JP4076385B2 - 新規微生物及びこれを用いたβグルカンの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食物繊維・抗腫瘍剤・免疫増強剤等として有効な多糖体であるβグルカンを得るのに有用な微生物、及びその微生物を用いたβグルカンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
βグルカンは、セルロースに代表されるように、ヒトの消化酵素によって非消化性の多糖体であることから、食物繊維としての働き、即ち、コレステロール低下作用、整腸作用、血糖値上昇を抑制する作用等が期待でき、生活習慣病予防に有用な材料である。βグルカンは、分子中にグルコースのβ結合を主に保持する多糖体と定義されるが、グルコースのβ結合様式、構成する糖の種類、あるいはリン酸基・硫酸基・カルボキシル基のような官能基による構成糖の修飾度合いの相違により、様々な分子種が天然に存在している。このようないわゆるβグルカンの中には、免疫系を刺激し、生体の防御機構を活性化する働きのあるものがある。近年、ある一部のβグルカンをはじめとする免疫系を活性化する免疫修飾物質（ＢＲＭ）を用いたインフルエンザ予防あるいはガン治療・老化防止の研究が注目されており、より効果の高い、一定の効果を持つβグルカンの提供、あるいは、そのようなβグルカン素材のより安価な安定した製造方法が必要となってきた。
【０００３】
免疫系を活性化するβグルカン類としては、植物細胞壁成分（特公昭６２−６６９２号公報、特開２００１−３２３００１号公報）、担子菌（キノコ）の子実体や菌糸体に含有されているもの（K.Sasaki et al., Carbohydrate Res., Vol.47, 99-104(1976)、特開平０５−３４５７２５号公報）、微生物菌体の細胞壁成分や菌体外に分泌生産されるβグルカン等が知られている。
【０００４】
微生物菌体の細胞壁成分は、いずれにおいてもβグルカンを含み免疫活性を増強する作用があることは一般的によく知られているが、特に安全性が高く食品としても利用価値が高いものとしては、酵母菌体（特開昭５４−１３８１１５号公報、特開平０９−１０３２６６号公報）、乳酸菌菌体（特開平０３−２２９７０２号公報、特開平１０−１６７９７２号公報）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）菌体（特公平０６−９２４４１号公報）等が知られている。
【０００５】
また、免疫活性を増強する機能を有するβグルカンを菌体外に分泌生産する微生物としては、特開平０３−２２０２号公報に記載の通り、マクロフォモブシス（Macrophomopsis）属、あるいは、アルカリゲネス属の生産するカードラン（食物繊維の科学、p108、朝倉書店、1997年）、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）（Agaric. Biol. Chem. 47(6), 1167-1172(1983)、特開平６−３４０７０１号公報）が知られている。
【０００６】
担子菌（キノコ）の子実体や菌糸体に含有されているβグルカンは、免疫増強活性が高く、シイタケ子実体より抽出されるレンチナンのように、医薬品として利用されているものもある。しかし、一般的に担子菌（キノコ）の子実体や菌糸体に含有されているβグルカンは、その生育・栽培条件により含まれるβグルカン量が大きく変動し、抽出操作でβグルカンを分離する必要があり、結果として得られるβグルカンが複雑多岐の分子種にわたり、高分子体と低分子体とが混在する等、品質が不安定なものとなっている。
【０００７】
このように担子菌（キノコ）では、高活性を有した一定のβグルカンを安定的に製造することが現時点での課題となっている。一方、微生物菌体の細胞壁は多量のβグルカンを含んでおり、βグルカンの供給源として興味深い。しかし、微生物菌体の細胞壁自体は、βグルカン以外の成分をも含み、また水に不溶性であるため、効果の高い水溶性のβグルカンを得るためには、担子菌と同様に抽出操作が必要であることから、一定の品質のβグルカンを安定的に抽出する方法の確立が課題であるといえる。
【０００８】
これに対し、菌体外に免疫増強活性の高い水溶性βグルカンを分泌生産する微生物を用いたβグルカンの発酵生産は、均一で水溶性の高活性なβグルカンを得ることが可能であり、きわめて有効な方法である。このような考えに基づき、高活性なβグルカンを菌体外に分泌生産することが知られているアウレオバシジウム属の微生物を用いたβグルカンの製造方法が提案されてきた。
【０００９】
しかしながら、アウレオバシジウム属の微生物は、シュークロースのような一般的な微生物培養に用いる炭素源を用いて培養すると、αグルカンであるプルランを菌体外に分泌生産することが知られており（特公昭５１−３６３６０号公報、特公昭５１−４２１９９号公報）、βグルカンを純度よく製造することが困難であった（特開平０６−３４０７０１号公報）。また、アウレオバシジウム属の微生物は、俗名で黒酵母と呼ばれ、菌体によって生産されるメラニン色素により菌体あるいは培養液が黒色に着色し、得られるβグルカンも着色することから、製造されるβグルカンは品質が著しく損なわれたものとなっている。この点を改良するため、変異原処理により着色を認めない突然変異体を取得し、該突然変異体を用いたプルラン等の多糖体の製造方法が提案されている（特公平４−１８８３５号公報）。しかし、メラニン色素を完全に生産せず、効率よく高純度のβグルカンを菌体外に分泌生産する（プルランを菌体外に分泌生産しない）菌株は、未だ知られていない。
【００１０】
また、βグルカン製造過程、即ち培養工程において、不純物として挙げられるプルランの生産を抑制する培養方法が種々検討され、特開平０６−３４０７０１号公報及び特開平０７−５１０８０号公報には、ｐH調整あるいは炭素源として特殊な糖類を用いることで、プルランの生産を押さえ、純度の高いβグルカンを生産できる方法が提案されている。この場合、特殊な培養条件を設定するため操作が煩雑であること、特殊な炭素源を利用するため培養に用いる培地のコストが高くなること等が、βグルカンを製造する上で問題となっている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
以上から、アウレオバシジウム属の微生物を用いてβグルカンを生産するためには、一般的に微生物培養に用いられる安価な糖類を炭素源として培養しても、プルラン等の不純物の生産がないかあるいは抑制されており、且つ、βグルカンの製造過程で実質的にメラニン色素の生産がないかあるい抑制されており、生産されたβグルカンが着色しないような、高活性で高品質のβグルカンを効率よく菌体外に分泌生産する菌株が必要とされている。
【００１２】
従って、本発明の目的は、シュークロース等の安価な糖類から高活性で高品質のβグルカンを効率良く高い生産速度で製造するのに有用な新規な微生物、該微生物を用いたβグルカンの製造方法、及び該微生物が菌体外に分泌生産するβグルカンを提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、シュークロースから、純度の高いβグルカンを効率良く菌体外に分泌生産する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、高品質のβグルカンを高効率で菌体外に分泌生産する新規な微生物を見出した。また、さらなる検討の結果、抗生物質シクロヘキシミドに耐性を有するアウレオバシジウム属に属する菌株が、純度の高いβグルカンを効率良く菌体外に分泌生産することを見出した。
【００１４】
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１７３２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含み、さらに抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有し、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有するアウレオバシジウム プルランス（ Aureobasidium pulullans ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株である微生物を提供するものである。
また、本発明は、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５６３塩基の配列が、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有するアウレオバシジウム プルランス（ Aureobasidium pulullans ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株であり、好ましくはさらに抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有する微生物を提供するものである。
また、本発明は、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有する上記微生物を提供するものである。
また、本発明は、上記微生物を培養（好ましくは炭素源として糖類を含有する培養液にて培養）し、βグルカンを菌体外に分泌生産させることを特徴とするβグルカンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、アウレオバシジウム プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｕｌｌａｎｓ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株を培養することによって菌体外に分泌生産され、培養液を適当に希釈し、菌体を遠心分離（１００００ｘｇ、１０ｍｉｎ．）にて除去した培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が、同様に培養して得たＩＦＯ−６３５３株の培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が０．１以上を示す条件において、０．０９９以下であり、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンを提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１７３２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含み、さらにストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）等によって生産される抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有し、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有する微生物、及び、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５６３塩基の配列が、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有し、好ましくはさらにストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）等によって生産される抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有する微生物である。
【００１７】
本発明者等は、実施例に詳細を示すように、環境中から本発明の微生物を分離した。分離した微生物の中には、アウレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物が認められた。中でも、純度が高く、非着色性のβグルカンを効率良く菌体外に分泌生産することができる１菌株をＡＤＫ−３４菌株と命名した。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Aureobasidium pullulans ＡＤＫ−３４」、受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２」として寄託されている。
【００１８】
また、薬剤耐性については、その菌株のコンディション、培地の種類、培養期間によって耐性を示す濃度が異なる場合があることから、本発明において「シクロヘキシミドに対する抵抗性を有する」とは、ＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株を基準として、これらの菌株に比較して、シクロヘキシミドに対する抵抗性を有することをいう。即ち、シクロヘキシミドを含有する固形培地（寒天プレート）に菌株を接種し、２６℃にて１０日間培養したとき、これらのＩＦＯ菌株の生育が認められないようなシクロヘキシミド濃度を有する固形培地にて、直径０．１ｍｍ以上、好ましくは０．３ｍｍ以上、さらに好ましくは０．５ｍｍ以上の菌体増殖によるコロニー形成が観察される場合をいう。通常、これらのＩＦＯ菌株は、固形培地中のシクロヘキシミド濃度が２０μｇ／ｍｌ以上であると生育が認められない。
【００１９】
また、本発明において、非着色性あるいは着色が抑制された、菌株あるいは培養液又はβグルカンとは、培養液を適当に希釈し、菌体を遠心分離（１００００ｘｇ、１０ｍｉｎ．）にて除去した培養希釈液の吸光度を４９０ｎｍで測定し、同様に培養して得たＩＦＯ−６３５３株の培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が０．１以上を示す条件において、本発明の微生物の菌株の場合、０．０９９以下、好ましくは０．０６０以下、さらに好ましくは０．０５０以下の場合をいう。
また、本発明において、高純度とは、後記の分析例３に示す生成多糖のプルランに対する純度測定において、プルラナーゼ酵素処理を行った際、酵素処理後のフェノール硫酸値の酵素処理前のフェノール硫酸値に対する比が７５％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上であることをいう。
【００２０】
本発明の微生物は、βグルカンを高純度に高効率に菌体外に生産させるのに有用である。本発明の微生物が生産する該βグルカンは、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンであることが好ましい。
【００２１】
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法の好ましい実施形態について、以下に説明する。
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法においては、本発明の微生物の菌株を該微生物が生育可能である培地に作用させ、菌体外の培地中にβグルカンを生産させればよい。また、本発明の微生物の菌株を培養して得られた培養菌体を分離し、該培養菌体をβグルカンの基質である糖類を含んだ溶液あるいは培地に作用させて、菌体外にβグルカンを生産させてもよい。ただし、菌体外への分泌が準備された分泌型のβグルカンを菌体内に内包している場合もあるので、このように菌体内に分泌のため準備蓄積されているβグルカンも、本発明においては菌体外に分泌されるβグルカンとする。
【００２２】
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法において、本発明の微生物の菌株を培養する培地としては、アウレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物が通常利用できる栄養源（炭素源、窒素源、無機塩類）を含有し、さらに必要に応じて有機栄養原を含む通常の培地を用いることができるが、炭素源として糖類を含有する培養液が好ましい。これらの培地としては、各種の合成培地、半合成培地、天然培地等いずれも利用可能である。
【００２３】
上記炭素源としては、糖類が好ましく、該糖類としては、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等の単糖類、シュークロース、マルトース、ラクトース、トレハロース等の２糖類、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖等のオリゴ糖類、デキストリンやデンプン等の多糖類が挙げられ、これらを単独又は組合せて用いることができる。これらの中でも、主炭素源として、グルコース、フラクトース等の６炭糖、シュークロース、ラクトース等の２糖類、デンプンやデキストリン、あるいはこれら炭水化物の加水分解物等の多糖類を用いるのが好ましい。また、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類をはじめとする果実搾汁、あるいはこれらの搾汁に糖を添加したもの等を用いることもできる。この他、グリセロール、エチレングリコール等のアルコール類、マンニトール、ソルビトール、エリスリット等の糖アルコール類、有機酸等のその他の炭素源を適宜使用することができる。これらの炭素源は、培養途中で随時添加してもよく、例えば、シュークロース等の糖類を培地中へ好ましくは３〜５００ｇ／ｌ、さらに好ましくは５〜３００ｇ／ｌ、最も好ましくは１０〜２００ｇ／ｌの濃度範囲となるように適宜フィードすると、βグルカンの生産速度・生成量を相対的に増大させることができる。
【００２４】
上記窒素源としては、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、麦芽エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、アンモニアガス、アンモニア水等の無機窒素源を単独又は組合せて用いることができる。
【００２５】
上記無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩等を使用することができ、必要に応じてビタミン類も添加使用することができる。なお、培養中に発泡が生じる場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。
【００２６】
本発明の微生物の菌株の培養条件には、格別の制限はなく、該菌株が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ５．０〜８．５、２０℃〜３５℃で２〜８日間程度培養するとよいが、これらの培養条件は、使用微生物菌株の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できる。また、培地への菌株の接種量は、フラスコ培養の場合は１白金耳、スケールアップの場合は種培養液を本培養液の１〜１０％（ｖ／ｖ）添加することが好ましいが、実質的に培養可能であればこの限りではない。
【００２７】
本発明の微生物の菌株の培養は、通気撹拌、振とう等による好気的条件下で行う。培養時間は、目的とするβグルカンの生成濃度に達するまで行われるのが好ましく、通常２〜５日間で行われる。また、連続的にβグルカンの基質である糖類や培地成分を連続添加し、βグルカンを連続的に生産してもよい。βグルカンの基質であるシュークロース等の糖類は、粉末のままか、あるいは高濃度に水に溶解させた液糖として培養液に添加することができ、その添加量は、培養液１ｌ当り０．１〜５００ｇが好ましい。添加量を５００ｇ／ｌより多くすると、生産速度が著しく遅くなり好ましくない。基質添加後は、好ましくは２５〜３５℃で１〜７日間、特に約２〜５日間、振とうあるいは通気攪拌等の操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより、基質であるシュークロース等の糖類からβグルカンを製造することができる。
【００２８】
また、本発明の微生物の菌株を培養することによって得られた培養菌体を分離して、該培養菌体あるいは該培養菌体の抽出液を触媒としてβグルカンを製造することもできる。この場合は、培養菌体、培養菌体調製物又は培養菌体処理物の懸濁液に、基質である糖類溶液あるいは培地を添加すればよい。上記培養菌体調製物としては、該培養菌体を例えばホモジナイズした細胞破砕液等が挙げられ、また、上記培養菌体処理物としては、培養菌体あるいは細胞破砕液をアルギン酸ゲル中、イオン交換樹脂、セラミック、キトサン等に固定化した固定化菌体等が挙げられる。これらの培養菌体、培養菌体調製物又は培養菌体処理物の懸濁液の調製に使用できる溶液としては、前記した培地、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等の緩衝液を単独又は混合したものが挙げられる。該緩衝液のｐＨは、好ましくは３．５〜９．０、さらに好ましくは５．０〜８．０、最も好ましくは５．２〜７．８である。前記懸濁液中の培養菌体の量は、特に限定されるものではないが、好ましくは湿容量比で０．１〜１０％程度がよい。
【００２９】
前記懸濁液への基質である糖類や培地の添加は、いかなる濃度、いかなる容量でも実施できるが、１回当りの基質の添加量は、菌体の活性を維持できる範囲が好ましい。例えば、懸濁液１ｌ当り０．１〜５００ｇを１回又は数回に分けて添加してもよいし、０．５〜５００ｇ／ｄａｙ程度で連続的に添加してもよい。菌体と基質とを作用させた溶液を、任意の時間と温度でインキュベーションすることにより、βグルカンを生産させることができるが、該インキュベーションは、前述した本発明の微生物の菌株の培養と同様の条件で実施することが好ましい。
【００３０】
前記の如く培養した後、菌体外に分泌生産されたβグルカンは、常法に従って、培養液より分離、採取される。具体的には、培養液から遠心分離、濾過等により菌体等の固形物を分離除去したり、活性炭、イオン交換樹脂等により不純物や塩類を除去する等、種々の既知の精製手段を選択、組合せて行うことができる。さらに、例えば、疎水性樹脂への吸着・溶出、エタノール、メタノール、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒沈降、シリカゲル等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組合せ、場合により反復使用することにより、分離精製することができる。
【００３１】
また、菌体外に分泌生産されたβグルカンを上記の方法で分離する前後において、菌体の殺菌を実施してもよい。殺菌温度は、菌体が死滅する温度であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは６０℃、最も好ましくは８０℃以上である。また、さらに温度を上げて、例えば、９０℃以上、あるいは加圧下１２１℃にて、菌体内に準備されている分泌型のβグルカンを熱水抽出することができる。殺菌時間及び熱水抽出時間は、任意の時間を設定できるが、好ましくは１０分以上８時間以下、さらに好ましくは１５分以上６時間以下、最も好ましくは３０分以上２時間以下とすると、不純物の混入が抑えられ、βグルカンが劣化しないので好適である。
【００３３】
また、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pulullans）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株を用いてβグルカンを製造すると、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンを得ることができる。
【００３４】
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法は、これまでに知られているアウレオバシジウム プルランスの菌株、あるいはアウレオバシジウム属に属する微生物を用いた培養に比較すると、プルランの生産が著しく抑制されていることから、培養物からのβグルカンの分離が容易であり、また高純度のβグルカンを得るための精製操作が簡略化できるという利点がある。さらに、アウレオバシジウム属に属する微生物、酵母、乳酸菌等の菌体の細胞壁や担子菌類や植物からの抽出βグルカンに比較して不純物が少なく、単離・精製操作が簡略化できると同時に、βグルカンの着色が著しく抑制されていることから、高品質で一定の品質を保持したβグルカンを安定的に得ることが容易である。
【００３５】
本発明で得られるβグルカンは、着色がなく、高品質であり、そのまま、あるいは他の製品に添加することで、種々の用途に使用できる。
本発明で得られるβグルカンの用途としては、食品、食品添加剤、化粧品、トイレタリー製品、化成品、医薬品等が挙げられる。
【００３６】
食品の具体例を以下に挙げる。
油脂食品としては、マーガリン、ショートニング、マヨネーズ、クリーム、サラダオイル、揚油、ホイップクリーム、起泡性乳化脂、ドレッシング、ファットスプレッド、カスタードクリーム、ディップクリーム等が挙げられる。本発明で得られたβグルカンは、油脂との相溶性に優れており、油脂に添加して、βグルカンを含有する油脂組成物としてから、他の原料とともに用いることが好ましい。
【００３７】
さらに穀類関連製品としては、小麦粉を主成分とした食品、米類を主成分とした食品、米加工品、小麦加工品、トウモロコシ加工品、大豆加工品等が挙げられ、例えば、食パン、菓子パン、パイ・デニッシュ等のベーカリー製品、ホットケーキ、ドーナッツ、ピザ、天ぷら等、更にそれらのプレミックス、ビスケット、クッキー、スナック等の菓子類、生麺、乾麺、即席麺、カップ麺、うどん、蕎麦、中華麺、ビーフン、パスタ類等の麺類、炊飯米、餅、無菌米飯、レトルト炊飯米、上新粉、餅粉、団子、せんべい、あられ等の米製品が挙げられる。
【００３８】
さらに菓子類としては、チョコレート、キャンディー・ドロップ、飴、チューインガム、焼き菓子、ケーキ、饅頭等の洋菓子又は和菓子等が挙げられる。
さらに畜肉加工品としては、ハム・ソーセージ、ハンバーグ等が挙げられ、水産加工品としては、ちくわ、かまぼこ、さつま揚げ、魚肉ソーセージ等が挙げられる。
さらに乳製品としては、バター、チーズ、アイスクリーム、ヨーグルト等が挙げられる。
【００３９】
さらに飲料としては、ビール、酒、日本酒、ウイスキー、ブランデー、洋酒、焼酎、蒸留酒、発泡酒、ワイン、果実酒等のアルコール飲料、コーヒー、紅茶、日本茶、ウーロン茶、中国茶、ココア、炭酸飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク、コーヒードリンク、炭酸飲料、乳酸菌飲料、果汁・果実飲料等の飲料が挙げられる。
さらに調味料、ソース類としては、スパイス、タレ、焼肉のタレ、ドレッシング、ソース、味噌、醤油、カレー、ハヤシ等のルーが挙げられる。またスープとしては、コーンスープ、ポテトスープ、パンプキンスープ等のスープが挙げられる。その他、ジャム、ピーナッツバター、ふりかけ等が挙げられる。
【００４０】
さらに長期保存食品としては、水産物、畜肉、果実、野菜、キノコ、コーンビーフ、ジャム、トマト等の缶詰又は瓶詰め、冷凍食品等が挙げられ、また、カレー、シチュー、ミートソース、マーボ豆腐、食肉野菜混合煮、スープ、米飯等のレトルト食品が挙げられる。また、粉末食品としては、飲料、スープ、味噌汁等の粉末インスタント食品等が挙げられる。
さらに、健康食品、薬用食品、離乳食等の育児用食品、流動食等の病人食、老人食、ダイエット食、サプリメント等が挙げられる。
さらに、電子レンジ加熱食品、電子レンジ調理食品等が挙げられる。
【００４１】
食品添加剤としては、乳化剤、増粘剤、増粘安定剤、品質改良剤、酸化防止剤、安定剤、保存料、香料、甘味料、着色料、漂白剤、酸味料、ガムベース、調味料、苦味料、栄養強化剤、香辛料、製造用剤等が挙げられる。
【００４２】
化粧品、トイレタリー製品としては、皮膚化粧品、頭髪用化粧品、薬用化粧品、口腔用剤等が挙げられ、具体的には、化粧水、乳液、スキンミルク、クリーム、軟膏、ローション、カラミンローション、サンスクリーン剤、サンタン剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、化粧下地料、パック料、クレンジング料、洗顔料、アクネ対策化粧料、エッセンス等の基礎化粧料；ファンデーション、白粉、アイシャドウ、アイライナー、アイブロー、チーク、口紅、ネイルカラー等のメイクアップ化粧料；シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアカラー、ヘアトニック、セット剤、整髪料、育毛料、養毛剤、ボディパウダー、デオドラント、脱毛剤、石鹸、ボディシャンプー、ハンドソープ、香水、歯磨き、口腔ケア製品、入浴剤等が挙げられる。
【００４３】
化成品としては、界面活性剤、乳化剤、増粘剤、粘度調整剤等が挙げられる。
医薬品としては、コレステロール低下作用、整腸作用、血糖値上昇を抑制する作用などを有し、生活習慣病を予防する医薬品、免疫増強作用を有する医薬品等が挙げられる。
【００４４】
【実施例】
実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。試験例１〜２においては、本発明の微生物の菌株のスクリーニング方法を示し、試験例３〜７においては、ＡＤＫ−３４菌株の菌学的性質を示す。また、実施例１〜３は、ＡＤＫ−３４菌株を用いた本発明のβグルカンの製造方法の実施例を示す。
【００４５】
〔試験例１〕菌株のスクリーニング方法１
日本において伝統的な保存食を中心に、通常、加熱調理せず摂取する市販の食品の表面に付着・生育している微生物を広く分離し、βグルカンを生産する菌株をスクリーニングした。スクリーニング方法を以下に詳述する。
先ず、対象サンプルである食品を滅菌シャーレに入れ、これに滅菌したＰＢＳ１０ｍｌを加え、滅菌済みスポイトを用いてサンプル表面をＰＢＳで繰り返し洗浄し、サンプルの表面を洗浄した洗浄液を得た。得られた洗浄液を滅菌したＰＢＳで１０〜１００倍希釈し、この２００μｌをプレートに添加し、コンラージ棒で広げ、２週間、室温で培養した。プレートは、ＹＭ培地（ディフコ社製）に、クロラムフェニコールを１００μｇ／ｍｌ、寒天を１．５重量％となるようにそれぞれ添加した培地を２０ｍｌ入れ、固化させたものを用いた。生育したコロニー約２万のうち、生育初期に乳白色で、次第にコロニー全体に光沢を生じ湿潤したコロニーを形成したもの、コロニー全体に光沢を生じ、中心部がわずかに黄色・褐色、あるいは黄色・褐色の輪郭を生じ、湿潤したコロニーを形成したもの、全体が乳白色〜ピンク色を呈するコロニーを形成したもの、次第に緑黒色となり毛羽立った特徴を有するコロニーが形成されたもの、以上の４形質を示すコロニーから釣菌した。なお、コロニー全体がピンク色となるが、上部に盛り上がり外周部への拡がりが認められない、光沢のないコロニーは除外した。釣菌した菌株は、単菌分離操作を実施し、再度７日間培養した後、顕微鏡観察によって出芽型分生子が観察されるもの、及び酵母様生育が認められるものを残し、分生子枝が観察されたものについては除外し、第１スクリーニング結果とした。
次に、第１スクリーニングにより得られた菌株を液体培養した。即ち、ＹＭ培地に５重量％となるようにシュークロースを添加した培地を調製し、２４穴マイクロプレートを用いて、２６℃、４日間の培養を行い、培養液を得た。生育した菌株が培養液全体に均一に分散し、かつ粘性を呈する培養液を与える菌株を残し、第２スクリーニング結果とした。
次に、第２スクリーニング結果により得られた菌株を単菌分離し、ＹＭ液体培地に植菌し、２６℃にて９６時間培養を実施した。得られた培養液に等量の蒸留水を加え、１２１℃にて２０分間の滅菌後、培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ）して培養上清を得た。培養上清３０μｌに２倍量のエタノールを加え、遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）にて沈殿を得て、１００μｌの蒸留水を加え、全多糖量をフェノール硫酸法にて測定し、培地について同様の操作をして得られた値より高値となったものを陽性と判定した。陽性のものを第３スクリーニング結果とした。
対象サンプルから分離・培養して生育した約２万コロニーから、第１スクリーニングにて１８０菌株、第２スクリーニングにて５０菌株、第３スクリーニングにて１４菌株を得た。第３スクリーニングで得られた菌株並びに（財）大阪発酵研究所から得た３菌株、即ちＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株について、培養上清中のβグルカン量を下記分析例１に示す測定方法により測定するとともに、下記分析例３に示す測定方法により培養液中の生成多糖のプルランに対する純度を測定した。その結果を表１に示す。ＡＤＫ−３４菌株が生成する多糖は、プルラナーゼによって消化されず、その多糖量はβグルカン定量値にほぼ一致するものであり、βグルカンが純度良く生成されていると結論された。
【００４６】
【表１】
【００４７】
〔試験例２〕菌株のスクリーニング方法２
抗生物質シクロヘキシミドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した培地を用いたこと以外は、試験例１と同様にして、菌株のスクリーニングを実施した。その結果、対象サンプルから分離・培養して生育した４０００コロニーから、第１スクリーニングにて３０菌株、第２スクリーニングにて１０菌株、第３スクリーニングにて３菌株（ＡＤＫ−７１菌株、ＡＤＫ−７７菌株、ＡＤＫ−８２菌株）が得られた。第３スクリーニングで得られた菌株について、試験例１と同様にして、βグルカン量及び生成多糖のプルランに対する純度を測定した。その結果を表２に示す。
また、第３スクリーニングの結果得られた３菌株について形態学的な観察から菌株同定をそれぞれ試みた。ＹＭ寒天培地に植菌後、２６℃、７日間培養したところ、３菌株のコロニーはいずれも、全体に光沢を生じ、中心部が黄色の輪郭を生じ、湿潤したコロニーを形成した。これらのプレートを４℃に移管して７日間保存することで、中心部の黄色は黒緑色へ変化した。ＡＤＫ−７１菌株及びＡＤＫ−７７菌株それぞれのコロニー全体は変化せず、白色〜ピンク色であった。ＡＤＫ−８２菌株はコロニー全体が黒色化した。また、これらの３菌株それぞれをＹＭ液体培地で２６℃にて３日間培養した菌体の顕微鏡観察では、３菌株いずれにおいても出芽型の分生子が認められ、酵母様の生育であった。また、これらの３菌株それぞれをＹＭ寒天培地で２６℃にて７日間培養したコロニーの菌体は、３菌株いずれにおいても、分生子がつながった鎖状に生育した菌体が観察されたが、分生子枝は認められなかった。以上から、３菌株はアウレオバシジウム プルランスと判定した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
〔試験例３〕形態的・培養的性質
試験例１で得られた菌株の中で、ＡＤＫ−３４菌株について、ＹＭ培地（１重量％グルコース、０．５重量％ペプトン、０．３重量％酵母エキス、０．３重量％マルトエキストラクト、ｐＨ６．０）で２６℃、３日間培養した後、顕微鏡で観察した所見を示すと、細胞の大きさは短径２〜２．５μｍ、長径５〜１０μｍ、形状は卵形、表面は平滑で無色、運動性はなかった。また、菌糸はごくわずかで、幅は２．５μｍであった。不均一で表面は平滑無色であった。酵母様の出芽分生子が形成された。
【００５０】
〔試験例４〕寒天平板培養
試験例１で得られた菌株の中で、ＡＤＫ−３４菌株について、ポテトデキストロース寒天培地（栄研）で２６℃にて７日間培養した。その時の所見を以下に示す。３日間の培養で、生育は良好であり、形態は円形で、全縁がギザギザで、コロニー全体に光沢があり、表面の状態は平滑、色調は白色であった。また、Ｃｏｌｏｎｙ（コロニー）は、５日間の培養で表面が平滑で淡灰白色となり、酵母様に発育し、７日間の培養でＣｏｌｏｎｙ表面はピンク色となった。２６℃にて７日間培養したプレートを、４℃にて７日間冷蔵したところ、若干ピンク色が濃くなったが、コロニー全体に変化はなかった。
【００５１】
〔試験例５〕液体培養
試験例１で得られた菌株の中で、ＡＤＫ−３４菌株について、ＹＭ培地で培養した。その時の最適生育温度及び最適生育ｐＨを示すと、最適生育温度は２６℃であり、最適生育ｐＨは５．０〜７．０であり、生育開始時のｐＨは６．２で、培養終了後のｐＨは７．５であった。好ましい発育温度は２０〜３０℃で、最適温度は２６℃、発育可能温度は５〜４０℃であった。グルコース、フラクトース、マンノース等のヘキソース、スクロース等の二糖類並びにデンプンを分解し、いずれの炭素源でも、培養液は、粘稠になり、特有の芳香を有した。
【００５２】
試験例３〜５の結果、本発明の微生物のうち、ＡＤＫ−３４菌株は菌学的特徴からアウレオバシジウム属の菌株と同定された。
【００５３】
〔試験例６〕シクロヘキシミド耐性試験
試験例１及び２のスクリーニングで得られた菌株、並びに（財）大阪発酵研究所に保存されている、ＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株、及びＩＦＯ−７７５７株について、各菌株のシクロヘキシミド耐性試験を実施した。即ち、各菌株をＹＭ寒天培地（ディフコ社製）にて２６℃で５日間生育させた。ＹＭ寒天培地（ディフコ社製）にシクロヘキシミドを５，１０，２０，４０，８０μｇ／ｍｌの濃度となるように添加した培地をそれぞれ調製し、上記の生育させておいた菌株を滅菌した楊子でこれらのシクロヘキシミド含有培地に植菌し、２６℃にて１０日間の培養後、生育したコロニーの有無を観察し、生育した場合はコロニーの直径を測定した。その結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】
表１及び表３から明らかなように、ＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株、及びＩＦＯ−７７５７株は、シクロヘキシミドに耐性を持たず、生産されるβグルカンのプルランに対する純度は低いものであった。一方、表１〜３から明らかなように、食品からの分離菌株の中で、シクロヘキシミドに耐性を有する菌株（ＡＤＫ−３４菌株、ＡＤＫ−７１菌株、ＡＤＫ−７７菌株、ＡＤＫ−８２菌株）は、βグルカンをプルランに対して純度よく生産し、シクロヘキシミドに耐性のない菌株の多くは、生産されたβグルカンのプルランに対する純度が低い結果となった。
【００５６】
〔試験例７〕１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子解析
スクリーニングの結果得られたＡＤＫ−３４菌株について、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１７３２ｂｐの塩基配列を以下のようにして決定した。ＡＤＫ−３４菌株をポテトデキストロース培地（ディフコ社）にて振とう培養し、遠心分離、蒸留水による洗浄を３回行い、ＤＮＡ抽出用菌体を得た。この菌体からFastPrepFP120（Qbiogene）とFastDNA-kit（Qbiogene）を用いて細胞破砕し、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）によりゲノムDNA分離を行った。このゲノムＤＮＡを鋳型として、Ready-To-Go PCR Beads（Amersharm-Pharmasia Biotech）とプライマーＮＳ１及びＮＳ８を用いてＰＣＲ増幅を行った。
プライマーＮＳ１とＮＳ８の塩基配列は、NS1： (5'->3') GTAGTCATATGCTTGTCTC、NS8：(5'->3') TCCGCAGGTTCACCTACGGAを用いた。サーマルサイクラーはgeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems)を用いた。反応終了後、ＰＣＲ産物をQIAquickPCR purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。このＤＮＡフラグメントを直接シーケンシング反応に供し、塩基配列解析はABI Prism377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) を用いて実施した。類似の塩基配列はＤＮＡデータベース（DDBJ, DNA Data Bank of Japan）からＢＬＡＳＴを利用して検索した。
その結果を配列表の配列番号１に示す。また、得られた塩基配列に基づいてデータベース検索を行い、同菌株と類縁菌との相同性を調べた結果を表４〜６に示す。決定された塩基配列（配列番号１）、相同性検索結果（表４〜６)より、ＡＤＫ−３４菌株はアウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）との相同性が１００％であり、完全に一致した。この結果から、本菌株はアウレオバシジウム プルランスであると判定された。
【００５７】
【表４】
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
【００６０】
〔試験例８〕ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
スクリーニングにより得られたＡＤＫ−３４菌株並びにＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株について、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５６３塩基配列あるいは５６４塩基配列を決定した。各菌株をポテトデキストロース培地（ディフコ社）にて振とう培養し、遠心分離、蒸留水による洗浄を３回行い、ＤＮＡ抽出用菌体を得た。この菌体からFastPrepFP120（Qbiogene）とFastDNA-kit（Qbiogene）を用いて細胞破砕し、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）によりゲノムＤＮＡ分離を行った。このゲノムＤＮＡを鋳型として、Ready-To-Go PCR Beads（Amersharm-Pharmasia Biotech）とプライマーＩＴＳ５およびＩＴＳ４を用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマーＩＴＳ４とＩＴＳ５の塩基配列は、ITS4： (5'->3') TCCTCCGCTTATTGATATGC、ITS5：(5'->3') GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG である。サーマルサイクラーはgeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems)を用いた。反応終了後、ＰＣＲ産物をQIAquickPCR purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。このＤＮＡフラグメントを直接シーケンシング反応に供し、塩基配列解析はABI Prism377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) を用いて実施した。類似の塩基配列はＤＮＡデータベース（DDBJ, DNA Data Bank of Japan）からＢＬＡＳＴを利用して検索した。
ＡＤＫ−３４菌株の結果を配列表の配列番号２に、ＩＦＯ−６３５３株の結果を配列番号３に、ＩＦＯ−７７５７株の結果を配列番号４にそれぞれ示す。また、得られた塩基配列に基づいてデ−タベース検索を行い、同菌株と類縁菌との相同性を調べた結果を表７及び８に示す。決定された塩基配列を比較したところ、ＡＤＫ−３４菌株とＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株とは異なり、完全一致しなかった。ＡＤＫ−３４菌株とＩＦＯ−６３５３株との相同性は９８％、ＡＤＫ−３４菌株とＩＦＯ−７７５７株との相同性は９８％であった。また、相同性検索結果（表７及び８）より、ＡＤＫ−３４菌株のＩＴＳ−５．８Ｓ領域の５６３塩基対が完全一致する菌株は、報告されていなかった。ＩＦＯ−６３５３株は、報告されているアウレオバシジウム プルランス菌株である登録番号「ＡＪ２７６０６２」と１００％（表９）、即ち完全一致し、ＩＦＯ−７７５７株は報告されているアウレオバシジウム プルランス菌株である登録番号「ＡＪ２７６０６２」と９９％で一致した（表１０）。ＡＤＫ−３４菌株は登録番号「ＡＪ２７６０６２」と９８％の一致率であった。
以上から、ＡＤＫ−３４菌株は、これまでに報告されているアウレオバシジウム プルランス菌株とはＩＴＳ−５．８Ｓ領域の塩基配列の一部が異なり、新菌株であると判定された。
【００６１】
【表７】
【００６２】
【表８】
【００６３】
【表９】
【００６４】
【表１０】
【００６５】
〔分析例１〕βグルカンの確認方法とβグルカン量の測定方法
多糖中のβグルカンの分析は、アルコールによって沈殿する全多糖量をフェノール硫酸法にて測定し、引き続き、沈殿させた多糖中のβグルカンの確認・定量を生化学工業（株）のβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を含むβグルカンの検出・測定用キットを用いて行った。以下にその手順を説明する。
先ず、測定サンプル中の全多糖量をフェノール硫酸法にて測定した。即ち、サンプル溶液３０μｌに蒸留水３０μｌを加え、ここに３００ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）を１２０μｌ加え、さらにエタノール５４０μｌ（３倍量）を添加し、−１５℃に１０分間放置して多糖を沈殿させた。上清を除去後、１００μｌの蒸留水を添加して沈殿を溶解させた。ここに５重量％フェノール水溶液１００μｌ及び硫酸５００μｌを加えて反応させた後、該溶液の４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、サンプルを加えず蒸留水１００μｌに５重量％フェノール水溶液１００μｌ及び硫酸５００μｌを加えたものをブランクとして、該ブランクの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。プルランの１０ｍｇ／ｍｌから２倍希釈系列を作成して標準サンプルとし、該標準サンプルを使用して検量線を作成し、該検量線と上記吸光度とから、サンプル中の全多糖量の定量を実施した。
次に、全多糖量が０．１〜１ｍｇ／ｍｌ前後の溶液を、先ず１．０ＭのＮａＯＨにて１０倍希釈し、引き続きβグルカンフリーの蒸留水にて希釈し、１０10倍まで希釈し、βグルカン希釈液を調製した。βグルカン希釈液５０μｌをチューブにとり、主反応試薬５０μｌを添加して、３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて、亜硝酸ナトリウム溶液５０μｌ、スルファミン酸アンモニウム５０μｌ、及びＮメチル２ピロリドン溶液５０μｌを加え、反応させた後、溶液の５４５ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）における吸光度を測定した。また、添付のβグルカン標準品を用いて７．５〜６０ｐｇ／ｍｌのβグルカン溶液を調製し、検量線を得た。該検量線と上記吸光度とから、各βグルカン希釈液の濃度を算出し、サンプル中のβグルカン量を求めた。
【００６６】
〔分析例２〕βグルカンの分子量測定方法
βグルカンの分子量測定は、以下の通りとした。先ず、培養上清に３倍量のアルコールを加え、−２０℃に冷却して１０分間放置し、沈殿を得た。沈殿させたβグルカンを５ｍｇチューブに取り、１ｍｌの蒸留水を加えて、沸騰水中で溶解させた。該溶液を０．２２μｍのフィルターに通してＨＰＬＣ用サンプルとした。分離にはＨＰＬＣゲル濾過カラムであるＳｈｏｄｅｘのパックドカラムＫＳ−８０５（昭和電工社製）を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、温度５０℃とし、検出にはＲＩ検出器を用い、水を分離溶媒として用いて実施した。分子量マーカーとしてはＳｈｏｄｅｘプルラン標準液Ｐ−８２（昭和電工社製）を用いて測定した。
【００６７】
〔分析例３〕培養液中に存在する多糖のプルランに対する純度の測定方法
プルランを特異的に分解する酵素であるプルラナーゼ（和光純薬工業社製）を用いて、培養液中に生産された多糖のプルランに対する純度を測定した。即ち、プルラナーゼによる酵素消化反応の前後で多糖量を測定し、酵素処理後の多糖量（プルラナーゼにより消化されない多糖量）と酵素処理前の多糖量とから生成多糖のプルランに対する純度を算出した。以下に多糖量の測定方法を詳述する。
先ず、プルラナーゼ酵素希釈液５０μＬにクエン酸Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸−２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０））２ｍＬを加えたものを酵素溶液とした。ポジティブコントロールとして、プルラン（東京化成工業社製）を１０ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液を標準サンプル溶液として用いた。培養液あるいは標準サンプルを３０μＬずつ、２本のサンプルチューブ（１．５ｍｌ容量）に量り取り、一方に酵素溶液３０μＬを加え、一方にＰＢＳ３０μＬを加え、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、各サンプルに、３倍量のエタノールを加えた。良く攪拌し、−１５℃にて１０分間インキュベートした後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を捨て、チューブを乾燥させ沈殿を得た。沈殿に蒸留水１００μＬを加え、撹拌し、５重量％フェノール水溶液１００μＬを加え、速やかに硫酸５００μＬを加え発色させた。冷却後、９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ分注し、蒸留水に５重量％フェノール水溶液及び硫酸を添加した場合をブランクとして、４９０ｎｍの吸光度を測定した。また、プルランを１０ｍｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌに希釈した溶液で検量線を作成した。該検量線と上記吸光度とから、酵素消化反応前後の培養液中の多糖量をそれぞれ定量し、培養液中に存在する多糖のプルランに対する純度を算出した。なお、標準サンプルであるプルラン溶液を酵素消化した場合、１０ｍｇ／ｍｌ溶液では９０％以上の消化率が、１ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液では９５％以上、０．１ｍｇ／ｍｌ以下では９８％以上の消化率が得られた。以上のように、プルランが生成している場合は、プルラナーゼの作用により、酵素処理後のフェノール硫酸値（吸光値）は低値となり、例えば吸光値が５０％減少している場合は、多糖のプルランに対する純度は５０％と算出した。
【００６８】
〔実施例１〕
３０ｍｌ容量の試験管にＹＭ培地（ディフコ社）５．５ｍｌを入れ、滅菌後（１２１℃、２０分間）、冷却してから、ＹＰＤ寒天培地（ディフコ社）のスラントにて保存してあるＡＤＫ−３４菌株を一白金耳、植菌し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で４日間培養し、種培養液を得た。別の試験管にクザペック培地（ディフコ社、シュークロース濃度３重量％）５．５ｍｌを入れ滅菌後、ＡＤＫ−３４菌株の種培養液５００μｌを添加（５％植菌）し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で４日間培養した。培養液は白色で顕著な粘性を有していた。培養後、培養液に等量の蒸留水を加え、１５分間、高圧蒸気殺菌してから、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離して多糖を含有する培養上清を得た。培養上清中のβグルカン量及び多糖のプルランに対する純度を分析例１及び分析例３の測定方法によりそれぞれ測定した。その結果、多糖のプルランに対する純度は１００％であり、βグルカン量から算出したβグルカンの対糖収率は４４％であった。なお、培養上清の４９０ｎｍによる吸光値は０．０３０であり、着色が抑制されていた。また、分析例２の測定方法によりβグルカンの分子量を測定したところ、分子量は１５万〜２００万を示した。
同様の方法でＩＦＯ−６３５３株を培養し、βグルカン量及び多糖のプルランに対する純度を測定したところ、多糖のプルランに対する純度は４０％、βグルカンの対糖収率は１１％と算出された。なお、培養上清の４９０ｎｍによる吸光値は０．１９０であり、着色が認められた。
【００６９】
〔実施例２〕
イースト窒素源基礎培地粉末（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammmonium Sulfate：ディフコ社）１．７ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解させ、フィルター滅菌した。硝酸ナトリウム５ｇを５００ｍｌの蒸留水に溶解し、２倍濃度の硝酸ナトリウム溶液を調製した。炭素源として、シュークロース、グルコース、フラクトース、可溶性デンプン又はマルトース（和光純薬工業）を用いて、１２重量％炭素源水溶液をそれぞれ調製した。硝酸ナトリウム、炭素源水溶液及び蒸留水をオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ．）し、滅菌済みの試験管に、イースト窒素源基礎培地１ｍｌ、硝酸ナトリウム溶液５ｍｌ、炭素源水溶液２．５ｍｌ及び蒸留水１．５ｍｌ加え、全量を１０ｍｌとし、各炭素源を添加した炭素源チェック培地を調製した。
３０ｍｌ容量の試験管に、ＹＭ培地（ディフコ社）５．５ｍｌを入れ、滅菌後（１２１℃、２０分間）、冷却してから、ＹＰＤ寒天培地（ディフコ社）のスラントにて保存してあるＡＤＫ−３４菌株を一白金耳、植菌し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で４日間培養し、種培養液を得た。得られた種培養液を上記炭素源チェック培地に植菌し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で５日間培養した。培養液は白色で顕著な粘性を有していた。培養後、培養液に等量の蒸留水を加え、１５分間、高圧蒸気殺菌してから、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離して多糖を含有する培養上清を得た。培養上清中のβグルカン量及び多糖のプルランに対する純度を分析例１及び分析例３の測定方法によりそれぞれ測定した。測定結果を表１１に示す。表１１から明らかなように、どの炭素源においても、多糖のプルランに対する純度は９０％以上であり、βグルカンの対糖収率は２０〜４６％と算出された。なお、培養上清の４９０ｎｍによる吸光度は０．０２６〜０．０４１であり、着色が抑制されていた。また、分析例２の測定方法によりβグルカンの分子量を測定したところ、分子量は１５万〜２００万であった。
【００７０】
【表１１】
【００７１】
〔実施例３〕
ＡＤＫ−３４株をＹＭ培地に植菌し、２６にて３日間培養して、３００ｍｌの種培養液を得た。フルゾーン翼を搭載した５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社）に、クザペック培地３Ｌ及びシュークロース３００ｇを入れ、滅菌・冷却後、１００ｍｌの種培養液を植菌し、２６℃にて７２時間の培養を実施し、培養液３Ｌを得た。培養液を８０℃にて３０分間加熱して、殺菌した後、等量の蒸留水を添加し、よく混合してから、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、培養希釈液を得た。培養希釈液をさらに蒸留水で５倍希釈し、吸光度を測定したところ、４９０ｎｍにおいて０．０２３であった。培養希釈液１００ｍｌに等量のエタノールを添加し、得られた沈殿を分離し、エタノールで洗浄し、そのまま５０ｍｌの蒸留水に溶解させた。この操作を再度繰り返し、透析膜（分子量３０００カット）に入れ１０倍量の蒸留水で透析を実施した。最終的に１００ｍｌの多糖溶液を得た。このときのβグルカン量は２５ｍｇ／ｍｌ、多糖のプルランに対する純度は９５％、βグルカンの分子量は１５万〜２００万と算出された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、βグルカンを効率よく高い生産速度で製造するのに有用な新規な微生物、及び該微生物を用いたβグルカンの製造方法を提供することができる。
【００７３】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食物繊維・抗腫瘍剤・免疫増強剤等として有効な多糖体であるβグルカンを得るのに有用な微生物、及びその微生物を用いたβグルカンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
βグルカンは、セルロースに代表されるように、ヒトの消化酵素によって非消化性の多糖体であることから、食物繊維としての働き、即ち、コレステロール低下作用、整腸作用、血糖値上昇を抑制する作用等が期待でき、生活習慣病予防に有用な材料である。βグルカンは、分子中にグルコースのβ結合を主に保持する多糖体と定義されるが、グルコースのβ結合様式、構成する糖の種類、あるいはリン酸基・硫酸基・カルボキシル基のような官能基による構成糖の修飾度合いの相違により、様々な分子種が天然に存在している。このようないわゆるβグルカンの中には、免疫系を刺激し、生体の防御機構を活性化する働きのあるものがある。近年、ある一部のβグルカンをはじめとする免疫系を活性化する免疫修飾物質（ＢＲＭ）を用いたインフルエンザ予防あるいはガン治療・老化防止の研究が注目されており、より効果の高い、一定の効果を持つβグルカンの提供、あるいは、そのようなβグルカン素材のより安価な安定した製造方法が必要となってきた。
【０００３】
免疫系を活性化するβグルカン類としては、植物細胞壁成分（特公昭６２−６６９２号公報、特開２００１−３２３００１号公報）、担子菌（キノコ）の子実体や菌糸体に含有されているもの（K.Sasaki et al., Carbohydrate Res., Vol.47, 99-104(1976)、特開平０５−３４５７２５号公報）、微生物菌体の細胞壁成分や菌体外に分泌生産されるβグルカン等が知られている。
【０００４】
微生物菌体の細胞壁成分は、いずれにおいてもβグルカンを含み免疫活性を増強する作用があることは一般的によく知られているが、特に安全性が高く食品としても利用価値が高いものとしては、酵母菌体（特開昭５４−１３８１１５号公報、特開平０９−１０３２６６号公報）、乳酸菌菌体（特開平０３−２２９７０２号公報、特開平１０−１６７９７２号公報）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）菌体（特公平０６−９２４４１号公報）等が知られている。
【０００５】
また、免疫活性を増強する機能を有するβグルカンを菌体外に分泌生産する微生物としては、特開平０３−２２０２号公報に記載の通り、マクロフォモブシス（Macrophomopsis）属、あるいは、アルカリゲネス属の生産するカードラン（食物繊維の科学、p108、朝倉書店、1997年）、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）（Agaric. Biol. Chem. 47(6), 1167-1172(1983)、特開平６−３４０７０１号公報）が知られている。
【０００６】
担子菌（キノコ）の子実体や菌糸体に含有されているβグルカンは、免疫増強活性が高く、シイタケ子実体より抽出されるレンチナンのように、医薬品として利用されているものもある。しかし、一般的に担子菌（キノコ）の子実体や菌糸体に含有されているβグルカンは、その生育・栽培条件により含まれるβグルカン量が大きく変動し、抽出操作でβグルカンを分離する必要があり、結果として得られるβグルカンが複雑多岐の分子種にわたり、高分子体と低分子体とが混在する等、品質が不安定なものとなっている。
【０００７】
このように担子菌（キノコ）では、高活性を有した一定のβグルカンを安定的に製造することが現時点での課題となっている。一方、微生物菌体の細胞壁は多量のβグルカンを含んでおり、βグルカンの供給源として興味深い。しかし、微生物菌体の細胞壁自体は、βグルカン以外の成分をも含み、また水に不溶性であるため、効果の高い水溶性のβグルカンを得るためには、担子菌と同様に抽出操作が必要であることから、一定の品質のβグルカンを安定的に抽出する方法の確立が課題であるといえる。
【０００８】
これに対し、菌体外に免疫増強活性の高い水溶性βグルカンを分泌生産する微生物を用いたβグルカンの発酵生産は、均一で水溶性の高活性なβグルカンを得ることが可能であり、きわめて有効な方法である。このような考えに基づき、高活性なβグルカンを菌体外に分泌生産することが知られているアウレオバシジウム属の微生物を用いたβグルカンの製造方法が提案されてきた。
【０００９】
しかしながら、アウレオバシジウム属の微生物は、シュークロースのような一般的な微生物培養に用いる炭素源を用いて培養すると、αグルカンであるプルランを菌体外に分泌生産することが知られており（特公昭５１−３６３６０号公報、特公昭５１−４２１９９号公報）、βグルカンを純度よく製造することが困難であった（特開平０６−３４０７０１号公報）。また、アウレオバシジウム属の微生物は、俗名で黒酵母と呼ばれ、菌体によって生産されるメラニン色素により菌体あるいは培養液が黒色に着色し、得られるβグルカンも着色することから、製造されるβグルカンは品質が著しく損なわれたものとなっている。この点を改良するため、変異原処理により着色を認めない突然変異体を取得し、該突然変異体を用いたプルラン等の多糖体の製造方法が提案されている（特公平４−１８８３５号公報）。しかし、メラニン色素を完全に生産せず、効率よく高純度のβグルカンを菌体外に分泌生産する（プルランを菌体外に分泌生産しない）菌株は、未だ知られていない。
【００１０】
また、βグルカン製造過程、即ち培養工程において、不純物として挙げられるプルランの生産を抑制する培養方法が種々検討され、特開平０６−３４０７０１号公報及び特開平０７−５１０８０号公報には、ｐH調整あるいは炭素源として特殊な糖類を用いることで、プルランの生産を押さえ、純度の高いβグルカンを生産できる方法が提案されている。この場合、特殊な培養条件を設定するため操作が煩雑であること、特殊な炭素源を利用するため培養に用いる培地のコストが高くなること等が、βグルカンを製造する上で問題となっている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
以上から、アウレオバシジウム属の微生物を用いてβグルカンを生産するためには、一般的に微生物培養に用いられる安価な糖類を炭素源として培養しても、プルラン等の不純物の生産がないかあるいは抑制されており、且つ、βグルカンの製造過程で実質的にメラニン色素の生産がないかあるい抑制されており、生産されたβグルカンが着色しないような、高活性で高品質のβグルカンを効率よく菌体外に分泌生産する菌株が必要とされている。
【００１２】
従って、本発明の目的は、シュークロース等の安価な糖類から高活性で高品質のβグルカンを効率良く高い生産速度で製造するのに有用な新規な微生物、該微生物を用いたβグルカンの製造方法、及び該微生物が菌体外に分泌生産するβグルカンを提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、シュークロースから、純度の高いβグルカンを効率良く菌体外に分泌生産する能力を有する微生物の探索を行った。その結果、高品質のβグルカンを高効率で菌体外に分泌生産する新規な微生物を見出した。また、さらなる検討の結果、抗生物質シクロヘキシミドに耐性を有するアウレオバシジウム属に属する菌株が、純度の高いβグルカンを効率良く菌体外に分泌生産することを見出した。
【００１４】
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１７３２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含み、さらに抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有し、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有するアウレオバシジウム プルランス（ Aureobasidium pulullans ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株である微生物を提供するものである。
また、本発明は、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５６３塩基の配列が、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有するアウレオバシジウム プルランス（ Aureobasidium pulullans ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株であり、好ましくはさらに抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有する微生物を提供するものである。
また、本発明は、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有する上記微生物を提供するものである。
また、本発明は、上記微生物を培養（好ましくは炭素源として糖類を含有する培養液にて培養）し、βグルカンを菌体外に分泌生産させることを特徴とするβグルカンの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、アウレオバシジウム プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｕｌｌａｎｓ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株を培養することによって菌体外に分泌生産され、培養液を適当に希釈し、菌体を遠心分離（１００００ｘｇ、１０ｍｉｎ．）にて除去した培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が、同様に培養して得たＩＦＯ−６３５３株の培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が０．１以上を示す条件において、０．０９９以下であり、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンを提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１７３２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含み、さらにストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）等によって生産される抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有し、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有する微生物、及び、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５６３塩基の配列が、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有し、好ましくはさらにストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）等によって生産される抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有する微生物である。
【００１７】
本発明者等は、実施例に詳細を示すように、環境中から本発明の微生物を分離した。分離した微生物の中には、アウレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物が認められた。中でも、純度が高く、非着色性のβグルカンを効率良く菌体外に分泌生産することができる１菌株をＡＤＫ−３４菌株と命名した。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Aureobasidium pullulans ＡＤＫ−３４」、受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２」として寄託されている。
【００１８】
また、薬剤耐性については、その菌株のコンディション、培地の種類、培養期間によって耐性を示す濃度が異なる場合があることから、本発明において「シクロヘキシミドに対する抵抗性を有する」とは、ＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株を基準として、これらの菌株に比較して、シクロヘキシミドに対する抵抗性を有することをいう。即ち、シクロヘキシミドを含有する固形培地（寒天プレート）に菌株を接種し、２６℃にて１０日間培養したとき、これらのＩＦＯ菌株の生育が認められないようなシクロヘキシミド濃度を有する固形培地にて、直径０．１ｍｍ以上、好ましくは０．３ｍｍ以上、さらに好ましくは０．５ｍｍ以上の菌体増殖によるコロニー形成が観察される場合をいう。通常、これらのＩＦＯ菌株は、固形培地中のシクロヘキシミド濃度が２０μｇ／ｍｌ以上であると生育が認められない。
【００１９】
また、本発明において、非着色性あるいは着色が抑制された、菌株あるいは培養液又はβグルカンとは、培養液を適当に希釈し、菌体を遠心分離（１００００ｘｇ、１０ｍｉｎ．）にて除去した培養希釈液の吸光度を４９０ｎｍで測定し、同様に培養して得たＩＦＯ−６３５３株の培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が０．１以上を示す条件において、本発明の微生物の菌株の場合、０．０９９以下、好ましくは０．０６０以下、さらに好ましくは０．０５０以下の場合をいう。
また、本発明において、高純度とは、後記の分析例３に示す生成多糖のプルランに対する純度測定において、プルラナーゼ酵素処理を行った際、酵素処理後のフェノール硫酸値の酵素処理前のフェノール硫酸値に対する比が７５％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上であることをいう。
【００２０】
本発明の微生物は、βグルカンを高純度に高効率に菌体外に生産させるのに有用である。本発明の微生物が生産する該βグルカンは、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンであることが好ましい。
【００２１】
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法の好ましい実施形態について、以下に説明する。
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法においては、本発明の微生物の菌株を該微生物が生育可能である培地に作用させ、菌体外の培地中にβグルカンを生産させればよい。また、本発明の微生物の菌株を培養して得られた培養菌体を分離し、該培養菌体をβグルカンの基質である糖類を含んだ溶液あるいは培地に作用させて、菌体外にβグルカンを生産させてもよい。ただし、菌体外への分泌が準備された分泌型のβグルカンを菌体内に内包している場合もあるので、このように菌体内に分泌のため準備蓄積されているβグルカンも、本発明においては菌体外に分泌されるβグルカンとする。
【００２２】
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法において、本発明の微生物の菌株を培養する培地としては、アウレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物が通常利用できる栄養源（炭素源、窒素源、無機塩類）を含有し、さらに必要に応じて有機栄養原を含む通常の培地を用いることができるが、炭素源として糖類を含有する培養液が好ましい。これらの培地としては、各種の合成培地、半合成培地、天然培地等いずれも利用可能である。
【００２３】
上記炭素源としては、糖類が好ましく、該糖類としては、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等の単糖類、シュークロース、マルトース、ラクトース、トレハロース等の２糖類、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖等のオリゴ糖類、デキストリンやデンプン等の多糖類が挙げられ、これらを単独又は組合せて用いることができる。これらの中でも、主炭素源として、グルコース、フラクトース等の６炭糖、シュークロース、ラクトース等の２糖類、デンプンやデキストリン、あるいはこれら炭水化物の加水分解物等の多糖類を用いるのが好ましい。また、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類をはじめとする果実搾汁、あるいはこれらの搾汁に糖を添加したもの等を用いることもできる。この他、グリセロール、エチレングリコール等のアルコール類、マンニトール、ソルビトール、エリスリット等の糖アルコール類、有機酸等のその他の炭素源を適宜使用することができる。これらの炭素源は、培養途中で随時添加してもよく、例えば、シュークロース等の糖類を培地中へ好ましくは３〜５００ｇ／ｌ、さらに好ましくは５〜３００ｇ／ｌ、最も好ましくは１０〜２００ｇ／ｌの濃度範囲となるように適宜フィードすると、βグルカンの生産速度・生成量を相対的に増大させることができる。
【００２４】
上記窒素源としては、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、麦芽エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、アンモニアガス、アンモニア水等の無機窒素源を単独又は組合せて用いることができる。
【００２５】
上記無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩等を使用することができ、必要に応じてビタミン類も添加使用することができる。なお、培養中に発泡が生じる場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。
【００２６】
本発明の微生物の菌株の培養条件には、格別の制限はなく、該菌株が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ５．０〜８．５、２０℃〜３５℃で２〜８日間程度培養するとよいが、これらの培養条件は、使用微生物菌株の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できる。また、培地への菌株の接種量は、フラスコ培養の場合は１白金耳、スケールアップの場合は種培養液を本培養液の１〜１０％（ｖ／ｖ）添加することが好ましいが、実質的に培養可能であればこの限りではない。
【００２７】
本発明の微生物の菌株の培養は、通気撹拌、振とう等による好気的条件下で行う。培養時間は、目的とするβグルカンの生成濃度に達するまで行われるのが好ましく、通常２〜５日間で行われる。また、連続的にβグルカンの基質である糖類や培地成分を連続添加し、βグルカンを連続的に生産してもよい。βグルカンの基質であるシュークロース等の糖類は、粉末のままか、あるいは高濃度に水に溶解させた液糖として培養液に添加することができ、その添加量は、培養液１ｌ当り０．１〜５００ｇが好ましい。添加量を５００ｇ／ｌより多くすると、生産速度が著しく遅くなり好ましくない。基質添加後は、好ましくは２５〜３５℃で１〜７日間、特に約２〜５日間、振とうあるいは通気攪拌等の操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより、基質であるシュークロース等の糖類からβグルカンを製造することができる。
【００２８】
また、本発明の微生物の菌株を培養することによって得られた培養菌体を分離して、該培養菌体あるいは該培養菌体の抽出液を触媒としてβグルカンを製造することもできる。この場合は、培養菌体、培養菌体調製物又は培養菌体処理物の懸濁液に、基質である糖類溶液あるいは培地を添加すればよい。上記培養菌体調製物としては、該培養菌体を例えばホモジナイズした細胞破砕液等が挙げられ、また、上記培養菌体処理物としては、培養菌体あるいは細胞破砕液をアルギン酸ゲル中、イオン交換樹脂、セラミック、キトサン等に固定化した固定化菌体等が挙げられる。これらの培養菌体、培養菌体調製物又は培養菌体処理物の懸濁液の調製に使用できる溶液としては、前記した培地、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等の緩衝液を単独又は混合したものが挙げられる。該緩衝液のｐＨは、好ましくは３．５〜９．０、さらに好ましくは５．０〜８．０、最も好ましくは５．２〜７．８である。前記懸濁液中の培養菌体の量は、特に限定されるものではないが、好ましくは湿容量比で０．１〜１０％程度がよい。
【００２９】
前記懸濁液への基質である糖類や培地の添加は、いかなる濃度、いかなる容量でも実施できるが、１回当りの基質の添加量は、菌体の活性を維持できる範囲が好ましい。例えば、懸濁液１ｌ当り０．１〜５００ｇを１回又は数回に分けて添加してもよいし、０．５〜５００ｇ／ｄａｙ程度で連続的に添加してもよい。菌体と基質とを作用させた溶液を、任意の時間と温度でインキュベーションすることにより、βグルカンを生産させることができるが、該インキュベーションは、前述した本発明の微生物の菌株の培養と同様の条件で実施することが好ましい。
【００３０】
前記の如く培養した後、菌体外に分泌生産されたβグルカンは、常法に従って、培養液より分離、採取される。具体的には、培養液から遠心分離、濾過等により菌体等の固形物を分離除去したり、活性炭、イオン交換樹脂等により不純物や塩類を除去する等、種々の既知の精製手段を選択、組合せて行うことができる。さらに、例えば、疎水性樹脂への吸着・溶出、エタノール、メタノール、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒沈降、シリカゲル等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組合せ、場合により反復使用することにより、分離精製することができる。
【００３１】
また、菌体外に分泌生産されたβグルカンを上記の方法で分離する前後において、菌体の殺菌を実施してもよい。殺菌温度は、菌体が死滅する温度であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは６０℃、最も好ましくは８０℃以上である。また、さらに温度を上げて、例えば、９０℃以上、あるいは加圧下１２１℃にて、菌体内に準備されている分泌型のβグルカンを熱水抽出することができる。殺菌時間及び熱水抽出時間は、任意の時間を設定できるが、好ましくは１０分以上８時間以下、さらに好ましくは１５分以上６時間以下、最も好ましくは３０分以上２時間以下とすると、不純物の混入が抑えられ、βグルカンが劣化しないので好適である。
【００３３】
また、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pulullans）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株を用いてβグルカンを製造すると、その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンを得ることができる。
【００３４】
本発明の微生物を用いたβグルカンの製造方法は、これまでに知られているアウレオバシジウム プルランスの菌株、あるいはアウレオバシジウム属に属する微生物を用いた培養に比較すると、プルランの生産が著しく抑制されていることから、培養物からのβグルカンの分離が容易であり、また高純度のβグルカンを得るための精製操作が簡略化できるという利点がある。さらに、アウレオバシジウム属に属する微生物、酵母、乳酸菌等の菌体の細胞壁や担子菌類や植物からの抽出βグルカンに比較して不純物が少なく、単離・精製操作が簡略化できると同時に、βグルカンの着色が著しく抑制されていることから、高品質で一定の品質を保持したβグルカンを安定的に得ることが容易である。
【００３５】
本発明で得られるβグルカンは、着色がなく、高品質であり、そのまま、あるいは他の製品に添加することで、種々の用途に使用できる。
本発明で得られるβグルカンの用途としては、食品、食品添加剤、化粧品、トイレタリー製品、化成品、医薬品等が挙げられる。
【００３６】
食品の具体例を以下に挙げる。
油脂食品としては、マーガリン、ショートニング、マヨネーズ、クリーム、サラダオイル、揚油、ホイップクリーム、起泡性乳化脂、ドレッシング、ファットスプレッド、カスタードクリーム、ディップクリーム等が挙げられる。本発明で得られたβグルカンは、油脂との相溶性に優れており、油脂に添加して、βグルカンを含有する油脂組成物としてから、他の原料とともに用いることが好ましい。
【００３７】
さらに穀類関連製品としては、小麦粉を主成分とした食品、米類を主成分とした食品、米加工品、小麦加工品、トウモロコシ加工品、大豆加工品等が挙げられ、例えば、食パン、菓子パン、パイ・デニッシュ等のベーカリー製品、ホットケーキ、ドーナッツ、ピザ、天ぷら等、更にそれらのプレミックス、ビスケット、クッキー、スナック等の菓子類、生麺、乾麺、即席麺、カップ麺、うどん、蕎麦、中華麺、ビーフン、パスタ類等の麺類、炊飯米、餅、無菌米飯、レトルト炊飯米、上新粉、餅粉、団子、せんべい、あられ等の米製品が挙げられる。
【００３８】
さらに菓子類としては、チョコレート、キャンディー・ドロップ、飴、チューインガム、焼き菓子、ケーキ、饅頭等の洋菓子又は和菓子等が挙げられる。
さらに畜肉加工品としては、ハム・ソーセージ、ハンバーグ等が挙げられ、水産加工品としては、ちくわ、かまぼこ、さつま揚げ、魚肉ソーセージ等が挙げられる。
さらに乳製品としては、バター、チーズ、アイスクリーム、ヨーグルト等が挙げられる。
【００３９】
さらに飲料としては、ビール、酒、日本酒、ウイスキー、ブランデー、洋酒、焼酎、蒸留酒、発泡酒、ワイン、果実酒等のアルコール飲料、コーヒー、紅茶、日本茶、ウーロン茶、中国茶、ココア、炭酸飲料、栄養ドリンク、スポーツドリンク、コーヒードリンク、炭酸飲料、乳酸菌飲料、果汁・果実飲料等の飲料が挙げられる。
さらに調味料、ソース類としては、スパイス、タレ、焼肉のタレ、ドレッシング、ソース、味噌、醤油、カレー、ハヤシ等のルーが挙げられる。またスープとしては、コーンスープ、ポテトスープ、パンプキンスープ等のスープが挙げられる。その他、ジャム、ピーナッツバター、ふりかけ等が挙げられる。
【００４０】
さらに長期保存食品としては、水産物、畜肉、果実、野菜、キノコ、コーンビーフ、ジャム、トマト等の缶詰又は瓶詰め、冷凍食品等が挙げられ、また、カレー、シチュー、ミートソース、マーボ豆腐、食肉野菜混合煮、スープ、米飯等のレトルト食品が挙げられる。また、粉末食品としては、飲料、スープ、味噌汁等の粉末インスタント食品等が挙げられる。
さらに、健康食品、薬用食品、離乳食等の育児用食品、流動食等の病人食、老人食、ダイエット食、サプリメント等が挙げられる。
さらに、電子レンジ加熱食品、電子レンジ調理食品等が挙げられる。
【００４１】
食品添加剤としては、乳化剤、増粘剤、増粘安定剤、品質改良剤、酸化防止剤、安定剤、保存料、香料、甘味料、着色料、漂白剤、酸味料、ガムベース、調味料、苦味料、栄養強化剤、香辛料、製造用剤等が挙げられる。
【００４２】
化粧品、トイレタリー製品としては、皮膚化粧品、頭髪用化粧品、薬用化粧品、口腔用剤等が挙げられ、具体的には、化粧水、乳液、スキンミルク、クリーム、軟膏、ローション、カラミンローション、サンスクリーン剤、サンタン剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、化粧下地料、パック料、クレンジング料、洗顔料、アクネ対策化粧料、エッセンス等の基礎化粧料；ファンデーション、白粉、アイシャドウ、アイライナー、アイブロー、チーク、口紅、ネイルカラー等のメイクアップ化粧料；シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアカラー、ヘアトニック、セット剤、整髪料、育毛料、養毛剤、ボディパウダー、デオドラント、脱毛剤、石鹸、ボディシャンプー、ハンドソープ、香水、歯磨き、口腔ケア製品、入浴剤等が挙げられる。
【００４３】
化成品としては、界面活性剤、乳化剤、増粘剤、粘度調整剤等が挙げられる。
医薬品としては、コレステロール低下作用、整腸作用、血糖値上昇を抑制する作用などを有し、生活習慣病を予防する医薬品、免疫増強作用を有する医薬品等が挙げられる。
【００４４】
【実施例】
実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。試験例１〜２においては、本発明の微生物の菌株のスクリーニング方法を示し、試験例３〜７においては、ＡＤＫ−３４菌株の菌学的性質を示す。また、実施例１〜３は、ＡＤＫ−３４菌株を用いた本発明のβグルカンの製造方法の実施例を示す。
【００４５】
〔試験例１〕菌株のスクリーニング方法１
日本において伝統的な保存食を中心に、通常、加熱調理せず摂取する市販の食品の表面に付着・生育している微生物を広く分離し、βグルカンを生産する菌株をスクリーニングした。スクリーニング方法を以下に詳述する。
先ず、対象サンプルである食品を滅菌シャーレに入れ、これに滅菌したＰＢＳ１０ｍｌを加え、滅菌済みスポイトを用いてサンプル表面をＰＢＳで繰り返し洗浄し、サンプルの表面を洗浄した洗浄液を得た。得られた洗浄液を滅菌したＰＢＳで１０〜１００倍希釈し、この２００μｌをプレートに添加し、コンラージ棒で広げ、２週間、室温で培養した。プレートは、ＹＭ培地（ディフコ社製）に、クロラムフェニコールを１００μｇ／ｍｌ、寒天を１．５重量％となるようにそれぞれ添加した培地を２０ｍｌ入れ、固化させたものを用いた。生育したコロニー約２万のうち、生育初期に乳白色で、次第にコロニー全体に光沢を生じ湿潤したコロニーを形成したもの、コロニー全体に光沢を生じ、中心部がわずかに黄色・褐色、あるいは黄色・褐色の輪郭を生じ、湿潤したコロニーを形成したもの、全体が乳白色〜ピンク色を呈するコロニーを形成したもの、次第に緑黒色となり毛羽立った特徴を有するコロニーが形成されたもの、以上の４形質を示すコロニーから釣菌した。なお、コロニー全体がピンク色となるが、上部に盛り上がり外周部への拡がりが認められない、光沢のないコロニーは除外した。釣菌した菌株は、単菌分離操作を実施し、再度７日間培養した後、顕微鏡観察によって出芽型分生子が観察されるもの、及び酵母様生育が認められるものを残し、分生子枝が観察されたものについては除外し、第１スクリーニング結果とした。
次に、第１スクリーニングにより得られた菌株を液体培養した。即ち、ＹＭ培地に５重量％となるようにシュークロースを添加した培地を調製し、２４穴マイクロプレートを用いて、２６℃、４日間の培養を行い、培養液を得た。生育した菌株が培養液全体に均一に分散し、かつ粘性を呈する培養液を与える菌株を残し、第２スクリーニング結果とした。
次に、第２スクリーニング結果により得られた菌株を単菌分離し、ＹＭ液体培地に植菌し、２６℃にて９６時間培養を実施した。得られた培養液に等量の蒸留水を加え、１２１℃にて２０分間の滅菌後、培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ）して培養上清を得た。培養上清３０μｌに２倍量のエタノールを加え、遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）にて沈殿を得て、１００μｌの蒸留水を加え、全多糖量をフェノール硫酸法にて測定し、培地について同様の操作をして得られた値より高値となったものを陽性と判定した。陽性のものを第３スクリーニング結果とした。
対象サンプルから分離・培養して生育した約２万コロニーから、第１スクリーニングにて１８０菌株、第２スクリーニングにて５０菌株、第３スクリーニングにて１４菌株を得た。第３スクリーニングで得られた菌株並びに（財）大阪発酵研究所から得た３菌株、即ちＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株について、培養上清中のβグルカン量を下記分析例１に示す測定方法により測定するとともに、下記分析例３に示す測定方法により培養液中の生成多糖のプルランに対する純度を測定した。その結果を表１に示す。ＡＤＫ−３４菌株が生成する多糖は、プルラナーゼによって消化されず、その多糖量はβグルカン定量値にほぼ一致するものであり、βグルカンが純度良く生成されていると結論された。
【００４６】
【表１】
〔試験例２〕菌株のスクリーニング方法２
抗生物質シクロヘキシミドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した培地を用いたこと以外は、試験例１と同様にして、菌株のスクリーニングを実施した。その結果、対象サンプルから分離・培養して生育した４０００コロニーから、第１スクリーニングにて３０菌株、第２スクリーニングにて１０菌株、第３スクリーニングにて３菌株（ＡＤＫ−７１菌株、ＡＤＫ−７７菌株、ＡＤＫ−８２菌株）が得られた。第３スクリーニングで得られた菌株について、試験例１と同様にして、βグルカン量及び生成多糖のプルランに対する純度を測定した。その結果を表２に示す。
また、第３スクリーニングの結果得られた３菌株について形態学的な観察から菌株同定をそれぞれ試みた。ＹＭ寒天培地に植菌後、２６℃、７日間培養したところ、３菌株のコロニーはいずれも、全体に光沢を生じ、中心部が黄色の輪郭を生じ、湿潤したコロニーを形成した。これらのプレートを４℃に移管して７日間保存することで、中心部の黄色は黒緑色へ変化した。ＡＤＫ−７１菌株及びＡＤＫ−７７菌株それぞれのコロニー全体は変化せず、白色〜ピンク色であった。ＡＤＫ−８２菌株はコロニー全体が黒色化した。また、これらの３菌株それぞれをＹＭ液体培地で２６℃にて３日間培養した菌体の顕微鏡観察では、３菌株いずれにおいても出芽型の分生子が認められ、酵母様の生育であった。また、これらの３菌株それぞれをＹＭ寒天培地で２６℃にて７日間培養したコロニーの菌体は、３菌株いずれにおいても、分生子がつながった鎖状に生育した菌体が観察されたが、分生子枝は認められなかった。以上から、３菌株はアウレオバシジウム プルランスと判定した。
【００４８】
【表２】
〔試験例３〕形態的・培養的性質
試験例１で得られた菌株の中で、ＡＤＫ−３４菌株について、ＹＭ培地（１重量％グルコース、０．５重量％ペプトン、０．３重量％酵母エキス、０．３重量％マルトエキストラクト、ｐＨ６．０）で２６℃、３日間培養した後、顕微鏡で観察した所見を示すと、細胞の大きさは短径２〜２．５μｍ、長径５〜１０μｍ、形状は卵形、表面は平滑で無色、運動性はなかった。また、菌糸はごくわずかで、幅は２．５μｍであった。不均一で表面は平滑無色であった。酵母様の出芽分生子が形成された。
【００５０】
〔試験例４〕寒天平板培養
試験例１で得られた菌株の中で、ＡＤＫ−３４菌株について、ポテトデキストロース寒天培地（栄研）で２６℃にて７日間培養した。その時の所見を以下に示す。３日間の培養で、生育は良好であり、形態は円形で、全縁がギザギザで、コロニー全体に光沢があり、表面の状態は平滑、色調は白色であった。また、Ｃｏｌｏｎｙ（コロニー）は、５日間の培養で表面が平滑で淡灰白色となり、酵母様に発育し、７日間の培養でＣｏｌｏｎｙ表面はピンク色となった。２６℃にて７日間培養したプレートを、４℃にて７日間冷蔵したところ、若干ピンク色が濃くなったが、コロニー全体に変化はなかった。
【００５１】
〔試験例５〕液体培養
試験例１で得られた菌株の中で、ＡＤＫ−３４菌株について、ＹＭ培地で培養した。その時の最適生育温度及び最適生育ｐＨを示すと、最適生育温度は２６℃であり、最適生育ｐＨは５．０〜７．０であり、生育開始時のｐＨは６．２で、培養終了後のｐＨは７．５であった。好ましい発育温度は２０〜３０℃で、最適温度は２６℃、発育可能温度は５〜４０℃であった。グルコース、フラクトース、マンノース等のヘキソース、スクロース等の二糖類並びにデンプンを分解し、いずれの炭素源でも、培養液は、粘稠になり、特有の芳香を有した。
【００５２】
試験例３〜５の結果、本発明の微生物のうち、ＡＤＫ−３４菌株は菌学的特徴からアウレオバシジウム属の菌株と同定された。
【００５３】
〔試験例６〕シクロヘキシミド耐性試験
試験例１及び２のスクリーニングで得られた菌株、並びに（財）大阪発酵研究所に保存されている、ＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株、及びＩＦＯ−７７５７株について、各菌株のシクロヘキシミド耐性試験を実施した。即ち、各菌株をＹＭ寒天培地（ディフコ社製）にて２６℃で５日間生育させた。ＹＭ寒天培地（ディフコ社製）にシクロヘキシミドを５，１０，２０，４０，８０μｇ／ｍｌの濃度となるように添加した培地をそれぞれ調製し、上記の生育させておいた菌株を滅菌した楊子でこれらのシクロヘキシミド含有培地に植菌し、２６℃にて１０日間の培養後、生育したコロニーの有無を観察し、生育した場合はコロニーの直径を測定した。その結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
表１及び表３から明らかなように、ＩＦＯ−４４６６株、ＩＦＯ−６３５３株、及びＩＦＯ−７７５７株は、シクロヘキシミドに耐性を持たず、生産されるβグルカンのプルランに対する純度は低いものであった。一方、表１〜３から明らかなように、食品からの分離菌株の中で、シクロヘキシミドに耐性を有する菌株（ＡＤＫ−３４菌株、ＡＤＫ−７１菌株、ＡＤＫ−７７菌株、ＡＤＫ−８２菌株）は、βグルカンをプルランに対して純度よく生産し、シクロヘキシミドに耐性のない菌株の多くは、生産されたβグルカンのプルランに対する純度が低い結果となった。
【００５６】
〔試験例７〕１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子解析
スクリーニングの結果得られたＡＤＫ−３４菌株について、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１７３２ｂｐの塩基配列を以下のようにして決定した。ＡＤＫ−３４菌株をポテトデキストロース培地（ディフコ社）にて振とう培養し、遠心分離、蒸留水による洗浄を３回行い、ＤＮＡ抽出用菌体を得た。この菌体からFastPrepFP120（Qbiogene）とFastDNA-kit（Qbiogene）を用いて細胞破砕し、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）によりゲノムDNA分離を行った。このゲノムＤＮＡを鋳型として、Ready-To-Go PCR Beads（Amersharm-Pharmasia Biotech）とプライマーＮＳ１及びＮＳ８を用いてＰＣＲ増幅を行った。
プライマーＮＳ１とＮＳ８の塩基配列は、NS1： (5'->3') GTAGTCATATGCTTGTCTC、NS8：(5'->3') TCCGCAGGTTCACCTACGGAを用いた。サーマルサイクラーはgeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems)を用いた。反応終了後、ＰＣＲ産物をQIAquickPCR purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。このＤＮＡフラグメントを直接シーケンシング反応に供し、塩基配列解析はABI Prism377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) を用いて実施した。類似の塩基配列はＤＮＡデータベース（DDBJ, DNA Data Bank of Japan）からＢＬＡＳＴを利用して検索した。
その結果を配列表の配列番号１に示す。また、得られた塩基配列に基づいてデータベース検索を行い、同菌株と類縁菌との相同性を調べた結果を表４〜６に示す。決定された塩基配列（配列番号１）、相同性検索結果（表４〜６)より、ＡＤＫ−３４菌株はアウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）との相同性が１００％であり、完全に一致した。この結果から、本菌株はアウレオバシジウム プルランスであると判定された。
【００５７】
【表４】
【表５】
【表６】
〔試験例８〕ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
スクリーニングにより得られたＡＤＫ−３４菌株並びにＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株について、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５６３塩基配列あるいは５６４塩基配列を決定した。各菌株をポテトデキストロース培地（ディフコ社）にて振とう培養し、遠心分離、蒸留水による洗浄を３回行い、ＤＮＡ抽出用菌体を得た。この菌体からFastPrepFP120（Qbiogene）とFastDNA-kit（Qbiogene）を用いて細胞破砕し、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）によりゲノムＤＮＡ分離を行った。このゲノムＤＮＡを鋳型として、Ready-To-Go PCR Beads（Amersharm-Pharmasia Biotech）とプライマーＩＴＳ５およびＩＴＳ４を用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマーＩＴＳ４とＩＴＳ５の塩基配列は、ITS4： (5'->3') TCCTCCGCTTATTGATATGC、ITS5：(5'->3') GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG である。サーマルサイクラーはgeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems)を用いた。反応終了後、ＰＣＲ産物をQIAquickPCR purification Kit(QIAGEN)を用いて精製した。このＤＮＡフラグメントを直接シーケンシング反応に供し、塩基配列解析はABI Prism377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) を用いて実施した。類似の塩基配列はＤＮＡデータベース（DDBJ, DNA Data Bank of Japan）からＢＬＡＳＴを利用して検索した。
ＡＤＫ−３４菌株の結果を配列表の配列番号２に、ＩＦＯ−６３５３株の結果を配列番号３に、ＩＦＯ−７７５７株の結果を配列番号４にそれぞれ示す。また、得られた塩基配列に基づいてデ−タベース検索を行い、同菌株と類縁菌との相同性を調べた結果を表７及び８に示す。決定された塩基配列を比較したところ、ＡＤＫ−３４菌株とＩＦＯ−６３５３株及びＩＦＯ−７７５７株とは異なり、完全一致しなかった。ＡＤＫ−３４菌株とＩＦＯ−６３５３株との相同性は９８％、ＡＤＫ−３４菌株とＩＦＯ−７７５７株との相同性は９８％であった。また、相同性検索結果（表７及び８）より、ＡＤＫ−３４菌株のＩＴＳ−５．８Ｓ領域の５６３塩基対が完全一致する菌株は、報告されていなかった。ＩＦＯ−６３５３株は、報告されているアウレオバシジウム プルランス菌株である登録番号「ＡＪ２７６０６２」と１００％（表９）、即ち完全一致し、ＩＦＯ−７７５７株は報告されているアウレオバシジウム プルランス菌株である登録番号「ＡＪ２７６０６２」と９９％で一致した（表１０）。ＡＤＫ−３４菌株は登録番号「ＡＪ２７６０６２」と９８％の一致率であった。
以上から、ＡＤＫ−３４菌株は、これまでに報告されているアウレオバシジウム プルランス菌株とはＩＴＳ−５．８Ｓ領域の塩基配列の一部が異なり、新菌株であると判定された。
【００６１】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
〔分析例１〕βグルカンの確認方法とβグルカン量の測定方法
多糖中のβグルカンの分析は、アルコールによって沈殿する全多糖量をフェノール硫酸法にて測定し、引き続き、沈殿させた多糖中のβグルカンの確認・定量を生化学工業（株）のβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を含むβグルカンの検出・測定用キットを用いて行った。以下にその手順を説明する。
先ず、測定サンプル中の全多糖量をフェノール硫酸法にて測定した。即ち、サンプル溶液３０μｌに蒸留水３０μｌを加え、ここに３００ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）を１２０μｌ加え、さらにエタノール５４０μｌ（３倍量）を添加し、−１５℃に１０分間放置して多糖を沈殿させた。上清を除去後、１００μｌの蒸留水を添加して沈殿を溶解させた。ここに５重量％フェノール水溶液１００μｌ及び硫酸５００μｌを加えて反応させた後、該溶液の４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、サンプルを加えず蒸留水１００μｌに５重量％フェノール水溶液１００μｌ及び硫酸５００μｌを加えたものをブランクとして、該ブランクの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。プルランの１０ｍｇ／ｍｌから２倍希釈系列を作成して標準サンプルとし、該標準サンプルを使用して検量線を作成し、該検量線と上記吸光度とから、サンプル中の全多糖量の定量を実施した。
次に、全多糖量が０．１〜１ｍｇ／ｍｌ前後の溶液を、先ず１．０ＭのＮａＯＨにて１０倍希釈し、引き続きβグルカンフリーの蒸留水にて希釈し、１０10倍まで希釈し、βグルカン希釈液を調製した。βグルカン希釈液５０μｌをチューブにとり、主反応試薬５０μｌを添加して、３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて、亜硝酸ナトリウム溶液５０μｌ、スルファミン酸アンモニウム５０μｌ、及びＮメチル２ピロリドン溶液５０μｌを加え、反応させた後、溶液の５４５ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）における吸光度を測定した。また、添付のβグルカン標準品を用いて７．５〜６０ｐｇ／ｍｌのβグルカン溶液を調製し、検量線を得た。該検量線と上記吸光度とから、各βグルカン希釈液の濃度を算出し、サンプル中のβグルカン量を求めた。
【００６６】
〔分析例２〕βグルカンの分子量測定方法
βグルカンの分子量測定は、以下の通りとした。先ず、培養上清に３倍量のアルコールを加え、−２０℃に冷却して１０分間放置し、沈殿を得た。沈殿させたβグルカンを５ｍｇチューブに取り、１ｍｌの蒸留水を加えて、沸騰水中で溶解させた。該溶液を０．２２μｍのフィルターに通してＨＰＬＣ用サンプルとした。分離にはＨＰＬＣゲル濾過カラムであるＳｈｏｄｅｘのパックドカラムＫＳ−８０５（昭和電工社製）を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、温度５０℃とし、検出にはＲＩ検出器を用い、水を分離溶媒として用いて実施した。分子量マーカーとしてはＳｈｏｄｅｘプルラン標準液Ｐ−８２（昭和電工社製）を用いて測定した。
【００６７】
〔分析例３〕培養液中に存在する多糖のプルランに対する純度の測定方法
プルランを特異的に分解する酵素であるプルラナーゼ（和光純薬工業社製）を用いて、培養液中に生産された多糖のプルランに対する純度を測定した。即ち、プルラナーゼによる酵素消化反応の前後で多糖量を測定し、酵素処理後の多糖量（プルラナーゼにより消化されない多糖量）と酵素処理前の多糖量とから生成多糖のプルランに対する純度を算出した。以下に多糖量の測定方法を詳述する。
先ず、プルラナーゼ酵素希釈液５０μＬにクエン酸Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸−２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０））２ｍＬを加えたものを酵素溶液とした。ポジティブコントロールとして、プルラン（東京化成工業社製）を１０ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液を標準サンプル溶液として用いた。培養液あるいは標準サンプルを３０μＬずつ、２本のサンプルチューブ（１．５ｍｌ容量）に量り取り、一方に酵素溶液３０μＬを加え、一方にＰＢＳ３０μＬを加え、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、各サンプルに、３倍量のエタノールを加えた。良く攪拌し、−１５℃にて１０分間インキュベートした後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を捨て、チューブを乾燥させ沈殿を得た。沈殿に蒸留水１００μＬを加え、撹拌し、５重量％フェノール水溶液１００μＬを加え、速やかに硫酸５００μＬを加え発色させた。冷却後、９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ分注し、蒸留水に５重量％フェノール水溶液及び硫酸を添加した場合をブランクとして、４９０ｎｍの吸光度を測定した。また、プルランを１０ｍｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌに希釈した溶液で検量線を作成した。該検量線と上記吸光度とから、酵素消化反応前後の培養液中の多糖量をそれぞれ定量し、培養液中に存在する多糖のプルランに対する純度を算出した。なお、標準サンプルであるプルラン溶液を酵素消化した場合、１０ｍｇ／ｍｌ溶液では９０％以上の消化率が、１ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液では９５％以上、０．１ｍｇ／ｍｌ以下では９８％以上の消化率が得られた。以上のように、プルランが生成している場合は、プルラナーゼの作用により、酵素処理後のフェノール硫酸値（吸光値）は低値となり、例えば吸光値が５０％減少している場合は、多糖のプルランに対する純度は５０％と算出した。
【００６８】
〔実施例１〕
３０ｍｌ容量の試験管にＹＭ培地（ディフコ社）５．５ｍｌを入れ、滅菌後（１２１℃、２０分間）、冷却してから、ＹＰＤ寒天培地（ディフコ社）のスラントにて保存してあるＡＤＫ−３４菌株を一白金耳、植菌し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で４日間培養し、種培養液を得た。別の試験管にクザペック培地（ディフコ社、シュークロース濃度３重量％）５．５ｍｌを入れ滅菌後、ＡＤＫ−３４菌株の種培養液５００μｌを添加（５％植菌）し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で４日間培養した。培養液は白色で顕著な粘性を有していた。培養後、培養液に等量の蒸留水を加え、１５分間、高圧蒸気殺菌してから、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離して多糖を含有する培養上清を得た。培養上清中のβグルカン量及び多糖のプルランに対する純度を分析例１及び分析例３の測定方法によりそれぞれ測定した。その結果、多糖のプルランに対する純度は１００％であり、βグルカン量から算出したβグルカンの対糖収率は４４％であった。なお、培養上清の４９０ｎｍによる吸光値は０．０３０であり、着色が抑制されていた。また、分析例２の測定方法によりβグルカンの分子量を測定したところ、分子量は１５万〜２００万を示した。
同様の方法でＩＦＯ−６３５３株を培養し、βグルカン量及び多糖のプルランに対する純度を測定したところ、多糖のプルランに対する純度は４０％、βグルカンの対糖収率は１１％と算出された。なお、培養上清の４９０ｎｍによる吸光値は０．１９０であり、着色が認められた。
【００６９】
〔実施例２〕
イースト窒素源基礎培地粉末（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammmonium Sulfate：ディフコ社）１．７ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解させ、フィルター滅菌した。硝酸ナトリウム５ｇを５００ｍｌの蒸留水に溶解し、２倍濃度の硝酸ナトリウム溶液を調製した。炭素源として、シュークロース、グルコース、フラクトース、可溶性デンプン又はマルトース（和光純薬工業）を用いて、１２重量％炭素源水溶液をそれぞれ調製した。硝酸ナトリウム、炭素源水溶液及び蒸留水をオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ．）し、滅菌済みの試験管に、イースト窒素源基礎培地１ｍｌ、硝酸ナトリウム溶液５ｍｌ、炭素源水溶液２．５ｍｌ及び蒸留水１．５ｍｌ加え、全量を１０ｍｌとし、各炭素源を添加した炭素源チェック培地を調製した。
３０ｍｌ容量の試験管に、ＹＭ培地（ディフコ社）５．５ｍｌを入れ、滅菌後（１２１℃、２０分間）、冷却してから、ＹＰＤ寒天培地（ディフコ社）のスラントにて保存してあるＡＤＫ−３４菌株を一白金耳、植菌し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で４日間培養し、種培養液を得た。得られた種培養液を上記炭素源チェック培地に植菌し、３００ｒｐｍの振とう培養器にて２６℃で５日間培養した。培養液は白色で顕著な粘性を有していた。培養後、培養液に等量の蒸留水を加え、１５分間、高圧蒸気殺菌してから、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離して多糖を含有する培養上清を得た。培養上清中のβグルカン量及び多糖のプルランに対する純度を分析例１及び分析例３の測定方法によりそれぞれ測定した。測定結果を表１１に示す。表１１から明らかなように、どの炭素源においても、多糖のプルランに対する純度は９０％以上であり、βグルカンの対糖収率は２０〜４６％と算出された。なお、培養上清の４９０ｎｍによる吸光度は０．０２６〜０．０４１であり、着色が抑制されていた。また、分析例２の測定方法によりβグルカンの分子量を測定したところ、分子量は１５万〜２００万であった。
【００７０】
【表１１】
〔実施例３〕
ＡＤＫ−３４株をＹＭ培地に植菌し、２６にて３日間培養して、３００ｍｌの種培養液を得た。フルゾーン翼を搭載した５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社）に、クザペック培地３Ｌ及びシュークロース３００ｇを入れ、滅菌・冷却後、１００ｍｌの種培養液を植菌し、２６℃にて７２時間の培養を実施し、培養液３Ｌを得た。培養液を８０℃にて３０分間加熱して、殺菌した後、等量の蒸留水を添加し、よく混合してから、８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、培養希釈液を得た。培養希釈液をさらに蒸留水で５倍希釈し、吸光度を測定したところ、４９０ｎｍにおいて０．０２３であった。培養希釈液１００ｍｌに等量のエタノールを添加し、得られた沈殿を分離し、エタノールで洗浄し、そのまま５０ｍｌの蒸留水に溶解させた。この操作を再度繰り返し、透析膜（分子量３０００カット）に入れ１０倍量の蒸留水で透析を実施した。最終的に１００ｍｌの多糖溶液を得た。このときのβグルカン量は２５ｍｇ／ｍｌ、多糖のプルランに対する純度は９５％、βグルカンの分子量は１５万〜２００万と算出された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、βグルカンを効率よく高い生産速度で製造するのに有用な新規な微生物、及び該微生物を用いたβグルカンの製造方法を提供することができる。
【００７３】
【配列表】
Claims (7)
- １８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１７３２塩基の配列が、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含み、さらに抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有し、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有するアウレオバシジウム プルランス（ Aureobasidium pulullans ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株である微生物。
- ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５６３塩基の配列が、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ、βグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有するアウレオバシジウム プルランス（ Aureobasidium pulullans ）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株である微生物。
- 抗生物質であるシクロヘキシミド（cycloheximide）に対する抵抗性を有する請求項２記載の微生物。
- その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカンを菌体外に分泌生産する能力を有する請求項１〜３のいずれかに記載の微生物。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の微生物を培養し、βグルカンを菌体外に分泌生産させることを特徴とするβグルカンの製造方法。
- 微生物の培養を、炭素源として糖類を含有する培養液を用いて行なう請求項５記載のβグルカンの製造方法。
- アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pulullans）ＡＤＫ−３４（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３２）菌株を培養することによって菌体外に分泌生産され、
培養液を適当に希釈し、菌体を遠心分離（１００００ｘｇ、１０ｍｉｎ．）にて除去した培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が、同様に培養して得たＩＦＯ−６３５３株の培養希釈液の４９０ｎｍにおける吸光度が０．１以上を示す条件において、０．０９９以下であり、
その構造に少なくともβ−１，３−Ｄ−グルコピラノース結合を有するβグルカン。
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