JP4086928B2 - タイプ２ヘルパーｔ細胞型サイトカイン産生選択的抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タイプ２ヘルパーＴ細胞（以下、Th2と略す）型サイトカイン産生選択的抑制剤に関する。さらに詳しくは、Th2型サイトカインの産生を選択的に抑制することにより、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防することができる、新規なTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫応答において中心的な役割を担っているヘルパーＴ細胞（以下、Thと略す）と呼ばれるリンパ球が、異なる二つのサブセットに分類されることを初めて提唱したのはMosmannらである。彼らはマウスのThを、産生するサイトカインのパターンにより、タイプ１ヘルパーＴ細胞（以下、Th1と略す）とTh2の２群に分類した（J.Immunol. (1986) 136 : 2348-2357 ）。
Th1は、インターフェロンγ（IFNγ）やインターロイキン２（IL-2）を産生し、マクロファージやナチュラルキラー細胞を活性化することで、主にウイルス、バクテリア等に対する感染防御などの細胞性免疫に関与することが知られている。一方、Th2は、IL-4、IL-5等を産生し、主にIgE抗体産生などの液性免疫に関与することが知られている。最近では、ヒトにおいてもTh1様細胞及びTh2様細胞がクローン化されて研究が進み、前述のような考え方がおおむねヒトにおいてもあてはまることが確認されている。
【０００３】
Th2は以下に述べるように、アレルギー反応に関与すると考えられているサイトカインを産生することから、アレルギー反応の制御細胞として重要視されている。すなわち、Th2型サイトカインの代表であるIL-4は、Ｂ細胞に対してIgE抗体の産生を誘導するとともに、肥満細胞の活性化及び増殖を誘導する作用を有している。また好酸球が血管内皮細胞に接着し、組織浸潤する際に機能する重要な分子であるVCAM-1の遺伝子発現も誘導する（ファルマシア(1993)29:1123-1128）。最近では該IL-4は、Th2自身の分化増殖因子としても注目されている。このようなIL-4で代表されるTh2型サイトカインの特性から、該Th2は、IgE抗体や肥満細胞が関与するアレルギーの即時型反応、及び好酸球が関与するアレルギーの遅発型反応という二つのアレルギー反応のいずれをも制御する中心的な細胞であると認識されている。従ってアレルギー性疾患は、Th2の病的な機能亢進に起因した疾患であるものと推測されている。実際にアレルギー性疾患の病変部である気道や皮膚において、IL-4やIL-5等のTh2型サイトカインの産生、あるいはTh2の存在等が確かめられていることもあり、アレルギー性疾患を治療あるいは予防するためには該Th2の活性化の制御、ひいてはTh2型サイトカインの産生制御が重要であるとする考え方が、広く一般に受け入れられている（Nature (1996) 383 : 787-793 ）。
【０００４】
前記アレルギー性疾患と同様に、Th2の機能亢進が関与する疾患として寄生虫感染症が知られている（臨床免疫（1995）27:652-656）。また、全身性エリテマトーデス等の、抗体産生あるいは液性免疫が異常に亢進した状態にある自己免疫疾患においても、やはりTh2が病的に機能亢進した状態にあると推定されている（Medical Immunology (1988) 15 : 401）。さらに最近の研究において、エイズの発症後期においてTh2がTh1に比べて優位になるバランス異常状態が確認されており、このバランス異常状態を経過することが、最終的な免疫不全状態に移行する上で重要な段階である可能性が示唆されている。そして、このバランス異常状態を改善できればエイズの発症を遅らせる、あるいは発症を止めることができるとの指摘もなされている（Immunology Today (1993) 14 : 107-111）。
以上のような知見から、Th2型サイトカインの産生を抑制する薬剤が開発されれば、前記アレルギー性疾患、自己免疫疾患あるいはエイズ等の有効な治療薬又は予防薬になるものと期待されている。
【０００５】
さらに、より副作用の少ない治療薬、予防薬の開発をも念頭に置いた場合、Th1型サイトカインの産生を抑制しないことも重要である。すなわち、先にも述べたようにTh1は、主としてIFNγを産生することによりウイルス、バクテリア等に対する感染防御を行うという生体にとって重要な役割を担っているため、前記Th2の作用の抑制を目的に開発された薬剤がTh1の作用を抑制しないものであれば、それは副作用の面から非常に望ましいことと言える。例えば免疫抑制剤であるシクロスポリンＡやFK506は、アレルギー性疾患である喘息やアトピー性皮膚炎に適用されその有効性が認められてはいるものの、これらの薬剤はいずれも副作用が非常に強く、有効性と副作用のバランスが問題視されており、副作用のことを考えると積極的に使用されるケースは限られている（Asthma (1994) 7: 154-157）。その理由として、これらシクロスポリンＡやFK506は、Th2のみならずTh1の作用をも抑制してしまうという非特異的な免疫抑制作用を有するがために、日和見感染等の副作用の問題を生じさせるものと予想されている。
以上のことから、IFNγのようなTh1型サイトカインの産生を抑制することなくIL-4のようなTh2型サイトカインの産生を抑制する薬剤が開発されれば、前述の如きアレルギー性疾患等の有効な治療薬あるいは予防薬になるものと考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、IFNγの如きTh1型サイトカインの産生を抑制することなく、IL-4の如きTh2型サイトカインの産生を抑制することにより、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防することができる、新規なTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤を提供することを目的とする。即ち本発明の課題は、Lipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含み、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防することができる、Th2型サイトカイン産生選択的抑制剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記従来技術からも明らかなように、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を有効かつ少ない副作用で治療又は予防することのできる薬剤は、そのメカニズムとしてTh1型サイトカインの産生は抑制せず、Th2型サイトカインの産生を抑制するものであると思われる。本発明者らは従来よりこのようなTh2型サイトカインの産生を選択的に抑制する薬剤の開発を目的とし、多数の化合物のスクリーニングと基礎的な検討を行ってきた。すなわち抗原で免疫感作したマウスのリンパ節細胞、あるいは抗原刺激したTh1及びTh2クローンからのTh1型及びTh2型サイトカインの産生を、スクリーニングに供した化合物がどのように抑制するか鋭意検討を行ってきた。
International Immunol.(1996) 8 : 897-904、J.Immunol.(1994) 153 : 4142、あるいはJ.Exp.Med.(1995) 182 : 1357-1367等の多くの文献において、Th2型サイトカインの代表としてIL-4が、またTh1型サイトカインの代表としてIFNγが挙げられており、Th2型サイトカインとは機能あるいは量の観点からIL-4であると言っても過言ではなく、また同様にTh1型サイトカインとはIFNγであると言っても過言ではないというのが広く一般的な認識となっている。従って本発明者らもTh2型サイトカインとしてIL-4を、またTh1型サイトカインとしてIFNγを測定することにより、目的とするTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤のスクリーニングを行った。
【０００８】
その結果、驚くべきことに、Lipid AあるいはLipid A類縁体がTh2型サイトカインの産生を選択的に抑制するという、本発明の目的とする作用を有することを見出した。さらに、in vivoでの効果を確認すべく、免疫したマウスIgE産生モデルに該Lipid AあるいはLipid A類縁体を供したところ、IgEの産生が阻害されること、すなわち抗アレルギー作用を有することを見出した。
【０００９】
Lipid Aは、グラム陰性菌の外膜構成成分であるLPS(リポポリサッカライド)の部分構造であり、グルコサミンなどのアミノ糖に脂肪酸が結合した構造を有している。LPSは1865年にBillrothによって、発熱物質としての作用が見い出され、1952年にWestphalらによって、その活性本体がLipid Aにあることが示された。
その後、LPSの作用は発熱作用のみではなく、抗腫瘍作用、補体の活性化、アジュバント作用、感染に対する非特異的抵抗性の亢進などの免疫賦活作用、あるいはエンドトキシンショック・シュワルツマン反応などの細胞障害作用などが見い出されてきた。このようにLPSは、生体にとって有害な作用がある反面、有益な面もあるため、例えばLPSの有する抗腫瘍作用、あるいは感染に対する抵抗性の増強などの免疫賦活作用を、その細胞障害作用をできるだけ抑えた形で利用したいと考えられている。現在、LPSの有する免疫賦活作用等の有益な作用を損なわない範囲で低分子化・低毒性化を行ったLipid A合成類縁体が、多くの製薬企業、研究機関で合成され、免疫増強剤あるいは抗癌剤として開発されている。しかし、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患の治療を目的とした開発は全くなされていない。
【００１０】
最近になって、LPSでマクロファージを刺激することにより、インターロイキン12(IL-12)の産生が増強されることが分かってきた（臨床免疫(1995)27:113-119）。IL-12のTh2への作用については、IL-12がTh2型サイトカインの産生を抑制するという説(J.Immunol.(1995)154:2578-2587)と、その逆にTh2クローンからのIL-4の産生を増強するという説（Eur.J.Immunol.(1995) 25:2247-2252)の相矛盾する２つの説があり、結局、IL-12あるいはIL-12産生増強作用を有するLPSやLipid Aが、Th2にどのような影響を及ぼすかについては、現在まで不明のままであった。
【００１１】
これに対し本発明者らは、Lipid AがIL-12を介さずにTh2に直接作用してTh2からのサイトカインの産生を抑制するという、従来知られていない新たな作用を有していることを発見した。すなわち後述の実施例２に記載のように、IL-12はTh2クローンからのIL-4の産生を弱く増強するが、Lipid Aはこれとは逆にTh2クローンからのIL-4の産生を強く抑制することが判明したことから、Lipid AはIL-12を介すことなくTh2からのIL-4の産生を独自に抑制していることが明らかとなった。このようなLipid AのIL-12を介さない新たな作用を見出したことによって初めて、Lipid Aが本発明のTh2型サイトカイン産生抑制剤となることが明らかとなったのである。
本発明は、これらの知見に基づき完成するに至ったものである。即ち本発明の要旨は、Lipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含むTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤、あるいはLipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含み、Th2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防するのものである、Th2型サイトカイン産生選択的抑制剤に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、有効成分としてLipid Aそのものを含んでいても良いし、あるいはその類縁体を含んでいても良い。Lipid Aはグラム陰性菌の外膜構成成分であるLPSの一部分であるが、該化合物が既に市販されているため（Lipid A S.minnesota R595 : Product No.401, List biological laboratories, Inc., Campbell (CA)等）、容易に入手することができる。また、Lipid A類縁体についても、種々のLipid A類縁体が既に市販されており（Lipid A monophosphoryl: Product No.L-6638, Sigma、GLA-60: Code No.071-03251,和光純薬等）、容易に入手することができる。現在市販あるいは開発中のLipid A合成類縁体は、そもそもLipid Aの有している活性を損なわない範囲で低分子化・低毒性化を行ったものであり、それゆえLipid A活性を保持していることには疑いない。本発明においてLipid AのTh2型サイトカイン産生選択的抑制効果が確認されたのであるから、該Lipid A活性を有するLipid A類縁体も、同様の効果を有するものとして本発明の範疇に含まれる。ちなみに、現在知られているLipid A類縁体のうち比較的低分子であるGLA-60においてさえ、本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制効果が見出されている。
【００１３】
上記以外のLipid A類縁体の例としては、例えばD-Glucose,2-deoxy-2-{[1-oxo-3-[(1-oxo-9-phenylnonyl)oxy]tetradecyl]amino]-,3-benzenenonanoate 4-(hydrogensulfate),monosodium salt、1,3-Dicarboxyisopropyl 2-Deoxy-6-O-[2-deoxy-3-O-(N-dodecanoylglycyl)-4-O-phosphono-2-tetradecanoylamino-b-D-glucopyranosyl]-3-O-(N-dodecanoylglycyl)-2-tetradecanoylamino-a-D-glucopyranoside（Chem.Pharm.Bull.(1991)39:3244-3253に記載）、a-D-Glucopyranose,2-deoxy-6-O-[2-deoxy-3-O-(1-oxotetradecyl)-2-[(1-oxotetradecyl)-O-phosphono-beta-D-glucopyranosyl]-2-[(1-oxotetradecyl)amino-,1-(dihydrogen phosphate)3-tetradecanoate、GLA-27、Lipid X等が挙げられる。
【００１４】
このような本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、優れたTh2型サイトカイン産生の抑制作用を示し、かつTh1型サイトカイン産生は抑制しないものであることから、Th2の機能亢進に起因する各種疾患、例えばアレルギー性疾患、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患あるいはエイズ等に対する有効な治療薬あるいは予防薬として使用できる。
【００１５】
本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、薬効成分としてLipid Aあるいはその類縁体を単独で含むもの、あるいはその両者を含むものであってもよいし、他の薬剤との併用であっても良い。ここで言う他の薬剤としては、アレルギー性疾患等において通常使用される気管支拡張剤や既知の抗アレルギー剤、ステロイド剤等が挙げられる。特に現在、重症の喘息やアトピー性皮膚炎に対しては、ステロイド剤が最も有効であるとして頻繁に使用されているが、該ステロイド剤は長期投与によりステロイド皮膚症、ムーンフェイス、また使用中止後のリバウンドなどの種々の副作用の生じることが問題となっている。従って、本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤を該ステロイド剤と併用することにより、ステロイドの使用量を従来より減らすことが可能である。
【００１６】
Lipid Aあるいはその類縁体を含有する本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、アレルギー性疾患等を治療するのに好ましい投与経路に適した薬学的に許容される媒体を含んでいてもよい。また、本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、通常許容される賦形剤、結合剤、安定剤などをLipid Aあるいはその類縁体とともに配合することにより製造することができる。また、注射剤形で用いる場合は、通常許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００１７】
投与法としては、経口及び非経口投与のいずれも使用可能である。経口投与の場合は吸入剤またはカプセル剤、錠剤、顆粒剤などの剤形で投与することができ、非経口投与の場合は水溶性懸濁液による皮下あるいは静脈注射剤、点滴剤、軟膏剤などの剤形で投与することができる。
【００１８】
投与量は、対象疾患を有効に治療するに充分な量を使用することが可能であるが、一般に、症状、年齢、体重等により異なるが、経口投与の場合、大人では1日当たり約1〜約1000mgの範囲、好ましくは約10〜約500mgの範囲を1回または数回に分けて投与することができる。非経口投与（注射剤）の場合、約0.1〜約500mgの範囲、好ましくは約3〜約100mgの範囲を1回または数回に分けて投与することができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
免疫したマウスリンパ節細胞の抗原依存的なサイトカイン産生に対する、シクロスポリンＡ、IPD-1151T、LPS、Lipid AおよびLipid A類縁体の作用
１．実験方法
１）動物
BALB/cマウスは日本チャールスリバー（横浜）より購入し、7-14週令の雌を使用した。
２）培地
D-MEM培地（ Code No.05919、日水製薬（東京））に牛胎児血清（ Code No.12103-78P、 JRH BIOSCIENCES（Lenexa、KS））を20％、２-メルカプトエタノール（Code No.214-18、ナカライテスク（京都））を50mMとなるように添加して使用した。
【００２１】
３）薬剤
シクロスポリンＡ（サンディミュン内用液、サンド薬品（東京））はジメチルスルホキサイド（Code No.134-45、ナカライテスク（京都））にて1mMとなるように溶解し、培地で希釈して最終濃度0.5、0.05、0.005μMとした。IPD-1151T（特開平8-188533記載の方法により合成可能）はジメチルスルホキサイドにて100mMとなるように溶解し、培地で希釈して最終濃度100、10、1μMとした。なお該IPD-1151Tは、IL-4の産生を抑制し、IFN-γの産生には影響しないという結果が報告されていることから（Jpn.J.Pharmacol.(1993)61:31-39）、対照として使用した。各種LPS、すなわちLPS（E.coli. 0111:B4、Oder No.3922-25-01、Difco Laboratories（Detroit、MI））、LPS(E.coli.026:B6、Code No.3920-25-2、Difco Laboratories（Detroit、MI））、LPS(S.typhosa.0901、Order No.3124-25-6、Difco Laboratories（Detroit、MI））、LPS detoxified（Product No.L-3023、Sigma（St.Louis、MO））は、全て注射用蒸留水（扶桑薬品工業（大阪））で2mg/mlに溶解し、培地で希釈して最終濃度20、2、0.2μg/mlとした。Lipid AであるLipid A S.minnesota R595（Product No.401、List biological laboratories,Inc.、 Campbell （CA））及びLipid A類縁体であるLipid A monophosphoryl（Product No.L-6638、 Sigma（St.Louis、MO））は、ジメチルスルホキサイドで10mg/mlに溶解し、培地で希釈して最終濃度10、1、0.1μg/mlとした。Lipid A類縁体であるGLA-60（Code No.071-03251、和光純薬（大阪））は、2％の注射用蒸留水を含むジメチルスルホキサイドにて溶解し、培地で希釈して最終濃度10、1、0.1μg/mlとした。
【００２２】
４）マウスの免疫
KLH（Catalog No.374805、Calbiochem-Novabiochem Corp.、 La Jolla,（CA））をPBS(-)（ Code No.05913、日水製薬（東京））で4mg/mlに希釈した溶液と完全フロイントアジュバント（Order No.3113-60-5、Difco Laboratories（Detroit、MI））を1:1の体積比で混合して乳化液とし、これをマウス後肢足蹠皮下に100μl/headで注射することによりマウスを免疫した。
５）抗原依存的サイトカイン産生
8-10日後に上記免疫マウスより膝窩リンパ節を摘出し、細胞浮遊液を調製した。次に96穴培養プレート（Code No.4-3075-2、Becton Dickinson Labware（東京））1ウエルあたりに3×105個の細胞をまき、ここへ100μg/ml KLH、10μg/ml抗IL-4受容体抗体（Code No.1688-01、Genzyme（Cambridge、MA））、および上記３）にて調製した各種薬剤を加えて37℃、5%CO2存在下で培養した（0.15ml/well）。培養4日後に上清を回収し、該培養上清中に産生されたサイトカインを以下に示すELISA法にて定量した。その際、Th2の産生する代表的なサイトカインとしてIL-4を、Th1の産生する代表的なサイトカインとしてIFNγを、それぞれ定量した。
【００２３】
６）ELISAによるIL-4及びIFNγ量の測定
培養上清中のIL-4量の測定は、以下に示すELISA法にて行った。まずラット抗マウスIL-4抗体（Catalog No.18031D、Pharmingen（SanDiego、CA））を炭酸緩衝液にて2μg/mlに希釈し、50μl/wellずつ96穴プレート（Falcon 3912、Becton Dickinson and company（Fraklin Lakes、NJ））に添加し、4℃で1晩吸着させた。その後、プレートをリンスし、3%BSA（Code No.012-02、ナカライテスク（京都））を含むPBS(-)にてブロッキングした（200μl/well）。ブロッキング後のプレートをリンスして、上記培養上清と、検量線作成のために20-0ng/mlのリコンビナントマウスIL-4（Catalog No.19004W, Pharmingen(SanDiego,CA)）を、それぞれ50μl/well添加し、室温で4時間反応させた。その後プレートをリンスし、0.1%BSAを含むPBS(-)で1μg/mlに希釈したビオチン標識ラット抗マウスIL-4抗体（Catalog No.18042D、Pharmingen（ SanDiego、CA ））を50μl/well添加し、室温で2時間反応させた。結合した2次抗体は、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（Catalog No.15-30-00、Kirkegaard and Perry Lab（Gaitherburg、MD））0.5μg/ml、100μl/wellにより検出した。室温で1時間インキュベートした後、プレートをリンスし、PNPP基質（code No.250-19、ナカライテスク（京都））を加えて発色させた。マイクロプレートリーダー（MTP-120 Microplatereader,Corona Electric）を用いて波長405nmの吸光度を測定した。 IFNγ量の測定は、1次抗体としてラット抗マウスIFNγ抗体（Catalog No.18181D、Pharmingen（SanDiego、CA））、2次抗体としてビオチン標識ラット抗マウスIFNγ抗体（Catalog No.18112D、Pharmingen（SanDiego、CA））を用いて上記と同様の方法にて行った。検量線作成のためはリコンビナントマウスIFNγ（Catalog No.19051U、Pharmingen（SanDiego、CA））を使用した。
【００２４】
２．結果
IL-4及びIFNγの産生に及ぼすシクロスポリンＡの影響を図１に示す。免疫抑制剤であるシクロスポリンＡは、高濃度ではIL-4、IFNγの両方の産生を抑制し、また低濃度（0.05μM程度）では高濃度と同様、IFNγの産生は抑制する一方、IL-4の産生は増強することが示された。以上のようにシクロスポリンＡは、IFNγの産生を強く抑制する事が示された。
IL-4及びIFNγの産生に及ぼすIPD-1151Tの影響を図２に示す。図２より、IPD-1151TはIL-4、IFNγの産生には影響を及ぼさないことが示された。従ってIPD-1151Tについて報告されているTh2型サイトカイン産生選択的抑制作用は、本試験系では再現されなかった。
IL-4及びIFNγの産生に及ぼす各種LPSの影響を図３（ａ）及び図３（ｂ）に、また各種Lipid A及びLipid A類縁体の影響を図４（ａ）及び図４（ｂ）に示す。図３及び図４より、LPS,detoxified (E.coli.0111:B4)を除く調べた全てのLPS及び調べた全てのLipid A及びLipid A類縁体は、IFNγの産生を抑制することなくIL-4産生を抑制することが示された。一方、Lipid A部分の欠失したLPSであるLPS,detoxified(E.coli.0111:B4)は、他のLPSと異なりIFNγの産生を弱いながらも抑制したことから、Th2型サイトカインを選択的に抑制する活性は、Lipid A部分に起因することが示された。
【００２５】
実施例２
Th1及びTh2クローンの抗原依存的なサイトカイン産生に対するシクロスポリンＡ、IL-12、Lipid Aの作用
次に、Th1クローン及びTh2クローンを用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【００２６】
１．実験方法
１）Th1、Th2 細胞株
Th1（23-1-8）、Th2（24-2）細胞株は東京大学医学部免疫学教室前教授多田富雄先生より分与されたものを使用した。
２）培地
D-MEM培地「ダイゴ」（日本製薬（東京））に56℃、30分にて非働化した牛胎児血清（Code No.A-1115-L、Hyclone Laboratories.（Logan、Utah））を10%、2-メルカプトエタノール（Code No.M-6250、 Sigma（St.Louis、MO））を50μMとなるように添加して使用した。
３）薬剤
シクロスポリンＡ（サンド薬品（東京））はジメチルスルホキサイド（Code No.134-45、ナカライテスク（京都））にて1mMとなるように溶解し、培地で希釈して最終濃度1、0.1、0.01μMとした。
Lipid AであるLipid A S.minnesota R595は、ジメチルスルホキサイドで10mg/mlに溶解し、培地で希釈して最終濃度10、1μg/mlとした。
IL-12（Catalog No.19361V、Pharmingen（SanDiego、CA））は、1% BSAを含むPBS(-)に5μg/mlに溶解後、さらに培地で希釈して最終濃度50、5ng/mlとした。
【００２７】
４）抗CD3、抗CD28抗体による刺激
抗CD3抗体（Catalog No.01081、Pharmingen（San Diego,CA））、抗CD28抗体（Catalog No.01671、Pharmingen（San Diego,CA））をPBS(-)で共に10μg/mlになるように希釈し、96穴培養プレートに吸着させた後リンスした。その後Th1クローン、Th2クローンそれぞれを2×104cells/wellで播種し、上記各薬剤を添加した（0.2ml/well）。培養3日後の上清を回収し、Th2の産生する代表的なサイトカインとしてIL-4を、またTh1の産生する代表的なサイトカインとしてIFNγを、それぞれ測定した。
５）IL-4及びIFNγ量の測定
IL-4及びIFNγ量の測定は、実施例１−６）のELISA法と同じ方法で行った。
【００２８】
２．結果
Th1及びTh2クローンの抗原依存的なサイトカイン産生に対するシクロスポリンＡの作用を図５に、IL-12の作用を図６に、そしてLipid Aの作用を図７に示す。シクロスポリンＡは、Th1 クローンからのIFNγ産生とTh2クローンからのIL-4産生を共に抑制した。IL-12はTh1クローンからのIFNγ産生とTh2クローンからのIL-4産生を共に弱く増強した。これに対しLipid Aは、Th1クローンからのIFNγ産生を抑制しないが、 Th2クローンからのIL-4産生を抑制するという、実施例１と同じ結果が得られた。これらの結果により、Lipid A及びLipid A類縁体のTh2型サイトカイン産生抑制作用は、Lipid Aにおいて従来知られていたIL-12の産生増強作用とは別の、IL-12を介さない新たな経路によるものであることが明らかとなった。このように、Lipid AがTh2からのサイトカインの産生を抑制するという作用は、現在までに知られていなかったことである（中野昌康・小玉正智/編 エンドトキシン 1995 p118-119）。
【００２９】
実施例３
免疫したマウスIgE産生モデルに対するLipid A類縁体の作用
IL-4はIgE抗体産生に必須であり、IFNγはIgG2a抗体産生に必要であることが知られている（Science 236: 944-947(1987)）。そこで、実施例１及び２で得られたLipid A及びLipid A類縁体のin vitroでの選択的作用をin vivoでも確認するために、本実験において該IgE値及びIgG2a値を測定した。
【００３０】
１．実験方法
１）動物
BALB/cマウスは日本チャールスリバー（横浜）より購入し、7週令の雌を使用した。
２）薬剤
Lipid A類縁体であるGLA-60は2％の注射用蒸留水を含むジメチルスルホキサイドにて2.5mg/mlとなるように溶解し、0.5％メチルセルロース（Code No.222-22、ナカライテスク（京都））で希釈して最終濃度0.2mg/mlとした。
３）薬剤の投与
対照群（Vehicle）に0.5％メチルセルロースを、GLA-60投与群に0.2mg/mlのGLA60を、0.2ml/20gマウス体重の用量で、1日1回、5日間腹腔内に投与した（2mg/kg/day）。
【００３１】
４）マウスの免疫
1mg/mlのオボアルブミン（=OVA、Product No.A-5503、Sigma（St.Louis、MO））を1.8％ NaCl（Product No.A-5503、ナカライテスク（京都））で4μg/mlに希釈し、水酸化アルミニウムゲルアジュバントAlu-Gel-S（Code No.12261、Serva Feinchemica GmbH and Co.（D-6900 Heidelberg 1））と1:1の体積比で混和した後、上記薬剤投与の1時間後にマウス腹腔内に500μl/headの用量で注射した。
【００３２】
５）抗原特異的マウス血漿IgE値及びIgG2a値の測定
免疫後13日目にマウス眼窩静脈叢からヘマトクリット毛細管（Catalog No.VC-H075H、テルモ(東京)）採血後、低速遠心により血漿を調製し、以下に示すELISA法にて抗原特異的IgE値及びIgG2a値を定量した。
抗原特異的IgE値の ELISAによる定量は、まずラット抗マウスIgE抗体（Code No.7627、Yamasa Corp.（千葉））をPBS(-)で6μg/ml に希釈し、96穴マイクロプレート（Nunc Immuno plate、Nunc（DK-4000 Roskide、Denmark））に50μl/wellで添加し、4℃で1晩吸着させた。その後プレートをリンスし、3%BSAを含むPBS(-)にてブロッキングした（200μl/well）。ブロッキング後プレートをリンスして、各マウス血漿を20-40倍希釈したサンプルと、検量線作成のために対照群のマウス5匹の血漿プールを10-1280倍希釈したサンプルとを50μl/well添加し、4℃で1晩反応させた。その後プレートをリンスし、0.1%BSAを含むPBS(-)で500倍に希釈したビオチン標識OVAを50μl/wellで添加し、室温で2時間反応させた。ビオチン標識OVAは、OVAをNHS-Biotin（Code No.20217X、Pierce（Rockford , IL））でビオチン標識したものを使用した。結合した2次抗体はVectastain ABC kit（Code No.PK-6100、Vector laboratories,Inc.（Burlingame、CA））により検出した。TMBマイクロウエルペルオキシダーゼキシツシステム（Code No.50-76-00、 Kirkegaard and Perry Lab（Gaitherburg、MD））を100μl/well加えて発色させた後、1Mリン酸水溶液（Code No.276-18、ナカライテスク（京都））を100μl/well加え発色反応を止めて、マイクロプレートリーダー（MTP-120 Microplatereader,Corona Electric）を用いて波長450nmの吸光度を測定した。
抗原特異的IgG2a値の ELISAによる定量は、まず注射用蒸留水で1mg/mlに溶解したOVAをPBS(-)でさらに10μg/mlに希釈し、96穴マイクロプレート（Nunc Immuno plate、Nunc（DK-4000 Roskide、Denmark））に50μl/wellで添加し、4℃1晩で吸着させた。その後、プレートをリンスし、3%BSAを含むPBS(-)にてブロッキングした（200μl/well）。ブロッキングの後プレートをリンスして、マウス血漿サンプルを20、40倍希釈して50μl/well添加し、4℃1晩反応させた。プレートをリンスし、0.1%BSAを含むPBS(-)で2000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG2a抗体(Catalog No.1080-04、Southern Biotechnology Associates,Inc.(160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, AL35209))を50μl/wellで添加し、室温で1時間反応させた。プレートをリンス後、PNPP基質（Code No.250-19、ナライテスク（京都））を加えて発色させた。マイクロプレートリーダー（MTP-120 Microplatereader,Corona Electric）を用いて波長405nmの吸光度を測定した。
６）統計処理方法
F検定で2群間が等分散であることを確認し、Studentt検定で有意差を調べた。
【００３３】
２．結果
抗原特異的IgE産生に対するGLA60の作用の結果を図８に示す。図８中、縦軸は血漿中の抗原特異的IgE相対量を示してある。GLA60投与群は、対照群と比較して抗原特異的IgEを有意に抑制した（危険率5%以下）。抗原特異的IgG2aのELISAにおける発色の結果を図９に示す。GLA60投与群は対照群と比較して、抗原特異的IgG2aのELISAにおける発色が強かった。以上の結果より、Lipid A類縁体であるGLA60は抗原特異的IgEを抑制するが、抗原特異的IgG2aを抑制しないことが示された。これらの結果は、GLA60において得られたin vitroでの結果、すなわちTh2型サイトカイン産生を選択的に抑制するという結果に矛盾しないものであった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、Lipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含むTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤が提供される。本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、Th2型サイトカインの産生を抑制し、Th1型サイトカインの産生は抑制しないことから、Th2の機能亢進に起因する各種疾患、例えばアレルギー性疾患、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、エイズなどに対する治療薬又は予防薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、リンパ節細胞からのIL-4、IFNγ産生に対するシクロスポリンの作用を示したグラフである。
【図２】図２は、リンパ節細胞からのIL-4、IFNγ産生に対するIPD1151Tの作用を示したグラフである。
【図３】図３(a)は、リンパ節細胞からのIL-4産生に対する各種LPSの作用を示したグラフであり、図３(b)は、リンパ節細胞からのIFNγ産生に対する各種LPSの作用を示したグラフである。
【図４】図４(a)は、リンパ節細胞からのIL-4産生に対するLipid AおよびLipid A類縁体の作用を示したグラフであり、図４(b)は、リンパ節細胞からのIFNγ産生に対するLipid AおよびLipid A類縁体の作用を示したグラフである。
【図５】図５は、Th2クローンからのIL-4産生に対するシクロスポリンの作用及び、Th1クローンからのIFNγ産生に対するシクロスポリンの作用を示したグラフである。
【図６】図６は、Th2クローンからのIL-4産生に対するIL-12の作用及び、Th1クローンからのIFNγ産生に対するIL-12の作用を示したグラフである。
【図７】図７は、Th2クローンからのIL-4産生に対するLipid Aの作用及び、Th1クローンからのIFNγ産生に対するLipid Aの作用を示したグラフである。
【図８】図８は、抗原特異的IgEに対するGLA60のin vivoでの作用を示したグラフである。
【図９】図９は、抗原特異的IgG2aに対するGLA60のin vivoでの作用を示したグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、タイプ２ヘルパーＴ細胞（以下、Th2と略す）型サイトカイン産生選択的抑制剤に関する。さらに詳しくは、Th2型サイトカインの産生を選択的に抑制することにより、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防することができる、新規なTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫応答において中心的な役割を担っているヘルパーＴ細胞（以下、Thと略す）と呼ばれるリンパ球が、異なる二つのサブセットに分類されることを初めて提唱したのはMosmannらである。彼らはマウスのThを、産生するサイトカインのパターンにより、タイプ１ヘルパーＴ細胞（以下、Th1と略す）とTh2の２群に分類した（J.Immunol. (1986) 136 : 2348-2357 ）。
Th1は、インターフェロンγ（IFNγ）やインターロイキン２（IL-2）を産生し、マクロファージやナチュラルキラー細胞を活性化することで、主にウイルス、バクテリア等に対する感染防御などの細胞性免疫に関与することが知られている。一方、Th2は、IL-4、IL-5等を産生し、主にIgE抗体産生などの液性免疫に関与することが知られている。最近では、ヒトにおいてもTh1様細胞及びTh2様細胞がクローン化されて研究が進み、前述のような考え方がおおむねヒトにおいてもあてはまることが確認されている。
【０００３】
Th2は以下に述べるように、アレルギー反応に関与すると考えられているサイトカインを産生することから、アレルギー反応の制御細胞として重要視されている。すなわち、Th2型サイトカインの代表であるIL-4は、Ｂ細胞に対してIgE抗体の産生を誘導するとともに、肥満細胞の活性化及び増殖を誘導する作用を有している。また好酸球が血管内皮細胞に接着し、組織浸潤する際に機能する重要な分子であるVCAM-1の遺伝子発現も誘導する（ファルマシア(1993)29:1123-1128）。最近では該IL-4は、Th2自身の分化増殖因子としても注目されている。このようなIL-4で代表されるTh2型サイトカインの特性から、該Th2は、IgE抗体や肥満細胞が関与するアレルギーの即時型反応、及び好酸球が関与するアレルギーの遅発型反応という二つのアレルギー反応のいずれをも制御する中心的な細胞であると認識されている。従ってアレルギー性疾患は、Th2の病的な機能亢進に起因した疾患であるものと推測されている。実際にアレルギー性疾患の病変部である気道や皮膚において、IL-4やIL-5等のTh2型サイトカインの産生、あるいはTh2の存在等が確かめられていることもあり、アレルギー性疾患を治療あるいは予防するためには該Th2の活性化の制御、ひいてはTh2型サイトカインの産生制御が重要であるとする考え方が、広く一般に受け入れられている（Nature (1996) 383 : 787-793 ）。
【０００４】
前記アレルギー性疾患と同様に、Th2の機能亢進が関与する疾患として寄生虫感染症が知られている（臨床免疫（1995）27:652-656）。また、全身性エリテマトーデス等の、抗体産生あるいは液性免疫が異常に亢進した状態にある自己免疫疾患においても、やはりTh2が病的に機能亢進した状態にあると推定されている（Medical Immunology (1988) 15 : 401）。さらに最近の研究において、エイズの発症後期においてTh2がTh1に比べて優位になるバランス異常状態が確認されており、このバランス異常状態を経過することが、最終的な免疫不全状態に移行する上で重要な段階である可能性が示唆されている。そして、このバランス異常状態を改善できればエイズの発症を遅らせる、あるいは発症を止めることができるとの指摘もなされている（Immunology Today (1993) 14 : 107-111）。
以上のような知見から、Th2型サイトカインの産生を抑制する薬剤が開発されれば、前記アレルギー性疾患、自己免疫疾患あるいはエイズ等の有効な治療薬又は予防薬になるものと期待されている。
【０００５】
さらに、より副作用の少ない治療薬、予防薬の開発をも念頭に置いた場合、Th1型サイトカインの産生を抑制しないことも重要である。すなわち、先にも述べたようにTh1は、主としてIFNγを産生することによりウイルス、バクテリア等に対する感染防御を行うという生体にとって重要な役割を担っているため、前記Th2の作用の抑制を目的に開発された薬剤がTh1の作用を抑制しないものであれば、それは副作用の面から非常に望ましいことと言える。例えば免疫抑制剤であるシクロスポリンＡやFK506は、アレルギー性疾患である喘息やアトピー性皮膚炎に適用されその有効性が認められてはいるものの、これらの薬剤はいずれも副作用が非常に強く、有効性と副作用のバランスが問題視されており、副作用のことを考えると積極的に使用されるケースは限られている（Asthma (1994) 7: 154-157）。その理由として、これらシクロスポリンＡやFK506は、Th2のみならずTh1の作用をも抑制してしまうという非特異的な免疫抑制作用を有するがために、日和見感染等の副作用の問題を生じさせるものと予想されている。
以上のことから、IFNγのようなTh1型サイトカインの産生を抑制することなくIL-4のようなTh2型サイトカインの産生を抑制する薬剤が開発されれば、前述の如きアレルギー性疾患等の有効な治療薬あるいは予防薬になるものと考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、IFNγの如きTh1型サイトカインの産生を抑制することなく、IL-4の如きTh2型サイトカインの産生を抑制することにより、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防することができる、新規なTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤を提供することを目的とする。即ち本発明の課題は、Lipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含み、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防することができる、Th2型サイトカイン産生選択的抑制剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記従来技術からも明らかなように、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患を有効かつ少ない副作用で治療又は予防することのできる薬剤は、そのメカニズムとしてTh1型サイトカインの産生は抑制せず、Th2型サイトカインの産生を抑制するものであると思われる。本発明者らは従来よりこのようなTh2型サイトカインの産生を選択的に抑制する薬剤の開発を目的とし、多数の化合物のスクリーニングと基礎的な検討を行ってきた。すなわち抗原で免疫感作したマウスのリンパ節細胞、あるいは抗原刺激したTh1及びTh2クローンからのTh1型及びTh2型サイトカインの産生を、スクリーニングに供した化合物がどのように抑制するか鋭意検討を行ってきた。
International Immunol.(1996) 8 : 897-904、J.Immunol.(1994) 153 : 4142、あるいはJ.Exp.Med.(1995) 182 : 1357-1367等の多くの文献において、Th2型サイトカインの代表としてIL-4が、またTh1型サイトカインの代表としてIFNγが挙げられており、Th2型サイトカインとは機能あるいは量の観点からIL-4であると言っても過言ではなく、また同様にTh1型サイトカインとはIFNγであると言っても過言ではないというのが広く一般的な認識となっている。従って本発明者らもTh2型サイトカインとしてIL-4を、またTh1型サイトカインとしてIFNγを測定することにより、目的とするTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤のスクリーニングを行った。
【０００８】
その結果、驚くべきことに、Lipid AあるいはLipid A類縁体がTh2型サイトカインの産生を選択的に抑制するという、本発明の目的とする作用を有することを見出した。さらに、in vivoでの効果を確認すべく、免疫したマウスIgE産生モデルに該Lipid AあるいはLipid A類縁体を供したところ、IgEの産生が阻害されること、すなわち抗アレルギー作用を有することを見出した。
【０００９】
Lipid Aは、グラム陰性菌の外膜構成成分であるLPS(リポポリサッカライド)の部分構造であり、グルコサミンなどのアミノ糖に脂肪酸が結合した構造を有している。LPSは1865年にBillrothによって、発熱物質としての作用が見い出され、1952年にWestphalらによって、その活性本体がLipid Aにあることが示された。
その後、LPSの作用は発熱作用のみではなく、抗腫瘍作用、補体の活性化、アジュバント作用、感染に対する非特異的抵抗性の亢進などの免疫賦活作用、あるいはエンドトキシンショック・シュワルツマン反応などの細胞障害作用などが見い出されてきた。このようにLPSは、生体にとって有害な作用がある反面、有益な面もあるため、例えばLPSの有する抗腫瘍作用、あるいは感染に対する抵抗性の増強などの免疫賦活作用を、その細胞障害作用をできるだけ抑えた形で利用したいと考えられている。現在、LPSの有する免疫賦活作用等の有益な作用を損なわない範囲で低分子化・低毒性化を行ったLipid A合成類縁体が、多くの製薬企業、研究機関で合成され、免疫増強剤あるいは抗癌剤として開発されている。しかし、アレルギー性疾患等のTh2の機能亢進に起因する疾患の治療を目的とした開発は全くなされていない。
【００１０】
最近になって、LPSでマクロファージを刺激することにより、インターロイキン12(IL-12)の産生が増強されることが分かってきた（臨床免疫(1995)27:113-119）。IL-12のTh2への作用については、IL-12がTh2型サイトカインの産生を抑制するという説(J.Immunol.(1995)154:2578-2587)と、その逆にTh2クローンからのIL-4の産生を増強するという説（Eur.J.Immunol.(1995) 25:2247-2252)の相矛盾する２つの説があり、結局、IL-12あるいはIL-12産生増強作用を有するLPSやLipid Aが、Th2にどのような影響を及ぼすかについては、現在まで不明のままであった。
【００１１】
これに対し本発明者らは、Lipid AがIL-12を介さずにTh2に直接作用してTh2からのサイトカインの産生を抑制するという、従来知られていない新たな作用を有していることを発見した。すなわち後述の実施例２に記載のように、IL-12はTh2クローンからのIL-4の産生を弱く増強するが、Lipid Aはこれとは逆にTh2クローンからのIL-4の産生を強く抑制することが判明したことから、Lipid AはIL-12を介すことなくTh2からのIL-4の産生を独自に抑制していることが明らかとなった。このようなLipid AのIL-12を介さない新たな作用を見出したことによって初めて、Lipid Aが本発明のTh2型サイトカイン産生抑制剤となることが明らかとなったのである。
本発明は、これらの知見に基づき完成するに至ったものである。即ち本発明の要旨は、Lipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含むTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤、あるいはLipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含み、Th2の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防するのものである、Th2型サイトカイン産生選択的抑制剤に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、有効成分としてLipid Aそのものを含んでいても良いし、あるいはその類縁体を含んでいても良い。Lipid Aはグラム陰性菌の外膜構成成分であるLPSの一部分であるが、該化合物が既に市販されているため（Lipid A S.minnesota R595 : Product No.401, List biological laboratories, Inc., Campbell (CA)等）、容易に入手することができる。また、Lipid A類縁体についても、種々のLipid A類縁体が既に市販されており（Lipid A monophosphoryl: Product No.L-6638, Sigma、GLA-60: Code No.071-03251,和光純薬等）、容易に入手することができる。現在市販あるいは開発中のLipid A合成類縁体は、そもそもLipid Aの有している活性を損なわない範囲で低分子化・低毒性化を行ったものであり、それゆえLipid A活性を保持していることには疑いない。本発明においてLipid AのTh2型サイトカイン産生選択的抑制効果が確認されたのであるから、該Lipid A活性を有するLipid A類縁体も、同様の効果を有するものとして本発明の範疇に含まれる。ちなみに、現在知られているLipid A類縁体のうち比較的低分子であるGLA-60においてさえ、本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制効果が見出されている。
【００１３】
上記以外のLipid A類縁体の例としては、例えばD-Glucose,2-deoxy-2-{[1-oxo-3-[(1-oxo-9-phenylnonyl)oxy]tetradecyl]amino]-,3-benzenenonanoate 4-(hydrogensulfate),monosodium salt、1,3-Dicarboxyisopropyl 2-Deoxy-6-O-[2-deoxy-3-O-(N-dodecanoylglycyl)-4-O-phosphono-2-tetradecanoylamino-b-D-glucopyranosyl]-3-O-(N-dodecanoylglycyl)-2-tetradecanoylamino-a-D-glucopyranoside（Chem.Pharm.Bull.(1991)39:3244-3253に記載）、a-D-Glucopyranose,2-deoxy-6-O-[2-deoxy-3-O-(1-oxotetradecyl)-2-[(1-oxotetradecyl)-O-phosphono-beta-D-glucopyranosyl]-2-[(1-oxotetradecyl)amino-,1-(dihydrogen phosphate)3-tetradecanoate、GLA-27、Lipid X等が挙げられる。
【００１４】
このような本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、優れたTh2型サイトカイン産生の抑制作用を示し、かつTh1型サイトカイン産生は抑制しないものであることから、Th2の機能亢進に起因する各種疾患、例えばアレルギー性疾患、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患あるいはエイズ等に対する有効な治療薬あるいは予防薬として使用できる。
【００１５】
本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、薬効成分としてLipid Aあるいはその類縁体を単独で含むもの、あるいはその両者を含むものであってもよいし、他の薬剤との併用であっても良い。ここで言う他の薬剤としては、アレルギー性疾患等において通常使用される気管支拡張剤や既知の抗アレルギー剤、ステロイド剤等が挙げられる。特に現在、重症の喘息やアトピー性皮膚炎に対しては、ステロイド剤が最も有効であるとして頻繁に使用されているが、該ステロイド剤は長期投与によりステロイド皮膚症、ムーンフェイス、また使用中止後のリバウンドなどの種々の副作用の生じることが問題となっている。従って、本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤を該ステロイド剤と併用することにより、ステロイドの使用量を従来より減らすことが可能である。
【００１６】
Lipid Aあるいはその類縁体を含有する本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、アレルギー性疾患等を治療するのに好ましい投与経路に適した薬学的に許容される媒体を含んでいてもよい。また、本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、通常許容される賦形剤、結合剤、安定剤などをLipid Aあるいはその類縁体とともに配合することにより製造することができる。また、注射剤形で用いる場合は、通常許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
【００１７】
投与法としては、経口及び非経口投与のいずれも使用可能である。経口投与の場合は吸入剤またはカプセル剤、錠剤、顆粒剤などの剤形で投与することができ、非経口投与の場合は水溶性懸濁液による皮下あるいは静脈注射剤、点滴剤、軟膏剤などの剤形で投与することができる。
【００１８】
投与量は、対象疾患を有効に治療するに充分な量を使用することが可能であるが、一般に、症状、年齢、体重等により異なるが、経口投与の場合、大人では1日当たり約1〜約1000mgの範囲、好ましくは約10〜約500mgの範囲を1回または数回に分けて投与することができる。非経口投与（注射剤）の場合、約0.1〜約500mgの範囲、好ましくは約3〜約100mgの範囲を1回または数回に分けて投与することができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
免疫したマウスリンパ節細胞の抗原依存的なサイトカイン産生に対する、シクロスポリンＡ、IPD-1151T、LPS、Lipid AおよびLipid A類縁体の作用
１．実験方法
１）動物
BALB/cマウスは日本チャールスリバー（横浜）より購入し、7-14週令の雌を使用した。
２）培地
D-MEM培地（ Code No.05919、日水製薬（東京））に牛胎児血清（ Code No.12103-78P、 JRH BIOSCIENCES（Lenexa、KS））を20％、２-メルカプトエタノール（Code No.214-18、ナカライテスク（京都））を50mMとなるように添加して使用した。
【００２１】
３）薬剤
シクロスポリンＡ（サンディミュン内用液、サンド薬品（東京））はジメチルスルホキサイド（Code No.134-45、ナカライテスク（京都））にて1mMとなるように溶解し、培地で希釈して最終濃度0.5、0.05、0.005μMとした。IPD-1151T（特開平8-188533記載の方法により合成可能）はジメチルスルホキサイドにて100mMとなるように溶解し、培地で希釈して最終濃度100、10、1μMとした。なお該IPD-1151Tは、IL-4の産生を抑制し、IFN-γの産生には影響しないという結果が報告されていることから（Jpn.J.Pharmacol.(1993)61:31-39）、対照として使用した。各種LPS、すなわちLPS（E.coli. 0111:B4、Oder No.3922-25-01、Difco Laboratories（Detroit、MI））、LPS(E.coli.026:B6、Code No.3920-25-2、Difco Laboratories（Detroit、MI））、LPS(S.typhosa.0901、Order No.3124-25-6、Difco Laboratories（Detroit、MI））、LPS detoxified（Product No.L-3023、Sigma（St.Louis、MO））は、全て注射用蒸留水（扶桑薬品工業（大阪））で2mg/mlに溶解し、培地で希釈して最終濃度20、2、0.2μg/mlとした。Lipid AであるLipid A S.minnesota R595（Product No.401、List biological laboratories,Inc.、 Campbell （CA））及びLipid A類縁体であるLipid A monophosphoryl（Product No.L-6638、 Sigma（St.Louis、MO））は、ジメチルスルホキサイドで10mg/mlに溶解し、培地で希釈して最終濃度10、1、0.1μg/mlとした。Lipid A類縁体であるGLA-60（Code No.071-03251、和光純薬（大阪））は、2％の注射用蒸留水を含むジメチルスルホキサイドにて溶解し、培地で希釈して最終濃度10、1、0.1μg/mlとした。
【００２２】
４）マウスの免疫
KLH（Catalog No.374805、Calbiochem-Novabiochem Corp.、 La Jolla,（CA））をPBS(-)（ Code No.05913、日水製薬（東京））で4mg/mlに希釈した溶液と完全フロイントアジュバント（Order No.3113-60-5、Difco Laboratories（Detroit、MI））を1:1の体積比で混合して乳化液とし、これをマウス後肢足蹠皮下に100μl/headで注射することによりマウスを免疫した。
５）抗原依存的サイトカイン産生
8-10日後に上記免疫マウスより膝窩リンパ節を摘出し、細胞浮遊液を調製した。次に96穴培養プレート（Code No.4-3075-2、Becton Dickinson Labware（東京））1ウエルあたりに3×105個の細胞をまき、ここへ100μg/ml KLH、10μg/ml抗IL-4受容体抗体（Code No.1688-01、Genzyme（Cambridge、MA））、および上記３）にて調製した各種薬剤を加えて37℃、5%CO2存在下で培養した（0.15ml/well）。培養4日後に上清を回収し、該培養上清中に産生されたサイトカインを以下に示すELISA法にて定量した。その際、Th2の産生する代表的なサイトカインとしてIL-4を、Th1の産生する代表的なサイトカインとしてIFNγを、それぞれ定量した。
【００２３】
６）ELISAによるIL-4及びIFNγ量の測定
培養上清中のIL-4量の測定は、以下に示すELISA法にて行った。まずラット抗マウスIL-4抗体（Catalog No.18031D、Pharmingen（SanDiego、CA））を炭酸緩衝液にて2μg/mlに希釈し、50μl/wellずつ96穴プレート（Falcon 3912、Becton Dickinson and company（Fraklin Lakes、NJ））に添加し、4℃で1晩吸着させた。その後、プレートをリンスし、3%BSA（Code No.012-02、ナカライテスク（京都））を含むPBS(-)にてブロッキングした（200μl/well）。ブロッキング後のプレートをリンスして、上記培養上清と、検量線作成のために20-0ng/mlのリコンビナントマウスIL-4（Catalog No.19004W, Pharmingen(SanDiego,CA)）を、それぞれ50μl/well添加し、室温で4時間反応させた。その後プレートをリンスし、0.1%BSAを含むPBS(-)で1μg/mlに希釈したビオチン標識ラット抗マウスIL-4抗体（Catalog No.18042D、Pharmingen（ SanDiego、CA ））を50μl/well添加し、室温で2時間反応させた。結合した2次抗体は、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（Catalog No.15-30-00、Kirkegaard and Perry Lab（Gaitherburg、MD））0.5μg/ml、100μl/wellにより検出した。室温で1時間インキュベートした後、プレートをリンスし、PNPP基質（code No.250-19、ナカライテスク（京都））を加えて発色させた。マイクロプレートリーダー（MTP-120 Microplatereader,Corona Electric）を用いて波長405nmの吸光度を測定した。 IFNγ量の測定は、1次抗体としてラット抗マウスIFNγ抗体（Catalog No.18181D、Pharmingen（SanDiego、CA））、2次抗体としてビオチン標識ラット抗マウスIFNγ抗体（Catalog No.18112D、Pharmingen（SanDiego、CA））を用いて上記と同様の方法にて行った。検量線作成のためはリコンビナントマウスIFNγ（Catalog No.19051U、Pharmingen（SanDiego、CA））を使用した。
【００２４】
２．結果
IL-4及びIFNγの産生に及ぼすシクロスポリンＡの影響を図１に示す。免疫抑制剤であるシクロスポリンＡは、高濃度ではIL-4、IFNγの両方の産生を抑制し、また低濃度（0.05μM程度）では高濃度と同様、IFNγの産生は抑制する一方、IL-4の産生は増強することが示された。以上のようにシクロスポリンＡは、IFNγの産生を強く抑制する事が示された。
IL-4及びIFNγの産生に及ぼすIPD-1151Tの影響を図２に示す。図２より、IPD-1151TはIL-4、IFNγの産生には影響を及ぼさないことが示された。従ってIPD-1151Tについて報告されているTh2型サイトカイン産生選択的抑制作用は、本試験系では再現されなかった。
IL-4及びIFNγの産生に及ぼす各種LPSの影響を図３（ａ）及び図３（ｂ）に、また各種Lipid A及びLipid A類縁体の影響を図４（ａ）及び図４（ｂ）に示す。図３及び図４より、LPS,detoxified (E.coli.0111:B4)を除く調べた全てのLPS及び調べた全てのLipid A及びLipid A類縁体は、IFNγの産生を抑制することなくIL-4産生を抑制することが示された。一方、Lipid A部分の欠失したLPSであるLPS,detoxified(E.coli.0111:B4)は、他のLPSと異なりIFNγの産生を弱いながらも抑制したことから、Th2型サイトカインを選択的に抑制する活性は、Lipid A部分に起因することが示された。
【００２５】
実施例２
Th1及びTh2クローンの抗原依存的なサイトカイン産生に対するシクロスポリンＡ、IL-12、Lipid Aの作用
次に、Th1クローン及びTh2クローンを用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【００２６】
１．実験方法
１）Th1、Th2 細胞株
Th1（23-1-8）、Th2（24-2）細胞株は東京大学医学部免疫学教室前教授多田富雄先生より分与されたものを使用した。
２）培地
D-MEM培地「ダイゴ」（日本製薬（東京））に56℃、30分にて非働化した牛胎児血清（Code No.A-1115-L、Hyclone Laboratories.（Logan、Utah））を10%、2-メルカプトエタノール（Code No.M-6250、 Sigma（St.Louis、MO））を50μMとなるように添加して使用した。
３）薬剤
シクロスポリンＡ（サンド薬品（東京））はジメチルスルホキサイド（Code No.134-45、ナカライテスク（京都））にて1mMとなるように溶解し、培地で希釈して最終濃度1、0.1、0.01μMとした。
Lipid AであるLipid A S.minnesota R595は、ジメチルスルホキサイドで10mg/mlに溶解し、培地で希釈して最終濃度10、1μg/mlとした。
IL-12（Catalog No.19361V、Pharmingen（SanDiego、CA））は、1% BSAを含むPBS(-)に5μg/mlに溶解後、さらに培地で希釈して最終濃度50、5ng/mlとした。
【００２７】
４）抗CD3、抗CD28抗体による刺激
抗CD3抗体（Catalog No.01081、Pharmingen（San Diego,CA））、抗CD28抗体（Catalog No.01671、Pharmingen（San Diego,CA））をPBS(-)で共に10μg/mlになるように希釈し、96穴培養プレートに吸着させた後リンスした。その後Th1クローン、Th2クローンそれぞれを2×104cells/wellで播種し、上記各薬剤を添加した（0.2ml/well）。培養3日後の上清を回収し、Th2の産生する代表的なサイトカインとしてIL-4を、またTh1の産生する代表的なサイトカインとしてIFNγを、それぞれ測定した。
５）IL-4及びIFNγ量の測定
IL-4及びIFNγ量の測定は、実施例１−６）のELISA法と同じ方法で行った。
【００２８】
２．結果
Th1及びTh2クローンの抗原依存的なサイトカイン産生に対するシクロスポリンＡの作用を図５に、IL-12の作用を図６に、そしてLipid Aの作用を図７に示す。シクロスポリンＡは、Th1 クローンからのIFNγ産生とTh2クローンからのIL-4産生を共に抑制した。IL-12はTh1クローンからのIFNγ産生とTh2クローンからのIL-4産生を共に弱く増強した。これに対しLipid Aは、Th1クローンからのIFNγ産生を抑制しないが、 Th2クローンからのIL-4産生を抑制するという、実施例１と同じ結果が得られた。これらの結果により、Lipid A及びLipid A類縁体のTh2型サイトカイン産生抑制作用は、Lipid Aにおいて従来知られていたIL-12の産生増強作用とは別の、IL-12を介さない新たな経路によるものであることが明らかとなった。このように、Lipid AがTh2からのサイトカインの産生を抑制するという作用は、現在までに知られていなかったことである（中野昌康・小玉正智/編 エンドトキシン 1995 p118-119）。
【００２９】
実施例３
免疫したマウスIgE産生モデルに対するLipid A類縁体の作用
IL-4はIgE抗体産生に必須であり、IFNγはIgG2a抗体産生に必要であることが知られている（Science 236: 944-947(1987)）。そこで、実施例１及び２で得られたLipid A及びLipid A類縁体のin vitroでの選択的作用をin vivoでも確認するために、本実験において該IgE値及びIgG2a値を測定した。
【００３０】
１．実験方法
１）動物
BALB/cマウスは日本チャールスリバー（横浜）より購入し、7週令の雌を使用した。
２）薬剤
Lipid A類縁体であるGLA-60は2％の注射用蒸留水を含むジメチルスルホキサイドにて2.5mg/mlとなるように溶解し、0.5％メチルセルロース（Code No.222-22、ナカライテスク（京都））で希釈して最終濃度0.2mg/mlとした。
３）薬剤の投与
対照群（Vehicle）に0.5％メチルセルロースを、GLA-60投与群に0.2mg/mlのGLA60を、0.2ml/20gマウス体重の用量で、1日1回、5日間腹腔内に投与した（2mg/kg/day）。
【００３１】
４）マウスの免疫
1mg/mlのオボアルブミン（=OVA、Product No.A-5503、Sigma（St.Louis、MO））を1.8％ NaCl（Product No.A-5503、ナカライテスク（京都））で4μg/mlに希釈し、水酸化アルミニウムゲルアジュバントAlu-Gel-S（Code No.12261、Serva Feinchemica GmbH and Co.（D-6900 Heidelberg 1））と1:1の体積比で混和した後、上記薬剤投与の1時間後にマウス腹腔内に500μl/headの用量で注射した。
【００３２】
５）抗原特異的マウス血漿IgE値及びIgG2a値の測定
免疫後13日目にマウス眼窩静脈叢からヘマトクリット毛細管（Catalog No.VC-H075H、テルモ(東京)）採血後、低速遠心により血漿を調製し、以下に示すELISA法にて抗原特異的IgE値及びIgG2a値を定量した。
抗原特異的IgE値の ELISAによる定量は、まずラット抗マウスIgE抗体（Code No.7627、Yamasa Corp.（千葉））をPBS(-)で6μg/ml に希釈し、96穴マイクロプレート（Nunc Immuno plate、Nunc（DK-4000 Roskide、Denmark））に50μl/wellで添加し、4℃で1晩吸着させた。その後プレートをリンスし、3%BSAを含むPBS(-)にてブロッキングした（200μl/well）。ブロッキング後プレートをリンスして、各マウス血漿を20-40倍希釈したサンプルと、検量線作成のために対照群のマウス5匹の血漿プールを10-1280倍希釈したサンプルとを50μl/well添加し、4℃で1晩反応させた。その後プレートをリンスし、0.1%BSAを含むPBS(-)で500倍に希釈したビオチン標識OVAを50μl/wellで添加し、室温で2時間反応させた。ビオチン標識OVAは、OVAをNHS-Biotin（Code No.20217X、Pierce（Rockford , IL））でビオチン標識したものを使用した。結合した2次抗体はVectastain ABC kit（Code No.PK-6100、Vector laboratories,Inc.（Burlingame、CA））により検出した。TMBマイクロウエルペルオキシダーゼキシツシステム（Code No.50-76-00、 Kirkegaard and Perry Lab（Gaitherburg、MD））を100μl/well加えて発色させた後、1Mリン酸水溶液（Code No.276-18、ナカライテスク（京都））を100μl/well加え発色反応を止めて、マイクロプレートリーダー（MTP-120 Microplatereader,Corona Electric）を用いて波長450nmの吸光度を測定した。
抗原特異的IgG2a値の ELISAによる定量は、まず注射用蒸留水で1mg/mlに溶解したOVAをPBS(-)でさらに10μg/mlに希釈し、96穴マイクロプレート（Nunc Immuno plate、Nunc（DK-4000 Roskide、Denmark））に50μl/wellで添加し、4℃1晩で吸着させた。その後、プレートをリンスし、3%BSAを含むPBS(-)にてブロッキングした（200μl/well）。ブロッキングの後プレートをリンスして、マウス血漿サンプルを20、40倍希釈して50μl/well添加し、4℃1晩反応させた。プレートをリンスし、0.1%BSAを含むPBS(-)で2000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG2a抗体(Catalog No.1080-04、Southern Biotechnology Associates,Inc.(160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, AL35209))を50μl/wellで添加し、室温で1時間反応させた。プレートをリンス後、PNPP基質（Code No.250-19、ナライテスク（京都））を加えて発色させた。マイクロプレートリーダー（MTP-120 Microplatereader,Corona Electric）を用いて波長405nmの吸光度を測定した。
６）統計処理方法
F検定で2群間が等分散であることを確認し、Studentt検定で有意差を調べた。
【００３３】
２．結果
抗原特異的IgE産生に対するGLA60の作用の結果を図８に示す。図８中、縦軸は血漿中の抗原特異的IgE相対量を示してある。GLA60投与群は、対照群と比較して抗原特異的IgEを有意に抑制した（危険率5%以下）。抗原特異的IgG2aのELISAにおける発色の結果を図９に示す。GLA60投与群は対照群と比較して、抗原特異的IgG2aのELISAにおける発色が強かった。以上の結果より、Lipid A類縁体であるGLA60は抗原特異的IgEを抑制するが、抗原特異的IgG2aを抑制しないことが示された。これらの結果は、GLA60において得られたin vitroでの結果、すなわちTh2型サイトカイン産生を選択的に抑制するという結果に矛盾しないものであった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、Lipid A又はLipid A類縁体を有効成分として含むTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤が提供される。本発明のTh2型サイトカイン産生選択的抑制剤は、Th2型サイトカインの産生を抑制し、Th1型サイトカインの産生は抑制しないことから、Th2の機能亢進に起因する各種疾患、例えばアレルギー性疾患、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、エイズなどに対する治療薬又は予防薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、リンパ節細胞からのIL-4、IFNγ産生に対するシクロスポリンの作用を示したグラフである。
【図２】図２は、リンパ節細胞からのIL-4、IFNγ産生に対するIPD1151Tの作用を示したグラフである。
【図３】図３(a)は、リンパ節細胞からのIL-4産生に対する各種LPSの作用を示したグラフであり、図３(b)は、リンパ節細胞からのIFNγ産生に対する各種LPSの作用を示したグラフである。
【図４】図４(a)は、リンパ節細胞からのIL-4産生に対するLipid AおよびLipid A類縁体の作用を示したグラフであり、図４(b)は、リンパ節細胞からのIFNγ産生に対するLipid AおよびLipid A類縁体の作用を示したグラフである。
【図５】図５は、Th2クローンからのIL-4産生に対するシクロスポリンの作用及び、Th1クローンからのIFNγ産生に対するシクロスポリンの作用を示したグラフである。
【図６】図６は、Th2クローンからのIL-4産生に対するIL-12の作用及び、Th1クローンからのIFNγ産生に対するIL-12の作用を示したグラフである。
【図７】図７は、Th2クローンからのIL-4産生に対するLipid Aの作用及び、Th1クローンからのIFNγ産生に対するLipid Aの作用を示したグラフである。
【図８】図８は、抗原特異的IgEに対するGLA60のin vivoでの作用を示したグラフである。
【図９】図９は、抗原特異的IgG2aに対するGLA60のin vivoでの作用を示したグラフである。
Claims (4)
- Ｌｉｐｉｄ Ａ又はＬｉｐｉｄ Ａ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌを有効成分として含む、タイプ１ヘルパーＴ細胞（以下Ｔｈ１と略す）型サイトカインの産生を抑制しない、タイプ２ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ２と略す）型サイトカイン産生選択的抑制剤。
- Ｌｉｐｉｄ Ａ又はＬｉｐｉｄ Ａ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌを有効成分として含み、Ｔｈ２の機能亢進に起因する疾患を治療又は予防するものである、請求項１記載のＴｈ２型サイトカイン産生選択的抑制剤。
- Ｌｉｐｉｄ Ａを有効成分として含む、請求項１又は２に記載のＴｈ２型サイトカイン産生選択的抑制剤。
- Ｔｈ２の機能亢進に起因する疾患が、 I 型免疫グロブリン E （ IgE ）依存性過敏症以外のアレルギー性疾患である、請求項２又は３に記載のＴｈ２型サイトカイン産生選択的抑制剤。
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