JP4066460B2

JP4066460B2 - 骨疾患治療薬

Info

Publication number: JP4066460B2
Application number: JP50745997A
Authority: JP
Inventors: 亘隆井田; 知比古鈴木; 栄美熊谷
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1995-07-25
Filing date: 1996-07-25
Publication date: 2008-03-26
Anticipated expiration: 2016-07-25
Also published as: EP0783891B1; EP1416282A2; EP1759708A1; DE69636790T2; EP0783891A4; DE69636790D1; EP0783891A1; US20050180954A1; EP1416282A3; WO1997004799A1; CA2200879A1

Description

技術分野
本発明はβ型インターフェロンの骨疾患用医薬に関するものであり、物理的、代謝学的、悪性新生物的などさまざまな原因による骨疾患に対し、予防または治療薬として利用される。また、本発明にはインターフェロン産生誘発剤の骨疾患予防および治療における医薬用途も含まれる。
背景技術
骨は脊椎動物においてその体を支える重要な組織である。その見掛上のイメージとは異なり、骨は活発に主に破骨細胞による破壊と骨芽細胞による形成を繰り返しており、両作用の絶妙なバランスのもとにその形態と物理的強度の恒常性を維持している。このバランスが崩れると様々な骨疾患が生じ、近年では特に骨粗鬆症が医学的にも社会的にも大きな問題となっている（折茂肇、小沢英浩、「目で見る骨粗鬆症」、メヂカルビュー社、1990）。骨粗鬆症は必ずしも骨吸収が異常に高い状態でのみ出現する疾患ではなく、例えば、骨吸収が低い状態であっても骨形成反応が更に低下した場合には出現する。骨粗鬆症には骨吸収および骨形成反応が共に盛んである高回転型、骨吸収および骨形成が共に低下している低回転型が存在する。前者はＩ型とも言われ閉経後の婦人に多発し、後者はII型とも称され男女を問わず老人に多発する。即ち、あくまでも骨形成反応と骨吸収反応の相対的バランスが重要であり、その結果が最終的に骨量、骨強度として反映される。従って、特に骨密度が低下する骨疾患に対しては骨形成速度を骨吸収速度に対して相対的に高めるか、骨吸収速度を骨形成速度に対して相対的に低下させる手段の適用が治療に有効であるとされている。
骨吸収過程では破骨細胞が、骨形成過程では骨芽細胞がその主役を果たしている（Baron, R.,et al., Bone and Mineral Res., 2,175-243, Elsevier, New York,1984）。閉経あるいは老化と言った生理的原因以外にもこれらの細胞の増殖、分化、機能発現に影響し、両者の相対的バランスを乱せば、その要因が物理的、化学的、生物学的、更に原因不明ないずれであっても、各種骨疾患を引き起こす。骨吸収および骨形成の相対的バランスを乱すものには、例えば、癌関連として肺癌、乳癌、腎癌の骨転移、多発性骨髄腫など、代謝性骨疾患として骨ページェット病、クル病、骨軟化症、大理石病、変形性関節炎、骨形成不全症など、ホルモン異常性関連として副腎皮質機能異常、副甲状腺機能異常に起因するもの、自己免疫異常による慢性関節リューマチ、その他歯周病に関連する歯槽骨疾患などがある。骨芽細胞は中胚葉に由来する未分化間葉系細胞から分化してくる単核の細胞である。実験動物の骨組織から分離、採取された骨芽細胞はin vitroでも***増殖する性質があることから多くの株化細胞も得られている。例えば、MC3T3-E1株（Sudo, H.et al., J.Cell Biol.,96, 191,1983）、ROS17/2株、UMR106株（Fraser, J. D.et.al., J. Biol. Chem., 263, 911, 1988）、RCT-3株（Hearth, J. K.et al., Endocrinology, 124, 3060, 1988）などがある。
破骨細胞は多核の大型細胞で（Wergedal, J. E., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,134, 244, 1970, Clark,S.E.et al., J. Bone Mineral Res., 4, 399, 1989），カルシトニンレセプターを有し（Warshawsky, H. D.et al.,J. Cell Biol.,85, 682, 1980, Nicholson, G. C. et al., J. Clin. Invest., 78, 355, 1986）、骨吸収においては骨基質に含まれるカルシウムをイオン化して体液中に移行させる（Blair, H.C. et al., Sience, 245, 855, 1989）などの特徴を持っている。破骨細胞は発生学的には骨髄細胞から分化し形成される。骨髄もしくは脾臓の単核細胞を活性型ビタミンＤ３やプロスタグランヂンＥ２などの共存のもとに培養すると破骨細胞の基本的性格を発現する破骨細胞様細胞が形成されることが知られている（Takahashi, N. et al., Endocrinology, 122, 1373, 1988, Udagawa, N.et al., Endocrinology, 125, 1805, 1989）。
インターフェロン（以下「ＩＦＮ」と略す）は抗ウイルス作用、抗腫瘍作用を始めとして様々な生理活性を示すタンパク質であり、現在その発見の経緯、構造、物理化学的性質の違いによりα型、β型、γ型に分類されている。例えば、α型は主に白血球、リンパ芽球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞など、β型は主に線維芽細胞、γ型は主にＴ細胞、ＮＫ細胞により産生される。いずれのＩＦＮについても既に抗腫瘍剤あるいは肝炎治療剤として市販され、ヒト臨床治療で使用されている。α型ＩＦＮの骨代謝への関与として、骨粗鬆症患者に対する活性型ビタミンＤ３あるいはカルシトニンの投与は血液中ＩＦＮ-αレベルの増加をもたらす事から（Shiozawa, S. et al, Gerontol., 35, 305, 1989）、何らかの関係が示唆された（藤田拓男、Clinical Calcium, 2, 852, 1992）。In vitroではヒト臍帯血を材料として各種ヒト遺伝子組み替えα型ＩＦＮによる破骨細胞様細胞の形成阻害の報告がある（穴井恭市ら、日本骨代謝学会雑誌、9巻、238、1991）。更に、ヒト遺伝子組み替えα型ＩＦＮによるＣ型肝炎の治療を行った患者で治療前に比べ骨吸収の指標となる尿中デオキシピリジノリンの値が低下したり（吉田博昭ら、日本骨代謝学会雑誌、12巻、215、1994）、骨量が増加したとする報告（川勝充ら、日本骨代謝学会雑誌、12巻、234、1994）がある一方で、ヒト遺伝子組み替えα型ＩＦＮ投与はＣ型肝炎患者の骨量に全く影響を与えないとの否定的な報告もあり（田中俊博ら、日本消化器病学会雑誌、91巻、演題0-423、1994）、評価は混沌としている。この効果の有無に関する混沌とした状況は基礎研究レベルでもみられる。即ち、骨の器官培養系でもパラサイロイドホルモンで誘発した骨吸収をマウスＩＦＮが阻害するとのin vitro実験報告がある（Jilka, R. L. and Hamilton, J. W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 553, 1984）一方で、脱灰した骨マトリックスを皮下移植したマウスに対しマウスＩＦＮを投与しても何等影響は無かったとのin vivo実験報告もある（Nilsson, O. S.et al,J. Interferon Res., 4, 135, 1984）。これらの実験に用いられたＩＦＮはいずれもα型とβ型の混合物である。さらに、リューマチ様関節炎に対しα型ＩＦＮは全く無効との報告や（Kajandahl, A. et al., Lancet, Vol. i, 984, 1979）、さらには、ＩＦＮは実験滑膜炎を惹起させ、ヒトでは自家免疫病を誘発するとするマイナス面を主張する報告（Rosenbach、T.O. et al., Clin. Rheumatol., 3, 361-364, 1984）さえある。従って、ＩＦＮ自体の評価が定まっていない事に加え、β型ＩＦＮ単独での作用の有無については全く判明していない。
ＩＦＮの骨代謝に及ぼす作用の有無が曖昧であった原因の少なからざる部分はＩＦＮの持つ種特異性という特性によっている。特にβ型ＩＦＮではα型ＩＦＮと異なり種特異性が強い。すなわち、β型ＩＦＮ試験の正当な評価は本来その動物種に対応した動物のβ型ＩＦＮで行わねばならない。前述したように骨量の増減はあくまでも骨形成系と骨吸収系への作用の相対的強弱で最終的に決定されるので、β型の骨に対する正当な評価は対応する動物種のＩＦＮ-βを用い、且つ厳密に、科学的にコントロールされた骨吸収系および骨形成系での比較実験で初めて可能になる。本発明者らの主張は、骨疾患分野の医薬の発明を完成させる上で、骨形成系と骨吸収系双方での相対評価が極めて重要な必須条件であるという点にある。この主張の正当性は、下記γ型ＩＦＮの例示でより明確、具体的に示すことが出来る。
ＩＦＮの骨代謝に及ぼす影響に関してはγ型に関しての報告が最も多い。その多くはTakahashiらの確立した骨髄細胞からの破骨細胞様細胞の形成の実験系に於て、ブラジキニン（Lerner, U. H. et al,Agen ts and Actions, 32, 305, 1991）、フォルスコリン、コレラトキシン（Lerner, U. H. et al, J. Bone Min. Res., 6, 551, 1991）、インターロイキン１（Foffmann, O.et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 143, 38, 1987）、あるいは活性型ビタミンＤ３（Gowen, M. et al, J. Bone Min. Res., 1, 469, 1986）刺激による形成が阻害される事実によって示されてきている。これらの報告に先立ち、γ型ＩＦＮの骨調節作用特許が既に提示されている（マインラットペテルリック、特願昭61-123862）。骨吸収系でのみ評価たれりとするなら、破骨細胞が骨吸収をするのでこの形成を抑制すれば骨量減少は抑制されるか、停止するかあるいは増加に転じるはずなので、γ型ＩＦＮの骨量改善薬としての発明が完成したとみなされたり、容易にその効果が推定されると言うことにもなりがちである。しかし、実体は全く逆であった。サイクロスポリンＡ投与で誘起される実験動物のオステオペニア（osteopeniaとは骨のカルシウム沈着もしくは密度の減少；ステッドマン医学大事典、改訂第２版、メジカルビュー社、1988）に対し、ＩＦＮ-γ投与は改善効果がなく、むしろ骨減少を引き起こす事実とその理由が骨塩沈着の抑制であろうとの示唆が報告された（Mann, G. N. et al, Endocrinology, 135, 1077, 1994）。さらに、あろう事かその後の研究によって、破骨細胞形成による骨吸収促進や活性化が治療や症状改善に必要とされる骨大理石病に対し強力な破骨細胞形成阻害能を有するγ型ＩＦＮが極めて優れた治療効果を動物（Rodriguiz, R.M. et al.,Pediatrics Res., 33, 384, 1993）およびヒト（Lyndon Key, Jr. L. et al., NewEngl. J. Med., 332, 1544, 1995）の両方で発揮したという皮肉な顛末に至っている。
すなわち、ＩＦＮの骨治療薬、特に骨量増加を必要とする骨疾患治療薬としての意義は単に当該医薬あるいは物質が示す骨吸収抑制作用のみでは不完全で、少なくとも骨形成系（骨芽細胞の増殖、分化、石灰化）全体に対し抑制が無いか、軽微であること、より好ましくは逆に骨形成系に対しては活性化作用のある事が証明されて初めて発明は完成される。実際に以下の課題の解決によりマウスＩＦＮ投与はマウス骨形成には何等効果が無いとする前述のNilssonら（J. Interferon Res., 4, 135, 1984）の主張とは全く逆の結論に本発明者らは到達する事が出来た。即ち、骨疾患モデル動物で一旦失われた骨量を回復させる骨形成促進効果の実証により本発明を完成させた。
発明の開示
本発明は、従来の物質的な曖昧さを解決し、かつ厳密にコントロールされた骨吸収系および骨形成系での相対評価から骨形成作用の有無を明らかにし、β型ＩＦＮを産業上および医療上有用な骨疾患の予防および治療薬として提供し、さらに本発明に至った発見の諸事実からα型、β型あるいはγ型ＩＦＮ誘発物質を骨疾患の予防および治療薬として医療の場に提供することになる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、破骨細胞様細胞の形成に対するマウスβ型、γ型ＩＦＮの阻害作用を示す骨髄細胞はddY系マウス由来である。
第２図は、破骨細胞様細胞の形成に対するマウスβ型γ型ＩＦＮの阻害作用を示す。骨髄細胞はC 57 BL/6系マウス由来である。
第３図は、マウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1株の増殖に対するマウスβ型、γ型ＩＦＮの作用を示す。
第４図は、マウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1株の石灰化に対するマウスβ型、γ型ＩＦＮ間の作用の違いを示す。
第５図は、マウスＩＦＮで処理したマウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1株の石灰化巣から抽出したカルシウム量を示す。
第６図は、マウスＩＦＮで処理したマウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1株の石灰化巣から抽出した無機リン量を示す。
第７図は、マウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1株におけるマウスβ型ＩＦＮの頻回投与による石灰化促進効果を示す。
第８図は、卵巣摘出で減少したマウス骨量のマウスＩＦＮ-β投与による回復効果を示す。
第９図は、卵巣摘出で増大した骨吸収に対するマウスＩＦＮ-β投与による抑制効果を示す。
第10図は、マウスＩＦＮ-β投与実験中のマウスの体重変化を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、先ず物質的な曖昧さを排する手段として高度に精製されたマウスＩＦＮを用いた。遺伝子操作技術による大量生産、精製はその目的のための良い一つの方法であり、それぞれ詳細な報告（マウスＩＦＮ-α：Shaw, G.D. et al., Nucleic Acids Research, 11, 556-573, 1982、マウスＩＦＮ-β：Higashi, Y., et al., J. Biol. Chem., 258, 9522, 1983, Senda, T. et al, Proc. Japan Acad., 66, Ser.B,77, 1990：マウスＩＦＮ-γ：Gray, P. W. and Goeddel, D. V., Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 5842, 1983）がある。勿論充分なレベルまでに精製されたものであれば天然型のマウスＩＦＮを用いても何ら問題はない。本発明における実施例中では、マウスＩＦＮ-αは市販品（Lot .B13010 10⁶units/ml/vial, Calbiochem-Novabiochem International, San Diego, CA）を用いた。マウスＩＦＮ-γはLot 254F3，2.06 x 10⁶units/mlの標品でGenentech, San Francisco, CAより提供されたされたものを用いた。マウスＩＦＮ-βは、Lot M-0034,10⁷units/ml/vialの当社で調製した標品を使用した。該マウスＩＦＮ-βの遺伝子組み替えによる大腸菌での生産方法、精製方法については既に詳細に報告されている（Tanaka, T. et al., J. Interferon Res., 6, 429,1986,Matsuda, S. et al., J. Interferon Res., 6, 519, 1986）。また、すでにこれらと同等の高純度マウスＩＦＮが他のメーカー（例えば、Hycult biotechnology社、Paesel GmbH社、Cosmo Bio社、Genzyme社）からも市販されているのでこれらを用いても良い。
生物学的評価の曖昧さの解決手段としては、同一動物種さらに同系統動物に由来する骨形成系細胞および骨吸収系細胞に対する相対活性を定量的に扱い、従来法による評価の欠点解消を計った。すなわち、同種実験動物であっても、その系統により各種ホルモンへの反応性が大きく変化することから、骨吸収系-骨形成系への相対効力も同系統で検討する必要がある。例えば、Ｉ型骨粗鬆症のモデルとしてマウスから卵巣摘出を行う場合にも骨量減少率に関してマウスに系統差が明確に存在することが知られている（保坂努ら、アニテックス、5巻、243、1992）。そこで、本発明者らは、高純度のマウスＩＦＮを用い、かつ同系統のマウスに由来する骨形成系を担う骨芽細胞系と、骨吸収系を担う破骨細胞系への作用を厳密かつ定量的に比較した。
その結果、β型ＩＦＮは破骨細胞形成を極めて強力に阻害する。その一方で、β型ＩＦＮは骨芽細胞系に対しては増殖能、分化能、石灰化能のいずれをも殆ど阻害しないばかりでなく、条件によっては石灰化をむしろ促進する事を初めて明らかにし本発明を完成した。本発明者らは、γ型ＩＦＮの強力な破骨細胞形成阻害を追認した。しかしその一方で、γ型ＩＦＮは骨形成系においては石灰化を強力に阻害することを骨芽細胞のみより成る単純なin vitroレベルで初めて明らかにした。この成績は既に紹介したin vivoレベルでのγ型ＩＦＮによる石灰化不全の類骨形成の成績（Mann, G. N. et al, Endocrinology, 135, 1077, 1994）を良く説明する。即ち、硬組織としての骨組織の完成に石灰化は必須のプロセスであり、γ型ＩＦＮに比べβ型ＩＦＮの性質は骨量改善に極めて好ましいものであることを証明して本発明は完成された。
β型ＩＦＮの強力な破骨細胞形成阻害は腫瘍関連の骨疾患、例えば乳癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎癌、大腸癌、消化器癌、食道癌などの骨転移（Stoll, B. A., Bone Metastasis: Monitoring and Treatment, Raven Press, N.Y., 1983）に対し予防および治療薬として有効に用いうる事は発明者自身が当然にも認識している事である。すなわち、腫瘍の骨転移巣の形成、進展には破骨細胞の増数、活性化が密接に関わっているからである（Galasco, C. B. S., Skeletal Metastases, Butterworths, pp 22-51, 1986）。従って、当然ながら、β型ＩＦＮは腫瘍に随伴する高カルシウム血症（腫瘍関連骨疾患の一態様）の治療にも有効に用い得る。本発明に於いて、ＩＦＮがin vitroで強力に破骨細胞形成を抑制し、一方で骨形成系細胞の増殖、分化、石灰化を支障無く進行させ、条件によっては石灰化を促進させる事実、更にin vivo骨粗しょう症モデル動物では骨吸収を抑制すると共に、一旦低下した骨量を増加させる事実は骨吸収系と骨形成系の両者での相対評価が必須であることを明らかに示すものである。骨吸収系に対する抑制効果が如何に強力であっても、それのみでは骨量改善を約束するものでない事は本発明中のＩＦＮ-γでの実験例および既に紹介した文献報告成績（Mann, G. N. et al, Endocrinology, 135, 1077, 1994）が明らかに物語っている。すなわち、ＩＦＮの骨吸収阻害作用を発見しても骨形成系への作用が明らかにされていなければ骨疾患予防あるいは治療薬としての発明は未完成である。
その曖昧さは本発明のin vitro試験において初めて解決されin vivo試験での実証により発明としての完成に至った。更に、β型ＩＦＮが生体を相対的に骨形成へと向かわせ、しかもその作用は骨量が正常値範囲にある生体より異常値範囲（例えば本発明の実施例の閉経後骨粗鬆症モデルにおける卵巣摘出マウス）にある生体で明瞭に現れた。即ち、本発明の実施例に示した様に、卵巣摘出で骨粗鬆状態になったマウスにおいて１０³units／頭／回の用量のＩＦＮ-β処置では骨量減少予防効果が示された。一方、偽手術群に於てもＩＦＮ-β投与による尿中デオキシピリジノリン（以下「D-Pyr」と略す。）排出抑制作用（骨吸収抑制作用）が発現しているが、それが直ちに当該マウスの著しい骨量増加をもたらしてはいない。これは骨代謝におけるホメオスターシスの発動により、いたずらな骨量増加、例えば骨大理石病のような状態に至らないように調節されているのかも知れない。事実、その乾燥骨重量は対照群である生理食塩水投与群のそれと同レベルであった。即ち、ＩＦＮ-βによる骨量増加効果は正常骨量レベルにある個体よりも低骨量（疾患、ホメオスターシスが乱れた）状態にある個体に対しより有効に発現する事を実証出来たのである。
これらの事実は、β型ＩＦＮが代謝性骨疾患、ホルモン異常性骨疾患、骨粗鬆症、骨折、歯槽骨疾患など骨組織全体であるいは部分的に異常骨量値を示す骨疾患の両者に対して予防的あるいは治療的な医薬として極めて有用である事も明らかに示すものである。本発明にあるＩＦＮの効果からはＩＦＮをヒト以外の動物の骨疾患にも用いる事が出来ることは明らかである。但し、ＩＦＮが有する種特異性からは該動物種に対応するＩＦＮであることが好ましい。近年、イヌやネコなどのコンパニオンアニマルの飼育環境は著しく改善され動物医療の現場での医療技術の高度化、バランスのとれた動物用食品の普及が進んでいる。その結果、コンパニオンアニマルも急速な高齢化社会を迎えている。これらの高齢化動物の示す歯科領域も含む多様な骨疾患の発現は驚くほどヒトのそれらに似ている。即ち、各種動物ＩＦＮは対応する動物種の代謝性骨疾患、ホルモン異常性骨疾患、骨粗鬆症、骨折、歯槽骨疾患などの予防および治療に用いることが出来る。
本発明に用いられるＩＦＮは、β型、あるいはβ型のアミノ酸配列を含むコンセンサス型や、ハイブリッド型のいずれでもよく、また由来も天然型、遺伝子組変え型、化学合成のいずれでもよい。
天然型インターフェロンβの生産では線維芽細胞およびその樹立株化細胞が好んで用いられる。遺伝子組換え型技術を利用してインターフェロンを調製する場合には、宿主細胞として、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などの哺乳動物細胞、カイコ、夜盗蛾などの昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物などを用いることができる。さらに、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。
この様にして調製されたインターフェロンβは、原料となる細胞培養上清、虫体抽出液、菌抽出液、生体抽出液から種々のクロマトグラフィーにより、精製分離することができる。用いるクロマトグラフィーは、インターフェロンβに親和性を有するものであればいずれでも良いが、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリン酸カルシウムを吸着素材とするカラム、ヘパリンや色素や疎水量をリガンドとするカラム、金属キレートカラム、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどである。
更に、本発明は骨疾患治療薬探索、評価の新規な方法を提供する。すなわち、従来の方法は試験物質をin vitroで骨芽細胞系細胞や破骨細胞（あるいは破骨細胞形成系統の細胞）に添加し、それぞれ骨形成能や骨吸収能を評価する方法であった。同様にin vivoにおいては動物に試験物質を投与して骨量を測定する手法が用いられている。これらは直接的な方法ではあるが多数の試験検体評価には時間も費用もかかる。一方、本発明の方法では骨疾患治療剤となるか否かの一次評価は、該検体のＩＦＮ産生能をまずin vitroついでin vivoで測定するという簡便な手段ですむ。また方法論的には間接的な手法であり、従来の直接法とは異なる。評価尺度の第１は産生されるＩＦＮの絶対量の多少であり、第２は骨吸収促進活性を示す他のサイトカイン、リンホカイン（例えば、インターロイキン１、インターロイキン６等）との相対産生量の比である。すなわち、ＩＦＮinducerを対象とした骨疾患治療薬探索においても相対活性概念の重要性を本発明者らは主張する。候補物質選択の第１及び第２の尺度の具体的数値は、２次評価に採用する試験系によって決定される。In vitroでＩＦＮ産生能評価に用いられる細胞は公知のいずれの細胞であってもよく、骨組織由来細胞も好ましく利用される。産生ＩＦＮ及び他のサイトカイン、リンフォカインの測定はバイオアッセイ、ＥＩＡ，ＲＩＡなど公知のいずれの方法によってもよい。
本発明により得られるＩＦＮはそれのみで医薬用途に用いてよいが、医薬品として容認し得る担体や医薬添加物を含んでいてもよい。例としては、水、生理食塩水、リンガー液、ハンクス液、およびグルコース液、ラクトース、デキストロース、エタノール、グリセロール、アルブミンなどの溶液を含む、非経口的投与に適した殆どのキャリアーが含まれる。これらの組成物は、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤、防腐剤、緩衝剤、界面活性剤および他の付属の添加剤を必要に応じて含み得る。また、ＩＦＮ投与により生ずる発熱等のいわゆるインフルエンザ様症状の予防あるいは抑制のために抗炎症剤をＩＦＮ製剤中に含有させることができる。実際の添加物は本発明が対象とする疾患の予防あるいは治療剤の剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
投与方法としては特に限定されるものではない。本発明の治療対象疾患に応じて投与方法が適宜選択される。経口的、および／または、皮下、筋肉内、腹腔内、経膣的、経直腸的あるいは静脈内注射を含む非経口的に全身的に、ならびに／あるいは、経鼻的に／あるいは経肺的に投与され得る。また、浸透圧ポンプ（例えば、alzet osmotic pump, Alzet Corporation, Palo Alto, CA）など体内留置型の徐放方式に適した製剤も本発明の対象とする疾患により選択され得る。
経鼻的にあるいは経肺的な投与方法に於ては微少液滴あるいは微少粉体を作り出す医学的に許容された適当なデバイスの利用と共に液状剤型あるいは粉体剤型が選択され得る。また、本発明によるＩＦＮは局所適応剤型としても利用される。例えば、注入、あるいは、持続放出型キャリアーの外科手術的埋め込みが治療部位に直接行われ得る。これらキャリアーとしてはヒドロゲル類、ポリ乳酸、およびコラーゲンマトリックス類が含まれる。コラーゲンマトリックス類としてはヒト以外の動物由来のコラーゲンを利用する場合はキャリアー自体の抗原性を消去したアテロコラーゲン（例えば、Zyderm, Collagen Corp., Palo Alto, CA）の利用が好ましい。また、整形外科、歯科領域に於て骨局所の再建に利用されるヒドロキシアパタイトカルシウムホスフェート（例えば、HA-TCP, Zimmer Inc., Warsaw, IN）も適当なキャリアーとして用い得る。さらに、投与法に応じて発熱等のいわゆるインフルエンザ様症状の発生が予想されたり発生した場合には、予防あるいは症状の緩解の為に抗炎症剤を併用することはなんら問題ない。
本発明のＩＦＮの正確な投与量は、被検体の年齢、体重、性別、および疾患の種類、特性、症状のステージなどにより変化する。従って、正確な投与量は前以て特定され得ず、治療する者によって決定される。しかしながら、適切な量はおよそ全身治療としてはヒト１日投与量として約1万unitsから約1000万unitsの間にある。局所投与のための有効量は１万unitsから約300万unitsの間にある。
さらに、本発明者らは得られた実験的諸事実に関し研究を行った結果、α型、β型またはγ型インターフェロン誘発物質（以下、「ＩＦＮinducer」と称する）に従来知られていなかった、それが低分子物質、高分子物質のいずれであるかを問わず、骨疾患予防薬および治療薬としてのポテンシャルのあることを明らかに出来た。骨疾患治療薬として用いることが出来るＩＦＮinducerとしては、例えば既に市販されているＯＫ−４３２（Saito, M. et al., Cell Immunol., 68, 187, 1982）やＰＳＫ（Tsuru, S. et al., Cancer Immunol. Immunother., 22, 114, 1986）、レバミゾール（Matsubara, S. et al., Cellular Immunol., 43, 214, 1979）と言った医薬の他に、各種低毒性の生ウイルス、不活化ウイルス、低毒性の菌体の培養上清や菌体処理物（例えば、Izumi, S. et al., Cancer Res., 46, 1960, 1986、原秀樹ら，Biotherapy 3, 1607, 1989、高橋哲ら、第44回日本癌学会総会記事，153頁，1985、日本国特許第1041679、日本国特許第863592、日本国特許第1287243、日本国特許第988498、日本国特許第1151765、日本国特許第1114570）、天然あるいは人工的に合成したリボ核酸およびそれらの誘導体、複合体（例えば、日本国特許第1139721、日本国特許第877116、日本国特許第1113637、特開平2-111723、特開昭59-93097）、植物あるいはグリチルリチンのような植物由来物質（例えば、漆崎一郎、堀越茂編、「癌とＢＲＭ」、187-188頁、サイエンスフォーラム、1982、日本国特許第1281580、日本国特許第1681643、日本国特許第1288021、特開平4-77431）、有機ゲルマニウム化合物（例えば、特開平7-247296、日本国特許第1661336、日本国特許第1418821、特開昭58-18395）、酪酸などの直鎖低級飽和カルボン酸、脂肪および脂肪酸化合物（例えば、特開平7-31495、日本国特許第1701933、特開平2-78623）、ペプチドもしくはタンパク質（例えば、特開平4-51892、特開昭59-222422、特開昭59-27832、特開昭58-15923）、ピリミジノール化合物（例えば、日本国特許第1905169）、多糖類（例えば、日本国特許第1643537、日本国特許第1449562、日本国特許第1393449）、ジピリダモール化合物（例えば、特開昭58-170715）、カルバミルピペラジン化合物（日本国特許第1290606）、イミキモド（例えば、Sidky, Y. A. et al., Cancer Res., 52, 3528, 1992）、放線菌およびその培養産物（例えば、特開昭57-58630）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。生体内に投与した場合にインターフェロン産生誘発能があるものであればよい（小林茂保、「増補版インターフェロン」、３章、19頁、講談社サイエンティフィク、1978）。本発明にあるＩＦＮinducerはそれのみで医薬用途に用いてよいが、医薬品として容認し得る担体や医薬添加物を含んでいてもよい。たとえば、水、生理食塩水、リンガー液、ハンクス液、およびグルコース液、ラクトース、デキストロース、エタノール、グリセロール、アルブミンなどの溶液を含む、非経口的投与に適した殆どのキャリアーが含まれる。これらの組成物は、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤、防腐剤、緩衝剤、界面活性剤および他の付属の添加剤を必要に応じて含み得る。投与方法としては特に限定されるものではない。本発明の治療対象疾患に応じて投与法方が適宜選択される。経口的、および／または、皮下、筋肉内、腹腔内、経膣的、経直腸的あるいは静脈内注射を含む非経口的に全身的に、ならびに／あるいは、経鼻的に／あるいは経肺的に投与され得る。また、浸透圧ポンプ（例えば、alzet osmotic pump）など体内留置型の徐放方式に適した製剤も本発明の対象とする疾患により選択され得る。経鼻的に／あるいは経肺的な投与方法に於ては微少液滴あるいは微少粉体を作り出す医学的に許容された適当なデバイスの利用と共に液状剤型あるいは粉体剤型が選択され得る。
また、本発明によるＩＦＮinducerは局所適応剤型としても利用される。例えば、注入、あるいは、持続放出型キャリアーの外科手術的埋め込みが治療部位に直接行われ得る。これらキャリアーとしてはヒドロゲル類、ポリ乳酸、およびコラーゲンマトリックス類が含まれる。コラーゲンマトリックス類としてはヒト以外の動物由来のコラーゲンを利用する場合はキャリアー自体の抗原性を消去したアテロコラーゲン（例えば、Zydem, Collagen Corp., Palo Alto, CA）の利用が好ましい。また、整形外科、歯科領域に於て骨局所の再建に利用されるヒドロキシアパタイトカルシウムホスフェート（例えば、HA-TCP, Zimmer Inc., Warsaw, IN）も適当なキャリアーとして用い得る。
さらに、投与法に応じて発熱等のいわゆるインフルエンザ様症状の発生が予想されたり発生した場合には、予防あるいは症状の緩解の為に抗炎症剤をＩＦＮinducerの投与前、投与中、投与後あるいはこれらを組み合わせて併用することはなんら問題ない。併用方法、投与量の設定は、骨疾患患者の年齢、体重、性別、および疾患の種類、特性、症状のステージなどを考慮し、治療を担当する物によって決定される。ＩＦＮ自体に発熱作用のあることが既に分かっていることから抗炎症剤を骨疾患治療薬としてのＩＦＮinducer製剤中の構成成分とする事も極めて有用である。
実施例
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。但し、下記実施例は例示のためにのみ示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
ddY系統マウスの破骨細胞様細胞形成への作用：
１）骨髄細胞の調製法および培養法
高橋らの方法（Takahashi, N. et al., Endocrinology, 122,1373,1988）に従い骨髄細胞を調製した。７週齢のddY系の雄マウスをエーテル麻酔下、放血死させ後肢の大腿骨および頚骨を採取。骨表面の結合織を丁寧に除去し、骨両端をハサミで切り落とした。25G針を付けたシリンジを用い、10％初乳前子牛血清（三菱化成、以下「ＪＣＳ」と略す。）添加α-ＭＥＭ培地（日水製薬）で骨髄細胞をフラッシュアウトし遠沈管に集め、上記培地で2000rpm，4℃で5分間遠心洗浄。沈澱細胞を上記培地で分散させ、さらに２回遠心洗浄操作を繰り返しマウス骨髄細胞を調製した。マウスＩＦＮ-α（以下「MuＩＦＮ-α」と略す。）、Lot .B13010 10⁶units/ml/vial（Calbiochem-Novabiochem International, San Diego, CA）、マウスＩＦＮ-β（以下「MuＩＦＮ-β」と略す。）、Lot M-0034,10⁷units/ml/vial（当社品）、マウスＩＦＮ-γ（以下「MuＩＦＮ-γ」と略す。）、Lot 254F3, 2.06 x 10⁶units/ml（Genentech、CA）は１０％ＪＣＳ加α-ＭＥＭ培地（日水製薬）にて目的のＩＦＮ濃度とした。活性型ビタミンＤ3（1α,25-Dihydroxyvitamin D3、和光純薬、以下「Vit D3」と略す。）はアルゴン置換エタノールに溶解、希釈し全ての培養系内でのエタノールの最終濃度は0.1％に調整した。
２）破骨細胞形成能の評価トリパンブルーで上記骨髄細胞の生細胞数をカウント、10％ＪＣＳ，10^-8M Vit D3, 10^-7Mデキサメサゾン添加α-ＭＥＭで1.5×10⁶個／mlになるように希釈し、24穴プレートの各ウエルに０．４５mlづつ蒔いた。各濃度のマウスＩＦＮを含む培地を50μl追添加、合計液量を０．５ml／ウエルして培養を開始した。３日毎に0.4mlの旧培地を抜取り、新鮮培地（各濃度ＩＦＮを含む上記培地）を0.4ml添加し培養8日目に培地を除き細胞をエチルアルコール、エーテル濃度（１：１）で固定、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）染色を行い、TRAP陽性多核細胞を位相差顕微鏡でカウントした。第１図は、この結果を示したものであり、各本系に添加したMuＩＦＮ-βおよび-γはいずれも強力に破骨細胞様細胞の形成を阻害した。図中の各カラムは４例の平均値および標準誤差で示してある。マウスＩＦＮ添加量を変えると明らかな用量依存性が両ＩＦＮで認められたが、その効果はγ型の方がβ型より強力でγ型の抑制濃度ＩＣ₅₀は0.1units/ml以下、β型のそれは0.2units/mlであった。
実施例２
C 57 BL/6系統マウスの破骨細胞様細胞形成への作用：
ddY系マウスに代え、７週齢のC 57 BL/6系の雄マウスを用いた。エーテル麻酔下、放血死させ後肢のfemurおよびtibiaを採取。骨表面の結合織を丁寧に除去し、骨両端をハサミで切り離した。25G針を付けたシリンジを用い、10％ＪＣＳ添加α-ＭＥＭで骨髄細胞をフラッシュアウトし遠沈管に集め上記培地で2000rpm、４℃で５分間遠心洗浄。沈澱した細胞を上記培地で分散させ、さらに２回遠心洗浄操作を繰り返し、実施例１の方法に従い破骨細胞様細胞形成を測定した結果、ddY系マウスでの場合と同様にMuＩＦＮ-βおよび-γはいずれも強力にC 57 BL/6系マウス骨髄細胞からの破骨細胞様細胞の形成を阻害した。第２図は、この結果を示したものであり、各本系に添加したMuＩＦＮ-βおよび-γによる破骨細胞様細胞の形成阻害のＩＣ₅₀値はそれぞれ0.1units/mlおよび1.5units/mlである。図中の各カラムは４例の平均値および標準誤差で示してある。
実施例３
マウス骨芽細胞の増殖に対する作用（in vitro単回投与）：
C 57 BL/6マウス起源であるマウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1（児玉ら、Jap. J. Oral Biol., 23, 899,1982）をＰＢＳ（-）で洗浄後、0.1%プロナーゼ（アクチナーゼＥ，科研製薬）を溶解したＰＢＳ（-）で保温剥離し、１０％ＪＣＳ、50ug/mlのＬ-アスコルビン酸（ASA）加α-ＭＥＭにて10,000個/mlに分散。細胞増殖能に対する評価はMC3T3-E1細胞を２４穴プレート（Corning）の各wellに5,000個/mlづつ蒔いた。ついで各ＩＦＮ希釈液を0.1ml/wellづつ添加し培養開始。Day２に培地を除去し、あらたに各ＩＦＮ希釈液を0.5ml/wellで添加（液総量；0.5ml/well）。Day６に培地除去、ＰＢＳ（-）洗浄後、0.1％プロナーゼ0.1％コラゲナーゼ混合酵素液を200μl/well添加し３７℃、15分反応。ついで、300μl/wellの１０％牛胎児血清（Gibco、以下「ＦＣＳ」と略す。）加α-ＭＥＭ培地を添加して分散、コールターカウンターにて細胞数を測定した。
細胞増殖に対する作用を図３に示す。各カラムとも４例の平均値および標準誤差で表示してある。両マウスＩＦＮともMC3T3-E1細胞増殖に対する阻害作用は極めて弱いか、ほとんど無かった。MuＩＦＮ-γで若干の増殖抑制が１units/mlから認められるものの用量依存性に乏しく、10,000units/mlという高濃度であっても３０％程度の抑制に留まった。一方、MuＩＦＮ-βでは10,000units/mlでも全く抑制の気配がなかった。
実施例４
マウス骨芽細胞の分化能、石灰化に対する作用（in vitro単回投与）：
分化能評価のパラメーターとしてはアルカリホスファターゼ（ALPase）および石灰化で評価した。骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリホスファターゼの検出は培養開始後day８に染色法で行った。石灰化判定はMC3T3-E1細胞を２４穴プレートの各wellに50,000個/ml（実施例３の抗細胞試験の１０倍量）づつ細胞を蒔き、day４に細胞が充分にコンフルエントに達していることを確認の上、培地を捨て、新たに0.9ml/wellの１０％ＪＣＳ、50μg/mlのＬ-アスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸加α-ＭＥＭを添加し、次いで各濃度のインターフェロン含有培地を0.1ml/well添加、４日後に培養液をＩＦＮ不含培地に置き換え、さらに４日毎に同様のＩＦＮ不含培地による培地交換を実施、day14にVon Kossa染色を行い石灰化巣を視覚化した。分化マーカーであるアルカリホスファターゼ活性の発現は次の石灰化への必須のステップであるが両マウスＩＦＮ共この分化マーカーである酵素活性の発現を阻害しなかった。
一方、第４図に示すように石灰化プロセスではMuＩＦＮ-βとMuＩＦＮ-γで大きな違いが現れた。すなわち、β型が存在しても石灰化は重大な影響を受けずに進行するのに対し、γ型は用量依存的で強力な石灰化阻害作用を示しその効果はわずか10units/mlという微量添加で出現し、石灰化阻害のＩＣ₅₀値は約３−４units/mlであった。硬組織としての骨組織が完全に修復されるためには、このMuＩＦＮ-γの石灰化阻害は好ましくないのは言うまでもなく、β型の優位性は明らかである。
実施例５
マウス骨芽細胞MC3T3-E1石灰化巣のカルシウムおよび無機リンの定量：
MC3T3-E1細胞を２４穴プレートの各wellに50,000個/mlで蒔き、コンフルエントに達するまで増殖後、培地を除き新たに0.9ml/wellの１０％ＪＣＳ、50μg/mlのＬ-アスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸加α-ＭＥＭを添加し、次いで各濃度のＩＦＮ含有培地を0.1ml/well添加、４日毎にＩＦＮ不含培地で培地を交換し培養を継続した。day14に培地を除去、ハンクス液で軽く洗浄、無水エタノールを1ml/wellで添加し室温にて１５分間固定後、さらに新鮮無水エタノール１ml/wellに置換し５分処理後室温で風乾。１Ｎの塩酸を１ml/well添加し室温で３０分間抽出。全量をエッペンドルフチューブに移し1,800 xg, ４℃、１０分遠心後上清のカルシウム量をカルシウムＣテストワコ−、無機リン量をホスファＢテストワコ−で測定した。β型ＩＦＮ添加でも若干のカルシウム沈着の抑制が見られたが、その程度は弱く1,000units/mlでも対照に比べ２０％減にとどまった。一方、γ型ＩＦＮは用量依存的で強力な石灰化阻害作用を示し、1,000units/mlでは対照に比べ７０％減に達し、ＩＣ₅₀値は約10units/mlと低濃度であった（第５図）。図中の各点は４例の平均値および標準誤差である。
さらに、石灰化巣から抽出された無機リン量は図６に示す。図中の各点は４例の平均値である。抽出された無機リン量はカルシウム量と良い相関を示し、β型ＩＦＮ1,000units/ml処理でも対照に比べなお約２０％減にとどまり、IC₅₀値は得られない。一方、γ型ＩＦＮ1,000units/ml処理では約８０％減となり、そのＩＣ₅₀値は約10units/mlで極めて低濃度で出現する（第６図）。
実施例６
マウス骨芽細胞の分化能、石灰化に対する作用（in vitro複数回投与）：
MC3T3-E1細胞を２４穴プレートの各wellに30,000個/mlづつ蒔き細胞がコンフルエントに達した後、培地を捨て、新たに0.9ml/wellの１０％ＪＣＳ、50μg/mlのＬ-アスコルビン酸、10mMβ−グリセロリン酸加α-ＭＥＭを添加し、次いで各濃度のＩＦＮ含有培地を0.1ml/well添加、その後の４日毎の培地交換は全て各濃度のＩＦＮ含有培地で行った。最初のＩＦＮ処理日から９日目にVon Kossa染色を行い石灰化巣を視覚化した。その結果、単回投与と異なり、ＩＦＮの２回投与により石灰化巣の数と染色強度は添加ＩＦＮの用量に応じ明らかに増加した（第７図）。
実施例７
骨粗鬆症モデルマウスに対するマウスＩＦＮ-βの治療効果：
８週令の雌ddy系マウスを５群に分け実験を行った。３群に両側の卵巣摘出手術を行い、２群は偽手術のみを行った。その後１カ月間正常食で飼育し、卵巣摘出群に骨祖しょう症状態を作りだした。本モデルにおいては卵巣摘出後２〜３週目で骨粗鬆状態になる事が知られている（保坂努ら、アニテックス、5巻、243、1992、Miyaura, C. et al., J. Bone Mineral Res., 10, 1365, 1995）。術後３週目からマウスＩＦＮの皮下投与（100μl/頭/回）を１日１回、計２５回行い、投与開始３０日目にエーテル麻酔下、体重測定、採血を行ない、大腿骨を採取し乾燥骨重量を測定した。
大腿骨の乾燥は以下のように行った。摘出大腿骨１本当たり２ｍｌの７０％エチルアルコールで２４時間室温にて固定後、ピンセットと手術用替刃メスにて付着筋肉と結合組織を骨から丁寧に除去した。更に、新しい７０％エチルアルコールに７２時間、室温にて浸漬後、大腿骨を５５℃の温風発生インキュベーター（Koukensha Engineering Co., Tokyo）中にて２４時間乾燥させた。乾燥骨の重量は電子天秤（Mettler AE50, Metteler Instrumente AG, Switzerland）にて測定した。投与マウスＩＦＮの目的濃度への希釈は生理食塩水にて行った。また、試験期間中に適宜代謝ケージ（ＫＮ-６４５、夏目製作所、東京）にてマウス尿を採取、凍結保存した。偽手術１群には生理食塩水（大塚製薬）を、他の１群には１０⁵units／頭／回のマウスＩＦＮ-β（生理食塩水にて用時希釈）を投与した。卵巣摘出３群のうち１群には生理食塩水を、他の２群にはそれぞれ１０³units／頭／回、もしくは１０⁵units／頭／回のMuＩＦＮ-βを投与した。第８図は乾燥骨重量を示したものである。閉経後骨粗しょう症のモデルである卵巣摘出はマウスに骨量減少を明らかに引き起こしたが、MuＩＦＮ-β１０⁵units／頭／回の投与は正常レベルにまで骨量を回復させる効果、即ち明確な治療効果を示した。一方、偽手術群においては有意な骨量増加は１０⁵units投与においても認められなかった。
骨コラーゲンの架橋物質である尿中D-Pyrの尿中***量の増減は骨コラーゲンの分解の程度、即ち骨吸収の程度を反映する優れたマーカーである事は良く知られている（C.P.Jerome et al., Bone and Mineral, 19, 117-125, 1992）。尿中D-Pyr測定には市販測定キット（PYRILINKS-D Assay、METRA BIOSYSTEMS）を用いた。MuＩＦＮ-β投与４周目の成績を各実験群マウスのD-Pyrの量を尿中クレアチニン量で補正した値として第９図に示した。生理食塩水投与群では骨吸収マーカーのかD-Pyrは明らかに増加したが１０³units／頭／回および１０⁵units／頭／回のMuＩＦＮ-β投与群で共にD-Pyr***量の低下、すなわち骨吸収の抑制が認められた。その抑制のレベルは偽手術群に対する生理食塩水投与レベル、すなわちほぼ正常な尿中の値と同等のレベルにまで達した。さらに第10図にはMuＩＦＮ-β投与開始前後の体重変化を示した。図中には示していないが卵巣摘出直前（MuＩＦＮ-β投与開始３週間前）のマウス体重は卵巣摘出予定群で２５．６±０．１８ｇ（ｎ=３３）、偽手術予定群で２５．７±０．３６ｇ（ｎ=１１）と同等であった。該手術後２週間経過後、すなわち図中のＩＦＮ投与開始１週間前の上記両群の体重に差が生じたが、これは卵巣摘出による体重増加（Miyaura, C. et al., J. Bone Mineral Res., 10, 1365, 1995）を反映している。また、試験終了時の剖検においては、卵巣摘出群での著しい子宮重量の減少も確認された。これも卵巣摘出処置による典型的な反応である（Miyaura, C. et al., J. Bone Mineral Res., 10, 1365, 1995）。骨量増加という治療効果のある用量（１０⁵units／頭／回）でＩＦＮ-β投与を４週間続けても各群のマウスの体重は何等問題となる変化を示さなかった。
実施例８
マウス破骨細胞形成抑制に対する各種マウスインターフェロンの効力比較：
MuＩＦＮ-βおよび-γにさらにMuＩＦＮ-αを加え、３種のマウスＩＦＮ間で効力比較をddY系マウスの骨髄細胞からの破骨細胞様細胞の形成抑制能で行った。試験方法は実施例１に従って行った。いずれのマウスＩＦＮとも破骨細胞様細胞の形成を抑制し、効果はγ型、β型、α型の順に強力であった。それらの用量依存性カーブから求めたＩＣ₅₀値はγ型が０．１units/ml以下、β型が約０．９units/mlであるのに対しα型でのＩＣ₅₀値は２２．４units/mlとなり、α型の破骨細胞形成抑制作用はβに比べ約２０倍、γ型に比べると１００倍以上弱かった。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明により、β型ＩＦＮの相対的な骨形成促進作用がin vitroおよび動物実験で明らかになり、β型ＩＦＮの骨疾患治療薬および予防薬としての有用性が示された。特に、in vivoでβ型ＩＦＮによる骨量回復が正常骨量を有する個体よりも異常骨量を有する個体で顕著である新知見はβ型ＩＦＮの骨疾患治療薬としての産業上の利用に関し高い利点を提供するものである。
またインターフェロン誘発物質においても骨疾患治療剤としての可能性を見出し、骨疾患治療薬としての産業上の利用に関し高い利点を提供するものである。

Claims

β型インターフェロンを有効成分とする骨疾患治療薬。
β型インターフェロンが天然型、遺伝子組み換え型または化学合成である請求の範囲第１項記載の治療薬。
骨疾患が骨粗鬆症、腫瘍関連、代謝性、歯周病関連、または骨折である請求の範囲第１項または第２項記載の治療薬。
腫瘍関連疾患が高カルシウム血症である請求の範囲第３項記載の治療薬。