JP4126055B2 - 組織横断輸送を強化するペプチドとその同定法および使用法 - Google Patents
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Description
本発明は、薬物、高分子、または生分解性のナノ粒子やミクロ粒子などの粒子のヒトまたは動物の組織を通る輸送を可能にするペプチド配列の同定に関する。また、本発明は特に胃腸管(GIT)の内腔側に沿って並ぶ上皮細胞などの組織を通るバクテリオファージの送達を強化するペプチド配列の同一性を決定するためのスクリーニング、アッセイにおけるファージ・ディスブレイ・ライブラリーの使用に関する。
胃腸管の内腔側に沿って並ぶ上皮細胞は、経口投与後の薬物送達の主たる関門である。とはいえ、薬物送達および輸送の促進に利用しうる輸送経路で認知されているものには、経細胞輸送、傍細胞輸送、担体仲介輸送、トランスサイトーシス輸送の4経路がある。従来の薬物、ペプチド、タンパク質、高分子またはナノ/ミクロ粒子系が上記の経路の一つと「相互作用」を行なう能力から、胃腸管から胃腸管の下に横たわる血行への薬物や粒子送達の強化がもたらされる。
本発明は、ヒトまたは動物の組織を通る活性物質輸送を可能にする、或いはそれを促進するペプチドを同定する方法を提供する。無作為ファージ・ライブラリー由来の所定量のファージをin vitro、in vivoまたはin situ、極性組織培養細胞中のいずれかで組織試料の第一の側、好ましくは頂端側にプレーティングもしくは接触させる。組織の第二の側、即ち第一の側の反対側、好ましくは側底側に輸送されたファージを所定の時間に回収して被輸送ファージを選択する。被輸送ファージを宿主中で増幅し、(直前のサイクルで得られた被輸送ファージを使用して)この事象サイクルを0回から6回などの所定の回数反復して行ない、第一の側から第二の側へ輸送が可能なファージを含む選択ファージ・ライブラリーが得られる。最後に、ヒトまたは動物の組織を通る活性物質輸送を可能にする、或いは促進するペプチドを同定するために選択ファージ・ライブラリー中のファージにコードされた、少なくとも一つの無作為ペプチドの配列を決定する。被輸送ファージは、活性物質有効搭載機(ファージ)を同伴した輸送体ペプチド(上記のファージにコードされた、少なくとも一つのランダムペプチド)の組合せであって、組織を通過する活性物質の輸送が輸送体ペプチドにより促進されるものと見ることができる。以上のことから、選択ファージ・ライブラリー中のファージにコードされた無作為ペプチドは、特定組織を通過する、薬物封入ナノ/ミクロ粒子などの他の活性物質の輸送を促進する可能性が予想される。
驚くべきことに、本発明は胃腸管上皮層、肺胞細胞、血液脳関門の内皮細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、腎上皮細胞、パイエル板のM細胞、肝細胞などを含むがこれらに限定されないヒトまたは動物の組織を横断する薬物などの活性物質の送達または輸送の促進が可能なペプチドを同定する方法を開示する。さらに、送達システム、例えばナノ粒子、ミクロ粒子、リポソーム、ミセルなどの外部をこれらの「帰巣」ペプチドで被覆するか、それらと連結させるか、それらで形成して特定組織を横断する封入薬物の標的化送達を可能にすることもできる。また、融合タンパク質をin vivoもしくはinvitroで合成することによってペプチドを読取り枠内で治療ペプチドまたは治療タンパク質と融合させ、治療ペプチドまたは治療タンパク質の組織横断的な送達または輸送をペプチドが強化するようにさせることも可能である。
fdなどの大腸菌糸状パクテリオファージにコードされた吸着タンパク質であるpIIIおよびpVIIIのNH2−末端アミノ酸配列は、DNA組換え技術により改変して、所定の長さの無作為ペプチド配列のライブラリーを含ませうることが従来から明らかにされている(Cwirla等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382(1990))。従って、可変のpIIIまたはpVIIIタンパク質をコードする改変ファージfd配列のDNAライブラリーを大腸菌内部に構築し、増殖させることが可能である。
本明細書中でL3.6、L3.15およびL8.15の記号で表す3つのファージ・ディスプレイ・ライブラリーはミズーリ大学コロンビア校のジョージP.スミス教授から入手した。各ライブラリーは親ベクター「fd−tet」由来のfUSE5ベクターの中にある。L3.6ライブラリーでは、fdパクテリオファージの遺伝子IIIによって無作為6量体ライブラリーが発現され、得られたpIIIタンパク質の5コピーのすべてに表される。増幅した形質導入体クローン数は3.7×1011であり、ファージDNAの大きさは9225塩基である。L3.15ライブラリーでは、fdバクテリオファージの遺伝子IIIによって無作為15量体ライブラリーが発現され、得られたpIIIタンパク質の5コピーのすべてに表される。増幅した形質導入体クローン数は1次増幅が3.2×1011、2次増幅が12.1x1012であり、ファージDNAの大きさは9252塩基である。L8.15ライブラリーでは、ベクターが同一ゲノムに二つの遺伝子VIIIを有し、一方は野生型であり、他方は外来残基を表す。無作為15量体ライブラリーはfdバクテリオファージの二つの遺伝子VIIIの一つにより発現され、得られた組換えpVIIIタンパク質の最大およそ300コピーに表される。このベクターはf88.4と呼ばれ、外来15量体がpVIIIタンパク質の最大およそ300コピーに表される。増幅した形質導入体クローン数は2.2×1012であり、ファージDNAの大きさは9273塩基である。
PEG−下層バンド、幅が狭い、筋状、綿状、不透明、白色
液をファージバンドの2mm上まで吸い取り、無菌太口トランスファー用ピペットを用いてファージバンドを採取し、26ml容のポリカーボネート製遠心管に入れた。TBSを遠心管の肩まで満たし、混合し、60Tiローター中で50,000rpm、4℃、4時間遠心分離した(反復)。ペレットをで穏やかにボルテックスして10mlのTBSに溶解し、冷所で終夜軟化させ、再びボルテックスした(反復)。次いでペレットをボルテックスしてTBSに溶解し(元の培養物1リットル分を2mlに)、4℃で終夜軟化させ、再びボルテックスした。遠心管を短時間遠心分離し、溶液を管底に集め、1.5ml容の微量遠心管に移した。アジ化ナトリウム(0.02%)を添加し、溶液を70℃に20分間加熱して残存微生物を殺菌してもよい。微量遠心分離を1分間行なって溶液を清澄化した後、上清を無菌微量遠心管に移し、4℃で保存した。1;100希釈液200μlを240〜320nm走査して物理的粒子の濃度を測定し、貧栄養培養したK91Kan細胞10μlで10-8希釈液10μlの力価を測定した。感染液200μlをLB(+40μg/mlテトラサイクリンおよび100μg/mlカナマイシン)に塗布し、37℃で24時間インキュベートし、コロニーを計数してファージ原液の感染価の力価を測定した。
最初にCaco-2細胞(ATCC名:CCL248、72歳男性の結腸癌の肺転移巣由来)およびT-84細胞(ATCC名:HTB37:72歳白人男性の原発結腸腫瘍から分離)を密集するまで25cm2フラスコで培養した。T-84細胞は2mMグルタミン、15mM HEPES、10%ウシ胎子血清(FCS)、1%MEM非必須アミノ酸、50U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンを含むDMEM:ハムF12培地(1:1)で増殖させた。Caco-2細胞は10%FCS、1%MEM非必須アミノ酸、50U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンを含むDMEM+グルタマックス−1(glutamax-1)で増殖させた。細胞は全て95%O2/'5%CO2中37℃でインキュベートした。細胞が密集した時点でスナップウェルの播種に使用した。
ラットを(一酸化炭素で)屠殺し、腹腔を切開し、結腸を捜し当て、取り出し、1倍ハンクス・バランス化塩類緩衝液(HBSS、Gibco BRL、Cat# 14065031)中で洗浄した。管状切片を腸間膜縁に沿って切開して平たく四角い組織片とした。次いで平滑筋層をブラント切開で除去しておよそ2.5cm2の上皮組織片を残した。
水浴を37℃に平衡化した。チャンバーにHBSS緩衝液(下記参照)を満たし、電極のスイッチを入れた。入力オフセット調節つまみをゼロに調整した。読取り値がずっとゼロに保たれていることを確認しながら、この系をおよそ20分間平衡化した。電極のスイッチを切り、HBSS溶液を除いた。ラット結腸上皮シートを含むフィルターを装置にセットし、HBSS緩衝液10mlを各側に同時に添加した。95%O2/5%CO2で組織を酸素化し、この系を少なくとも30分間平衡化した。電極のスイッチを入れ、つまみを電圧固定と電流にセットした。電圧を調整して電流をおよそ2〜3μA変化させた。次いで8分ごとに電圧が印可されるようにタイマーをセットし、対応する偏向電流を用いてオームの関係式(R=V/I)によってTERを計算した。記録はファージ添加の少なくとも10分間前に開始した。
96穴組織培養プレート中で密集するまでCaco-2細胞(100μl)を増殖させた(2×105細胞/ウェルをDMEM/グルタマックス+1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%MEMおよび10%FCS含有増殖培地で2日間増殖)。2日間増殖後、10%ホルムアルデヒド(ホルムアルデヒド(38%):蒸留水=1:3(v/v))100μlを密集Caco-2細胞単層に添加した後、室温で15分間インキュベーションを行なった。プレートを上下逆にして細かく振ることによりマイクロタイター・ウェル内容物を取り除き、DPBS(ダルベッコのPBS)でウェルを3回洗浄した。各ウェルを0.1%フェニルヒドラジン−DPBS(フェニルヒドラジンの0.1%DPBS溶液)200μlで満たし、37℃で1時間インキュベートした。次いでプレートを上下逆にして細かく振ることによりマイクロタイター・ウェル内容物を取り除き、DPBSでウェルを3回洗浄した。各ウェルにBSAの0.5%DPBS溶液200μlを添加した後、室温で1時間インキュベーションを行なった。次いで各ウェルを1%BPT(DPBS中、1%BSA、0.05%トウィーン20溶液)で3回洗浄した。
本明細書中で記載したin vivoでの態様で使用するために、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーをPEG沈殿法もしくはショ糖またはCsCl密度勾配遠心法などにより精製する。ファージ・ディスブレイ・ライブラリーをPBS(またはTBS)緩衝液に再懸濁し、閉(または開)動物ループモデル(ラット、ウサギその他の種)の空腸、回腸、結腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、骨盤結腸などのin vivoの動物部位に注入する。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを動物モデルの胃腸管に投与し、所定の時間(0分、15分、30分、45分、60分など、最長6時間まで)に門脈および/または体血液試料を採取し、或いは閉(または開)動物ループモデルに投与したファージ・ディスプレイ・ライブラリーを所定の時間インキュベートした後で、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーに暴露した、或いはそれと共にインキュベートしたGIT管の対応領域を実験終了時に回収しうる。回収した腸組織をプロテアーゼインヒビターを含むPBSなどの適当な緩衝液で繰り返し洗浄した後、洗浄した組織をプロテアーゼインヒビターを含むPBS中でホモジナイズし、ホモジネートを大腸菌の感染に使用して、腸組織にしっかりと結合しうるファージの増幅を可能にする。別法として、回収した腸組織を適当なPBS緩衝液中でホモジナイズし、繰り返し洗浄し、最終組織ホモジネート中に存在するファージを大腸菌内で増幅することができる。後者の方法によると、腸組織にしっかりと結合するファージかまたは腸組織細胞に取り込まれるファージのいずれかの増幅も可能である。
A.ファージ・ディスプレイ集団による組織培養細胞単層(スナップウェル・モデル)の処理
ラミナーフローキャビネット中で、ファージ溶液100μlに抗生物質を含まない増殖培地(各細胞株の完全推奨培地だが抗生物質は添加しないもの)900μlを微量遠心管中で混合した。同じ実験を2回行い、ファージを含まない対照処理を含めた。細胞の焙養令と継代数に注意しながら、各スナップウェルについてTERを測定した。期待通りのTERを有する推奨培養令の無処置の単層だけを使用した。スナップウェル内の側底側培地を抗生物質を含まない培地と交換し、頂端側培地を除去した。細胞の頂端側にファージ溶液と対照溶液を添加し、スナップウェル培養物を通常通りインキュベートした。各回収時間(例えばファージ添加後1、5、24時間後)に側底側から培地を採取し、2ml容の無菌ねじ口管に入れて4℃で保存した。側底側培地採取毎に、焙地を抗生物質を含まない新鮮培地と交換した。実験終了時にTERを測定し、通常通り単層をビルコン(Vircon)殺菌剤で処理した。
ひとたびラット結腸組織が上記のように調製されると、電極のスイッチを切った後で、HBSS緩衝溶液中のおよそ1×1011ファージを結腸組織の消化管側に塗布した。続いて指定の時間に、設定を電圧および増幅に変更し、系を接地し、結腸組織の消化管側と血液側の培地を両方とも同時に取り除き、血液側の焙地を4℃に保存した。消化管側に存在する元の培地をS−Gチャンバーにセットした結腸組織の消化管側に移し替えた。同時に、新鮮なHBSS緩衝焙地を血液側に添加し、組織を95%O2/5%CO2中で酸素化した。再び電極のスイッチを入れ、つまみを電圧固定および電流に設定した。電圧を調整して電流がおよそ2〜3μAとなるように変えた。次いで8分毎に電圧を印可するようにタイマーをセットし、対応する偏向電流を用いてオームの関係式(R=V/I)によってTERを計算した。
精製したファージ・ディスプレイ・ライブラリー(無作為または予備選択)をPBS緩衝液で500μlに希釈し、閉(または開)腸ルーブモデル(例えばラット、ウサギその他の種)に注入した。注入時および注入後の各時間に、門脈循環または体循環試料を採取した。採取した血液の一部を大腸菌と共にインキュベートした後、ファージのプラーク、導入単位、ファージがテトラサイクリンなどの抗生物質への耐性をコードするコロニーのためのプレーティングをすることができる。採取した血液試料の残り(最高150μl)を大腸菌250μlおよびLB培地5mlまたはその他の適当な増殖培地と共にインキュベートする。振盪培養器で37℃でインキュベートすることにより大腸菌培養物を終夜インキュベートする。その他の時間(15分、30分、45分、60分など、最長6時間まで)に採取した血液試料を同様に処理して、これらの時間に門脈循環または体循環に存在するファージを大腸菌内で増幅できるようにする。増幅後、増幅されたファージをPEG沈殿法により回収し、PBS緩衝液またはTBS緩衝液に再懸濁する。さらに、PEG沈殿前後の増幅されたファージの力価を測定する。増幅しPEG沈殿したファージを既知のファージ力価(通常108から1010ファージまたはプラーク形成単位/ml)に希釈し、動物閉(または開)ループモデルのGITに注入する。種々の時間に門脈循環および/または体循環から血液試料を採取し、血液試料に輸送されたファージを上記1回目のサイクルと同様に大腸菌内で増幅する。続いてファージをPEG沈殿し、再懸濁し、力価測定し、希釈し、そして動物閉(または開)ループモデルのGITに注入する。ファージを注入し、その後に門脈循環および/または体循環血液試料を採取し、これら血液試料に輸送されたファージを増幅するこの手順は、例えば10回まで反復することができ、GITから門脈循環および/または体循環へ選択的に輸送されるファージの選択を可能にする。
上記の手順に従い、Caco-2細胞を用いてライブラリーL3.6、L3.15、L8.15およびfUSE2(対照)をスクリーニングした。サイクル毎の収率(%)(1時間、5時間、24時間および全収率)およびサイクルについての経上皮抵抗性の変化を測定した。Caco-2細胞のTER測定値は224〜449Ω/cm2の範囲に留まった。細胞培養物の側底側のファージ収率は頂端側に添加したファージに対する百分率として報告する。連続6回のスクリーニングサイクルを行ない、側底緩衝液の1時間、5時間、および24時間試料を採取した。サイクル1〜6でサイクル毎に得られたファージの収率(%)を表1にまとめた。使用可能な収率は通常4回目のサイクルから得られた。
上記の手順に従い、T-84細胞を用いてライブラリーL3.6、L3.15、L8.15およびfUSE2(対照)をスクリーニングした。サイクル毎の収率(%)(1時間、5時間、24時間および合計収率)およびサイクルについての経上皮抵抗性の変化を測定した。T-84細胞のTER測定値は224〜449Ω/cm2の範囲に留まった。細胞培養物の側底側のファージ収率は頂端側に添加したファージに対する百分率として報告する。連続4回のスクリーニングサイクルを行ない、側底緩衝液の1時間、5時間、および24時間試料を採取した。サイクル1〜4でサイクル毎に得られたファージの収率(%)を表2にまとめた。使用可能な収率は通常4回目のサイクルから得られた。
上記の手順に従い、分離ラット結腸を用いてライブラリーL3.6、L3.15、L8.15を含むファージ混合物をスクリーニングした。組織試料の側底側のファージ収率は頂端側に添加したファージに対する百分率として報告する。連続6回のスクリーニングサイクルを行ない、側底緩衝液の1時間試料4検体を採取した。表3に分離結腸断片でのファージ収率(%)を報告する。
遺伝子VIIIのDNAシークエンシング・プライマーELN71(SEQ ID NO:1)または遺伝子IIIのDNAシークエンシング・プライマーELN77a(SEQ ID NO:17)のいずれか一方と35S−dATPとシークエナーゼ バージョン2.0(Sequenase version 2.0)DNAシークエンシング・キット(アマシャムライフサイエンス、英国)を使用して、ラット結腸断片を用いたスクリーニングの6回目のサイクルから無作為に選択されたファージのクローン36個(実施例3および表3に示したもの)の塩基配列決定を行なった。サイクル1からサイクル6へ進むと、遺伝子IIIとは反対に、遺伝子VIIIにコードされる無作為ペプチドによるファージ選択に偏りがあるが、これはおそらく遺伝子IIIにコードされるペプチドがファージ粒子につきコピー数3〜5存在するのに対して、合成遺伝子VIIIにコードされるペプチドはファージ粒子につきコピー数約300存在するためであろう。この比較的高い発現レベルから給合価効果がもたらされ、組織試料中の受容体部位/経路との相互作用が起きる可能性が高まる。
9%)、SEQ ID NO:4(3クローンのクラス−存在比8.3%)が決定された。これらのクラスは全て3重挿入DNAからなる。個々の分離配列をSEQ ID NO:5からSEQ ID NO:9(3重挿入DNA)およびSEQ ID NO:10(単一挿入DNA)に示す。
表6a.Caco-2スクリーニング・サイクル1〜6、結腸スクリーニング・サイクル1〜6およびT-84スクリーニング・サイクル1〜6
表6b.非選択ライブラリーL3.6、L3.15およびL8.15
上記同様、Caco-2細胞のスナップウェルを調製し、上に示した方法に従いCaco-2細胞を用いてX30ライブラリーのスクリーニングを行なった。図1に、スナップウェルで増殖した極性Caco-2細胞の側底側培地中のサイクル1、2、3および4におけるファージ収率(頂端側培地から側底側培地へ輸送されたファージ、%)をまとめた。各サイクルともファージを頂端側培地への添加から1時間後と24時間後の両方に側底側培地の試料採取を行なった。従って、サイクル1の最初のファージ・ライブラリー添加から1時間後に側底側培地を回収し、新鮮な側底側培地と交換した。続いて最初のファージ・ライブラリー添加から24時間後に側底側培地を回収した。各場合とも(1時間および24時間側底側培地試料)、大腸菌K91Kan株の各側底側培地試料の力価測定を行なうことにより、存在するファージを定量した。1時間および24時間の試料回収時点に採取した側底側培地の残りを合わせ、存在するファージをPEG沈殿させ、沈殿したファージを100μlのTBSに再懸濁し、大腸菌K91Kanを感染するために使用して、それにより前に概説したように側底側培地に存在するファージの増幅を可能にした。増幅後、増幅されたファージの力価測定を行ない、PEG沈殿させ、TBSに再懸濁し、そして力価測定を行なった。このファージ懸濁液は、前に概説したように、側底側培地中に輸送されたファージを用いて上記の手順を反復することにより、次のCaco-2細胞での別の選択段階へ進む準備が整った。サイクル1から4へ進むと、スナップウェルで増殖したCaco-2細胞の頂端側培地から側底側焙地へ輸送されたファージが19.2倍濃縮された。
この検討では、無作為ファージ・ディスプレイ・ライブラリー由来のファージ並びに対照ファージをラット胃腸管(in situラット閉ループモデル)内腔に注入した。実験期間にわたって体循環または門脈循環のいずれかから採血し、大腸菌で血液試料の力価測定を行なうことによって、循環内へ輸送されたファージ数を測定した。
体循環への輸送を調べるため、動物R1、R2およびR3に対照ファージM13mp18を投与し、動物R4、R5、R6およびR7に被検ファージD38/DC43混合物を投与した。門脈循環への輸送を調べるため、動物R8、R9およびR10に対照ファージM13mp18を投与し、動物R11、R12、R13およびR14に被検ファージD38/DC43混合物を投与した。動物R15には、1日目に体循環から採取後に大腸菌で増幅し、PEG沈殿させ、そしてPBSに再懸濁した動物R4〜R7(表8参照)由来の混合ファージ試料を与えた。後に分析したところ、このファージの力価は動物R8〜R14に用いた他のファージと比べて100倍高いことが分かった。そのため、この知見に基づき表9の動物R15のファージ力価は他のラットのものにあわせたものとした。
動物R4、R5、R6およびR7には被検ファージD38/DC43混合物を投与した。
表9.閉ループモデルから門脈循環へ輸送されたファージ数
動物R11、R12、R13およびR14には被検ファージD38/DC43混合物を投与した。
動物R15*には、1日目に体循環から採取後に大腸菌増幅、PEG沈殿、そしてPBS再懸濁した動物R4〜R7(表8参照)由来の混合ファージ試料を与えた。後に分析したところ、このファージの力価は動物R8〜R14に用いた他のファージと比べて100倍高いことが分かった。そのためこの知見に基づき表9のラットR15のファージ力価は、他の動物のものとあわせたものとした。
GITの中にある4種類の別個の受容体または結合部位を用いて無作為ファージ・ディスプレイ・ライブラリーD38およびDC43をスクリーニングすることにより、予め選択したファージをプールすることによってGI-D、GI-S、GI-HおよびGI-Pの4つの予備選択ファージ・ライブラリーを構築する。上記実施例7同様、これらの予備選択ファージ・ライブラリーを陰性対照ファージM13mp18と共にラット閉ループモデル(予備選択ファージ・ライブラリー毎に動物6匹)に注入し、実験期間の間は門脈静脈を介して門脈循環から採血し、実験終了時に尾静脈から体循環血試料を採取し、そして閉ループから腸組織領域を採取する。
Claims (9)
- ヒト組織または動物組織を介した活性物質の輸送を可能にし、または促進するペプチドであって、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、またはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む、前記ペプチド。
- 組織が、十二指腸、空腸、回腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、骨盤結腸、血管系に沿って並ぶ血管内皮、血液脳関門の血管内皮、血管平滑筋、肺胞、肝臓、腎臓、骨髄、心臓、脾臓、膵臓、胸腺、脳、脊髄、神経、または眼の網膜から選択される、請求項1に記載のペプチド。
- 組織が胃腸管の管腔側に並んでいる上皮細胞を含む、請求項1に記載のペプチド。
- 組織が結腸から誘導される、請求項3のペプチド。
- 活性物質が薬物または抗原である、請求項1ないし4のいずれか一項に記載のペプチド。
- 活性物質がナノ粒子またはミクロ粒子である、請求項1ないし請求項4のいずれか一項に記載のペプチド。
- ペプチドがナノ粒子またはミクロ粒子の表面にコートされ、または吸着され、または共有結合される、請求項6に記載のペプチド。
- ナノ粒子またはミクロ粒子がペプチドから形成される、請求項6に記載のペプチド。
- ナノ粒子またはミクロ粒子が、薬物を充填または薬物を封入したナノ粒子またはミクロ粒子である、請求項6ないし8のいずれか一項に記載のペプチド。
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