JP4116665B2 - フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子配列およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
この明細書を通じて、特記しない限り、用語「含んでなる」は、記載された要素もしくは整数または記載された複数の要素または整数の群を含むことを意味するが、他の要素もしくは整数または他の複数要素もしくは整数の群を排除しないことが理解されるであろう。
関連する態様において、実質的に配列番号:4に記載するアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約50%の類似性を有するアミノ酸配列をコードする配列をコードするか、あるいはそれに対して相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子が提供される。
なお他の関連する態様は、実質的に配列番号:8に記載するアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約50%の類似性を有するアミノ酸配列をコードする配列をコードするか、あるいはそれに対して相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子を提供する。
他のそれ以上の態様において、実質的に配列番号:15に記載するアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約50%の類似性を有するアミノ酸配列をコードする配列をコードするか、あるいはそれに対して相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子が提供される。
なおしかも他のそれ以上の態様は、実質的に配列番号:19に記載するアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約50%の類似性を有するアミノ酸配列をコードする配列をコードするか、あるいはそれに対して相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子を提供する。
なおしかも他のそれ以上の態様は、実質的に配列番号:23に記載するアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約50%の類似性を有するアミノ酸配列をコードする配列をコードするか、あるいはそれに対して相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子に関する。
したがって、本発明は、本発明の核酸分子のすべてまたは一部分および/またはその任意の相同体または関連する形態またはこれらの任意のアンチセンス形態を含有するすべてのトランスジェニック植物、特に変更された花の色を示すトランスジェニック植物に拡張される。トランスジェニック植物は、F3'Hをコードする配列をコードするか、あるいはそれに対して相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる導入された核酸分子を含有することができる。一般に、核酸は植物のゲノムの中に安定に導入されるであろうが、本発明は、また、自律的に複製する核酸配列、例えば、植物細胞内で複製することができるDNAまたはRNAウイルス内へのF3'Hヌクレオチド配列の導入に拡張される。また、本発明は、このようなトランスジェニック植物からの種子に拡張される。このような種子は、特に着色されている場合、植物の登録された標識として有用であろう。
本発明のなお他の面は、植物または植物細胞中の3'-ヒドロキシル化アントシアニンのレベルを調節するとき使用できる遺伝構築物の製造における本明細書において記載する遺伝子配列の使用を包含する。
本発明の他の面は、F3'Hまたはその誘導体をコードする配列をコードするか、あるいはそれに対して相補的であるヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子に関し、ここで前記核酸分子は植物細胞の中で発現することができる。用語「発現する」は上記において定義した用語「発現」に等しい。
図面において:
明細書を通じて使用したアミノ酸の略号を下記表2に示す。
フラボノイド3'-ヒドロキシラーゼの単離および関係する核酸配列
ペチュニア
使用したペチュニア・ヒブリダ(Petunia hybrida)品種を表5に表す。
ジアンサス・カリオフィルス(Dianthus caryophyllus)cv.Kortina Chanelを、ヴァン・ワイク・アンド・サン・フラワー・サプライ(Van Wyk and Son Flower Supply)(ヴィクトリア)から入手した。
下記のように規定した発生段階において、ジアンサス・カリオフィルスの花を収獲した:
段階1:閉じた芽、花弁は見えない。
段階2:花の芽が開く;花弁の先端が見える。
段階3:ほとんどすべての花弁は露出する。「塗料はけの段階」。
段階4:幹に対して45°の外側の花弁。
段階5:花が完全に開く。
使用したアンチリヌム・マジュス(Antirrhinum majus)系統を、親の系統K16(eos - )およびN8(Eos + )から誘導した。F3'H活性とフラボン、フラボノールおよびアントシアニンの3'-ヒドロキシル化をコントロールすることが知られているEos + 遺伝子(ForkmannおよびStotz、1981)との間に、厳格な相関が存在する。K16はF3'H活性を欠如する同型劣性突然変異体であるが、N8はF3'H活性に対して野生型である。これらの系統は類似するが、同質遺伝子的ではない。親の系統および自殖した(K16×N8)F1 植物からの種子の双方を、C.Martin博士(John Innes Centre、英国ノーウィッチ)から入手した。
アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)Columbia(Tt7)、Landsberg erecta(Tt7)およびNW88(tt7)を、ノッチンガム・アラビドプシス・ストック・センター(Nottingham、Arabidopsis Stock Centre)から入手した。野生型アラビドプシス・タリアナ(A.thaliana)(Tt7)種子は特徴ある褐色を有する。tt7突然変異体の種子は淡い褐色の種子であり、そして植物は葉における減少したアントシアニン含量により特徴づけられる(Koornneef et al.、1982)。Tt7植物はシアニジン産生するが、tt7突然変異体はペラルゴニジンを蓄積し、Tt7遺伝子がフラボノイドの3'-ヒドロキシル化をコントロールすることを示す。
ロサ・ハイブリダ(Rosa hybrida)cv.Kardinalを、ヴァン・ワイク・アンド・サン・フラワー・サプライ(Van Wyk and Son Flower Supply)(ヴィクトリア)から入手した。
ロサ・ハイブリダの花の発生の段階を、下記のように規定した:
段階2:色素沈着あり、きつく閉じた芽(15mmの高さ;9mmの幅)。
段階3:色素沈着あり、閉じた芽;萼片はちょうど開く(25〜30mmの高さ;13〜15mmの幅)。
段階4:花芽は開き始める;花弁は高度に色素沈着する;萼片は分離した(芽は25〜30mmの高さおよび18mmの幅である)。
段階5:萼片は完全に開いた;多少カールしている。花弁は高度に色素沈着し、開いている(芽は30〜33mmの高さおよび20mmの幅である)。
キクの花の発生の段階を、下記のように規定した:
段階0:可視の花芽の非存在。
段階1:花芽は可視である;小花は苞により完全に覆われている。
段階2:花芽は開いている;小花の先端は可視である。
段階3:小花は緊密にオーバーラップしている。
段階4:ほとんどすべての小花の先端は露出している;外側の小花は開いているが、いずれも水平ではない。
段階5:外側の小花は水平である。
段階6:花は成熟に近づいている。
クローニングベクターpBluescriptは、ストラタジーン(Stratagene)から入手した。
大腸菌(E.coli)DH5α細胞の形質転換は、Inoue et al.(1990)の方法に従い実施した。
DNAプローブの 32 P標識化
オリゴ標識化キット(Bresatec)を使用して、DNAフラグメント(50〜100ng)を50μCiの[α-32P]-dCTPで放射性標識化した。セファデックス(Sephadex)G-50(Fine)カラム上のクロマトグラフィーにより、取り込まれない[α-32P]-dCTPを除去した。
アプライド・バイオシステムス(Applied Biosystems)からのPRISMTMレディー・リアクション・ダイ・プライマー・サイクル・配列決定キット(Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing Kit)を使用して、DNAの配列決定を実施した。製造業者が供給したプロトコールに従った。サイクル配列決定反応をパーキン・エルマー(Perkin Elmer)PCR機械(GeneAmp PCR System9600)を使用して実施し、自動化373A DNA配列決定装置(Applied Biosystems)により実験した。
MacVecterTM6.0アプリケーション(OxfordMolecular Ltd.)の中に組込まれたクルスタル(Clustal)Wプログラムを使用して、多数の配列の整列(2のktup値)を実施した。
Ht1遺伝子座に連鎖しかつペチュニアフラボノイド経路においてフラボノイド3'-ヒドロキシラーゼ(F3'H)表わしたcDNAクローンを単離するために、段階1〜3のオールド・グローリイ・レッド(OGR)ペチュニアの花ホルマリン単離されたRNAから、花弁cDNAライブラリーを調製した。OGR花はシアニジンをベースとする色素を含有し、そして高いレベルのフラボノイド3'-ヒドロキシラーゼ活性を有する。
TurpenおよびGriffith(1986)の方法を使用して、ペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)cv.OGRの段階1〜3の花弁組織から、全体のRNAを単離した。oligotex-dTTM(Qiagen)を使用して、全体のRNAからポリ(A)+ RNAを選択した。 ZAP-cDNA ギガパックIIIゴールド・クローニング(Gigapack III Gold Cloning)キット(Stratagene)を使用して、鋳型としてOGRの段階1〜3から単離された5μgのポリ(A)+RNAを使用して、λZAP中で方向的花弁cDNAライブラリーを構築した。得られた組換え体の合計の数は2.46×106 であった。
F3'5'Hのプローブ
Holton et al.(1993)および米国特許第5,349,125号に記載されているようにHf1またはHf2遺伝子座に相当する2つのフラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼを、スクリーニングプロセスにおいて使用した。
Hf1またはHf2遺伝子座に相当する2つのフラボノイド3',5'ヒドロキシラーゼを単離するために使用したスクリーニングプロセス(Holton et al.(1993);米国特許第5,349,125号)において、多数のシトクロムP450cDNAクローンが単離された。ヤエナリからの以前に特性決定されたC4H(Mizutani et al.、1993)を使用する配列の同定に基づいて、これらのクローンの1つの(F1)(pCGP161の中に含有される)(第2図)はシンナメート4-ヒドロキシラーゼ(C4H)を表すとして同定された。ペチュニアF1cDNAクローンの5'末端における295ヌクレオチドから、配列のデータを発生させた。配列決定された295ヌクレオチドにわたってヤエナリC4Hクローンと83.1%の類似性が存在し、そして予測されたアミノ酸配列にわたって93.9%の類似性が存在した。
pCGP619(第5図)の中に含有される651cDNAクローンの単離および同定は、公開番号WO93/20206を有する国際特許出願に記載された。pYE22m(Tanaka etal.、1988)の酵母グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの制御下に651cDNAクローンを含有する酵母のタンパク質抽出物は、F3'H活性を示した。
ハイブリダイズの前に、重複プラークのリフトを予備洗浄溶液(50mMのTris-HCl、pH7.5、1MのNaCl、1mMのEDTA、0.1%(w/v)のサルコシン)中で65℃において30分間洗浄し、0.4Mの水酸化ナトリウム中で65℃において30分間ストリップし、次いで0.2MのTris-HCl、pH8.0、0.1×SSC、0.1%(w/v)のSDSの溶液中で65℃において30分間洗浄し、2×SSC、1.0%(w/v)のSDS中で完全にすすいだ。
フラボノイド3'-ヒドロキシラーゼ活性をコントロールする2つの遺伝子座、Ht1およびHt2、がペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)の中に存在した(Tabak et al.、1978;Wieringおよびde Vlaming、1984)。Ht1はペチュニア・ヒブリダの花の拡大部および管の双方において発現され、そして管においてのみ発現されるHt2よりも高いレベルのF3'H活性を生ずる。F3'Hはジヒドロケンプフェロールおよびナリンゲニンを、それぞれ、ジヒドロクエルセチンおよびエリオジクチオールに変換することができる。
本質的にDellaporta et al.(1983)が記載するように、DNAを葉の組織から単離した。DNA調製物をCsCl浮遊密度遠心(Sambrook et al.、1989)によりさらに精製した。
遺伝子操作DNA(10μg)を60単位のEcoRIで16時間消化し、そしてTAE(40mMのTris-酢酸塩、50mMのEDTA)の流れる緩衝液中で0.7%(w/v)のアガロースゲルを通して電気泳動させた。次いでDNAを変性溶液(1.5MのNaCl/0.5MのNaOH)中で1〜1.5時間変性し、0.5MのTris-HCl(pH7.5)/1.5MのNaCl中で2〜3時間中性し、次いで20×SSC中のハイボンド(Hybond)N(Amersham)フィルターに移した。
TurpenおよびGriffith(1986)の方法を使用して、ペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)cv.OGR段階1〜3の花の花弁組織から、全体のRNAを単離した。
40mMのモルホリノプロパンスルホン酸(pH7.0)、5mMの酢酸ナトリウム、0.1mMのEDTA(pH8.0)を含有する流れる緩衝液を使用して、2.2Mのホルムアルデヒド/1.2%(w/v)のアガロースゲルを通して、RNAサンプルを電気泳動させた。製造業者が記載するようにハイボンド(Hybond)-Nフィルター(Amersham)にRNAを移した。
サザンブロットおよびRNAブロットを32P標識化cDNA断片(108 cpm/μg、2×106 cpm/ml)でプローブした。プレハイブリダイズ(42℃において1時間)およびハイブリダイズ(42℃において16時間)を50%(w/v)のホルムアミド、1MのNaCl、1%(w/v)のSDS、10%(w/v)の硫酸デキストラン中で実施した。フィルターを2×SSC、1%(w/v)のSDS中の65℃において1〜2時間洗浄し、次いで0.2×SSC、1%(w/v)のSDS中の65℃において0.5〜1時間洗浄した。増強スクリーンを使用して-70℃においてフィルターを16時間Kodak XARフィルムに露出した。
RFLPを使用して、Ht1遺伝子座に対するOGR-27、OGR-38およびOGR-39のcDNAクローンに対応する遺伝子の連鎖を研究した。
OGR-27、OGR-38およびOGR-39のcDNAクローンの32P標識化フラグメントを使用して、VR×V23戻し交配集団における個々の植物から単離されたゲノムDNAのRNAブロットおよびサザンブロットをプローブした。VR×V23戻し交配集団から単離されたEcoRI消化ゲノムDNAは、Ht1に連鎖したOGR-38プローブについてRFLPを明らかにした。さらに、VR様系統において検出された転写体の高いレベルに比較したとき、V23様系統において非常に減少したレベルの転写体が検出された(第6図)。
データは、プラスミドpCGP1805の中に含有されるOGR-38cDNAクローンがHt1に相当しかつF3'Hを表すという強い証拠を提供した。
RFLP分析を使用して、既知の遺伝子座に対するOGR-38のcDNAクローンに対応する遺伝子の連鎖を研究した。
MapMakerマッピングプログラムのMacintosh(登録商標)バージョン2.0(DuPont)(Lander et al.、1987)を使用して、RFLP分析を実施した。連鎖の限界値について、3.0のLODスコアを使用した。
5つのペチュニアOGR花弁の発生段階の各から単離された、ならびに葉、萼片、根、幹、花梗、子房、葯および花柱から単離された、全体のRNAの20μgを含有するRNAブロットに対するプローブとして、OGR-38cDNAインサートの32P標識化フラグメントを使用することによって、OGR花弁、ならびに他のOGR組織における発生の発現のプロフィルを決定した。OGR-38プローブは1.8kbの転写体とハイブリダイズし、これは花発生の1〜3のより若い段階においてピークとなった。転写体にハイブリダイズするOGR-38は花弁および子房において最も豊富であり、また、OGR植物の萼片、花梗および葯において検出された。また、低いレベルの転写体は幹において検出された。使用した条件下に、葉、花柱または根から単離された全体のRNAのノザン分析により、ハイブリダイズする転写体は検出されなかった。
ランダムにオーバーラップするクローンを発生する標準的手法(Sambrook et al.、1989)を使用して得られた異なるpUC18サブクローンからの配列を収集することによって、OGR-38cDNAクローンの完全な配列(配列番号:1)を決定した。この配列は、512アミノ酸の推定上のポリペプチドをコードする1536塩基のオープンリーディングフレームを含有した。
pYE22m(Tanaka et al.、1988)の酵母グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの背後において「センス」の向きでpCGP1805からのOGR-38cDNAインサートをクローニングすることによって、プラスミドpCGP1646(第7図)を構築した。
酵母G-1315株(Matα、trp1)(Ashikari et al.、1989)をIto et al.(1983)に従いpCGP1646で形質転換した。G-1315をトリプトファンプロトトロピーに回復するそれらの能力により、形質転換体を選択した。
G-1315/pCGP1646の単一の単離物を使用して50mlの変更バークホルダー培地(Modified Burkholder's medium)(20.0g/lのデキスロース、2.0g/lのL-アスパラギン、1.5g/lのKH2 PO4 、0.5g/lのMgSO4 ・7H2 O、0.33g/lのCaCl2 、2g/lの(NH4 )2 SO4 、0.1mg/lのKI、0.92g/lの(NH4 )6 Mo7 O24・4H2 O、0.1g/lのニトリロ三酢酸、0.99mg/lのFeSO4 ・7H2 O、1.25mg/lのEDTA、5.47mg/lのZnSO4 ・7H2 O、2.5mg/lのFeSO4 ・7H2 O、0.77mg/lのMnSO4 ・7H2 O、0.196mg/lのCuSO4 ・5H2 O、0.124mg/lのCo(NH4 )2 (SO4 )2 ・6H2 O、0.088mg/lのNa2 B4 O7 ・10H2 O、0.2mg/lのチアミン、0.2mlのピリドキシン、0.2mg/lのニコチン酸、0.2mg/lのパントテネート、0.002mg/lのビオチン、10mg/lのイノシトール)を接種し、引き続いてこれをOD600 における値が30℃において1.8となるまでインキュベートした。
StotzおよびForkmann(1982)により記載されている方法の変更バージョンを使用して、F3'H酵素活性を測定した。アッセイ混合物は典型的には100μlの酵母抽出物、5μlのアッセイ緩衝液(100mMのリン酸カリウム(pH8.0)、1mMのEDTAおよび20mMの2-メルカプトエタノール)中の50mMのNADPHおよび10μCiの[3 H]-ナリンゲニンを含有し、そしてアッセイ緩衝液で210μlまでの最終体積にした。23℃において2〜16時間インキュベートした後、反応混合物を0.5mlの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル期を真空下に乾燥し、次いで10μlの酢酸エチルの中に再懸濁させた。トリチウム化フラボノイド分子を、セルロースの薄層プレート(Merck Art 5577、ドイツ国)上でクロロホルム:酢酸:水(10:9:1v/v)溶媒系を使用して分離した。反応生成物をオートラジオグラフィーにより局在化し、反応生成物に沿って展開する非反応性ナリンゲニンおよびエリオジクチオールの標準と比較することによって同定し、紫外線下に可視化した。
pCGP293(Brugliera et al.、1994)のMacプロモーター(Comai et al.、1990)の背後に「センス」の向きでpCGP1805からのcDNAインサートをクローニングすることによって、プラスミドpCGP1867(第8図)を構築した。プラスミドpCGP1805をXbaIおよびKpnIで消化して、cDNAインサートを解放した。ブレサクリー・キット(Bresatec)を使用して、cDNAフラグメントを単離し、精製し、pCGP293バイナリーベクターのXbaI/KpnI端と結合させた。アマーシャム結合キットを使用して、結合を実施した。ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離されたDNAのXbaI/KpnI制限酵素分析により、pCGP1867中のフラグメントの正しい挿入は確立された。
pCGP1867中のOGR-38cDNAフラグメントが植物中の機能的F3'Hを表示するかどうかを決定するために、一時的発現の研究を確立した。突然変異体ペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)Skr4×SW63系統の花弁を、pCGP1867DNAでコーティングした金粒子(直径1μm)で衝撃した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)の形質転換
50mlのMG/L(GarfinkelおよびNester、1980)培養物を接種し、28℃において震盪しながら16時間増殖することによって調製した100μlのコンピテントAGL0細胞に、5μgのプラスミドDNAを添加することによって、プラスミドpCGP1867(第8図)をアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)AGL0株の中に導入した。次いで細胞をペレット化し、0.5mlの85%(w/v)の100mMのCaCl2 /15%(v/v)のグリセロールの中に再懸濁させた。
(a)植物材料
ペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)cv.Skr4×SW63の成熟植物からの葉組織を1.25%(w/v)の次亜塩素酸ナトリウム中で2分間処理し、次いで無菌の水中で3回すすいだ。次いで葉組織を25mm2 の正方形にカットし、0.05mg/lのカイネチンおよび1.0mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)を補充したMS培地(MurashigeおよびSkoog、1962)上で24時間前培養した。
100mg/lのゲンタマイシンを含有するMG/L寒天平板上で4℃において、バイナリーベクターpCGP1867(第11図)を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)AGL0株を維持した。1%(w/v)のバクト-ペプトン、0.5%(w/v)のバクト-酵母エキスおよび1%(w/v)のNaClを含有する液体培地中で、単一のコロニーを一夜生長させた。
同時培養後、葉ディスクを選択培地(3%(w/v)のスクロース、2mg/mlのα-ベンジルアミノプリン(BAP)、0.5mg/lのα-ナフタレン酢酸(NAA)、300mg/lのカナマイシン、350mg/lのセフォタキシムおよび0.3%(w/v)のゲルライト・ゲラン・ガム(Gelrite Gellan Gum)(Schweizerhall)を補充したMS培地)に移した。再生する外植体を4週後に新鮮な選択培地に移した。
pCGP1867プラスミドで形質転換されたSkr4×SW63植物で得られた種々の花弁および花粉の色の表現型を、表7に示す。トランスジェニック植物#593A、590A、571A、589A、592Aおよび591Aは、変更した花弁色をもつ花を産生した。そのうえ、植物#593A、590A、589A、592Aおよび591Aからの花の葯および花粉は、白色である対照Skr4×SW63植物のそれらと比較して、ピンク色であった。
pCGP1867で形質転換されたSkr4×SW63植物の花弁および雄蕊(花粉、葯およびフィラメントを含む)において産生されたアントシアニンおよびフロバノールを、TLCにより分析した。
TLC分析の前に、花弁および雄蕊の抽出物の中に存在するアントシアニンおよびフロバノールの分子を酸加水分解し、アントシアニンまたはフロバノールのコアからグリコシル部分を除去した。アントシアニンおよびフロバノールの標準を使用して、花の抽出物の中に存在する化合物の同定を促進した。
トランスジェニックSkr4×SW63/pCGP2167植物の花弁および雄蕊の中の3'-ヒドロキシル化アントシアニン、ペオニジンの蓄積は、同一植物の花弁、葯および花粉において観察されたピンク色および暗いピンク色と相関した。
F3'H活性のレベルを減少するために、プラスミドpCGP1867を、また、ペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)cv.オールド・グローリイ・レッド(Old Glory Red)(Ht1)の中に導入した。
上記実施例9に記載されているように、形質転換を実施した。
38のトランスジェニック植物のうちの2つは変更された表現型をもつ花を産生した。OGRは通常深い赤色の花を産生した(PHSCC#46B)。変更された花の色をもつ2つのトランスジェニック植物は、淡いピンク色または淡い赤色の色相をもつ花を産生した(PHSCC#54Bおよび#53C)。
対照の花および淡いピンク色のトランスジェニック花におけるアントシアニンのレベルを、分光光度測定分析により測定した。
2mlのメタノール/1%(v/v)HCl中で200〜300mgの花弁拡大部を4℃において16時間インキュベートすることによって、アントシアニンおよびフロバノールを花弁拡大部から抽出した。次いで50μlのこの溶液を950μlのメタノール/1%(v/v)HClに添加し、そして希釈した溶液の吸収を530nmにおいて測定した。下記の式を使用して、アントシアニンのレベル(nmol./g)を決定した:[(吸収(530nm)/34,000)×抽出緩衝液の体積×希釈係数×106 ]/重量(g)。
これらのデータが示唆するように、OGR植物の中にセンスの向きでペチュニアのF3'H(OGR-38)cDNAクローンを導入すると、内因性およびトランスジェニックの双方のF3'H転写体は「共抑制」(減少)される。より淡い色、アントシアニン産生の減少およびF3'H転写体レベルの減少の間に相関が観察された。
ジアンサス・カリオフィルス(カーネーション)のF3'HcDNAクローンを単離するために、pCGP1805(前述)の中に含有される、ペチュニアのHt1連鎖F3'HcDNAクローン(OGR-38)を使用して、低いストリンジェンシイ条件下に、カーネーション(Carnation)cv.コルチナ・チャネル(Kortina Chanel)の花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。
コルチナ・チャネルの花の段階1、2および3から単離された(以前に記載されたように)20μgの全体のRNAを、1×スーパースクリプト(SuperscriptTM)反応緩衝液、10mMのジチオスレイトール(DTT)、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、500μMの5-メチル-dCTP、ZAP-cDNAギガパック(Gigapack)IIIゴールド・クローニング(Gold Cloning)キット(Stratagene)からの2.8μgのプライマー-リンカーオリゴおよび2μlのスーパースクリプト(SuperscriptTM)逆転写酵素(BRL)を含有する50μlの体積中で逆転写した。反応混合物を37℃において60分間インキュベートし、次いで氷上に配置した。ZAP-cDNAギガパックIIIゴールド・クローニング・キット(Stratagene)を使用して、ライブラリーの構築を完結した。組換え体の合計の数は2.4×106 であった。
ハイブリダイズの前に、重複プラークのリフトを以前に記載されたように処理した。コルチナ・チャネルの花弁のcDNAライブラリーからの重複リフトを、pCGP1805からの1.8kbのEcoRI/XhoIの32P標識化フラグメントでスクリーニングした。ペチュニアのOGRcDNAライブラリーのスクリーニングについて記載したように、低いストリンジェンシイ条件を使用した。
pCGP1807の中に含有されるKC-1cDNAインサートはEcoRI/XhoIで消化するとき解放され、そして約2kbであった。KC-1cDNAインサートのサブクローンからの配列の収集により、KC-1cDNAクローンの完全な配列を決定した。(pBluescriptの中にサブクローニングしてpCGP1808を得たKC-1の3'領域をカバーする800bpのKpnIフラグメントから、458ヌクレオチドをカバーする部分的配列を発生させた。)完全な配列(配列番号:3)は、500アミノ酸の推定上のポリペプチド(配列番号:4)をコードする1508塩基のオープンリーディングフレームを含有した。
pCGP1810の調製
pCGP90(米国特許第5,349,125号)、pCGP293をベースとする構築物(Brugliera et al.、1994)、のMacプロモーター(Comai et al.、1990)の背後において「センス」の向きでpCGP1807からのcDNAインサートをクローニングすることによって、プラスミドpCGP1810(第9図)を構築した。プラスミドpCGP1807をBamHIおよびApaIで消化して、KC-1cDNAインサートを解放した。ブレサクリーン(Bresaclean)キット(Bresatec)を使用して、cDNAフラグメントを単離し、精製した。
Skr4×SW63におけるpCGP1810
Skr4×SW63ハイブリッドにおける導入されたKC-1cDNAの発現は、花の色に対して顕著な作用を有した。pCGP1810で形質転換された12のトランスジェニック植物のうちの10は、Skr4×SW63対照(RHSCC#74C)と比較して、変更された花弁の色(RHSCC#73A)をもつ花を産生した。そのうえ、トランスジェニック花の葯および花粉は、白色である対照のSkr4×SW63植物と比較して、ピンク色であった。
トランスジェニックSkr4×SW63植物の花弁の中の3'-ヒドロキシル化アントシアニン、ペオニジンの蓄積は、同一植物の花弁において観察された暗いピンク色と相関した。
pCGP1958のMacプロモーター(Comai et al.、1990)の背後において「センス」の向きでpCGP1807から単離されたcDNAをクローニングすることによって、プラスミドpCGP1811を構築した。pCGP1958は、MacプロモーターおよびpCGP619主鎖中のマンノパインシンターゼ(mas)(Comai et al.、1990)ターミネーターを含有する。pCGP1807をPstIおよびXhoIで消化してcDNAインサートを解放した。DNAポリメラーゼ(クレノーフラグメント)(Sambrook et al.、1989)を使用して、オーバーハンギング5'末端を充填した。ブレサクリーン・キット(Bresatec)を使用して、cDNAフラグメントを単離し、精製し、pCGP1958ベクターのSmaI末端と結合してpCGP1811を生成した。
実施例9に記載されているように、バイナリーベクターpCGP1813をアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株の細胞の中に導入した。pCGP1813/AGL0細胞を使用してカーネーション植物を形質転換して、3'-ヒドロキシル化フラボノイドの量を減少させた。
ジアンサス・カリオフィルス(cv.Kortina Chanel)の挿し木を、ヴァン・ワイク・アンド・サン・フラワー・サプライ(Van Wyk and Son Flower Supply)(オーストリア国ヴィクトリア)から入手した。外側の葉を除去し、挿し木を70%v/vエタノール中で短時間滅菌し、次いで1.25%w/v次亜塩素酸ナトリウム(ツイーン20を含む)中で6分間滅菌し、無菌の水で3回洗浄した。同時培養の前に、すべての可視の葉および腋芽を解剖顕微鏡下に除去した。
バイナリーベクターpCGP1813を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスAGL0株(Lazo et al.、1991)を、50mg/lのテトラサイクリンを含むLB寒天平板上で4℃において維持した。50mg/lのテトラサイクリンを含む液体LBブロス中で単一のコロニーを一夜生長させ、次の日に接種前に5×108 細胞/mlに希釈した。3%w/vのスクロース、0.5mg/lのBAP、0.5mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)、100mMのアセトスリンゴンおよび0.25%w/vのゲルライト(Gelrite)(pH5.7)を補充したMS培地上で、ジアンサス幹組織をアグロバクテリウムとともに5日間同時培養した。
形質転換された幹組織を選択するために、各同時培養した幹の上部6〜8mmを3〜4mmのセグメントに切断し、次いでこれらを0.3%w/vのスクロース、0.5mg/lのBAP、0.5mg/lの2,4-D、1μg/lのクロルスルフロン、500mg/lのテトラサイクリンおよび0.25%w/vのゲルライトを補充したMS培地(MurashigeおよびSkoog、1962)に移した。
新規なアプローチを使用して、アンチリヌム・マジュス(Antirrhinus majus)(キンギョソウ)からのF3'HをコードするcDNA配列を単離した。(i)重複オリゴヌクレオチドを使用する植物のシトクロムP450配列の単離(Holton et al.、1993)および(ii)真核メッセンジャーRNAの異なる表示(LiangおよびPardee、1992)のプロトコールに基づく変更された方法を組合わせて、野生型(Eos + )およびF3'H突然変異体(eos - )キンギョソウの系統の間の花弁のシトクロムP450転写体の集団を比較した。
使用したアンチリヌム・マジュス(Antirrhinus majus)系統は、親の系統K16(eos - )およびN8(Eos + )から誘導された。K16はF3'H活性を欠如する同型劣性突然変異体であるが、N8はF3'H活性の野生型である。これらの系統は類似するが、同質遺伝子的ではない。自殖したK16×N8F1 植物(#E228)からのカプセルE2282 の種子を発芽させ、そして生ずる植物(K16×N8F2 植物)をシアニジン、すなわち、F3'H活性の産物、の存在または非存在についてスコアをつけた(第1a図および第1b図を参照のこと)。
TurpenおよびGriffith(1986)の方法を使用して、アンチリヌム・マジュス(A.majus)K16×N8F2 を分離する集団(E2282 )の植物#13の葉および植物#3、#5および#12の花弁組織から、全体のRNAを単離した。製造業者が推奨する緩衝液中で37℃において40単位のRNasinR リボヌクレアーゼインヒビター(Promega)の存在下に、50μgの全体のRNAを1単位のRQ1RNアーゼ不含DNアーゼ(Promega)で処理することによって、汚染するDNAを除去した。次いで、フェノール/クロロホルム/イソ-アミルアルコール(25:24:1)で抽出し、引き続くエタノール沈降により、RNAをさらに精製した。
ポリT-anchA TTTTTTTTTTTTTTTTTA 配列番号:27
ポリT-anchC TTTTTTTTTTTTTTTTTC 配列番号:28
ポリT-anchG TTTTTTTTTTTTTTTTTG 配列番号:29
重複オリゴヌクレオチド(植物のシトクロムP450のコーディング配列の3'末端付近の保存された配列に対して相補的であるように設計された)およびポリTアンカーオリゴヌクレオチドを使用して、シトクロムP450配列を増幅した。同様なアプローチは従来ペチュニア・ヒブリダ(Petunia hybrida)からシトクロムP450配列を発生するために使用され、そして米国特許第5,349,125号に記載されている。
WAIGRDP(配列番号:30) TGG GCI ATI GGI (A/C)GI GA(T/C) CC(配列番号:31)
FRPERF(配列番号:32) AGG AAT T(T/C)(A/C) GIC CIG A(A/G)(A/C) GIT T(配列番号:33)
Pet Haem-New CCI TT(T/C) GGI GCI GGI (A/C)GI (A/G)GI ATI TG(T/G) (C/G)CI GG(配列番号:34)
EFXPERF(配列番号:35) GAI TT(T/C) III CCI GAI (A/C)GI TT(配列番号:36)
5%(w/v)のポリアクリルアミド/尿素の変性ゲル(Sambrook et al.、1989)上で分離した後、33P標識化PCRフラグメントを可視化した。33P標識化M13amp18配列決定ラダーをゲル上に含めて、サイズマーカーとして働かせた。配列決定ゲルをワットマン(Whatman)3MM紙上に乾燥させ、そして室温においてKodak XARフィルムに対して露出させた。
シアニジン産生花弁サンプルと非シアニジン産生花弁サンプルとの間のバンドを比較すると、シアニジン産生花弁の中に独占的に存在するmRNAを表す11のバンドが明らかになった。これらの11のバンドのうちで、2つのみが葉のサンプルの中にまた存在した(減少した強度で)。
PCR生成物を乾燥した配列決定ゲルから精製し、Lianget al.(1993)が記載する方法により再増幅した。1.2%(w/v)のアガロース/TAEゲル上で電気泳動分離後、ブレサクリーン・キット(Bresatec)を使用して、増幅されたcDNAを精製した。次いで、精製されたフラグメントを、商業的に調製されたpCR-ScriptTMベクター(Stratagene)、あるいはMarchuk et al.(1990)のプロトコールを使用してT-テイルドされたEcoRV線状化pBluescriptR (Stratagene)の中に直接的に結合した。
11のクローニングした分別表示PCR生成物(500bpを越えないインサートをもつ)の各々を双方の鎖上で配列決定しそして、PearsonおよびLipamn(1988)を使用して、アントシアニン生合成に関係する他の既知のシトクロムP450配列に対して比較した。
再び、制限フラグメント長さの多形性(RFLP)の分析を使用して、花弁中のシアニジン産生活性の存在または非存在に対するcDNAクローンAm3Gaに対応する遺伝子の連鎖を研究した。Am3Gaの32P標識化インサートを使用して、K16×N8F2 分離植物ならびに親のK16およびN8系統から単離されたゲノムDNAのサザンブロットをプローブした。
分別表示により示されるように、推定上のシトクロムP450フラグメントの発現プロフィルを確証するために、ノザン分析を使用した。8つのK16×N8F2 分離集団からの10μgの全体の花弁RNAを1.2%(w/v)のアガロース/ホルムアルデヒドゲル(Sambrook et al.、1989)上で分離し、ハイボンドNナイロン膜(Amersham)に移した。また、シアニジン産生植物#13からの葉RNAをノザン分析において陰性の対照として含めた。クローンAm3GaからのcDNAインサートの32P標識化フラグメントを使用して、RNAブロットをプローブした。
部分的Am3Gaクローンの配列の知識を使用する全長のF3'HcDNAクローンを単離するために、Frohman et al.(1988)のcDNA Ends(RACE)プロトコールの急速増幅を用いた。遺伝子特異的プライマー(Am3Ga配列361-334に対して相補的な「SnapredRace A」)を合成して、花弁RNAからの逆転写を可能とした。また、3'増幅プライマー(Am3Ga(3'UTR)配列283-259に対して相補的な「SnapredRace C」)を合成して、「SnapredRace A」のちょうど上流を結合した。「ポリ(C)」プライマーを使用して、cDNA分子の5'末端からの配列を増幅した。
Snapred Race A CCA CAC GAG TAG TTT TGG CAT TTG ACC C (配列番号:37)
Snapred Race C GTC TTG GAC ATC ACA CTT CAA TCT G (配列番号:38)
PolyC race CCG AAT TCC CCC CCC CC(配列番号:39)
生ずる1.71kbのDNAフラグメント(sdF3'H)を、Marchuk et al.(1990)のプロトコールを使用してTテイルを有するEcoRV線状化pBluescriptR(Stratagene)ベクターの中に直接的にクローニングした。このプラスミドをpCGP246と命名した。
pCGP246のsdF3'HのcDNA配列内の好都合な制限部位を利用して、プラスミドベクターpC19において1連の短いオーバーラッピングサブクローンを発生させた。これらのサブクローンの各々の配列を収集して、全体のsdF3'H RACE cDNAの配列を得た。sdF3'H cDNA配列をクローンAm3Gaからのそれとカップリングして、キンギョソウのF3'HcDNAの全体の配列を得た(配列番号:5)。それは512アミノ酸の推定上のポリペプチド(配列番号:6)をコードする1711塩基のオープンリーディングフレームを含有する。
キンギョソウsdF3'H配列は、翻訳を開始するように作用することができる2つの「インフレーム」ATGコドンを含有する。これらのコドンの第1(配列番号:5の位置91)からの開始は追加の10のN-末端のアミノ酸をもつタンパク質を与え、そして翻訳の走査モデルに従い確証づけられるであろう(Kozak、1989)。
pCGP293(Brugliera et al.、1994)のMacプロモーター(Comai et al.、1990)の背後において「センス」の向きでpCGP246からの全体のsdF3'H RACE cDNAインサート(位置1から1711まで(配列番号:5))をクローニングすることによって、プラスミドpCGP250(第13図)をつくった。プラスミドpCGP246をEcoRIで消化してcDNAインサートを解放した。
pCGP293(Brugliera et al.、1994)のMacプロモーター(Comai et al.、1990)の背後において「センス」の向きで、第1「インフレーム」ATGコドン(位置1から1711まで(配列番号:5))の下流に、pCGP246からのRACE cDNAインサートをクローニングすることによって、プラスミドpCGP231(第14図)をつくった。プラスミドpCGP246をSspI(これは候補のATGコドンの間の部位を認識する)およびSmaI(ベクターのポリリンカー配列の中に部位をもつ)で消化して平滑末端のcDNAフラグメントを解放した。このフラグメントは第2の推定上の開始コドンから下流に全体のコーディング領域を含む。次いで、XbaIで線状化しそしてDNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントを使用して平滑末端とされた、バイナリーベクターの中にcDNAフラグメントを結合した。アマーシャム結合キットを使用して結合を実施した。pCGP231の中のインサートの正しい挿入は、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離されたDNAのBamHIおよびPstI制限酵素分析により確立された。
pCGP231およびpCGP250中のpCGP246配列が植物における活性なフラボノイド3'-ヒドロキシラーゼをコードしたかどうかを急速に決定するために、一過性発現の研究を実施した。実施例8に記載する方法を使用して、pCGP231またはpCGP250でコーティングされた金粒子(直径1μm)で、突然変異体ペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)Skr4×SW63の花弁を衝撃した。
実施例9に記載するように、バイナリーベクターpCGP250およびpCGP231をアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)AGL0株の細胞の中に導入した。pCGP250/AGL0およびpCGP231/AGL0の細胞を使用してSkr4×SW63ペチュニア植物(また、実施例9に記載されている)を形質転換して、キンギョソウsdF3'HcDNAクローンに対応する遺伝子によりコードされる酵素の安定な発現および活性を試験した。
酸加水分解した花の抽出物(実施例11を参照のこと)をフォレスタル(Forestal)溶媒系(HOAc:水:HCl;30:10:3)(Markham、1982)中で展開した。sdF3'HcDNAクローンをSkr4×SW63の中に導入すると、花弁において3'-ヒドロキシル化フラボノイド、ペオニジンのレベルは増加した。ペオニジンはシアニジンのメチル化誘導である(第1a図および第1b図)。
アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)からフラボノイド3'-ヒドロキシラーゼを表すcDNAを単離するために、シトクロムP450の保存された領域からの色素を使用して、PCRフラグメントを発生させた。1つのPCR生成物(p58092.13)は、ペチュニアOGR-38およびキンギョソウF3'HcDNAクローンと高い配列の類似性を有することが見出された。次いでPCRフラグメントを、pCGP1805からのHt1cDNAインサート(OGR-38)と一緒に、使用して、アラビドプシス・タリアナ(A.thaliana)cDNAライブラリーをスクリーニングした。
ヘム結合ドメイン付近に位置するペチュニア・ヒブリダ(P.hybrida)シトクロムP450の部分的配列のコンセンサスアミノ酸配列から、PCR DNA増幅のための縮重オリゴヌクレオチドを設計した。各コドンの第3塩基(A、T、G、およびCに対して同様な効率を有するデオキシイノシン)(下記においてIと表示する)を含め、そしてコンセンサス配列が非特異的である場合別の塩基を含めることによって、プライマーの縮重は確立された。したがって、ヘム結合のためにきわめて重要なシステイン残基のコドンを含有するアミノ-末端の方向プライマー「Pet Haem」(ペチュニアのヘム結合ドメイン)、および上流のプライマー「WAIGRDP」(また、実施例15を参照のこと)を設計した。
Pet Haem CCI GG(A/G) CAI ATI C(G/T)(C/T)(C/T)TI CCI GCI CC(A/G) AAI GG(配列番号:40)
Dellaporta et al.(1987)が記載する方法を使用して、アラビドプシス・タリアナ(A.thaliana)エコタイプCloumbiaからゲノムDNAを単離した。シトクロムP450相同体の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応は、典型的には、100〜200ngのCloumbiaゲノムDNA、10mMのTris-HCl(pH8.3)、5mMのKCl、1.5mMのMgCl2 、0.01%(w/v)のゼラチン、0.2mMの各dNTP、312ngの「WAIGRDP」および484ngの「Pet Haem」および1.25単位のTaqポリメラーゼ(Cetus)を含有した。反応混合物(50μl)を、94℃において50秒間、45℃において50秒間および72℃において45秒間のサイクルに40回かけた。
15の形質転換体からのプラスミドDNAを調製した(DelSal et al.,1989)。これらのPCRフラグメントから発生した配列決定データは、15のうちの11がユニークなクローンを表すことを示した。また、アラビドプシス・タリアナ(A.thaliana)PCRインサート内にコードされた翻訳された配列の中に、シトクロムP450コンセンサスアミノ酸の独特の組が見出された。また、PCRフラグメントの配列を、ペチュニアのOGR-38F3'HcDNAクローンおよびキンギョソウF3'HcDNAクローンの配列と比較した。PCRフラグメント、p58092.13は、ペチュニアおよびキンギョソウの双方からのF3'H配列に最も類似した。
p58092.13のPCR生成物のcDNAライブラリーを単離するために、pCGP1805の中に含有されるペチュニアHt1cDNAインサート(OGR-38)の32P標識化フラグメントと一緒に、p58092.13の32P標識化フラグメントで、アラビドプシス・タリアナ(A.thaliana)エコタイプCloumbiacDNAライブラリー(Newman et al.、1994;D'Alessio et al.、1992)をスクリーニングした。
ハイブリダイズの前に、2枚のプラークのリフトを予備洗浄溶液(50mMのTris/HCl、pH7.5、1MのNaCl、1mMのEDTA、0.1%(w/v)のサルコシン)中で65℃において30分間洗浄し、0.4Mの水酸化ナトリウム中で65℃において30分間ストリップし、次いで0.2MのTris-HCl、pH8.0、0.1×SSC、0.1%(w/v)のSDS中で65℃において30分間洗浄し、最後に2×SSC、1.0%(w/v)の中ですすいだ。
ペチュニア、カーネーション、キンギョソウ、ナズナ、バラ、キクおよびトレニアの配列の整列(それらのすべてはこの明細書に開示されている)、およびヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列の間の配列の類似性の比較の種々の要約は、それぞれ、表7の中に、および表8、9、10、11および12の中に見出すことができる。これらの表は、この明細書の終わりにおける、実施例34の中に存在する。
アラビドプシス・タリアナ(A.thaliana)F3'H遺伝子のゲノムのコロニーを単離するために、アラビドプシス・タリアナ(A.thaliana)生態型Landsbergのエレクタ(erecta)ゲノムDNAを32P標識化p60606.04フラグメントでスクリーニングした。BamHI消化バクテリオファージラムダEMBL4抗生物質耐性マーカーの間に部分的MboI消化ゲノムDNAをクローニングすることによって、ライブラリーをつくった。スクリーニングの前に、30,000クローンを含有する主要なライブラリーを1回増幅した。
Tt7ゲノムのクローンのフラグメントの大部分を含有するpTt7-2からの6.4kbのBamHIフラグメントを、標準的技術(Sambrook et al.、1989)に従い、精製し、自己結合し、超音波処理し、末端修復し、サイズ分画し(450bp〜800bp)そしてSmaIで切断したpCGP619の中にクローニングした。組換えクローンを単離し、そしてDNAを精製し、M13-21またはM13逆配列決定プライマーを使用して配列決定した。オーバーラップするクローンからの配列を組合わせて、1つの隣接するフラグメントにした。また、-21およびREVプライマーを使用する配列決定により、Tt7ゲノムのフラグメントの末端の配列を得た。配列のすべてを一緒に組合わせて、E-5(配列番号:9)からの6.5kbのEcoRI/SalIフラグメントの完全な配列を得た。
バイナリーベクターの調製
E-5からのEcoRI/SalIフラグメントを、EcoRI/SalI切断pBI101(Jefferson et al.、1987)の中にクローニングした。2つの別々であるが、同一のクローンが同定された:pBI-Tt7-2(第15図)およびpBI-Tt7-4。双方のクローンをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)の形質転換に使用した。
プラスミドpBI-Tt7-2、pBI-Tt7-4およびpBI101を、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウム(Agrobacterium)GV3101pMP90株の中に形質転換した。50μg/mlのカナマイシン(およびレジデントpMP90について選択するために50μg/mlのゲンタマイシン)を含有する培地上で、形質転換体を選択した。
各クローンについて4つの形質転換体のコロニーからのプラスミドDNAを単離し、EcoRI/SalIで消化し、電気泳動させ、サザンブロットし、そしてTt7cDNAインサートでプローブした。pBI-Tt7-2およびpBI-Tt7-4について、期待したインサートのバンドが同定された。
これらの形質転換体を移植し、成熟に生長させ、個々に種子について収穫した。各場合において、pBI-Tt7-2-3およびpBI-Tt7-4-4の形質転換体について、種子はtt7突然変異体植物の薄い褐色よりも可視的に褐色であった。対照形質転換体からの種子はtt7突然変異体の親と区別できなかった。これらの種子を栄養培地およびカナマイシンを添加した栄養培地の上に移植し、そしてTt7表現型(子葉の境界および下子葉部において赤色/紫色のアントシアニン色素)およびカナマイシン耐性についてスコアをつけた。各種子のロットについて少なくとも1つの形質転換体の子孫は、明らかに独立の形質転換の事象であったので、それらを検査した。
バラのF3'HcDNAクローンを単離するために、pCGP1805の中に含有されるペチュニアHt1cDNAクローン(OGR-38)およびpCGP246の中に含有されるキンギョソウF3'HcDNAクローン(sdF3'H)の32P標識化フラグメントで、ロサ・ハイブリダ(Rosa hybrida)cv.Kardinal花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。
ロサ・ハイブリダcv.Kardinal段階2の芽から、全体のRNAを調製した。この段階において、緊密に閉じた芽は高さ1.5cm、幅ほぼ0.9cmであり、薄いピンク色の花弁を有した。
凍結した組織(1〜3g)を液体窒素中で乳鉢および乳棒で粉砕し、25mlの前もって冷却した緩衝液A[0.2Mのホウ酸、10mMのEDTA(ナトリウム塩)(pH7.6)]の中に入れ、短時間均質化した。抽出物が室温に到達するまで、抽出物を回転震盪機上で混合し、等しい体積のフェノール/クロロホルム(1:v/v)(緩衝液Aと平衡化した)を添加した。さらに10分間混合した後、RNA調製物を10,000×gで20℃において10分間遠心した。上部の水性相を保持し、前述したようにフェノール界面を再抽出した。水性相をプールし、0.1Mの酢酸ナトリウム(pH6.0)に調節し、2.5体積の95%エタノールを添加し、この混合物を-20℃において一夜貯蔵した。
ハイブリダイズ前に、重複プラークリフトを予備洗浄溶液(50mMのTris-HCl、pH7.5,1MのNaCl、1mMのEDTA、0.1%(w/v)のサルコシン)中で65℃において30分間洗浄し、0.4Mの水酸化ナトリウム中で65℃において30分間ストリップし、次いで0.2MのTris-HCl、pH8.0、0.1×SSC、0.1%(w/v)のSDSの溶液中で30分間洗浄し、最後に2×SSC、1.0%(w/v)のSDS中ですすいだ。
バラから「全長の」F3'HcDNAクローンを単離するために、実施例24に記載するロサ・ハイブリダ(Rosa hybrida)cv.カージナル(Kardinal)花弁cDNAライブラリーをバラR4cDNAクローン(前述の)の32P標識化フラグメントでスクリーニングした。
ハイブリダイズ前に、重複プラークリフトを実施例24に記載されているように処理した。
カージナルcDNAライブラリーからの重複リフトを、バラR4cDNAクローンからのEcoRIフラグメントの32P標識化フラグメントでスクリーニングした。
XL1-Blue MRF'細胞を10mlの溶融したNZY上部寒天に添加し、NZYプレート(直径15cm)上に注ぎ、固化させた。レプリカプレート装置を使用して、前もってXL1-Blue MRF'細胞を接種したNZYプレート上に規則的配列中の73のファージ単離物を移した。37℃において6時間インキュベートし、次いで4℃において一夜インキュベートした後、製造業者が推奨するように、三重リフト(配列1、2および3)を重複リフトをコロニー/プラーク・スクリーン(Colony/Plaque ScreenTM)フィルター(DuPont)上に取り、処理した。
最終の洗浄を0.1×SSC、0.1%(w/v)のSDS中の65℃において30分間実施した以外、前述のハイブリダイズおよび洗浄条件を使用して、3つの配列をa)バラR4cDNAクローンの5'末端をカバーするEcoRI/SalIフラグメント、b)バラR4cDNAクローンの5'末端をカバーするEcoRI/ClaIフラグメントまたはc)全体のバラR4cDNAクローンのEcoRIフラグメントの32P標識化フラグメントでスクリーニングした。増強スクリーンを使用してKodak XARフィルムに対して-70℃において16時間フィルターを露出した。
pCGP2166の調製
pCGP293(Brugliera et al.、1994)のMacプロモーター(Comai et al.、1990)の背後において「センス」の向きでpCGP2158からのcDNAインサートをクローニングすることによって、プラスミドpCGP2166(第16図)を構築した。プラスミドpCGP2158をEcoRIで消化してcDNAインサートを解放させた。DNAポリメラーゼ(クレノーフラグメント)(Sambrook et al.、1989)を使用して、オーバーハンギング5'を充填した。cDNAフラグメントを単離し、pCGP293バイナリーベクターの充填したBamHI末端と結合させた。pCGP2166中のフラグメントの正しい挿入は、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析により確立された。
Skr4×SW63ハイブリッドにおける導入されたバラF3'HcDNAの発現は、花の色に対して顕著な効果を有した。非トランスジェニック対照の雄蕊組織は白色であるが、トランスジェニック植物の大部分における同一組織はピンク色であった。さらに、Skr4×SW63ハイブリッドにおけるバラF3'HcDNA発現は、通常薄いライラック色(RHSCC#75C)である花冠に暗いピンク色の色相(RHSCC#64Cおよび74C)を付与した。色コードはロイアル・ホーティカルチュラル・ソサイアティーズ・カラー・チャート(Royal Horticultrural Society's Colour Chart)(RHSCC)から採用する。それらは観察された色の表現型を記載する別の手段を提供する。しかしながら、表示された番号は知覚された色に対する指針としてのみ取るべきであり、得ることができる可能な色の限定として見るべきではない。
トランスジェニックSkr4×SW63/pCGP2166植物における3'-ヒドロキシル化フラボノイド、ペオニジンおよびフロバノール、クエルセチンの蓄積は、同一植物の花弁において観察されたピークおよび暗いピンク色と相関した。
CaMV35Sプロモーター(Franck et al.、1980;Guilley et al.、1982)とocsターミネーター(De Greve et al.、1982)との間に「センス」の向きでpCGP2158からのcDNAインサートをクローニングすることによって、バイナリー構築物pCGP2169(第17図)を構築した。プラスミドpCGP1634はCaMV35Sプロモーター、大腸菌(E.coli)uidA遺伝子座(Jefferson et al.、1987)によりコードされるβ-グルクロニダーゼ(GUS)リポーター遺伝子およびpCGP619ベクター中のocsターミネーター領域を含有した。プラスミドpCGP2158をNcoI/XbaIで消化してcDNAインサートを解放させた。
キクF3'HcDNAクローンを単離するために、キクcv.Red Minstral花弁cDNAライブラリーをpCGP1805の中に含有されるペチュニアHt1cDNAクローン(OGR-38)の32P標識化フラグメントでスクリーニングした。
製造業者の推奨に従いトリゾル(TrizolTM)試薬(Life Technology)(ChomczynskiおよびSacchi、1987)を使用して、キクcv.Red Minstralの花弁(段階3〜5)から全体のRNAを調製した。オリゴ-(dT)アフィニティースパン-カラムクロマトグラフィーに頼るmRNA単離キット(Pharmacia)を使用して、ポリ(A)+ RNAを全体のRNAから濃縮した。
Y1090r-をトランスフェクトした後、30,000pfusのライブラリーをLBプレート(Sambrook et al.、1989)上に3,000pfu/直径15cmのプレートの密度でプレートした。4℃において1時間インキュベートした後、製造業者が推奨するように、重複リフトをハイボンド(Hybond)N+TMフィルター(Amersham)上に取り、処理した。
Red Minstral花弁cDNAライブラリーからの重複リフトを、pCGP1805からの1.8kbのAsp718/BamHIインサートの32P標識化フラグメントでスクリーニングした。
ハイブリダイズ条件は、1mMのEDTA(pH8.0)、0.5MのNa2 HPO4 (pH7.2)、7%(w/v)のSDS(ChurchおよびGilbert、1984)中の65℃における少なくとも1時間のプレハイブリダイズ工程を含んだ。次いで32P標識化フラグメント(1×106 cpm/ml)をハイブリダイズ溶液に添加し、ハイブリダイズを65℃においてさらに16時間実施した。次いでフィルターを2×SSC、0.1%(w/v)のSDS中で65℃において2×1時間洗浄し、増強スクリーンを使用して-70℃において48時間Kodak BioMaxTMフィルムに露出した。
pART7(Gleave、1992)の中に含有される完全なCaMV35Sプロモーターの背後において「アンチセンス」の向きでpCHRM1からのRM6icDNAインサートをクローニングすることによって、pLN84と表示するプラスミドを構築した。プラスミドpCHRM1をNotIで消化してcDNAインサートを解放させた。アガロースゲル電気泳動およびGELアーゼ(Epicentre Technologies)後、RM6icDNAフラグメントをT4DNAポリメラーゼ(Sambrooket al.、1989)で平滑末端とし、精製した。
トレニア(torenia)F3'HcDNAクローンを単離するために、pCGP1805の中に含有されるペチュニアHt1cDNAクローン(OGR-38)を使用して、低いストリンジェンシイ条件下に、トレニア・フォウルニエリ(Torenia fournieri)cv.Summer Waveの花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。
本質的に実施例4に記載するように、方向的花弁cDNAライブラリーをSummer Waveから調製した。
pCGP1805からの1.8kbのOGR-38cDNAインサートのDIG標識化フラグメントで、合計200,000の増幅したSummer Waveの花弁cDNAライブラリーのリフトをスクリーニングした。ベーリンガー・マンヘイム(Boehringer Mannheim)からのDIG DNA標識化・検出キットを製造業者の推奨に従い使用した。
pYE22m(Tanaka et al.、1988)の酵母グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの背後において「センス」の向きでpTHT6からのcDNAインサートをクローニングすることによって、プラスミドpYTHT6(第19図)を構築した。プラスミドpYTHT6をTHT6cDNAクローンを含有した。THT6は、5'非コーディング領域が75bpだけ短い以外、THT52と同一であった。
酵母の形質転換、酵母抽出物の調製およびF3'Hアッセイは実施例6に記載されている。
F3'H活性はG1315/pYTHT6の抽出物において検出されたが、非トランスジェニック酵母の抽出物において検出されなかった。これから、THT6cDNAインサートはpYTHT6、コード化F3'Hの中に含有されることが結論された。
ヒルガオF3'HcDNAクローンを単離するために、pCGP1805の中に含有されるペチュニアHt1cDNAクローン(OGR-38)を使用して、低いストリンジェンシイ条件下に、日本ヒルガオの花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。
ファービチス・ニル(Pharbitis nil)(日本ヒルガオ)の若い花弁からの花弁cDNAライブラリーをIIda博士(国立基礎生物学研究所、日本国)から入手した。
pCGP1805からの1.8kbのOGR-38cDNAインサートのDIG標識化フラグメントで、合計200,000の増幅した日本ヒルガオの花弁cDNAライブラリーのリフトをスクリーニングした。ベーリンガー・マンヘイム(BoehringerMannheim)からのDIG DNA標識化・検出キットを製造業者の推奨に従い使用した。
リンドウF3'HcDNAクローンを単離するために、pCGP1805の中に含有されるペチュニアHt1cDNAクローン(OGR-38)を使用して、低いストリンジェンシイ条件下に、ゲンチアナ・トリフロラ(Gentiana triflora)Pall.var japonica Haraの花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。
Tanaka et al.、1988が記載するように、ゲンチアナ・トリフロラ(Gentiana triflora)Pall.var japonica Haraの花から、花弁cDNAライブラリーを調製した。
pCGP1805からの1.8kbのOGR-38cDNAインサートのDIG標識化フラグメントで、合計200,000の増幅したリンドウの花弁cDNAライブラリーのリフトをスクリーニングした。ベーリンガー・マンヘイム(Boehringer Mannheim)からのDIG DNA標識化・検出キットを製造業者の推奨に従い使用した。
リシアンサスF3'HcDNAクローンを単離するために、pCGP1805の中に含有されるペチュニアHt1cDNAクローン(OGR-38)を使用して、低いストリンジェンシイ条件下に、リシアンサスの花弁cDNAライブラリーをスクリーニングした。
Y1090r-をトランスフェクトした後、Davies et al.(1993)およびMarkhamおよびOffman(1993)が記載する10,000pfusのリシアンサス花弁cDNAライブラリーをLBプレート(Sambrook et al.、1989)上に3,000pfu/直径15cmのプレートの密度でプレートし、37℃において15時間インキュベートした。4℃において1時間インキュベートした後、製造業者が推奨するように重複リフトをハイボンド(Hybond)N+TMフィルター(Amersham)上に取り、処理した。
リシアンサス#54花弁cDNAライブラリーからの重複リフトを、pCGP1805からの1.8kbのAsp718/BamHIインサートの32P標識化フラグメントでスクリーニングした。
配列の比較に基づいて、pL3-6はペチュニアOGR-38F3'HcDNAクローンとの類似性を示し、さらに特性決定した。
実施例3に記載されているクラスタル(Clustal)Wプログラムを使用して、多数の配列の整列を実施した。表7(下)は下記の予測されたアミノ酸配列の多数の配列の整列を提供する:ペチュニアOGR-38(A);カーネーション(B);キンギョソウ(C);ナズナTt7コーディング領域(D);バラ(E);キク(F);トレニア(G);ヒルガオ(H);リンドウ(部分的配列)(I);リシアンサス(部分的配列)(J)およびペチュニア651cDNA(K)。保存されたアミノ酸はボールドフェースの大文字で示されており、囲まれ、陰影をつけられている。同様なアミノ酸は大文字で示されており、薄く陰影をつけられており、そして非類似のアミノ酸は小文字で示されている。
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Claims (14)
- フラボノイド3'−ヒドロキシラーゼをコードする配列番号:3に示されるヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子。
- 配列番号:3に示されるヌクレオチド配列を有する核酸に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることが出来、フラボノイド3'−ヒドロラーゼをコードする核酸分子であって、当該フラボノイド3'−ヒドロラーゼが、配列番号:26に示されるヌクレオチド配列によりコードされるフラボノイド3'−ヒドロラーゼに比べて、植物中でフラボノイド化合物のヒドロキシル化のより効率よいモジュレーションを行うことが出来る、ことを特徴とする核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子。
- 配列番号:4に示されるアミノ酸配列を有するフラボノイド3'−ヒドロキシラーゼをコードする核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子。
- 配列番号:4に示されるアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するフラボノイド3'−ヒドロキシラーゼをコードする核酸分子であって、当該フラボノイド3'−ヒドロラーゼが、配列番号:26に示されるヌクレオチド配列によりコードされるフラボノイド3'−ヒドロラーゼに比べて、植物中でフラボノイド化合物のヒドロキシル化のより効率のよいモジュレーションを行うことが出来る、ことを特徴とする核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子。
- 植物においてフラボノイド3'−ヒドロキシラーゼをコードする内因性遺伝子の発現を減少することが出来る遺伝子構築物であって、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子を含んでなる遺伝子構築物。
- フラボノイド3'−ヒドロキシラーゼを合成することが出来るトランスジェニック植物の製造方法において、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子により植物の細胞を安定に形質転換し、前記植物の細胞からトランスジェニック植物を再生し、そしてフラボノイド3'−ヒドロキシラーゼを合成することが出来る前記トランスジェニック植物を選択する、ことを含んでなる方法。
- 内因性の又は既に存在するフラボノイド3'−ヒドロキシラーゼの活性が低下しているトランスジェニック植物の製造方法において、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子により植物の細胞を安定に形質転換し、前記植物の細胞からトランスジェニック植物を再生し、そしてフラボノイド3'−ヒドロキシラーゼの活性が低下している前記トランスジェニック植物を選択する、ことを含んでなる方法。
- 前記核酸分子を受容する植物が、ペチュニア、カーネーション、キク、キンギョソウ、タバコ、ムギナデシコ(cornflower)、フクロソウ、リシアンサス(lisianthus)、ガーベラ、リンゴ、アイリス、ユリ、アフリカスミレ及びヒルガオから選択される、請求項6又は7に記載の方法。
- フラボノイド化合物のヒドロキシル化の調整が可能なトランスジェニック植物の製造方法において、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子により植物の細胞又は細胞群を安定に形質転換する、ことを含んである方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のヌクレオド配列を含む核酸分子を含んでなるトランスジェニック植物であって、変更された色を示す組織を有するトランスジェニック植物。
- 請求項10に記載のトランスジェニック植物からの切花。
- 請求項10に記載のトランスジェニック植物からの種子。
- 請求項10に記載のトランスジェニック植物からの果実。
- 請求項10に記載のトランスジェニック植物からの葉。
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