JP2005073550A - プレニルアルコールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法の提供。
【解決手段】 プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法。
【選択図】 なし
【解決手段】 プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法に関する。また本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からスクアレンを回収するスクアレンの製造方法に関する。
プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチル−ＣｏＡとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレニルアルコールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な種々のテルペノイドの他、トコフェノール、カロチノイドをはじめとするビタミン類の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
従来、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みとしては、上述した代謝経路の酵素を強化したり、変異導入して酵素の特異性を改変するといった手法が取られてきた。例えば、特許文献１及び２には、スクアレン合成酵素活性を低下させ、プレニルアルコールを製造する方法が記載されている。この方法は、生物の細胞膜に多く含まれるステロール類がスクアレンから合成されるため、このスクアレン合成活性を阻害剤、遺伝子破壊等を利用して低下させることによりプレニルアルコールの生産が増加することに基づくものである。しかし、細胞内に蓄積した過剰のプレニル二リン酸類はプレニルアルコール合成以外にプレニル化タンパク、ドリコール合成等の原料として使われるため必ずしも効率的にプレニルアルコールを製造できるものではなかった。
また、特許文献３には、カウレン合成酵素阻害剤を含む培地でジベレリン生産菌を培養しプレニルアルコールを製造方法が記載されている。特許文献４には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子、ＦＰＰ合成酵素遺伝子若しくはＩＰＰΔ−イソメラーゼ遺伝子を酵母に導入し、プレニルアルコールを製造する方法が記載されている。さらに特許文献５には、培養液に油状物質を添加して微生物のプレニルアルコール生産を促進する方法が記載されている。
これらの方法は、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法として大いに期待できるが、工業規模でプレニルアルコールを製造するためにはさらなる改善が望まれる。
また、スクアレンは、ステロール類の前駆物質であり、動植物・微生物の脂質成分として存在することが知られている。スクアレンは水素添加されてスクアランとなる。スクアランは流動パラフィンと比較して軽い油性感があり皮膚に対する触感が良く、低温での流動性も良いので化粧品の油性原料として広く使用されている。さらにステロール類は、製剤原料や乳化剤（コレステロール）、化粧品添加物（エルゴステロール）、ファンデーション、シャンプー、リンス及び化粧石鹸（シトステロール）等に使用される。
スクアレン類は主として深海鮫の肝油又はオリーブ油等から採取精製したものが用いられている。しかしながらこれら天然物を原料とした場合、漁獲量の変動や天候・気候等の条件により供給量が安定しないこともあるため、安定かつ効率的なスクアレン類の製造方法が望まれている。例えば、シュードモナス属、プロタミノバクター属等のスクアレン生産菌を栄養培地に好気条件下で培養し、菌体内にスクアレンを蓄積させ、このスクアレンを取り出す方法が提案されている（特許文献６）。しかしながら、この方法では、培地１リットル当り換算でのスクアレン生成量は０.０５〜２.１２ｍｇと少なく、生産効率の点で問題がある。
一方、特許文献７〜９には、プレニル化酵素の阻害剤が開示されている。しかし、これらの文献は、プレニル化酵素阻害剤の医療用途、すなわち疾患の治療用途等を開示するのみである。従って、プレニル化酵素の阻害剤をプレニルアルコール又はスクアレンの製造に使用することについては従来報告されていない。
以上のように、プレニルアルコール又はスクアレンの生産性を向上させるため、より簡易に且つ、十分な生産効率を達成できるプレニルアルコール又はスクアレンの製造方法が望まれている。
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、生産効率に優れたプレニルアルコール又はスクアレンの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、炭素源のプレニルアルコールへの変換効率が上昇しない原因の１つとして、プレニルアルコール及びスクアレンの原料となるプレニル二リン酸が、プレニルアルコール及びスクアレンに変換されると同時にプレニル化酵素によりプレニル化タンパク質に変換されるため、プレニルアルコール及びスクアレンの生成率が低くなるのではないかと考えた。そこで、このプレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養したところ、プレニルアルコール及びスクアレンの生産を上昇させることができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法である。
また上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素阻害剤を培地に添加することで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
また上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素阻害剤を培地に添加することで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
上記プレニルアルコールの製造方法では、複数のプレニル化酵素遺伝子のうち、少なくとも１のプレニル化酵素遺伝子を破壊した細胞を用いることができる。
また上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素遺伝子の発現を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
さらに上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素遺伝子の翻訳効率を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
また上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素遺伝子の発現を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
さらに上記プレニルアルコールの製造方法では、プレニル化酵素遺伝子の翻訳効率を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることができる。
上記プレニルアルコールの製造方法において、プレニル化酵素としては、例えばファルネシル化酵素及びゲラニルゲラニル化酵素が挙げられる。
一方、上記プレニルアルコールの製造方法では、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させてもよい。
さらに本発明は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からスクアレンを回収するスクアレンの製造方法である。
さらに本発明は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からスクアレンを回収するスクアレンの製造方法である。
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、菌体又は細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。また、本発明に係る方法では、スクアレンの生産性を向上させることができ、スクアレンを優れた生産性で製造できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養することで、当該菌体又は細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール及びゲラニルリナロール等を意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。
また本発明に係るスクアレンの製造方法は、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養することで、当該菌体又は細胞のスクアレン生産能を亢進させ、スクアレンを回収するものである。本発明において、スクアレンとは、スクアレン、並びにスクアレンから生成されるステロール類、エルゴステロール類等を意味する。本発明によれば、これらスクアレンのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。
プレニルアルコール及びスクアレンを合成する代謝経路では、図１の経路に示すように、グルコースやエタノール等の炭素源から合成されたアセチル−ＣｏＡからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が合成される。イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）は、ペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に異性化される。また、図１に示すように、１分子のジメチルアリル二リン酸と２分子のイソペンテニル二リン酸とが、ゲラニル二リン酸合成酵素の作用により縮合反応してゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）が合成され、更に１分子のイソペンテニル二リン酸がファルネシル二リン酸合成酵素の作用により反応してファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）が合成され、さらにこれに１分子のイソペンテニル二リン酸がゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の作用により反応してゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）が順次合成される。プレニルアルコールであるファルネソール（ＦＯＨ）とネロリドール（ＮＯＨ）はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）から合成され、また、ゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）はゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から合成される。一方、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、図１に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンに変換される。スクアレンは、ステロイドの前駆体物質であり、酵母やカビ類においては最終的にエルゴステロールに変換される。
さらに、図１に示すように、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）は、ファルネシル化酵素の作用によりそのファルネシル基がタンパク質に転移され、ファルネシル化タンパク質が生成される。また同様にゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）からはゲラニルゲラニル化酵素の作用によりゲラニルゲラニル化タンパク質が生成される。ｒａｓタンパク質を含む多くのタンパク質がプレニル化され、膜にアンカーされていることが知られている。
なお、図１並びに以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；ＧＧＯＨ）
ファルネソール（farnesol；ＦＯＨ）
ネロリドール（nerolidol；ＮＯＨ）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；ＧＧＰＰ）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；ＦＰＰ）
ゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate；ＧＰＰ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；ＩＰＰ）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；ＤＭＡＰＰ）
スクアレン（squalene；ＳＱ）
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；ＧＧＯＨ）
ファルネソール（farnesol；ＦＯＨ）
ネロリドール（nerolidol；ＮＯＨ）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；ＧＧＰＰ）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；ＦＰＰ）
ゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate；ＧＰＰ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；ＩＰＰ）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；ＤＭＡＰＰ）
スクアレン（squalene；ＳＱ）
本方法においては、プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養する。本発明において「プレニル化酵素」とは、プレニル二リン酸からプレニル基をタンパク質に転移させてプレニル化タンパク質を生成する酵素を指し、限定するものではないが、ファルネシル化酵素及びゲラニルゲラニル化酵素が含まれる。
ここでプレニル化酵素活性を低下させる方法としては、
（１）プレニル化酵素阻害剤を培地に添加する
（２）プレニル化酵素欠損株を用いる
（３）プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する
（４）プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する
方法が挙げられる。
（１）プレニル化酵素阻害剤を培地に添加する
（２）プレニル化酵素欠損株を用いる
（３）プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する
（４）プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する
方法が挙げられる。
（１）プレニル化酵素阻害剤を培地に添加する方法
プレニル化酵素阻害剤は、プレニル化酵素のプレニル基転移作用を阻害することができるものであれば限定されるものではないが、具体的には、ファルネシル化酵素阻害剤、及びゲラニルゲラニル化酵素阻害剤が挙げられる。ファルネシル化酵素阻害剤としては、例えばα−ヒドロキシファルネシルフォスフォン酸（ＨＦＰ）；マヌマイシンＡ（Manumycin A）；ザーネストラＲ１１５７７７（（Ｒ）−６−アミノ［（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン）；４−（ナフタレン−１−イル）ピリジン（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，１３（９）１５２３−１５２６）；２−アミノエタンチオール；３−アリルファルネソール（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００２，３０３（１）７４−８１）；（＋）−４−［２−［４−（８−クロロ−３，１０−ジブロモ−６，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２ｂ］ピリジン−１１（Ｒ）−イル)−１−ピペリジニル］−２−オキソエチル］−１−ピペリジンカルボキサミド（Ｓｃｈ−６６３３６）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５（１８）３８５４−６４）；Ｌ−７７８１２３（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７（１２）３８９４−３９０３）；ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６，６１（１８）６２９６−６３０１）；ＴＡＮ−１８１３（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ ２０００，５３（８）７６５−７７８）；ＦＬ−４１５１０；３，１０−ジブロモ−８−クロロベンゾシクロヘプタピリジン（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２（１４）２６５１−２６６１）；ｃｌａｖａｒｉｃ ａｃｉｄ（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９８，６１（１２）１５６８−１５７０）；ペンタペプチド誘導体Ｃｂｚ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）−Ｔｒｐ−ＤＡｌａ−ＮＨ2（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４０（２）１９２−２００）；バリノクチンＡ（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９６，４９（１０）１０３１−１０３５）；ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，４（６）８８１−８８３）；ペプチシンナミンＥ（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９３，４６（２）２２９−２３４）を挙げることができる。
ゲラニルゲラニル化酵素阻害剤としては、Ｎ−アセチル−Ｓ−ゲラニル−Ｌ−システイン（ＧＣ）、Ａｊｏｅｎｅ（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３，１３８（５）８１１−８１８）、ＧＧＴＩ−２１４７、ＧＧＴＩ−２８６（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００，２８１（４）８２４−８３１）を挙げることができる。
プレニル化酵素阻害剤は、プレニル化酵素のプレニル基転移作用を阻害することができるものであれば限定されるものではないが、具体的には、ファルネシル化酵素阻害剤、及びゲラニルゲラニル化酵素阻害剤が挙げられる。ファルネシル化酵素阻害剤としては、例えばα−ヒドロキシファルネシルフォスフォン酸（ＨＦＰ）；マヌマイシンＡ（Manumycin A）；ザーネストラＲ１１５７７７（（Ｒ）−６−アミノ［（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン）；４−（ナフタレン−１−イル）ピリジン（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，１３（９）１５２３−１５２６）；２−アミノエタンチオール；３−アリルファルネソール（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００２，３０３（１）７４−８１）；（＋）−４−［２−［４−（８−クロロ−３，１０−ジブロモ−６，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２ｂ］ピリジン−１１（Ｒ）−イル)−１−ピペリジニル］−２−オキソエチル］−１−ピペリジンカルボキサミド（Ｓｃｈ−６６３３６）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５（１８）３８５４−６４）；Ｌ−７７８１２３（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７（１２）３８９４−３９０３）；ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６，６１（１８）６２９６−６３０１）；ＴＡＮ−１８１３（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ ２０００，５３（８）７６５−７７８）；ＦＬ−４１５１０；３，１０−ジブロモ−８−クロロベンゾシクロヘプタピリジン（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２（１４）２６５１−２６６１）；ｃｌａｖａｒｉｃ ａｃｉｄ（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９８，６１（１２）１５６８−１５７０）；ペンタペプチド誘導体Ｃｂｚ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（ＯＢｎ）−Ｔｒｐ−ＤＡｌａ−ＮＨ2（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４０（２）１９２−２００）；バリノクチンＡ（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９６，４９（１０）１０３１−１０３５）；ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ Ａ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６，４（６）８８１−８８３）；ペプチシンナミンＥ（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９３，４６（２）２２９−２３４）を挙げることができる。
ゲラニルゲラニル化酵素阻害剤としては、Ｎ−アセチル−Ｓ−ゲラニル−Ｌ−システイン（ＧＣ）、Ａｊｏｅｎｅ（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００３，１３８（５）８１１−８１８）、ＧＧＴＩ−２１４７、ＧＧＴＩ−２８６（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００，２８１（４）８２４−８３１）を挙げることができる。
これらプレニル化酵素阻害剤は、菌体又は細胞を培養する培地に単独で添加しても良いし、複数を組み合わせて添加しても良い。プレニル化酵素阻害剤としてＨＦＰを使用する場合、添加量は、特に限定されないが、約０．０００１〜０．１％、例えば０．００１〜０．０５％が好ましい。またＧＣを使用する場合、添加量は、特に限定されないが、約０．０００１〜０．１％、例えば０．００１〜０．０５％が好ましい。
また、本方法では、プレニル化酵素阻害剤を、菌体又は細胞を培養する培地に予め添加しても良いし、菌体又は細胞の培養途中に培地に添加してもよい。特に細胞の種類によっては、プレニル化酵素阻害剤によって生育阻害が生ずる場合もあり、この場合には、細胞が十分に生育（増殖）した後、プレニル化酵素阻害剤を培地に添加することが好ましい。
（２）プレニル化酵素欠損株を用いる方法
本発明において、プレニル化酵素欠損株とは、生物によっては複数のプレニル化酵素遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも１のプレニル化酵素遺伝子を破壊した菌株を意味する。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、本来的に、ファルネシル化酵素ＲＡＭ１及び２をコードする遺伝子、またゲラニルゲラニル化酵素ＢＥＴ２、４、及びＣＤＣ４３をコードする遺伝子、といったプレニル化酵素遺伝子を有している。従って、例えば、プレニル化酵素欠損株としては、これら遺伝子のうち１つのみを破壊したサッカロミセス・セレビシエ、及び上記遺伝子のうち任意の組合せの遺伝子を破壊したサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。なお、上記遺伝子のうち、ＲＡＭ１をコードする遺伝子以外の遺伝子の破壊は細胞致死となる可能性が高いため、ＲＡＭ１をコードする遺伝子以外の遺伝子を破壊する場合には、ゲノム上の対立遺伝子のうち一方が破壊されているヘテロ二倍体を作製することが好ましい。
本発明において、プレニル化酵素欠損株とは、生物によっては複数のプレニル化酵素遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも１のプレニル化酵素遺伝子を破壊した菌株を意味する。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、本来的に、ファルネシル化酵素ＲＡＭ１及び２をコードする遺伝子、またゲラニルゲラニル化酵素ＢＥＴ２、４、及びＣＤＣ４３をコードする遺伝子、といったプレニル化酵素遺伝子を有している。従って、例えば、プレニル化酵素欠損株としては、これら遺伝子のうち１つのみを破壊したサッカロミセス・セレビシエ、及び上記遺伝子のうち任意の組合せの遺伝子を破壊したサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。なお、上記遺伝子のうち、ＲＡＭ１をコードする遺伝子以外の遺伝子の破壊は細胞致死となる可能性が高いため、ＲＡＭ１をコードする遺伝子以外の遺伝子を破壊する場合には、ゲノム上の対立遺伝子のうち一方が破壊されているヘテロ二倍体を作製することが好ましい。
プレニル化酵素欠損株としては、既存の菌株を用いても良いし、野生型の菌株に対して新たに変異（例えば部位特異的変異）を導入して作出したものを用いてもよい。プレニル化酵素遺伝子に変異を導入する手法は当技術分野で周知であり、特に限定されるものではない。
プレニル化酵素欠損株は、後述するように、プレニル化酵素阻害剤を添加しない又は添加した通常の培地を用いて培養することができる。
（３）プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する方法
プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる菌株又は細胞におけるプレニル化酵素遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該変異型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、ＧＡＬ１遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる菌株又は細胞におけるプレニル化酵素遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該変異型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、ＧＡＬ１遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
また、プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制する方法としては、菌体又は細胞におけるプレニル化酵素遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入してなる変異型菌株又は細胞を調製し、当該菌体又は細胞を培養しても良い。
さらに、本発明においては、プレニル化酵素遺伝子の転写の抑制には、プレニル化酵素遺伝子の転写時期を改変することも含む。例えば、遺伝子の転写時期を改変するには、時期特異的に発現するプロモーターを使用することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエの場合には、培養後期に転写活性を高めるためにＡＣＳ１、ＡＬＤ２などのプロモーターに置換することができる。一方、培養初期の転写活性を高めるためには、ＴＨ１２、ＡＤＥ１などのプロモーターに置換することができる。これにより、菌体又は細胞をある程度増殖させた培養中後期において、プレニル化酵素遺伝子の転写を抑制することが可能となる。このようにプレニル化酵素の発現時期を改変することは、プレニル化タンパク質の存在が特に重要な菌体又は細胞において有用である。
（４）プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法
また、プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスＲＮＡを用いる方法が挙げられる。すなわち、プレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを転写する遺伝子を、菌体又は細胞のゲノムに組み込み、当該アンチセンスＲＮＡを過剰発現させることで、プレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。アンチセンスＲＮＡに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳動物（マウス）、昆虫（線虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１９６６−１９７０；Ａｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６９，３００７−３０１２；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，５６９−５９７；Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１，１０９４−１０９９；Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ，３７，４２９−３６；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４３１３−４３１７；Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２４，１０７９−８６）。
また、プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスＲＮＡを用いる方法が挙げられる。すなわち、プレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを転写する遺伝子を、菌体又は細胞のゲノムに組み込み、当該アンチセンスＲＮＡを過剰発現させることで、プレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。アンチセンスＲＮＡに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳動物（マウス）、昆虫（線虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１９６６−１９７０；Ａｉｂａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６９，３００７−３０１２；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５５，５６９−５９７；Ｈａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１，１０９４−１０９９；Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ，３７，４２９−３６；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４３１３−４３１７；Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２４，１０７９−８６）。
また、プレニル化酵素遺伝子の翻訳を抑制するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を利用することも可能である。具体的には、標的とするプレニル化酵素遺伝子の塩基配列に相補的な二本鎖ＲＮＡを菌体又は細胞内に導入すると、内在性のプレニル化酵素遺伝子のｍＲＮＡが分解されて、結果としてその菌体又は細胞でのプレニル化酵素遺伝子発現が特異的に抑制されることとなる。この手法は、最初に線虫で報告され、その後ショウジョウバエ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、植物、哺乳動物細胞などにおいても確認されている（Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１８，２４４−２５１（ｒｅｖｉｅｗ）；特表２００２−５１６０６２号公報；特表平８−５０６７３４号公報）。
上記（１）〜（４）の方法において、使用可能な菌体又は細胞は、プレニルアルコール及び／又はスクアレンを生合成する代謝経路を有する、すなわちプレニルアルコール及び／又はスクアレン生産能を有する菌体又は細胞であれば特に限定されない。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、デバリオマイセス・バンリイアエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、ウィリオプシス・サツルナス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｓａｔｕｒｎｕｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄ ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。また、本方法においては微生物の他、動物細胞及び植物細胞を用いることも可能である。さらに、野生型の菌体又は細胞だけではなく、変異型のものを使用することも可能である。一例として、サッカロミセス・セレビシエＡＨ３ ＡＨＫＵ株（特許文献１及び２参照）を用いることができる。ＡＨ３ ＡＨＫＵ株は、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＢＴＳ１）とファルネシル二リン酸合成酵素（ＥＲＧ２０）との融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ１）をコードする遺伝子を、３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターの下流に連結して形質転換された二倍体酵母であり、プレニルアルコールの生産能が高められている。従って、ＡＨ３ ＡＨＫＵ株は本方法においてプレニルアルコールを製造するために好ましい。
上記菌体又は細胞を培養するための培地は、特に限定されるものではなく、上述した菌体又は細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば細胞としてサッカロミセス・セレビシエを使用する場合には、グルコース及び大豆油を添加したＹＰＤ培地を使用することができる。
また、培地中には、エタノールを添加することが好ましい。エタノールを添加した培地によれば、プレニルアルコール及びスクアレンの生産効率が向上することとなる。
さらに、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、プレニルアルコール及びスクアレンの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンＸ−３０５、スパン８５、アデカノールＬＧ−１０９（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９４（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９７（旭電化製）、アデカノールＢ−３００９Ａ（旭電化製）、アデカプロニックＬ−６１（旭電化製）
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンＸ−３０５、スパン８５、アデカノールＬＧ−１０９（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９４（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９７（旭電化製）、アデカノールＢ−３００９Ａ（旭電化製）、アデカプロニックＬ−６１（旭電化製）
テルペノイド濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、油脂濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、界面活性剤濃度は０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
また、培地は、エタノール及び／又は脂質を含有するものであってもよい。エタノールは、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは０．５〜５％、最も好ましくは１〜３％の濃度で含有する。脂質としては、例えばパルミチン酸を挙げることができ、培地中に、例えば０．１〜５％の濃度で含有する。
また特に本発明に係るプレニルアルコールの製造方法においては、菌体又は細胞を、スクアレン合成酵素活性を低下させた条件下で培養してもよい。スクアレン合成酵素活性を低下させると、ファルネシル二リン酸を基質としたスクアレンの合成が阻害され、結果としてプレニルアルコールの生産が促進される。スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、上述したプレニル化酵素活性を低下させる場合と同様な方法を使用することができる。すなわち、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下としては、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法、スクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法、またさらにはスクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法が挙げられる。
また、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、ＷＯ０２／０５３７４７号パンフレットに開示されている方法を、菌体又は細胞に適用することができる。
スクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、ＳＱＡＤ（特表平８−５０８２４５号公報）、ＢＳＭ−１８７７４５（Ｔｏｘｉ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍ．１４５，９１−９８（１９８７））、ＥＲ−２７８５６（Ｊ．ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４４，１２８−１３５（２００２））等の合成品の他、カビ類が生産するｚａｒａｇｏｚｉｃ ａｃｉｄ（Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１１，２７９−３０２（１９９４））を挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを使用した場合、ＳＱＡＤの添加量は、菌体又は細胞を培養する培地中に５〜２００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。
一方、スクアレン合成酵素活性を低下させることによって、ファルネシル二リン酸を基質としたスクアレンの合成が阻害されることとになる。スクアレン合成酵素活性を低下させた場合、細胞においてエルゴステロール生合成が抑制されるため、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。エルゴステロールを含む培地を用いるか、エルゴステロールを培地に追添加することによって、エルゴステロール生合成阻害による細胞の生育阻害等を防止することができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを用いた場合、エルゴステロールの添加量は、１〜１００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。
菌体又は細胞を培養する条件は、特に限定されるものではなく、使用する菌体又は細胞の種類、及び使用する培地などに応じて適宜設定することができる。例えば、細胞としてサッカロミセス・セレビシエ（又はその変異株）を使用し、培地としてグルコース及び大豆油を添加したＹＰＤ培地を使用する場合には、約２０〜４０℃、好ましくは３０℃にて、約１２時間〜１４日、好ましくは４日間培養する。
以上のように、プレニル化酵素活性を低下させた条件下で菌体又は細胞を培養することによって、得られる培養物からプレニルアルコール及びスクアレンを優れた生産性で採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本方法においては、プレニルアルコール及びスクアレンを高収率で生産することができる。なお、プレニルアルコール及びスクアレンを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、プレニルアルコール又はスクアレンが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりプレニルアルコール又はスクアレンを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、プレニルアルコール又はスクアレンが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコール又はスクアレンを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
図１に示した代謝経路から判るように、プレニルアルコールは、プレニル二リン酸（ＦＰＰ，ＧＧＰＰ）から合成される。この代謝経路においては、プレニル化酵素もプレニル二リン酸を基質として利用し、プレニル化タンパク質を合成する。したがって、上述したようにプレニル化酵素活性を低下させた場合、プレニル化酵素によるプレニル二リン酸の消費が抑えられ、アルキルホスファターゼの作用によりプレニル二リン酸からプレニルアルコールが生成される反応がより強く進行することとなる。例えば、ファルネシル二リン酸からファルネソール（ＦＯＨ）が生成される反応、ＦＯＨからネロリドール（ＮＯＨ）が生成される反応、ゲラニルゲラニル二リン酸からゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）が生成される反応が強く進行することとなる。その結果、プレニルアルコールの生産効率が向上することとなる。
またプレニル二リン酸が蓄積すると、プレニル二リン酸を原料とするテルペノイド類の合成を増加させることができる。例えば、ステロール、カロチノイド、ビタミンＫ類などがこれに該当するが、特にステロールの前駆体であるスクアレンの合成増加を促進できる。
一般に、アミノ酸を始めとする生育上極めて重要な一次代謝産物では、当該産物の合成反応に直接関与する遺伝子を強化又は抑制することによって、当該産物の生産性を向上させる試みが行われ成果を出している。しかしながら、プレニルアルコール及びスクアレン等の二次代謝産物においては、その合成経路の強化又は抑制を行っても、原料物質が一次代謝産物等の合成に消費されることが多く、生産性を向上させることが困難である。例えば、単にアセチル−ＣｏＡの生産を亢進しても、プレニルアルコール及びスクアレンの生合成が強化される蓋然性は低いといえる。
本発明においては、プレニル二リン酸が関与する様々な代謝経路の中で、特にプレニル二リン酸をプレニル化タンパク質に変換するプレニル化酵素活性を低下させ、プレニルアルコール及びスクアレンへの変換反応を亢進することで、プレニルアルコール及びスクアレンの生産性を向上させることができる。
以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔参考例〕
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＢＴＳ１）とファルネシル二リン酸合成酵素（ＥＲＧ２０）との融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ１）をコードする遺伝子を、３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターの下流に連結し、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）において発現させた。具体的な手順を以下に示す。
（１）遺伝子取得
（１−Ａ）ファルネシルピロリン酸合成酵素遺伝子（ＦＰＳ）ＥＲＧ２０のクローニング
サッカロミセス・セレビシエＤＢＹ７４６由来のｃＤＮＡライブラリー“Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ”（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を鋳型として用い、以下の条件でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した：
プライマー１（SCFPS1）：5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3'（配列番号１）
プライマー２（SCFPS 2）：5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3'（配列番号２）
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素（ＢＴＳ１）とファルネシル二リン酸合成酵素（ＥＲＧ２０）との融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ１）をコードする遺伝子を、３リン酸脱水素酵素遺伝子のプロモーターの下流に連結し、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）において発現させた。具体的な手順を以下に示す。
（１）遺伝子取得
（１−Ａ）ファルネシルピロリン酸合成酵素遺伝子（ＦＰＳ）ＥＲＧ２０のクローニング
サッカロミセス・セレビシエＤＢＹ７４６由来のｃＤＮＡライブラリー“Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ”（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を鋳型として用い、以下の条件でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した：
プライマー１（SCFPS1）：5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3'（配列番号１）
プライマー２（SCFPS 2）：5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3'（配列番号２）
１０×ＥｘＴａｑバッファー（タカラバイオ） ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ ４μｌ
５Ｕ／μｌ ＥｘＴａｑ（タカラバイオ） １μｌ
１０ｐｍｏｌ プライマー１
１０ｐｍｏｌ プライマー２
計５０μｌにする
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ ４μｌ
５Ｕ／μｌ ＥｘＴａｑ（タカラバイオ） １μｌ
１０ｐｍｏｌ プライマー１
１０ｐｍｏｌ プライマー２
計５０μｌにする
上記反応液を用い、９４℃にて４５秒、５５℃にて１分及び７２℃にて２分を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。なお、後述するＰＣＲ反応は特別な記載がない限り上記と同様の条件で行った。増幅したＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）へＴ／Ａライゲーションによりクローニングした。サッカロミセス・セレビシエゲノムデータベース（http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/）にあるＥＲＧ２０の塩基配列と比較したところエラーはなかった。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＥＲＧ２０とした。
（１−Ｂ）ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素遺伝子ＢＴＳ１のクローニング
以下のプライマーを用いて上記ＥＲＧ２０の場合と同様にＰＣＲ反応を行った：
プライマー３：5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3'（配列番号３）
プライマー４：5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3'（配列番号４）
以下のプライマーを用いて上記ＥＲＧ２０の場合と同様にＰＣＲ反応を行った：
プライマー３：5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3'（配列番号３）
プライマー４：5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3'（配列番号４）
ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。増幅した約１．０ｋｂの断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターにＴ／Ａクローニングし、ＢＴＳ１領域の塩基配列を決定した。その結果、ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html）のＢＴＳ１配列と完全に一致し、サッカロミセス・セレビシエ由来の遺伝子であることを確認した。次にＢＴＳ１遺伝子がクローニングされたｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターをＢａｍＨ１とＳａｌＩで消化し、ＢＴＳ１遺伝子を含むＢａｍＨ１−ＳａｌＩフラグメントをｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに導入した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６と命名した。
（１−Ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子ＨＭＧ１のクローニング
以下のプライマーを用いて上記ＥＲＧ２０の場合と同様にＰＣＲ反応を行った：
プライマー５：5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3'（配列番号５）
プライマー６：5'-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3'（配列番号６）
以下のプライマーを用いて上記ＥＲＧ２０の場合と同様にＰＣＲ反応を行った：
プライマー５：5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3'（配列番号５）
プライマー６：5'-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3'（配列番号６）
ＰＣＲは、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｍａｔｃｈ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。増幅した約３．２ｋｂの断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターにＴ／Ａクローニングし、ＨＭＧ１領域の塩基配列を決定した。その結果、ＧｅｎＢａｎｋ（http://www.neb.nih.gov/Genbank/index.html）に登録されているサッカロミセス・セレビシエ由来のＨＭＧ１遺伝子配列と比較したところ１２ヶ所で違いが見られた。この内の３ヶ所はアミノ酸配列に影響する変異であった（Ｓ６８Ｆ、Ｌ６０７Ｓ、Ｈ９０９Ｒ）。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴ７ＨＭＧ１とした。
次にＰＣＲエラーを修正するため、ｐＴ７ＨＭＧ１をＳｍａ１、ＡｐａＬ１、Ｓａｌ１で切断し、３．２ｋｂｐ断片をアガロース電気泳動で調製した。この断片をｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＳｍａ１−Ｓａｌ１部位に挿入し、ｐＡＬＨＭＧ１を作製した。ｐＡＬＨＭＧ１をアルカリ変性後、下記変異導入オリゴ、Ａｍｐ ｒｅｐａｉｒ ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｔｅｔ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｌｉｇｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をアニーリングさせた。大腸菌ＥＳ１３０１株（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入後、１２５μｇ／ｍｌアンピシリンで部位特異的変異が導入されたプラスミドを保持する形質転換体を集積培養し、プラスミドＤＮＡを調製した。
プライマー７：5'-CCA AAT AAA GAC TCC AAC ACT CTA TTT-3'（配列番号７）
プライマー８：5'-GAA TTA GAA GCA TTA TTA AGT AGT GGA-3'（配列番号８）
プライマー９：5'-GGA TTT AAC GCA CAT GCA GCT AAT TTA-3'（配列番号９）
得られたプラスミドのＤＮＡ配列を解析したところ修正されていた。このプラスミドをｐＡＬＨＭＧ１０６とした。
プライマー８：5'-GAA TTA GAA GCA TTA TTA AGT AGT GGA-3'（配列番号８）
プライマー９：5'-GGA TTT AAC GCA CAT GCA GCT AAT TTA-3'（配列番号９）
得られたプラスミドのＤＮＡ配列を解析したところ修正されていた。このプラスミドをｐＡＬＨＭＧ１０６とした。
（２）ベクターの構築
（２−Ａ）ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃの作製（ｐＲＳベクターへＣＹＣ１ｔ断片の挿入）
ＣＹＣ１転写ターミネーターＣＹＣ１ｔ断片はＰＣＲで調製した。以下の組み合わせのプライマーを用いてＰＣＲ行った。
（２−Ａ）ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃの作製（ｐＲＳベクターへＣＹＣ１ｔ断片の挿入）
ＣＹＣ１転写ターミネーターＣＹＣ１ｔ断片はＰＣＲで調製した。以下の組み合わせのプライマーを用いてＰＣＲ行った。
（イ）ＣＹＣ１ｔ−ＸＫ
XhoI-Tcyc1FW：5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3'（配列番号１０）
KpnI-Tcyc1RV：5'CAT TAG GTA CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3'（配列番号１１）
（ロ）ＣＹＣ１ｔＸＡ
XhoI-Tcyc1FW：5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3'（配列番号１２）
ApaI-Tcyc1RV：5'CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3'（配列番号１３）
XhoI-Tcyc1FW：5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3'（配列番号１０）
KpnI-Tcyc1RV：5'CAT TAG GTA CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3'（配列番号１１）
（ロ）ＣＹＣ１ｔＸＡ
XhoI-Tcyc1FW：5'TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG 3'（配列番号１２）
ApaI-Tcyc1RV：5'CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG 3'（配列番号１３）
ＰＣＲ条件：
鋳型 ：ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）０．１μｇ
プライマー：５０ｐｍｏｌ プライマーＤＮＡ
反応液 ：１×ｐｆｕバッファー（ＭｇＳＯ4添加）（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１０ｎｍｏｌ ｄＮＴＰ
１．５μ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１μｌ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む５０μｌ溶液
反応 ：９５℃にて２分→（９５℃４５秒、６０℃３０秒、７２℃１分）×３０サイクル→７２℃５分→４℃ストック
鋳型 ：ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）０．１μｇ
プライマー：５０ｐｍｏｌ プライマーＤＮＡ
反応液 ：１×ｐｆｕバッファー（ＭｇＳＯ4添加）（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１０ｎｍｏｌ ｄＮＴＰ
１．５μ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１μｌ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む５０μｌ溶液
反応 ：９５℃にて２分→（９５℃４５秒、６０℃３０秒、７２℃１分）×３０サイクル→７２℃５分→４℃ストック
上記（イ）及び（ロ）の条件で増幅したＤＮＡをそれぞれ、ＸｈｏＩとＫｐｎＩ、又は、ＸｈｏＩとＡｐａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で２６０ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、ＣＹＣ１ｔ−ＸＫ及びＣＹＣ１ｔＸＡとした。ｐＲＳ４０５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ部位にＣＹＣ１ｔ−ＸＫを、ｐＲＳ４０４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＸｈｏＩ−ＡｐａＩ部位にＣＹＣ１ｔＸＡを挿入し、それぞれｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃとした。
（２−Ｂ）ＴＤＨ３ｐの作製（転写プロモーターの調製）
サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ゲノムＤＮＡを酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製し、同ゲノムを鋳型としたＰＣＲを行い、ＴＤＨ３ｐ（ＰＧＫ）プロモーターを含むＤＮＡ断片を調製した。
サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ゲノムＤＮＡを酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製し、同ゲノムを鋳型としたＰＣＲを行い、ＴＤＨ３ｐ（ＰＧＫ）プロモーターを含むＤＮＡ断片を調製した。
ＤＮＡプライマー １００ｐｍｏｌ
SacI-Ptdh3FW：5'CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA 3'（配列番号１４）
SacII-Ptdh3RV：5'CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC 3'（配列番号１５）
鋳型：サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ゲノムＤＮＡ０．４６μｇ
反応溶液：１×ＥｘＴａｑバッファー（Ｔａｋａｒａ）
２０ｎｍｏｌｄＮＴＰ
０．５μＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）
１μｌ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー
を含む１００μｌ溶液
反応：９５℃２分→（９５℃４５秒、６０℃１分、７２℃２分）×３０サイクル→７２℃４分→４℃ストック
増幅したＤＮＡをＳａｃＩとＳａｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で６８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製しＴＤＨ３ｐとした。
SacI-Ptdh3FW：5'CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA 3'（配列番号１４）
SacII-Ptdh3RV：5'CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC 3'（配列番号１５）
鋳型：サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ゲノムＤＮＡ０．４６μｇ
反応溶液：１×ＥｘＴａｑバッファー（Ｔａｋａｒａ）
２０ｎｍｏｌｄＮＴＰ
０．５μＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）
１μｌ ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈポリメラーゼエンハンサー
を含む１００μｌ溶液
反応：９５℃２分→（９５℃４５秒、６０℃１分、７２℃２分）×３０サイクル→７２℃４分→４℃ストック
増幅したＤＮＡをＳａｃＩとＳａｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で６８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製しＴＤＨ３ｐとした。
（２−Ｃ）２μＯｒｉＳＮの作製（２μＤＮＡ複製開始領域の調製）
ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＳｓｐＩとＮｈｅＩで切断後２μＤＮＡ複製開始点（２μｏｒｉ）を含む１．５ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、このＤＮＡ断片を２μＯｒｉＳＮとした。
ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＳｓｐＩとＮｈｅＩで切断後２μＤＮＡ複製開始点（２μｏｒｉ）を含む１．５ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化し、このＤＮＡ断片を２μＯｒｉＳＮとした。
（２−Ｄ）ｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰの作製（ＹＥｐ型発現ベクターの作製）
ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃを、ＢＡＰ（細菌アルカリホスファターゼ，Ｔａｋａｒａ）処理したＮａｅＩ部位に２μＯｒｉＳＮを挿入し、大腸菌ＳＵＲＥ２に形質転換後、プラスミドＤＮＡを調製した。これを、ＤｒａＩＩＩとＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、又は、ＰｓｔＩとＰｖｕＩＩにより切断後、アガロースゲル電気泳動し、２μｏｒｉの挿入とその向きをチェックした。作製したｐＲＳ４０４ Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５ Ｔｃｙｃに、ｐＹＥＳ２と同じ向きに２μｏｒｉが挿入されたプラスミドをそれぞれｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μＯｒｉとした。
ｐＲＳ４０４Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５Ｔｃｙｃを、ＢＡＰ（細菌アルカリホスファターゼ，Ｔａｋａｒａ）処理したＮａｅＩ部位に２μＯｒｉＳＮを挿入し、大腸菌ＳＵＲＥ２に形質転換後、プラスミドＤＮＡを調製した。これを、ＤｒａＩＩＩとＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、又は、ＰｓｔＩとＰｖｕＩＩにより切断後、アガロースゲル電気泳動し、２μｏｒｉの挿入とその向きをチェックした。作製したｐＲＳ４０４ Ｔｃｙｃ、ｐＲＳ４０５ Ｔｃｙｃに、ｐＹＥＳ２と同じ向きに２μｏｒｉが挿入されたプラスミドをそれぞれｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μＯｒｉとした。
ｐＲＳ４３４Ｔｃｙｃ２μＯｒｉ、ｐＲＳ４３５Ｔｃｙｃ２μＯｒｉのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位に転写プロモーターを含む断片ＴＤＨ３ｐを挿入し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ、ｐＲＳ４３５ＧＡＰをそれぞれ得た。
（３）融合遺伝子の作製
（３−Ａ）ｐＲＳ４３５ＧＧＦ（ＦＰＳ−ＧＧＰＳ融合タンパク遺伝子）の作製
ＧＧＰＳ遺伝子ＢＴＳ１を組み込んだｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６と、ＦＰＳ遺伝子ＥＲＧ２０を組み込んだｐＴ７−ＥＲＧ２０を鋳型に用い、以下の条件でＰＣＲを行った：
（イ）ＰＣＲ１
鋳型 ：ｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６
プライマー１：SacII-BTS1：5'TCC (CCG CGG) ATG GAG GCC AAG ATA GAT 3'（配列番号１６）
プライマー２：BTSI-109I：5'GCA [GGG ACC C]CA ATT CGG ATA AGT GGT C 3'（配列番号１７）
（ロ）ＰＣＲ２
鋳型 ：pT7-ERG20
プライマー１：109I-ERG20：5'GTA [GGG TCC T]CA GAA AAA GAA ATT AGG AG 3'（配列番号１８）
プライマー２：-21：5'TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3'（配列番号１９）
（３−Ａ）ｐＲＳ４３５ＧＧＦ（ＦＰＳ−ＧＧＰＳ融合タンパク遺伝子）の作製
ＧＧＰＳ遺伝子ＢＴＳ１を組み込んだｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６と、ＦＰＳ遺伝子ＥＲＧ２０を組み込んだｐＴ７−ＥＲＧ２０を鋳型に用い、以下の条件でＰＣＲを行った：
（イ）ＰＣＲ１
鋳型 ：ｐＹＥＳ−ＧＧＰＳ６
プライマー１：SacII-BTS1：5'TCC (CCG CGG) ATG GAG GCC AAG ATA GAT 3'（配列番号１６）
プライマー２：BTSI-109I：5'GCA [GGG ACC C]CA ATT CGG ATA AGT GGT C 3'（配列番号１７）
（ロ）ＰＣＲ２
鋳型 ：pT7-ERG20
プライマー１：109I-ERG20：5'GTA [GGG TCC T]CA GAA AAA GAA ATT AGG AG 3'（配列番号１８）
プライマー２：-21：5'TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3'（配列番号１９）
括弧内はベクター連結用のＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩ又はＸｂａＩ認識部位で、四角括弧内は融合遺伝子作製用のＥｃｏＯ１０９Ｉ認識部位を示す）
反応液：１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓバッファー（Ｔｏｙｏｂｏ）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．２５ｍＭ ＭｇＳＯ4
１５ｐｍｏｌプライマー１
１５ｐｍｏｌプライマー２
０．０１〜０．１μｇ鋳型ＤＮＡ
１ｕＫＯＤ−ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）
（５０μｌ反応カクテル中）ＫＯＤ−Ｐｌｕｓには１．６μｇ／μｌのＫＯＤ抗体が含まれている。
反応条件：９４℃−２分の後、９４℃−１５秒，５５℃−３０秒，６８℃−１分を３０サイクルし、６８℃−２分保温
反応液：１×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓバッファー（Ｔｏｙｏｂｏ）
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．２５ｍＭ ＭｇＳＯ4
１５ｐｍｏｌプライマー１
１５ｐｍｏｌプライマー２
０．０１〜０．１μｇ鋳型ＤＮＡ
１ｕＫＯＤ−ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）
（５０μｌ反応カクテル中）ＫＯＤ−Ｐｌｕｓには１．６μｇ／μｌのＫＯＤ抗体が含まれている。
反応条件：９４℃−２分の後、９４℃−１５秒，５５℃−３０秒，６８℃−１分を３０サイクルし、６８℃−２分保温
上記（イ）及び（ロ）で得られた反応産物をそれぞれ＃９及び＃１１とした。＃９及び＃１１を制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉで消化後ライゲーションし、この溶液をＰＣＲの鋳型とし、さらに上記ＳａｃＩＩ−ＢＴＳ１と−２１をプライマーとし、同様の条件で２ｎｄＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片＃９−＃１１を得た。
２ｎｄＰＣＲ産物＃９−＃１１をＳａｃＩＩとＢａｍＨＩで切断後、ｐＲＳ４３５ＧＡＰのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＲＳ４３５ＧＧＦとした。
（４）ＨＭＧ１遺伝子発現ベクターの作製
ｐＡＬＨＭＧ１０６をＳｍａＩとＳａｌＩで切断後、アガロース電気泳動で３．２ｋｂのＨＭＧ１遺伝子断片を精製した。これをｐＲＳ４３４ＧＡＰのＳｍａＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１を得た。
ｐＡＬＨＭＧ１０６をＳｍａＩとＳａｌＩで切断後、アガロース電気泳動で３．２ｋｂのＨＭＧ１遺伝子断片を精製した。これをｐＲＳ４３４ＧＡＰのＳｍａＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１を得た。
（５）遺伝子導入酵母の非栄養要求性二倍体化
（Ａ−１）野生型Ｈｉｓ３フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した。
プライマー１（His3-L）：5'-TTT TAA GAG CTT GGT GAG CGC-3'（配列番号２０）
プライマー２（His3-R）：5'-TCG AGT TCA AGA GAA AAA AAA-3'（配列番号２１）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、３０ｎｇ
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃１０分でＰＣＲ反応を行った。
（Ａ−１）野生型Ｈｉｓ３フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した。
プライマー１（His3-L）：5'-TTT TAA GAG CTT GGT GAG CGC-3'（配列番号２０）
プライマー２（His3-R）：5'-TCG AGT TCA AGA GAA AAA AAA-3'（配列番号２１）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、３０ｎｇ
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃１０分でＰＣＲ反応を行った。
（Ａ−２）野生型Ａｄｅ２フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（Ade 1）：5'-ATG GAT TCT AGA ACA GTT GGT-3'（配列番号２２）
プライマー２（Ade 2）：5'-TTA CTT GTT TTC TAG ATA AGC-3'（配列番号２３）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃７分でＰＣＲ反応を行った。
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（Ade 1）：5'-ATG GAT TCT AGA ACA GTT GGT-3'（配列番号２２）
プライマー２（Ade 2）：5'-TTA CTT GTT TTC TAG ATA AGC-3'（配列番号２３）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃７分でＰＣＲ反応を行った。
（Ａ−３）野生型Ｕｒａ３フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（URA3-L）：5'-TTC AAT TCA TCA TTT TTT TTT-3'（配列番号２４）
プライマー２（URA3-R）：5'-GGG TAA TAA CTG ATA TAA TTA-3'（配列番号２５）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５０℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃、７分でＰＣＲ反応を行った。
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（URA3-L）：5'-TTC AAT TCA TCA TTT TTT TTT-3'（配列番号２４）
プライマー２（URA3-R）：5'-GGG TAA TAA CTG ATA TAA TTA-3'（配列番号２５）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５０℃１分、７２℃２分）×３０サイクル、７２℃、７分でＰＣＲ反応を行った。
（Ａ−４）野生型Ｌｙｓ１フラグメントの増幅
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（Lys 1）：5'-ATG ACT AAC GAA AAG GTC TGG-3'（配列番号２６）
プライマー２（Lys 2）：5'-TAA AGC TGC TGC GGA GCT TCC-3'（配列番号２７）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５８℃１分、７２℃４分）×３０サイクル、７２℃７分でＰＣＲ反応を行った。
次に以下の条件（１００μｌ）でＰＣＲを実施した：
プライマー１（Lys 1）：5'-ATG ACT AAC GAA AAG GTC TGG-3'（配列番号２６）
プライマー２（Lys 2）：5'-TAA AGC TGC TGC GGA GCT TCC-3'（配列番号２７）
１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（タカラバイオ製）
２００μＭ ｄＮＴＰｍｉｘ
０．４μＭ ＤＮＡプライマー
２．５Ｕ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ製）
テンプレート：サッカロミセス・セレビシエＡ４５１（ＡＴＣＣ２００５８９）、０．０５μｇ，酵母ゲノムＤＮＡ調製用キット「Ｇｅｎとるくん」（タカラバイオ製）で調製
上記反応液を用い、９４℃１分、（９４℃３０秒、５８℃１分、７２℃４分）×３０サイクル、７２℃７分でＰＣＲ反応を行った。
（Ｂ）ＹＨ１−ＡＨ株の作製
凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１をサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入し、酵母を形質転換した。ｐＲＳ４３５ＧＧＦが導入されればロイシン非要求性に、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１が導入されればトリプトファン非要求性になることから、アデニン、ヒスチジン、リジン及びウラシルを含む酵母最少栄養培地ＤＯＢ（ＢＩＯ１０１社製）プレートで生育する株を取得した。２つのベクターが導入された株をＹＨ１株と命名した。次に、アデニンとヒスチジン要求性をなくすため野生型のＨｉｓ３、Ａｄｅ２遺伝子を相同組換えで染色体ＤＮＡ上に組み込むことにした。前項（Ａ−１）及び（Ａ−２）においてＰＣＲ増幅したＨｉｓ３、Ａｄｅ２フラグメントを凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて順次導入、形質転換し、酵母最少栄養培地を用い、アデニン、ヒスチジン非要求性になった株を取得した。同株をＹＨ１−ＡＨ株と命名した。
凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でｐＲＳ４３５ＧＧＦとｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１をサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入し、酵母を形質転換した。ｐＲＳ４３５ＧＧＦが導入されればロイシン非要求性に、ｐＲＳ４３４ＧＡＰ−ＨＭＧ１が導入されればトリプトファン非要求性になることから、アデニン、ヒスチジン、リジン及びウラシルを含む酵母最少栄養培地ＤＯＢ（ＢＩＯ１０１社製）プレートで生育する株を取得した。２つのベクターが導入された株をＹＨ１株と命名した。次に、アデニンとヒスチジン要求性をなくすため野生型のＨｉｓ３、Ａｄｅ２遺伝子を相同組換えで染色体ＤＮＡ上に組み込むことにした。前項（Ａ−１）及び（Ａ−２）においてＰＣＲ増幅したＨｉｓ３、Ａｄｅ２フラグメントを凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて順次導入、形質転換し、酵母最少栄養培地を用い、アデニン、ヒスチジン非要求性になった株を取得した。同株をＹＨ１−ＡＨ株と命名した。
（Ｃ）ＹＰＨ５００−ＫＵ株の作製
前項（Ｂ）と同様にしてサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００（ＡＴＣＣ２０４６８０）株をウラシル、リジン非要求性にした。前項（Ａ−３）及び（Ａ−４）においてＰＣＲ増幅したＵｒａ３、Ｌｙｓ１フラグメントを凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて順次導入、形質転換し、酵母最少栄養培地を用い、ウラシル、リジン非要求性になった株を取得した。同株をＹＰＨ５００−ＫＵ株と命名した。
前項（Ｂ）と同様にしてサッカロミセス・セレビシエＹＰＨ５００（ＡＴＣＣ２０４６８０）株をウラシル、リジン非要求性にした。前項（Ａ−３）及び（Ａ−４）においてＰＣＲ増幅したＵｒａ３、Ｌｙｓ１フラグメントを凍結ＥＺ酵母形質転換キット（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて順次導入、形質転換し、酵母最少栄養培地を用い、ウラシル、リジン非要求性になった株を取得した。同株をＹＰＨ５００−ＫＵ株と命名した。
（Ｄ）ＹＨ３−ＡＨＫＵ株作製
ＹＨ１−ＡＨ株とＹＰＨ５００−ＫＵ株を、イーストエクストラクト５ｇ／Ｌ、モルトエクストラクト５ｇ／Ｌ、バクトペプトン１０ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌを含む培地（ＹＰＤ７）で３０℃にて、それぞれ一晩振とう培養した。両株の培養液２００μｌずつを混合し（ほぼ同じＯＤ６００ｎｍになるよう液量を調整）、新しいＹＰＤ７培地を加え、さらに一晩振とう培養した。培養液を生理食塩水で希釈してＤＯＢプレート（ＢＩＯ１０１社製）にまき、コロニーを取得した。二倍体化された株は栄養要求性が相補され、最少培地のＤＯＢプレートで生育するようになる。
ＹＨ１−ＡＨ株とＹＰＨ５００−ＫＵ株を、イーストエクストラクト５ｇ／Ｌ、モルトエクストラクト５ｇ／Ｌ、バクトペプトン１０ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌを含む培地（ＹＰＤ７）で３０℃にて、それぞれ一晩振とう培養した。両株の培養液２００μｌずつを混合し（ほぼ同じＯＤ６００ｎｍになるよう液量を調整）、新しいＹＰＤ７培地を加え、さらに一晩振とう培養した。培養液を生理食塩水で希釈してＤＯＢプレート（ＢＩＯ１０１社製）にまき、コロニーを取得した。二倍体化された株は栄養要求性が相補され、最少培地のＤＯＢプレートで生育するようになる。
二倍体化していることを確認するため得られたコロニーをＹＰＤ７培地で液体培養した後、前胞子形成培地に全量をプレーティングし３０℃で一晩培養した。
＜前胞子形成培地＞
０．８％イーストエクストラクト
０．３％ポリペプトン
１０％グルコース
２％アガロース
＜前胞子形成培地＞
０．８％イーストエクストラクト
０．３％ポリペプトン
１０％グルコース
２％アガロース
次に、前胞子形成培地で生育した菌体を以下に示す胞子形成培地に塗布した。このとき約１ｃｍ四方に厚めに菌を塗った。室温で３日間置いた後、位相差顕微鏡で胞子形成を確認したところ、約２０％近くが四胞子を形成しており、二倍体化されていることが確認できた。このようにして得られた二倍体栄養非要求性株をＹＨ３−ＡＨＫＵ株と命名した。
＜胞子形成培地＞
０．１％イーストエクストラクト
１％酢酸カリウム
０．０５％グルコース
２％アガロース
０．１％イーストエクストラクト
１％酢酸カリウム
０．０５％グルコース
２％アガロース
〔実施例１〕プレニルアルコール及びスクアレン産生
本実施例においては、参考例で作製したＡＨ３ ＡＨＫＵ株を用いて、プレニル化酵素阻害剤の存在下におけるそれらのプレニルアルコール及びスクアレン産生能について試験した。
本実施例においては、参考例で作製したＡＨ３ ＡＨＫＵ株を用いて、プレニル化酵素阻害剤の存在下におけるそれらのプレニルアルコール及びスクアレン産生能について試験した。
上記ＡＨ３ ＡＨＫＵ株を、６％グルコース、１％大豆油を含む２ｍｌのＹＰＤ培地（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ）１３−１参照）において３０℃にて４日間培養した。また、培養開始時と培養２日目に、ゲラニルゲラニル化酵素阻害剤であるＮ−アセチル−Ｓ−ゲラニル−Ｌ−システイン（ＧＣ）又はファルネシル化酵素阻害剤であるα−ヒドロキシファルネシルフォスフォン酸（ＨＦＰ）を、０．００２２５％又は０．０２２５％で培地に添加した。
培養終了後、培養液２ｍｌを採取し、これにメタノール１．２ｍｌ及びペンタン２ｍｌを添加した。その後、培養液を十分に攪拌し、ペンタン相を成分分析に供した。成分分析は、以下の条件で行った。分析装置は、ヒューレットパッカード社製ＨＰ６８９０／５９７３ ＧＣ／ＭＳシステムを用いた。
インレット温度：２５０℃
ディテクター温度：２６０℃
ＭＳゾーン温度
ＭＳ Ｑｕａｄ：１５０℃
ＭＳ Ｓｏｕｒｃｅ：２３０℃
スキャンパラメーター
Ｌｏｗ Ｍａｓｓ：３５
Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓ：２００
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：４０
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：２μｌ
洗浄回数：メタノールで３回、ヘキサンで２回
スプリット比：１：２０
カラム：ヒューレットパッカード社製ＨＰ−５ＭＳ（０．２５ｍｍ×３０Ｍ、フィルム厚０．２５μｍ）
キャリアーガス：１ヘリウム１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ソルベントディレイ：２ｍｉｎ
オ一ブン昇温条件：ｌ１５℃、１．５分保持→７０／分で２５０℃まで昇温、２分保持→７０／分で３００℃まで昇温、７分保持
ポストタイム：０
内部標準：１−ウンデカノール／エタノール溶液（１μｌ／ｍｌ）を各バイアルに１０μ１添加
注入口ライナー：スプリット／スプリットレス ライナー
解析：ＴＩＣを取り込んだ後、６９マスをセレクションし１ウンデカノール（ＲＴ＝３．３９ｍｉｎ）、ネロリドール（ＲＴ＝３．８６ｍｉｎ）、ファルネソール（ＲＴ＝４．２３ｍｉｎ）、ゲラニルゲラニオ一ル（ＲＴ＝５．７８ｍｉｎ）のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
ディテクター温度：２６０℃
ＭＳゾーン温度
ＭＳ Ｑｕａｄ：１５０℃
ＭＳ Ｓｏｕｒｃｅ：２３０℃
スキャンパラメーター
Ｌｏｗ Ｍａｓｓ：３５
Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓ：２００
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：４０
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：２μｌ
洗浄回数：メタノールで３回、ヘキサンで２回
スプリット比：１：２０
カラム：ヒューレットパッカード社製ＨＰ−５ＭＳ（０．２５ｍｍ×３０Ｍ、フィルム厚０．２５μｍ）
キャリアーガス：１ヘリウム１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ソルベントディレイ：２ｍｉｎ
オ一ブン昇温条件：ｌ１５℃、１．５分保持→７０／分で２５０℃まで昇温、２分保持→７０／分で３００℃まで昇温、７分保持
ポストタイム：０
内部標準：１−ウンデカノール／エタノール溶液（１μｌ／ｍｌ）を各バイアルに１０μ１添加
注入口ライナー：スプリット／スプリットレス ライナー
解析：ＴＩＣを取り込んだ後、６９マスをセレクションし１ウンデカノール（ＲＴ＝３．３９ｍｉｎ）、ネロリドール（ＲＴ＝３．８６ｍｉｎ）、ファルネソール（ＲＴ＝４．２３ｍｉｎ）、ゲラニルゲラニオ一ル（ＲＴ＝５．７８ｍｉｎ）のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
また、培養終了後、菌数を測定した。培養液１００μｌを生理食塩水で１〜２０倍に希釈し、血球計（林理化学）で細胞数を計測した。０．０６ｍｍ四方（最少グリット９つ分）の菌数を４平均し、以下の式から培養液１Ｌ当りの菌数を算出した。
菌数（１０9／培地１ｌ）＝０．４４４×（０．０６ｍｍ四方の菌体数）×希釈倍率
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。
菌数（１０9／培地１ｌ）＝０．４４４×（０．０６ｍｍ四方の菌体数）×希釈倍率
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。
表１から判るように、ＨＦＰ又はＧＣを培養開始時又は培養中に培地に添加して培養することにより、ネロリドール（ＮＯＨ）、ファルネソール（ＦＯＨ）及びゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）の各プレニルアルコール、及びスクアレン（ＳＱ）の生産が上昇した。具体的には、培養開始時にＨＦＰ又はＧＣを添加した場合、ＮＯＨは約１．０〜１．６倍、ＦＯＨは約１．０〜２．０倍、ＧＧＯＨは約０．８５〜１．４倍、ＳＱは約１．０〜１．７倍に上昇した。また培養２日目にＨＦＰ又はＧＣを添加した場合、ＮＯＨは約１．１〜１．３倍、ＦＯＨは約１．１〜１．５倍、ＧＧＯＨは約１．１〜１．２倍、ＳＱは約１．１〜１．３倍に上昇した。この結果より、ＧＧＯＨの生産効率を上げることを目的とする場合には、培養開始直後ではなく、培養開始から所定期間経過後にプレニル化酵素阻害剤を添加することが好ましいことがわかる。
以上のように、プレニル化酵素阻害剤を添加した培地で酵母を培養することによりプレニルアルコール及びスクアレンの生産効率を向上させることができる。
以上、詳細に説明したように、本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、細胞におけるプレニルアルコール及びスクアレンの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコール及びスクアレンを優れた生産性で製造できる。
配列番号１〜２７ 合成オリゴヌクレオチド
Claims (8)
- プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養し、
培養物中からプレニルアルコールを回収する
プレニルアルコールの製造方法。 - プレニル化酵素阻害剤を培地に添加することで、プレニル化酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
- 複数のプレニル化酵素遺伝子のうち、少なくとも１のプレニル化酵素遺伝子を破壊した菌体又は細胞を用いることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
- プレニル化酵素遺伝子の発現を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
- プレニル化酵素遺伝子の翻訳効率を低下させることで、プレニル化酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
- プレニル化酵素がファルネシル化酵素又はゲラニルゲラニル化酵素であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のプレニルアルコールの製造方法。
- スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
- プレニル化酵素活性を低下させる条件下で菌体又は細胞を培養し、
培養物中からスクアレンを回収する
スクアレンの製造方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009532377A (ja) * | 2006-03-31 | 2009-09-10 | アルコン リサーチ， リミテッド | 高眼圧症の制御および緑内障の治療のためのプレニルトランスフェラーゼ阻害剤 |
-
2003
- 2003-08-29 JP JP2003306876A patent/JP2005073550A/ja active Pending
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