JP4098836B2 - 塩基不安定性アミノ保護基を用いるpnaの合成 - Google Patents
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Description
ペプチド核酸(PNA)はデオキシリボースホスフェート骨格がペプチドオリゴマーによって置換されたDNA類縁体の化合物である。これまでに、文献に報告されてきたその合成(Michael Egholm, Peter E. Nielsen, Ole Buchardt & Rolf H. Berg, J. Am. Chem. Soc, 1992, 114, 9677-9678;Ole Buchardt, Michael Egholm, Peter E. Nielsen & Rolf H. Berg, WO 92/20702)では、モノマ−のアミノ基を一時的に保護するために、中等度の強度の酸、たとえばトリフルオロ酢酸で除去される酸不安定性の三級ブチルオキシカルボニル(Boc)保護基が用いられている。オリゴマーの固相合成では、ついで慣用の、たとえばMerrifield(B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149)によって記載されたペプチド合成法に従って行われる。この場合、固体支持体からPNAオリゴマーを切断するために、強酸、通常は液体フッ化水素が使用される。その結果、これらの反応条件とくにトリフルオロ酢酸による反復処理は、たとえば、多重ペプチドシンセサイザー[総説:G. Jung & A. Sickinger, Angew. Chem. 104(1992)375-391]が採用される場合のような開放反応容器での反応は許容されない。
【0002】
本発明の目的は、PNAオリゴマーの構築のために、塩基不安定性の一時的アミノ保護基を使用し、弱いまたは中等度の強さの酸を用いる固体支持体からのオリゴマーの切断を可能にする合成方法を開発することにある。
【0003】
本発明は、式I
【化9】
[式中、
R0は水素、C1〜C18−アルカノイル、C1〜C18−アルコキシカルボニル、C3〜C8−シクロアルカノイル、C7〜C15−アロイル、C3〜C13−ヘテロアロイル、またはオリゴマーの細胞内取り込みに好ましいかまたはハイブリダイゼーションを誘導する標的核酸と相互作用する基であり、
Aは、好ましくはグリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロキノリン−3−カルボン酸、オクタヒドロインドール−2−カルボン酸およびN−(2−アミノエチル)グリシンの群からのアミノ酸残基であり、
kは0から20まで、好ましくは0から10までの整数であり、
Qは、好ましくはグリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロキノリン−3−カルボン酸、オクタヒドロインドール−2−カルボン酸およびN−(2−アミノエチル)グリシンの群からのアミノ酸残基であり、
lは0から20まで、好ましくは0から10の整数であり、
Bはヌクレオチド化学において慣用されるヌクレオチド塩基、たとえばアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルのような天然のヌクレオチド塩基、またはプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N4,N4−エタノシトシン、N6,N6−エタノ−2,6−ジアミノプリン、5−メチルシトシン、5−(C3〜C6)−アルキニル−ウラシル、5−(C3〜C6)−アルキニル−シトシン、5−フルオロウラシルもしくはプソイドイソシトシン、2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾロピリミジン、あるいはそれらのプロドラッグ型であり、
Q0はヒドロキシル、NH2またはNHR″(R″はC1〜C18−アルキル、C2〜C18−アミノアルキルまたはC2〜C18−ヒドロキシアルキルである)であり、
nは1〜50、好ましくは4〜35の整数である]
のPNAオリゴマ−を製造するにあたり、
基Q0を潜在的様式で含有するアンカー基Lを備える式II
L−[ポリマー] (II)
のポリマー支持体に、固相合成に慣用される方法を用いて、いずれかのアミノ酸(Q')を最初にカップリングさせ、中間体として式III
(Q′)1−L−[ポリマー] (III)
(式中、Lは上に定義した通りであり、Q′は必要に応じて側鎖が保護されているアミノ酸Qであり、lは0から20までの整数である)を得、ついで、
a) 式IV
【化10】
(式中、
PGは塩基不安定性アミノ保護基であり、そして
B′は環外アミノ官能基が保護されているヌクレオチド塩基である)の化合物を、ペプチド化学において慣用されるカップリング試薬を用いて、式IIIの化合物にカップリングさせるか、または式IVの化合物を式IIのポリマー支持体に直接カップリングさせ、
b) 一時的な、塩基不安定性保護基PGを、適当な試薬を用いて除去し、
c) 工程aおよびbをn−1回反復し、
d) Aとして定義されたアミノ酸であるが、必要に応じてそれらの側鎖が保護されたアミノ酸A′をさらに、固相合成に慣用される方法を用いてカップリングさせ、ついでR0が水素ではない場合には慣用方法を用いて基R0を導入し、
e) 中間体として得られる式Ia
【化11】
(式中、R0、A′、k、B′、n、Q′およびlは上に定義した通りであり、Lはアンカー基である)の化合物を開裂剤を用いてポリマー支持体から切断し、ヌクレオチド塩基の環外アミノ官能基およびアミノ酸の側鎖に必要に応じて存在する保護基を同時にまたは別個に除去することにより式Iの化合物を得る方法に関する。
【0004】
オリゴマーの細胞内取り込みに好ましい基の例には、各種の親油性基たとえば−(CH2)x−CH3(式中、xは6〜18の整数である)、−(CH2)n−CH=CH−(CH2)m−CH3(式中、nおよびmは互いに独立に6〜12の整数である)、−(CH2CH2O)4−(CH2)9−CH3、−(CH2CH2O)8−(CH2)13−CH3および−(CH2CH2O)7−(CH2)15−CH3、ならびにステロイド残基たとえばコレステリル、またはビタミン残基たとえばビタミンE、ビタミンAまたはビタミンD、および天然のキャリアー系たとえば胆汁酸、葉酸、2−(N−アルキル、N−アルコキシ)−アミノアントラキノンを使用する他のコンジュゲート、ならびにマンノースおよびオリゴマーの受容体仲介エンドサイト−シスに導く相当する受容体のペプチドたとえばEGF(上皮増殖因子)、ブラジキニンおよびPDGF(血小板由来増殖因子)のコンジュゲートがある。標識基は、たとえばダンシル−(N−ジメチル−1−アミノナフチル−5−スルホニル−)誘導体、フルオレセイン誘導体もしくはクマリン誘導体の蛍光基、またはたとえばアクリジン誘導体の化学発光基ならびにELISAを用いて検出可能なジゴキシゲニン系、ビオチン/アビジン系を用いて検出可能なビオチン基、または後で検出可能なレポーター基によって誘導体化することが可能な官能基を有する他のリンカーアームたとえば活性アクリジニウムエステルと反応して化学発光プローブを形成するアミノアルキルリンカーを意味するものと理解すべきである。
【0005】
代表的な標識基は以下の基である。
【化12】
【0006】
オリゴマーの標的核酸とのハイブリダイゼーションに際して、結合、架橋またはクリアリングによって核酸を攻撃する基はたとえば、アクリジン、ソラレン、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリールのコンジュゲートである。代表的な挿入残基および架橋残基は以下の通りである。
【0007】
【化13】
【0008】
官能基Q0を潜在的様式で含有するアンカー基Lは、たとえば、George Barany,Nancy Kneib-Cordonier & Daniel G.Mullen,Int.J.Peptide Protein Res.,1987,30,705-739;Gregg B.Fields & Richard L.Noble,Int.J.Peptide Protein Res.,35,1990,161-214;K.Barlos,D.Gatos,J.Hondrelis,J.Matsoukas,G.J.Moore,W.Schaefer & P.Sotiriou,Liebigs Ann.Chem.1989,951-955;H.Rink,Tetrahedron Lett.1987,3787-3790;G.Breiphol,J.Knolle & R.Geiger,Tetrahedron Lett.1987,5647-5650;G.Breipohl,J.Knolle & W.Stueber,Int.J.Peptide Protein Res.,1989,34,262-267;W.Stueber,J.Knolle & G.Breipohl,Int.J.Peptide Protein Res.,1989,34,215-220;またはEP-A-0 264 802(HOE 86/F259),EP-A-0 287 882(HOE 86/F101)およびEP-A-0 322 348(HOE 87/F386K)に記載されている。
【0009】
基Q0を潜在的様式で含有するアンカー基を備えたポリマ−支持体の例には、4−アルコキシベンジルアルコール樹脂、2−メトキシ−4−アルコキシベンジルアルコール樹脂、2−クロロトリフェニルメチル樹脂、2,4−ジメトキシベンズヒドリルアミン樹脂もしくは4−(2′,4′−ジメトキシフェニルアミノメチル)フェノキシメチル樹脂、または第一アミノ基で官能化されているポリマ−支持体、たとえばRpolyHIPE,RTentagel,RControlled Pore Glassもしくはポリスチレン上に、基Q0を潜在的様式で含有するアンカー基の一つ、たとえば4−(4′−メトキシベンズヒドリル)フェノキシ酢酸、4−(4′−メトキシベンズヒドリル)フェノキシ酪酸、4−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸、2−メトキシ−4−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸、5−(4−アミノメチル−3,5−ジメトキシフェノキシ)吉草酸、3−(アミノ−4−メトキシベンジル)−4−メトキシフェニルプロピオン酸、5−(アミノ−4−メトキシベンジル)−2,4−ジメトキシフェニルプロピオン酸、4−(アミノ−(C2〜C8)アルキルアミノカルボニルオキシメチル)フェノキシ酢酸、シュウ酸モノ(アミノ−C2〜C16−アルキル)エステルまたはコハク酸モノ(アミノ−C2〜C16−アルキル)エステルがカップリングされたポリマー支持体がある。
【0010】
以下のアンカー基、または既にポリマ−支持体に結合しているアンカー基の使用が好ましい。すなわち、4−アルコキシベンジルアルコール樹脂、メトキシ−4−アルコキシベンジルアルコール樹脂もしくは2−クロロトリフェニルメチル樹脂、または基Q0を潜在的様式で含有するアンカー基、4−(4′−メトキシベンズヒドリル)フェノキシ酪酸、4−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸、2−メトキシ−4−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸、5−(アミノ−4−メトキシベンジル)−2,4−ジメトキシフェニルプロピオン酸、4−(アミノ−(C2〜C8)−アルキルアミノカルボニルオキシメチル)フェノキシ酢酸、シュウ酸モノ(アミノ−C2〜C16−アルキル)エステルもしくはコハク酸モノ(アミノ−C2〜C16−アルキル)エステルがRTentagel,RControlled Pore Glassもしくはポリスチレン型の支持体上にカップリングされている樹脂であって第一アミノ基で官能化されているポリマーである。
【0011】
塩基不安定性アミノ保護基PGの例としては、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)および2,2−[ビス(4−ニトロフェニル)]エトキシカルボニル(Bnpeoc)がある(W.Koenig,D.Buecher,R.Knuettel,K.Lindner & A.Volk,Proceedings of the Akabori Conference,Grainau-Eibsee/Bavaria,1985年6月12〜13日、32頁およびR.Ramage,A.J.Blake,M.R.Florence,Th,Gray,G.Raphy & P.L.Roach,Tetrahedron 1991,37,8001-8024)、2−(2,4−ジニトロフェニル)エトキシカルボニル(Dnpeoc)(M.Acedo,F.Albericio,R.Eritja,Tetrahedron Lett.1992,4989-4992)、2−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル(Msc)および1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)(B.W.Bycroft,W.C.Chan,S.R.Chabra & N.D.Home,J.Chem.Soc.Chem.Commun.1993,778-779)がある。Fmoc、BnpeocおよびDnpeocの使用が好ましく、Fmoc保護基がとくにきわめて好ましく使用される。
【0012】
上述の合成方法の工程aにおいて用いられた、ペプチド合成において慣用される活性化方法はたとえば、Houben Wyle,Methoden der Organischen Chemie(有機化学の方法)15/2巻,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,1974に記載されている。その他の試薬たとえばBOP(B.Castro,J.R.Dormoy,G.Evin & C.Selve,Tetrahedron Lett.1975,1219-1222),PyBOP(J.Coste,D.Le-Nguyen & B.Castro,Tetrahedron Lett.1990,205-208),BroP(J.Coste,M.-N.Dufour,A.Pantaloni & B.Castro,Tetrahedron Lett.1990,669-672)またはPyBroP(J.Coste,E.Frerot,P.Jouin & B.Castro,Tetrahedron Lett.1991,1967-1970)およびウロニウム試薬たとえばHBTU(V.Dourtoglou,B.Gross,V.Lambropoulou,C.Zioudrou,Synthesis,1984,572-574),TBTU,TPTU,TSTU,TNTU(R.Knorr,A.Trezeciak,W.Bannwarth & D.Gillessen,Tetrahedron Lett.1989,1927-1930),TOTU(EP-A-0 460 446),HATU(L.A.Carpino,J.Am.Chem.Soc.1993,115,4397-4398),HAPyU,TAPipU(A.Ehrlich,S.Rothemund,M.Brudel,M.Beyermann,L.A.Carpino & M.Bienert,Tetrahedron Lett.1993,4781-4784)またはBOI(K.Akaji,N.Kuriyama,T.Kimura,Y.Fujiwara & Y.Kiso,Tetrahedron Lett.1992,3177-3180)、または酸クロリドもしくは酸フルオリド(L.A.Carpino,H.G.Chao,M.Beyermann & M.Bienert,J.Org.Chem.56(1991),2635);J.-N.Bertho,A.Loffet,C.Pinel,F.Reuther & G.Sennyey,〔in E.Giralt & D.Andreu(編)〕Peptides 1990,Escom Science Publishers B.V.1991,53-54頁;J.Green & K.Bradley,Tetrahedron,1993,4141-4146),2,4,6−メシチレンスルホニル−3−ニトロ−1,2,4−トリアゾリド(MSNT)(B.Blankemeyer-Menge,M.Nimitz & R.Frank,Tetrahedron Lett.1990,1701-1704)、2,5−ジフェニル−2,3−ジヒドロ−3−オキソ−4−ヒドロキシチオフェンジオキシド(TDO)(R.Kirstgen,R.C.Sheppard,W.Steglich,J.Chem.Soc.Chem.Commun.1987,1870-1871)、あるいは活性化エステル(D.Hudson Peptide Res.1990,51-55)が対応する参考文献に記載されている。
【0013】
カルボジイミド、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドの使用が好ましい。ホスホニウム試薬、たとえばPyBOPもしくはPyBroP、ウロニウム試薬、たとえばHBTU、TBTU、TPTU、TSTU、TNTU、TOTUもしくはHATU、BOIまたは酸クロリドもしくは酸フルオリドも同様に好ましく使用される。
【0014】
この場合、カップリングは直接、樹脂に、アミノ酸誘導体または式IVのPNAモノマーを活性化試薬とともに加え、必要に応じて添加物、たとえば1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(W.Koenig,R.Geiger,Chem.Ber.103,788(1970))もしくは3−ヒドロキシ−4−オキソ−3,4−ジヒドロベンゾトリアゾール(HOOBt)(W.Koenig,R.Geiger,Chem.Ber.103,2034(1970))を添加して行うことができ、または構造成分を別個に予め活性化して活性化エステルを形成させ、活性化した種の溶液を適当な溶媒中、カップリング可能なポリマーに添加することができる。
【0015】
塩基不安定性アミノ保護基PGと適合性がある保護基は弱酸または中等度の強度の酸に不安定な保護基、たとえばウレタン型たとえば三級ブチルオキシカルボニル(Boc)、4−メトキシベンジルオキシカルボニル(Moz)もしくは3,5−ジメトキシフェニル−2−プロピル−2−オキシカルボニル(Ddz)、またはトリチル型たとえばトリフェニルメチル(Trt)、(4−メトキシフェニル)ジフェニルメチル(Mmt)、(4−メチルフェニル)ジフェニルメチル(Mtt)、ジ−(4−メトキシフェニル)フェニルメチル(Dmt)もしくは9−(9−フェニル)キサンテニル(pixyl)が、環外アミノ機能が保護されるヌクレオチド塩基B′における環外アミノ機能を保護するために使用される.ブチルオキシカルボニル(Boc)、トリフェニルメチル(Trt)、(4−メトキシフェニル)ジフェニルメチル(Mmt)、(4−メチルフェニル)ジフェニルメチル(Mtt)またはジ−(4−メトキシフェニル)フェニルメチル(Dmt)の使用はとくに好ましく、Trt、Mtt、MmtおよびDmtは驚くべきことに、モノマーの溶解性に著しい改善を生じる。とくに、(4−メトキシフェニル)ジフェニルメチル(Mmt)の使用はきわめて好ましい。
【0016】
塩基不安定性アミノ保護基PGを除去するための試薬の例にはピペリジン、モルホリン、ヒドラジンまたは1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU)のジメチルホルムアミド、N−メチルピロリジノン(NMP)、アセトニトリル(ACN)またはジクロロメタン(DCM)中溶液がある。DMFまたはN−メチルピロリジノン中20%ピペリジンならびにDMF中2%DBUおよび2%ピペリジンの混合物、またはDMF中0.1MのDBUもしくはジクロロメタン中0.1MのDBUの使用はFmoc、DnpeocおよびBnpeoc保護基にとくに好ましい。
【0017】
式Iaのアミノ酸残基Q′およびA′のカップリングは、好ましくは式IVの化合物にも使用される同じアミノ保護基PGをもつアミノ酸誘導体を用いて行われるのが好ましい。存在するアミノ酸の側鎖の官能基には、たとえばBoc、Moz、OtBu、tBu、Trt、MtrまたはPmcのような弱酸ないし中等度の強度の酸に不安定な保護基を付与する。この場合、PG−Gly−OH、PG−Lys(Boc)−OH、PG−Arg(Mtr)−OH、PG−Arg(Pmc)−OH、PG−Arg(Trt)−OH、PG−Cys(Trt)−OH、PG−Asp(OtBu)−OH、PG−Glu(OtBu)−OHもしくはPG−Aeg(Boc)−OH、PG−His(Trt)−OH(PGは上述の意味を有する)のようなアミノ酸誘導体が好ましい。この場合とくに、以下のアミノ酸誘導体、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Arg(Mtr)−OH、Fmoc−Arg(Pmc)−OH、Fmoc−Arg(Trt)−OH、Fmoc−Cys(Trt)−OH、Fmoc−Asp(OtBu)−OH、Fmoc−Glu(OtBu)−OHおよびFmoc−Aeg(Boc)−OH、Fmoc−His(Trt)−OHがきわめて好ましい。
【0018】
上述の合成方法に用いられる式IV
【化14】
(式中、
PGは塩基不安定性アミノ保護基であり、そして
B′は環外アミノ官能基が保護されているヌクレオチド塩基である)の化合物は新規である。
【0019】
式IV
【化15】
の化合物は、式V
【化16】
(式中、
PGは塩基不安定性アミノ保護基であり、
R1は、メチル、エチル、ブチル、2−(メトキシエトキシ)エチル、ベンジル、好ましくはメチルまたは2−(メトキシエトキシ)エチル、とくに好ましくはメチルのエステル保護基である)の化合物を、式VI
【化17】
(式中、
B′は、ヌクレオチド塩基の環外アミノ官能基が塩基不安定性アミノ保護基と適合性がある保護基、たとえば弱酸に不安定なウレタン型たとえばBocもしくはMozまたはトリチル型たとえばTrt、Mmt、Dmtもしくはpixylのような保護基によって保護されているヌクレオチド塩基である)の化合物と、適当な溶媒たとえばDMF、アセトニトリル、ジクロロメタンまたはこれらの溶媒の混合物中、カルボジイミド、ホスホニウム試薬、ウロニウム試薬、酸ハライドまたは活性化エステルのようなペプチド化学で慣用されるカップリング試薬を用いて0〜45℃、好ましくは室温で反応させて式VII
【化18】
(式中、PG、B′およびR1は上に定義した通りである)
の化合物を得、ついでエステル保護基のR1を、適当な溶媒たとえばジオキサン、水、テトラヒドロフラン、メタノール、水またはこれらの溶媒の混合物中、0〜50℃において、アルカリ金属水酸化物溶液を用いてまたはエステラーゼもしくはリパーゼを用いて酵素的に除去して得られる。
【0020】
さらに式IVの化合物の合成には、式V
【化19】
(式中、
PGは上述の意味を有する塩基不安定性アミノ保護基であり、
R1は水素または一時的なシリル保護基たとえばトリメチルシリルである)の化合物を式VIII
B′−CH2−CO−R2 (VIII)
(式中、
B′は式VIについて定義した通りであり、
R2は、ハロゲンたとえばフッ素、塩素もしくは臭素、または活性化エステル基たとえばOBt、OObt、OPfpもしくはONSuである)の化合物と、適当な溶媒たとえばDMF、NMP、アセトニトリル、ジクロロメタンまたはこれらの溶媒の混合物中、0〜40℃好ましくは20〜30℃で反応させる方法を選択することもできる。この場合、式Vの化合物中の酸官能基の一時的保護は、慣用のシリル化試薬たとえばビス(トリメチルシリル)アセトアミドとの反応によって行うことができる。この一時的保護基は、式VIIIの化合物が反応したのちに反応混合物に水またはアルコールを添加して除去される。
【0021】
式Vの化合物の合成には、アミノエチルグリシンまたは相当するアミノエチルグリシンエステルに適当な塩基不安定性保護基が付与される。この場合、塩基不安定性保護基は文献で知られている方法を一部改良して用いて導入される。適当な試薬の例にはFmoc−Cl、Fmoc−ONSu、Bnpeoc−ONSu、Dnpeoc−ONSu、Msc−Clおよび2−アセチルジメドン(Dde)がある。この反応では、アミノエチルグリシンの溶解性が改善できると同時に、慣用のシリル化試薬たとえばビス(トリメチルシリル)アセトアミドとの反応による酸官能基の保護が可能である。この一時的な保護基は、保護基試薬との反応後、反応混合物に水またはアルコールを添加することによって除去される。出発原料として用いられるアミノエチルグリシンは文献で知られている方法により製造される(E.P.Heimer,H.E.Gallo-Torres,A.M.Felix,M.Ahmad,T.J.Lambros,F.Scheidl & J.Meienhofer,Int.J.Peptide Protein Res.23,1984,203-211)。
【0022】
アミノエチルグリシンを製造するための他のもっと簡単な方法に、エチレンジアミンを用いるグリオキシル酸の還元アミノ化があり、その方法は、同時に出願された発明の名称「アミノエチルグリシンの製造法」(HOE 94/F 061、DE-P 44 08 530.3)の出願に記載されている。
【0023】
式VIのヌクレオチド塩基−酢酸誘導体は相当するヌクレオチド塩基またはそれらの環外アミノ官能基が保護されているヌクレオチド塩基を、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸またはそれらのエステルでアルキル化することによって得られる。同時に、一時的保護基が、必要に応じて、選択的アルキル化のためにさらにヌクレオチド塩基に挿入される。塩基不安定性保護基PGと適合性のあるすべての保護基がヌクレオチド塩基の保護基として使用できる。弱酸にに不安定なウレタン型たとえばBoc、MozもしくはDdzまたはトリチル型たとえばTrt、Mmt、Dmtもしくpixylのような保護基が環外アミノ官能基への使用に好ましい。とくに好ましい保護基は弱酸にに不安定なトリチル型たとえばTrt、MmtまたはDmt保護基であり、とくにMmtが好ましい。この後者の保護基は驚くべきことにモノマー構造成分の溶解性を著しく改善し、自動合成装置たとえば多重ペプチドシンセサイザーに使用するための溶液を調製できる。
【0024】
式Vの化合物の製造に用いられ、環外アミノ官能基が保護されているヌクレオチド塩基B′は、相当するヌクレオチド塩基から、それ自体文献から既知の方法により、適当な保護基試薬たとえばBoc2O、Moz−アジド、Trt−Cl、Mtt−Cl、Mmt−Cl、Dmt−Clまたはpixyl−Clを用いて製造される。必要に応じて、選択的アルキル化のために一時的保護基をさらにヌクレオチド塩基に同時に挿入される。
【0025】
式VIのヌクレオチド塩基−酢酸は、ペプチド合成に慣用される上述の活性化方法を用いて、塩基不安定性保護基で保護されている式Vのアミノエチルグリシン誘導体にカップリングされる。カルボジイミドたとえばジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドの使用が好ましい。ホスホニウム試薬たとえばBOP(B.Castro,J.R.Dormoy,G.Evin & C.Selve,Tetrahedron Lett.1975,1219-1222)およびウロニウム試薬たとえばHBTU(V.Dourtoglou,B.Gross,V.Lambropoulou,C.Zioudrou,Synthesis,1984,572-574);TBTU,TPTU,TSTU,TNTU(R.Knorr,A.Trezeciak,W.Bannwarth & D.Gillessen,Tetrahedron Lett.1989,1927-1930)、TOTU(EP-A-0 460 446)、または酸クロリドもしくは酸フルオリド(L.A.Carpino,H.G.Chao,M.Beyermann & M.Bienert,J.Org.Chem.56 (1991),2635);J.-N.Bertho,A.Loffet,C.Pinel,F.Reuther & G.Sennyey,〔in E.Giralt & D.Andreu(編)〕Peptides 1990,Escom Science Publishers B.V.1991,53-54頁)も同様に好ましく使用する。
【0026】
上述のPNAは、適当な支持材料(たとえばポリスチレンまたはポリオキシエチレンで変性されたポリスチレン、たとえば RTentagelまたは RControlled Pore Glass)で、基Q0を潜在的様式で含有するアンカー基Lが与えられている支持体上、固相合成によって構築される。固相合成はPNAのC−末端において、塩基不安定性保護基で保護されたモノマーまたは必要に応じてその側鎖官能基が保護されたアミノ酸の適当な樹脂へのカップリングによって開始する。
【0027】
樹脂にカップリングされた構造成分の塩基不安定性保護基を上述のような適当な試薬を用いて除去したのち、以後の保護された構造成分(RNAモノマ−およびアミノ酸誘導体)を順次、所望の配列で互いにカップリングさせる。中間体として生じ、N末端が塩基不安定性保護基で保護されているPNA樹脂は、次のPNAモノマーとの連結の前に、上述の試薬によって脱保護される。
【0028】
アミノ酸誘導体のカップリングまたは上述の活性化試薬の1種による活性化は、ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリジノン、アセトニトリルもしくはメチレンクロリド、または上記溶媒の混合物中において実施できる。活性化された誘導体は通常1.5〜10倍過剰で使用される。不完全なカップリングが生じる場合には、カップリングさせたばかりの構造成分のアミノ基を脱保護することなく、そのカップリング反応を反復する。
【0029】
基R0がカルボン酸官能基を含有する場合に適用可能な基R0の挿入方法の例が、アミノ酸とPNAモノマーのカップリングのための上述の方法である。他の方法には、イソシアネートたとえばフェニルイソシアネート、イソチオシアネートたとえばフルオレセインイソチオシアネート、クロロギ酸誘導体たとえばクロロホルミルカルバゾール、活性化炭酸エステルたとえばコレステリル−4−ニトロフェニルカーボネートもしくはアクリジニウムスクシンイミジルカーボネート、スルホニルクロリドたとえばダンシルクロリド等の反応がある。
【0030】
上述の合成操作は、通常使用されるプログラムをわずかに改変すれば、市販の自動シンセサイザーたとえばペプチドシンセサイザー、多重ペプチドシンセサイザーまたはDNAシンセサイザーを用いて行うこともできる。
上述の方法でPNAが合成されたならば、PNAオリゴマ−は、適当な試薬たとえば弱酸または中等度の強度の酸に不安定なアンカー基の場合にはトリフルオロ酢酸を用いて、樹脂から切断することができる。使用されたリンカーおよび保護基の性質に依存して、ヌクレオチド塩基のオリゴマーと付加的な側鎖保護基が同時に切断される。これらの環境下には開裂試薬はまた適当な溶媒たとえばメチレンクロリドで希釈して使用することができる。必要に応じて、副反応を回避するために、この開裂試薬にはさらに添加物を加えることもできる。この場合に適当な陽イオン捕獲剤は、フェノール、クレゾール、チオクレゾール、アニソール、チオアニソール、エタンジチオール、ジメチルスルフィド、エチル−メチル−スルフィド、トリエチルシラン、トリイソプロピルシランのような物質または固相ペプチド合成に慣用される類似の添加物である。これらの添加物は、個々にまたはこれらの補助物質の2種以上の混合物として添加できる。
【0031】
開裂が行われたならば、得られた粗製のオリゴマーは、たとえばHPLC、イオン交換クロマトグラフィー等、ペプチドまたはヌクレオチド化学に慣用される方法を用いて精製する。
アミノ酸について使用する略号はペプチド化学において慣用される、Eur.J.Biochem.138,9(1984)に記載された三文字のコードに従う。使用される他の略号を以下に掲げる。
【0032】
ACN= アセトニトリル
Aeg= N−(2−アミノエチル)グリシル、−NH−CH2−CH2−NH−CH2−CO−
Aeg(AMmt)= N−(2−アミノエチル)−N−((9−(N6−4−メトキシフェニルジフェニル)アデノシル)アセチル)グリシル
Aeg(CMmt)= N−(2−アミノエチル)−N−((1−(N4−4−メトキシフェニルジフェニル)シトシル)アセチル)グリシル
Aeg(T)= N−(2−アミノエチル)−N−((1−チミニル)アセチル)グリシル
Aeg(TBom)= N−(2−アミノエチル)−N−((1−(N3−ベンジルオキシメチル)チミニル)アセチル)グリシル
Aeg(Ttriazolo)= N−(2−アミノエチル)−N−((2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾロピリミジン−1−イル)アセチル)グリシル
Bnpeoc= 2,2−[ビス(4−ニトロフェニル)]エトキシカルボニル)三級ブチルオキシカルボニル
Boc= 三級ブチルオキシカルボニル
BOI= 2−(ベンゾトリアゾール−1−イル)オキシ−1,3−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート
【0033】
Bom= ベンジルオキシメチル
BOP= ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
BroP= ブロモトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
BSA= N,O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミド
But= 三級ブチル
Bzl= ベンジル
Cl−Z= 4−クロロベンジルオキシカルボニル
CPG= 制御多孔ガラス
DBU= 1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン
DCM= ジクロロメタン
Dde= 1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキシシクロヘキシリデン)エチル
Ddz= 3,5−ジメトキシフェニル−2−プロピル−2−オキシカルボニル
DMF= ジメチルホルムアミド
DMT= 4,4′−ジメトキシトリフェニルメチル
Dmt= ジ−(4−メトキシフェニル)フェニルメチル
Dnpeoc= 2−(2,4−ジニトロフェニル)エトキシカルボニル
FAM= フルオレセイン残基
Fmoc= 9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
H−Aeg−OH= N−(2−アミノエチル)グリシン
【0034】
HAPyU= O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−ビス(テトラメチレン)ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HATU= O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HBTU= O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt= 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HONSu= N−ヒドロキシスクシンイミド
HOObt= 3−ヒドロキシ−4−オキソ−3,4−ジヒドロベンゾトリアジン
MeOBz= 4−メトキシベンゾイル
Mmt= 4−メトキシトリフェニルメチル
Moz= 4−メトキシベンジルオキシカルボニル
MSNT= 2,4,6−メシチレンスルホニル−3−ニトロ−1,2,4−トリアゾリド
Mtt= 4−(メチルフェニル)ジフェニルメチル
NBA= ニトロベンジルアルコ−ル
NMP= N−メチルピロリジン
Pixyl= 9−(9−フェニル)キサンテニル
PyBOP= ベンゾトリアゾリル−1−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
PyBroP= ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
【0035】
TAPipu= O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−ビス(ペンタメチレン)ウロニウムテトラフルオロボレート
TBTU= O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
tBu= 三級ブチル
tBuBz= 4−三級ブチルベンゾイル
TDBTU= O−(3,4−ジヒドロ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン−3−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
TDO= 2,5−ジフェニル−2,3−ジヒドロ−3−オキソ−4−ヒドロキシチオフェンジオキシド
TFA= トリフルオロ酢酸
THF= テトラヒドロフラン
TNTU= O−(5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
TOTU= O−[(シアノ(エトキシカルボニル)メチレン)アミノ]−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
TPTU= O−(1,2−ジヒドロ−2−オキソ−1−ピリジル)−1,1,3,3′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Trt= トリチル
TSTU= O−(N−スクシンイミジル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
Z= ベンジルオキシカルボニル
MS(ES+)= 静電スプレ−マススペクトル(陽イオン)
MS(ES-)= 静電スプレ−マススペクトル(陰イオン)
MS(DCI)= 脱着化学イオン化マススペクトル
MS(FAB)= 高速原子衝突マススペクトル
以下の実施例は本発明の化合物を製造する好ましい方法を説明することを意図するものであり、本発明をそれに限定するものではない。
【0036】
例1
N−(Fmoc−アミノエチル)グリシンメチルエステル塩酸塩
Fmoc−Aeg−OMe・HCl
8.2gのアミノエチルグリシンメチルエステルニ塩酸塩を100mlの水に溶解し、400mlのジオキサン中13.48gのFmoc−ONSuを激しく撹拌しながら加える。ついで150mlの水中10.08gの炭酸水素ナトリウムを15分の間隔内に滴下して加える。混合物を室温でさらに15時間撹拌したままにしたのち、真空中で約100mlに濃縮する。この濃縮された混合物を酢酸エチル600mlで抽出し、有機相を各回50mlの水で3回洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥しついで約50mlの容量に濃縮する。100mlのジクロロメタンと20mlの2Nメタノール性塩酸を加えると、生成物が直ちに沈殿する。混合物を密閉フラスコ中4℃に一夜放置する。沈殿を吸引ろ過し、乾燥する。
収量:9.8g
RF:0.50(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(FAB、NBA/LiCl):361.2[M+Li]+
【0037】
例2
N−(Fmoc−アミノエチル)グリシン塩酸塩
Fmoc−Aeg−OH・HCl
11.21gのアミノエチルグリシンを250mlのDMFに懸濁し、撹拌しながら98.8mlのビス(トリメチルシリル)アセトアミドを加える。15分間撹拌すると、澄明な溶液が得られる。それに、33.7gのFmoc−ONSuのDMF200ml中溶液を15分の間隔内に滴下して加える。ついで反応混合物をさらに1時間撹拌したのち、それにメタノールおよび水各100mlを加える。10分後、16.6mlの6N塩酸も加え、混合物をさらに10分間撹拌する。次に混合物を真空中ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、250mlのジクロロメタンを残留物に加え、この混合物を撹拌する。最初は澄明な溶液を生じるが、約5分後にこれから生成物が徐々に沈殿する。さらに250mlのジクロロメタンをゆっくりと加え、混合物を計1.5時間撹拌する。沈殿した生成物を速やかに吸引ろ過し、ついで吸引ろ斗上で各回150mlのジクロロメタンを用いて2回撹拌し、吸引ろ過する。沈殿をついでフラスコに移し、45℃で約300mlの酢酸エチルと共に完全に撹拌し、沈殿を温溶液からろ過し、ついで少量の温酢酸エチルで洗浄する。沈殿を真空乾燥器中で完全に乾燥する。
収率:34.4g
【0038】
例3
Fmoc−アミノエチルグリシンの遊離
Fmoc−Aeg−OH
23gの上記Fmoc−アミノエチルグリシン塩酸塩を、400mlの熱メタノ−ルに溶解する。混合物を室温まで冷却したのち、完全に撹拌しながら、80mlのメタノ−ル中2.2gのNaOHの溶液を滴下して加える。次いで生成物が直ちに沈殿する。溶液についで40mlの水を加え、この混合物を加熱すると澄明な溶液が得られ、これを放置して室温までゆっくりと冷却させ、ついでさらに1時間0℃に放置する。沈殿を吸引ろ過し、各回70mlの90%含水メタノ−ルを用いて3回洗浄し、ついで真空乾燥器中で十分に乾燥させる。
収率:15.0g
RF:0.55(n−ブタノール/酢酸/水 2:1:2)
MS(FAB、NBA):341.2[M+H]+
【0039】
例4
2−アミノ−6−クロロプリン−9−イル酢酸メチルエステル
1.43gの水素化ナトリウム(95%)を最初に、アルゴン雰囲気下、十分に乾燥したガラス装置中に取り、200mlの十分に乾燥したN,N−ジメチルホルムアミドを水素化物上に注ぐ。10.0gの2−アミノ−6−クロロプリンをついで加えると、気体と熱の発生が起こり、黄色の溶液が形成される。この溶液を1時間完全に撹拌したのち、40mlのDMF中10.8gのブロモ酢酸メチルエステルの溶液をそれに滴下して加える。反応混合物をさらに2時間撹拌し、ついで油圧ポンプ真空下にロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物に水を加え、この混合物をついで酢酸エチルで抽出する。有機相を濃縮乾固し、粗生成物をシリカゲル上ジクロロメタン/メタノ−ル(95/5)を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
収量:生成物11g
RF:0.44(ジクロロメタン/メタノール 9:1)
MS(CI):242(M+H)+
【0040】
例5
2−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)−6−クロロプリン−9−イル酢酸メチルエステル
11gの2−アミノ−6−クロロプリン−9−イル酢酸メチルエステルをアルゴン下、75mlのピリジンと9.5mlのトリエチルアミンの混合物中に懸濁し、15gの4−メトキシフェニル−ジフェニルメチルクロリドを4回に分けて1時間内に加える。混合物を一夜そのまま反応させ、ついで濃縮乾固する。残留物を少量のトルエンとともに1回共蒸留し、粗生成物をシリカゲル上ジクロロメタン/メタノール(98:2)を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
収量:15.5g
RF:0.60(ジクロロメタン/メタノール 97:3)
MS(ES+):514.2(M+H)+
【0041】
例6
2−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)−6−ヒドロキシプリン−9−イル酢酸
0.5gの2−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)−6−クロロプリン−9−イル酢酸メチルエステルを水酸化ナトリウムの10%溶液12ml中還流下に3時間加熱する。この混合物をついで室温に冷却させ、注意深く10%の塩酸で中和する。沈殿した生成物を吸引ろ過し、数回水で洗浄し、十分に乾燥する。
収量:400mg
RF:0.1(ジクロロメタン/メタノール 7:3)
MS(FAB、NBA/LiCl):488.2(M+Li)+
【0042】
例7
6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン
13.5gの6−アミノプリンおよび46.2gの4−メトキシフェニル−ジフェニルメチルクロリドを500mlの乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁し、トリエチルアミン13.9mlを添加したのち、この混合物を60℃に短時間加熱する。ほぼ澄明な緑色を帯びた溶液を一夜放置する。ついで混合物を真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、50mlのメタノールを加えてもう一度濃縮する。残留物をシリカゲル上0.1%トリエチルアミン含有ジクロロメタン/メタノール混合物(95/5)を用いてクロマトグラフィーにより精製する.
収量:泡状物9.8g
RF:0.35(ジクロロメタン/メタノール 9:1)
MS(FAB、MeOH/NBA):408.2(M+H)+
【0043】
例8
6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン
20.25gの6−アミノプリンおよび69.3gの4−メトキシフェニル−ジフェニルメチルクロリドを500mlの乾燥ピリジンに懸濁し、次に19.1mlの4−エチルモルホリンを添加し、この混合物を約40℃に短時間加熱する。この混合物を一夜放置する。ついで懸濁液を水およびジクロロメタンと撹拌し、沈殿を吸引ろ過する。ジクロロメタン相を真空中で濃縮乾固し、少量のジクロロメタンと磨砕する。沈殿を吸引ろ過し、最初に得られた沈殿と合わせる。乾燥後、47.3gの生成物が得られる。
RF:0.53(酢酸エチル)
MS(FAB、MeOH/NBA):408.2(M+H)+
【0044】
例9
6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン−9−イル酢酸メチルエステル
6.2gの6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリンを乾燥ジメチルホルムアミド75ml中に分散し、ついで0.36gの水素化ナトリウムを加える。次にこの混合物を1時間撹拌し、ついで2.52gのブロモ酢酸メチルエステルを加えて、撹拌をさらに2時間継続する。反応混合物についで2mlのメタノールを加えて10分間撹拌し、真空中ロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物をシリカゲル上0.5%のトリエチルアミンを含む酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーにより精製する。
収量:泡状物4.0g
RF:0.68(酢酸エチル/メタノール 3:1)
MS(FAB、NBA/LiCl):480.2(M+H)+;485.2(M+Li)+
【0045】
例10
6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン−9−イル酢酸
3.0gの6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン−9−イル酢酸メチルエステルを20mlのジメチルホルムアミドに溶解し、この溶液に水5ml中0.25gのNaOHを撹拌しながら加える。10分後、加水分解は完結し、希酢酸を用いて反応混合物のpHを6に調整する。混合物を水100mlでさらに希釈し、ついで真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮する。残留物を次に少量のトルエンと2回蒸留し、得られた残留物にジエチルエーテルを加えると生成物が析出する。沈殿した生成物を吸引ろ過し、ついで少量のジエチルエーテルで洗浄し、乾燥する。
収量:3.2g
融点:157−160℃(分解)
RF:0.15(酢酸エチル/メタノール 3:1)
MS(FAB、NBA/LiCl):465.1(M+H)+;472.1(M+Li)+;478.2(M+2Li)+
【0046】
例11
1−アセチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン
1−アセチルチミン
75gのチミンを375mlの無水酢酸に懸濁し、この懸濁液を45分間還流下に加熱する。ついで、この混合物を0℃に冷却すると、生成物が沈殿する。沈殿を吸引ろ過し、375mlの酢酸エチルと撹拌する。沈殿を吸引ろ過し、ついで少量のジエチルエーテルで洗浄して乾燥する。
収量:89.1g
融点:187−189℃
RF:0.67(ジクロロメタン/メタノール 95:5)
【0047】
例12
3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン
3−ベンジルオキシメチルチミン
52.0gの1−アセチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジンを300mlのDMF中に懸濁し、47.5mlのトリエチルアミンを添加したのち、混合物を0℃に冷却する。50mlのDMF中100mlのベンジルクロロメチルエーテルをこの温度で、完全に撹拌した混合物に徐々に滴下して加える。混合物をついでさらに1時間撹拌したのち、一夜室温に放置する。反応混合物をついで真空中ロータリーエバポレーターで濃縮して、残留物を450mlのメタノールおよび300mlの40%メチルアミン水溶液に取り、この混合物を1.5時間還流下に煮沸する。ついで溶液を濃縮し、残留物を水600ml中10.8gの炭酸水素ナトリウムとともに撹拌する。沈殿した生成物を吸引ろ過し、水およびエタノールで洗浄し、エタノールから再結晶する。
収量:46.66g
融点:119−120℃
RF:0.38(ジクロロメタン/メタノール 95:5)
【0048】
例13
3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン−酢酸エチルエステル
3−ベンジルオキシメチルチミニル酢酸エチルエステル
4.97gの水素化ナトリウムを最初に150mlのTHF中に導入し、ついで550mlのTHFに溶解した3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン45.04gを、N2雰囲気下0℃で滴下して加え、ついでこの温度で、700mlのTHF中21.42gのブロモ酢酸エチルエステルを加える。ついで混合物をさらに5時間室温に撹拌しながら放置し、次に水を注意深く加える。有機相を分離し、水相をさらに4回ジクロロメタンで抽出する。有機相を合わせて硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮し、残留物をヘプタンと撹拌する。
収量:52.4g
RF:0.15(ジクロロメタン/メタノール 95:5)
MS(FAB、NBA):319.1(M+H)+
【0049】
例14
2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸エチルエステル
チミニル酢酸エチルエステル
25gの3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン−酢酸エチルエステルを1000mlのジクロロメタン中に溶解し、この混合物を−70℃に冷却し、ジクロロメタン中三塩化ホウ素の1M溶液375mlをこの混合物に、この温度で、完全に撹拌しながら滴下して加える。混合物をこの温度でさらに3時間反応させたのち、320mlのメタノ−ルを−70℃〜−60℃で滴下して加える。1時間後に、197.05mlのトリエチルアミンを加え、混合物の温度を室温まで上昇させる。ついで、少量の水を加え、混合物をロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物を酢酸エチルに取り、この混合物を水で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、ついで濃縮乾固する。
収量:12g
RF:0.45(ジクロロメタン/メタノール 9:1)
MS(DCI):199(M+H)+
【0050】
例15
2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸
チミニル酢酸
10gの2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸エチルエステルをジオキサン/水(1:1)130mlに溶解し、ついで60mlの1N−LiOHを加えたのち、混合物を室温で一夜撹拌する。ついでこれを小容量に濃縮し、水相をエーテルで洗浄し、ついでpHを2.5に調整する。この時点で生成物が沈殿する。これを吸引ろ過すると生成物4.9gが得られる。母液をペンタノールで抽出しヘプタン/エ−テルで沈殿させるとさらに1.5gの生成物が得られる。
収量:6.4g
RF:0.30(ジクロロメタン/メタノール 3:2)
MS(DCI):185(M+H)+
【0051】
例16
N1−クロロカルボキシメチルチミン
チミニルアセチルクロリド
例16a
2gの2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸を15mlのチオニルクロリドと、60℃で3時間、も早気体が発生しなくなるまで撹拌する。ついで過剰のチオニルクロリドを真空中ロータリーエバポレーターを用いて留去し、残留物をついで、少量のトルエンとともに3回蒸留する。得られた生成物はそのまま次の反応に使用する。
収量:2.4g
MS(DCI):203(M+H)+
【0052】
例16b
N1−カルボキシメチルチミン(3.0g;16.3ミリモル)をチオニルクロリド(90ml)に懸濁する。この懸濁液を70℃に1.5時間加熱し、ついで室温に16時間放置する。過剰のチオニルクロリドを真空中で除去し、残留物をトルエンとともに3回共蒸留する。得られた生成物をn−ヘキサンと2回磨砕し、真空中で乾燥する。化合物は淡橙色の粉末として得られる。
収量:3.30g
MS(CI;ジクロロメタン):203(M+H)+
RF:0.10(ジクロロメタン/メタノール 7:3)
【0053】
例17
2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジン
N4−Mmt−シトシン
11.6gの4−アミノ−2−ヒドロキシピリミジンおよび46.2gの4−メトキシフェニルジフェニルメチルクロリドを500mlの乾燥ピリジンに懸濁して、12.8mlの4−エチルモルホリンを添加したのち、この混合物を約40℃に短時間加熱する。この混合物を一夜放置する。ついで懸濁液を水およびジクロロメタンと撹拌し、沈殿を吸引ろ過する。ジクロロメタン相を真空中で濃縮乾固し、残留物を少量のジクロロメタンと磨砕する。沈殿を吸引ろ過し、最初に得られた沈殿と合わせる。乾燥後、16.8gの生成物が得られる。
RF:0.45(ジクロロメタン/メタノール 9:1)
MS(FAB、MeOH/NBA):384.2(M+H)+
【0054】
例18
2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジン−1−イル酢酸メチルエステル
N4−Mmt−シトシル酢酸メチルエステル
11.5gの2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジンを乾燥ジメチルホルムアミド120ml中に分散し、ついで0.72gの水素化ナトリウムを加える。次にこの混合物を1時間撹拌したのち5.05gのブロモ酢酸メチルエステルを加えて、撹拌をさらに2時間継続する。反応混合物についで2mlのメタノールを加えて10分間撹拌し、真空中ロータリーエバポレーターで濃縮する。残留物を水と磨砕し、吸引ろ過して乾燥する。
収量:10.7g
RF:0.39(酢酸エチル)
MS(FAB、NBA/LiCl):462.2(M+Li)+
【0055】
例19
2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジン−1−イル酢酸
N4−Mmt−シトシル酢酸
10.5gの2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジン−1−イル酢酸メチルエステルを100mlのジメチルホルムアミドに溶解し、この溶液に撹拌しながら、水5ml中0.94gのNaOHを加える。10分後、加水分解は完結し、希酢酸を用いて反応混合物のpHを6に調整する。ついで混合物を水100mlで希釈し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮する。残留物を次に少量のトルエンと2回蒸留し、これらの蒸留から得られた残留物にジエチルエーテルを加えると生成物が沈殿する。沈殿した生成物を吸引ろ過し、ついで少量のジエチルエーテルで洗浄し、乾燥する。
収量:8.55g
RF:0.27(酢酸エチル)
MS(FAB、NBA/LiCl):448(M+Li)+
【0056】
例20
N4−(三級ブチルオキシカルボニル)−N1−カルボキシメチルシトシン
N4−Boc−シトシル酢酸
例20a
N4−(三級ブチルオキシカルボニル)−シトシン
N4−Boc−シトシン
シトシン(11.1g)を乾燥ピリジン(250ml)に懸濁する。ついで、ジ三級ブチルジカルボネート(21.8g)とスパーテルの先端量の4−ジメチルアミノピリジンを添加する。この混合物を60℃で6時間撹拌すると、濃厚な沈殿が出現する。反応液を冷却し、沈殿を吸引ろ過する。沈殿を温水と撹拌し、吸引ろ過し、真空中で乾燥する。
収量:10.26g
MS(DCI):212(M+H)+
RF:0.6(ジクロロメタン/メタノール 6:4)
【0057】
例20b
N4−(三級ブチルオキシカルボニル)−N1−メトキシカルボニルメチルシトシン
N4−Boc−シトシル酢酸メチルエステル
N4−(三級ブチルオキシカルボニル)−シトシン(1.6g)を乾燥DMF(30ml)中に懸濁し、水素化ナトリウム(0.19g)を少量ずつ加え、混合物を室温で1.5時間、水素の発生が完結するまで撹拌する。次に、ブロモ酢酸メチルエステル(0.84ml)を室温でシリンジを用いて滴下して加える。混合物を室温でさらに5時間撹拌し、ついでメタノール(1ml)を加える。溶媒を真空中で留去し、残った残留物をシリカゲル上溶出液としてジクロロメタンを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製する。生成物を含有する分画を合わせて真空中で濃縮する。
収量:1.1g
MS(DCI):284(M+H)+
RF:0.5(ジクロロメタン/メタノール 95:5)
【0058】
例20c
N4−(三級ブチルオキシカルボニル)−N1−カルボキシメチルシトシン
N4−(Boc−シトシル酢酸)
N4−(三級ブチルオキシカルボニル)−N1−メトキシカルボニルメチルシトシン(4.2g)を水(30ml)に懸濁し、0℃でpHを制御(pH12)しながら、メチルエステルが加水分解されるまで、水酸化ナトリウムの2N水溶液を滴下して加える。反応の進行はTLCによってモニターする。反応溶液のpHを酢酸で3に調整し、溶媒を真空中で留去する。粗生成物をシリカゲル上溶出液としてジクロロメタン/メタノール/トリエチルアミン 8:1:1を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製する。生成物を含有する分画を合わせて真空中で濃縮する。
収量:3.5g
融点:95−98℃(分解)
MS(FAB、NBA):270.2(M+Li)+
RF:0.35(ジクロロメタン/メタノ−ル/トリエチルアミン 8:1:1)
【0059】
例21
N−[2−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)−6−ヒドロキシプリン−9−イルアセチル]−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシン
Fmoc−Aeg(GMmt)−OH
1gの2−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)−6−ヒドロキシプリン−9−イル酢酸をDMFに溶解し、682mgのTOTUおよび239mgのN−エチルモルホリンを、順次、予め0℃に冷却した上記溶液に添加する。混合物をついで室温で20分間撹拌する。1.06gのFmoc−アミノエチルグリシンの4mlのジメチルホルムアミドと1.5gのビス(トリメチルシリル)アセトアミド中溶液を別のフラスコ中に調製する。この溶液をついで、2−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)−6−ヒドロキシプリン−9−イル酢酸の予め活性化した溶液に加える。混合物をさらに2時間撹拌し、ついで濃縮乾固する。次に残留物を30mlの酢酸エチルに取り、この混合物を各回15mlの水で3回抽出する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、シリカゲル上メタノール/ジクロロメタン/水/氷酢酸(1.5:10:0.25:0.075)を用いてクロマトグラフィーによって精製する。
収量:600mg
RF:0.35(メチレンクロリド:メタノール/7:3)
MS(FAB、DMSO/NBA/LiCl):810.3(M+Li)+
【0060】
例22
N−[6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン−9−イルアセチル]−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシンメチルエステル
Fmoc−Aeg(AMmt)−OMe
848mg(2.6ミリモル)のFmoc−Aeg−OMe・HClおよび407mg(2.5ミリモル)のHOOBtの混合物を5mlのDMFに溶解し、ついでこの溶液に、5mlのDMFに溶解した640μl(5ミリモル)のNEMおよび1.2g(2.5ミリモル)の6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン−9−イル酢酸の溶液を加える。その後、471μl(3ミリモル)のジイソプロピルカルボジイミドを加え、混合物を室温で4時間撹拌する。ついで混合物をろ過し、ろ液を真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮する。無定形の残留物をジクロロメタンに取り、この混合物を水および炭酸水素ナトリウム溶液で抽出する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中で濃縮乾固する。残留物を4.5mlの酢酸エチルに溶解し、ジイソプロピルエーテル20mlを加をえて沈殿を生じさせる。得られた半固体の沈殿を20mlのメタノールに溶解し、30mlの水を加えて沈殿させ、ついで真空中で乾燥させる。
収量:1.05g
RF:0.85(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(FAB、DMSO/NBA):802.4(M+H)+
【0061】
例23
N−[6−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)プリン−9−イルアセチル]−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシンの合成
Fmoc−Aeg(AMmt)−OH
900mg(1.125ミリモル)のFmoc−Aeg(AMmt)−OMeを5mlのジオキサンおよび2.5mlの水の混合物中に溶解し、氷水で冷却しながら、2.4mlの1N−NaOHと2.5mlのジオキサンの混合物を少量ずつ添加して加水分解する。反応が完了したならば、混合物に少量の固体二酸化炭素を加えて緩衝化し、わずかに起こっていたFmocの除去をFmoc−ONSUを添加して逆転させる。ついで大部分のジオキサンを真空中で留去し、溶液を水で希釈し、酢酸エチル/n−ブタノール(1:1)で覆う。混合物を氷水で冷却しながら、硫酸水素カリウムの溶液を加えてpHを5〜6の酸性にする。有機相を分離し、水相はさらに2回酢酸エチル/n−ブタノール(1:1)で抽出する。有機相を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮する。残留物を5mlの酢酸エチルに溶解し、メチルブチルエーテル20mlを加えて沈殿させる。
収量:1.02g
RF:0.73(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(FAB、DMSO/NBA):787(M+H)+、794(M+Li)+
【0062】
例24
N−(2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン−1−イルアセチル)−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシン
Fmoc−Aeg(T)−OH
4.03gのFmoc−Aeg−OHを80mlのDMFに懸濁し、4.39mlのN,O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミドを加え、この混合物を室温で40分間撹拌する。ついで澄明な溶液に、0℃で撹拌しながら、2.4gの2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジンアセチルクロリドを加える。この混合物を室温でさらに3時間反応させ、ついでロータリーエバポレーターで溶媒を留去する。生成した粗生成物に水を加え、この混合物を0℃に一夜放置する。ついで水を傾瀉し、残留物を高真空下に乾燥し、シリカゲル上ジクロロメタン/メタノール/氷酢酸/水(500/100/25/2)を用いてクロマトグラフィーによって精製する。生成物の分画を合わせて濃縮乾固し、ついでさらに3回少量のトルエンとともに蒸留する。
収量:3.8g
RF:0.42(ジクロロメタン/メタノール/酢酸 100:20:5)
MS(FAB、DMSO/NBA):507.3(M+H)+
【0063】
例25
N−(2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン−1−イルアセチル)−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシン
Fmoc−Aeg(T)−OH
386mg(2ミリモル)の2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸および652mg(4ミリモル)のHOOBtの混合物を6mlのDMF中70〜80℃に短時間加熱する。混合物を室温まで冷却したのち、314μl(2ミリモル)のジイソプロピルカルボジイミドを加え、混合物を30分間撹拌する。その後、686mg(2ミリモル)のFmoc−Aeg−OHを加え、30分間隔で混合物を約70℃に短時間3回加熱する。ついで溶媒を真空中ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させ、残った残留物を水と磨砕する。得られた粗生成物をn−ブタノールと水に分配する。有機相を硫酸水素カリウム溶液、炭酸水素カリウム溶液および水で抽出する。有機相をついで真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮すると、生成物が沈殿する。
収量:260mg
RF:0.40(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(FAB、DMSO/NBA):507.3(M+H)+
【0064】
例26
N−[2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジン−1−イルアセチル]−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシンメチルエステル
Fmoc−Aeg(CMmt)−OMe
1.7g(5ミリモル)のFmoc−Aeg−OMe・HCl、および675mg(5ミリモル)のHOOBtの混合物を10mlの乾燥DMFに溶解し、これに、1.28ml(10ミリモル)のNEMを加える。ついでこの混合物を0℃に冷却し、2.21g(5ミリモル)の2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジン−1−イル酢酸、続いて5ミリモルのジイソプロピルカルボジイミドを加え、この混合物をついで0℃で30分間撹拌する。次に室温で4.5時間撹拌したのち、溶媒を真空中ロータリーエバポレーターを用いて留去する。残留物をジクロロメタンと水に分配し、有機相を炭酸水素ナトリウムの溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固する。残留物を10mlのメタノールに溶解し、水15mlを加えて沈殿させる。得られた生成物を少量の水と磨砕し、水酸化カリウム上真空乾燥器中で乾燥する。
収量:3.19g
RF:0.79(n−ブタノール/ピリジン/水/酢酸 8:2:2:10)
MS(FAB、DMSO/NBA):778.4(M)+
【0065】
例27
N−[2−ヒドロキシ−4−(4−メトキシフェニルジフェニルメチルアミノ)ピリミジン−1−イルアセチル]−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシン
Fmoc−Aeg(CMmt)−OH
3.0g(3.86ミリモル)のFmoc−Aeg(CMmt)−OMeを15mlのジオキサンおよび10mlの水の混合物中に溶解し、この溶液を氷水で冷却しながら、10.2mlの1N−NaOHとジオキサンの混合物(1:1)を少量ずつ添加して加水分解する。反応が完了したならば、混合物に少量の固体二酸化炭素を加えて緩衝化し、わずかに起こっていたFmocの除去を0.5gのFmoc−ONSUの添加ついで45分間の撹拌により逆転させる。次に、混合物に硫酸水素カリウムの2M溶液0.5mlを加えてpHを6.5に調整する。ついで大部分のジオキサンを真空中で留去し、溶液を水で希釈し、酢酸エチルで覆う。混合物を氷水で冷却しながら、硫酸水素カリウムの溶液を加えてpHを5の酸性にする。有機相を分離し、水相はさらに2回酢酸エチルで抽出する。有機相を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮する。残留物を5mlのメタノールと15mlの酢酸エチルの混合物に溶解し、メチルブチルエーテル80mlを加えて沈殿させる。生成物をろ過し、真空中で乾燥する。
収量:1.95g
RF:0.80(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(FAB、DMSO/NBA/LiCl):770.3(M+Li)+
【0066】
例28
N−[2−ヒドロキシ−4−(三級ブチルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン−1−イルアセチル]−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシンメチルエステル
Fmoc−Aeg(CBoc)−OMe
0.85(3ミリモル)のN4−(三級ブチルオキシカルボニル)−N1−カルボキシメチルシトシンおよび0.49g(3ミリモル)のHOOBtの混合物を5mlの乾燥DMFに溶解し、ついで、786μl(6ミリモル)のNEMを、続いて1.02g(3ミリモル)のFmoc−Aeg−OMe・HClを加える。この混合物を0℃に冷却し、564μl(3.6ミリモル)のジイソプロピルカルボジイミドを加え、この混合物を0℃で30分間、室温で4時間撹拌する。溶媒をついで真空中ロータリーエバポレーターを用いて留去する。残留物をジクロロメタンと水に分配し、有機相を炭酸水素ナトリウムの溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固する。残留物を20mlの酢酸エチルから再結晶する。
収量:1.19g
RF:0.88(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(FAB、DMSO/NBA):606.3(M)+
【0067】
例29
Fmoc−Aeg(CBoc)−OMe
2.87g(8.47ミリモル)のFmoc−Aeg−OMe・HClと1.38g(8.47ミリモル)のHOOBtの混合物を15mlの乾燥DMFに溶解し、これに、1.08ml(8.47ミリモル)のNEM、続いて2.4g(8.47ミリモル)のN4−(三級ブチルオキシカルボニル)−N1−カルボキシメチルシトシンを加える。この混合物をついで0℃に冷却し、1.33ml(8.47ミリモル)のジイソプロピルカルボジイミドを加え、0℃で30分間、室温で3時間撹拌する。ついで溶媒を真空中ロータリーエバポレーターを用いて留去する。残留物を100mlのジクロロメタンに取り、有機相を水、炭酸水素ナトリウムの溶液および水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固する。残留物をメチル三級ブチルエーテルと磨砕する。
収量:4.5g
RF:0.88(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
【0068】
例30
N−[2−ヒドロキシ−4−(三級ブチルオキシカルボニルアミノ)ピリミジン−1−イルアセチル]−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシン
Fmoc−Aeg(CBoc)−OH
700mg(1.15ミリモル)のFmoc−Aeg(CBoc)−OMeを6mlのジオキサンおよび3mlの水の混合物中に溶解して、0℃で2時間の間隔内に、計0.95mlの2N−NaOHを少量ずつ加える。反応が完了したならば混合物に少量の固体二酸化炭素を加えて緩衝化し、わずかに起こっているFmocの除去を5おmgのFmoc−ONSUの添加ついで45分間の撹拌により逆転させる。次に、混合物に硫酸水素カリウムの2M溶液0.5mlを加えてpHを6.5に調整する。ついで大部分のジオキサンを真空中で留去し、この溶液を水で希釈し、酢酸エチルで覆う。混合物を氷水で冷却しながら、硫酸水素カリウムの溶液を加えてpHを5の酸性にする。有機相を分離し、水相はさらに2回酢酸エチルで抽出する。有機相を合わせて硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮すると、生成物が沈殿する。生成物をろ過し、真空中で乾燥する。
収量:485mg
RF:0.55(n−ブタノール/ピリジン/酢酸/水 8:2:2:10)
MS(FAB、DMSO/NBA):592(M+)
【0069】
例31
Fmoc−Aeg(T)−OMe
11.73gのFmoc−Aeg−OMe・HClを5.52gのチミニル酢酸とともに100mlの乾燥DMFに溶解し、9.84gのTOTUおよび20.4mlのジイソプロピルエチルアミンを順次加える。混合物を室温で3時間撹拌し、真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮する。残留物を酢酸エチルに取り、この混合物を炭酸水素ナトリウム溶液および硫酸水素カリウム溶液でそれぞれ3回抽出する。有機相を濃縮し、残留物を少量の酢酸エチルに溶解しこの溶液にエーテルを加えると、生成物が沈殿する。
収量:12.3g
RF:0.63(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(ES+):521.4(M+H)+
【0070】
例32
Fmoc−Aeg(T)−OH
12.0gのFmoc−Aeg(T)−OMeを、100mlのジオキサンと50mlの水の混合物に懸濁し、32mlの2N−NaOHを少量ずつ加えて加水分解する。反応が完了後、混合物に少量の固体二酸化炭素を加えて緩衝化し、部分的に起こっているFmocの除去を、2.7mgのFmoc−ONSUの添加により逆転させる。次に、混合物をろ過し、ろ液を酢酸エチルで抽出する。水相に1N−HClを加えてpHを2に調整すると、生成物が沈殿する。沈殿を吸引ろ過し、真空中で乾燥する(粗生成物11.6g)。塩を除去するため、粗生成物を穏やかに加温したDMF70mlに取り、溶解しない物質をろ去し、ろ液を濃縮乾固する。残留物を酢酸エチルに取り、イソプロピルエーテルを加えて沈殿させる。生成物を吸引ろ過し、真空中で乾燥する。
収量:10.4g
RF:0.40(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(ES+):507.3(M+H)+
【0071】
例33
3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸3−ベンジルオキシメチルチミニル酢酸
13.65gの3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸エチルエステルを400mlのジオキサン、200mlの水、100mlのメタノールおよび40mlの2N−NaOHの混合物中に溶解する。混合物を室温で2時間撹拌すると、加水分解は完結する。混合物を真空中ロータリーエバポレーターを用いて容量約200mlに濃縮し、ついで水200mlを加え、混合物を1回酢酸エチルで抽出する(捨てる)。水相のpHを1N−HClにより1.5に調整し、100mlの酢酸エチルで3回抽出する。酢酸エチル相を合わせて、硫酸ナトリウム上で乾燥する。乾燥剤をろ過後、ろ液を濃縮乾固する。粘稠な油状物が残り、これをそのまま次の反応に使用する。比較的長期間放置すると、油状物は固化する。
収量:11.35g
RF:0.64(2−ブタノン/ピリジン/水/酢酸 70:15:15:2)
MS(ES+):305.2(M+H)+
【0072】
例34
N−(3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン−1−イルアセチル)−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシンメチルエステル
Fmoc−Aeg(TBom)−OMe
3.04gの3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン酢酸を100mlの乾燥DMFに溶解、し3.9gのFmoc−Aeg−OMe・HCl、3.28gのTOTUおよび5.1mlのジイソプロピルエチルアミンを順次加える。混合物を室温で2時間撹拌し、次いで真空中ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固する。残留物を酢酸エチルに取り、この混合物を炭酸水素ナトリウム溶液および硫酸水素カリウム溶液でそれぞれ3回抽出する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、乾燥剤をろ過したのち濃縮する。残った泡状の残留物を石油エーテルと磨砕し、吸引ろ過し、真空中で乾燥する。
収量:4.68g
RF:0.75(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(ES+):641.4(M+H)+
【0073】
例35
N−(3−ベンジルオキシメチル−2,4−ジヒドロキシ−5−メチルピリミジン−1−イルアセチル)−N−2−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチルグリシン
Fmoc−Aeg(TBom)−OH
2.3gのFmoc−Aeg(TBom)−OMeを30mlのジオキサンと15mlの水の混合物に溶解し、7.36mlの1N−NaOHを少量ずつ加えて加水分解する。反応完結後、混合物に少量の固体二酸化炭素を加えて緩衝化し、部分的に起こっているFmocの除去を0.41gのFmoc−ONSUの添加により逆転させる。次に、混合物をろ過し、ジオキサンを真空中ロータリーエバポレーターを用いて留去し、残留溶液を30mlの水で希釈し、まだアルカリ性の得られた溶液を酢酸エチルで1回抽出する。水相を1N−HClでpH3に調整すると、生成物が沈殿する。混合物を冷室に4℃で一夜放置したのち、沈殿を吸引ろ過し、真空中で乾燥する。ろ液を小容量に濃縮すると、ろ液からさらに生成物が沈殿する。
収量:1.47g
RF:0.37(n−ブタノール/酢酸/水 3:1:1)
MS(ES+):627.2(M+H)+
【0074】
例36
H−(Aeg(T))8−Lys−NH2(C49H127N35O33、式量2275.26)合成は、Abimed製の多重ペプチドシンセサイザー中、アンカー基として5−(Fmoc−アミノ−4−メトキシベンジル)−2,4−ジメトキシフェニルプロピオン酸を用い、アミノメチル−ポリスチレン樹脂上で行う。
14.7mg(10マイクロモル)のFmoc−アミドアンカー樹脂をDMF中で予め膨潤させ、多重ペプチドシンセサイザーの反応容器に導入する。合成には以下の反応溶液を使用する。
1) アクティベーター溶液:乾燥DMF中0.876モルPyBOP溶液
2) 活性化用塩基:乾燥DMF中3.95モルNEM溶液
3) Fmoc−Lys(Boc)−OH:乾燥DMF中0.65モル溶液
4) Fmoc−Aeg(T)−OH:乾燥DMF1ml中250mg
5) ピペリジン:DMF中20%溶液
ピペリジン溶液によるFmocの除去およびDMFでの洗浄ののち、アクティベーター溶液、Fmoc誘導体および塩基を、反応容器中の脱保護樹脂に加える。カップリング時間は40分とする。反応を28分間進行させたのち、100μlのジクロロメタンを加える。ついで樹脂をDMFで5回洗浄すると、ピペリジンによる次の処理が実施できる。Fmocの最後の除去後に、樹脂を乾燥し、計4mlの95%TFAを少量ずつ加えて処理する(約2.5時間)。TFA溶液を真空中で濃縮し、残留物を250μlのTFAに溶解する。この溶液を5個のエッペンドルフチューブに分配し、各チューブあたり600μlのメチル三級ブチルエーテルを加えて沈殿させる。遠心分離して沈殿を沈降させ、ついで上清を傾瀉して除去する。沈殿を少量のメチル三級ブチルエーテルに懸濁し、再び遠心分離して沈降させ、上清をもう一度傾瀉する。この操作をもう一度繰り返して生成物を真空中で乾燥する。精製はRMonoQカラム(Pharmacia,Munzingen)上、10mM−NaOH(pH12)中0.17〜0.44Mの食塩勾配を用いるクロマトグラフィーによって行い、限外ろ過によって脱塩する。
収量:198 OD260
MS(FAB、AcOH/NBA):2298(M+Na)+
【0075】
例37
H−(Aeg(Ttriazolo))8−Lys−NH2(C110H134N58O26、式量2682.65)
合成は380B ABI DNAシンセサイザー中、アンカー基として5−(Fmoc−アミノ−4−メトキシベンジル)−2,4−ジメトキシフェニルプロピオン酸を用い、アミノメチル−ポリスチレン樹脂上で行う。14.7mg(10マイクロモル)のFmoc−アミドアンカー樹脂を、小合成カラム中、以下の溶液を添加するプログラムコントロールにより反応させる。
位置1:Fmoc−Lys(Boc)−OH:DMF中0.66モル溶液
位置2:乾燥DMF2ml中Fmoc−Aeg(Ttriazolo)−OH 735mg
位置5:1.35mlのNEMと1.7mlのDMFの混合物(3.46モル)
位置6:PyBOP:乾燥DMF中0.91モル溶液
位置14:MF中20%ピペリジン
位置16:樹脂洗浄用DMF
位置17:反応用DMF(乾燥)
充填に使用する量は流速により、リジン誘導体またはアミノエチルグリシン誘導体の5倍過剰に調整する。カップリングは各場合2回行う。化合物を樹脂から切断するためには、計約5mlの90%TFAを小カラムから手動で2時間を要して押出す。TFAを真空中で濃縮し、残留物を300μlのTFAに溶解する。この溶液を6個のエッペンドルフチューブに分配する。各チューブにメチル三級ブチルエーテル1mlを加えて生成物を沈殿させる。遠心分離して沈殿を沈降させ、ついで上清を傾瀉して除去する。沈殿を少量のメチル三級ブチルエーテルに懸濁し、再び遠心分離して沈降させ、上清をもう一度傾瀉する。この操作をもう一度繰り返して生成物を真空中で乾燥する。最後に、生成物をメチル三級ブチルエーテルにもう一度懸濁し、遠心分離して乾燥する。
収量:270 OD260
MS(FAB/NBA):2684(M+)
【0076】
例38
H−(Aeg(C))7−Lys−NH2(C76H106N38O22、式量1903.92)
15mlの乾燥DMFに溶解した750mgのFmoc−Aeg(CMmt)−OHを用いるほかは例36の記載と同様に合成を行う。切断および沈殿は上述のように実施する。
収量:16mgまたは218 OD260
MS(FAB、TFA/NBA):1905(M+H)+
【0077】
例39
Ac−Aeg(A)−Aeg(C)−Aeg(A)−Aeg(T)−Aeg(C)−Aeg(A)−Aeg(T)−Aeg(G)−Aeg(G)−Aeg(T)−Aeg(C)−Aeg(G)−Lys−NH2(C137H176N72O38、式量3439.39)
PNAはEcosyn D300 DNAシンセサイザー(Eppendorf/Biotronik製、Maintal)により、アンカー基として5−(Fmoc−アミノ−4−メトキシベンジル)−2,4−ジメトキシフェニルプロピオン酸を負荷したアミノプロピル−CPG、100mg(5マイクロモル)を用いて合成する。
【0078】
合成には以下の溶液を使用した。
1) アクティベーター溶液:乾燥DMF中0.3モルHATU溶液
2) 活性化用塩基:乾燥DMF中0.3モルNEM溶液
3) Fmoc−Lys(Boc)−OH:DMF中0.3モル溶液
4) Fmocの除去:DMF中20%ピペリジン溶液
5) Fmoc−Aeg(T)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
6) Fmoc−Aeg(AMmt)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
7) Fmoc−Aeg(CMmt)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
8) Fmoc−Aeg(GMmt)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
ピペリジン溶液によるFmocの除去およびDMFでの洗浄ののち、アクティベーター溶液、Fmoc誘導体および塩基を、反応容器中の脱保護支持体に加える。カップリング時間は20分とする。ついでCPGをDMFで5回洗浄すると、ピペリジンによる次の処理が実施できる。合成完了後、PNA−CPG支持体を乾燥し、ついで上述のように後処理する。
収量:210 OD260
MS:3439.4(ES+):(M)+
【0079】
例40
H−Asp−Aeg(C)−Aeg(C)−Aeg(A)−Aeg(T)−Aeg(G)−Aeg(G)−Aeg(T)−Aeg(C)−Aeg(C)−Aeg(C)−Asp−NH−(CH2)6−OH(C119H157N57O38,式量2993.94)
PNAはEcosyn D300 DNAシンセサイザー(Eppendorf/Biotronik製、Maintal)により、6−メチルアミノヘキス−1−イルヘミスクシネートを負荷したアミノプロピル−CPG、133mg(5マイクロモル)を用いて合成する。
【0080】
合成には以下の溶液を使用した。
1) アクティベーター溶液:乾燥DMF中0.3モルHATU溶液
2) 活性化用塩基:乾燥DMF中0.3モルNEM溶液
3) Fmoc−Asp(OtBu)−OH:DMF中0.3モル溶液
4) Fmocの除去:DMF中20%ピペリジン溶液
5) Fmoc−Aeg(T)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
6) Fmoc−Aeg(AMmt)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
7) Fmoc−Aeg(CMmt)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
8) Fmoc−Aeg(GMmt)−OH:乾燥DMF中0.3モル溶液
ピペリジン溶液によるFmocの除去およびDMFでの洗浄ののち、アクティベーター溶液、Fmoc誘導体および塩基を、反応容器中の脱保護支持体に加える。カップリング時間は20分とする。ついでCPGをDMFで5回洗浄すると、ピペリジンによる次の処理が実施できる。合成完了後、PNA−CPG支持体を乾燥し、塩基上のMmt保護基をまず3%トリクロロ酢酸を用いて除去し、ついでアスパラギン酸上の三級ブチル基をジクロロメタン中60%TFAを用いて除去する。次にPNAを65℃でアンモニア溶液によって処理して支持体から切断し、ついで上述のように後処理する。
収量:100 OD260
MS:2994.4(ES+):(M+H)+
Claims (5)
- 式I
R0は水素、C1〜C18−アルカノイル、C1〜C18−アルコキシカルボニル、C3〜C8−シクロアルカノイル、C7〜C15−アロイル、C3〜C13−ヘテロアロイル、またはオリゴマーの細胞内取り込みに好ましい基であり、
Aはアミノ酸残基であり、
kは0から20までの整数であり、
Qはアミノ酸残基であり、
lは0から20までの整数であり、
Bはヌクレオチド化学において慣用されるヌクレオチド塩基またはそのプロドラッグ型であり、
Q0はヒドロキシル、NH2またはNHR″(R″はC1〜C18−アルキル、C2〜C18−アミノアルキルまたはC2〜C18−ヒドロキシアルキルである)であり、
nは1〜50の整数である]
のPNAオリゴマ−を製造するにあたり、
基Q0を含有するアンカー基Lを備える式II
L−[ポリマー] (II)
のポリマー支持体に、いずれかのアミノ酸(Q′)を最初にカップリングさせ、中間体として式III
(Q')1−L−[ポリマ−] (III)
(式中、Lは上記に定義した通りであり、Q′は必要に応じて側鎖が保護されているアミノ酸Qであり、lは0から20までの整数である)を得、ついで、
a) 式IV
PGは9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、2,2−[ビス(4−ニトロフェニル)]エトキシカルボニル(Bnpeoc)、2−(2,4−ジニトロフェニル)エトキシカルボニル(Dnpeoc)、2−メチルスルホニルエチルオキシカルボニル(Msc)および1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)から選ばれる塩基不安定性アミノ保護基であり、
B′は環外アミノ官能基が保護されているヌクレオチド塩基である)の化合物を、式IIIの化合物にカップリングさせるか、または式IVの化合物を式IIのポリマー支持体に直接カップリングさせ、
b) 塩基不安定性アミノ保護基PGを、塩基性の試薬を用いて除去し、
c) 工程aおよびbをn−1回反復し、
d) Aとして定義されたアミノ酸であるが必要に応じてそれらの側鎖が保護されたアミノ酸A'をさらにカップリングさせ、ついでR0が水素ではない場合には基R0を導入し、
e) 中間体として得られた式Ia
- 式Iにおいて、
Aは、グリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロキノリン−3−カルボン酸、オクタヒドロインドール−2−カルボン酸およびN−(2−アミノエチル)グリシンの群からのアミノ酸残基であり、
kは、0から10までの整数であり、
Qは、グリシン、ロイシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、テトラヒドロキノリン−3−カルボン酸、オクタヒドロインドール−2−カルボン酸およびN−(2−アミノエチル)グリシンの群からのアミノ酸残基であり、
lは0から10までの整数であり、
Bは、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの群からの天然のヌクレオチド塩基、もしくはプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N4,N4−エタノシトシン、N6,N6−エタノー2,6−ジアミノプリン、5−メチルシトシン、5−(C3〜C6)−アルキニル−ウラシル、5−(C3〜C6)−アルキニル−シトシン、5−フルオロウラシル、プソイドイソシトシンおよび2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾールピリミジン、またはそれらのプロドラッグ型であり、
nは4〜35の整数である]
である請求項1に記載の式IのPNAオリゴマーの製造方法。 - PGはFmocまたはBnpeocまたはDnpeoc保護基であり、B′は環外アミノ官能基が弱酸または中等度の強度の酸に不安定なウレタン型またはトリチル型の基である保護基によって保護されているヌクレオチド塩基である請求項3に記載の式IVの化合物。
- PGはFmoc保護基であり、B′は環外アミノ官能基が弱酸または中等度の強度の酸に不安定なウレタン型またはトリチル型の基である保護基によって保護されているヌクレオチド塩基である請求項4に記載の式IVの化合物。
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