４には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子、ＦＰＰ合成酵素遺伝子若しくはＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子を酵母に導入し、プレニルアルコールを製造する方法が記載されている。さらに特許文献５には、培養液に油状物質を添加して微生物のプレニルアルコール生産を促進する方法が記載されている。

これらの方法は、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法として大いに期待できるが、工業規模でプレニルアルコールを製造するためにはさらなる改善が望まれる。

すなわち、プレニルアルコールの生産性を向上させるため、より簡易に且つ、十分な生産効率を達成できるプレニルアルコールの製造方法が望まれている。

特表２００２−５１９０４９号公報 特表２００２−５１９３９７号公報 特開２００２−１９９８８４号公報 特開２００２−１９９８８３号公報 特開２００２−２９１４９４号公報

そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、炭素源のプレニルアルコールへの変換効率が上昇しない原因が、プレニルアルコールの原料となるピルビン酸が、アセチル−ＣｏＡに変換されると同時にすみやかにＴＣＡサイクルによりＣＯ₂に分解されるためであると推定した。そこで、このＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養したところ、プレニルアルコールの生産を上昇させることができるという知見を得、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、クエン酸合成酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法である。

上記プレニルアルコールの製造方法では、複数のクエン酸合成酵素遺伝子のうち、少なくとも１のクエン酸合成酵素遺伝子を除く他のクエン酸合成酵素遺伝子を破壊した細胞を用いることができる。

また上記プレニルアルコールの製造方法では、クエン酸合成酵素遺伝子の発現を低下させることで、クエン酸合成酵素活性を低下させることができる。

さらに上記プレニルアルコールの製造方法では、クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳効率を低下させることで、クエン酸合成酵素活性を低下させることができる。

またさらに上記プレニルアルコールの製造方法では、ＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生を阻害することで、クエン酸合成酵素活性を低下させることができる。ここで、クエン酸合成酵素による生成物産生の阻害は、クエン酸、２−オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、及びピルビン酸からなる群より選択される少なくとも１のＴＣＡサイクルにおける反応に関与する有機酸を添加した培地において菌体又は細胞を培養することにより行うことができる。

また上記プレニルアルコールの製造方法では、クエン酸合成酵素阻害剤を培地に添加することで、クエン酸合成酵素活性を低下させることができる。

一方、上記プレニルアルコールの製造方法では、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させてもよい。

本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、菌体又は細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、クエン酸合成酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養することで、当該菌体又は細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール及びゲラニルリナロール等を意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。

プレニルアルコールを合成する代謝経路では、図１の右側の経路に示すように、グルコースやエタノール等の炭素源から合成されたアセチル−ＣｏＡからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が合成される。イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）は、ペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に異性化される。また、図１に示すように、１分子のジメチルアリル二リン酸と２分子のイソペンテニル二リン酸とが縮合反応してゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）が合成され、更に１分子のイソペンテニル二リン酸が反応してファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）が合成され、さらにこれに１分子のイソペンテニル二リン酸が反応してゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が順次合成される。プレニルアルコールであるファルネソール（ＦＯＨ）とネロリドール（ＮＯＨ）はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から合成され、また、ゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）はゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から合成される。一方、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、図１の下側に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンに変換される。スクアレンは、ステロイドの前駆体物質であり、酵母やカビ類においては最終的にエルゴステロールに変換される。

さらに、図１の左側の代謝経路に示すように、培地中の炭素源から合成されたピルビン酸は、ピルビン酸脱水素コンプレックスによりアセチル−ＣｏＡになる。ＴＣＡサイクルでは、クエン酸合成酵素の作用によりアセチル−ＣｏＡとオキサロ酢酸とが縮合されて、クエン酸が合成される。その後、クエン酸は、種々の酵素反応によって、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸に変換され、エネルギー（ＡＴＰ）が生成される。

なお、図１並びに以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；ＧＧＯＨ）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；ＧＧＰＰ）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；ＦＰＰ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；ＩＰＰ）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；ＤＭＡＰＰ）
ファルネソール（farnesol；ＦＯＨ）
ネロリドール（nerolidol；ＮＯＨ）

本方法においては、クエン酸合成酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養する。ここでクエン酸合成酵素活性を低下させる方法としては、
（１）クエン酸合成酵素欠損株を用いる
（２）クエン酸合成酵素遺伝子の転写を抑制する
（３）クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する
（４）ＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生を阻害する
（５）クエン酸合成酵素阻害剤を培地に添加する
方法が挙げられる。

（１）クエン酸合成酵素欠損株を用いる方法
本発明において、クエン酸合成酵素欠損株とは、生物によっては複数のクエン酸合成酵素遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも１のクエン酸合成酵素遺伝子を除く他のクエン酸合成酵素遺伝子を破壊した菌株を意味する。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、本来的に、ＣＩＴ１、ＣＩＴ２及びＣＩＴ３と呼ばれる３つのクエン酸合成酵素遺伝子を有している。従って、例えば、クエン酸合成酵素欠損株としては、これらＣＩＴ１、ＣＩＴ２及びＣＩＴ３のうち１つのみを破壊したサッカロミセス・セレビシエ、並びにＣＩＴ１、ＣＩＴ２及びＣＩＴ３のうち任意の組合せの遺伝子を破壊したサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。なお、ＣＩＴ１を欠損したサッカロミセス・セレビシエはＡＴＣＣ４００５３７６として、ＣＩＴ２を欠損したサッカロミセス・セレビシエはＡＴＣＣ４００３４８５として、ＣＩＴ３を欠損したサッカロミセス・セレビシエはＡＴＣＣ４００２８２８としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。

クエン酸合成酵素欠損株としては、既存の菌株を用いても良いし、野生型の菌株に対して新たに変異（例えば部位特異的変異）を導入して作出したものを用いてもよい。クエン酸合成酵素遺伝子に変異を導入する手法は当技術分野で周知であり、特に限定されるものではない。

クエン酸合成酵素欠損株は、後述するように、通常の培地を用いて培養することができる。

（２）クエン酸合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法
クエン酸合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる菌株又は細胞におけるクエン酸合成酵素遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該変異型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、ＧＡＬ１遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。

また、クエン酸合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、菌体又は細胞におけるクエン酸合成酵素遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該菌体又は細胞を培養しても良い。

さらに、本発明においては、クエン酸合成酵素遺伝子の転写の抑制には、クエン酸合成酵素遺伝子の転写位置又は転写時期を改変することも含む。例えば、遺伝子の転写位置を改変するには、通常２５塩基対離れている転写開始点からＴＡＴＡボックスまでの距離を変更する。この変更は、ＴＡＴＡボックスの配列ＴＡＴＡＡＡＴの塩基の欠失又はＴ若しくはＡの挿入などにより行うことができる。また例えば、遺伝子の転写時期を改変するには、時期特異的に発現するプロモーターを使用することができる。例えば培養後期に転写活性を高めるためには、酢酸の分解に関与しているＡＣＳ１遺伝子のプロモーター、エタノール分解に関与しているＡＬＤ２及びＡＬＤ４遺伝子のプロモーターに置換することが考えられる。一方、培養初期に強く発現するプロモーターとしては、ＴＨ１２遺伝子のプロモーター、ＡＤＥ１遺伝子のプロモーターを挙げることができる。これにより、菌体若しくは細胞におけるプレニルアルコール産生部位のみにおいて、及び／又は、菌体若しくは細胞をある程度増殖させた培養中後期において、クエン酸合成酵素遺伝子の転写を抑制することが可能となる。このようにクエン酸合成酵素の発現位置又は時期を改変することは、ＴＣＡサイクルの反応が特に重要な菌体又は細胞において有用である。

（３）クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法
また、クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスＲＮＡを用いる方法が挙げられる。すなわち、クエン酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを転写する遺伝子を、菌体又は細胞のゲノムに組み込み、当該アンチセンスＲＮＡを過剰発現させることで、クエン酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。アンチセンスＲＮＡに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳動物（マウス）、昆虫（線虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１９６６−１９７０；Ａｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６９，３００７−３０１２；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，５６９−５９７；Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１，１０９４−１０９９；Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ，３７，４２９−３６；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４３１３−４３１７；Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２４，１０７９−８６）。

また、クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳を抑制するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を利用することも可能である。具体的には、標的とするクエン酸合成酵素遺伝子の塩基配列に相同的な二本鎖ＲＮＡを菌体又は細胞内に導入すると、内在性のクエン酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその菌体又は細胞でのクエン酸合成酵素遺伝子発現が特異的に抑制されることとなる。この手法は、最初に線虫で報告され、その後ショウジョウバエ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、植物、哺乳動物細胞などにおいても確認されている（Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１８，２４４−２５１（ｒｅｖｉｅｗ）；特表２００２−５１６０６２号公報；特表平８−５０６７３４号公報）。

（４）ＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生の阻害方法
また、ＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生を阻害する方法としては、ＴＣＡサイクルにおける反応に関与する有機酸（以下、「ＴＣＡサイクル有機酸」ともいう）を培地中に添加し、菌体又は細胞を培養する方法が挙げられる。ＴＣＡサイクル有機酸としては、例えば、クエン酸、２−オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、ピルビン酸などが挙げられ、特にクエン酸が好ましい。

本発明においては、これらのＴＣＡサイクル有機酸のうち少なくとも１種を培地中に添加する。添加濃度は、例えばクエン酸、２−オキソグルタル酸、又はコハク酸の場合には、１ｍＭ以上であれば特に限定されないが、好ましくは２０ｍＭ〜６０ｍＭ程度である。また、例えばフマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、又はピルビン酸の場合には、１ｍＭ以上であれば特に限定されないが、好ましくは５０〜１００ｍＭ程度である。

上記ＴＣＡサイクル有機酸は、菌体又は細胞の培養開始時に添加してもよいし、培養経過を観察しながら培養中に添加してもよい。培養開始時に添加した場合には、有機酸により酵母の生育が阻害されるため、添加濃度を１０ｍＭ以下にすることが望ましい。

菌体又は細胞の培地中にＴＣＡサイクル有機酸が添加された結果、ＴＣＡサイクルにおける反応に該有機酸が利用されることとなり、クエン酸合成酵素による生成物産生が阻害され、クエン酸合成酵素活性が低下する。

（５）クエン酸合成酵素阻害剤を培地に添加する方法
クエン酸合成酵素阻害剤としては、例えば、カルボキシメチル−ＣｏＡ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１５５−１６０，１９８１）、フルオロアセチル−ＣｏＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１７，２１３−２２４，１９５５）、パルミトイル−ＣｏＡ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０６，４４５−４５５，１９６５）、Ｓ−ヘプタデシル−ＣｏＡ（Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，８２８−８４１，１９８１）を挙げることができる。

これらクエン酸合成酵素阻害剤は、菌体又は細胞を培養する培地に単独で添加しても良いし、複数を組み合わせて添加しても良い。クエン酸合成酵素阻害剤の添加量は、特に限定されないが、１ｍＭ程度で十分であると考えられる。

また、本方法では、クエン酸合成酵素阻害剤を、菌体又は細胞を培養する培地に予め添加していても良いし、菌体又は細胞の培養途中に培地に添加してもよい。特に細胞の種類によっては、クエン酸合成酵素阻害剤によって生育阻害が生ずる場合もあり、この場合には、細胞が十分に生育（増殖）した後、クエン酸合成酵素阻害剤を培地に添加することが好ましい。

上記（１）〜（５）の方法において、使用可能な菌体又は細胞は、プレニルアルコールを生合成する代謝経路と、ＴＣＡサイクル代謝系とを併せ持つ菌体又は細胞であれば特に限定されない。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、デドリオマイセス・バンリイアエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、ウィリオプシス・サツルナス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ）、キャンディダ・ガラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）などが挙げられる。

上記菌体又は細胞を培養するための培地は、特に限定されるものではなく、上述した菌体又は細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば細胞としてサッカロミセス・セレビシエを使用する場合には、グルコース及び大豆油を添加したＹＭ培地を使用することができる。

また、培地中には、エタノールを添加することが好ましい。エタノールを添加した培地によれば、プレニルアルコールの生産効率が向上することとなる。

さらに、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、プレニルアルコールの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンＸ−３０５、スパン８５、アデカノールＬＧ−１０９（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９４（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９７（旭電化製）、アデカノールＢ−３００９Ａ（旭電化製）、アデカプロニックＬ−６１（旭電化製）

テルペノイド濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、油脂濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、界面活性剤濃度は０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。

また、培地は、エタノール及び／又は脂質を含有するものであってもよい。エタノールは、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは０．５〜５％、最も好ましくは１〜３％の濃度で含有する。脂質としては、例えばパルミチン酸を挙げることができ、培地中に、例えば０．１〜５％の濃度で含有する。

またさらに本方法においては、菌体又は細胞を、スクアレン合成酵素活性を低下させた条件下で培養してもよい。スクアレン合成酵素活性を低下させると、ファルネシル二リン酸を基質としたスクアレンの合成が阻害され、結果としてプレニルアルコールの生産が促進される。スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、上述したクエン酸合成酵素活性を低下させる場合と同様な方法を使用することができる。すなわち、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下としては、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法、スクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法、またさらにはスクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法が挙げられる。

また、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、ＷＯ０２／０５３７４７号パンフレットに開示されている方法を、菌体又は細胞に適用することができる。

スクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、ＳＱＡＤ（特表平８−５０８２４５号公報）、ＢＳＭ−１８７７４５（Ｔｏｘｉ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍ．１４５，９１−９８（１９８７））、ＥＲ−２７８５６（Ｊ．ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４４，１２８−１３５（２００２））等の合成品の他、カビ類が生産するｚａｒａｇｏｚｉｃ ａｃｉｄ（Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１１，２７９−３０２（１９９４））を挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを使用した場合、ＳＱＡＤの添加量は、菌体又は細胞を培養する培地中に５〜２００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。

一方、スクアレン合成酵素活性を低下させることによって、ファルネシル二リン酸を基質としたスクアレンの合成が阻害されることとになる。スクアレン合成酵素活性を低下させた場合、細胞においてエルゴステロール生合成が抑制されるため、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。エルゴステロールを含む培地を用いるか、エルゴステロールを培地に追添加することによって、エルゴステロール生合成阻害による細胞の生育阻害等を防止することができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを用いた場合、エルゴステロールの添加量は、１〜１００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。

菌体又は細胞を培養する条件は、特に限定されるものではなく、使用する菌体又は細胞の種類、及び使用する培地などに応じて適宜設定することができる。例えば、細胞としてサッカロミセス・セレビシエを使用し、培地としてグルコース及び大豆油を添加したＹＭ培地を使用する場合には、約２０〜４０℃、好ましくは３０℃にて、約１２時間〜１４日、好ましくは４日間培養する。

以上のように、クエン酸合成酵素活性を低下させた条件下で菌体又は細胞を培養することによって、得られる培養物からプレニルアルコールを優れた生産性で採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。

本方法においては、プレニルアルコールを高収率で生産することができる。なお、プレニルアルコールを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、プレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。

図１に示した代謝経路から判るように、プレニルアルコールは、アセチル−ＣｏＡを原料として合成される（図１右側）。また、ＴＣＡサイクルにおいてもアセチル−ＣｏＡが利用され、クエン酸合成酵素（ＣＩＴ１、ＣＩＴ２、ＣＩＴ３）は、培地中の炭素源から合成されたアセチル−ＣｏＡを基質として作用してクエン酸を合成する（図１左側）。したがって、上述したようにクエン酸合成酵素活性を低下させた場合、ＴＣＡサイクルにおけるアセチル−ＣｏＡの消費が抑えられ、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの作用によりアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡとなる反応がより強く進行することとなる。また、例えば、サッカロミセス・セレビシエのようにアルコール発酵を行う酵母では、ピルビン酸デカルボキシラーゼによりピルビン酸がエタノールになり、更に酢酸を経てアセチル−ＣｏＡになる反応も強く進行することとなる。その結果、アセチル−ＣｏＡからのプレニルアルコールの生合成が強く進行し、プレニルアルコールの生産効率が向上することとなる。

一般に、アミノ酸を始めとする生育上極めて重要な一次代謝産物では、当該産物の合成反応に直接関与する遺伝子を強化又は抑制することによって、当該産物の生産性を向上させる試みが行われ成果を出している。しかしながら、プレニルアルコール等の二次代謝産物においては、その合成経路の強化又は抑制を行っても、原料物質が一次代謝産物等の合成に消費されることが多く、生産性を向上させることが困難である。すなわち、単にアセチル−ＣｏＡの生産を亢進しても、プレニルアルコールの生合成が強化される蓋然性は低いといえる。

さらに、アセチル−ＣｏＡは、脂肪酸合成代謝経路を始めとして様々な物質代謝経路に関与している。したがって、アセチル−ＣｏＡが関与する物質代謝経路のうち、如何なる経路を強化又は抑制すれば、プレニルアルコールの生産性を向上できるのかは全く予測ができない。

本発明においては、アセチル−ＣｏＡが関与する様々な代謝経路の中で、特にＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素活性を低下させ、アセチル−ＣｏＡの生産を亢進することで、プレニルアルコールの生産性を向上させることができる。

以下、実施例を用いて本発明に係るプレニルアルコールの製造方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕クエン酸合成酵素遺伝子欠損株のプレニルアルコール産生
本実施例においては、クエン酸合成酵素遺伝子欠損株を用いて、それらのプレニルアルコール産生能について試験した。クエン酸合成酵素遺伝子欠損株としては、サッカロミセス・セレビシエにおいてクエン酸合成酵素遺伝子（ＣＩＴ１、ＣＩＴ２、ＣＩＴ３）が破壊されたＣＩＴ１欠損株（ＡＴＣＣ４００５３７６）、ＣＩＴ２欠損株（ＡＴＣＣ４００３４８５）及びＣＩＴ３欠損株（ＡＴＣＣ４００２８２８）を使用した。また、対照として、サッカロミセス・セレビシエの野生株ＡＴＣＣ２０１３８８を使用した。

上記ＣＩＴ１欠損株、ＣＩＴ２欠損株及びＣＩＴ３欠損株、並びに野生株を、４ｍｇ／Ｌエルゴステロール、６％グルコース、１％大豆油、０．１％アデカノールＬＧ１０９（旭電化社製）、２０ｍｇ／Ｌスクアレン合成阻害剤ＳＱＡＤ（特表平８−５０８２４５号公報参照）を含む２ｍｌのＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）において３０℃にて４日間培養した。また、クエン酸合成酵素欠損の効果を調べるために、１０〜６０ｍＭのクエン酸ナトリウムを添加した。培養終了後、培養液２ｍｌを採取し、これにメタノール１．２ｍｌ及びペンタン２ｍｌを添加した。その後、培養液を十分に攪拌し、ペンタン相を成分分析に供した。成分分析は、以下の条件で行った。分析装置は、ヒューレットパッカード社製ＨＰ６８９０／５９７３ ＧＣ／ＭＳシステムを用いた。
インレット温度：２５０℃
ディテクター温度：２６０℃
ＭＳゾーン温度
ＭＳ Ｑｕａｄ：１５０℃
ＭＳ Ｓｏｕｒｃｅ：２３０℃
スキャンパラメーター
Ｌｏｗ Ｍａｓｓ：３５
Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓ：２００
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：４０
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：２μｌ
洗浄回数：メタノールで３回、ヘキサンで２回
スプリット比：１：２０
カラム：ヒューレットパッカード社製ＨＰ−５ＭＳ（０．２５ｍｍ×３０Ｍ、フィルム厚０．２５μｍ）
キャリアーガス：１ヘリウム１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ソルベントディレイ：２ｍｉｎ
オ一ブン昇温条件：ｌ１５℃、１．５分保持→７０／分で２５０℃まで昇温、２分保持→７０／分で３００℃まで昇温、７分保持
ポストタイム：０
内部標準：１−ウンデカノール／エタノール溶液（１μｌ／ｍｌ）を各バイアルに１０μ１添加
注入口ライナー：スプリット／スプリットレス ライナー
解析：ＴＩＣを取り込んだ後、６９マスをセレクションし１ウンデカノール（ＲＴ＝３．３９ｍｉｎ）、ネロリドール（ＲＴ＝３．８６ｍｉｎ）、ファルネソール（ＲＴ＝４．２３ｍｉｎ）、ゲラニルゲラニオ一ル（ＲＴ＝５．７８ｍｉｎ）のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。

また、培養終了後、菌数を測定した。培養液１００μｌを生理食塩水で１〜２０倍に希釈し、血球計（林理化学）で細胞数を計測した。０．０６ｍｍ四方（最少グリット９つ分）の菌数を４平均し、以下の式から培養液１Ｌ当りの菌数を算出した。
菌数（１０⁹／培地１ｌ）＝０．４４４×（０．０６ｍｍ四方の菌体数）×希釈倍率
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。

表１から判るように、サッカロミセス・セレビシエにおいて、ＣＩＴ１、ＣＩＴ２又はＣＩＴ３のいずれかを欠損させることにより、ファルネソール（ＦＯＨ）、ゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）の各プレニルアルコール、及びスクアレン（ＳＱ）の生産が上昇していた。

一方、２０ｍＭ以上のクエン酸を添加した場合には、野生株とクエン酸合成酵素欠損株とのプレニルアルコール生産量の差は小さくなった。このことは、クエン酸を添加することにより、クエン酸合成酵素の生成物阻害が生じ、クエン酸合成酵素を欠損させた場合と同様の効果が得られたものと考えられる。

以上のように、クエン酸合成酵素の欠損株を培養するか、又は生成物のクエン酸を添加した培地で野生株を培養することによりプレニルアルコールの生産効率を向上させることができる。

〔実施例２〕ＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素の生成物産生の阻害
本実施例においては、ＴＣＡサイクルにおける反応に関与する有機酸（ＴＣＡサイクル有機酸）を培養開始時又は培養中に培地に添加してサッカロミセス・セレビシエを培養した場合のプレニルアルコールの生産量について試験した。
（１）培養開始時にＴＣＡサイクル有機酸を添加した場合
最初に、培地を、２０ｍｇ／Ｌエルゴステロールを含む２ｍｌのＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に、水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整した０．０１％の有機酸（ピルビン酸、クエン酸、２−オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸又はオキサロ酢酸）を添加して調製した。この培地において、サッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ６４０３１株（スクアレン合成酵素遺伝子ｅｒｇ９が欠失した変異酵母）を２８℃にて４日間試験管培養した。培養後、培養液２ｍｌにメタノール１．２ｍｌ及びペンタン２ｍｌを添加して十分に撹拌し、ペンタン相を実施例１と同様にＧＣ／ＭＳで分析した。

各実験区について、培養物の成分分析の結果を表２に示す。表２中、「ＳＵＰ」とは培地上清を表し、「ＰＰＴ」とは菌体破砕物を表し、また「ＮＯＨ」「ＦＯＨ」及び「ＧＧＯＨ」はそれぞれ「ネロリドール」「ファルネソール」及び「ゲラニルゲラニオール」であり、プレニルアルコールである。「ＳＱ」は「スクアレン」である。さらにＯＤ６００ｎｍは、細胞濃度（濁度）を調べるために測定した。

表２に示されるように、０．０１％の有機酸の添加によって、ファルネソール（ＦＯＨ）生産が、上清（ＳＵＰ）については１．３〜２．１倍、また菌体破砕物（ＰＰＴ）については１．６〜２．３倍増加することがわかった。

（２）培養中にＴＣＡサイクル有機酸を添加した場合
次に、２０ｍｇ／Ｌエルゴステロール、終濃度６％グルコース、終濃度１％大豆油を含むＹＭ培地を用いてサッカロミセス・セレビシエＡＴＣＣ６４０３１株を培養し、その培養２日目に０．０１〜３％の各有機酸を添加して４日間培養を行った。上記と同様に、各実験区について培養物の成分分析を行った。その結果を表３に示す。

表３から、培養途中にＴＣＡサイクル有機酸を添加した場合であってもファルネソール（ＦＯＨ）の生産効率が向上したことがわかる。０．０１％リンゴ酸添加が最大のＦＯＨ生産促進効果を示し、ＦＯＨ生産が２．５倍上昇した。またこの際、微量ではあるが生成されるネロリドール（ＮＯＨ）、ゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）及びスクアレン（ＳＱ）も同様に増加していた（約１．７〜２．５倍）。

本実施例から、ＴＣＡサイクルにおける反応に関与する有機酸を添加することによって、プレニルアルコールの生産効率が向上するものと考えられる。これは、ＴＣＡサイクルが、クエン酸合成酵素による生成物産生によらなくても反応を促進することが可能となり、その結果としてクエン酸合成酵素による生成物産生が阻害されたことに起因する。

以上、詳細に説明したように、本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。

細胞におけるプレニルアルコール生合成経路を模式的に示す図である。

Claims (8)

1. クエン酸合成酵素活性を低下させる条件下で酵母を培養し、
   培養物中からプレニルアルコールを回収する
   プレニルアルコールの製造方法。
2. 上記酵母は、複数のクエン酸合成酵素遺伝子のうち、少なくとも１のクエン酸合成酵素遺伝子を除く他のクエン酸合成酵素遺伝子を破壊した株であることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
3. クエン酸合成酵素遺伝子の発現を低下させることで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
4. クエン酸合成酵素遺伝子の翻訳効率を低下させることで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
5. ＴＣＡサイクルにおけるクエン酸合成酵素による生成物産生を阻害することで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
6. クエン酸合成酵素による生成物産生の阻害を、クエン酸、２−オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、及びピルビン酸からなる群より選択される少なくとも１のＴＣＡサイクルにおける反応に関与する有機酸を添加した培地において上記酵母を培養することにより行う請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
7. クエン酸合成酵素阻害剤を培地に添加することで、クエン酸合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
8. スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。

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