JP2003174874A - 広ｐＨ範囲にわたり分子電荷があまり変化しない変異体酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 広いpH範囲にわたり電荷の変化が少ない新規
な変異体酵素の提供。 【解決手段】 例えば、サブチリシン酵素において、グ
ルタミン酸、リジン、ヒスチジン、チロシンなどを他の
アミノ酸に置換した変異体サブチリシン酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は酵素、例えばそれらの生産のために適するrDNA
法、突然変異遺伝子、ベクターおよび突然変異体、およ
びにそれらの生産に有用な形質転換微生物、ならびに例
えばそれらを含有する酵素的洗剤と掃除用組成物を含め
てのそれらの応用に関するものである。より詳細な態様
において、本発明は改良酵素およびその製造および使
用、特に改良プロテアーゼに関する。そのような改良プ
ロテアーゼは、遺伝子的（例えばrDNA法による）に改良
された、祖先から系統を受け継いだ微生物由来のものを
含む。

【０００２】より詳細な態様において、本発明は改良酵
素の調製および使用に関し、特に改良されたアルカリセ
リンプロテアーゼ、特に細菌および真菌起源のものに関
する。すなわち以下に記載する本発明は、とりわけプロ
テアーゼを生産するための技術を提供し、それは例えば
バチルス・ズブチルスプロテアーゼおよび他のズブチリ
シンプロテアーゼであり、ならびにさらにそのような酵
素の遺伝子的改良体およびそのような酵素の洗剤および
掃除用組成物中での使用を提供する。

【０００３】発明の背景 酵素および特にプロテアーゼは、望ましくないタンパク
質様の汚れなどを除去するため、または除去を容易にす
るために洗剤および掃除用組成物中に20年以上の間使用
されて来た。これらの目的のために使用される酵素の中
で商業的に最も重要なものはプロテアーゼであり、特に
ズブチリシンプロテアーゼである。プロテアーゼは洗剤
産業において20年以上使用されて来たが、良好な洗濯結
果の要因となる物理的または化学的特性は未だ正確に知
られていない。最近使用されている酵素は、天然からの
プロテアーゼを単離し、そしてそれらを洗剤配合物に試
す事により見出された。

【０００４】セリンプロテアーゼは酵素の一種として知
られており、ズブチリシンを含むが、これはペプチド結
合を加水分解し、活性部位に必須なセリン残基が特徴で
ある(White, Handler およびSmith"生化学の理論 (Prin
ciples of Biochemistry)"第５版、マグロー−ヒル出版
社、ニューヨーク 'McGraw-Hill Book Co. New York),
1973, 271-272 頁) 。

【０００５】既知のセリンプロテアーゼの分子量範囲は
25,000から30,000である。それらはジイソプロピル−フ
ルオロリン酸塩により阻害されるが、メタロプロテアー
ゼとは対照的にエチレンジアミン四酢酸（EDTA) には耐
性である（しかしそれらはカルシウムイオンにより高温
で安定化されるが）。それらは単なる末端エステルを加
水分解し、これはやはりセリンプロテアーゼである真核
性キモトリプシンとも活性において同様である。換言す
れば、アルカリプロテアーゼはセリンプロテアーゼの至
適高温性 pH9.0から11.0を反映する (総説として、Prie
stの1977, Bacteriological Rev. 41:711-753 を参照)
。

【０００６】ズブチリシンはグラム−陽性細菌または真
菌により生産されるセリンプロテアーゼである。ズブチ
リシンの広範な種類が同定されており、少なくとも８つ
のズブチリシンについてアミノ酸配列が決定されてい
る。これらはバチルス株からの６つのズブチリシン、す
なわち 168ズブチリシンBPN'、ズブチリシンカールスバ
ーグ (Carlsberg)、ズブチリシンDY、ズブチリシンアミ
ロサッカリティクス (amylosacchariticus) およびメセ
ンテリコペプチダーゼ (mesentericopeptidase)(Kuriha
raら1972, J.Biol.Chem. 247：5629-5631 ;

【０００７】Stahl およびFerrai, 1984, J.Bacteriol.
159：811-819, Jacobsら、1985,Nucl. Acid Res. 1
3：8913-8926 : Nedkovら、1985, Biol.Chem.Hoppe-Sey
ler 366:421-430, Svendsenら、1986, FEBS Lett 196 :
228-232)および２つの真菌ズブチリシンサーモアクチ
ノミセス・ブルガリス (Thermoactinomyces vulgaris)
からのズブチリシンであるサーミターゼ (thermitase)
(Melounら.,1985, FEBS Lett. 1983 : 195-200)および
トリチラチウム・アルブム (Tritirachium album)から
のプロティナーゼＫ (JanyおよびMayer,1985, Biol.Che
m.Hoppe-Seyler 366：584-492)である。

【０００８】ズブチリシンは物理的および化学的によく
特徴づけられている。これら酵素の一次構造（アミノ酸
配列）に加えて、50倍以上の解像度のズブチリシンのＸ
−線構造が決定され、これは基質との結合、遷移状態、
産物、３種のプロテアーゼインヒビターを描写し、天然
の変更体の構造的結論を定める(Kraut, 1977, Ann. Re
v. Biochem. 46：331-358)。

【０００９】ズブチリシン遺伝子の不規則なおよび部位
特異的突然変異は、酵素の物理的および化学的性質に関
する両方の知識から生まれ、ズブチリシンの触媒活性、
基質特異性、三次元構造などに関する情報に寄与した(W
ellsら、1987, Proc, Natl.Acad.Sci.U.S.A.84；1219-1
223； Wellsら、1986, Phil.Trans.R.Soc.Lond.A. 31
7：415-423:Hwang および Warshel, 1987, Biochem.2
6： 2669-2673； Raoら1987, Nature 328:551-554) 。

【００１０】ズブチリシン遺伝子の部位特異的突然変異
は多くの注目を浴び、種々の突然変異が以下の特許出願
および特許に記載されている：欧州特許第 0 130 756号
(ジェネンティック)(対応する米国特許第4 760 025(ジ
ェネンコー))は部位特異性または不規則に生成した”カ
ルボニルヒドロラーゼ”中の突然変異体に関し、引き続
き突然変異酵素の種々の性質、例えばKcat／Km比、pH−
活性プロファイル、および酸化安定性などを探索した。
部位特異的突然変異の可能性を示した事、ならびに特定
部位 (即ち、-1Tyr, 32Asp, 135Asn, 104 Tyr, 222Me
t, 166Gly, 64His, 169Gly, 189Phe, 33Ser, 221Ser, 2
17Tyr, 156Gluまたは152Ala) でのズブチリシンBPN'の
突然変異が別の性質を表すことを酵素に与えたとは別
に、その出願は所望の性質を持つ酵素を得るためにどこ
に突然変異を導入するかを決めるという問題を解決する
ことには寄与していない。

【００１１】欧州特許第0 214 435(ヘンケル）はズブチ
リシン カールスバーグおよびその二つの突然変異体の
クローニングと発現に関する（しかし158Aspから158ser
ならびに161Serから161aspへの突然変異の理由は与えて
いない) 。国際特許出願第WO 87/04461(アムジェン)
は、親の酵素に存在する Asn-Gly配列の数を減少させ
て、pHおよび熱安定性を表す酵素を得た。ここではズブ
チリシンBPN'の109Asnと218Asn残基の除去、変異または
修飾が強調された。国際特許出願第WO 87/05050(ジェネ
ックス) は、改善された性質のためのズブチリシンBPN'
の不規則な突然変異とそれに続く多数の突然変異体の探
索を記載し、218Asn, 131Gly, 254Tyr, 166Gly, 116Al
a, 188Ser, 126Leuおよび 53Ser位での突然変異を記載
する。

【００１２】欧州特許第 0 251 446号 (ジェネンティッ
ク）は、第一および第三次構造レベルでのホモロジーの
考察を、同等のアミノ酸残基が、保存されているか、否
かを同定するためにどのように応用できるかを記載す
る。この情報は、ズブチリシンBPN'の三次構造に関する
著者の知識とともに、突然変異が可能な多くの部位の選
択を導き、これらは改変した性質をもつ突然変異体を得
るために期待されるものである。そのように同定された
部位としては、124Met, 222Met , 104Tyr, 152Ala, 156
Glu, 166Gly, 169Gly, 189Phe, 217Tyr 、である。

【００１３】また 155Asn, 21Tyr, 22Thr, 24Ser, 32As
p, 33Ser, 36Asp, 46Gly, 48Ala,49Ser, 50Met, 77Asn,
87Ser, 94Lys, 95Val, 96Leu, 107Ile, 110Gly, 170Ly
s, 171Tyr, 172Pro, 197Asp, 199Met, 204Ser, 213Lys
および221Serも酵素の種々の性質に影響を有すると同定
され、これらの提案を支持する多くの突然変異体が例示
された。これらの部位での単一突然変異に加えて、著者
は多くの複数部位の突然変異も行った。さらに著者は、
215Gly, 67His, 126Leu, 135Leuおよび97-103, 126-12
9, 213-215および 152-172の部分内のアミノ酸残基を、
興味あるものと同定したが、これらの部位での突然変異
は実施していない。

【００１４】欧州特許第0 260 105(ジェネンコー) は、
触媒的な三組を含有する酵素中の特定の性質を改変する
ことを記載し、これは触媒的な三組から約15Ａ内のアミ
ノ酸を選択し、選択したアミノ酸をもうひとつのアミノ
酸と交換することによる。本明細書に記載されたズブチ
リシンタイプの酵素は、特に触媒的な三組を含有する酵
素の種類に属すると言われている。ズブチリシンの 222
および 217位は置換するに好ましい位置として指示され
ている。

【００１５】Thomas, Russell およびFersht (Nature
(1985) 318, 375-376) により、ズブチリシンの 99Asp
を 99Serへ変換することにより酵素のpH依存性が変化す
ることが表された。引き続づいて、同じ著者は記事(J.M
ol.Biol. (1987) 193, 803-813) で156Gluに代えて156S
erの置換も検討している。これらの突然変異は活性な 6
4Hisから約15Ａ離れた中にある。

【００１６】Nature, 328, 496-500 (1987) では、 Rus
sellおよびFershtは、彼らの実験結果を討論し、pH−活
性プルファイルを変更するための規則を与え、これは酵
素を突然変異させ、表面電荷を変えることによる。現在
以下のズブチリシンプロテアーゼが知られており、それ
らの多くが世界中の多くの国で、特に洗剤用として販売
されている：ズブチリシンBPN'またはNovo、例えば米
国、セントルイス、シグマから市販されている：

【００１７】ズブチリシン カールスバーグ、Novo-Nor
disk A/S（デンマーク) からALCALASE (TM) として、な
らびに IBIS(オランダ) からMAXATASE(TM)として市販さ
れている：バチルス レンテス ズブチリシン、Novo-N
ordisk A/S（デンマーク）からSAVINASE (TM) として市
販されている：SAVINASE (TM) の同類として、MAXACEL
(TM) がIBISから、ならびにOPTICLEAN(TM) (オランダ)
がMiles Chemie (ドイツ) から市販されている：バチル
ス レンテス ズブチリシン、Novo-Nordisk A/S（デン
マーク）からESPERASE (TM) として市販されている：KA
ZUSASE (TM) が昭和電工 (日本) により市販されてい
る。

【００１８】例えば、ズブチリシンは他の酵素 (他の基
質に対して活性である) と組み合わせて使用することも
でき、選択したズブチリシンはそのような酵素に対して
安定性を有するべきであり、また選択したズブチリシン
は好ましくは他の酵素を消化すべきではない。また選択
したズブチリシンは洗剤配合物中の他の成分、例えば漂
白剤、酸化剤などに対して耐性であるべきであり、特に
洗剤配合物中で使用される酵素は、保存中および洗浄中
の液体中での洗剤中の非−酵素的成分により形成される
酸化粉末、カルシウム結合性質、洗浄性およびpH状態に
関して安定であるべきである。洗浄液中で安定に維持さ
れる酵素能力は、しばしば洗浄能力または洗浄力といわ
れる。

【００１９】天然ズブチリシンは、その洗浄力、すなわ
ちpHおよびイオン強度などの種々のパラメーター下での
能力に関して高度に可変であるということが分かった。
上記市販されている洗剤用プロテアーゼのいくつかは、
まさに約20年以上前から販売されているものよりもよい
性能を有するが、各酵素の至適性能は配合および洗浄力
に関してそれに特有の条件があり、それは例えばpH、温
度、イオン強度（Ｉ）、活性系、ビルダーなどである。
結果として、低いpHおよび低いＩで所望の性質を有する
酵素はよりアルカリ性の条件では望ましくなく、逆も言
えることが見いだされた。

【００２０】さらに、洗浄過程で起こる洗浄液のpH変化
に対して比較的耐性である酵素を製造および使用するこ
とがのぞましい。現在、所望のアミノ酸配列を有する酵
素を構築することが可能であり、上記のように変更した
ズブチリシンの性質を構築するためにかなりの研究が費
やされた。多くの突然変異酵素を生産および探索する方
法が提案された中で、欧州特許第0 130 756(ジェネンテ
ィック)(米国特許第4,760,025) (ジェネンコー))および
国際特許出願WO 87/05050(ジェネックス))は天然酵素の
単離およびその性質についてのそれらのスクリーニング
の古典的方法に対応するが、より効果的ではある。

【００２１】ズブチリシンプロテアーゼはそれぞれが天
然に存在し得る20のアミノ酸の１つであり得る約 275ア
ミノ酸残基から典型的に構成されるので、その操作で
は、一次スクリーニングにおいて注目の性質を示す選択
された変異体をさらに試験するに先立って、生成した極
めて多数の変異体を予備スクリーニングにかけなければ
ならないという重大な欠点がある。これはまたたとえ
ば、洗浄液の特別な条件下で改良された洗浄能力を表す
洗浄用組成物を配合する場合のような目的の使用につい
て、改良された性質を持つ所望の酵素を得るためにどの
アミノ酸残基を変異させるかというガイドラインが示め
されていないからである。

【００２２】これらの特許出願に概略された方法は、従
って、従来の長い間知られたランダム突然変異法よりわ
ずかによいだけである。他の既知の技術は、加水分解速
度 (欧州特許第0 260 105(ジェネンコー))およびpH−活
性プロファイル (Thomasおよび Russell、およびFersh
t、同上) のような、特定な性質を変更させることに関
する。これらの出版物のどれも酵素の洗浄性能すなわち
"洗浄力" を変更することに関連しない。まさに、その
ようによく知られた酵素の性質と酵素の洗浄性能すなわ
ち "洗浄力" との間の関係はよく同定されていない。

【００２３】国際特許出願第WO (89/06279 (PCT/DK 88/
00002) (NovoインダストリーＡ／Ｓ）は、どのアミノ酸
を変更すべきであるか、および洗浄力において所望の変
更を得るためにどのアミノ酸を導入すべきであるかを決
定するためのホモロジー比較の概念の使用を提案してい
る。（出版されていないが）欧州特許出願第90306952.4
(Unilever)は、変更されたpIを持つ突然変異ズブチリ
シンプロテアーゼの生産と使用、ならびにそれらを含有
する洗浄組成物を記載する。

【００２４】残る課題は、多くの研究がプロテアーゼ酵
素作用の機構を明らかにすることを対象としたが、それ
らを洗浄性能に関して酵素の性質を決定する、構造とア
ミノ酸残基の組合せはいまだ少しも知られていないこと
にあると思われる。結局、洗浄システムに対するプロテ
アーゼ酵素の改良と作成についての必要性が、掃除用ま
たは洗剤用組成物として実際に使用する際のプロテアー
ゼ作用機構のよりよい理解と同様に未だ存在する。

【００２５】発明の説明 本発明の内容において、突然変異プロテアーゼ、例えば
突然変異ズブチリシンプロテアーゼは、元々の又は親遺
伝子を有しそして対応する親酵素を生産する親微生物か
ら誘導された突然変異遺伝子を発現している生物により
生産されたプロテアーゼを意味し、親遺伝子は突然変異
遺伝子を生産するために突然変異され、これにより安定
な宿主中で発現された時に該突然変異プロテアーゼが生
産される。上記のように細菌および真菌起源のプロテア
ーゼは、特にズブチリシンプロテアーゼはそれらが特に
洗剤および掃除用組成物において有用であり、それは例
えば洗濯用洗剤のようなものである。

【００２６】ズブチリシンおよび他のアルカリプロテア
ーゼはアルカリ性の洗浄条件にある程度耐えることがで
き、それにより実際の使用が可能になるものである。に
もかかわらず、それらはアルカリ領域のpHへの活性およ
び安定依存性を示し、酵素の性質が現在までに入手し得
るものよりもよりアルカリpH領域で扱いやすい酵素調製
物が望まれる。ひとつの観点において本発明は、rDNA法
で製造されるプロテアーゼ (例えばズブチリシンプロテ
アーゼ) を提供することであり、これはそのアミノ酸配
列において、少なくともひとつの突然変異を有し、親の
プロテアーゼと比較すると、pH領域にわたって分子荷電
の低度の変化を示す (例えばpH領域にわたり荷電が実質
的に一定に到達する、例えば中性に到達する) 。

【００２７】また本発明により提供されるのは、例えば
洗剤用界面活性剤および洗剤用添加物に加えて、rDNA法
により生産されたプロテアーゼ (これはそのアミノ酸配
列において、少なくともひとつの突然変異を有し、親の
プロテアーゼと比較するとpH領域にわたって分子の荷電
の低度の変化を示す (例えばpH領域にわたり荷電の実質
的一定性に到達する、例えば中性に到達する))を含む酵
素的洗剤用組成物である。本発明によれば、そのような
分子電荷の低度の変化により (特に例えばpH領域にわた
って分子電荷が実質的に中性または一定である) 、洗剤
用配合構成物の柔軟性を提供し、幾つかの場合において
は所望のpHに近いpHを有する洗剤の配合を可能にする。
そのような酵素はまた使用中に、野生型酵素よりもpH変
化に対してより感度が低い。

【００２８】そのような突然変異酵素は、洗剤用または
掃除用組成物の一部として使用した時、活性、安定性、
および／または洗剤性能において、そして／またはより
広範囲のpH領域にわたって使用されるという点で利点を
もたらすことができる。そのような突然変異酵素は、洗
浄液のpH変化に対する感度の減少を示すことにより衣類
洗濯サイクル中の望ましくない性能変化を減少すること
ができる。そのような酵素は、実質的に均等な性能をも
って、比較的高いまたは比較的低いpHの洗剤において適
用することができる。

【００２９】ズブチリシンプロテアーゼのなかで広く使
用されているもののひとつ（ズブチリシン309 、上記)
はpH領域７から11にわたり、低pHでの約＋５から高pHで
の約−３までの、分子あたり約８単位の正味の分子荷電
の変化に反映されるpHに対する感受性を示す。本発明に
包含される突然変異酵素の例は、野性型酵素に比べて、
pHによる変化が小さく、例えば分子荷電の変化が実質的
に小さく、実質的な一定値に達し、ある場合には分子荷
電の中性に達し、例えばpH範囲が約８から約11、場合に
よってはより広い約７から約11の多少広がりのあるpH領
域において、その変化はある場合は分子あたり５電荷単
位より小さく、例えば分子あたり３電荷より小さな変化
であり、さらにある場合は分子あたり約１電荷より小さ
い。

【００３０】最も普通には、荷電はpHの上昇に伴いより
陰性になる。突然変異プロテアーゼが、pHに対応して分
子の荷電の小さい割合の変化を表せば十分であるが、こ
のpH範囲はpH７から11の範囲をあまり超えず、例えばす
くなくとも 0.5pH単位のpH領域にわたって、例えば少な
くとも１pH単位、例えば少なくとも２または３pH単位に
わたり、そのようなあまり超えない範囲はpH領域約７か
ら約11内に位置し、例えば約pH８から約pH11に位置す
る。pHに対する減少した電荷変化の領域内の、pH値での
分子電荷は、分子あたり約＋５から約−３電荷単位の間
にあり、例えば＋３から−１単位範囲内にあり、正味の
電荷は＋／−１，例えば＋／−0.5 、例えばゼロに近い
かまたはわずかに陽性である。

【００３１】ある場合には、プロテアーゼの正味の電荷
は、分子あたり＋／−１またはより狭くは＋／−0.5 電
荷の変化の範囲で、例えばほとんど一定、すなわちほと
んどゼロに維持されることができる。本発明の態様によ
る突然変異酵素は、一般的に知られているrDNA法を応用
して作ることができ、これは例えば上記の出版物および
本明細書の引用参照に述べられている（引用により本明
細書に編入された）。以下に述べる本発明による突然変
異酵素の態様は、タンパク質に天然に存在するアミノ酸
の以下の省略記号を参照することにより特定される：

【００３２】 Ａ＝ Ala＝アラニン Ｖ＝ Val＝バリン Ｌ＝ Leu＝ロイシン Ｉ＝ Ile＝イソロイシン Ｐ＝ Pro＝プロリン Ｆ＝ Phe＝フェニルアラニン Ｗ＝ Trp＝トリプトファン Ｍ＝ Met＝メチオニン Ｇ＝ Gly＝グリシン Ｓ＝ Ser＝セリン Ｔ＝ Thr＝スレオニン Ｃ＝ Cys＝システイン Ｙ＝ Tyr＝チロシン Ｎ＝ Asn＝アスパラギン Ｑ＝ Gln＝グルタミン Ｄ＝ Asp＝アスパラギン酸 Ｅ＝ Glu＝グルタミン酸 Ｋ＝ Lys＝リシン Ｒ＝ Arg＝アルギニン Ｈ＝ His＝ヒスチジン Ｂ＝ Asx＝ AspまたはAsn Ｚ＝ Glx＝ GluまたはGln

【００３３】ここに本発明に従い作成された突然変異０
の対象の番号づけられたアミノ酸配列位置への言及は、
ズブチリシンBPN'の配列中にあるアミノ酸残基およびそ
の番号への言及である。本発明はまた、他のズブチリシ
ンプロテアーゼ（例えばその配列が国際特許出願第WO
91/00345の表Ｉに与えられたもの、それを引用により本
明細書に編入される）を含む。ここで言及する番号づけ
された突然変異部位をそのような他のプロテアーゼに適
用するためには、ズブチリシンBPN'と最大のホモロジー
を有するという意味で参考の番号部分は、そのようなも
うひとつのホモロガスなズブチリシンプロテアーゼの対
応する部位への言及として理解されるべきである。

【００３４】そのような対応部分は、他のBPN'の遺伝子
との比較により、そのような他のプロテアーゼの遺伝子
中の明らかな削除と挿入の理由により番号が他のプロテ
アーゼの鎖に沿って異なるかもしれない。該表におい
て、アミノ酸の削除または欠損は’＊’で、BPN'に比較
して挿入となるものは位置番号に付された小文字のアル
ファベットで示される。

【００３５】本発明によれば、突然変異ズブチリシン酵
素は、ズブチリシンBPN'、ズブチリシンアミロサッカリ
ティクス、ズブチリシン168 、ズブチリシンメッセント
リコペプチダーゼ、ズブチリシンカールスバーグ、ズブ
チリシンDY、ズブチリシン309 、ズブチリシン147 、サ
ーミターゼ、バチルスPB92プロテアーゼおよびプロティ
ナーゼＫから選択された親の酵素の突然変異を表すこと
が好ましく、好ましくはズブチリシン309 、ズブチリシ
ン147 、ズブチリシンカールスバーグ、アクアリシンま
たはバチルスPB92プロテアーゼである。

【００３６】本発明の範囲にある有用なズブチリシンプ
ロテアーゼは、リシン、ヒスチジン、システインかつ／
またはチロシン残基（これはしばしば滴定値(titrate)
または pKa値が８−11の範囲中にある) を持ち、それら
が非−滴定(non-titrating)残基、またはその範囲外の
pKa値、又は場合によっては７−12以外の範囲にある残
基（特にチロシン以外の残基)(例えばリシンまたはシス
テインからアルギニン、ロイシン、スレオニン、アスパ
ラギン、グルタミン酸またはアスパラギン酸へ；チロシ
ンからフェニルアラニン、スレオニン、バリン、トリプ
トファンまたはグルタミン酸へ；ヒスチジンからグルタ
ミン、アスパラギン、セリン、グルタミン酸またはアス
パラギン酸へ）により置換される。

【００３７】特に、本発明の態様は以下の突然変異また
は突然変異の組み合わせを指示した部位に導入すること
ができる：H17Q, K27R, H39S, E54D, Y91F, K94R, H120
D, H120N, Y167E, Y167F, Y171V,Y192E, Y192F, Y209F,
Y214T, H226S, K235L, K235R, K237R, K251E, K251N,Y
263F.E54DおよびK94Rの突然変異は通常一緒に導入され
るべきである。突然変異の例はさらに次のように分けら
れる:

【００３８】 a - K27R; b - H17Q+K27R+H39S; c - E54D+Y91F+K94R; d - E54D+Y91F+K94R+H120D; e - E54D+Y91F+K94R+H120N; f - Y167F+Y171V+Y192F+Y209F+Y214T; g - K235L+K237R+K251E+Y263F; h - K235L+K237R+K251N+Y263F; i - H226S+K235L+K237R+K251N+Y263F; k - H226S+K235L+K237R+K251E+Y263F; g′- K235R+K237R+K251E+Y263F; h′- K235R+K237R+K251N+Y263F; i′- H226S+K235R+K237R+K251N+Y263F; k′- H226S+K235R+K237R+K251E+Y263F.

【００３９】従って、本発明の態様はａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ，
ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋ，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ，ｂ
＋ｄ＋ｆ＋ｋ，ａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ′，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ′，
ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋ′，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ′，ｂ＋ｄ＋ｆ＋
ｋ′、に対応する組み合わせの突然変異を有する例も含
み、ここで文字は上のパラグラフで示した変異又は変異
の組合せを示す。目的の突然変異プロテアーゼの特別な
例は次のごとくである：

【００４０】 Ａ：K27R; Ｂ：K235R+K237R+K251E+Y263F; Ｃ：E54D+Y91F+K94R; Ｄ：K27R+E54D+Y91F+K94R+Y209F+Y214T+K235R+K237R+K2
51E+Y263F; Ｅ：K27R+E54D+Y91F+K94R+Y167F+Y171V+Y192F+Y209F+Y2
14T+K235R+K237R+K251E+Y263F (すべてのＹ，Ｋが変
化）； Ｆ：Ｄ残基に電荷を加え、そしてひとつのＥ残基に電荷
を加えたさらに二つの突然変異を有する突然変異体Ｅ Ｇ：17, 39, 120, 226位のヒスチジンに中性残基のさら
なる突然変異を有する突然変異体Ｆ、 Ｈ：Ｎ−末端が化学的に修飾されて（ブロック）中性基
を与えるか、またはpKaが７から12の範囲外にある基を
与える突然変異体Ｇ プロテアーゼＡからＨの滴定曲線（計算した）は、野生
型ズブチリシン309 と一致し、添付の図１から３に与え
られる。

【００４１】上記プロテアーゼＨに関連して記載したよ
うに、そして一般的に応用できるものとして、プロテア
ーゼ（ポリペプチドの環境においてしばしば約８の pKa
を有する) のＮ−末端アミノ基を修飾することも有用で
あり、これは例えば微生物により生産された後のプロテ
アーゼをアシル化またはアルキル化するための修飾試薬
による。これは、８−11のアルカリpHでの電荷の安定化
の程度に寄与するためには、例えばブロッキング処理の
結果によりＮ−末端のアミノ基をpKa が約８−11、例え
ば約７−12の外にある基で置換して配置することによ
る。

【００４２】適当な方法は例えば”タンパク質の化学的
修飾 (Chemical Modification of Protein" G.E.Means,
R.E.Feeney, 1971ホルデンデイ社 (Holden Day Inc.)
サンフランシスコ、およびFinn Wold による "タンパク
質のインビボ修飾 (In VivoChemical Modification of
Proteins)", Ann.Rev Biochem 50 (1981), 783-814に開
示されている。最適な方法は、（ｉ）例えばエチルアセ
トアミドと反応させることによりアミノ基をホモグアニ
ジウム基に転換するか、または０−メチルイソウレアで
グアニジル化することにより、末端アミノ基を修飾し
て、より高いpHの正電荷基を残す、（ii）Ｎ−末端を無
水酢酸によりアセチル化することにより、またはシアネ
ートでカルバミル化することにより中和する、または
（iii ）末端−アミノ基を例えば無水コハク酸でアシル
化することにより負電荷基に転換する、工程を含む。こ
れらの方法は接近可能なリシン残基に影響する。

【００４３】本発明はまた、本発明の突然変異酵素を、
掃除および洗剤組成物中に使用することから成り、そし
てそのような突然変異酵素を含む掃除および洗剤組成物
にまで広がる。これらの酵素は洗剤組成物中に既知の量
で使用できる。その量は非常に広い範囲に変化し、洗剤
組成物のグラムあたりアンソン単位(Anson) で例えば約
0.0002−0.01、例えば約0.005-0.05である。他の単位で
表せば、プロテアーゼ組成物中に、洗剤配合物あたり約
0.1 − 100GU／mg（例えば１−50、特に５−20GU／mg)
のオーダーで、または任意に洗剤配合物あたり約0.01−
４、例えば 0.1−0.4 kNPUを中心とした広範囲の量であ
る。

【００４４】KNPUは、Novo Nordisk A/Sにより発表され
た技術的文書中に定義されたものである。GUはグリシン
単位であり、これは標準的な条件下で、40℃で15分間Ｎ
−アセチルカゼインを基質としてインキュベーションす
る間に、１マイクロモルのグリシンと等量のNH₂ 基を生
成するタンパク質溶解酵素活性として定義される。例え
ば、リットル当たり0.08kNPUのオーダーの酵素活性に対
応して本発明の酵素を洗濯液１リットルあたり約0.25mg
の割合で使用することが適当である。対応する洗剤配合
物は例えば 0.1−0.4KNPU ／ｇのオーダーの量で含有で
きる。

【００４５】そのような組成物は、本発明の前述の任意
の観点に従った突然変異ズブチリシン酵素の任意のひと
つ又はそれ以上のみに加えて、当業者に周知のそのよう
な組成物中に含まれる成分を含む。そのような成分は、
リン酸またはゼオライト研摩剤のようなビルダー、アニ
オン、カチオンまたは非−イオン性のような界面活性
剤、アクリル酸または同等のポリマーのようなポリマ
ー、過硼酸塩−またはアミノ酸−含有漂白前駆体または
活性化剤のような漂白系、シリケート構造物のような構
造物、pHを調整するためのアルカリまたは酸、除湿剤お
よび、または中性有機塩を含む。洗剤組成物はさらに酵
素を含有する。

【００４６】例えば、欧州特許第258068中のNovo Nordi
sk A/Sのリパーゼおよびリポラーゼおよび他の酵素組成
物を、キャリアー物質とともにリパーゼ酵素の粒状組成
物として加えることができる（別法として溶液またはス
ラリーで）。リパーゼの添加量は、広い範囲で選択で
き、例えばグラムあたりの界面活性剤系または洗剤組成
物に50から30,000LU／ｇ、例えば頻繁には少なくとも 1
00LU／ｇ、大変有効には少なくとも 500LU／ｇ、しばし
ば好ましくは1000, 2000LU／ｇまたは4000LU／ｇ以上で
あり、従って最も頻繁には50−4000LU／ｇの範囲内、そ
して可能な範囲は200 −1000LU／ｇである。このリパー
ゼ単位の仕様は、欧州特許第258068に定義されたもので
ある。

【００４７】脂肪溶解酵素は広範なリパーゼから選択で
きる：特に以下の特許明細書に記載されたリパーゼ、欧
州特許第214761号 (Novo Nordisk A/S) 、欧州特許第 0
258068号および特にサーモマイセス ラヌギオネスス
(Thermomyces lanuginosus)ATCC 22070 からのリパーゼ
に対して生じる抗血清に免疫的交差反応を表すリパー
ゼ、欧州特許第 0 205 208号および欧州特許第 0 206 3
90号、そして特にクロモバクター ビスコスム バー
リポリティクム (Chromobacter viscosum varlipolytic
um)NRRL B-3673からの、またはアルカリジーンズ (Alca
ligenes) PL-679, ATCC31371および FERM-P 3783からの
リパーゼに対して生じる抗血清に免疫的交差反応を表す
リパーゼ、またWO87/00859 (ギスト−ブローカデス) お
よび欧州特許第0 204 284(サッポロビール) の明細書。

【００４８】特に有用なものは、例えば以下の市販され
ているリパーゼ組成物である：Novoリパーゼ、アマノ
リパーゼCE P, B, AP, M-AP, AMLおよび CESおよびメイ
トーリパーゼMY-30, OF,およびPL, またエステラーゼ
(Esterase) MM、リポザイム (Lipozyme), SP225, SP28
5、サイカン リパーゼ、エンゼコリパーゼ、トーヨー
ジョゾーリパーゼおよびダイオシンスリパーゼ (商標)
である。

【００４９】これらのさらなるリパーゼ酵素の遺伝子工
学は、適当なリパーゼ遺伝子 (例えばサーモマイセス
ラヌギオネススからのリパーゼ遺伝子またはその突然変
異体) の抽出、例えばアスペルギルスなどの適当な生産
体生物中にその遺伝子またはその誘導体を導入、発現さ
せて達成される。その方法は、WO 88/02775(Novo Nordi
sk A/S) 、欧州特許第 0243338号(Labofin) または欧州
特許第 0268452号 (ジェネンコー) および注目すべきは
欧州特許第 0305216号(Novo Nordisk A/S)または欧州特
許第0283075(ギスト−ブローカデス) が適用できる。

【００５０】他の酵素における同様の考察がミュータシ
ス ミュータンデス(Mutatis Mutandis)にも適用でき、
これもまた存在する。制限する事なく：例えば所望によ
りアミラーゼも使用でき、その範囲はグラムあたりの洗
剤組成物あたり約１から約 100MUの範囲の量であり (マ
ルトース単位)(または 0.014−1.4 、例えば0.07−0.7K
NU／ｇ)(Novo単位) である。例えばセルラーゼも所望に
より使用でき、それはグラムあたりの洗剤組成物あたり
約 0.3から35CEVU単位の範囲の量である。

【００５１】本発明の洗剤組成物中に通常量で存在でき
る有用な洗剤成分は以下のとおりである。組成物は構築
されてもされてなくてもよく、そしてゼロ−Ｐ（すなわ
ちリン酸含有ビルダーは含有しない）であることができ
る。従って組成物は例えば１−50％から、例えば少なく
とも5 ％、そしてより頻繁には35−40重量％までのひと
つまたはそれ以上の有機および／または無機ビルダーの
凝集物を含んでもよい。ビルダーの典型的な例は上記に
述べたものを含む他、より広範にはアルカリ金属、オル
ト、ピロ、およびトリポリフォスフェート、アルカリ金
属カーボネイト、方解石、アルカリ金属クエン酸塩、ア
ルカリ金属ニトリロトリ酢酸塩、カーボキシメチルオキ
シサクシネート、ゼオライトポリアセタールカルボキシ
レートなどの単独または混合物を含む。

【００５２】さらに、洗剤組成物は１−35％の漂白剤、
または漂白前駆体、または漂白剤および／またはその活
性化剤の前駆体とともになるシステムを含んでもよい。
さらに随意の成分として、気泡増進剤、消泡剤、抗−腐
食剤、汚れ沈殿防止剤、金属イオン封鎖剤、抗−汚れ再
付着剤、香料、染料、酵素のための安定化剤などであ
る。

【００５３】組成物を、特に限定的にではなく、綿およ
びポリエステルを基本とした、またはそれらの混合物の
衣料材料を洗濯するために使用できる。例えば特に、約
60−65℃またはそれより低い、例えば約30−35℃または
それより低い温度で行われる洗濯に適する。洗濯液中の
界面活性剤１リットルあたり約 0.4−0.8 ｇ提供するこ
の為に十分な量の組成物を使用することが適当である
が、所望によりより少ない、またはより多い使用も可能
である。限定的にではなく、例えば約１から10ｇ／Ｌ、
例えば約３−６ｇ／Ｌの洗剤配合物の使用割合が、実施
例と実質的に同じ配合物の場合には適当である。

【００５４】本発明の観点の中にある洗剤組成物の特別
な形態には： ａ）リン酸ビルダー、アニオン性界面活性剤、非イオン
性界面活性剤、アクリル酸または同等のポリマー、過硼
酸塩漂白前駆体、アミノ−含有漂白活性化剤、シリケー
ト又は他の構造体、使用に適するpHに調整するアルカ
リ、および中性有機塩を含有する洗剤粉末として配合さ
れた洗剤組成物。 ｂ）ゼオライトビルダー、アニオン性界面活性剤、非イ
オン性界面活性剤、アクリル酸または同等のポリマー、
過硼酸塩漂白前駆体、アミノ−含有漂白活性化剤、シリ
ケート又は他の構造体、使用に適するpHに調整するアル
カリ、および中性有機塩を含有する洗剤粉末として配合
された洗剤組成物。 ｃ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、有
機酸、苛性アルカリ、９から10の間の値に調整されたpH
の液体洗剤として配合された洗剤組成物。

【００５５】ｄ）本質的に直線状アルコキシル化一級ア
ルコール、トリアセチン、三リン酸ナトリウム、苛性ア
ルカリ、過硼酸モノハイドレイト漂白前駆体、三級アミ
ン漂白活性化剤、９から10の間の値に調整されたpHから
成る液体非イオン性界面活性剤を含む非水性液体洗剤と
して配合された洗剤組成物。 ｅ）アニオン性界面活性剤および各アルコキシル化度が
約７と約３との非イオン性界面活性剤の混合物、低い、
または実質的にゼロである中性無機塩、リン酸ビルダ
ー、過硼酸塩漂白前駆体、三級アミン漂白活性化剤、シ
リケートナトリウム、そしてマイナーズ(minors)および
湿度を含有する少なくとも 600ｇ／Ｌのバルク密度を持
つ粒質物の形態である洗剤粉末として配合された洗剤組
成物。

【００５６】ｆ）アニオン性界面活性剤および各アルコ
キシル化度が約７と約３との非イオン性界面活性剤の混
合物、低い、または実質的にゼロである中性無機塩、ゼ
オライトビルダー、過硼酸塩漂白前駆体、三級アミン漂
白活性化剤、シリケートナトリウム、そして微量物質お
よび湿分を含有する少なくとも 600ｇ／Ｌのバルク密度
を持つ粒質物の形態である洗剤粉末として配合された洗
剤組成物。 ｇ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ア
クリル酸ポリマー、脂肪酸石鹸、炭酸ナトリウム、硫酸
ナトリウム、粘度粒子、過硼酸塩漂白前駆体、三級アミ
ン漂白活性化剤、シリケートナトリウム、そして微量物
質および湿分を含有する洗剤粉末として配合された洗剤
組成物。

【００５７】ｈ）牛脂とココナッツ油との全−鹸化混合
物に基づく石鹸、オルトリン酸で中和化し、プロテアー
ゼを混合し、またギ酸ナトリウム、ホウ砂、プロピレン
グリコールおよび硫酸ナトリウムとを混合し、そしてさ
らに石鹸生産ラインで作られた（石鹸）棒洗剤として配
合された洗剤組成物。 ｊ）１リットルの界面活性剤あたり 0.4− 0.8ｇ／Ｌに
対応する割合で使用される時、洗浄液のpHを９またはそ
れより低くするように配合された、酵素洗剤組成物。 ｋ）１リットルの界面活性剤あたり 0.4− 0.8ｇ／Ｌに
対応する割合で使用される時、洗浄液のpHを 8.5または
それより高くするように配合された、酵素洗剤組成物。

【００５８】ｌ）１リットルの界面活性剤あたり 0.4−
0.8ｇ／Ｌに対応する割合で使用される時、洗浄液のイ
オン強度を0.03またはそれより低く、例えば0.02または
それより低くするように配合された、酵素洗剤組成物。 ｍ）１リットルの界面活性剤あたり 0.4− 0.8ｇ／Ｌに
対応する割合で使用される時、洗浄液のイオン強度を0.
01またはそれより高く、例えば0.02またはそれより高く
するように配合された、酵素洗剤組成物。本発明はさら
に以下の実施例および付随する図面により説明される。

【００５９】実施例 実施例Ａ、添付図面の図１−３及び図４〜11は適当なrD
NA法による本発明の変種プロテアーゼの構成に係わり、
さらにはプロテアーゼの製造に有用な突然変異を誘発さ
せた遺伝子、ベクター及び変異体及び形質転換微生物に
係わる。実施例Ｂは実施例Ａのプロテアーゼを含む洗剤
の組成とその性能テストの結果に係わる。実施例Ｄ１−
Ｄ14は本発明のプロテアーゼを適当に組込むことのでき
るその他の洗剤組成に係わる。

【００６０】実施例Ａ： Ｉ：遺伝子に突然変異を導入する種々の方法が既に公知
となっている。サブチリシン遺伝子のクローン化に関し
て概説したのち、サブチリシン遺伝子内の不特定部位及
び特定部位に突然変異を発生させる方法を説明する。

【００６１】公知の種々の方法によりグラム陽性の細菌
または真菌からサブチリシンをコードする遺伝子をクロ
ーン化することができる。先ず、研究対象たるサブチリ
シンを産生する生物体からの染色体 DNAまたはメッセン
ジャーRNA を利用して DNAのゲノムライブラリー及び／
またはcDNAライブラリーを構成しなければならない。次
いで、もしサブチリシンのアミノ酸配列が判明している
なら、相同性の標識付きオリゴヌクレオチド・プローブ
を合成し、これを利用することによって細菌 DNAのゲノ
ム・ライブラリーからの、または真菌cDNAライブラリー
からのサブチリシン・コード化クローンを識別すればよ
い。これに代わる方法として、他の菌株に属する細菌ま
たは真菌からのサブチリシンと相同の配列を含む標識付
きオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、比較的
ゆるやかなハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用
することによってサブチリシン・コード化クローンを識
別することも可能である。

【００６２】サブチリシン産生クローンを識別する他の
方法では、ゲノム DNAのフラグメントを例えばプラスミ
ドのような発現ベクターに挿入し、得られたゲノム DNA
ライブラリーでプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、次
いでサブチリシンの基質、例えばスキムミルクを含有す
る寒天培地で形質転換細菌を平板培養する。サブチリシ
ン支持プラスミドを含有するこの細菌は排出されるサブ
チリシンがスキムミルクを消化することで、透明な寒天
培地の輪によって囲まれたコロニーを産生する。

【００６３】サブチリシン遺伝子をクローン化してプラ
スミドのような適当なベクターに導入したら、あとはい
くつかの方法を利用することによって遺伝子に不特定
（ランダム）突然変異を導入することができる。１つの
方法として、検索可能なベクターの一部としてクローン
化サブチリシン遺伝子を大腸菌の突然変異誘発菌株に組
込む。

【００６４】他の方法では、１本鎖形のサブチリシン遺
伝子を発生させ、サブチリシン遺伝子の一部が１本鎖の
ままとなるようにサブチリシン遺伝子を含有する DNAの
フラグメントを他の DNAフラグメントと共にアニールす
る。この孤立した１本鎖領域に任意の突然変異誘発剤、
例えば亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜硝
酸、ギ酸、またはヒドララジンを作用させる。まお、突
然変異誘発剤は上記例に限らない。不特定（ランダム）
突然変異を発生させるこの方法の１例は Shortle及び N
atbansの論文 (1978, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 7
5：2170-2174)に記載されている。 Shortle及び Natban
sの方法によれば、サブチリシン遺伝子を支持するプラ
スミドを、遺伝子の内部で開裂する制限酵素によってニ
ックする。 DNAポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ作
用を利用してこのニックをギャップに広げる。こうして
得られた１本鎖ギャップを、任意の上記突然変異誘発剤
を利用して突然変異させる。

【００６５】さらに他の方法では、天然プロモーター及
びその他の制御配列を含むバチルス属からのサブチリシ
ンをクローン化して、大腸菌及び枯草菌双方のレプリコ
ン、選択可能な遺伝子表現マーカー、及びヘルパー・フ
ァージIR１との重感染で１本鎖プラスミドDNA を産生す
るＭ13ori-領域を含有するプラスミド・ベクターに導入
する。クローン化サブチリシン遺伝子を含有する１本鎖
プラスミドDNA を分離し、ベクター配列は含有するがサ
ブチリシンのコーディング領域は含有しない DNAフラグ
メントと共にアニールすることによってギャップのある
二本鎖分子を得る。上述したように亜硫酸ナトリウム、
亜硝酸またはギ酸を作用させるかまたは大腸菌の突然変
異誘発菌株中で複製することによりサブチリシン遺伝子
に突然変異を導入する。

【００６６】亜硫酸ナトリウムは１本鎖DNA 中のシトシ
ンとだけ反応するから、この変異原物質による突然変異
はコーディング領域だけに制限される。反応時間及び亜
硫酸塩濃度は実験ごとに異なり、平均して各サブチリシ
ン遺伝子に対して１つまたは５つの突然変異が誘発され
るようにする。 pH6.0の４Ｍ亜硫酸ナトリウムに10マイ
クログラムのギャップのある２本鎖DNA を溶かした溶液
を 400マイクロリットルの反応容積中で９分間30℃に保
温して１本鎖領域のシトシンの約１％を脱アミノする。
DNA鎖によっても異なるが熟成サブチリシンのコーディ
ング領域は約 200個のシトシンを含有する。好都合なこ
とに、反応時間には約４分間（約１／200 の突然変異頻
度) から約20分間 (約５／200)までの幅がある。

【００６７】突然変異誘発後、試験管中でギャップを有
する分子を DNAポリメラーゼＩ（Klenowフラグメント)
で処理することにより完全な２本鎖分子を形成し、突然
変異を固定する。次いで反応性大腸菌を変異誘発原物質
処理DNA で形質転換することにより増幅された突然変異
体サブチリシンのライブラリーを産生する。エラーを生
じ易い DNAポリメラーゼが原因で変異範囲を広げる大腸
菌の Mut D株中でプラスミドDNA を培養することによっ
ても増幅された変異体ライブラリーを得ることができ
る。

【００６８】変異誘発原物質である亜硝酸及びギ酸を使
用することによって変異体ライブラリーを産生すること
もできる。これらの化学物質は亜硫酸ナトリウムのよう
に１本鎖DNA に対して特異性ではないから、突然変異誘
発反応を以下に述べる方法で進行させる。即ち、サブチ
リシン遺伝子のコーディング部分を標準的な方法によっ
てＭ13ファージ中でクローン化し、１本鎖ファージDNA
を調製する。次いで１本鎖DNA を１Ｍ， pH4.3の亜硝酸
と23℃で15−60分間に亘って、または 2.4Ｍギ酸と23℃
で１−５分間に亘って反応させる。

【００６９】このような範囲の反応時間で１／1000乃至
５／1000の突然変異頻度が得られる。変異誘発後、汎用
プライマーをアニールしてＭ13 DNAを得、変異誘発され
た１本鎖DNA をテンプレートとして使用することにより
相補結合DNA を合成し、サブチリシン遺伝子のコーディ
ング部分が完全な２本鎖となるようにする。この時点で
コーディング領域は制限酵素でＭ13ベクターから切断さ
れ、変異誘発されていない発現ベクターに結合されるか
ら、制限フラグメントだけに突然変異が起こる(Myers
等、Science 229 (1985) 242-257) 。

【００７０】サブチリシン遺伝子をクローン化し、所期
の突然変異部位が明らかになったら、合成オリゴヌクレ
オチドを利用してこの突然変異を導入することができ
る。このオリゴヌクレオチドは所期の変異誘発部位に位
置するヌクレオチド配列を含有する。変異誘発ヌクレオ
チドはオリゴヌクレオチド合成の過程で挿入される。

【００７１】好ましい方法では、サブチリシン遺伝子を
架橋する DNAの１本鎖ギャップがサブチリシン遺伝子支
持ベクター中に形成される。次いで、所期の突然変異を
生む合成ヌクレオチドをアニールして１本鎖DNA の相同
部分を得る。残るギャップをDNAポリメラーゼＩ(Klenow
フラグメント) により埋め、Ｔ４リガーゼを利用して
構成体を結合する。この方法の具体例はMorinaga等の論
文 (Biotechnology ２(1984) 646-639) に記載されてい
る。Morinaga等の論文では、制限エンドヌクレアーゼを
利用して遺伝子内のフラグメントを除去する。

【００７２】ギャップを含んでいるベクター／遺伝子を
変性させ、ハイブリダイズ処理することにより、ギャッ
プの代りにギャップ領域より外側の部位を他の制限エン
ドヌクレアーゼで裂開させられたベクター／遺伝子を得
る。遺伝子の１本鎖領域を変異誘発オリゴヌクレオチド
でハイブリダイズ処理し、残るギャップに DNAポリメラ
ーゼＩのKlenowフラグメントを埋め、挿入体をＴ４ DNA
リガーゼで結合し、１複製サイクル後、所期の変異を有
する２本鎖プラスミドを産生する。Morinaga法は新しい
制御部位を構成する余分な操作を省くから、多重部位に
おける突然変異発生を容易にする。

【００７３】米国特許第 4,760,025号 (Estell等、1988
年７月26日) はカセットを少し変更することによって多
重変異を有するオリゴヌクレオチドを導入する方法を開
示しているが、Morinaga法では長さの異なる多数のオリ
ゴヌクレオチドを導入できるから一度にもっと多様な突
然変異を導入できる。

【００７４】本発明の実施に際しては、上記の類似方法
またはこれらに代わる公知の方法によって上記の変異を
誘発されたサブチリシン遺伝子を産生することができ、
発現ベクターを利用して酵素の形で発現させることがで
きる。発現ベクターは典型的なクローニング・ベクター
の成分、即ち、微生物のゲノムに関係なく微生物におけ
る自律的なベクター複写を可能にするエレメント、及び
選択用の１つまたは２つ以上の表現マーカーを含むのが
普通であるから、一般的にはクローニング・ベクターの
定義に当てはまる。発現ベクターはプロモーター、オペ
レーター、リボソーム結合部位、トランスレーション開
始シグナル、及び必要に応じてリプレッサー遺伝子また
は種々の賦活性遺伝子をコード化する制御配列を含む。

【００７５】発現蛋白質の分泌を可能にするためには、
遺伝子のコーディング配列に先立って“シグナル配列”
を挿入すればよい。制御配列の指示下に発現させるた
め、本発明に従って処理すべき標的遺伝子をしかるべき
読み枠において制御配列と連動させる。プラスミド・ベ
クターに組込むことのでき、変異体サブチリシン遺伝子
の転写を支持できるプロモーター配列としては例えば原
核生物タイプのβ−ラクタマーゼ・プロモーター (Vill
a-Kamaroff等、Proc. Natl. Acad Sci USA 75 (1978) 3
727-3731)やタック・プロモーター (DeBoer等、Proc Na
tl Acad Sci USA80 (1983) 21-25) などが挙げられる。
さらに、Scientific American, 242 (1980) 74-94 に掲
載された"Useful proteins from recombinant bacteri
a" にも掲載されている。

【００７６】１つの態様では、変異誘発された DNAを担
持する発現ベクターによって枯草菌を形質転換する。枯
草菌のような分泌微生物において発現させたい場合、シ
グナル配列が翻訳開始シグナルにつづき、問題の DNA配
列に先行すればよい。シグナル配列は発現産生物を細胞
壁へ運び、細胞壁において産生物は分泌と同時に産生物
から分離する。上記の用語“制御配列”はもしシグナル
配列が存在するならこのシグナル配列をも含むものとす
る。

【００７７】II：本発明の実施例に従って野性型及び変
種のプロテアーゼ酵素の遺伝情報を指定するための遺伝
子を構成し、発現させる好ましい方法を示す以下に述べ
る実施例では下記の材料に言及する：枯草菌309 及び 1
47はバシルス・レンタス(Bacillus lentus) の変種であ
り、NCIBに寄託され、受理番号NCIB 10147及びNCIB 103
09を与えられ、米国特許第 3723 250号に記載されてお
り、該特許の内容を引用により本願明細書中に組み入れ
る。

【００７８】大腸菌MC1000 (M.J.Casadaban 及びS.N.Co
hen, J Mol Boil 138 (1980) 179-207) は公知の方法に
よりγ−ｍ＋にされたものであり、米国特許出願第 03
9,298号にも記載されている。サブチリシン309 及びそ
の変異体の遺伝情報を指定する合成遺伝子に適したベク
ターを構成した。これは本質的には pUC19プラスミド
(C.Yanish-Perron 及びJ.Messing, Gene 33 (1985) 103
-119) であり、多重クローニング部位が遺伝子を構成す
る５個のサブフラグメントを分離するための制限部位を
含むリンカーに置き換えられている。新しいリンカーを
Eco RI-Hin dIII 切断 pUC19に挿入してこの制限部位を
破壊した。

【００７９】

【化１】

【００８０】サブチリシン309 の熟成部分の遺伝情報を
指定する合成遺伝子を以下に説明し、添付図面の図４〜
18に示すように構成した。合成遺伝子の構造は図４〜14
に、構成に使用されるフラグメントと共に略示してあ
る。各サブフラグメントは６乃至12個のオリゴヌクレオ
チドから成る。このオリゴヌクレオチドは調節ガラス支
持板上のフォスフォラミダイト化学を利用する自動 DNA
シンセサイザーでオリゴヌクレオチドを合成した (S.L.
Beaucage及びM.H.Carruthers, Tetrahedron Letters 22
(1981) 1859-1869 参照) 。図中オリゴヌクレオチドの
５′−端の点はこれらのオリゴヌクレオチドガリン酸塩
付加されたことを指示する手段である。５分間に亘って
90℃に加熱してから75分間に亘って室温まで冷却するこ
とによって対応のオリゴヌクレオチド対から２本鎖（図
４〜11）を形成した。２本鎖を混合し、Ｔ４ DNAリガー
ゼで処理した。

【００８１】５個のサブフラグメントを２％アガローゼ
・ゲル上で分離し、pSX191に挿入した。ジデオキシヌク
レオチド・シーケンシングによって配列を確認した。フ
ラグメントＡ−Ｅを分離し、KpnI-BamHI cut pXS191と
共に結合した。結合混合物を利用してアンピシリン耐性
の点で有効な大腸菌MC1000γ−，ｍ＋を形質転換した。
次いで酵素の熟成部分の遺伝情報を指示するサブチリシ
ン309 の部分を構成する850bp KpnI-BamHIフラグメント
を利用してpSX212の野生型遺伝子を置き換えてpSX222と
し、これを有効な枯草菌SHa273に形質転換した。形質転
換された菌種を発酵させ、酵素を精製した結果、産生物
が野生型産生物と区別できないことが判明した。

【００８２】突然変異を必要とする部位に (例えば後述
するような) 異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを
使用し、これを合成遺伝子に適した他のオリゴヌクレオ
チドと混合することによって合成遺伝子から得られるプ
ロテアーゼ変種を調製した。その他の点では上述したの
と同様の態様で変異遺伝子を組立てる。合成遺伝子に関
するその他の情報は Nature 227 (1970) 27-34に掲載さ
れた Agarval等の論文に記載されている。

【００８３】酵素の熟成部分をコード化するサブチリシ
ン309 合成遺伝子の先頭にKpnI部位を導入した。使用さ
れた方法はいわゆるオリゴヌクレオチド２本鎖破壊修復
変異誘発法であり、Proc. Natl. Acad Sci USA 83 (198
6) 7177-7181 に掲載されたWlodek Mandeckiの論文に記
載されている。サブチリシン309 熟成部分の先頭部分に
おいてNcoIでpSX172を開き、アミノ酸配列を変えずに２
個の塩基を変えることによってNcoIの直ぐ前にKpnI部位
を導入する。pSX172はヨーロッパ特許出願第EP 0 405 9
01号に記載されている。このように形成されたKpnI部位
を400-bp PvuI-NheIフラグメントのpSX120に挿入してpX
212 を生成させる。pSX120もヨーロッパ特許出願第EP 0
405 901号に記載されている。

【００８４】pSX212のKpnIと BamHIの間に合成遺伝子を
挿入してpSX222を生成させる。得られた産生物をオリゴ
ヌクレオチドNOR789 (配列を図18に示す）と混合し、10
0℃に加熱し、０℃まで冷却し、大腸菌に形質転換す
る。再び形質転換したのち、32−Ｐ−標識NOR789を利用
するコロニー・ハイブリダイゼーションによって組換え
型部分をスクリーンすることができる。突然変異及び対
応のオリゴヌクレオチドの例は下記の通りである：A2-0
2/A3-01: K27R; B1-02; E54D; B4-03: Y91F, K94R; D1-
01/D2-02: Y167E, Y171V; D3-04: Y192E; D4-01/D5-01:
Y209F, Y214T; E2-01: K235R, K237R; E3-01: K251E;
E4-02; Y263F 。ここに述べるような突然変異導入に適
したこのようなオリゴヌクレオチドは例えば下記のよう
な配列を持つことができる：

【００８５】

【化２】

【００８６】

【化３】

【００８７】これらのオリゴヌクレオチドを合成遺伝子
からのオリゴヌクレオチドのうち変化しない部分と組合
わせた。突然変異誘発されたフラグメントＡ，Ｂ，Ｃ及
びＥを変異体構成に全く変化を必要としないフラグメン
トＣと共に結合した。 III：サブチリシン147 をベースとする対応の変異体も
同様に生成させることができ、形質転換させた枯草菌を
発酵させ、事後処理することによって所期の酵素を精製
する。

【００８８】IV：下記の精製法はサブチリシン147 酵
素、サブチリシン309 酵素またはその変異体の10ｌスケ
ール発酵ブロスを精製する典型的な方法である。約８ｌ
の発酵ブロスを１ｌビーカーで30分間に亘って5000rpm
で遠心分離する。10％酢酸で上澄を pH6.5に調節し、Se
itz Supra S100フィルター・プレートで濾過する。

【００８９】Amicon S1Y10 UF カートリッジを装備した
Amicon CH2A UFユニットを使用して濾液を約 400〓に濃
縮する。UF濃縮液を遠心分離し、濾過してから室温でpH
７のBacitracinアフィニティー・カラムに吸着させる。
0.01ジメチルグルタル酸、 0.1Ｍ硼酸及び 0.002Ｍ塩化
カルシウムから成るpH７の緩衝液に25％２−プロパノー
ル及び１Ｍ塩化ナトリウムを加えた溶液を使用して室温
でBacitracinカラムからプロテアーゼを溶出させる。Ba
citracin精製工程から得られたプロテアーゼ活性留分を
一括して、0.01ジメチルグルタル酸、 0.2Ｍ硼酸及び
0.002Ｍ塩化カルシウムから成る pH6.5の緩衝液で平衡
させた 750ml Sephadex G25 カラム (直径５cm）に添加
する。

【００９０】Sephadex G25カラムから得られたプロティ
ナーゼ活性留分を一括し、0.01Ｍジメチルグルタル酸、
0.2Ｍ硼酸、及び 0.002Ｍ塩化カルシウムを含有する p
H6.5の緩衝液で平衡させた 150ml CM Sepharose CL 6B
陽イオン交換カラム (直径５cm）に加えた。２ｌの同じ
緩衝液における０−0.1 Ｍ塩化ナトリウムの線形勾配を
利用してプロテアーゼを溶出させる（サブチリシン147
の場合には０−0.2 Ｍ塩化ナトリウム）。最終精製工程
でCM Sepharoseカラムからのプロテアーゼ含有留分を一
括し、(Danish Sugar Factories Inc 製の) GR81PP膜を
装備したAmicon限外濾過セルで濃縮する。

【００９１】実施例Ｂ 本発明のプロテアーゼ及び洗剤の代表的な実施例の滴定
曲線及び洗浄性能は以下に述べる通りである：実施例Ａ
で述べた方法で形成された変異体プロテアーゼ酵素Ａ，
Ｂ、及びＣをテストした。それぞれのアミノ酸配列はサ
ブチリシン309 のそれに対応し、下記のような突然変異
を伴なった： プロテアーゼ： Ａ：K27R Ｂ：K235R+K237R+K251E+Y263F Ｃ：E54D+Y91F+K94R

【００９２】それぞれの計算滴定曲線をサブチリシン30
9 の曲線と共に図１に示す。図１乃至３にはその他の変
異体の計算滴定曲線をも示す： Ｄ：K27R+E54D+Y91F+K94R+Y209F+Y214T+K235R+K237R+K2
51E+Y263F Ｅ：K27R+E54D+Y91F+K94R+Y171V+Y192F+Y209F+Y214T+K2
35R+K237R+K251E+Y263F Ｆ：Ｄ残基の電荷を加えるさらに２個の変異及びＥ残基
に電荷を加える１つの変異を有する変異体Ｅ Ｇ：位置17, 39, 120, 226におけるヒスチジンが突然変
異して中性残基となっている変異体Ｆ Ｈ：Ｎ−末端が化学的に変性（ブロック）されて中性基
となっている変異体Ｇ

【００９３】変異体酵素のプロティナーゼ活量は参考の
ため本願明細書にその内容を引用したNovo-Nordisk A/
S, Bagsvaerd, Denmarkから発行のNOVO Publication AF
220-gb (または新版) に記載されているジメチルカゼ
イン(DMC) 法によって分析評価することができる。洗浄
テストは下記の洗剤系において行われた：洗浄液は下記
組成（重量％）から成る20℃の0.83ｇ／Ｌ溶液であっ
た：

【００９４】

【表１】

【００９５】(Werner Mathis AG, Zurich, Switzerlan
d）の製造にかかるMathis Washing and Drying Unit Ty
pe TH の草ジュースを満たした容器に糊抜き綿布(100％
綿、DS71) に通して約 0.1ｇのテスト布(2.2cm×2.2cm)
を作成し、最後に布を室温の強い空気流で乾燥させ、室
温で３週間貯蔵したのち、使用まで18℃に保つ。テスト
はすべて模型のミニウォッシュ・システムで行う。この
システムでは60mlの洗剤液が入っている 150mlビーカー
中で６枚のテスト布を洗浄する。ビーカーを磁気撹拌さ
れた20℃の恒温水溶中に維持する。10分間洗浄したのち
布をバケツの中で25分間水道水で水洗いする。

【００９６】次いで (日光を避けて) １晩布を空気乾燥
し、Datacolor S.A., Dietkikon, Switzerlandの製造に
かかるELREPHO 2000光度計により460nm において反射率
Ｒを測定する。洗浄性能の目安として酵素を添加して洗
浄したあとの反射率と酵素を添加しないで洗浄したあと
の反射率との差に相当する反射率差ΔＲを利用する。改
善率は用量反応曲線から計算され、問題の野生型酵素と
の比較において一定のΔＲ値を得るのに要する酵素量と
関連する。ここでは酵素の性能を「野生型」サブチリシ
ン309(`wt') の性能と比較した。例えば、改善率２は同
じΔＲ値を得るのに半分の酵素量で足りることを意味す
る。

【００９７】結果は下記の通りであった：

【表２】

【００９８】これらの変異体プロテアーゼのうち好まし
いのはプロテアーゼＢであり、滴定曲線が最もゆるやか
で、改善率が野生型酵素と比較して最も大きい。以下に
本発明の洗剤組成の実施例を列記するが本発明はこれら
の実施例に制限されるものではない。

【００９９】洗剤Ｄ１：ビルダーとして燐酸塩を含有す
る本発明の実施例として下記成分から粉末洗剤を調合す
る：活性洗剤総量約16％、アニオン性洗剤約９％、非イ
オン性洗剤約６％、燐酸塩系ビルダー約20％、アクリル
または等価のポリマー約 3.5％ (あるいは約２％）、漂
白先駆物質として過硼酸約６−18％ (あるいは約15−20
％) 、アミノ含有漂白賦活剤約２％、珪酸塩またはその
他の構造剤約 3.5％ (あるいは約８％）、約８グリシン
単位／mg活量の酵素、使用に必要なpHに調節するための
アルカリ、及び中性無機塩、及び酵素（各酵素約 0.5
％) 。

【０１００】アニオン性洗剤はドデシルベンゼンスルホ
ン酸ナトリウムまたは直鎖型アルキルベンゼンスルホン
酸ナトリウム６％と、第１硫酸アルキル３％の混合物で
ある。非イオン性洗剤は１モル当りエトキシレート残基
を７個有する約Ｃ13−Ｃ15第１アルコールのエトキシレ
ートである。ビルダーとしての燐酸塩はトリポリ燐酸ナ
トリウムである。ポリマーはポリアクリル酸またはアク
リル／マレイン・コポリマーである。漂白先駆物質とし
ての過硼酸塩は四水化または一水化四硼酸ナトリウムで
ある。賦活剤はテトラアセチルエチレンジアミンであ
る。構造剤は珪酸ナトリウムである。中性無機塩は硫酸
ナトリウムである。酵素は上述したプロテアーゼＢであ
る。

【０１０１】洗剤Ｄ１ａ：ビルダーとして燐酸塩を含有
する本発明の実施例として下記成分から粉末洗剤を調合
する：活性洗剤総量約15％、アニオン性洗剤約６％、燐
酸塩系ビルダー約25％、アクリルまたは等価のポリマー
約0.5 ％、漂白先駆物質としての過硼酸塩約10％、アミ
ノ含有漂白賦活剤約２％、珪酸塩またはその他の構造剤
約６％、約８グリシン単位／mlグレードのプロテアーゼ
酵素、使用に必要なpHに調節するためのアルカリ、及び
中性無機塩、及び酵素（各酵素約 0.5％) 。

【０１０２】アニオン性洗剤は直鎖型アルキルベンゼン
スルホン酸ナトリウムである。非イオン性洗剤は１モル
当り７個のエトキシレート残基を有する約Ｃ13−Ｃ15第
１アルコールのエトキシレートまたはこれと対応の、即
ち、１モル当り３個の残基を有するようにエトキシレー
トされたアルコールとの混合物である。ビルダーとして
の燐酸塩はトリポリ燐酸ナトリウムである。漂白先駆物
質としての過硼酸塩または過酸は四水化四硼酸ナトリウ
ムである。賦活剤はテトラアセチルエチレンジアミンで
ある。構造剤は珪酸ナトリウムである。中性無機塩は硫
酸ナトリウムである。酵素は上記プロテアーゼＢであ
る。

【０１０３】洗剤Ｄ２：ビルダーとしてゼオライトを含
有する本発明の実施例として、下記成分から粉末洗剤を
調合する：活性洗剤総量約16％、アニオン性洗剤約９
％、非イオン性洗剤約６％、ゼオライト系ビルダー約20
％、アクリルまたは等価のポリマー約３％、漂白先駆物
質としての過硼酸塩約６−18％、珪酸塩またはその他の
構造剤約 3.5％または約2.5 ％、約８ (または約５）グ
リシン単位／mgの酵素、使用に必要なpHに調節するため
のアルカリ、及び中性無機塩、及び酵素（各酵素約 0.5
％)。

【０１０４】アニオン性洗剤はドデシルベンゼンスルホ
ン酸ナトリウムまたは直鎖型アルキルベンゼンスルホン
酸ナトリウム６％と、第１硫酸アルキル３％の混合物で
ある。非イオン性洗剤は１モル当り７個のエトキシレー
ト残基を有する約Ｃ13−Ｃ15第１アルコールのエトキシ
レートである。ゼオライト系ビルダーはＡゼオライトで
ある。ポリマーはポリアクリル酸である。漂白先駆物質
としての過硼酸塩は四水化または一水化四硼酸ナトリウ
ムである。賦活剤はテトラアセチルエチレンジアミンで
ある。構造剤は珪酸ナトリウムである。中性無機塩は硫
酸ナトリウムである。酵素は上記プロテアーゼＢであ
る。

【０１０５】洗剤Ｄ２ａ：ゼオライト系ビルダーを含有
する本発明の実施例として下記成分から粉末洗剤を調合
する：活性洗剤約14％、アニオン性洗剤約７％、非イオ
ン性洗剤約７％、ゼオライト系ビルダー約25％、アクリ
ルまたは等価のポリマー約３％、アミノ系漂白賦活剤約
２％、珪酸塩またはその他の構造剤約 0.5％、約６個の
グリシン単位／mgを有する酵素、使用に必要なpHに調節
するためのアルカリ、及び中性無機塩、及び酵素（各酵
素約 0.5％) 。

【０１０６】アニオン洗剤は直鎖型アルキルベンゼンス
ルホン酸ナトリウムであり、非イオン性洗剤は１モル当
り７個及び３個のエトキシレート残基をそれぞれ有する
約Ｃ13−Ｃ15第１アルコール・エトキシレートの混合物
である。ゼオライト系ビルダーはＡゼオライトである。
ポリマーはアクリル／マレイン・コポリマーである。漂
白先駆物質としての過硼酸塩は一水化四硼酸ナトリウム
である。賦活剤はテトラアセチルエチレンジアミンであ
る。構造剤は珪酸ナトリウムである。中性無機塩は硫酸
ナトリウムである。酵素は上記プロテアーゼＢである。

【０１０７】洗剤Ｄ３：本発明の実施例として下記成分
から水性液状洗剤を調合する：ドデシルベンゼンスルホ
ン酸16％、７モル／モルのエチレンオキシドで縮合した
Ｃ12−Ｃ15直鎖型アルコール７％、モノエタノールアミ
ン２％、クエン酸 6.5％、キシレンスルホン酸ナトリウ
ム６％、水酸化ナトリウム約 4.1％、プロテアーゼ 0.5
％、微量成分及び水100 ％またはそれ以下。pHは９乃至
10の範囲に調節する。酵素は上記プロテアーゼＢ及び／
またはＣである。

【０１０８】洗剤Ｄ４：本発明の実施例として 4.9モル
／モルのエチレンオキシド及び2.7 モル／モルのプロピ
レンオキシドでアルコキシル化したＣ13−Ｃ15直鎖型第
１アルコール38.5％、トリアセチン５％、三燐酸ナトリ
ウム30％、ソーダ灰４％、微量のオキソ硼酸塩を含む一
水化過硼酸ナトリウム15.5％、TAED４％、 0.1％がホス
ホン酸であるEDTA0.25％、 Aerosil 0.6％、SCMC１％、
及びプロテアーゼ 0.6％から非水性液状洗剤を調合す
る。pHは９乃至10、例えば約 9.8に調節する。酵素は上
記プロテアーゼＢ及び／またはＣである。

【０１０９】洗剤Ｄ５：本発明の実施例として下記成分
からかさ密度が少なくとも 600ｇ／ｌの顆粒状洗剤を調
合する：約10％がドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、残りがSynperonic A7 とSynperonic A3(約 5.5％乃
至 4.5％) の混合物である約20重量％の界面活性剤、中
性無機塩 (例えば硫酸ナトリウム）０％、燐酸塩系ビル
ダー約33％、四水化過硼酸ナトリウム約16％、TAED賦活
剤約 4.5％、珪酸ナトリウム約６％、炭酸ナトリウム約
２％を含む微量成分、及び水分約10％。酵素 (各酵素約
0.5％) をも含む。酵素は上記プロテアーゼＢである。

【０１１０】洗剤Ｄ６：本発明の実施例としてかさ密度
が少なくとも 600ｇ／ｌまたは約550 ｇ／ｌの顆粒状洗
剤を下記成分から調合する：約９％または約７％がドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたは直鎖型アルキ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウムであり、残りがSynper
onic A7 とSynperonic A3 (またはこれらと類似のエト
キシレート)(それぞれ５％と６％、または約４％と７
％) の混合物である約20または約16重量％の界面活性
剤、中性無機塩 (例えば硫酸ナトリウム）０％、ゼオラ
イト系ビルダー約30％または約25％、四水化または一水
化過硼酸ナトリウム約14％または15％、TAED賦活剤約
3.6％、及び炭酸ナトリウムを含む微量成分約９％また
は約15％、Dequest 2047約0.7 ％及び水分約10％。酵素
(それぞれ約 0.5％またはリパーゼ0.2 ％及びプロテア
ーゼ約 0.7％) をも含む。酵素は上記プロテアーゼＢで
ある。

【０１１１】洗剤Ｄ６ａ：本発明の実施例として、かさ
密度が少なくとも 600ｇ／ｌの顆粒状洗剤を調合する：
約７％が直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、２％が第１硫酸アルコール、残りがSynperonic A7
または類似のエトキシレートである約15重量％の界面活
性剤、中性無機塩 (例えば硫酸ナトリウム）０％、ゼオ
ライト系ビルダー約22％、四水化過硼酸ナトリウム約15
％、TAED賦活剤約７％、炭酸ナトリウムを含む微量成分
約15％、Dequest 2047約 0.7％、及び水分約10％。酵素
(約 1.2％) として上記プロテアーゼＢなども含まれ
る。

【０１１２】洗剤Ｄ７：本発明の実施例として下記成分
を含有する粉末洗剤を調合する：ドデシルベンゼンスル
ホン酸６％、７モル／モルのエチレンオキシドと縮合し
たＣ12−Ｃ15直鎖型アルコール５％、脂肪酸石けん３
％、Sokolan CP5 ポリマー３％、ゼオライトＡ 22％、
炭酸ナトリウム10％、硫酸ナトリウム17％、粘土粒子８
％、四水化過硼酸ナトリウム13％、テトラアセチルエチ
レンジアミン２％、プロテアーゼ0.5 ％、微量成分及び
水 100％またはそれ以下。pHを９乃至10に調整する。プ
ロテアーゼ酵素は上記プロテアーゼＢである。

【０１１３】洗剤Ｄ８：本発明の実施例として下記のよ
うに棒状洗剤（棒石けん）を調合する：完全けん化82％
獣脂と18％のココナッツ油をベースとし、0.15％のオル
ト燐酸で中和し、（棒組成物の約８GU／mgに相当する）
プロテアーゼ及びギ酸ナトリウム２％、硼砂２％、プロ
ピレングリコール２％及び硫酸ナトリウム１％と混合し
たのち、石けん製造ラインを進む。プロテアーゼ酵素は
上記プロテアーゼＢ及び／またはＣである。

【０１１４】洗剤Ｄ９：構造性の液状洗剤はプロテアー
ゼのほかに例えば２−15％の非イオン性界面活性剤、場
合によってはアニオン性界面活性をも含めて合計５−40
％の界面活性剤、５−35％の燐酸塩系または非燐酸塩系
ビルダー、分子量が 106以上の例えば交差結合アクリル
ポリマーのような 0.2−0.8 ％の増粘ポリマー、少なく
とも10％の珪酸ナトリウム例えば中性水ガラス、pHを所
要の値、好ましくは９−10またはそれ以上の値、例えば
11に調節するためのアルカリ (例えば、カリウムを含む
アルカリ）を含有することができ、ナトリウム陽イオン
と珪酸塩陰イオン (遊離シリカ) の重量比は 0.7：１、
粘度 0.3−30Pas(20℃, 20ｓ−１）とすればよい。

【０１１５】好適な実施例は１モル当り約５個のEO基及
び１モル当り約 2.7個のPO基でアルコキシレートされた
約５％の非イオン性界面活性剤Ｃ13−Ｃ15アルコール、
シリカと酸化ナトリウムの重量比が 3.5の中性水ガラス
15−23％、さらに13−19％のKOH、８−23％のSTPP、０
−11％の炭酸ナトリウム、 0.5％のCarbopol 941を含有
する。プロテアーゼとしては上記プロテアーゼＢを例え
ば 0.5％の組成比で組込めばよい。

【０１１６】洗剤Ｄ10：洗濯用に適した構造性の高粘度
水性液状洗剤を下記のように調合する (重量％）：

【表３】

【０１１７】洗剤Ｄ11：洗濯用の等張性の水性液状洗剤
を下記のように調合する (重量％）

【表４】

【０１１８】洗剤Ｄ12：下記成分組成で水性液状洗剤を
調合する：

【表５】

【０１１９】洗剤Ｄ13：下記組成を有する水性液状洗剤
を調合する：

【表６】

【０１２０】洗剤Ｄ14：下記組成 (重量％) となるよう
に非水性液状洗剤を調合する：

【表７】

【０１２１】この組成物の調合に際しては、液状非イオ
ン性界面活性剤及びトリアセチンを先ず添加してから酸
化マグネシウムを、さらに酵素以外のその他の成分を添
加する。コロイドミルで混合物を混練して冷却し、最後
に酵素やその他の感熱性微量成分を添加する。酵素は上
記プロテアーゼＢである。例えば上記プロテアーゼＢと
はEP 0 342 177に開示されている洗剤組成を使用するこ
ともできる。以上、特定の実施例に基づいて本発明を説
明したが、これらの実施例は本発明の用途及び範囲を制
限するものではなく、本発明は以上に述べ、請求の範囲
において後記する構成要件のあらゆる組合わせに及ぶも
のである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、種々の変異体サブチリシン酵素のpHと
電荷との関係を示すグラフである。

【図２】図２は、種々の変異体サブチリシン酵素のpHと
電荷との関係を示すグラフである。

【図３】図３は、種々の変異体サブチリシン酵素のpHと
電荷との関係を示すグラフである。

【図４】図４は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列とそ
れをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を示す
図である。

【図５】図５は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列とそ
れをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を示す
図である。

【図６】図６は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列とそ
れをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を示す
図である。

【図７】図７は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列とそ
れをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を示す
図である。

【図８】図８は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列とそ
れをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を示す
図である。

【図９】図９は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列とそ
れをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を示す
図である。

【図１０】図１０は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列
とそれをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を
示す図である。

【図１１】図１１は、サブチリシン酵素のアミノ酸配列
とそれをコードする塩基配列、及び制限酵素切断部位を
示す図である。

【図１２】図１２は、図４〜図１１に示す塩基配列を切
断する制限酵素を示す。

【図１３】図１３は、図４〜図１１に示す塩基配列を切
断しない制限酵素を示す。

【図１４】図１４は、遺伝子部分Ｄ及びＥを構成するオ
リゴヌクレオチド断片を示す。

【図１５】図１５は、プラスミドpSX191の構造を示すず
である。

【図１６】図１６は、多クローニング部位の塩基配列を
示す図である。

【図１７】図１７は、サブチリシン酵素をコードする遺
伝子の構成部分Ａ〜Ｅを示す図である。

【図１８】図１８は、プラスミドpSX193の作製過程を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハストルプ，スベン デンマーク国，デーコー−2400 コペンハ ーゲン エヌベー，３．テーホー．フレズ リクスボルグバイ 10 (72)発明者 オルセン，オレ ビルステッド デンマーク国，デーコー−2700 ブローエ ンショエイ，バエケスコウバイ 38 (72)発明者 エリクセン，ニーナ デンマーク国，デーコー−2000 フレデリ クスベルゥ，１．テーベー，マティルデバ イ 15 (72)発明者 リンデガールド，ポール デンマーク国，デーコー−2100 コペンハ ーゲン ０，オーステル ソエガゼ 52 (72)発明者 カステレイーン，エリク オランダ国，エヌエル−2907 セーヘー カペル，パリエテルブルハ 105 (72)発明者 マールテン，ロベルト エフモンド オランダ国，エヌエル−3461 ヘーデー リンスホーテン，デ ネス 34，アー／デ ー イーセル (72)発明者 ハフェルカンプ，ヨハン オランダ国，エヌエル−2661 カーエル ベルフスヘンホーク，デ クロス カルペ ル 40 (72)発明者 ムステルス，ワウテル オランダ国，エヌエル−3141 エルデー マースルイス，ウィッペルスパルク 138 (72)発明者 デ フリーフ，ヤコブ オランダ国，エヌエル−3011 カーハー ロッテルダム，ホウドセシンヘル 274エ ー Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA14 CA03 DA06 DA07 EA04 GA11 HA01 HA20 4B050 CC01 CC04 DD02 EE10 LL04

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 pH範囲に亘るプロテアーゼの分子電荷変
   動を親プロテアーゼよりも軽度にする（例えば、pH範囲
   に亘って電荷をほぼ一定、例えば中性に近づける）少な
   くとも１つのアミノ酸配列突然変異を誘発することを特
   徴とする例えば変異体サブチリシンプロテアーゼのよう
   な変異体プロテアーゼ。
2. 【請求項２】 サブチリシンのアミノ酸配列の１又は複
   数の突然変異が約７乃至約11のpH範囲内における変異体
   プロテインのプロテアーゼ分子電荷変動を親プロテアー
   ゼよりも軽度にする（例えばほとんど一定、例えば正味
   電荷がほぼゼロの状態）ことを特徴とする請求の範囲第
   １項に記載のプロテアーゼ。
3. 【請求項３】 前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約11
   のpH範囲内の少なくとも 0.5pH単位のpH範囲内で現われ
   ることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のプロテア
   ーゼ。
4. 【請求項４】 前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約11
   のpH範囲内の少なくとも１pH単位のpH範囲内で現われる
   ことを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に記載
   のプロテアーゼ。
5. 【請求項５】 前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約11
   のpH範囲内の少なくとも２pH単位のpH範囲内で現われる
   ことを特徴とする請求の範囲第２項、第３項または第４
   項に記載のプロテアーゼ。
6. 【請求項６】 前記軽度の正味電荷変動が約８乃至約11
   のpH範囲内のほとんど全域に亘って現われることを特徴
   とする請求の範囲第２項から第５項までのいずれかに記
   載のプロテアーゼ。
7. 【請求項７】 前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約11
   のpH範囲内のほとんど全域に亘って現われることを特徴
   とする請求の範囲第２項から第６項までのいずれかに記
   載のプロテアーゼ。
8. 【請求項８】 プロテアーゼの正味電荷が１分子当り±
   １電荷の偏差範囲内でほとんど一定またはほとんどゼロ
   のままであることを特徴とする請求の範囲第２項から第
   ７項までのいずれかに記載のプロテアーゼ。
9. 【請求項９】 前記ほとんど一定またはほとんどゼロの
   正味電荷の偏差範囲が１分子当り±0.5 電荷以内である
   ことを特徴とする請求の範囲第２項から第８項までのい
   ずれかに記載のプロテアーゼ。
10. 【請求項１０】 前記ほとんど一定の正味電荷が約＋
    ４，＋３，＋２，＋１，０，−１，−２，−３または−
    ４であることを特徴とする請求の範囲第８項または第９
    項に記載のプロテアーゼ。
11. 【請求項１１】 約８乃至11の範囲よりも外側、例えば
    約７乃至12の範囲よりも外側に側鎖 pKaを有する残基に
    置き換えるか、または残基が全く無くするような、少な
    くとも１つのリシン、ヒロチジン、システイン及び／ま
    たはチロシン残基突然変異を誘発することを特徴とする
    請求の範囲第１項から第10項までのいずれかに記載のプ
    ロテアーゼ。
12. 【請求項１２】 （リシンまたはシステインを）アルギ
    ニン、ロイシン、スレオニン、アスパラギン、グルタミ
    ン酸またはアスパラギン酸に；（チロシンを）フェニル
    アラニン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたは
    グルタミン酸に；または（ヒスチジンを）グルタミン、
    アスパラギン、セリン、グルタミン酸またはアスパラギ
    ン酸に置き換えるような少なくとも１つのリシン、ヒス
    チジン、システイン及び／またはチロシン残基突然変異
    を誘発することを特徴とする請求の範囲第１項から第11
    項までのいずれかに記載のプロテアーゼ。
13. 【請求項１３】 下記突然変異の少なくとも１つを誘発
    することを特徴とする請求の範囲第１項から第11項まで
    のいずれかに記載のプロテアーゼ：E54D, H17Q, H120D,
    H120N, H226S, H39S, K27R, K94R, K235L, K237R, K25
    1E,K251N, Y91F, Y167E, Y167F, Y171F, Y171V, Y192E,
    Y192F, Y209F, Y209L,Y214F, Y214T, K235R, Y263F。
14. 【請求項１４】 下記の突然変異または突然変異群の少
    なくとも１つを誘発することを特徴とする請求の範囲第
    13項に記載のプロテアーゼ： a - K27R; b - H17Q+K27R+H39S; c - E54D+Y91F+K94R; d - E54D+Y91F+K94R+H120D; e - E54D+Y91F+K94R+H120N; f - Y167F+Y171V+Y192F+Y209F+Y214T; g - K235L+K237R+K251E+Y263F; h - K235L+K237R+K251N+Y263F; i - H226S+K235L+K237R+K251N+Y263F; k - H226S+K235L+K237R+K251E+Y263F; g′- K235R+K237R+K251E+Y263F; h′- K235R+K237R+K251N+Y263F; i′- H226S+K235R+K237R+K251N+Y263F; k′- H226S+K235R+K237R+K251E+Y263F.
15. 【請求項１５】 それぞれの文字が請求の範囲第14項に
    示した突然変異または突然変異群を表わすとして、下記
    の突然変異または突然変異群の少なくとも１つを誘発す
    ることを特徴とする請求の範囲第14項に記載のプロテア
    ーゼ： セット ａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ，ｂ＋ｅ＋ｆ
    ＋ｋ，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｋ，ａ＋ｃ＋ｆ＋
    ｇ′，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ′，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋ′，ｂ＋ｅ＋
    ｆ＋ｉ′，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｋ′。
16. 【請求項１６】 Ｎ−末端アミノ基を約８乃至11の範囲
    より外側、例えば約９乃至12の範囲より外側に pKaを有
    する基に転換できる試薬で請求の範囲第１項から第15項
    までのいずれかに記載のプロテアーゼを処理することを
    特徴とする方法。
17. 【請求項１７】 約７−12、（例えば８−11のアルカリ
    pHに電荷を安定させるためプロテアーゼのＮ−末端アミ
    ノ基を変性させることのできる試薬と反応させたことを
    特徴とする請求の範囲第１項から第15項までのいずれか
    に記載のプロテアーゼ。
18. 【請求項１８】 プロテアーゼがサブスチリシンBPN'、
    サブスチリシンアミロサッカリチクス、サブスチリシン
    168 、サブスチリシンメセンテリコペプチダーゼ、サブ
    スチリシン Carlsberg、サブスチリシンDY、サブスチリ
    シン309 、サブスチリシン147 、サブスチリシンテルミ
    ターゼ、プロテアーゼTW７、プロテアーゼTW３、及びプ
    ロテアーゼＫまたはアクアリシンから選択された親酵素
    の突然変異を表わすことを特徴とする請求の範囲第１項
    から第17項までのいずれかに記載のプロテアーゼ。
19. 【請求項１９】 プロテアーゼが親サブチリシンとして
    サブチリシン309 をベースとすることを特徴とする請求
    の範囲第18項に記載のプロテアーゼ。
20. 【請求項２０】 プロテアーゼが親サブチリシンとして
    サブチリシン147 をベースとすることを特徴とする請求
    の範囲第18項に記載のプロテアーゼ。