JP4087919B2

JP4087919B2 - ｄ−ビオチンの発酵による製造

Info

Publication number: JP4087919B2
Application number: JP07332897A
Authority: JP
Inventors: 達雄星野; 昭文野呂; 正明田副
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1996-04-06
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: DE69713436D1; ES2177854T3; CN1172165A; ATE219523T1; EP0799895B1; JPH104995A; US5922581A; EP0799895A1; DK0799895T3; CN1115416C; DE69713436T2; ID16417A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵によるｄ−ビオチンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ｄ−ビオチンは、動物、植物および微生物の栄養に必須なビタミンの一つであり、医薬品および食品添加物として非常に重要である。本発明は、発酵による高収量でのｄ−ビオチンの製造を可能にする。
【０００３】
これまでｄ−ビオチンの発酵による生産に関しては、数多くの研究がある。ビオチン代謝拮抗物質に耐性を有するバチルス（Bacillus）株（特開昭５８−１５２４９５）およびビオチン代謝拮抗物質に耐性を有するセラチア(Serratia)株（特開平２−２７９８０）は、それぞれ０. ６〜４. ０mg/lおよび４. ３〜２２mg/lのｄ−ビオチンを生産する。しかし、ビオチン代謝拮抗物質に耐性を有するクルチア（Kurthia)属に属する微生物によるｄ−ビオチンの生産はこれまで報告されていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、大量のｄ−ビオチンを蓄積させることを可能とする。ビオチン代謝拮抗物質、たとえばアシドマイシン（以下、ＡＣＭと略記する）、５−（２−チエニル）−吉草酸（以下、ＴＶＡと略記する）、α−メチルデチオビオチン（以下、ＭｅＤＴＢと略記する）、２−メチルＡＣＭ、アミクレノマイシンおよびビスノルビオチノールおよびそれらの混合物に耐性を有する、クルチア属に属する微生物が、培養ブロス中に大量のｄ−ビオチンを蓄積することができ、そこから良好な純度で蓄積したｄ−ビオチンを採取できることが認められた。事実、本発明を用いることにより、バチルス又はセラチア属に属する株を用いる既存の方法より約５ないし２００倍高い収量でｄ−ビオチンを生産させることが可能である。このように本発明は、ビオチン代謝拮抗物質に耐性を有し、ｄ−ビオチン生産能を有するクルチア属に属する微生物を、好気的条件下、培地中で培養し、生成したｄ−ビオチンを発酵ブロスから分離することからなるｄ−ビオチンの製造法を提供する。
【０００５】
培養ブロス中に蓄積したｄ−ビオチンの含有量は、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum)ＡＴＣＣ８０１４〔Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 56, 95-98 (1944)〕を用いる比濁法〔J. Microbiological Methods, 6, 237-245 (1987) 〕により定量することができる。
【０００６】
本発明で用いることができる微生物は、クルチア属〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th ed., vol.2, 1255 (1984）を参照〕に属し、前述のようなビオチン代謝拮抗物質に耐性を有する、ｄ−ビオチンを生産するすべての微生物を含む。上述の微生物は、親株としてクルチア属に属する株を、変異原物質、たとえばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＴＧと略記する）、エチルメタンスルホン酸、アクリジンオレンジ、紫外線又はＸ線で処理することにより効率良く得られる。
【０００７】
本発明で用いられる微生物を調製するための親株としては、クルチア属に属するいかなる株も用いることができる。クルチア属に属する微生物は、自然界から分離してもよく、又は微生物菌株保存機関から購入してもよい。好ましくは本発明においては、クルチアＳＰ５３８−６（ＤＳＭ No.９４５４）を用いる。大量のｄ−ビオチン生産能を有する微生物は、クルチア属に属し、上述したようなビオチン代謝拮抗物質に耐性を有する微生物を分離することにより得ることができる。たとえば、大量のｄ−ビオチンを生産するクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳＭ No.９４５４）の変異株は、以下に述べるように分離した。
【０００８】
（１）大量のｄ−ビオチン生産能を有するＡＣＭ耐性変異株の分離
液体培地で培養したクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳＭ No.９４５４）の細胞を遠心分離により集め、生理食塩水で洗浄し、懸濁した。突然変異誘発を以下に述べるようにAdelbergら〔Biochem. Biophys. Res. Comm., 18, 788, (1965) 〕の方法で行った。細胞を、１００mMトリス塩酸緩衝液中、pH８. ０で、５０〜３００μg/mlのＮＴＧで振とうしながら処理した。処理後、その細胞を生理食塩水で洗浄し、ふたたび懸濁した。その洗浄細胞を、ＡＣＭ１００μg/mlを含む蒸留水１，０００mlにグリセリン２０ｇ、ビタミンを含まないカザミノ酸（ディフコ）５ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ２ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ０．０１ｇおよびチアミン・塩酸塩１００μg を含む、ｄ−ビオチンを含まない合成培地（以下、ＢＭと略記する）の寒天平板上にまいた。培養後、生育した大きなコロニーを、ビオチンの指示菌としてラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に植菌した。３７℃で培養後、ｄ−ビオチン量に依存して生じる生育ハローの直径を測定した。その結果、最も大きなハローを形成するコロニーを得、クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６と命名した。
【０００９】
（２）大量のｄ−ビオチン生産能を有するＡＣＭおよびＴＶＡ耐性変異株の分離
クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６を培養し、その細胞を（１）で述べたのと同様の方法でＮＴＧで処理した。処理した細胞を、ＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含む蒸留水１，０００mlにグリセリン２０ｇ、（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ３ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ２ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ０．０１ｇおよびチアミン・塩酸塩１００μg を含む、ｄ−ビオチンを含まない合成培地（以下、ＭＭと略記する）で培養し、２〜３日ごとにＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含む新しい培地で連続的に数回植え継いだ。その結果、得られる集積物を希釈し、ＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含むＭＭ寒天平板上にまいた。培養後、生育した大きなコロニーを、（１）で述べたのと同様の方法で、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に植菌した。培養後、生育ハローの直径を測定した。その結果、最も大きなハローを形成するコロニーを得、クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４と命名した。
【００１０】
（３）大量のｄ−ビオチン生産能を有するＡＣＭ、ＴＶＡおよびＭｅＤＴＢ耐性変異株の分離
クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４を培養し、その細胞を（１）で述べたのと同様の方法でＮＴＧで処理した。処理した細胞を、ＡＣＭ１００μg/mlを含むＢＭ寒天平板上にまいた。培養後、プレート中でｄ−デチオビオチン０. ５μg/mlおよびＭｅＤＴＢ８０μg/mlを含む生産培地の寒天ブロック上にコロニーを植菌した。培養後、寒天ブロックに紫外線を照射し、それらの寒天ブロックをラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に移した。培養後、生育ハローの直径を測定した。その結果、最も大きなハローを形成するコロニーを得、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９と命名した。
【００１１】
更に、前のパラグラフで述べたのと同様の方法でＭｅＤＴＢ１５０μg/mlに耐性な変異株をスクリーニングした。その実験から、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９より更に大きなハローを形成するコロニーを得、クルチアＳＰ５３８−２Ａ１３と命名した。
【００１２】
本発明の製造法は、同化可能な炭素源、消化しやすい窒素源、無機塩、および微生物の生育に必要な他の栄養素を含む培地で微生物を培養することにより適宜実施する。炭素源としては、たとえばグルコース、フラクトース、デンプン、乳糖、マルトース、ガラクトース、スクロース、デキストリン、グリセリン又はキビゼリーなどが用いられ、好ましくはグリセリン又はグルコースが用いられる。窒素源としては、たとえばペプトン、大豆粉、コーンスチープリカー（corn steep liquor)、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素又はそれらの混合物が用いられ、好ましくはペプトンが用いられる。更に、その他の微量元素としてカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルトおよび鉄の硫酸塩、塩酸塩あるいはリン酸塩などが用いられる。特に好ましい無機塩は、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄および硫酸マンガンである。また、必要に応じて動物油、植物油、鉱油などの一般的な栄養因子もしくは消泡剤を加えてもよい。培養に用いる培地のpHは、好都合には約５. ０ないし９. ０、好ましくは約６. ５ないし７. ５である。培養温度は、適当には約１０ないし４０℃、好ましくは約２６ないし３０℃である。培養時間は、約１ないし１０日、好ましくは約２ないし７日、最も好ましくは約２ないし４日（４８ないし９６時間）である。通常、培養において通気、撹拌により好ましい結果が得られる。
【００１３】
本発明の製造法において、好ましくは、微生物の培養は、同化可能な炭素源、消化しやすい窒素源、無機塩、および微生物の成育に必要な他の栄養素を含む培地中、約５．０ないし９．０のpH、約１０ないし４０℃の温度で、好気的条件下で、約１ないし１０日間行う。より好ましくは、微生物の培養は、炭素源としてグリセリン又はグルコース、窒素源としてペプトン、そしてリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄および硫酸マンガンなどの無機塩少量を含む培地中、約６．５ないし７．５のpH、約２６ないし３０℃の温度で、好気的条件下で、約４８ないし９６時間行う。
【００１４】
培養後、生産されたｄ−ビオチンは、培養ブロスから分離され、精製される。通常、培養ブロスから生成物の抽出に用いる方法は、ｄ−ビオチンの各種の性質を利用して行われる。したがって、たとえば菌体を培養ブロスから除き、その濾液中の所望な物質を活性炭に吸着させ、溶出後、更にイオン交換樹脂で精製する。あるいは、直接、培養濾液をイオン交換樹脂に適用し、溶出後、所望な生成物をアルコールと水の混液から再結晶化する。
【００１５】
本発明で用いられる微生物は、ＡＣＭ、ＴＶＡ、ＭｅＤＴＢ、２−メチルＡＣＭ、アミクレノマイシンおよびビスノルビオチノール又はそれらの混合物に耐性な、ｄ−ビオチン生産能を有するクルチア属に属するすべての菌株を含む。クルチア属の菌株の中で、特に好ましい株はクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６、クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９およびクルチアＳＰ５３８−２Ａ１３であり、それらの菌は１９９６年３月２６日にドイツ、ブラウンシュバイクのＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)に、それぞれＤＳＭ No.１０６０９、ＤＳＭ No.１０６０８、ＤＳＭ No.１０６１０およびＤＳＭ No.１０６０７として寄託されており、これら自体が本発明に包含される。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明について実施例を示して更に詳細な説明を行うが、本発明は、特定の実施例に限定されるものではないと理解される。
【００１７】
実施例１
１％ブイヨン（極東製薬）を含む寒天培地（以下、ＮＢと略記する）に生育したクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳＭ No.９４５４）の一白金耳の細胞を、ＮＢ培地５０mlを含む５００ml容フラスコに植菌し、２８℃で回転振とう（１８０rpm)を行った。１３. ５時間培養後、培養ブロス中の細胞を７, ５００rpm で１０分間遠心分離することにより集め、滅菌生理食塩水で２回洗浄し、滅菌水２０mlに懸濁した。１００mMトリス塩酸緩衝液（pH８. ０）中、ＮＴＧ５０〜３００μg/mlおよび１×１０⁷ 個／mlの細胞を含む反応混合物５mlを含む試験管を、２８℃で３０分間、往復振とう（２８５rpm)した。その細胞を滅菌生理食塩水５mlで２回洗浄し、生理食塩水５mlに懸濁した。その細胞懸濁液を１０^-1〜１０^-7まで滅菌生理食塩水で連続的に希釈し、ＡＣＭ１００μg/mlを含むＢＭ寒天上にまいた。２８℃で３日間培養後、生育したそれぞれのコロニーのｄ−ビオチン生産性を、以下に述べるラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む寒天平板法で定量した。７５０のコロニーを、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に楊枝を用いて移した。３７℃で一晩培養後、ｄ−ビオチン量に依存する生育ハローの直径を測定した。その結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０６０９）を得た。
【００１８】
ＡＣＭ１００μg/mlを含むＢＭ寒天上に生育するクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６の一白金耳の細胞を、グリセリン２％、プロテオース・ペプトン（日本製薬）４％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．００１％、ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ０．００１％からなる生産培地５mlを含む試験管に植菌後、その試験管を往復振とう機（２８５rpm)にて２８℃で振とうした。３日間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、以下に述べるラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる比濁法で定量した。上澄およびｄ−ビオチンの標準溶液（０〜１０mg/l）を蒸留水で順次１. ２５×１０^-3まで希釈した。希釈溶液５０μl および蒸留水５mlをこの順に試験管に加えた。１２０℃で１０分間オートクレーブ滅菌後、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含むｄ−ビオチン定量用培地（日水）５mlを試験管に加え、３７℃で試験管を垂直に立てて培養した。２１時間培養後、菌体の増殖を、０. ２N 塩酸５mlを加えて停止し、その後６６０nmで試料の濁度を測定した。試料中のｄ−ビオチン量は、試料の濁度を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４の標準生育曲線と比較して計算した。その結果、３日目の培養ブロス上澄中には１リットルあたり３. ９mgのｄ−ビオチンが含まれていた。クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０６０９）は、親株のクルチアＳＰ５３８−６（ＤＳＭ No.９４５４）の約３, ９００倍のｄ−ビオチンを生産していた。
【００１９】
実施例２
実施例１で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０６０９）の細胞をＮＴＧで処理し、ＡＣＭおよびＴＶＡに耐性な細胞を以下に述べるように集積した。ＮＴＧ処理後、洗浄した細胞を、ＡＣＭ１００μg/mlを含むＢＭ培地５mlを含む試験管に植菌し、その試験管を往復振とう機（２８５rpm)にて２８℃で振とうした。一晩培養後、その培養ブロスを、ＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含むＭＭ５mlを含む試験管に、６００nmでの濁度が約０. ０３になるよう植菌した。その試験管を２８℃で振とうし、培養物が混濁するまで生育させた。この集積を２又は３日ごとにＡＣＭ２００μg/mlおよびＴＶＡ２００μg/mlを含む新しいＭＭ培地を含む試験管でくり返した。３回くり返した後、培養物を生理食塩水で希釈し、同じ培地の寒天上にまいた。２８℃で３〜４日間培養後、６５０のコロニーについてｄ−ビオチン生産性を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上で定量した。その結果、最も大きなハローを生産するクルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）を得た。
【００２０】
ＡＣＭ１００μg/mlを含むＢＭ寒天上に生育するクルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）の一白金耳の細胞を、ＡＣＭ５００μg/mlを含むＢＭ培地５mlを含む試験管に植菌し、その試験管を２８℃で振とうした。一晩培養後、培養ブロス１mlを、グリセリン４％、プロテオース・ペプトン４. ５％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％、ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ０．００１％および消泡剤ＣＡ−１１５（日本油脂）１滴からなる生産培地５０mlを含むフラスコに移し、そのフラスコを２８℃で振とうした。７２時間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる比濁法で定量した。その結果、上澄中には１リットルあたり２６. ３mgのｄ−ビオチンが含まれていた。クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）は、親株のクルチアＳＰ５３８−ＫＡ２６（ＤＳＭ No.１０６０９）の約６. ７倍のｄ−ビオチンを生産していた。
【００２１】
実施例３
クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）の培養ブロスからｄ−ビオチンを採取した。それぞれの精製過程でのｄ−ビオチン濃度は、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる比濁法で追跡した。ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４に対してｄ−ビオチン活性２５. ７mg/lを有する７２時間培養ブロス１リットルを、７, ５００rpm で１０分間、遠心分離した。その上澄を、活性炭（和光純藥）３８０mlを充填した３. ６×４２cmのカラムに通した。そのカラムを脱イオン水５００mlで洗浄後、５０％エタノール４７４mlと２５％アンモニア２６mlを含むエタノール／アンモニア溶液５００mlで展開した。ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４に対してｄ−ビオチン活性８２. １mg/lを有する溶出液３００mlを減圧下、５０mlまで濃縮した。その濃縮物を、ダウエックス（Dowex)１×４（ギ酸型、１００−２００メッシュ、Dow Chemical Co. Ltd., U.S.A.)１９０mlを充填したカラム（２. ６×３８cm）に通した後、そのカラムを０. ０５M ギ酸２００mlで洗浄した。その後カラムを、０. １M ギ酸２５０mlを初発の緩衝液として展開し、０. １M ギ酸と０. ３５M ギ酸のそれぞれ２５０mlで直線的濃度勾配溶出を行った。ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４に対してｄ−ビオチン活性１４４. ８mg/lを有する溶出液１６０mlを減圧下で濃縮して、白色粉末１７. ６mgを得た。その白色粉末を、エタノール−水混液から結晶化して、２３２℃の融点を有する白色針状物質１５. １mgを得た。その試料の融点、薄層クロマトグラフ上でのＲｆ値（溶媒系：酢酸エチル／メタノール＝１０／１、Kieselgel 60 F254 ，E. Merck）、赤外線吸収スペクトル、ＮＭＲスペクトルは、ｄ−ビオチン標品（Sigma Co, Ltd., U.S.A.）のそれらと一致していた。
【００２２】
実施例４
実施例１で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）の細胞をＮＴＧで処理した後、ＭｅＤＴＢに耐性な変異株を以下に述べる方法でスクリーニングした。処理した細胞を、ＡＣＭ１００μg/mlを含むＢＭ培地中で２８℃で一晩培養した後、その培養物を滅菌生理食塩水で１０^-1〜１０^-7まで連続的に希釈し、ＡＣＭ８０μg/mlを含むＢＭ寒天上にまいた。２８℃で２〜３日培養後、プレート中でｄ−デチオビオチン０．５μg/mlおよびＭｅＤＴＢ８０μg/mlを補給した、グリセリン２％、プロテオース・ペプトン２％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．０５％、ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ０．００１％および寒天１. ５％を含む生産培地の寒天ブロック上に１９，５００のコロニーを植菌した。２８℃で２日培養後、寒天ブロックに紫外線を２時間照射し、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を含む定量平板上に移した。定量平板を３７℃で１９時間培養し、ハローの直径を測定した。その結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）を得た。
【００２３】
ＡＣＭ１００μg/mlを含むＢＭ寒天上に生育するクルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）の一白金耳の細胞を、ＡＣＭ５００μg/mlを含むＢＭ培地５mlを含む試験管中、２８℃で培養した。一晩培養後、その細胞を遠心分離により集め、１０％グリセリン溶液に懸濁した。その細胞懸濁液１mlを、グリセリン６％、プロテオース・ペプトン５. ５％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０. １％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０. ０５％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０. ０５％、ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ０. ００１％および消泡剤ＣＡ−１１５１滴を含む生産培地５０ml（以下、ＦＭ１と略記する）を含むフラスコに植菌し、そのフラスコを２８℃で培養した。７２時間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる比濁法で定量した。その結果、上澄中には１リットルあたり４１. ５mgのｄ−ビオチンが含まれていた。クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）は、親株のクルチアＳＰ５３８−１７Ｈ４（ＤＳＭ No.１０６０８）の約１. ６倍のｄ−ビオチンを生産していた。
【００２４】
実施例５
ＭｅＤＴＢに対してより耐性な変異株を、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）から誘導した。実施例１で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）の細胞をＮＴＧで処理した後、ＭｅＤＴＢ１５０μg/mlに耐性な変異株を、寒天ブロック中のＭｅＤＴＢ濃度以外は実施例４で述べたのと同様の方法でスクリーニングした。その結果、最も大きなハローを形成するクルチアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.１０６０７）を得た。
【００２５】
実施例４で述べたのと同様の方法で、クルチアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.１０６０７）を、ＦＭ１培地５０mlを含むフラスコで２８℃で培養した。２４時間培養後、グリセリン４０％およびプロテオース・ペプトン２０％を含む滅菌培地５mlを供給し、培養を続けた。１２０時間培養後、培養ブロス上澄中のｄ−ビオチン含量を、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４を用いる比濁法で定量した。その結果、上澄には１リットルあたり１２６mgのｄ−ビオチンが含まれていた。クルチアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.１０６０７）は、親株のクルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）の約３倍のｄ−ビオチンを生産していた。
【００２６】
下記の表−１には、これまでに得られた変異株のｄ−ビオチン生産性を要約した。
【００２７】
【表１】

Claims

クルチアＳＰ５３８−５１Ｆ９（ＤＳＭ No.１０６１０）またはクルチアＳＰ５３８−２Ａ１３（ＤＳＭ No.１０６０７）。
請求項１に記載の微生物を、好気的条件下、培地中で培養し、生成したｄ−ビオチンを発酵ブロスから分離することを特徴とするｄ−ビオチンの製造法。