JP4070394B2 - ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ - Google Patents
ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本明細書に記載および特許請求される発明は、ライム病に関連するボレリア(Borrelia)生物体に対する増幅オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブの設計および使用に関し、それらは例えば、組織試料および体液からの、および培養物からの試験試料中の生物体の検出を可能にする。
【0002】
【従来の技術】
ライム病は北アメリカ、欧州および温帯気候を持つ世界の他の地域において、しばしば診断されるヒト疾患であり、最も流行しているダニ媒介疾患である。A.G.Barbour & D.Fish,Science 260:1610−16(1993);J.F.Anderson,Rev.Insect Dis.11:51451−59(1989);A.C.Steere,N.Engl.J.Med.,331:586−96(1989)を参照されたい。ライム病またはライムボレリア病はボレリアスピロヘータにより引き起こされる多段階感染である。ボレリア生物体は感染したマダニ属のダニによりヒトおよび動物へ伝搬される。白尾シカおよび白足マウス(ペロミスカス ロイコパス)が各々自然における成虫ダニおよび幼虫型の一次保有体である。
【0003】
ヒトおよび動物におけるライムボレリア病の感染は感染の段階に依存して多くの異なった臨床症状発現を起こす。ヒトの初期感染は通常、遊走性紅斑と称される特徴的な皮膚発疹を伴うインフルエンザ様の病気である。遊走性紅斑は遠心的に広がり、通常環状の形をしている。遊走性紅斑は通常、ダニに咬まれた後1−5週間以内に現れ、数週間または数カ月後に自然に消散する。H.W.Pfisterら、Lancet 343:1013(1994)を参照されたい。
【0004】
ボレリア感染後数週間から数カ月以内に、感染は脳、神経、眼、関節および心臓を含む種々の器官に広がるであろう。この感染の広がりは疾患のII期が進行状態にあることを示している。ライムボレリア病の神経学的特色には髄膜神経根神経炎(バンワース症候群)、髄膜炎、顔面神経の脳神経炎、神経叢神経炎、多発性単神経炎、および希に、脳炎、脊椎炎、心血管炎、CSFリンパ球多サイトーシスが含まれる。
【0005】
ライム心臓炎は重度の病態であり、一般に種々の程度の過渡的な房室ブロック、周期障害心筋心臓炎および心不全を特徴とする。ライム心臓病の共通の徴候には動悸、胸部不快感、息切れ、運動時のめまい感およびアダムス−ストークス発作が含まれる。
【0006】
筋骨格系のライムボレリア感染は筋痛炎症性ではない関節炎、関節炎、筋炎、およびリンパ節症のような徴候を起こす。眼へのボレリア感染は結膜炎、虹彩毛様体炎、脈絡膜炎、瞳孔浮腫を伴う視神経障害、汎眼球炎のような徴候を起こす。他の器官への感染では肝腫、肝炎、咳および精巣膨潤が起きるであろう。
【0007】
感染して数カ月から数年後、慢性的な器官障害が起こり、ライムボレリア病がIII期に入ったことを示している。この段階の徴候には慢性関節炎、単関節関節炎、少数関節関節炎、慢性萎縮性先端皮膚炎、脳炎、筋炎、角膜炎、慢性多発性神経炎および拡張型心筋症が挙げられる。
【0008】
ライムボレリア病を起こすことが知られているボレリアスピロヘータは最初はボレリア ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)と称されていたが、現在は三つの主なゲノム種に分類されている。R.T.Marconi & C.F.Guron,J.Clin.Microbiol.,30:2830−34(1992)を参照されたい。一つの群は種呼称B.ブルグドルフェリを保持しており、第二の群はボレリア ガルニー(Borreliagarnii)と名付けられており、第三の群は種の名前が未だ帰属されていず、VS461と称されている。
【0009】
別のボレリア種、B.ヘルムシー(hermsii)はB.ブルグドルフェリと非常に近縁であるが異なったヒト疾患(回帰熱)に関連している。B.ヘルムシーはDNAハイブリダイゼーションによりB.パルヘリ(parheri)およびB.トゥリカテ(turicatae)と同一の種に属していると特性付けられているが、各々は特定の節足動物ベクターに特異的である(Barberi& Hayes,Microbiol Reviews 50:391−400,1986)。二つの他のボレリア種B.アンセリナ(anserina)およびB.コリアセエ(coriaceae)はB.ブルグドルフェリと非常に近縁であるが、ヒトに対して感染性ではない。
【0010】
ボレリア生物体は他のスピロヘータのように波打った形および鞭毛を持っている。A.G.Barbour & S.F.Hayes,Microbiol.Rev.,50:381−400(1986)。これらの生物体はまた、染色体および環状というよりむしろ線状のいくつかの染色体外要素も持っている。A.G.Barbour & C.F.Garon,Science,237:409(1987)。いくつかの表面露出リポ蛋白質、OspAおよびOspBが同定されており、血清学的実験室試験において抗原マーカーとして使用された。
【0011】
体液からのボレリア生物体の培養は困難であり、培養によるライムボレリア病の微生物学的診断を不十分なものにしている。B.ブルグドルフェリを検出するための血清学的試験が開発されており、酵素結合免疫吸着アッセイ[ELISA]、間接免疫蛍光アッセイ(IFA)およびウェスタンブロッティングが挙げられている。M.G.Golightly,Am.J.Clin.Pathol.,99:168−74(1993)を参照されたい。しかしながら、これらの血清学的試験では標準化が難しく、偽りの陽性および偽りの陰性結果を与えるのでその有効性は制限されている。Barbour,Ann.Intern.Med.,110:504(1989)を参照されたい。
【0012】
感染初期(I期)またはII期の患者では抗体が検出可能なレベルには達していず、トレポネマ(Treponema)またはライム病と関連しない他のボレリアとの交差反応が起こるであろう。抗生物質による処置はライムボレリア病患者における検出可能な抗体の発生を妨げまたは遅延させるであろう。これらの欠陥は、ライムボレリア病の診断および処置における血清学的試験の有用性および信頼性を制限する。
【0013】
感染作因の認識のためのプローブとして特異的ヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドの使用は問題のある免疫学的検出アッセイの代替物になってきている。ボレリアのゲノムおよびプラスミドDNA配列の両方の少なくとも一部が得られている。Schwanら、J.Clin.Microbiol.,27:1734(1989);Schwanら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,539:419(1988)を参照されたい。B.ブルグドルフェリの直線状プラスミドから誘導された核酸ハイブリダイゼーションプローブが製造され、多数のボレリア種からのB.ブルグドルフェリの同定に使用された。しかしながら、これらのプローブはそのヌクレオチド配列が時間が経つと不安定になり、または病原性ボレリア単離物には存在しないかもしれないプラスミドから誘導されているので生来的に制限されている。特異的ボレリア遺伝子を標的とする他の核酸ハイブリダイゼーションプローブもまた、標的とされた遺伝子の進化的安定性の程度に依存して生来的に制限されている。例えば、Malloyら、J.Clin.Microbiol.,28:1089(1990);Lebachら、J.Clin.Microbiol.,29:731−737;およびGoodmanら、Infect.Immun.,59:269−278(1991)を参照されたい。
【0014】
無作為にクローン化したB.ブルグドルフェリDNA配列が核酸プライマーを構築するのに使用され、これらのプライマーがB.ブルグドルフェリの標的DNA配列の増幅に使用された。Rosaら、J.Infect.Dis.,160:1018(1989)を参照されたい。しかしながら、B.ブルグドルフェリ単離物の全ては検出されず、ライム病を起こす全てのB.ブルグドルフェリを検出するためには不十分な核酸プライマーであった。
【0015】
FukunagaおよびSohnaka、Biophys.Res.Comm.,183:952−57(1992);およびPosticら、Res.Microbiol.,141:465−475(1990)によりB.ブルグドルフェリのリボソームRNA(rRNA)遺伝子の地図が作製され、クローン化された。B.ブルグドルフェリは染色体当たり23S RNA遺伝子の二つのコピーおよび16S rRNAをコードしているたった一つのコピーのみを含んでいるようである点において通常と異なっている。(Fukunagaら、J.Gen.Microbiol.,138:871−877,1992)。ボレリア16S RNAの配列が培養B.ブルグドルフェリ生物体を検出できたハイブリダイゼーションプローブの設計に使用された。Marconiら、J.Clin.Microbiol.,30:628−32(1992)を参照されたい。生物体を培養せずに臨床試料中のB.ブルグドルフェリを検出することに対するこのプローブの有用性は証明されていない。
【0016】
これらの制限を克服するため、ボレリア16S rDNAを増幅するための広範囲の特異性を持つプライマー対を用いたリボソームRNA配列の核酸増幅が記載されている。Malloyら、J.Clin.Microbiol.,28:1089−93(1990)を参照されたい。しかしながら、使用された核酸プライマーはS.オーレウス(aureus)およびP.アエルギノサ(aeruginosa)をもまた増幅し、従ってボレリア ブルグドルフェリに特異的ではなかった。
【0017】
16S rRNA配列由来の四つの組のプライマーが三つの異なったボレリアゲノム群のDNAを増幅するのに使用された。R.T.MarconiおよびC.F.Baron,J.Clin.Microbiol.,30:2830−34(1992)を参照されたい。ボレリア16S rRNAの819−842および1153−1173位由来のたただ一つのプライマーの組のみが試験された種々の培養ライム病単離物中に存在するすべてのボレリア生物体を検出した。他のプライマーの組はライム病ボレリアの三つすべてを認識しなかったかまたはライム病に関係しないボレリアをも認識した。その他のプライマーの組は臨床単離物から培養された種々のボレリア生物体のすべてを増幅しなかった。16S rRNA配列および16S rRNA遺伝子のV4領域が変化したボレリア ブルグドルフェリのサブタイプの増幅はAdamら、Infec.Immun.,59:2579−85、により記載されている。PCRプライマーがB.ブルグドルフェリの23S rRNAの特異的領域を増幅するためおよびボレリアの他の種からそれを区別するために使用された。Schwartzら、J.Clin.Micro.,30:3082(1992)を参照されたい。
【0018】
ボレリア16S rRNA配列に相補的な他のプローブがWeisburg、EPO公開番号EPO 0421 725A号、出願番号第90310766.2号、により記載されている。WhiteおよびDodge、PCT US91/01574号、はB.ブルグドルフェリおよびB.ヘルムシーの16S rRNA遺伝子由来のプライマーおよびプローブを開示している。
【0019】
ライム病の血清学的検出および同定において現在は制限があるため、ライム病に関連するボレリアのすべての地理的単離物を検出するための感度のよい方法に対する要望が存在する。
【0020】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はボレリアのrRNA(リボソームRNA)またはrDNA(リボソームDNA)ヌクレオチド配列の特定の領域に相補的であるように設計された新規かつ有用な増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ、またはボレリアrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列またはその相補体の特定の部分に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを開示し、特許請求している。これらの増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブは病原性ボレリアの16Sおよび23S rRNA由来であるので、これらのrRNA遺伝子から発現されたRNAのレベルがより高くなり、核酸配列の変化の速度が遅く、および生物体間でのrRNA配列の側方伝達がなくなるためより優れた検出アッセイが得られる。
【0021】
増幅オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブはストリンジェントハイブリダイゼーションアッセイ条件下、標的ボレリア16Sおよび23S rRNAおよび/またはrDNA遺伝子配列にハイブリダイズすることにより機能する。好適な態様において、本明細書に記載したプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドはボレリア ブルグドルフェリ、ボレリア ガルニーおよびVS461群のボレリアを含むライム病関連ボレリアを、血液または組織のような臨床試料中に観察される他の微生物および他のボレリア種から区別できる。従って、本増幅オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブはライム病関連ボレリアを特異的に検出および/または定量するためのアッセイに使用されるであろう。好適な態様において、本明細書に記載したハイブリダイゼーションアッセイプローブはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ライム病関連ボレリアからの核酸に選択的にハイブリダイズすることができ、ボレリア ヘルムシーからの核酸にはハイブリダイズしない。本発明のいくつかの態様において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同定を助けるため、アクリジニウムエステルまたは放射性同位元素のようなレポーター基を含むオリゴヌクレオチドから成っている。本発明のいくつかの態様において、増幅オリゴヌクレオチドは随意にRNAポリメラーゼにより認識されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核酸配列を持っているものである。
【0022】
本発明はライム病関連ボレリアおよびボレリア ヘルムシーからの核酸の存在を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特色とする。好適には、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列から選択される:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【0023】
本発明はライム病関連ボレリアからの核酸の存在を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特色とする。これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは、好適には以下のヌクレオチド配列から選択される:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
【0024】
本発明はまたボレリア ヘルムシー核酸を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブも特色とする。好適には、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列の一つから選択されるヌクレオチド配列を持っている:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【0025】
本発明の別の態様は本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブと一緒にヘルパーオリゴヌクレオチド(プローブ)を含むプローブ混合物である。好適には、ヘルパーオリゴヌクレオチドは標的核酸へのアッセイプローブの特異的ハイブリダイゼーションを容易にするために使用される;ヘルパーオリゴヌクレオチドは本明細書において援用され、本発明と共通の所有権を享有するHoganおよびMillimanの米国特許第5,030,557号に記載されている。本発明においてヘルパープローブとして使用されるオリゴヌクレオチドには以下の配列が含まれる:
配列ID番号3:TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号14:UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG
配列ID番号15:CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【0026】
本発明の別の態様はライム病関連ボレリアを検出するための組成物であり、それは本発明のオリゴヌクレオチドとライム病関連ボレリアからのヌクレオチドポリマーの特定の領域との間で形成された核酸ハイブリッドである。一般的に、ヌクレオチドポリマーは本発明のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体に実質的に対応する核酸配列を含んでおり、ボレリアのリボソームRNAをコードしているrRNAまたはrDNAから誘導される。これらの組成物に存在するオリゴヌクレオチドは増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、またはそれらの混合物であろう。従って、本発明の組成物は一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、一つまたはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび一つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプローブを含んでいるであろう。
【0027】
その標的配列へハイブリダイズしたプローブを含んでいる本発明の組成物は核酸配列の存在を検出するために有用である。その標的核酸配列へハイブリダイズしたヘルパーオリゴヌクレオチドを含んでいる本発明の組成物はハイブリダイゼーションに利用可能な標的核酸配列の特定の部分を作るために有用である。その標的配列へハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいる本発明の組成物はプライマーの3’末端にポリメラーゼのための開始部位を作り出すために有用である。
【0028】
本発明はライム病に関連したボレリアの存在を検出するための方法もまた企図しており、核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブがボレリア ブルグドルフェリ標的核酸配列へハイブリダイズできるがボレリア ヘルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズしないストリンジェントハイブリダイゼーションアッセイ条件下、試験試料を核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる。本発明はまたこれらの方法で使用されるオリゴヌクレオチドおよびその均等物も企図しており、それらは標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同定の助けとなるレポーター分子を随意に含んでいる。本発明は血液、血液由来試料、組織、組織由来試料、他の体液および身体試料のようなヒトからの試験試料におけるボレリア核酸の存在を検出するのに有用である。
【0029】
核酸が少なくとも一つの本発明の増幅オリゴヌクレオチドを用いて増幅される、ライム病関連ボレリアの存在を検出するための方法も本発明はまた企図している。好適な態様において、そのような増幅後に検出工程が続いており、そこでは本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて増幅された核酸が検出される。本発明の方法はまた、RNAプロモーターのためのヌクレオチド配列を含む増幅オリゴヌクレオチドの使用も企図している。
【0030】
別の態様において、本発明は増幅アッセイにおける、ボレリア ブルグドルフェリを含むライム病関連スピロヘータの検出に有用な増幅オリゴヌクレオチドを特色としている。そのようなオリゴマーは好適には以下の配列の一つに実質的に対応している:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
配列ID番号46:CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA
配列ID番号47:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC
および
配列ID番号50:CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
ここで、オリゴマーは修飾されていなくてもよいし、またはRNAポリメラーゼにより認識される5’末端への特異的核酸配列(T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列が挙げられるが、これらに制限されるわけではない)、および/またはRNAポリメラーゼによりRNA転写の開始または伸長を促進する配列の付加のような修飾を含んでいてもよい。プロモーター配列の一つの例としては、
配列ID番号:43、5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'が挙げられる。有用なプロモーター配列の別の例には、例えば、Stratagene Cloning SystemsからのpBluescriptRベクターまたはPromega Biotec.からのpGEMTMベクターを含む種々の市販品として入手可能なベクターが含まれる。
【0031】
本発明の別の態様において、増幅オリゴヌクレオチドは以下の配列に実質的に対応する配列を介して結合するかまたは配列の伸長を起こす:
配列ID番号36:ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT
配列ID番号37:TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATAGAGGAAG
配列ID番号38:TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGGGTGG
配列ID番号39:ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT
配列ID番号40:CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG
配列ID番号41:GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC
配列ID番号42:CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号51:ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU
配列ID番号52:UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUAGAGGAAG
配列ID番号53:UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGGGUGG
配列ID番号54:ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU
配列ID番号55:CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG
配列ID番号56:GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG
および
配列ID番号57:CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG。
【0032】
本発明の別の態様は、増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む一つまたはそれ以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットを含んでいる。好適な態様において、本発明のキットは少なくとも一つの増幅オリゴヌクレオチド、および他の微生物および他のボレリア種からライム病関連ボレリアを区別できる一つのハイブリダイゼーションアッセイプローブを含んでいる。
【0033】
特定の核酸配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションの使用の基礎的な記述は、Kohne(1989年7月25日に公開された米国特許第4,851,330号)およびHoganら(”非ウイルス生物体の検出および/または定量のための核酸プローブ”と題された国際特許出願番号PCT/US87/03009)により与えられている(両方の参照文献とも本明細書において援用される)。Hoganらは(上記文献)試料(例えば、痰、尿、血液および組織切片、食品、土壌および水)中の非ウイルス生物体または非ウイルス生物体の群の存在を決定するための方法を記載している。
【0034】
【課題を解決するための手段】
A.定義
以下の用語は特別に異なった意味を持つように指示しない限り、本明細書においては指示された意味を持っている。
【0035】
”標的核酸”とは標的ヌクレオチド配列を持っている核酸を意味している。
”オリゴヌクレオチド”とはお互いに共有結合で結合された二つ以上のヌクレオチドサブユニットから作製された一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味している。好適には、10から100の間のヌクレオチドユニットが存在し、より好適には12から50の間のヌクレオチドサブユニットがお互いに結合されている。ヌクレオチドサブユニットの糖部分はリボースでも、デオキシリボースでも、または0−メチルリボースのようなそれらの修飾誘導体でもよい。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットはホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨害しない他の希なまたは天然に存在しない結合により結合されているであろう。さらに、オリゴヌクレオチドは普通には存在しないヌクレオチドまたは非ヌクレオチド残基を持っていてもよい。本明細書で定義されるように、オリゴヌクレオチドは核酸であるが(好適にはDNA)、RNAまたは共有結合で結合されたリボ−およびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせでもよい。決められた配列のオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドは、化学的または生化学的合成および例えば、細菌またはレトロウイルスベクターのような組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によるような当業者には既知の技術により製造される。本開示により意図されるように、オリゴヌクレオチドは野生型染色体DNAまたはそのインビボ転写生成物からは成っていない。プローブの一つの使用はハイブリダイゼーションアッセイプローブとしてであり;プローブは病気にかかった、感染したまたは病原性の細胞においての遺伝子転写または翻訳を阻止または阻害するためのインビボまたはインビトロ治療増幅オリゴマーまたはアンチセンス剤としても使用されるであろう。
【0036】
”標的核酸配列”、”標的ヌクレオチド配列”または”標的配列”とは一本鎖核酸分子の全部または一部のヌクレオチド配列およびそれらに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列からなる特異的デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味している。
【0037】
核酸ハイブリダイゼーションとは、完全にまたは一部が相補的であるヌクレオチド配列を持つ二つの核酸鎖が前もって決定された反応条件下でお互いに一緒になって特異的水素結合を持つ安定な二本鎖ハイブリッドを形成する過程である。
【0038】
どちらの核酸鎖もデオキシリボ核酸(DNA)かまたはリボ核酸(RNA)であり;従ってハイブリダイゼーションによりRNA:RNAハイブリッド、DNA:DNAハイブリッドまたはRNA:DNAハイブリッドが生成する。
【0039】
本明細書で使用する場合の用語”ハイブリダイゼーション”とは二つの相補的または部分的に相補的な一本鎖核酸が逆平行配位で一緒になって二本鎖領域を持つ安定な構造を形成する能力を指している。この二本鎖構造(しばしばハイブリッドと呼ばれる)の構成鎖は水素結合によりお互いに保たれている。これらの水素結合は一本鎖核酸上に塩基アデニンおよびチミンまたはウラシル(AおよびTまたはU)またはシトシンおよびグアニン(CおよびG)を含むヌクレオチド間で最も普通に形成されるが、これらの”規範的”対の構成要素ではない塩基間でも塩基対形成は形成できる。非規範的塩基対形成は本分野ではよく知られている。例えば、The Biochemistry of the NucleicAcids(Adamsら、編、1992)を参照されたい。
【0040】
”ストリンジェント”ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが他の微生物(例えば、ボレリア ヘルムシー)またはヒトに由来する試験試料中に存在する他の核酸の中で標的核酸(好適にはライム病関連ボレリアのrRNAまたはrDNA)とハイブリダイズできる条件を意味している。これらの条件は、GC含量およびプローブの長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成、および考えられたハイブリダイゼーション特異性の程度を含む因子に依存して変化するであろうことが理解されるであろう。特異的ストリンジェント条件は以下の開示で提供される。
【0041】
”プローブ”とは検出されるべきと考えられた核酸配列にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするようにその配列と部分的または完全に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドを意味している。用語”プローブ”では天然に存在する核酸は除かれる。精製されたオリゴヌクレオチドプローブは化学合成および組換え核酸分子(例えば、レトロウイルスベクター)からのインビトロおよびインビボ発現のような本分野で知られている技術により製造される。好適には、プローブは10から100ヌクレオチドの長さである。プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションに実質的に影響を与えない限り、標的配列に相補的でない領域を持っていてもよい。もしそのような領域が存在するならば、それらはRNA転写のための5’プロモーター配列および/または結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むか、またはプローブまたは標的核酸上に、またはその両方に触媒活性部位またはヘアピン構造のような所望の二次または三次構造を与えるであろう配列を含んでいるであろう。プローブが標的配列へハイブリダイズしたことを検出または確認するために使用できる放射性同位元素、蛍光または化学発光残基のようなレポーター基残基、酵素または他のリガンドで修飾されているであろう。
【0042】
本開示において使用される特異的配列の群”より選択される配列から本質的に成る核酸配列を持つプローブ(またはオリゴヌクレオチド)”という句は、そのプローブが(基本的はおよび新規で特徴的なものとして)ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、掲げた核酸配列の群の一つの配列の正確な相補体を持つ核酸へ安定にハイブリダイズできることを意味している。正確な相補体には対応するDNAまたはRNA配列が含まれる。
【0043】
句”核酸配列に実質的に対応している”とは引き合いに出された核酸は十分に核酸配列と類似しており、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、同一の標的核酸配列とハイブリダイズするであろうという点で引き合いに出された核酸は核酸配列と類似のハイブリダイゼーション特性を持っている。
【0044】
本発明の実質的に対応するプローブおよびプライマーは引き合いに出された配列と変わっていてもよいが、依然として同一の標的核酸配列にハイブリダイズすることを当業者は理解するであろう。当業者はまた、この変異はプローブまたはプライマー中の同一でない塩基の数、または標的核酸配列の対応する塩基へハイブリダイズしないプローブの不適正塩基の数として表現できることも理解するであろう。本発明のプローブまたはプライマーは、もしこれらのパーセントが100%から80%であるか、または10ヌクレオチド標的配列中の不適正が0塩基から10ヌクレオチド標的配列中の不適正が2塩基であるならば実質的に対応している。
【0045】
好適な態様において、このパーセントは100%から85%である。より好適な態様において、このパーセントは90%から100%であり;別の好適な態様において、このパーセントは95%から100%である。当業者は受容不可能なレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを起こすことなく、特異的標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にする相補性の種々のパーセントで必要とされるであろうハイブリダイゼーション条件の種々の変更を理解するであろう。
【0046】
”核酸ハイブリッド”または”ハイブリッド”とは二本鎖、水素結合領域(好適には10から100ヌクレオチドの間の長さで、最も好適には約12から50ヌクレオチドの間の長さで)を含む核酸構造を意味しており、ここで各々の鎖は相手と相補的であり、およびこの領域は化学発光または蛍光光検出、オートラジオグラフィーまたはゲル電気泳動を含む(これらに制限されるわけではない)方法により検出されるようにストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で十分に安定である。そのようなハイブリッドはRNA:RNA、RNA:DNAまたはDNA:DNAデュープレックス分子から成っている。
【0047】
”相補的”とは二つの一本鎖核酸の類似の領域または同一の一本鎖核酸の異なった領域のヌクレオチド配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、一本鎖が一緒になって安定な二本鎖水素結合領域にハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成を持っていることを意味している。一つの一本鎖領域のヌクレオチドの隣接する配列が他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似の配列と一連の”規範的”水素結合塩基対(AはUまたはTと対合し、CがGと対合するような)を形成できるとき、ヌクレオチド配列は”完全に”相補的である。
【0048】
”保存的に修飾された変異体”とは別の核酸の核酸領域と相補的であるヌクレオチド配列を持っている核酸またはオリゴヌクレオチドを意味しており、そのような領域は順番に参照核酸と完全に相補的である。そのような保存的に修飾された変異体はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリアヌクレオチド配列を持つ標的核酸領域と安定にハイブリダイズできる。
【0049】
”増幅オリゴヌクレオチド”とは標的核酸配列とハイブリダイズでき、および核酸合成のためのプライマーまたは核酸合成開始のためのプロモーター鋳型(例えば、相補鎖合成のための、それにより機能性プロモーター配列が形成される)またはその両方として働くことができるオリゴヌクレオチドを意味している。もし増幅オリゴヌクレオチドがRNA合成を開始させるように設計されているとしたら、オリゴヌクレオチドは標的配列とは相補的ではないが、RNAポリメラーゼ(T7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼのような)により認識されるヌクレオチド配列を含んでいるであろう。増幅ヌクレオチドはプライマー伸長を阻害するまたはその量を少なくするように修飾された3’末端を持っていてもよいし、持っていなくてもよい。本明細書で定義されたように、増幅ヌクレオチドは好適には10から100ヌクレオチドの間の長さであろう;最も好適であるのは約12から50ヌクレオチドの間の長さであろう。本発明の増幅オリゴヌクレオチドは化学的に合成されるかまたはベクターから誘導されるが、そのようなオリゴヌクレオチドは天然に存在する核酸ではない。
【0050】
”核酸増幅”または”標的増幅”とは少なくとも一つの標的核酸配列を持つ核酸分子の数を増加させることを意味している。
”アンチセンス”または”負のセンス”とは参照核酸配列と相補的な核酸配列を持っていることを意味している。
【0051】
”センス”、”同一センス”または”正のセンス”とは参照核酸配列と類似の核酸配列を持っていることを意味している。
”ヘルパーオリゴヌクレオチド”とは標識プローブと異なった場所で標的核酸とハイブリダイズするように設計された核酸プローブを意味しており、それにより標識プローブのハイブリダイゼーション速度を増加させ、または標的:標識プローブハイブリッドの融解温度(Tm)を高め、またはその両方を行う。
【0052】
”ライム病関連ボレリア”とはライム病を起こすボレリア種であり、亞種ボレリア ブルグドルフェリ、ボレリア ガルニーおよびボレリアVS461が含まれる。典型的には、ライム病関連ボレリアはライム病に罹患した哺乳類から単離できる。
【0053】
”系統発生的に密接に関係した”とは生物体が進化的意味においてお互いに密接に関係しており、従ってより遠い関係の生物体より形態学における著しい類似性およびより高い全核酸配列相同性を持っているであろう。系統発生樹上で隣りおよび隣の次の位置を占める生物体は密接に関係している。系統発生樹上で隣りおよび隣の次よりさらに離れた位置を占める生物体は、もしそれらが著しい全核酸配列相同性を持っているならば密接に関係しているであろう。
【0054】
B.ハイブリダイゼーション条件およびプローブ/プライマー設計
ハイブリダイゼーション反応条件(ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩濃度が最も重要)は本発明の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブが標的ボレリアヌクレオチド配列を持つ核酸と優先的にハイブリダイズ可能にし、試験試料中に存在していると疑われる他の選ばれていない核酸とはハイブリダイズしないように選択できる。塩濃度が減少および/または温度が上昇(ストリンジェンシーの増加と呼ばれる)すると、二本鎖ハイブリッド分子において対合したヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されるので核酸ハイブリダイゼーションの程度が減少する;この過程は”融解”と呼ばれている。
【0055】
一般的に言って、最も安定なハイブリッドは最も多くの隣接する完全に一致した(即ち、水素結合された)ヌクレオチド塩基対を持つものである。従って、そのようなハイブリッドは通常ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増加させた場合最も遅く融解することが期待されるであろう。しかしながら、一つまたはそれ以上の不適正な(”非規範的”)または不完全な塩基対(核酸のヌクレオチド配列のその位置でより弱い塩基対合を生じるかまたは塩基対合が存在しない結果を生む)を含む二本鎖核酸領域は、それでも試験試料中に存在する他の選ばれていない核酸と交差反応することなくハイブリダイゼーションアッセイで検出されるべき核酸ハイブリッドを与える比較的高いストリンジェンシー条件下で十分に安定である。
【0056】
これ故、標的核酸のヌクレオチド配列および系統発生的に別個のものに属するが一方密接に関係した非標的核酸のヌクレオチド配列間の類似性の程度、および特定の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列および他の標的および非標的核酸のヌクレオチド配列間の相補性の程度に依存して、一つまたはそれ以上の不適正は標的核酸へハイブリダイズし、非標的核酸へハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの能力を必ずしもくじくわけではないであろう。
【0057】
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブはプローブ:標的ハイブリッドの融解温度(Tm、与えられた反応混合物中の潜在的二本鎖分子の半分が一本鎖の変性された状態にある温度として定義される)およびプローブと試験試料中に存在すると予想される系統発生的に最も密接に関係した生物体のrRNAまたはrDNA(検出されるべきとは求められていない)のTm間の相違が最大になるように選択、抜粋および/または設計された。非標識増幅オリゴヌクレオチドおよびヘルパーオリゴヌクレオチドは本発明で有用な標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブのように非常に高程度の特異性を持つ必要はないので、それらは他の核酸を制して一つまたはそれ以上の標的核酸へ優先的にハイブリダイズするための同様の方法で設計された。
【0058】
原核生物のヌクレオチド配列は5S、16Sおよび23S rRNAをコードしているrRNA遺伝子を含んでいる。レプトスピラ、レプトネマ、セルピュラ、スピロヘータおよびトレポネマ16S核酸配列のリボソームRNA遺伝子(rRNA)のボレリア核酸配列もまた比較のために使用された。ボレリア核酸配列情報は実験室での研究および発表された論文(MarconiおよびGaron、J.Gen.Microbiol.138:533−536(1992);Pasterら、J.Bacteriol.173:8181−6109(1991);MarconiおよびGaron、J.Bacteriol.174:241−244(1992);Marconi & Garon、J.Clin.Microbiol.30:2830−34(1992);Davidsonら、J.Bacteriol.174:3776−74(1992))から得られた。
【0059】
プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドとして使用されるべき核酸配列の同定を容易にするため、生物体の異なった種からのヌクレオチド配列を最初に整列させて相同性を最大限に活用した。rRNA分子内では、全体にわたる構造および機能間に緊密な関係が存在する。このことは一次配列の進化的変化に制限を賦課し、そのため二次構造が維持されている。例えば、もしヘリックスの一つの側で塩基が変化していると、相補性を保存するために他の側に補償する変化がなされている(このことは共変異と呼ばれている)。このことは保存された一次配列におよび保存された二次構造要素に基づいて整列されるべき二つの非常に異なった配列を可能にする。ハイブリダイゼーションプローブのための可能性のある標的配列は整列させた配列の相同性の変異に注目して同定された。
【0060】
変異領域の各々での配列進化はほとんど分岐的である。分岐のため、ライム病関連ボレリアのより遠い系統発生的関係種は系統学的により近い関係種よりも変異領域により大きな変異性を示す。ライム病関連ボレリアおよび同一の試料中に観察されるであろう他のボレリア種の間に、好適な標的部位を同定および有用なプローブを設計するための十分な変異が観察された。
【0061】
ライム病に関連するボレリア種と、文献で発表されているまたは実験室で決定されたrRNA配列の比較分析による他のボレリア種との間で変化している配列が同定された。本明細書で開示されている目的のために使用されるまたは適用されるであろうコンピューターおよびコンピュータープログラムは市販品として入手可能である。本プローブを設計するため、標的生物体および同一の試料中に観察されるであろう最も近い系統発生的関係種間に十分な変異が観察された。
【0062】
推定の独特で可能性のある標的ヌクレオチド配列を単に同定するだけでは、その配列を含むボレリアrRNAまたはrDNAへハイブリダイズする機能的な種特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが製作できることを保証してはいない。種々の他の因子が種特異的プローブのための標的部位としての核酸座の適性を決定するであろう。本明細書に記載したようなハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は多くの因子により影響されるため、一つまたはそれ以上のこれらの因子の操作が特定のオリゴヌクレオチド(その標的に完全に相補的であるにしろまたはないにしろ)の正確な感受性および特異性を決定するであろう。種々のアッセイ条件の重要性および影響はHoganら(本出願と同一の譲受人および本明細書において援用される)およびHoganおよびHammond、米国特許第5,216,143号(国際特許番号PCT/US87/03009号に譲渡されている)、Kohne、米国特許第4,851,330号により記載されているように当業者には知られている。
【0063】
例としては:可能な標的ヌクレオチド配列の(および従って二本鎖プローブ:標的ハイブリッドの)GC含量がより高いと一般的に安定性および従ってハイブリッドのTmが上昇する。一つまたはそれ以上の”選ばれなかった”生物体と同一である配列内のヌクレオチドの数もまた安定性、従って、ボレリアrRNAと完全に相補的であるプローブと選ばれなかった生物体(類)のrRNAヌクレオチド配列を持っている核酸の間の部分的に不適正なハイブリッドのTm’に影響する。
【0064】
ハイブリダイゼーションの望まれる温度およびハイブリダイゼーション溶液組成(濃度、界面活性剤および他の溶質のような)もまた二本鎖ハイブリッドの安定性に大きな影響を与える。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズされるであろう温度のような条件は、群−または種−特異的プローブの構築に考えに入れなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は一般に反応混合物のイオン強度の増加とともに増加する。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコールのような水素結合を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を非常に減少させることができる。
【0065】
標的に対するプローブの特異性を最大限に活用するため、本発明の目的プローブは高いストリンジェンシーの条件下で標的とハイブリダイズするように設計された。そのような条件下では程度の高い相補性を持つ核酸一本鎖のみがお互いにハイブリダイズするであろう;そのような程度の高い相補性を持たない核酸一本鎖はハイブリッドを形成しないであろう。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーはハイブリッドを形成するために二つの核酸鎖間に存在しなければならない相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸の間で形成されるハイブリッドおよびプローブと存在する任意の非標的核酸の間で形成される可能性のあるハイブリッドの安定性の相違を最大限に活用するように選択される。
【0066】
適切な特異性は、非標的生物体の配列に対する完全な相補性を持つプローブの長さを最少にすることにより、非標的配列に対する相同性のGおよびCが豊富な領域を避けることにより、および可能な限り非標的配列に対する多くの不安定化不適正を含むようにプローブを構築することにより達成される。プローブ配列が生物体の特定の型のみを検出するのに有効かどうかは、プローブ:標的ハイブリッド対潜在的プローブ:非標的ハイブリッド間の熱安定性の相違に大きく依存している。プローブの設計において、これらのハイブリッド間のTm値の相違は可能な限り大きくしなければならない(好適には約5℃またはそれ以上)。Tmの操作はプローブ長およびプローブ組成(GC含量に対するAT含量)を変化させることにより達成できる。
【0067】
一般に、約10−50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブに対する至適ハイブリダイゼーション温度は、与えられたデュープレックスに対する融解温度の約5℃下である。至適温度以下の温度でのインキュベーションは不適正塩基配列のハイブリダイズを可能にし、従って特異性を減少できる。プローブをより長くすると(塩基対間の水素結合が多くなる)、一般にTmが高くなる。また、GおよびCのパーセントを多くすると、G−C塩基対は追加の水素結合を示してA−T塩基対よりも熱安定性が大きくなるのでTmは高くなる。
【0068】
Tmを決定するための好適な方法では、”均一保護アッセイ”と題したArnoldら(上記文献)によるハイブリダイゼーション保護アッセイ(HPA)を用いてハイブリダイゼーションが測定される。Tmは以下の方法によりHPAを用いて測定できる。プローブ:標的ハイブリッドはコハク酸リチウム緩衝化溶液(0.1Mコハク酸リチウム緩衝液、pH5.0、2mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2mMエチレン グリコール−ビス(β−アミノ−エチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、10%(w/v)ラウリル硫酸リチウム)中、過剰量の標的を用いて形成させる。ハイブリッドの一部は次にクエン酸リチウム緩衝化溶液で希釈し、予期されるTm(典型的には55℃)より下の温度から始め、2−5℃づつ高くした種々の温度で5分間インキュベートする。この溶液は続いて温和なアルカリ性ホウ酸緩衝液(0.15M四ホウ酸ナトリウム、pH7.6、5%(v/v)TRITONR X−100)で希釈してより低い温度(例えば、50℃)で10分間インキュベートする。これらの条件下、一本鎖プローブに結合されているアクリジニウムエステルは加水分解されるが、一方ハイブリダイズされたプローブに結合されているアクリジニウムエステルは加水分解から比較的保護されている。従って、残存するアクリジニウムエステルはハイブリッドの量に比例し、過酸化水素続いてのアルカリの添加によりアクリジニウムエステルから発生される化学発光により測定できる。化学発光はルミノメーター(例えば、Gen−Probe LEADERRIまたはLEADERR50)により測定できる。得られたデータは温度に対して最大信号(通常最も低い温度)のパーセントとしてプロットする。Tmは残存する最大信号の50%を示す温度として定義される。上記の方法に加え、当業者にはよく知られている同位元素法(例えば、Hoganら、上記文献)によってもTmが決定されるであろう。
【0069】
与えられたハイブリッドのTmは使用されたハイブリダイゼーション溶液に依存して変化することに注意しなければならない。塩濃度、界面活性剤および他の溶質のような因子は熱変性の間のハイブリッド安定性に影響を及ぼすことができる(J.Sambrook,E.F.FritschおよびT.Maniatis,Molecular Cloning,11章(第ニ版、1989))。プローブの標的へのハイブリダイズに使用されるであろうイオン強度およびインキュベーション温度のような条件はプローブの構築の際に考えに入れなければならない。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキスドおよびアルコールのような水素結合を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を大きく減少させることができる。
【0070】
プローブがその標的に特異的であることを確かにするため、高いストリンジェンシーの条件下でのみハイブリダイズするプローブを持つことが望まれる。高ストリンジェンシー条件下では高度に相補的である核酸ハイブリッドのみが形成される;十分な程度の相補性のないハイブリッドは形成されないであろう。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーがハイブリッドを形成するための二つの核酸鎖間に必要とされる相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは標的および他の核酸配列で形成されるハイブリッド間の安定性の相違を最大にするように選ばれる。
【0071】
適切な特異性は、非標的核酸に対して完全な相補性の長さを最少にすることにより、非標的配列に対する相同性のGおよびCが豊富な領域を避けることにより、および可能な限り非標的配列に対する多くの不安定化不適正を含むようにすることにより達成される。プローブ配列が生物体の特定の型のみを検出するのに有効かどうかは、プローブ:標的ハイブリッドおよびプローブ:非標的ハイブリッド間の熱安定性の相違に大きく依存している。プローブの設計において、これらのTm値間の相違は可能な限り大きくしなければならない(好適には約5℃またはそれ以上)。
【0072】
標的核酸配列の長さ、および、従ってプローブ配列の長さもまた重要である。ある場合には、特定の領域、例えば、位置および長さが変化している変異領域からのいくつかの配列が存在し、それらから所望のハイブリダイゼーション特性を持つプローブが得られる。別の場合には、あるプローブが単一の塩基が異なっているヌクレオチド配列を持つプローブよりも著しく良好であろう。核酸はハイブリダイズするために完全に相同的ではなくてもよく、完全に相同的な塩基配列の最も長い広がりが一般的にハイブリッド安定性を決定し、塩基対の組成もまたそれに対して役割を果たしている。標的核酸配列の長さ、および、従ってプローブ配列の長さもまた重要である。ある場合には、特定の”変異”領域(位置および長さが変化している)からのいくつかの配列が存在し、それらは所望のハイブリダイゼーション特性を持つプローブの設計に使用される。
【0073】
本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは種々の長さである。好適なプローブは10から100ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである。
【0074】
ハイブリダイゼーションの阻害となる強い内部構造を形成するrRNA領域は、少なくともヘルパープローブが使用されないアッセイではより好ましくない標的領域である。同様に、強い自己相補性を生じるプローブ設計も避けるべきである。前に説明したように、ハイブリダイゼーションとは相補的核酸の二つの一本鎖が会合して水素結合で結合されたニ本鎖ハイブリッドを形成することである。従って、二つの鎖の一つが完全にまたは部分的に分子内または分子間ハイブリッドに含まれているとしたら、新しい分子間プローブ:標的ハイブリッドの形成に関与しにくいであろう。リボソームRNA分子は水素結合により非常に安定な分子内ヘリックスおよび二次構造を形成することが知られている。標的化された配列の実質的な部分がプローブとのハイブリダイゼーションまで一本鎖状態で残っているようにハイブリダイゼーションアッセイを設計することにより、プローブおよび標的間のハイブリダイゼーションの速度および程度が著しく増加するであろう。このことの一つの方法は、標的ヌクレオチド配列として分子内水素結合に含まれていない配列を選ぶことにより達成されるであろう。もしくはまたはさらに、標的部位をハイブリダイゼーションのためにハイブリダイゼーションアッセイプローブにより近づき易くするようにできるヘルパーオリゴヌクレオチドとのプローブ混合物としてハイブリダイゼーションアッセイプローブが使用される。
【0075】
DNA標的は自然にはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の生成物のようにニ本鎖の形で存在する。これらのニ本鎖標的は自然にはプローブとのハイブリダイゼーションには阻害的であり、ハイブリダイゼーションに先立って変性を必要とする。適した変性およびハイブリダイゼーション条件は本分野では既知である(例えば、E.M.Southern,J.Mol.Biol.98:503(1975))。
【0076】
その標的核酸へ完全に一致したオリゴヌクレオチドのために融解温度の推定値を提供するであろう多くの式が利用可能である。そのような式の一つ、Tm=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(分画G+C)−(600/N)(式中、N=ヌクレオチドの数でのオリゴヌクレオチドの長さ)は14から60または70ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドに対して良好な推定値を提供する。そのような計算から、続いての経験的確認またはTmの”微細な調整”が本分野ではよく知られているスクリーニング技術を用いて行われる。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報は、例えば、本明細書において援用されるSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989)を参照されたい(11章)。この参照文献は特に本分野でよく知られており、ハイブリッドのTmに対する不適正の影響の推定値も提供している。従って、二つまたはそれ以上の生物体のリボソームRNA(またはrDNA)の与えられた既知のヌクレオチド配列から、これらの生物体をお互いに区別するであろうオリゴヌクレオチドが設計される。
【0077】
C.核酸増幅
好適には、本発明の増幅オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによる伸長生成物合成のための基質として使用するのに十分な長さである。至適プライマー長は反応温度、構造およびプライマーの塩基組成およびいかにプライマーが使用されるべきかなどのいくつかの因子を考えに入れなければならない。例えば、至適特異性のためにはオリゴヌクレオチドプライマーは一般的には標的核酸配列の複雑さに依存して少なくとも約12のヌクレオチドを含んでいなければならない。もしそのような特異性が必須ではないなら、より短いプライマーが使用されるであろう;そのような場合、鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形成させるためにより冷たい温度で反応を実施することが望ましいであろう。
【0078】
所望の特性を持つ増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブのための有用なガイドラインが本明細書に記載されている。我々の最良の様式設計部位は、単一核酸分子の約15塩基より大きく約350塩基以内の、およびより好適には150保存ヌクレオチド以内のライム病関連ボレリア核酸の二つおよび好適には三つの保存領域を含んでいる。
【0079】
プライマーまたはプロモータープライマーの組で観察される増幅の程度は、その相補的配列へハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力および酵素的に伸長またはコピーされるそれらの能力を含むいくつかの因子に依存している。異なった長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドが使用できるが、本発明で好適なオリゴヌクレオチドは18−40塩基の標的結合領域を持ち、約65℃の標的との予想Tmを持っている。
【0080】
Tmのようなプローブのハイブリダイゼーションに影響するパラメーター、相補性および標的配列の二次構造もまたプライマーハイブリダイゼーションおよびその結果としての性能に影響する。非特異的伸長(プライマー−ダイマーまたは補標的のコピー)の程度もまた増幅効率に影響し、従ってプライマーは低自己−または交差−相補性を持つように選択される(特に配列の3’末端で)。長いホモポリマー領域および高GC含量は見せかけのプライマー伸長を減少させるために避けられる。設計のこの局面を助けるためにコンピュータープログラムが利用可能である。
【0081】
本発明の増幅オリゴヌクレオチドに関連して使用される核酸ポリメラーゼは化学的、物理的または生物学的作用剤を意味し、それは鋳型依存的様式で核酸ポリマーまたは鎖内へリボ−またはデオキシリボヌクレオチドまたはその両方を取り込む。核酸ポリメラーゼの例としては、DNA−指向DNAポリメラーゼ、RNA−指向DNAポリメラーゼおよびRNA−指向RNAポリメラーゼが含まれる。DNAポリメラーゼは鋳型依存的様式でおよび5’から3’方向への核酸合成を引起こす。ニ本鎖核酸中の二つの鎖は逆平行配向のため、この方向は鋳型の3’領域から鋳型の5’領域である。DNA−指向DNAポリメラーゼの例には大腸菌DNAポリメラーゼI、テルムス アクアチクス(Thermus aquaticus)(Taq)からの熱安定性DNAポリメラーゼおよびバシルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophi lus)(Bst)からのDNAポリメラーゼIのラージフラグメントが含まれる。RNA−指向DNAポリメラーゼの例にはモロニーマウス白血球ウイルス(MMLV)逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素のような種々のレトロウイルス逆転写酵素が含まれる。
【0082】
ほとんどの核酸増幅反応の間に、核酸ポリメラーゼは鋳型として標的核酸を用いてプライマーの3’末端にヌクレオチド残基を付加するので、標的核酸領域に部分的にまたは完全に相補的である核酸配列を持つ第二の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応において、生じたニ本鎖構造を含む二つの鎖は、増幅反応の進行を可能にするために化学的または物理的手段により分離されなければならない。もしくは、新しく合成された鋳型鎖は、鎖置換または本来の標的鎖の一部または全部を消化する核酸分解性酵素の使用により第二のプライマーまたはプロモーター−プライマーによるハイブリダイゼーションに利用可能なようにされるであろう。このように、本過程を多くのサイクル繰り返され、標的ヌクレオチド配列を持つ核酸分子の数が多量に増加する。
【0083】
第一または第二の増幅オリゴヌクレオチドまたはその両方がプロモーター−プライマーであろう。そのようなプロモーター−プライマーは通常標的核酸分子またはプライマー伸長生成物のヌクレオチド配列と相補的ではないヌクレオチド配列を含んでいる。これらの非相補的配列は増幅オリゴヌクレオチドの相補的配列の5’に位置しており、核酸ポリメラーゼの作用によりニ本鎖が作製された場合、RNA合成開始のための座を提供するであろう。このように提供されたプロモーターは標的核酸配列の複数のRNAコピーのインビトロ転写を可能にするであろう。本明細書のプライマーに言及する場合、言及の文脈において明白に他のものを示していない限り、そのような言及はプロモーター−プライマーのプライマー的見地を含んでいるつもりである。
【0084】
いくつかの増幅系において(例えば、Dattaguptaら、上記文献、の増幅法)、増幅オリゴヌクレオチドは鎖置換を助ける5’非相補的ヌクレオチドを含んでいるであろう。さらに、5’エキソヌクレアーゼ活性を持つ核酸ポリメラーゼと関連して使用された場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵素的消化を防止するためにそれらの5’末端が修飾されているであろう。もしくは、核酸ポリメラーゼは5’エキソヌクレアーゼを除去するように修飾(そのようなヌクレアーゼを持たない活性なポリメラーゼ断片を発生するプロテアーゼでの処理によるような)されているであろう。そのような場合、オリゴヌクレオチドはその5’末端が修飾される必要はない。
【0085】
1.オリゴヌクレオチドの製造
オリゴヌクレオチドはお互いに共有結合で連結されたヌクレオチドサブユニットから作られている。ヌクレオチドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボースまたはO−メチルリボースのようなそれらの修飾された誘導体である。ヌクレオチドサブユニットはホスホジエステル結合、修飾結合またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを阻害しない非ヌクレオチド残基のような結合で連結されている。修飾結合には標準ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合のような異なった結合で置き換えられている結合が含まれる。前記のように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとして使用された場合、オリゴヌクレオチドは好適には、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同定を助けるためアクリジニウムエステルまたは放射性同位元素のようなレポーター基を含んでいる。
【0086】
本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチドは本分野では既知の方法により容易に製造できる。好適には、プライマーは固相法を用いて合成された。例えば、Carruthersらはホスホジエステル結合によりヌクレオチドを連結するために標準ホスホロアミダイト固相化学の使用を記載している。シアノエチルホスホロアミダイト前駆体を用いる自動化固相化学合成がBaroneら、Nucleic Acids Research,12:405(1984)、により記載されている。(Methods in Enzymology,143巻、287ページ(1987))。同様に、Bhattはホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチド合成のための方法を記載している。(本発明と共通の所有権を享有する”有機リン化合物の硫化のための方法および試薬”と題した米国特許出願第07/319,570号)。また、Klemら(”オリゴマー合成の改良法”と題したPCT WO92/07864)は、メチルホスホネート結合を含む異なった結合を持つオリゴヌクレオチドの合成を記載している。後の三つの参照文献は本発明において援用される。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成のための方法は当業者には既知であり,Sambrookらにより記載されている(上記文献、前に本明細書において援用されている)。
【0087】
特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製に続いて、いくつかの異なった方法が大きさおよび純度の点でのプローブまたはプライマーの受容可能性を決定するために利用される。適した方法にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーが含まれる。これらの方法は両方とも当業者にはよく知られている。
【0088】
本発明のすべてのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドにせよ、それらの性能を高めるためまたは増幅精製物の特性決定を容易にするために化学基で修飾される。例えば、オリゴヌクレオチドをある種のポリメラーゼの核酸分解活性耐性にするホスホロチオエートまたはメチルホスホネート基を持つオリゴヌクレオチドのような主鎖修飾オリゴヌクレオチドは増幅または他の反応でのそのような酵素の使用を可能にする。修飾の別の例にはハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長を妨害しない、核酸鎖中のヌクレオチド間に取り込まれたヌクレオチドリンカー(例えば、Arnoldら、”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合剤”欧州特許出願第88308766−0号)の使用が含まれる。増幅オリゴヌクレオチドはまた所望の修飾および天然のヌクレオチドの混合物も含んでいる。
【0089】
増幅オリゴヌクレオチドの3’末端はまた、”核酸配列増幅”と題された米国特許出願第07/925,405号(本発明と共通の所有権を享有し、本明細書において援用される)にMaDonoughにより記載されているようにDNA合成の開始を防止するために保護されている。異なった3’保護増幅オリゴヌクレオチドはここに記載されているように核酸増幅の効率を増加させる。
【0090】
前記のように、オリゴヌクレオチドの5’末端はいくつかの核酸ポリメラーゼに存在する5’−エキソヌクレアーゼ活性に耐性となるように修飾されている。そのような修飾は、前に本明細書において援用された”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合剤”と題してArnoldらにより記載されているような技術を用いてプライマーの末端5’ヌクレオチドへ非ヌクレオチド基を付加させることにより実施できる。
【0091】
一度合成されたら、選択されたオリゴヌクレオチドプローブはいくつかの既知の方法により標識される(例えば、J.Sambrook、上記文献)。有用な標識には放射性同位元素ならびに非放射活性レポート基が含まれる。同位元素標識には3H、35S、32P、125I、57Coおよび14Cが含まれる。同位元素標識は、ニックトランスレーション、末端標識、第二鎖合成、逆転写の使用および化学的方法のような本分野では既知の技術によりオリゴヌクレオチド内へ導入できる。放射性標識プローブを使用した場合、ハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィー、シンチレーション計数またはガンマ計数により検出できる。選択される検出法は標識に使用された特定の放射性同位元素に依存するであろう。
【0092】
非同位元素物質もまた標識に使用でき、核酸配列の内部にまたは核酸配列の末端に導入される。修飾ヌクレオチドは酵素的にまたは化学的に取り込まれる。プローブの化学修飾は、例えば、Arnoldら(”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合剤”と題したEPO出願番号第88308766−0号、公開番号第313219号、本明細書において援用される)により記載されたような非ヌクレオチドリンカー基の使用により、プローブ合成の間または後で実行される。非同位元素標識には蛍光分子、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたはその他のリガンドが含まれる。
【0093】
好適には、プローブはアクリジニウムエステルで標識される。アクリジニウムエステル標識はArnoldら(”アクリジニウムエステル標識およびヌクレオチドプローブの精製”と題して1993年2月9日に公開された米国特許第5,185,439号、本明細書において援用される)により記載されたように実施される。
【0094】
2.ボレリアrRNAおよびrDNAの増幅
本発明の増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア16Sまたは23S rRNAヌクレオチド配列またはそれらのrDNA対応物に方向付けられている。これらの増幅オリゴヌクレオチドは、核酸増幅アッセイにおいてボレリアの存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブとして使用された少なくとも一つの標的ヌクレオチド配列内に隣接または含まれている。本明細書において記載され特許請求された増幅オリゴヌクレオチドは二つの組の増幅オリゴヌクレオチドを含んでいる。増幅オリゴヌクレオチドの組の構成物は以下のヌクレオチド配列の一つを持つかまたは実質的に対応している核酸とハイブリダイズできる:
配列ID番号36:ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT
配列ID番号37:TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATAGAGGAAG
配列ID番号38:TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGGGTGG
配列ID番号39:ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT
配列ID番号40:CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG
配列ID番号41:GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC
配列ID番号42:CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG
配列ID番号51:ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU
配列ID番号52:UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUAGAGGAAG
配列ID番号53:UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGGGUGG
配列ID番号54:ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU
配列ID番号55:CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG
配列ID番号56:GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号57:CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【0095】
好適な態様において、これらの増幅オリゴヌクレオチドは以下の配列を持つかまたは実質的に対応している:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
配列ID番号46:CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA
配列ID番号47:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC
配列ID番号50:CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG
および
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA。
これらのオリゴヌクレオチドはまた、その5’末端にRNAポリメラーゼを結合でき、鋳型として標的核酸を用いるRNA転写を指図するプロモーター配列を含む追加の非相補的塩基も持っている。
【0096】
ボレリアの16S rRNAへ方向付けられた好適な増幅プライマーは以下の配列を持つかまたは実質的に対応している:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
配列ID番号46:CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA
および
配列ID番号47:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU。
【0097】
これらの16S rRNA増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア16S rRNA核酸配列、rDNA対応物に方向付けることができ、部分的または完全にこれらの配列と重複している。
【0098】
好適であるのはヌクレオチド配列:
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
に実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ16S増幅オリゴヌクレオチドである。
【0099】
最も好適であるのはヌクレオチド配列:
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
(式中、19の最も3’のヌクレオチドが示された通り厳密であるである)に実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ16S増幅オリゴヌクレオチドである。
【0100】
ボレリアの236S rRNAへ方向付けられた好適な増幅プライマーは以下の配列を持つかまたは実質的に対応している:
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC
および
配列ID番号50:CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
【0101】
これらの23S rRNA増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア23S rRNA核酸配列、rDNA対応物に方向付けることができ、部分的または完全にこれらの配列と重複している。
【0102】
本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチドはこれらの配列への修飾または付加を含まない配列を持っている。増幅オリゴヌクレオチドはまた、またはもしくは、保護された3’および/または5’末端またはRNAポリメラーゼにより認識される特異的ヌクレオチド配列(例えば、T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列)の付加、RNAポリメラーゼによるRNA転写の開始または延長を促進する配列の付加、または分子内塩基対合を提供し、二次または三次核酸構造の形成を助長する配列の付加を含む(これらに制限されるわけではない)付加のような修飾を持っていてもよい。
【0103】
ポリメラーゼ連鎖反応またはKacianおよびFUltz、上記文献,Dattaguptaら、上記文献、およびSninskyら、米国特許第5,079,351号(どちらも本明細書において援用され、最初の二つは本発明と共通の所有権を享有している)により記載されたようなRNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼおよびRNAse Hまたはその均等物を用いる増幅反応のような核酸増幅反応で増幅オリゴヌクレオチドが使用される。
【0104】
増幅された標的配列の検出に広範囲の方法が利用できる。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは新たに合成されるDNA内へ取り込まれる検出可能な標識を含むことができる。生じた標識増幅生成物は次に、未使用の標識ヌクレオチドまたはプライマーから分離され、標識は分離された生成物分画で検出される。
【0105】
有用な検出可能標識として働くことができる物質は本分野ではよく知られており、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、発色団、ならびにビオチンおよびハプテンのようなリガンド(こられは直接的には検出可能ではないが、例えば、各々アビジンおよび抗体のようなそれらの特異的結合相手の標識形との反応により容易に検出できる)が含まれる。
【0106】
増幅生成物を検出する別の方法は、検出可能なように標識した核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、生じたハイブリッドを通常の様式で測定する方法である。特に、生成物は標的配列へ化学発光アクリジニウムエステル標識核酸プローブをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在するアクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメーターで残存するアクリジニウムエステルから発生する化学発光を測定することによりアッセイできる。(例えば、Arnoldら、上記文献、PCT出願番号US88/02746、およびNelsonら、”Non−Isotopic DNA Probe Technologies”,Academic Preess,San Diego(Kricka編、1992年)、両方の参照文献ともに本明細書において援用される、を参照されたい。)
D.ボレリアrRNAおよびrDNAに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ
本明細書において開示および請求されているオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは系統発生学的に密接に関連した細菌種の核酸を制して、ライム病関連ボレリアrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列を含む標的核酸へ優先的にハイブリダイズできる。これらのハイブリダイゼーションプローブは、ライム病関連ボレリアおよび該系統発生学的に密接に関連した種のヌクレオチド配列の比較に基づいて設計され、選択されおよび/または決められた。好適な態様において、これらのプローブはボレリア ヘルムシーの核酸を制してライム病関連ボレリアの核酸に選択的にハイブリダイズする。
【0107】
本発明はライム病関連ボレリアまたはボレリア ヘルムシーを含むボレリア種の核酸に選択的にハイブリダイズするが密接に関連した微生物の核酸とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを企図しており、以下の核酸配列を持つまたは実質的に対応する核酸配列が含まれる:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【0108】
ライム病関連ボレリアの核酸に選択的にハイブリダイズする本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下の核酸配列を持つまたは実質的に対応する:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
【0109】
現在の所、ライム病関連ボレリアの16S rRNAに方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
および
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC。
【0110】
ライム病関連ボレリアの23S rRNAに方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する:
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
【0111】
本発明の多くのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは他の系統発生学的に密接に関連した細菌種の核酸を制して、ボレリア ヘルムシーrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列を含む標的核酸へ好適にハイブリダイズする。好適な態様において、これらのハイブリダイゼーションアッセイプローブは他のボレリア核酸からボレリア ヘルムシー核酸を区別できる。
【0112】
ボレリア ヘルムシーに由来する核酸に選択的にハイブリダイズする本発明のハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【0113】
ボレリア ヘルムシーの16S rRNAに方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
および
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC。
【0114】
ボレリア ヘルムシーの23S rRNAに方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する:
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【0115】
本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的配列へプローブがハイブリダイズしたことを検出または確認するために使用できる放射性同位元素、蛍光性または化学発光性残基、酵素またはその他のリガンドのようなレポーター基残基で好適に標識される。標識として化学発光性アクリジニウムエステルの使用が最も好ましい。本出願と共通の所有権を享有し、本明細書において援用されるArnoldらによる米国特許第5,185,439号を参照されたい。アッセイプローブは、相補性領域中での水素結合形成により二つの鎖のアニーリングを可能にするために適したハイブリダイゼーション条件下、標的配列を持っている核酸を含むと疑われる試料と混合する。プローブは標的ボレリアヌクレオチド配列を持っている核酸との結合を容易にするため、一つまたはそれ以上の非標識ヘルパーオリゴヌクレオチドとも結合されているであろう。プローブは試料中に存在する標的核酸へハイブリダイズする;生じたハイブリッドデュープレックスは分離され、ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性モニタリングのような本分野ではよく知られている種々の技術により検出される。本出願と共通の所有権を享有し、本明細書において援用されるArnoldらによる米国特許第5,283,174号に開示されているような、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、続いて残存するハイブリダイズしたプローブに付随する標識の量を測定することを含む技術もこれらの技術の中に含まれている。この後者の技術が現在のところ好ましい。
【0116】
E.ボレリアの検出に使用されるヘルパーオリゴヌクレオチド
特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドが標的核酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを容易にするために使用された。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、本出願と共通の所有権を享有し、本明細書において援用される”核酸ハイブリダイゼーションを促進するための手段および方法”と題されたHoganおよびMillimanによる米国特許第5,030,557号に開示されている。
【0117】
ヘルパープローブはハイブリダイゼーションアッセイプローブにより標的化された領域近くに位置する核酸配列へハイブリダイズするように選択される。ヘルパープローブのハイブリダイゼーションは標的核酸の二次および三次構造を変化させ、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを容易にする。
【0118】
ボレリア核酸の特異的検出を容易にするための特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドはこれらのヌクレオチド配列の一つを持っているかまたは実質的に対応している:
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号15:CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
および
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA。
【0119】
別の態様において、ボレリア核酸の特異的検出を容易にするための特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドは以下のヌクレオチド配列の一つを持っているかまたは実質的に対応している:
配列ID番号3:TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号14:UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【0120】
好適な態様において、ヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用されるライム病関連ボレリアの16Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列を持っているかまたは実質的に対応している:
配列ID番号3:TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号14:UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG
配列ID番号15:CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
および
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG。
【0121】
最も好適な態様において、実質的に
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
に対応するライム病関連ボレリア16Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列:
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号15:CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA
および
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【0122】
最も好適な態様において、実質的に
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
に対応するライム病関連ボレリア16Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列:
配列ID番号3:TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号14:UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG
および
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【0123】
好適な態様において、ヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用されるライム病関連ボレリアの23S核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列を持っているかまたは実質的に対応している:
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【0124】
最も好適な態様において、実質的に
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
に対応するライム病関連ボレリア23Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列:
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
および
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【0125】
好適な態様において、実質的に配列ID番号10または配列ID番号33に対応するボレリア ヘルムシー16Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列:
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
および
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【0126】
好適な態様において、実質的に
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
に対応するボレリア ヘルムシー16Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列:
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
および
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【0127】
好適な態様において、ボレリア ヘルムシー23Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列:
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG
を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【0128】
好適な態様において、実質的に
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
に対応するボレリア ヘルムシー23Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列:
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
および
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【0129】
ヘルパーオリゴヌクレオチドは一般的にはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で使用されるが、特異性においては種特異的である必要はない;すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標的ヌクレオチド配列は種ボレリアに独特である必要はない。
【0130】
F.核酸組成物
別の関連する態様において、本発明はハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびそれに対して実質的に相補的である核酸配列間の核酸ハイブリッド(プローブ:標的)を含む組成物を特色としている。プローブおよび標的間で形成されたハイブリッドの一つの使用は標的配列の存在を検出することである。例えば、ハイブリッドに存在するアクリジニウムエステル(”AE”)はアルカリ溶液での加水分解に抵抗するが、一方一本鎖核酸に存在するAEはアルカリ溶液で加水分解される(Arnoldら、”同質保護アッセイ”と題されたEPO出願番号第88308767.8号、公開番号第309230号、および米国特許番号第5,238,174号、本明細書において援用される)。従って、非結合AE−標識プローブの加水分解後、核酸ハイブリッドに付随する残存アクリジニウムエステルの化学発光を測定することにより標的核酸の存在が検出できる。
【0131】
本発明はまた増幅オリゴヌクレオチドおよびそれに対して実質的に相補的な核酸配列間の核酸ハイブリッド(プライマー:標的)を含む組成物も企図している。プライマーおよび標的間で形成された核酸ハイブリッドの一つの使用は増幅オリゴヌクレオチドの3’末端にポリメラーゼのための開始部位を提供することである。例えば、ハイブリッドは逆転写酵素、TaqポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼおよびT7ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼおよびT3ポリメラーゼなどのようなDNAポリメラーゼのための開始部位を形成するであろう。
【0132】
本発明はまた、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびそれに対して実質的に相補的である核酸配列間の核酸ハイブリッド(ヘルパーオリゴヌクレオチド:標的)を含む組成物を特色とする。ヘルパーオリゴヌクレオチドおよび標的間のハイブリッドの一つの使用は特別の核酸配列をハイブリダイゼーションに利用できることにすることである。例えば、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびその標的間のハイブリッドは核酸配列をハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションに利用可能な標的配列へハイブリダイズできるようにするであろう。ヘルパーオリゴヌクレオチド使用の完全な記述はHoganおよびMillimanによる米国特許第5,030,557号に提供されている。
【0133】
本発明の組成物にはボレリア核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア核酸を検出するための組成物が含まれる:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
配列ID番号46:CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA
配列ID番号47:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC
および
配列ID番号50:CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
【0134】
本発明の好適な組成物にはボレリア核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物が含まれる:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
配列ID番号46:CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC
および
配列ID番号50:CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
【0135】
本発明の好適な組成物にはボレリア核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物が含まれる:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
および
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG。
【0136】
本発明はまた、ボレリア核酸および
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、また以下の核酸配列:
配列ID番号8:おCTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
および
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図している。
【0137】
本発明はまた、ボレリア核酸および
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、また以下の核酸配列:
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
および
配列ID番号46:CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA
の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図している。
【0138】
本発明の好適な組成物にはボレリア ヘルムシー核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成物が含まれる:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
および
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC。
【0139】
本発明のより好適な組成物にはボレリア ヘルムシー核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成物が含まれる:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
および
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC。
【0140】
本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、以下の核酸配列:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
および
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図している。
【0141】
本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、また以下の核酸配列:
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
および
配列ID番号47:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU
の少なくとも一つと実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図している。
【0142】
本発明はまた本発明のプローブおよび下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドを企図している:
配列ID番号3:TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号14:UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG
配列ID番号15:CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【0143】
本発明はまた、ボレリア核酸および
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
および
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、また以下の核酸配列:
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
および
配列ID番号46:CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCUAUCA
の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号15:CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
配列ID番号3:TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号14:UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG
および
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからなるライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図している。
【0144】
本発明はまた、ボレリア核酸および
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
および
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、また以下の核酸配列:
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
および
配列ID番号50:CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG
の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列:
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG
の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからなるライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図している。
【0145】
本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
および
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、また以下の核酸配列:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号44:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
および
配列ID番号47:AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU
の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU
および
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG
の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからなるボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図している。
【0146】
本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
および
配列ID番号48:CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG
に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され、および、また以下の核酸配列:
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号49:GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
および
配列ID番号50:CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG
の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列:
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号27:TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
および
配列ID番号29:UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG
の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからなるボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図している。
【0147】
好適な態様において、本発明はまた本発明のプローブおよび下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドを企図している:
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA。
【0148】
本発明はまた、ボレリア核酸および
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
または
配列ID番号45:CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUCCAACAUA
(ここで19の最も3’のヌクレオチドは示されたように厳密である)に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図している。
【0149】
G.アッセイ法
本発明は試料内のボレリア核酸の存在をアッセイするための種々の方法を企図している。使用される厳密なアッセイ条件、プローブまたはプライマーは、使用される特定のアッセイ型および試料源に依存して変化するであろうことが当業者には理解されるであろう。
【0150】
一般に、本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア標的核酸とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボレリ ア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC
から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を持っている。
【0151】
ライム病関連ボレリアの存在を検出するための好適な方法は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的核酸とハイブリダイズできるが、ボレリア ヘルムシーのような密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる工程を含み、該標的核酸配列は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
から成るより選択される配列に実質的に対応する。
【0152】
ライム病関連ボレリアの存在を検出するためのより好適な方法は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的核酸とハイブリダイズできるが、ボレリア ヘルムシーのような密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる工程を含み、該標的核酸配列は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
および
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
から成るより選択される配列に実質的に対応する。
【0153】
本発明はまた、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア16Sリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
および
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
から成る群より選択される配列に実質的に対応している。
【0154】
一般に、本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア23Sリボソーム核酸とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は:
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC
から成る群より選択される配列に実質的に対応している。
【0155】
本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア16Sリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドルフェリおよび他のライム病関連ボレリアのような密接に関連した微生物からの核酸とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボレリア ヘルムシー微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
配列ID番号34:GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC
および
配列ID番号35:GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC
から成る群より選択される配列に実質的に対応するヌクレオチド配列を持っている。
【0156】
本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリア23Sリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドルフェリおよび他のライム病関連ボレリアのような密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりボレリア ヘルムシー微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は:
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
配列ID番号30:CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC
配列ID番号31:GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号32:CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC
から成る群より選択される配列に実質的に対応する。
【0157】
本発明はまた、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア16Sリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
および
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
から成る群より選択される配列に実質的に対応している。
【0158】
最も好適であるのはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア16Sリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方法であり、該標的核酸配列は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
から成る群より選択される配列に実質的に対応している。
【0159】
本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア23Sリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は:
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
から成る群より選択される配列に実質的に対応している。
【0160】
最も好適であるのはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア23Sリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方法であり、該標的核酸配列はヌクレオチド配列:
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
に実質的に対応している。
【0161】
本発明はまた、最初にボレリア核酸の一部を増幅し、次に随意に本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて本発明のプライマーにより増幅された特異的ボレリア核酸をアッセイすることによるボレリア微生物の検出法も企図している。増幅された核酸はゲル電気泳動を含む多くの方法で検出できる。
【0162】
好適な態様において、本発明は最初に以下の配列:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
および
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
の一つまたはそれ以上へ結合するまたは延長を起こすであろう少なくとも一つの増幅オリゴヌクレオチドで該核酸を増幅するボレリア核酸の検出法を企図しており、ここで該増幅オリゴヌクレオチドは随意にRNAポリメラーゼにより認識されるまたはRNAポリメラーゼによる延長の開始を促進する核酸配列を持っている。
【0163】
この最初の方法工程に続いて、増幅工程で産生された増幅核酸をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブで検出する。
【0164】
本発明の方法で使用される増幅オリゴヌクレオチドは随意にRNAポリメラーゼにより認識されるまたはRNAポリメラーゼによる延長の開始を促進する核酸配列を持っている。
【0165】
H.診断システム
本発明はまたキットの形での診断システムも企図している。本発明の診断システムには、少なくとも1回のアッセイに十分な量の増幅プライマーおよび/または本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブを包装素材内に包含するキットを含まれる。典型的には、キットにはまた包装されたプライマーおよび/またはプローブを使用するための説明書も含まれているであろう。
【0166】
診断システムのさまざまな構成要素は種々の形で提供される。例えば、必要とされる酵素、ヌクレオチド三リン酸、プライマーおよびプローブは凍結乾燥された試薬として提供される。これらの凍結乾燥された試薬は再構成された場合、各々の成分の適正な比を持ちアッセイに即座に使用できる完全な混合物を形成させるために凍結乾燥に先立って混合されているであろう。さらに、本発明の診断システムはキットの凍結乾燥試薬再構築のための再構築試薬を含んでいるであろう。好適なキットにおいて、酵素、ヌクレオチド三リン酸および酵素に必要とされる補助因子は単独の凍結乾燥試薬として提供され、再構築された場合に本方法で使用する適切な試薬を形成する。これらの好適なキットにおいて、凍結乾燥プライマー試薬もまた提供される。別の好適なキットにおいては凍結乾燥プローブ試薬が提供される。
【0167】
典型的な包装素材には本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーを固定した範囲内に保つことができるガラス、プラスチック、紙、およびホイルのような固体マトリックスが含まれるであろう。従って、例えば、包装素材から作製された包装とは企図されたプライマーまたはハイブリダイゼーションアッセイプローブのマイクログラムからミリグラム量を包含させるためのガラスバイアルであろうし、または本発明のプローブおよび/またはプライマーが作動可能なように付着されている(すなわち、本発明の検出法に関与できるように結合されている)マイクロタイタープレートであろう。
【0168】
使用説明書は典型的には種々の試薬および/または試薬の濃度を記載している明確な表現、および少なくとも一つのアッセイ法パラメーター(例えば、試料量当たりの試薬の相対量であろう)を含んでいる。さらに、メンテナンス、時間、温度および緩衝液条件のような明細書も含まれているであろう。
【0169】
本発明は本発明の組成物のオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。本発明はまた、本発明の方法を実施するのに必要なオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0170】
本発明は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
配列ID番号25:GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG
および
配列ID番号26:CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC
から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応している核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0171】
本発明は:
該オリゴヌクレオチドが
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
または
配列ID番号12:GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC
である場合:
配列ID番号3:TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG
配列ID番号5:CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTTAT
配列ID番号14:UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG
配列ID番号16:CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUUUUAU;または
該オリゴヌクレオチドが
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
または
配列ID番号13:GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC
である場合:
配列ID番号4:CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA
配列ID番号6:ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTTGG
配列ID番号15:CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA
配列ID番号17:AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUGUUGG;
または、該オリゴヌクレオチドが
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
である場合:
配列ID番号23:CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA
配列ID番号28:CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA
から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパープローブを随意に持つ診断システムまたはキットを企図している。
【0172】
本発明は、随意にRNAポリメラーゼにより認識される、またはRNAポリメラーゼによる開始または延長を促進する5’配列を持つ:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
および
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応している核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0173】
本発明は:
該二つのオリゴヌクレオチドが:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
および
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
から選択される場合は:
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
および
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC;
または、該オリゴヌクレオチドが
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
および
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
から選択される場合は:
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
および
配列ID番号22:GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG
から選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを随意に持つ診断システムまたはキットを企図している。
【0174】
本発明は以下の配列:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
および
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
または
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0175】
本発明は以下の配列:
配列ID番号7:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT
配列ID番号9:CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTATCA
および
配列ID番号1:GCATAGACTTATATATCCGCC
または
配列ID番号2:GGCGGATATATAAGTCTATGC
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0176】
本発明は以下の配列:
配列ID番号11:AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT
配列ID番号8:CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCAACATA
および
配列ID番号10:GGCGGATATGCAAGTCTATGC
または
配列ID番号33:GCATAGACTTGCATATCCGCC
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0177】
本発明は以下の配列:
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号19:GCACTCATCATCACATCTTAGCTC
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
または
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0178】
本発明は以下の配列:
配列ID番号18:CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG
配列ID番号20:CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG
配列ID番号21:GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG
または
配列ID番号24:CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図している。
【0179】
【実施例】
実施例:
本発明の異なった特色および態様を例示するために以下に実施例が提供される。これらの実施例は開示された発明を制限することを意図しているものではない。
【0180】
ボレリア ブルグドルフェリを含むライム病関連ボレリアに対して特異的なプローブは報告および決定されている16Sおよび23S rRNA配列から同定された。系統発生的に近い近縁種B.ヘルムシー、B.トゥリカテ、B.アンセリナおよびB.コリアセエからの核酸配列は変異領域を同定するためにB.ブルグドルフェリの核酸配列との比較に使用された。
【0181】
以下のハイブリダイゼーションアッセイプローブ配列は以下の実施例に特徴が示されている:配列ID番号:1、配列ID番号:2および配列ID番号:21はB.ブルグドルフェリに方向付けられており、および配列ID番号:10および22はB.ヘルムシーに方向付けられている。
【0182】
プローブはArnoldら(上記文献、”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合剤”)により記載されているように非ヌクレオチドリンカーで合成され、次にArnoldら(上記文献、米国特許第5,185,439号)により記載されているように化学発光性アクリジニウムエステルで標識された。ライム病関連ボレリアに対する反応性および特異性はArnoldら(上記文献、”均質保護アッセイ”)およびArnoldら(Clin.Chem.35:1588(1989)、本明細書において援用される)により記載されているような均質アッセイフォーマットを用いて示された。結果はルミノメーターにより検出された光子計測の相対的光ユニット(RLU)として与えられた。プローブは細胞溶解物の核酸または標的増幅反応の生成物とハイブリダイズされた。以下の実施例はボレリア ブルグドルフェリを含むライム病関連ボレリアを標的とするハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび増幅オリゴヌクレオチド、およびハイブリダイゼーションおよび増幅/ハイブリダイゼーションアッセイにおけるそれらの使用を記載している。
実施例1. 16S rRNAを標的とするプローブを用いたライム病関連ボレリアの検出
この実施例はB.ブルグドルフェリからのライム病関連ボレリア核酸を直接検出するために(しかしB.ヘルムシーは検出しない)ライム病関連ボレリア16S rRNAを標的としたプローブの能力を例示している。プローブ溶液は配列、配列ID番号:1で合成されたアクリジニウムエステル標識プローブおよび配列ID番号:3および配列ID番号:5を持つ対応する非標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを含んでいる。配列ID番号:1からなるプローブの標的配列はライム病関連ボレリア群を示す株で同一になるように選択され、従ってこのプローブはライム病に関連する三つすべての亜種または種(VS461、B.ブルグドルフェリ センス ストリクチュおよびB.ガリニー)を検出することが期待される。
【0183】
B.ブルグドルフェリ、B.ヘルムシーおよび大腸菌16Sの領域を整列させたものが以下に示されており、点は配列における類似点を示している:
【0184】
【化1】
大腸菌16S
5'- GGCGGUUUGUUAAGUCUG-AU-3'
..... . .......
Bbu GGCGGAUAUAUAAGUCUUACG-3'
Bhe .........GC...... ....
以下の実験において、細胞溶解物から放出された核酸が直接アッセイされた。溶解物を調製するための方法の例はMurphyら(EPO公開番号第288618号、本明細書において援用される)により提供されている。各々の細胞の50μlおよび100mMコハク酸リチウム pH5、2%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、1.2M塩化リチウム、20mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、およびエチレングリコールビス(ベータ−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’四酢酸(EGTA)を含む50μlのプローブ溶液を混合し、60℃で20分インキュベートし、続いて0.3mlの0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、1%トリトンX−100を加え、60℃で15分間インキュベートした。反応液を冷却し、0.1%過酸化水素を含む1mM硝酸の自動注入、続いての1M水酸化ナトリウム溶液の注入後、ハイブリダイズしたアクリジニウムエステル標識プローブからの残存する化学発光をルミノメーターで測定した。結果は相対的光ユニットまたはRLUで与えられた。配列ID番号:58−63を含むヘルパーオリゴヌクレオチドとともに全細菌/酵母プローブ混合物が細菌核酸の存在を示すために対照として使用された。Hoganら(上記文献、”非ウイルス生物体の検出および/または定量のための核酸プローブ”と題された)は適した全細菌/酵母プローブ混合物の例を与えている。データは、プローブはライム病関連ボレリア種ボレリア ブルグドルフェリとハイブリダイズし、それをその密接な系統発生学的近縁種ボレリア ヘルムシーと区別していることを示している。
【0185】
【表1】
表1. ボレリア ブルグドルフェリおよびボレリア ヘルムシーのrRNAへのプローブ配列番号:1のハイブリダイゼーション
実施例2. 増幅に続いてのオリゴヌクレオチドプローブを用いるボレリア生物体の検出
少数のボレリア生物体の検出はハイブリダイゼーションによるアッセイに先だってのrRNAまたはrDNAの増幅により促進できる。この実験において、約30,000生物体からの精製B.ブルグドルフェリDNAがB.ブルグドルフェリrRNA配列と相補的または相同なオリゴヌクレオチドで増幅された。一つの増幅オリゴヌクレオチドは3’末端の配列ID番号:7および5’末端のT7プロモーター配列配列ID番号:43から合成されたプロモーター−プライマーから成り(以後プロモーター−プライマーはその標的結合領域の配列ID番号で同定されるであろう)、および第二のオリゴヌクレオチドは配列、配列ID番号:8または9のプライマーから成っている。増幅混合物は50mMトリスHCl、pH8.5、40mM酢酸カリウム、6mM GTP、6mM ATP,2.5mM UTP、2.5mM CTP、0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、17.5mM MgCl2、10mM ジチオスレイトール、10%(v/v)グリセロール、2mMスペルミジン、30ピコモルのプロモーター−プライマー配列ID番号:7および30ピコモルのプロモーター−プライマー配列ID番号:8または9を100μlの最終容量に含んでいた。混合物は95℃で8分加熱し、42℃まで冷却して900単位のMMLV逆転写酵素(RT)および400単位のT7 RNAポリメラーゼを添加した。42℃で2時間インキュベーション後、増幅反応液の20μlが非標識ヘルパー配列ID番号:3および5を持つ配列ID番号:1のアクリジニウムエステル標識プローブとのハイブリダイゼーションによりアッセイされた。二回の反応の結果が報告されている。
【0186】
【表2】
表2 ボレリア ブルグドルフェリrDNAの増幅とプローブ配列番号:1による選択
これらのデータは、ボレリアRNAに相補的な配列ID番号:1のプローブはrRNA配列の直接的検出または増幅生成物の検出に使用してもよいことを示している。これらの結果は、配列ID番号:7(5’末端に配列ID番号:43を加えて)および配列ID番号:8かまたは9を持つプライマーの組はB.ブルグドルフェリ核酸を増幅できることを示している。配列ID番号:9がより有効な負のセンスプライマーであることも明かである。
実施例3 16S rRNA配列へハイブリダイズするプライマーを用いるボレリア核酸の増幅
この実施例において、ボレリアからの核酸が16SリボソームRNA配列に相補的または相同的なプライマーで増幅された。B.ブルグドルフェリまたはB.ヘルムシー細胞からの溶解物がRNAの保存領域へ方向付けられたプローブによるハイブリダイゼーションにより定量された。RNAは希釈され、30ピコモルの5’末端に配列、配列ID番号:43を持つ配列ID番号:8のプロモーター−プライマーおよび30ピコモルのプライマー配列ID番号:7を含む反応混合物へ加えられた。最終反応条件は、100mMトリスHCl、pH8.5、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mM ATP、4mM UTP、4mMCTP、0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、20mM MgCl2、10mM ジチオスレイトール、10%(v/v)グリセロール、2mMスペルミジンであった。混合物は95℃で5分加熱し、42℃まで冷却して800単位のMMLV RTおよび400単位のT7 RNAポリメラーゼを添加した。42℃で2時間インキュベーション後、反応液の20μlが、15mMのアルドリチオール存在下、配列、配列ID番号:2で合成されたプローブ、および配列ID番号:4および6の非標識ヘルパープローブを用いて実施例1に記載したようにハイブリダイゼーションによりアッセイされた。結果はプライマーでのボレリア ブルグドルフェリ核酸の増幅は成功し、少量のボレリアrRNAの検出を可能にした。大過剰のB.ヘルムシー核酸存在下でさえも有意な交差反応は観察されなかった。3回の反応の結果が報告されている。
【0187】
【表3】
表3 配列番号:7/8プライマーによるボレリア ブルグドルフェリおよびボレリア ヘルムシー核酸の増幅およびプローブ配列番号:2による検出。
実施例4 ハイブリダイゼーションアッセイプローブ番号2および10を用いるボレリアの増幅および検出
この実施例においては、増幅は実施例3のように実行されるが、ただし配列ID番号:8のプロモーター−プライマー(配列ID番号:43の5’プロモーター配列を持つ)および配列ID番号:11のプライマーが使用され、および配列ID番号:10のプローブが使用された。この実施例で使用されたアクリジニウムエステル標識プローブおよび非標識ヘルパープローブは表に示されている。これらのデータは、これらのプライマーがB.ブルグドルフェリおよびB.ヘルムシーrRNA配列の両方を増幅でき、プローブは開示されたアッセイシステムで二つの生物体間を区別したことを示している。
【0188】
【表4】
表4 ボレリア ブルグドルフェリおよびボレリア ヘルムシー核酸の増幅およびプローブ配列番号:2および10による検出。
実施例5 23SリボソームRNAへ方向付けられたプローブを用いるボレリアの検出
B.ブルグドルフェリの23S rRNA配列は報告されている、J.Clin.Microbiol.30:3082(1992)およびJ.Bacter iol.174:3766−3774(1992)。ボレリア23S rRNA配列へ方向付けられた特異的プライマーおよびプローブを設計するため、密接に関連した生物体の配列が必要とされた。ボレリア ヘルムシー、ボレリア コリアセエおよび ボレリア トゥリカテをBSK Hブロス(Sigma)中で数日増殖させ、ペレット化し、50mMトリスHCl pH8.0に再懸濁した。DNAは溶解に続いてトリスHCl[pH8.0]で平衡化したフェノール中に調製された。最終生成物はエタノール沈澱により単離した。23S rDNA配列の5’および3’部分をポリメラーゼ連鎖反応およびAmpliTaqポリメラーゼ(Perkin−Elmer)を用いて、ボレリア種の保存領域またはB.ブルグドルフェリ特異的配列に方向付けられたプライマーで増幅した。精製アンプリコンは35S−dNTP取り込みを用い、Promega(fmolキット)またはNew England Biolabs(サーカムベントキット)からの市販品として入手可能なキットを使用して配列決定した。得られた配列は報告されているボレリア ブルグドルフェリ配列(Gen−Bank寄託番号M88330、J.Clin.Microbiol.30:3082(1992)およびJ.Bacteriol.174:3766−3774(1992))と比較した。B.ブルグドルフェリがB.ヘルムシーおよびB.トゥリカテから変異している特異的配列が23Sプローブ設計のために選ばれた。この領域は大腸菌の塩基1478−1500に対応し、B.ヘルムシーおよびB.トゥリカテはこの領域に同一のヌクレオチド配列を持っていたが、B.ブルグドルフェリでは4塩基変化していた。一つのプローブがB.ブルグドルフェリに設計され、第二のプローブはB.ヘルムシーおよびB.トゥリカテに設計された(配列ID番号:22)。rRNA配列は以下に示されている:
【0189】
【化2】
大腸菌 GGC---UGGUUUUCCAGGCAAAUCCG
.. .. ... .......
Bbu GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG (配列番号:25)
.... .... .. ............
bHE GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG (配列番号:31)
増幅効率およびプローブ特異性を示すため、以下の実験が実施された。7mlの培養物を0.75mlの10mM N−アセチル−L−システイン、2mM EDTA、40mMトリスHCl pH8を含む0.75mlの溶液を再懸濁し、60℃で5分間加熱することにより細胞溶解物をB.ブルグドルフェリ株N40およびB.トゥリカテの培養物から調製した。各々の試料中の核酸の量を定量するため、実施例1に記載したように異なった量の試料およびボレリア23S rRNAの保存領域に方向付けられたプローブとハイブリダイゼーションを実施した。得られた値は既知の標品の結果と比較した。
【0190】
B.ブルグドルフェリまたはB.トゥリカテ溶解物中の既知量の核酸を、30ピコモルの5’プロモーター配列(配列ID番号:43)および配列ID番号:19かまたは配列ID番号:20の3’標的ハイブリダイゼーション領域で合成したプロモーター−プライマーおよび配列ID番号:18を持つプライマーを含む100μlの反応液で増幅した。溶解物は適当な濃度に水で希釈し、プライマーおよびプロモーター−プライマーを含む溶液に加え、95℃で15分加熱した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV RT)900単位および400単位のT7 RNAポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は50mMトリスHCl、pH8.5、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mM ATP、4mM UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1.2mM dCTP、1mM dGTP、20mM MgCl2、20mM N−アセチルーL−システイン、5%グリセロールを含んでいる。42℃で2時間インキュベーション後、全100μlの増幅反応液を配列ID番号:21のアクリジニウムエステル標識プローブによるハイブリダイゼーションでアッセイした。 ハイブリダイゼーションは0.05Mコハク酸リチウム pH5、0.6M LiCl、1%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、10mM EDTA、および10mM EGTAを含む200μlの溶液中、60℃で10分間で実施し、続いて300μlの0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、1%トリトンRX−100を加えた。この混合物は60℃で15分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々のチューブの残存化学発光を、1mM硝酸および0.1%過酸化水素の自動注入、続いて1Nの水酸化ナトリウムを注入装置を備えた続いてGen−Probe LEADERR Iルミノメータでアッセイした。結果はRLUで示されている。
【0191】
【表5】
表5 配列ID番号:19および18または20および18を含む増幅オリゴヌクレオチドによるボレリア ブルグドルフェリの増幅および続いての配列番号:21を含むプローブによる検出
別の実験において、配列、配列ID番号:19を持つオリゴヌクレオチドがプライマーとして使用された。配列ID番号:18および19および配列ID番号:23および19を持つプライマーはB.ブルグドルフェリ株B21およびBN40両方のrRNA配列を増幅することが示された(データは示されていない)。
実施例6 23S rRNAへ方向付けられたハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いるボレリア ヘルムシーの特異的検出
この実施例においては、B.ヘルムシーに対するプローブの特異性が示される。B.ブルグドルフェリ、B.ヘルムシーおよびB.トゥリカテは23S rRNA核酸配列レベルで非常に密接に関係している。B.ブルグドルフェリ23SrRNAプローブのように、23S rRNAの同一の領域でB.ヘルムシーおよびB.トゥリカテの両方を検出するようにプローブが設計された。B.ブルグドルフェリまたはB.ヘルムシー/B.トゥリカテ配列の両方を含む二つの合成標的が合成され、各々の標的がハイブリダイゼーションが55℃で15分実施されることを除いて前記の条件下で配列ID番号:22のプローブとハイブリダイズさせた。0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、1%トリトンRX−100を含む300μlの溶液を加えた後、反応液は55℃で5分インキュベートされた。試料は上記のようにルミノメーターで読みとられた。結果は、本プローブはB.ブルグドルフェリ配列からB.ヘルムシー配列を区別できることを示している。
【0192】
【表6】
表6 B.ヘルムシー/B.トゥリカテプローブとB.ヘルムシーおよびB.ブルグドルフェリ合成DNA標的のハイブリダイゼーション
実施例7 23S rRNAハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いるボレリアの増幅および検出
次に、B.トゥリカテ核酸の増幅および検出が示される。B.トゥリカテ細胞溶解物は30ピコモルの配列、配列ID番号:18から合成されたプライマーおよび30ピコモルの5’配列、配列ID番号:43および3’標的ハイブリダイゼーション領域配列ID番号:19を持つプロモーター−プライマーで増幅された。全増幅反応液は2.5ピコモルの非標識ヘルパープローブ配列ID番号:23の存在下、配列ID番号:22のプローブを用い、55℃で15分ハイブリダイズされ、0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、1%トリトンRX−100を加え、ルミノメーターで読みとられた。B.ヘルムシーと同一の信号が予期され、なぜなら、23S rRNAのこの領域は二つの生物体の配列が同一であるからである。
【0193】
【表7】
表7 B.トゥリカテrRNA配列の増幅
実施例8 血液中に観察される微生物存在下でのボレリアの特異的増幅および特異的検出
プライマー配列ID番号:18および3’末端に配列ID番号:20を持つプロモーター−プライマーが血液単離物に観察されることが予期される一団の生物体から調製される細胞溶解物の増幅に使用された。各々の細胞溶解物から少なくとも3x10−19モルのrRNAがヌクレオチド配列配列ID番号:21(表8)または配列ID番号:22(データは示されていない)で合成されたプローブで試験された。両方のプローブとも非ボレリア種との交差反応は観察されなかった。配列ID番号:22のプローブはB.トゥリカテ培養物で強い信号を与え(>2,000,000RLU)、B.トゥリカテ細胞の存在が確認された。配列ID番号:21による検出の結果は下記の表に示されている。
【0194】
【表8】
表8 血液標本に単離される一連の微生物の増幅
上記のデータは本明細書で開示および請求された新規増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブはボレリアrRNA配列を増幅できおよびライム病関連ボレリア(ボレリア ブルグドルフェリ)を他の細菌およびボレリア属の他の構成菌から区別できることが確認された。
実施例9 16Sリボソームプローブを用いるボレリアの増幅および特異的検出
16Sリボソーム核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブ配列ID番号:1がボレリア存在を検出するため、およびこのハイブリダイゼーションアッセイプローブが血液中に普通に観察される他の生物体と交差反応しないことを決定するために使用された。ハイブリダイゼーションプローブは細胞溶解物中で、ヘルパーオリゴヌクレオチド配列ID番号:3および5の存在下、ボレリア核酸にハイブリダイズされた。アッセイは上記実施例1に記載されたように直接ハイブリダイゼーションフォーマットを用いて実施された。各々の試料中のリボソームrRNAの存在は試料を全細菌プローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチド配列ID番号:58、59、60および61、または真菌プローブおよびヘルパープローブ配列ID番号:62および63とハイブリダイズすることにより確認された。このアッセイでは、30,000相対的光ユニット(RLU)より大きな値は陽性と考えられる。このアッセイの結果は下記表9に示されている。
【0195】
【表9】
【0196】
実施例10 三つの異なった系統発生学的群からのライム病関連ボレリアの増幅および検出
報告されている配列は異なったライム病関連ボレリア間のプローブ配列ID番号:2により標的とされる部位にrRNA配列の保存が示されている。以下のデータは本発明のプライマーおよびプローブが、ライム病に関連したボレリアの三つの系統発生学的グループ化を示す一つ以上の地理的場所からの単離物の増幅および検出に有用であることを示している。溶解物はB.ブルグドルフェリ株N40(グループI)、B.ガリニー株IP−90(ロシア単離物)および株014A(NBS16)(グループII)およびB.アフゼリー株IP−3(ロシア単離物)および株09A(ACA1、スエーデン単離物)からの培養物から、約15mlの培養液からの細胞を30mMリン酸ナトリウム、pH6.8、1mM EDTA、1mM EGTAおよび3%(w/v)ラウリル硫酸リチウムを含む0.1mlの溶液に再懸濁することにより調製される。各々の溶解物中の核酸量を定量するため、異なった量の溶解物および23S rRNA保存領域に方向付けられたプローブでハイブリダイゼーションを実施した。得られた値は既知の標品の結果と比較された。既知の量のB.ブルグドルフェリ、B.ガリニーおよびB.アフゼリー溶解物(約=3x10−19モルのRNA)は、配列ID番号:8の3’標的ハイブリダイズ領域(B.ブルグドルフェリ16S rRNAと相補的)の50ピコモルのプライマー、および配列ID番号:11のrRNAとして同じセンスのプライマー、および50mMトリスHCl、pH8、25mM KCl,2mM MgCl2,2.5U AmpliTaqポリメラーゼ(Perkin−Elmer)を含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅された。反応液は95℃で2分間加熱し、次に55℃1分、72℃1分、95℃0.5分のサイクルを35回行い、続いてアッセイまでに4℃に冷却する。アガロースゲル電気泳動は、三つすべての系統発生学的群からの核酸はエチジウムブロミド染色により検出可能な175塩基対断片を産生した。B.アフゼリー株09A核酸を含む試料の配列ID番号:2アクリジニウムエステル標識プローブへの56℃でのハイブリダイゼーションはこのプローブでの陽性信号を明らかにした(バックグラウンドの少なくとも19倍)。B.ブルグドルフェリ、B.ガリニー株IP−90または株014AまたはB.アフゼリー株IP−3核酸は60℃でハイブリダイズさせた場合、少なくともバックグラウンドの178倍の信号を与えた。B.アフゼリー098株は他の単離物よりも低いハイブリダイゼーション信号を与えたが、しかし、バックグラウンドを制して明らかに検出された。
実施例11 56℃でのライム病関連ボレリアの特異的増幅および検出
この実施例では、配列、配列ID番号:8から合成された30ピコモルのプロモーター−プライマーおよび配列ID番号:11のプライマーを含む100μlの反応液が使用された。溶解物は水で適した濃度に希釈され、プロモータープライマーを含む溶液に加えられ、95℃で15分加熱し、5分で42℃まで冷却した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV RT)900単位、および400単位のT7RNAポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は50mMトリスHCl、pH8.5、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mMATP、4mM UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1.2mM dCTP、1mM dGTP、20mM MgCl2、20mM N−アセチルーL−システイン、5%グリセロールを含んでいる。42℃で2時間インキュベーション後、全100μlの増幅反応液を配列ID番号:2のアクリジニウムエステル標識プローブおよび非標識ヘルパープローブ配列ID番号:4および6または配列ID番号:10と非標識ヘルパー配列ID番号:4および6によるハイブリダイゼーションでアッセイした。 ハイブリダイゼーションは0.05Mコハク酸リチウム pH5、0.6M LiCl、1%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、10mM EDTA、および10mM EGTAを含む200μlの溶液中、56℃で15分間で実施し、続いて300μlの0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、1%トリトンRX−100を加えた。この混合物は56℃で15分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々のチューブの残存化学発光を、1mM硝酸および0.1%過酸化水素の自動注入、続いて1Nの水酸化ナトリウムを注入装置を備えた続いてGen−Probe LEADERR Iルミノメータでアッセイした。結果はRLUで示されている。
【0197】
これらのデータは温度56℃でのプローブ配列ID番号:2のハイブリダイゼーションでもB.ブルグドルフェリおよびB.ヘルムシー間の明瞭な区別が可能であることを示している。
【0198】
【表10】
【0199】
実施例12 プロモーター配列を含む増幅プライマーを用いるボレリア核酸の増幅
プライマーなしでプロモーター−プライマーのみを用いる方式で増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブを使用してもよい。この方式はPCT公開番号WO93/22461号に記載されている。二つのプロモータープライマーが合成され、各々が5’末端で標的相補的配列(配列ID番号:8)の3’末端に共有結合で結合されたT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列、配列ID番号:43、5’−AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA−3’を含んでいる。一つのプロモータープライマーは遊離の3’OH基を持つように合成され、100μl反応液当たり4ピコモルで使用された。第二のプロモータープライマーは3’末端にアルカンジオールを持つように合成され、100μl反応液当たり26ピコモルで使用された。ボレリア溶解物は水で適した濃度に希釈され、プロモータープライマーを含む溶液に加えられ、95℃で5分加熱し、15分で42℃まで冷却した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLVRT)900単位、および400単位のT7RNAポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は50mMトリスHCl、pH8.5、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mM ATP、4mM UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、1mM dGTP、20mM UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、1mM dGTP、20mM MgCl2、20mM N−アセチルーL−システイン、5%グリセロールを含んでいる。42℃で3.5時間インキュベーション後、30μlの増幅反応液を配列ID番号:2のアクリジニウムエステル標識プローブおよび非標識ヘルパープローブ配列ID番号:4および6によるハイブリダイゼーションでアッセイした。 ハイブリダイゼーションは0.05Mコハク酸リチウム pH5、0.6M LiCl、1%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、10mM EDTA、および10mM EGTAを含む200μlの溶液中、60℃で15分間で実施し、続いて300μlの0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、1%トリトンRX−100を加えた。この混合物は60℃で15分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々のチューブの残存化学発光を、Gen−Probe LEADERR Iルミノメータでアッセイした。表には同一条件下、同一のプロモーター配列、配列ID番号:43、5’−AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA−3’および3’標的相補的領域配列ID番号:9を含んでいるプロモーター−プライマー対を用いて得られたデータも示されている。100μl当たり遊離3’OHを持つ4ピコモルのプロモーター−プライマーおよび3’アルカンジオール基を持つように合成された26ピコモルの同じプロモータープライマーが使用された。
【0200】
【表11】
【0201】
他の態様は以下の請求の範囲内に存在する。
【0202】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
配列番号: 1:
GCATAGACTT ATATATCCGC C 21
配列番号: 2:
GGCGGATATA TAAGTCTATG C 21
配列番号: 3:
TACTCACCCT TTACGCCCAA TAATCCCG 28
配列番号: 4:
CGGGATTATT GGGCGTAAAG GGTGAGTA 28
配列番号: 5:
CCAACATAGG TCCACAGTTG AGCTGTGGTA TTTTAT 36
配列番号: 6:
ATAAAATACC ACAGCTCAAC TGTGGACCTA TGTTGG 36
配列番号: 7:
AGCCGCGGTA ATACGTAAGG GTTTAGCGT 29
配列番号: 8:
CTTCCTCTAT CAGACTCTAG ACATATAGTT TCCAACATA 39
配列番号: 9:
CCACCCTTAC ACCAGAAATT CTAACTTCCT CTATCA 36
配列番号: 10:
GGCGGATATG CAAGTCTATG C 21
配列番号: 11:
AGCCGCGGTA ATACGTAAGG GGCGAGCGT 29
配列番号: 12:
GCAUAGACUU AUAUAUCCGC C 21
配列番号: 13:
GGCGGAUAUA UAAGUCUAUG C 21
配列番号: 14:
UACUCACCCU UUACGCCCAA UAAUCCCG 28
配列番号: 15:
CGGGAUUAUU GGGCGUAAAG GGUGAGUA 28
配列番号: 16:
CCAACAUAGG UCCACAGUUG AGCUGUGGUA UUUUAU 36
配列番号: 17:
AUAAAAUACC ACAGCUCAAC UGUGGACCUA UGUUGG 36
配列番号: 18:
CTGAAAAGTG TAGTCGATGG GAAACGGG 28
配列番号: 19:
GCACTCATCA TCACATCTTA GCTC 24
配列番号: 20:
CGTATTTTGC AGAGTTCCTT AACG 24
配列番号: 21:
GGTGATGATC TTGATAGGAA AATCCG 26
配列番号: 22:
GGTGTTGATT TTAGTAGGAA AATCCG 26
配列番号: 23:
CGATGGTTGT CCTAGTTTAA GCATTAA 27
配列番号: 24:
CGGATTTTCC TATCAAGATC ATCACC 26
配列番号: 25:
GGUGAUGAUC UUGAUAGGAA AAUCCG 26
配列番号: 26:
CGGAUUUUCC UAUCAAGAUC AUCACC 26
配列番号: 27:
TTAATGCTTA AACTAGGACA ACCATCG 27
配列番号: 28:
CGAUGGUUGU CCUAGUUUAA GCAUUAA 27
配列番号: 29:
UUAAUGCUUA AACUAGGACA ACCAUCG 27
配列番号: 30:
CGGATTTTCC TACTAAAATC AACACC 26
配列番号: 31:
GGUGUUGAUU UUAGUAGGAA AAUCCG 26
配列番号: 32:
CGGAUUUUCC UACUAAAAUC AACACC 26
配列番号: 33:
GCATAGACTT GCATATCCGC C 21
配列番号: 34:
GGCGGAUAUG CAAGUCUAUG C 21
配列番号: 35:
GCAUAGACUU GCAUAUCCGC C 21
配列番号: 36:
ACGCTAAACC CTTACGTATT ACCGCGGCT 29
配列番号: 37:
TATGTTGGAA ACTATATGTC TAGAGTCTGA TAGAGGAAG 39
配列番号: 38:
TGATAGAGGA AGTTAGAATT TCTGGTGTAA GGGTGG 36
配列番号: 39:
ACGCTCGCCC CTTACGTATT ACCGCGGCT 29
配列番号: 40:
CCCGTTTCCC ATCGACTACA CTTTTCAG 28
配列番号: 41:
GAGCTAAGAT GTGATGATGA GTGC 24
配列番号: 42:
CGTTAAGGAA CTCTGCAAAA TACG 24
配列番号: 43:
AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGA 27
配列番号: 44:
AGCCGCGGUA AUACGUAAGG GUUUAGCGU 29
配列番号: 45:
CUUCCUCUAU CAGACUCUAG ACAUAUAGUU UCCAACAUA 39
配列番号: 46:
CCACCCUUAC ACCAGAAAUU CUAACUUCCU CUAUCA 36
配列番号: 47:
AGCCGCGGUA AUACGUAAGG GGCGAGCGU 29
配列番号: 48:
CUGAAAAGUG UAGUCGAUGG GAAACGGG 28
配列番号: 49:
GCACUCAUCA UCACAUCUUA GCUC 24
配列番号: 50:
CGUAUUUUGC AGAGUUCCUU AACG 24
配列番号: 51:
ACGCUAAACC CUUACGUAUU ACCGCGGCU 29
配列番号: 52:
UAUGUUGGAA ACUAUAUGUC UAGAGUCUGA UAGAGGAAG 39
配列番号: 53:
UGAUAGAGGA AGUUAGAAUU UCUGGUGUAA GGGUGG 36
配列番号: 54:
ACGCUCGCCC CUUACGUAUU ACCGCGGCU 29
配列番号: 55:
CCCGUUUCCC AUCGACUACA CUUUUCAG 28
配列番号: 56:
GAGCUAAGAU GUGAUGAUGA GUGC 24
配列番号: 57:
CGUUAAGGAA CUCUGCAAAA UACG 24
配列番号: 58:
GGAACTTACC CGACAAGGAA TTTCGCTACC TTAGG 35
配列番号: 59:
ACCGTTATAG TTACGGCCGC CGTTTACTGG GGCTTC 36
配列番号: 60:
GCCTGGCCAT CGTTACGCCA TTCGTGCAGG TC 32
配列番号: 61:
GCCCAAATCG TTACGCCTTT CGTGCGGGTC 30
配列番号: 62:
CCCGACCGTC CCTATTAATC ATTACGATGG 30
配列番号: 63:
CTACGACGGT ATCTGATCAT CTTCGATCCC CTAACTTTCG TTCTTG 46
Claims (44)
- 非標的生物体に優先して、試料中に存在するかもしれないライム病関連ボレリアの検出に使用されるハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、当該プローブは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:12及び配列番号:13から成る群より選択される核酸配列を含む標的相補的部分を有し、ここで、当該プローブがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ライム病関連ボレリア由来の核酸に安定にハイブリダイズするが、ボレリア ヘルムシー、ボレリア トゥリカテ、ボレリア アンセリナ又はボレリア コリアセエ由来の核酸にはハイブリダイズせず、そして、当該ライム病関連ボレリアはボレリア ブルグドルフェリ、ボレリア ガリニー及びボレリアVS461群を含む、前記プローブ。
- 前記プローブは、前記条件下で、バクテロイデス フラギリス、カンジダ アルビカンス、大腸菌、ヘモフィラス インフルエンザ、クレブシエラ ニューモニエ、プロテウス ミラビリス、シュードモナス アエルギノサ又はスタフィロコッカス オーレウス由来の核酸とはハイブリダイズしない、請求項1記載のプローブ。
- 前記プローブの塩基配列が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:12及び配列番号:13から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項1又は2記載のプローブ。
- 検出可能な標識をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項記載のプローブ。
- 請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブと、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチドとを含む、プローブ混合物。
- 前記ヘルパーオリゴヌクレオチドが、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項5記載のプローブ混合物。
- 請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ及び第一ヘルパーオリゴヌクレオチドと第二ヘルパーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物であって、前記第一ヘルパーオリゴヌクレオチドは配列番号:3及び配列番号:14から成る群より選択される核酸配列を含み、そして、前記第二ヘルパーオリゴヌクレオチドは配列番号:5及び配列番号:16から成る群より選択される核酸配列を含む、前記プローブ混合物。
- 前記第一ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:3及び配列番号:14から成る群より選択される核酸配列から成り、そして、前記第二ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:5及び配列番号:16から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項7記載のプローブ混合物。
- 請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ、及び第一ヘルパーオリゴヌクレオチドと第二ヘルパーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物であって、前記第一ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:4及び配列番号:15から成る群より選択される核酸配列を含み、そして、前記第二ヘルパーオリゴヌクレオチドは配列番号:6及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列を含む、前記プローブ混合物。
- 前記第一ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:4及び配列番号:15から成る群より選択される核酸配列から成り、そして、前記第二ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:6及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項9記載のプローブ混合物。
- 請求項1〜4いずれか1項のプローブ及びライム病関連ボレリア由来の核酸の間に形成した核酸ハイブリッドを含む組成物。
- 請求項5又は6記載のプローブとヘルパーオリゴヌクレオチド及びライム病関連ボレリア由来の核酸の間に形成した核酸ハイブリッドを含む組成物。
- 請求項7〜10いずれか1項に記載のプローブと第一ヘルパーオリゴヌクレオチドと第二ヘルパーオリゴヌクレオチド、及びライム病関連ボレリア由来の核酸の間に形成した核酸ハイブリッドを含む組成物。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の存在を検出する方法であって、下記の工程:
a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブと試料とを接触させ;そして
b)前記試料中のライム病関連ボレリア核酸の存在の指標として、前記プローブの存在を検出する
ことを含む、前記方法。 - 一つ又はそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドを用いて、試料中のライム病関連ボレリア核酸を増幅する工程をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドが、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:44、配列番号:46及び配列番号:47から成る群より選択される核酸配列を含む増幅オリゴヌクレオチドを含む、請求項15記載の方法。
- 前記増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:44、配列番号:46及び配列番号:47から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより阻害若しくは延長を促進する5’核酸配列から成る、請求項16記載の方法。
- 核酸配列が配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される、請求項16又は17記載の方法。
- 核酸配列が配列番号:9及び配列番号:46から成る群より選択される、請求項16又は17記載の方法。
- 核酸配列が配列番号:11及び配列番号:47から成る群より選択される、請求項16又は17記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドが下記:
配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される核酸配列を含む第一増幅オリゴヌクレオチド;そして
配列番号:8及び配列番号:45から成る群より選択される核酸配列を含む第二増幅オリゴヌクレオチド
を含む、請求項15記載の方法。 - 前記第一増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:7及び配列番号:44、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始又は延長を促進する5’核酸配列から成る群より選択される核酸配列から成り、そして、前記第二増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:8及び配列番号:45、及び、場合により、RNAポリメラーゼによって認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始又は延長を増強する5’核酸配列から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項21記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドが下記:
配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される核酸配列を含む第一増幅オリゴヌクレオチド;そして
配列番号:9及び配列番号:46から成る群より選択される核酸配列を含む第二増幅オリゴヌクレオチド
を含む、請求項15記載の方法。 - 前記第一増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成り、そして、前記第二増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:9及び配列番号:46から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成る、請求項23記載の方法。
- 前記一つ又はそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドが、下記:
配列番号:8及び配列番号:45から成る群より選択される核酸配列を含む第一増幅オリゴヌクレオチド;そして
配列番号:11及び配列番号:47から成る群より選択される核酸配列を含む第二増幅オリゴヌクレオチド
を含む、請求項15記載の方法。 - 前記第一増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:8及び配列番号:45から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成り、そして、前記第二増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:11及び配列番号:47から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成る、請求項25記載の方法。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の存在を検出する方法であって、下記の工程:
a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項5〜10いずれか1項に記載のプローブ混合物と試料とを接触させること;そして
b)前記試料中のライム病関連ボレリア核酸の存在の指標として、前記プローブの存在を検出すること
を含む、前記方法。 - 試料中のライム病関連ボレリア核酸の検出に使用するためのキットであって、下記:
請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ;そして
配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチド
を含む、前記キット。 - 前記ヘルパーオリゴヌクレオチドが、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項28記載のキット。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の検出に使用するキットであって、下記:
請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ;
配列番号:3及び配列番号:14から成る群より選択される核酸配列を含む第一ヘルパーオリゴヌクレオチド;そして
配列番号:5及び配列番号:16から成る群より選択される核酸配列を含む第二ヘルパーオリゴヌクレオチド
を含む、前記キット。 - 前記第一ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:3及び配列番号:14から成る群より選択される核酸配列から成り、そして、前記第二ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:5及び配列番号:16から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項30記載のキット。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の検出に使用するキットであって、下記:
請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ;そして
配列番号:4及び配列番号:15から成る群より選択される核酸配列を含む第一ヘルパーオリゴヌクレオチド;及び
配列番号:6及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列を含む第二ヘルパーオリゴヌクレオチド
を含む、前記キット。 - 前記第一ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:4及び配列番号:15から成る群より選択される核酸配列から成り、そして、前記第二ヘルパーオリゴヌクレオチドが配列番号:6及び配列番号:17から成る群より選択される核酸配列から成る、請求項32記載のキット。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の増幅及び検出に使用するキットであって、下記:
請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ;そして
配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:44、配列番号:46及び配列番号:47から成る群より選択される核酸配列を含む増幅オリゴヌクレオチド
を含む、前記キット。 - 前記増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:44、配列番号:46及び配列番号:47から成る群より選択される核酸配列、及び任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成る、請求項34記載のキット。
- 前記核酸配列が配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される、請求項34又は35記載のキット。
- 前記核酸配列が配列番号:9及び配列番号:46から成る群より選択される、請求項34又は35記載のキット。
- 前記核酸配列が配列番号:11及び配列番号:47から成る群より選択される、請求項34又は35記載のキット。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の増幅及び検出に使用するキットであって、下記:
請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ;そして
配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される核酸配列を含む第一増幅オリゴヌクレオチド;及び
配列番号:8及び配列番号:45から成る群より選択される核酸配列を含む第二増幅オリゴヌクレオチド
を含む、前記キット。 - 前記第一増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成り、そして、前記第二増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:8及び配列番号:45から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成る、請求項39記載のキット。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の増幅及び検出に使用するキットであって、下記:
請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ;そして
配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される核酸配列を含む第一増幅オリゴヌクレオチド;及び
配列番号:9及び配列番号:46から成る群より選択される核酸配列を含む第二増幅オリゴヌクレオチド
を含む、前記キット。 - 前記第一増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:7及び配列番号:44から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成り、そして、前記第二増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:9及び配列番号:46から成る群より選択される核酸配列、及び、任意の、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成る、請求項41記載のキット。
- 試料中のライム病関連ボレリア核酸の増幅及び検出に使用するキットであって、下記:
請求項1〜4いずれか1項に記載のプローブ;そして
配列番号:8及び配列番号:45から成る群より選択される核酸配列を含む第一増幅オリゴヌクレオチド;及び
配列番号:11及び配列番号47から成る群より選択される核酸配列を含む第二増幅オリゴヌクレオチド
を含む、前記キット。 - 前記第一増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:8及び配列番号:45から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成り、そして、前記第二増幅オリゴヌクレオチドが配列番号:11及び配列番号:47から成る群より選択される核酸配列、及び、任意に、RNAポリメラーゼにより認識されるか、又はRNAポリメラーゼにより開始若しくは延長を促進する5’核酸配列から成る、請求項43記載のキット。
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