CN113186317A - 一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物、试剂盒及其应用，涉及病原体检测技术领域。该核酸组合物可同时满足这两种病原体的准确检出。经验证，发明人提供的上述核酸组合物灵敏度高，对于两种病原体的最低检测限均达到5×102copies/mL，其检测灵敏度远高于现有的鉴定方法的检测灵敏度。另外，上述核酸组合物具有特异性强的优势，极大程度上杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果；采用本发明提供的核酸组合物具有检测时间短的优势，且检测过程无需开盖，无污染。

Description

一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及病原体检测技术领域，具体而言，涉及一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
犬猫动物不仅可以携带危害犬猫健康的病原体，也能携带传播多中能够人畜共患病。弓形虫病和钩端螺旋体病是较为常见的人畜共患病。其中，弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，TOXO)所引起的人畜共患病，广泛寄生在人和动物的有核细胞内，是人和动物孕期宫内感染导致胚胎畸形的重要病原体之一。钩端螺旋体病(Leptospirosis)简称钩体病，是由钩端螺旋体(Leptospira)感染引起的人畜共患病，广泛存在于世界各地。患犬临床表现多样，主要有发热、黄疸、血红蛋白尿、流产等。
目前临床的诊断方法有病原学检测，但其存在检测周期长、危险性大的问题，免疫学检测的灵敏度较低，检测病原单一。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物、试剂盒及其应用以实现快速准确同时检测引起人畜共患病的两种常见病原。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物，人畜共患病病原体包括弓形虫和钩端螺旋体，核酸组合物包括分别用于检测弓形虫和钩端螺旋体的第一核酸组合物和第二核酸组合物；
第一核酸组合物包括与SEQ ID NO.1-2所示的序列至少80％一致性的第一引物对以及与SEQ ID NO.3所示的序列至少80％一致性的第一探针；第二核酸组合物包括与SEQID NO.4-5所示的序列至少80％一致性的第二引物对以及与SEQ ID NO.6所示的序列至少80％一致性的第二探针。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一核酸组合物包括与SEQ ID NO.1-2所示的序列至少90％一致性的第一引物对以及与SEQ ID NO.3所示的序列至少90％一致性的第一探针；第二核酸组合物包括与SEQ ID NO.4-5所示的序列至少90％一致性的第二引物对以及与SEQ ID NO.6所示的序列至少90％一致性的第二探针。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一核酸组合物包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对以及SEQ ID NO.3所示的第一探针；第二核酸组合物包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对以及SEQ ID NO.6所示的第二探针。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一探针和第二探针的5’端均标记有荧光报告基团，且第一探针和第二探针的3’端均标记有荧光猝灭基团。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。
本发明提供了一种试剂盒，其包括上述的核酸组合物。
本发明提供了一种核酸组合物在制备试剂盒中的应用。
本发明提供了一种试剂，其包括上述的核酸组合物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂为冻干试剂。
核酸组合物或试剂在鉴定或辅助鉴定人畜共患病病原体中的应用；该应用为非疾病诊断或治疗为目的的应用；病原体为弓形虫和钩端螺旋体这两种病原中的至少一种。
含有上述的核酸组合物的鉴定或辅助鉴定人畜共患病病原体的芯片。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种检测弓形虫、钩端螺旋体的核酸组合物，该核酸组合物可同时满足这两种病原体的准确检出。经验证，发明人提供的上述核酸组合物灵敏度高，对于两种病原体的最低检测限均达到5×102copies/mL，其检测灵敏度远高于现有的鉴定方法的检测灵敏度。另外，上述核酸组合物具有特异性强的优势，极大程度上杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果；采用本发明提供的核酸组合物具有检测时间短的优势，且检测过程无需开盖，无污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为弓形虫引物探针筛选结果图；
图2是钩端螺旋体引物探针筛选结果图；
图3是试剂盒特异性测试中弓形虫检测通道结果图；
图4是试剂盒特异性测试中钩端螺旋体检测通道结果图；
图5是试剂盒检测限测试中弓形虫在最低检测限时的扩增图；
图6是试剂盒检测限测试中钩端螺旋体在最低检测限时的扩增图；
图7为弓形虫样本的检测扩增图；
图8是钩端螺旋体样本的检测扩增图；
图9为弓形虫质粒的PCR的扩增产物的测序结果BLAST对比图；
图10为钩端螺旋体质粒的PCR的扩增产物的测序结果BLAST对比图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物，人畜共患病病原体包括弓形虫和钩端螺旋体，核酸组合物包括分别用于检测弓形虫和钩端螺旋体的第一核酸组合物和第二核酸组合物；
第一核酸组合物包括与SEQ ID NO.1-2所示的序列至少80％一致性的第一引物对以及与SEQ ID NO.3所示的序列至少80％一致性的第一探针；第二核酸组合物包括与SEQID NO.4-5所示的序列至少80％一致性的第二引物对以及与SEQ ID NO.6所示的序列至少80％一致性的第二探针。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一核酸组合物包括与SEQ ID NO.1-2所示的序列至少90％一致性(例如98％或99％序列一致性)的第一引物对以及与SEQ ID NO.3所示的序列至少90％一致性(例如98％或99％序列一致性)的第一探针；第二核酸组合物包括与SEQ ID NO.4-5所示的序列至少90％一致性(例如98％或99％序列一致性)的第二引物对以及与SEQ ID NO.6所示的序列至少90％一致性(例如98％或99％序列一致性)的第二探针。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一核酸组合物包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对以及SEQ ID NO.3所示的第一探针；第二核酸组合物包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对以及SEQ ID NO.6所示的第二探针。
序列如下所示：
Figure BDA0003092516170000051
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一探针和第二探针的5’端均标记有荧光报告基团，且第一探针和第二探针的3’端均标记有荧光猝灭基团。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。
在其他实施方式中，上述荧光报告基团以及猝灭基团可以根据需要进行自适应调整，并不限于上述限定的几种类型。
本发明提供了一种试剂盒，其包括上述的核酸组合物。在其他实施方式中，上述的试剂盒还包括荧光定量PCR所需的缓冲液、DNA聚合酶和水。
本发明提供了一种核酸组合物在制备试剂盒中的应用。
本发明提供了一种试剂，其包括上述的核酸组合物。在一种实施方式中，上述试剂中含有用于保护核酸组合物的冻干保护剂等组分。
需要说明的是，可选的，将上述第一引物对的两条上下游引物分装于保存容器中，再将所对应的第一探针进行单独保存；可选的，将上述第二引物对的两条上下游引物分装于保存容器中，再将所对应的第二探针进行单独保存。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂为冻干试剂，例如冻干粉剂。
核酸组合物或试剂在鉴定或辅助鉴定人畜共患病病原体中的应用；该应用为非疾病诊断或治疗为目的的应用；病原体为弓形虫和钩端螺旋体这两种病原中的至少一种。
含有上述的核酸组合物的鉴定或辅助鉴定人畜共患病病原体的芯片。例如在芯片的固相载体上锚固上述的核酸组合物以实现弓形虫及钩端螺旋体的检测。固相载体可以选择市售的任意一种载体。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物，人畜共患病病原体包括弓形虫和钩端螺旋体，核酸组合物包括分别用于检测弓形虫和钩端螺旋体的第一核酸组合物和第二核酸组合物。上述核酸组合是通过查询两种病原的相关资料文献，并对相关基因进行分析筛选获得的。具体地，第一核酸组合物是根据NCBI登录号为AF146527的弓形虫529bp重复序列设计的引物和探针序列；第二核酸组合物是根据钩端螺旋体的23S rRNA设计的引物探针(本发明提供的第二核苷酸组合物覆盖了钩端螺旋体的多个基因型。Leptospira interrogans(问号钩端螺旋体)、Leptospira weilii(韦氏钩端螺旋体)、Leptospira kmetyi、Leptospira borgpetersenii(博氏钩端螺旋体)、Leptospirasantarosal(圣地罗西钩端螺旋体)、Leptospira mayottensis)。使用引物探针设计软件选择合适的序列，即尽量避免引物间形成二聚体和发卡结构，且其引物退火温度在60℃左右。
第一核酸组合物包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对以及SEQ ID NO.3所示的第一探针；第二核酸组合物包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对以及SEQ ID NO.6所示的第二探针。
实施例2
本实施例提供了一种检测弓形虫、钩端螺旋体的核酸检测试剂盒，其包括实施例1的核酸组合物。
试剂盒采用25μL反应体系，包括13.5μL的PCR反应液(逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2)；
弓形虫的引物探针组：0.5μL的TOXO-F、0.5μL的TOXO-R、0.4μL的TOXO-P；
钩端螺旋体的引物探针组：0.5μL的钩体-F、0.5μL的钩体-R、0.4μL的钩体-P，3.7μL的DEPC处理水、5μL的模板。其中PCR反应液购自(珠海宝锐生物)。
对比例1
提供了一种检测弓形虫和钩端螺旋体的核酸组合物，其包括表1所示的用于检测弓形虫的TOXO-F1与TOXO-R1引物对，以及TOXO-P1探针；用于检测钩端螺旋体的钩体-F1和钩体-R1引物对以及钩体-P1探针。
需要说明的是，本对比例中的核酸组合物的序列筛选方法同实施例1。
表1序列表。
Figure BDA0003092516170000081
实验例1
本实验例对上述实施例1和对比例1中的核酸组合物进行筛选测试。
具体地，委托赛默飞世尔科技公司合成实施例1和对比例1中的引物探针，并按照说明书进行稀释。
委托西安擎科生物科技有限公司合成相关病原体的质粒，弓形虫的质粒是将529bp的重复序列***大肠杆菌载体获得，钩端螺旋体质粒是将23S rRNA中的一段序列***大肠杆菌载体获得。
分别使用TOXO-F与TOXO-R、TOXO-F1与TOXO-R1、钩体-F钩体-R、钩体-F1钩体-R1为引物探针组，配制PCR试剂。
反应体系为25μL，包括13.5μLPCR反应液(Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2等)。
其中，弓形虫的引物探针组：0.5μL的TOXO-F/TOXO-F1、0.5μL的TOXO-R/TOXO-R1、0.4μL的TOXO-P/TOXO-P1；钩端螺旋体的引物探针组：0.5μL的钩体-F/钩体-F1、0.5μL的钩体-R/钩体-R1、0.4μL的钩体-P/钩体-P1。
DEPC处理水3.7μL、并加入对应的阳性质粒样本5μL进行扩增，两种病原体的扩增程序均为：95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 30s，共40个循环。
荧光定量扩增曲线如图1和图2所示。
对各引物或探针组合的扩增结果进行筛选，优选的引物组应满足Ct值较小且荧光值更高。按照图1和图2的对比结果，选出每种病原体检测结果中最佳的一对引物，即实施例1提供的核酸组合物其Ct值较小且荧光值更高。
为确认各引物或探针的特异性，将PCR的扩增产物进行测序，测序委托西安擎科生物科技有限公司进行。测序结果在NCBI中进行BLAST对比，对比结果显示扩增产物确实为弓形虫(图9)或钩端螺旋体(图10)的片段，符合预期。
实验例2
试剂盒特异性测试：
按照上述实施例2中弓形虫、钩端螺旋体核酸检测试剂盒的组分及比例进行配制PCR反应体系，然后分别加入目标质粒和其它干扰病原体质粒进行测试。病原体包括弓形虫、钩端螺旋体、吉氏巴贝斯虫、犬巴贝斯虫、布鲁氏杆菌。吉氏巴贝斯虫和犬巴贝斯虫为阳性样本，布鲁氏杆菌购买自金宇保灵生物药品有限公司布氏菌病活疫苗(S2株)。按照试剂盒的反应体系与反应条件进行扩增。
PCR反应条件为：(1)95℃预变性2min；(2)95℃变性5s；(3)60℃退火/延伸20s，采集荧光。其中(2)-(3)共进行40个循环。
图3为弓形虫检测通道扩增图，其中有扩增曲线的为弓形虫，其余病原均未扩增；图4为钩端螺旋体检测通道扩增图，其中有扩增曲线的为钩端螺旋体，其余病原均未扩增。结果显示，实施例2提供的试剂盒具有较好的特异性。
试剂盒重复性测试：
本实验对弓形虫及钩端螺旋体质粒进行扩增，每种样本重复扩增10次，得出下表数据，变异系数(CV，％)均小于2％。
TOXO 钩体
平均Ct值 24.55 35.48
CV,％ 1.64 1.36
试剂盒灵敏度测试：
将弓形虫及钩端螺旋体的质粒分别稀释至5×102copies/mL、2.5×102copies/mL后进行扩增，选择检出率在95％以上的最低浓度即为检测检浓度。最终确认弓形虫、钩端螺旋体的检测限为5×102copies/mL。
图5是弓形虫的质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图、图6是钩端螺旋体的质粒在最低检测限(5×102copies/mL)时的扩增图。图5和图6中所示的重复曲线为多次重复测试的扩增图。
图7是弓形虫样本的检测扩增图、图8是钩端螺旋体样本的检测扩增图。
需要说明的是，当Ct≤36的时候判断为阳性，Ct>36的时候判断为阴性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海基灵生物科技有限公司
<120> 一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物、试剂盒及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcaggactgt agatgaag 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccactcttca attctctc 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtcgtctcg tctggatcgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagccaccc tttaaagaca 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccatgctta gtcccgatta gt 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agctcactgg tcgagtgctc gg 22

Claims (10)

1.一种检测人畜共患病病原体的核酸组合物，其特征在于，所述人畜共患病病原体包括弓形虫和钩端螺旋体，所述核酸组合物包括分别用于检测所述弓形虫和钩端螺旋体的第一核酸组合物和第二核酸组合物；
所述第一核酸组合物包括与SEQ ID NO.1-2所示的序列至少80％一致性的第一引物对以及与SEQ ID NO.3所示的序列至少80％一致性的第一探针；所述第二核酸组合物包括与SEQ ID NO.4-5所示的序列至少80％一致性的第二引物对以及与SEQ ID NO.6所示的序列至少80％一致性的第二探针。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一核酸组合物包括与SEQ IDNO.1-2所示的序列至少90％一致性的第一引物对以及与SEQ ID NO.3所示的序列至少90％一致性的第一探针；所述第二核酸组合物包括与SEQ ID NO.4-5所示的序列至少90％一致性的第二引物对以及与SEQ ID NO.6所示的序列至少90％一致性的第二探针；
优选地，所述第一核酸组合物包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对以及SEQ ID NO.3所示的第一探针；所述第二核酸组合物包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对以及SEQ IDNO.6所示的第二探针。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针的5’端均标记有荧光报告基团，且所述第一探针和所述第二探针的3’端均标记有荧光猝灭基团。
4.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。
5.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的核酸组合物。
6.一种如权利要求1-4任一项所述的核酸组合物在制备试剂盒中的应用。
7.一种试剂，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的核酸组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述试剂为冻干试剂。
9.权利要求1-4任一项所述的核酸组合物或权利要求7-8所述的试剂在鉴定或辅助鉴定人畜共患病病原体中的应用；所述应用为非疾病诊断或治疗为目的的应用；所述病原体为弓形虫和钩端螺旋体这两种病原中的至少一种。
10.含有权利要求1-4任一项所述的核酸组合物的鉴定或辅助鉴定人畜共患病病原体的芯片。
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