JP4924975B2 - 破骨細胞形成を制御する方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は破骨細胞形成シグナルを制御する方法に関する。より具体的には、破骨細胞形成を制御する方法に関する。
背景技術
骨形成と骨吸収の微妙なバランスは、骨強度や統合性を維持するために極めて重要であり、骨吸収を起こす破骨細胞と骨形成を起こす骨芽細胞はその中心的な役割を果たしている（Ｍａｎｏｌａｇａｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２１，１１５−１３７（２０００）；Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．＆ Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，１５０８−１５１４（２０００））。骨リモデリングと呼ばれるこの生理学的過程は厳密に調節されており、バランスが崩れ破骨細胞が優勢となると、慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）を含む自己免疫性関節炎、歯周病、閉経後骨粗鬆症、パジェット病、および骨癌などの病的骨吸収に至る（Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．＆ Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，１５０８−１５１４（２０００）；Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０２，３０４−３０９（１９９９）；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４３，２５９−２６９（２０００）；Ｈｏｎｏｒｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，５２１−５２８（２０００））。従って、破骨細胞による骨吸収を効果的に調節することが極めて重要であるが、病的骨吸収を制御できる有効な治療法は確立されていない。
ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーメンバーの１つであるＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ ｌｉｇａｎｄ，別名ＴＲＡＮＣＥ／ＯＰＧＬ／ＯＤＦ）によるシグナル伝達は、単球／マクロファージ前駆細胞から破骨細胞への分化に必須である（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，３５９７−３５６０（１９９８）；Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９７，３１５−３２３（１９９９）；Ｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．２０，３４５−３５７（１９９９））。ＲＡＮＫＬがその受容体であるＲＡＮＫに結合すると、ＴＲＡＦ６などのＴＲＡＦファミリー蛋白質が動員され、ＮＦ−κＢおよびＪｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）経路を活性化する（Ｄａｒｎａｙ，Ｂ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７７２４−７７３１（１９９９）；Ｗｏｎｇ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８３５５−２８３５９（１９９８））。メカニズムはまだ解明されていないが、ＲＡＮＫＬ自身もｃ−Ｆｏｓの発現を誘導する（Ｍａｔｓｕｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４，１８４−１８７（２０００））。ｃ−Ｆｏｓは、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、およびＡＴＦファミリー蛋白質からなる二量体を形成する転写因子のグループに属するＡＰ−１の成分である。破骨細胞形成におけるＴＲＡＦ６およびｃ−Ｆｏｓ経路の重要性は、遺伝子破壊実験により詳細に解析されている（Ｌｏｍａｇａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，１０１５−１０２４（１９９９）；Ｎａｉｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ４，３５３−３６２（１９９９）；Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６０，７４１−７４５（１９９２）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７１，５７７−５８６（１９９２）；Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６，４４３−４４８（１９９４）；Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，１５０４−１５０８（２０００））。生理学的に正常な骨リモデリングを維持するには、ＲＡＮＫＬシグナル伝達は高度に調節される必要がある。これに関して、ＲＡＮＫＬの可溶性デコイ受容体であるｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）は破骨細胞形成のネガティブ調節因子として機能する（Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｗ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８９，３０９−３１９（１９９７）；Ｔｓｕｄａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３４，１３７−１４２（１９９７））。実際、ＯＰＧを欠失したマウスでは重篤な骨減少症が発症し、ＲＡＮＫＬレベルとＯＰＧレベルのバランスが骨吸収調節における鍵となるメカニズムの１つであることが示されている（Ｂｕｃａｙ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２，１２６０−１２６８（１９９８）；Ｍｉｚｕｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４７，６１０−６１５（１９９８））。それに加えて、この過程は他のメディエーターによっても影響され得ることが報告されている（Ｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．２０，３４５−３５７（１９９９）；Ｒｏｏｄｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７，１２２９−１２４１（１９９９）；Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９２，４−１３（２０００））が、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるそれらの特異的な機能はよくわかっていない。例えば、骨ホメオスタシスを維持するために、破骨細胞形成においてＲＡＮＫＬシグナル伝達自身がネガティブ調節機構（群）を活性化し得るのかは知られていない。
ところで、インターフェロン（ＩＦＮ）−αおよびＩＦＮ−β（以下ＩＦＮ−α／βとも記す）はウイルス感染における宿主防御に重要な役割を果たしており、また抗増殖効果や様々な免疫調節機能を有している。このためＩＦＮ−α／βは、肝炎ウイルス感染、ある種の癌、および多発性硬化症などの自己免疫疾患に対して臨床適用がなされている。しかしながら、ＩＦＮ−α／β系がＲＡＮＫＬシグナル伝達および骨代謝に関連しているのかは知られていない。また、ＩＦＮ−α／βが生体内において骨格系を調節しているのかは明らかになっておらず、また骨疾患に対するＩＦＮ−α／βの有効性は全く知られていない。
発明の開示
本発明は、破骨細胞形成シグナルを制御する方法を提供することを課題とする。本発明の方法により、破骨細胞形成を制御することができる。具体的には、本発明は破骨細胞形成に関与するＲＡＮＫＬシグナル伝達の作用を制御する方法を提供する。さらに本発明は、破骨細胞形成に関与するｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、またはその両方を制御する方法を提供する。本発明により、骨吸収および骨破壊を制御することが可能となる。また本発明は、これらの制御に用いるための薬剤を提供することを課題とする。また本発明は、破骨細胞形成または骨破壊を制御するための医薬を提供することを課題とする。
骨ホメオスタシスの制御におけるＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを含む）の生理学的な役割を解明し、骨代謝におけるＩ型ＩＦＮの有効性を検証するため、本発明者らは野生型マウス由来の骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）を用いて、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成に及ぼすＩＦＮ−α／βの効果を調べた。その結果、Ｉ型ＩＦＮはＢＭＭからの破骨細胞形成を顕著に阻害することが判明した。さらにＩＦＮ−γＲ^−／−、Ｓｔａｔ１^−／−、またはＩＲＦ−１^−／−マウス由来のＢＭＭを用いて、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成に及ぼすＩＦＮ−α／βの効果を検証したところ、ＩＦＮ−γＲ^−／−マウスまたはＩＲＦ−１^−／−マウスでは野生型マウスと同様にＩＦＮ−α／βによる阻害効果が観察されたが、Ｓｔａｔ１^−／−マウスではＩＦＮ−α／βによる破骨細胞形成の抑制能が顕著に低下した（図１）。この事実は、Ｓｔａｔ１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−１）を介するシグナル伝達の活性化が、ＩＦＮ−α／βによる破骨細胞形成の抑制に本質的な役割を果たすことを示している。このことから、ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路のＩＦＮ−α／βによる抑制には、Ｓｔａｔ１を介し、ＩＲＦ−１に非依存的な遺伝子誘導経路が重要であることが示された。
また本発明者らは、ＩＦＮ−α／βの受容体成分の１つを欠損したマウス（ＩＮＦＡＲ１^−／−マウス）の骨格系の評価を行った。ＩＮＦＡＲ１^−／−マウスでは、破骨細胞による骨吸収が亢進しており、骨量の著しい減少が観察された（図２ａ）。ＩＮＦＡＲ１^−／−マウス由来のＢＭＭｓを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成においても、野生型マウス由来のＢＭＭｓに比べＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦによる破骨細胞形成の誘導が亢進していた（図２ｂおよび３）。
組み換えマウスＩＦＮ−βは、ＢＭＭｓの破骨細胞形成を阻害するのみならず、Ｍ−ＣＳＦ非依存性のＲＡＷ２６４．７細胞からの破骨細胞形成に対しても顕著な阻害効果を示したことから、ＩＦＮ−βはＲＡＮＫＬシグナル伝達を妨害することが示された。ＩＦＮ−βを欠失するマウス（ＩＦＮ−β^−／−マウス）においても、ＩＮＦＡＲ１^−／−マウスと同様、破骨細胞形成の増強による重篤な骨減少症を発症したことから、骨ホメオスタシスにおいてＲＡＮＫＬにより誘導されるＩＦＮ−βが必須の役割を果たすことが示された（図４ｂ）。興味深いことに、ＲＡＮＫＬは破骨細胞前駆細胞においてＩＦＮ−β遺伝子を誘導することが判明した（図４ａ）。このことは、ＩＦＮ−βがＲＡＮＫＬシグナル伝達におけるネガティブフィードバック調節因子としての生理的機能を果たしていることを示している。ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−β遺伝子誘導はｃ−Ｆｏｓの発現に依存しており、ウイルス感染におけるＩＦＮ−β遺伝子の誘導の機構とは異なっていた（図１１）。ＩＦＮ−βはそのレセプター複合体に結合し、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、およびＩＲＦ−９（ｐ４８／ＩＳＧＦ３γ）で構成される転写因子複合体が活性化される。ＩＦＮ−βによる破骨細胞形成の阻害効果は、ＩＦＮＡＲ１^−／−マウス、Ｓｔａｔ１^−／−マウス、およびＩＲＦ−９^−／−マウスでは失われたが、ＩＲＦ−１^−／−マウスでは認められた（図５）。
大理石骨病の表現型を示す遺伝子改変マウスにより、ＲＡＮＫＬ、そのレセプターであるＲＡＮＫ、ＴＲＡＦ６（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ６）、ＮＦ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ）−κＢ成分であるｐ５０／ｐ５２、およびＡＰ−１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）成分であるｃ−Ｆｏｓを含む破骨細胞形成に必須な分子が明らかとなっている。ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合すると、ＴＲＡＦ６が動員され、これがＮＦ−κＢ経路およびＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−ＪｕｎＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ／ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）経路を活性化する。ＲＡＮＫＬがどのようにｃ−Ｆｏｓ経路を活性化するのかは知られていないが、ｃ−ｆｏｓ^−／−マウスにおける大理石骨病は、ｃ−Ｆｏｓの転写標的であるＦｒａ−１の過剰発現によりレスキューできることから、Ｆｏｓファミリー蛋白質もまた、破骨細胞形成に本質的な役割を果たしていることが示唆される。本発明において、ＩＦＮ−βはｃ−Ｆｏｓ蛋白質のＲＡＮＫＬ依存的な誘導を強く阻害し、同時にＦｒａ−１およびＦｒａ−２の転写を低下させることが判明した（図６および７）。レトロウイルスを用いてｃ−Ｆｏｓ、Ｆｒａ−１、またはＦｒａ−２を過剰発現させたところ、ＩＦＮ−βによる破骨細胞の分化抑止が解除されたことから、ｃ−Ｆｏｓおよびその転写のターゲット分子がＩＦＮ−βによる破骨細胞形成の阻害の原因であることが示された（図９および１０）。これらの結果から、ＲＡＮＫＬとＩＦＮ−α／βとの間の新規なシグナル伝達のクロストークが明らかとなり、骨変性疾患におけるＩＦＮ−α／β投与の治療的有効性に関する分子的基盤が提供された。
炎症性骨破壊のエンドトキシン誘導モデルを用いて、ＩＦＮ−βの局所注入の治療効果を調べた。炎症部位へのＩＦＮ−β投与を毎日行った結果、破骨細胞形成および骨吸収が顕著に阻害された（図１２）。これは骨破壊疾患におけるＩＦＮ−βの臨床適用の可能性を示唆している。ＩＦＮ−βは既に数種のヒト癌および多発性硬化症などの自己免疫疾患に対して適用が行われている。骨破壊は、複数の骨髄腫および転移性骨癌を含む腫瘍、並びに自己免疫性関節炎などの炎症状態にしばしば付随していることから、ＩＦＮ−βは癌や関節炎で誘導される骨破壊に対する治療に特に効果を有する可能性がある。骨破壊部位へのＩＦＮ−α／βの局所送達は投与量を低く抑えることができるため、副作用を低減することが可能である。
また本発明者らは、ヒト破骨細胞形成における組み換えＩＦＮ−βの効果を確認した（図１３）。ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦで刺激したヒト末梢血単核細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成において、組み換えヒトＩＦＮ−βはマウスにおける場合と同様に強い抑制効果を示した。さらに本発明者らは、慢性関節リウマチ患者由来の培養滑膜細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成の系を利用して、ヒト疾患における病的骨吸収に対するＩＦＮ−βの有益な効果を実証した。具体的には、慢性関節リウマチ患者より滑膜組織を単離し、ビタミンＤ３活性代謝物および組み換えヒトＭ−ＣＳＦにより誘導されるｅｘ ｖｉｖｏ破骨細胞形成におけるＩＦＮ−βの効果を検証した。その結果、組み換えＩＦＮ−βは滑膜細胞からの破骨細胞形成を強く阻害することが実証され、Ｉ型ＩＦＮが慢性関節リウマチにおける骨破壊を抑制する医薬として有効であることが明確に示された。これらの結果は、Ｉ型ＩＦＮを局所的または全身的に適用することは、ヒト骨疾患における骨吸収を抑制するための新たな戦略となることを示している。
本発明により、以下のような骨代謝疾患に対する新たな治療的アプローチが可能となる。
１）破骨細胞の生成および活性の制御は骨代謝疾患の予防および治療に有効である。特に自己免疫性関節炎に対して効果を有する。
２）ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路の阻害は、自己免疫性関節炎を含む骨代謝疾患における有効な治療戦略となる。
３）ｃ−Ｆｏｓは、ＲＡＮＫＬシグナルによる破骨細胞形成の制御における重要なターゲット分子である。
４）Ｉ型ＩＦＮ（例えばＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）は自己免疫性関節炎を含む骨代謝疾患の予防および治療に有効である。
このように本発明者らは、破骨細胞形成の新規な調節機構を解明し、破骨細胞による異常な骨吸収を制御する方法を開発するに至った。すなわち本発明は、破骨細胞形成シグナルを制御する方法、並びに該制御に用いるための薬剤および医薬に関し、より具体的には、
（１）破骨細胞前駆細胞におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制する工程を含む、破骨細胞形成シグナルを制御する方法、
（２）破骨細胞前駆細胞におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制する工程を含む、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかを制御する方法、
（ａ）破骨細胞形成
（ｂ）ＲＡＮＫシグナル伝達
（ｃ）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルまたはその機能
（ｄ）骨吸収
（３）破骨細胞前駆細胞におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程を含む、炎症性骨破壊の抑制方法、
（４）Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達がＳｔａｔ１、ＩＲＦ−９、またはＩＳＧＦ３を介するシグナル伝達である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（５）Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の促進または抑制が、Ｉ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進または抑制である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（６）Ｉ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進を、下記（ａ）または（ｂ）に記載の工程により行う、（５）に記載の方法、
（ａ）Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与
（ｂ）Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現するベクターの投与
（７）リガンドがＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである、（５）または（６）に記載の方法、
（８）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収に及ぼす化合物の効果を検出する方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫシグナル伝達、並びにＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、を含む方法、
（９）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫシグナル伝達、並びにＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、
（ｃ）対照の条件下に比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物を選択する工程、を含む方法、
（１０）Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達がＳｔａｔ１、ＩＲＦ−９、またはＩＳＧＦ３を介するシグナル伝達である、（８）または（９）に記載の方法、
（１１）Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の促進が、Ｉ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進である、（８）または（９）に記載の方法、
（１２）Ｉ型ＩＦＮ受容体とそのリガンドとの相互作用の促進を、下記（ａ）または（ｂ）に記載の工程により行う、（１１）に記載の方法、
（ａ）Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与
（ｂ）Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現するベクターの投与
（１３）リガンドがＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである、（１１）または（１２）に記載の方法、
（１４）Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドまたは該リガンドを発現するベクターを含む、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の薬剤、
（ａ）破骨細胞形成抑制剤
（ｂ）ＲＡＮＫシグナル伝達抑制剤
（ｃ）ｃ−Ｆｏｓ抑制剤
（ｄ）骨吸収抑制剤
（１５）Ｉ型ＩＦＮ受容体のリガンドがＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである、（１４）に記載の薬剤、
（１６）Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドまたは該リガンドを発現するベクターを含む、骨破壊を抑制するための医薬組成物、
（１７）自己免疫性関節炎における骨破壊の予防または治療に用いられる、（１６）に記載の医薬組成物、に関する。
本発明はＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制することにより、破骨細胞形成シグナルを制御する方法に関する。本発明において「破骨細胞形成シグナル」とは、破骨細胞形成を誘導する過程および破骨細胞形成により誘導される過程における作用または該作用の一部を指す。これらの作用には、遺伝子の発現、細胞の形態および機能変化を含む表現型の変化、ならびにこれらの表現型の変化により引き起こされる代謝活動などが含まれる。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することによって、破骨細胞形成シグナルは阻害され骨吸収が抑制される。逆にＩ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制することによって、破骨細胞形成シグナルの阻害が低下し骨吸収が促進される。
破骨細胞は、造血幹細胞を起源とするマクロファージ・単球系細胞（ＣＦＵ−Ｍ）より分化した単核の破骨細胞前駆細胞が融合して形成される多核巨細胞である（Ｕｄａｇａｗａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：７２６０，１９９０）。一般に成熟した破骨細胞は、酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）、カルシトニン受容体、ヴィトロネクチン受容体、およびＭ−ＣＳＦ受容体（ｃ−Ｆｍｓ）を発現し、骨吸収能を示す。破骨細胞形成は、これらの指標の少なくとも１つをもとに判断することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系において、骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｏｗ ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）は、Ｈ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；マクロファージコロニー刺激因子）存在下でＲＡＮＫＬの刺激により破骨細胞に分化する。これらの因子以外にも、炎症性関節炎などにおける骨破壊には、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）−α、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−２、およびＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などのサイトカインや増殖因子が関与している。破骨細胞が骨吸収を行う際には、明帯（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）と呼ばれるアクチンに富んだ部位で骨に接触し、波状縁（ｒｕｆｆｌｅｄ ｂｏｒｄｅｒ）という膜陥入構造を形成し、プロトンポンプによる酸性環境下でマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カテプシンなどの基質分解酵素を自ら産生することにより骨基質が分解される。本発明によれば、このような破骨細胞の分化および骨吸収などを誘導する破骨細胞形成シグナルを、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の調節により制御することができる。すなわち、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより骨破壊を抑制し、逆にＩ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制することによって、骨破壊を促進することができる。
また、上記のように、一般に破骨細胞の形成は、Ｍ−ＣＳＦ存在下、ＲＡＮＫＬにより誘導される。ＲＡＮＫＬは細胞表面に発現するＲＡＮＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ）のリガンドであり、ＲＡＮＫを介したシグナル伝達を誘導する。ＲＡＮＫの活性化により、シグナルはＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、および他のＴＲＡＦファミリー因子を含むエフェクター分子を介して下流に伝達され、ｃ−Ｆｏｓ、Ｆｒａ−１、およびＦｒａ−２を含むＦｏｓファミリー蛋白質の発現を介して、結果的に破骨細胞への分化および活性化を促し破骨細胞を形成させる。破骨細胞の形成には、ＲＡＮＫＬ以外にＴＮＦαおよびＩＬ−１も関与しており、ＴＮＦαはＩ型およびＩＩ型ＴＮＦ受容体を介して、またＩＬ−１はＩＬ−１受容体を介して破骨細胞形成シグナルを伝達する。また、ＴＲＡＦファミリー因子は、ＴＮＦ受容体およびＩＬ−１受容体を介するシグナルにも関与しており、例えばＴＲＡＦ６はＩＬ−１受容体のアダプター分子としても機能する。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制することにより、これらの破骨細胞形成シグナルをそれぞれ抑制または促進することが可能である。
実施例４に示されるように、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進または抑制することにより、特にＲＡＮＫシグナル伝達を効果的に制御することができる。ＩＦＮ−βは、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬに依存して分化するＢＭＭｓの破骨細胞形成を阻害するのみならず、Ｍ−ＣＳＦ非依存性のマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７のＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成も阻害する。この知見は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより、ＲＡＮＫシグナル伝達を特に選択的に抑制することができることを示している。逆にＩ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制することにより、ＲＡＮＫシグナル伝達の阻害を低下させることができる。「ＲＡＮＫシグナル伝達」とは、ＲＡＮＫを介した一連のシグナル伝達またはその一部を指し、ＲＡＮＫの下流のシグナル分子の活性化や発現の上昇、標的遺伝子発現の誘導、ＲＡＮＫの活性化により引き起こされる細胞の形質変化などを含む。これらには、特にｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルの上昇、ｆｒａ−１およびｆｒａ−２のようなｆｏｓファミリー遺伝子の発現の誘導、ならびにその下流のシグナル伝達が挙げられる。また、破骨細胞形成、並びにＴＲＡＰ、カルシトニン受容体、およびヴィトロネクチン受容体等の破骨細胞で発現される遺伝子の発現誘導、さらには骨吸収能の獲得などが挙げられる。
また、実施例５に示されるように、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の促進は、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質の発現を顕著に阻害することが判明した。イムノブロット解析の結果は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の促進が、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルを有意に低下させることを示している（図６）。従って、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより、ＲＡＮＫシグナルによるｃ−Ｆｏｓ蛋白質の発現誘導を抑制することが可能である。ｃ−Ｆｏｓの発現を抑制することによりｃ−Ｆｏｓの機能は抑制される。ｃ−Ｆｏｓの機能としては、例えばＡＰ−１複合体の形成やその標的遺伝子の発現誘導などを含む、ｃ−Ｆｏｓを介するシグナル伝達が挙げられる。すなわち、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することにより、ｃ−Ｆｏｓが関与するシグナル伝達を抑制することができる。ｃ−ＦｏｓはＲＡＮＫシグナル伝達以外にも様々なシグナル伝達に関与している。本発明の方法を用いてｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルを制御することにより、これらのｃ−Ｆｏｓを介するシグナル伝達を制御し得る。
本発明において「Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達」とは、Ｉ型ＩＦＮにより誘導されるシグナル伝達またはその一部を言う。すなわち、Ｉ型ＩＦＮにより誘導されるシグナル伝達、Ｉ型ＩＦＮ受容体の活性化により誘導されるシグナル伝達、およびＩ型ＩＦＮ受容体の下流のエフェクター分子により誘導されるシグナル伝達などは、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に含まれる。本発明においてＩ型ＩＦＮシグナル伝達は、好適には、Ｉ型ＩＦＮ受容体の活性化により誘導されるシグナル伝達を言う。
Ｉ型ＩＦＮとしてはＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β等が挙げられ、これらのＩ型ＩＦＮはＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドとして機能してＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化する。これらのリガンドがＩ型ＩＦＮ受容体に結合すると、ＪＡＫ１およびＴｙｋ２が活性化され、細胞内の転写因子群ＩＳＧＦ３（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｆａｃｔｏｒ ３）のチロシンリン酸化が起こる。ＩＳＧＦ３はＳｔａｔ１を含む成分であるＩＳＧＦ３α［ｐ９１／８４（Ｓｔａｔ１α／β）およびｐ１１３（Ｓｔａｔ２）を含む複合体］とＤＮＡ結合成分であるＩＳＧＦ３γ（ｐ４８）とからなり、活性化により核に移行してＩＳＲＥ（ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し標的遺伝子群の転写を促進する。このように、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達としては、ＩＳＧＦ３を介するシグナル伝達が挙げられる。
Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化するには、例えばＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドを作用させる。また、Ｉ型ＩＦＮ受容体の下流のシグナル伝達を活性化することもできる。中でも、Ｓｔａｔ１を介するシグナル伝達を促進することが好ましい。例えば、ＩＳＧＦ３形成を促進することによりＩ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化することができる。また、ＩＳＲＥ応答性の遺伝子群の発現を促進することにより、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を活性化することもできる。
Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を抑制するには、例えばＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドを取り除いたり、リガンドと受容体との結合を阻害する。例えば、リガンドに対する抗体を投与することによりリガンドを中和することができる。また、Ｉ型ＩＦＮ受容体からのシグナル伝達を抑制することもできる。
また、例えば活性化型ＪＡＫやＴｙｋを細胞で発現させるなど、細胞内におけるＪＡＫファミリーのチロシンキナーゼ活性を上昇させることにより、ＩＳＧＦ３（Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ２／ｐ４８）の形成を促進してＩ型ＩＦＮシグナルを促進することも可能である。逆にＪＡＫを阻害すればＩ型ＩＦＮシグナルを抑制することができる。また、Ｓｔａｔ１は核内でＣＢＰ／ｐ３００等の転写コアクチベーターと結合して転写活性が促進される。そこで、ＣＢＰ／ｐ３００等を過剰発現したり、これらとＳｔａｔ１との結合能を高めれば、Ｉ型ＩＦＮシグナルは亢進する。逆に、ＣＢＰ／ｐ３００等とＳｔａｔ１との結合を阻害すれば、Ｉ型ＩＦＮシグナルを阻害することができる（Ｈｏｒｖａｉ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０７４−１０７９（１９９７））。
Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の制御を行う標的となる細胞は、破骨細胞前駆細胞である。本発明において「破骨細胞前駆細胞」とは、破骨細胞に分化し得る細胞を指す。このような細胞としては、破骨細胞に分化し得るマクロファージ・単球系細胞等が含まれる。具体的には、骨髄マクロファージ系細胞や滑膜マクロファージなどの、骨軟骨組織に存在するマクロファージ系細胞（例えばマクロファージ・単球系前駆細胞など）などが挙げられる。また、造血幹細胞なども含まれる。細胞が由来する生物種に特に制限はない。ＲＡＮＫＬシグナル伝達系およびＩ型ＩＦＮシグナル伝達系は、哺乳動物において広く保存されており、ヒト細胞等においても、これらのシグナル分子群はマウス細胞と共通しており、その機能についても同様であることが知られている。実際、本発明者らはヒト細胞において、Ｉ型ＩＦＮが破骨細胞形成を強く抑制することを実証した。従って、例えばヒトおよびサルを含む霊長類に由来する破骨細胞前駆細胞に対して、本発明に従いＩ型ＩＦＮシグナル伝達の制御を行うことにより、該細胞の破骨細胞形成を制御することが可能である。また本発明者らは、Ｉ型ＩＦＮが、慢性関節リウマチ患者滑膜からの破骨細胞形成を強く阻害できることを示した。この事実は、本発明の方法が慢性関節リウマチを含む炎症性骨破壊における処置に効果を有することを明確に示している。
Ｉ型ＩＦＮ受容体のリガンドとは、Ｉ型ＩＦＮ受容体に結合して受容体を活性化させる分子を指す。Ｉ型ＩＦＮ受容体のリガンドを用いてシグナル伝達を促進する場合、用いられるＩ型ＩＦＮ受容体のリガンドとしては、該受容体に結合し、受容体を活性化させる限り特に制限はない。リガンドには天然のリガンド、天然のリガンドの誘導体、リガンドとして作用する他の蛋白質、および人工的なリガンド等が含まれる。リガンドは蛋白質またはペプチドであっても、非ペプチド性化合物であってもよい。ペプチド性のリガンドは、組み換え体であってよく、また、修飾されていてもよい。また、リガンドは製剤化されたものであってもよい。また、グリコール結合体（ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＩＦＮ）など、他の化合物と結合したものであってもよい。
Ｉ型ＩＦＮ受容体のリガンドとしては例えばＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βなどが挙げられる。本発明においてＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βには、野生型ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βのみならず、野生型分子の誘導体も含まれる。例えば、野生型ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βに１または複数のアミノ酸を付加、欠失、置換、および／または挿入した蛋白質や、主鎖または側鎖が修飾された蛋白質なども、本発明においてＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βに含まれる。天然のＩ型ＩＦＮには複数のファミリーまたはアイソフォームが存在するが、これらのいずれの分子も、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の制御に利用することができる。また、本発明においてＩＦＮ−αには、ＩＦＮ−ωとも呼ばれるものを含め、全てのＩＦＮ−α型サブタイプ、およびＩＦＮ−α様活性を示す誘導体などが含まれる。またＩＦＮ−βには、全てのＩＦＮ−β型サブタイプ、およびＩＦＮ−β様活性を示す誘導体などが含まれる。
これらのＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを投与して、Ｉ型ＩＦＮ受容体にリガンドを相互作用させることにより、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することができる。リガンドの投与は、標的細胞の受容体に結合し得るように、適宜公知の投与方法に従って行えばよい。
リガンド自体を用いる代わりに、リガンドを発現するベクターを用いることも考えられる。ペプチド性のリガンドは、これをコードする核酸を発現させることにより産生させることができる。例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはこれらの派生体などを発現するベクターを細胞に導入すれば、導入細胞から産生されたこれらの分子がＩ型ＩＦＮ受容体に結合してＩ型ＩＦＮシグナルを活性化する。本発明においてベクターは、Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドを発現することができる限り制限はなく、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むポリヌクレオチド自体、および該ポリヌクレオチドを含む複合体の形態であってよい。リガンドを発現するベクターの作製には、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む公知のベクター系を用いることができる。ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられる。生体へのベクターの投与は、直接ベクターを投与するｉｎ ｖｉｖｏ法、またはベクターを導入した細胞を投与するｅｘ ｖｉｖｏ法により行うことができる。
ｅｘ ｖｉｖｏ法により遺伝子を導入する場合、例えばレトロウイルスベクターを好適に用いることができる。レトロウイルスベクターは、導入遺伝子を宿主染色体に組み込むため、長期間安定した発現が期待できる。例えば関節に対する遺伝子導入においては、体外に取り出した滑膜細胞に対して遺伝子導入を行い、遺伝子が導入された細胞を再び関節に移植することが考えられる。ｉｎ ｖｉｖｏ法により遺伝子を導入する場合、例えばアデノウイルスベクターを用いることができる。アデノウイルスは高濃度に濃縮が可能であり、導入遺伝子がホストのゲノムに組み込まれないため安全性も高い。実際に、滑膜細胞に対してのアデノウイルスベクターの遺伝子導入効率は高いことが報告されており、関節に対する遺伝子導入に用いることが可能である。その他、ｎａｋｅｄ ＤＮＡの投与や、センダイウイルスリポソームを用いた方法などにより、非ウイルスベクターを用いた細胞または生体への遺伝子導入を行うこともできる。ベクターを投与する対象となる細胞は特に制限はない。ベクターやベクターを導入した細胞は、生産されたリガンドが破骨細胞前駆細胞に作用し得るように投与される。例えば骨軟骨部位へ局所投与することができる。
また、ベクターを導入した細胞に限らず、Ｉ型ＩＦＮ受容体のリガンドを産生する細胞であれば、この細胞を投与することも考えられる。本発明におけるＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの投与には、そのリガンドを産生する細胞の投与などのリガンドの間接的な投与も含まれる。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは線維芽細胞、血管内皮細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージなど様々な細胞から産生されるが、特にＩＦＮ−αであれば非Ｔ細胞、ＮＫ細胞等が挙げられる。ＩＦＮ−βであれば、線維芽細胞等が挙げられる。
また、体内にあるＩ型ＩＦＮ産生細胞からのＩ型ＩＦＮ産生を促進することにより、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進することもできる。このためには、Ｉ型ＩＦＮ産生細胞からのＩＦＮ産生を促進する刺激を与えればよい。一般にＩ型ＩＦＮ産生は、ウイルスや微生物の感染、エンドトキシン、合成低分子、抗生物質、多糖体、核酸、マイトジェン、免疫増強剤の投与などによって誘導される（Ｍａｙｅｒ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，”Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ”（インターフェロンおよび他の調節性サイトカイン），１９９８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）。
以上のような方法により、Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドを受容体に相互作用させれば、破骨細胞前駆細胞においてＲＡＮＫＬなどにより誘導される破骨細胞形成が阻害され、骨吸収を抑制することができる。本発明の方法によれば、例えば自己免疫性関節炎における骨破壊を抑制することができる。骨破壊を抑制する対象となる個体に制限はなく、例えばヒト、およびマウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒト骨破壊性疾患に対する予防法または治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、例えば自己免疫性関節炎における骨破壊を予防する新たな方法を開発することができる。
最近、蛋白質の機能抑制の方法の一つとして、抗体誘導療法や、ＤＮＡワクチンによる抗体誘導療法が開発されている。これらの免疫学的手法を用いて破骨細胞形成シグナルに関与する分子の機能を遮断することにより、骨吸収や骨破壊を制御することが可能である。本発明は、破骨細胞形成シグナルに関与する分子に対する抗体を誘導することにより、破骨細胞形成を調節する方法を提供する。好ましい一態様においては、ＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する蛋白質に対する免疫反応を誘導することにより、破骨細胞形成の調節を行う。例えば、癌の骨転移やリウマチなどの病的骨破壊疾患一般に対して、ＲＡＮＫＬシグナル伝達を行う蛋白質に対する免疫反応を誘導することにより、骨破壊を抑制するための抗体誘導療法を実施することができる。ＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する蛋白質としては、例えばＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＦ６、ｃ−Ｆｏｓ、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、Ｆｒａ−１、およびＦｒａ−２などが挙げられるがこれらに制限されない。特に好ましい標的蛋白質としては、ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫが挙げられる。
また、好ましい他の態様においては、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に関与する蛋白質に対する免疫反応を誘導することにより、破骨細胞形成の調節を行う。Ｉ型ＩＦＮシグナルは破骨細胞形成に抑制的に働くことから、このシグナル伝達を抑制することにより、破骨細胞形成を促進することができる。骨形成が亢進する病態に対してＩ型ＩＦＮシグナル伝達に関与する蛋白質に対する免疫療法を実施することにより、破骨細胞形成を促進して骨量の増加を抑制することが可能である。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に関与する蛋白質としては、ＩＦＮ−α／βを含むＩ型ＩＦＮ、その受容体、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、ＩＲＦ−９、およびＰＫＲなどが挙げられるがこれらに制限されない。特に、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−β受容体は、免疫反応の誘導のための標的として好ましい。
破骨細胞形成シグナルに関与する蛋白質を標的とした免疫反応は、これらの蛋白質または抗原性を有する部分蛋白質を抗原として投与することにより誘導される。抗原蛋白質は、適宜アジュバントと組み合わせて投与することができる。例えば、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫあるいはそれらの部分蛋白質を抗原として投与し、抗体を誘導する。ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫに対する免疫反応を誘導する方法を利用してＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫの結合を抑制すること（抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＲＡＮＫ抗体の誘導療法を含む）により、破骨細胞形成は抑制され、骨吸収を低下させることができる。また、Ｉ型ＩＦＮまたはその受容体に対する免疫反応を誘導する方法を利用してＩ型ＩＦＮ−Ｉ型ＩＦＮ受容体の結合を抑制すること（抗Ｉ型ＩＦＮ抗体、抗Ｉ型ＩＦＮ受容体抗体の誘導療法を含む）により、破骨細胞形成の抑制が解除され、骨吸収を促進することができる。本発明は、このような阻害抗体の誘導法による骨吸収の制御により、病的骨破壊または骨形成を病態とする疾患に対する治療を行う方法を提供する。
また、破骨細胞形成を調節するために、抗体以外の可溶性因子を利用することも可能である。例えば、ＲＡＮＫＬに対するデコイ受容体として知られるＯＰＧは、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの結合を阻害することによりＲＡＮＫＬシグナル伝達を遮断する。ＯＰＧが関節炎に対して治療効果を有することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４３，２５９−２６９（２０００）およびｉｎ ｖｉｖｏ（Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：３０４−３０９（１９９９））で示されている。これらのデコイを利用すれば、破骨細胞形成に関わるＲＡＮＫやＩ型ＩＦＮ等のリガンドの作用を阻害することができる。デコイとして機能する蛋白質は、天然の可溶性受容体などを用いることもできるし、また、膜結合型受容体の細胞外領域の部分蛋白質を製造して利用することもできる。例えば、ＲＡＮＫのリガンド結合領域を含む部分ペプチドによりＲＡＮＫＬを捕捉すれば、ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合を阻害し、破骨細胞形成を抑制することができる。また、Ｉ型ＩＦＮに結合するデコイを用いれば、Ｉ型ＩＦＮシグナルを遮断して破骨細胞形成を促進することができる。また、リガンドに結合する蛋白質ではなく、受容体に結合するが受容体を活性化しない因子を用いてシグナルを遮断することもできる。このような因子は、リガンドの変異体や受容体結合部を含む部分ペプチドであってもよく、また非ペプチド性化合物などであってもよい。本発明は、デコイなどによりＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ間、あるいはＩ型ＩＦＮ−Ｉ型ＩＦＮ受容体間の結合を阻害することにより、骨吸収を制御して病的骨破壊または骨形成を病態とする骨疾患に対する治療を行う方法に関する。また、生体が内因性に持つデコイに対する阻害抗体を上記のように誘導させれば、骨吸収をより多様に制御することも可能と考えられる。
Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の制御により破骨細胞形成シグナルを調節する方法を利用すれば、これに影響を与え得る化合物のアッセイ系やスクリーニング系を構築することができる。これらの系では、例えば破骨細胞形成、ＲＡＮＫシグナル伝達、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または骨吸収に対する調節を指標として、化合物の効果が検証される。例えば、被検化合物の存在下において、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達による上記の調節効果がどのように変化するかを調べれば、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの制御を促進または抑制する化合物を見出すことができる。
具体的には、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収に及ぼす化合物の効果を検出する方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞形成を誘導し得る条件で破骨細胞前駆細胞におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、を含む方法である。
この検出における「破骨細胞を誘導し得る条件」とは、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が活性化されなければ、破骨細胞形成が誘導される条件を指す。このような条件とは、例えば破骨細胞前駆細胞においてＲＡＮＫシグナル伝達を促進する条件である。
この検出方法は、特にＩ型ＩＦＮシグナル伝達による（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収、の抑制に及ぼす化合物の促進または抑制効果を検出するために有用である。例えば、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する条件下においても、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収が誘導されるならば、用いた被検化合物は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの抑制作用を低下させる活性を有していると判断される。また、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する条件下において、被検化合物が、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収の阻害をさらに上昇させるならば、用いた被検化合物は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの抑制作用を上昇させる活性を有している可能性がある。さらにＩ型ＩＦＮシグナル伝達が阻害されている条件下で同様の検出を行えば、化合物の効果がＩ型ＩＦＮシグナルに依存しているのかを知ることもできる。このような検出のためには、例えばＩ型ＩＦＮの中和抗体によりＩＦＮを中和したり、実施例で用いられたようなＩＦＮＡＲ^−／−やＩＲＦ−９^−／−の個体や細胞を用いることができる。
用いられる細胞は、破骨細胞に分化し得る細胞であれば制限はなく、例えば骨髄マクロファージ系細胞等が利用される。ＲＡＮＫシグナル伝達を促進するには、例えばＲＡＮＫのリガンドであるＲＡＮＫＬを投与すればよい。ＩＦＮシグナルを活性化しなければ破骨細胞形成が誘導されるように、必要に応じてＭ−ＣＳＦや他のサイトカイン・増殖因子を投与する。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する方法は、上記した方法により行えばよい。具体的には、例えばＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βなどのＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを投与することができる。被検化合物を含む試料としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清などが挙げられる。
本発明の検出方法を用いれば、（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物のスクリーニングを行うことができる。このスクリーニング方法は、
（ａ）被検化合物を含む試料の存在下、破骨細胞形成を誘導し得る条件で破骨細胞前駆細胞におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達を促進する工程、
（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、
（ｃ）対照の条件下と比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を調節する化合物を選択する工程、を含む方法である。
上記の検出方法と同様に、「破骨細胞を誘導し得る条件」とは、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が活性化されなければ、破骨細胞形成が誘導される条件を指す。このような条件とは、例えば破骨細胞前駆細胞においてＲＡＮＫシグナル伝達を促進する条件である。また、このスクリーニング方法は、上記の検出方法と同様に、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達による（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収、の抑制作用を上昇または低下させる化合物をスクリーニングするために利用できる。
対照の条件としては特に制限はないが、例えば被検化合物を含む試料の非存在下における場合が挙げられる。すなわち、上記の工程（ｃ）において、被検化合物を含む試料の非存在下における場合と比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を上昇または低下させる化合物を選択することにより、これらを調節する化合物を得ることができる。また、対照の条件としては、破骨細胞形成、ＲＡＮＫシグナル伝達、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または骨吸収を調節し得る他の化合物の存在下における場合を挙げることもできる。このような態様も、工程（ａ）における被検化合物を含む試料の非存在下における場合に含まれる。この場合、上記の工程（ｃ）において、対照の化合物の存在下における場合と比べ、該（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を上昇または低下させる化合物を選択する。このようなスクリーニングにおいては、ある化合物に比べより高い効果を有する化合物を得ることができる。また、工程（ｃ）において、工程（ａ）よりも低い用量の被検化合物を用いた場合を挙げることもできる。これにより化合物の用量依存性が明らかとなる。
本発明の検出方法およびスクリーニング方法は、例えば実施例１に記載したような破骨細胞形成のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系を用いて行うことができる。具体的には、例えば、非接触性骨髄細胞（２４穴プレートの１ウェル当たり５×１０^５細胞）を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ）で２日間培養し、１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＲＡＮＫＬ、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、さらに適当な濃度のＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの存在下でさらに３日間培養して破骨細胞を形成させる系を利用できる。ここに被検化合物を含む試料を添加して培養する。また、ｉｎ ｖｉｖｏの系であれば、例えば実施例で用いたようなエンドトキシン誘導性骨吸収動物モデルを用いた系が挙げられる。
破骨細胞形成は、例えば文献（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，３５９７−６０２（１９９８））に従って観察することがでる。具体的には、例えば個体であれば、骨切片を作成して骨吸収を観察することができる。また、顕微鏡観察により多核巨細胞を同定したり、ＴＲＡＰ染色や、カルシトニン受容体またはヴィトロネクチン受容体の発現の検出などの公知の検出法により、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ両方で破骨細胞形成を検出することができる。ＲＡＮＫシグナル伝達であれば、例えばＮＦ−κＢやＪＮＫの活性化などを実施例に記載の方法等により検出することができる。また、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルであれば、イムノブロットや免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等によりｃ−Ｆｏｓ蛋白質を検出することができる。ｃ−Ｆｏｓ蛋白質の機能であれば、例えばｆｒａ−１やｆｒａ−２の発現を、ノーザンブロットやＲＴ−ＰＣＲ、イムノブロットなどによりＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルで検出することができる他、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質を介する下流のシグナル伝達の活性化を検出することによって評価することもできる。骨吸収であれば、例えば象牙切片上での骨吸収活性を公知の方法により検出することができる。
この検出の結果、被検化合物を含む試料の添加により、対照の条件下（例えば試料非存在下で検出した場合など）と比較して（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収が有意に促進または抑制されていれば、用いた被検試料はＩ型ＩＦＮシグナル伝達によるこれらの制御を調節する化合物の候補となる。このスクリーニング方法により単離される化合物は、破骨細胞形成を制御するために有用であり、骨代謝疾患の予防薬や治療薬の開発の上でも有用である。
スクリーニングにより選択された医薬候補化合物は、上記本発明の検査方法を用いて、臨床適用のための詳細な投与条件を決定することができる。すなわち、上記検査方法を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防または治療効果を得られる条件を決定することができる。同様に、Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンドの臨床適用のための詳細な投与条件を決定するには、（ａ）破骨細胞形成を誘導し得る条件で破骨細胞前駆細胞にＩ型ＩＦＮ受容体リガンドを接触させる工程工程、（ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ＲＡＮＫシグナル伝達、（３）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその機能、または（４）骨吸収を検出する工程、を含むＩ型ＩＦＮ受容体リガンドの効果を検出する方法を用いることができる。具体的には、本明細書に記載された方法を利用して実施することができる。
また、本発明は、Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンド、または該リガンドを発現するベクターを含む、破骨細胞形成シグナルの制御に用いられる薬剤に関する。本発明は、Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンド、または該リガンドを発現するベクターを含む、以下の薬剤を提供する。
（ａ）破骨細胞形成抑制剤
（ｂ）ＲＡＮＫＬシグナル伝達抑制剤
（ｃ）ｃ−Ｆｏｓ抑制剤
（ｄ）骨破壊抑制剤
Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンド、および該リガンドを発現するベクターは、先に記載したものを用いることができる。本発明において薬剤には、試薬および医薬が含まれる。これらの薬剤は、リガンドやベクター自体を用いる他、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、他の蛋白質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等と適宜組み合わせて組成物としてもよい。これらは混ぜ合わさっていてもよく、使用時に混合されるまで分離されていてもよい。本発明の薬剤は、破骨細胞形成を抑制する作用を有すること、ＲＡＮＫＬシグナル伝達を抑制する作用を有すること、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質の発現またはその活性を抑制する作用を有すること、または骨破壊抑制を抑制する作用を有することが、該薬剤の容器、包装箱、または添付される説明書等に記載されているか、あるいは該薬剤に関連付けられていることが好ましい。関連付けられているとは、該薬剤、その容器、包装箱、または添付される説明書等から、該薬剤が上記作用を有するという情報を直接的または間接的に入手可能であることを言う。例えばこれらの薬剤の作用または用途が別途発行される印刷物に記載されていたり、あるいはウェブ上に開示されている場合などが含まれる。本発明の薬剤は、培養細胞系や個体に適用することができる。対象となる個体は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。特に、Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンド、または該リガンドを発現するベクターを含む本発明の医薬組成物は、ヒト骨破壊疾患に対する予防薬および治療薬として有用である。
Ｉ型ＩＦＮ受容体リガンド、該リガンドを発現するベクター、または上記薬剤を医薬組成物として用いる場合は、リガンドやベクター自体を直接患者や個体に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。組成物におけるリガンドやベクターの含有率は適宜決定すればよい。
患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。また、全身的または局所的に投与され得る。ＩＦＮ等の薬剤の投与による全身的な副作用が問題となる場合には、局所投与により投与量を抑えることができる。投与量、投与方法は、医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。実施例に示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において１Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βが破骨細胞形成をほぼ完全に抑制した。また、ＩＦＮ−αにおいては１０Ｕ／ｍｌの濃度において、ＩＦＮ−α非存在下に比べ破骨細胞形成を約１／１０に抑制した。例えばｉｎ ｖｉｖｏにおいても、標的とする破骨細胞前駆細胞周辺で、このような有効濃度を維持できるように薬剤の投与量を決定することができる。投与は１回から数回に分けて行うことができる。
本発明の医薬組成物は、特に炎症性骨吸収および炎症性骨破壊の防止に有用である。「炎症性骨吸収および骨破壊」とは、炎症を伴う骨吸収および骨破壊を言う。例えば関節炎においては、滑膜に含まれる滑膜マクロファージからの破骨細胞形成が促進され、パンヌスが骨へと侵入する前線領域で活発な骨吸収が起こっている。特に慢性関節炎においては、この骨吸収により長期的な関節破壊が進行する。本発明の医薬組成物を投与することにより、この病的骨吸収を抑制することができる。このような炎症症骨吸収を伴う関節炎としては、特に慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）を含む自己免疫性関節炎が挙げられる。慢性関節リウマチは、自己免疫性の慢性炎症性疾患であり、増殖した滑膜が活発に骨軟骨へと侵入し、多発性の関節破壊をもたらす。本発明の医薬組成物は、この関節炎性骨破壊を防止するために好適に用いられる。また、本発明の医薬組成物が適用され得る他の炎症性骨吸収としては、歯周病が挙げられる。
また、本発明の医薬組成物は、巨細胞腫、癌骨転移、および色素性絨毛結節滑膜炎（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｖｉｌｌｏｎｏｄｕｌａｒ ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ；ＰＶＳ）を含む、破骨細胞による骨吸収亢進を病態とする様々な疾患に対しても適用され得る。また、骨粗鬆症および癌の高カルシウム血症の治療への適用も期待される。さらに、Ｐａｇｅｔ病、肝炎やエイズに伴う骨量減少、白血病や多発性骨髄腫に伴う骨吸収・骨破壊、人工関節周囲の骨吸収（ルースニング）に対する予防および治療にも適用され得る。本発明の医薬組成物は、該組成物が上記に示した疾患の少なくとも１つに対して適用できることがその容器、包装箱、または添付される説明書等に記載されているか、あるいは該組成物に関連付けられていることが好ましい。本発明により、破骨細胞の形成および機能の制御による新たな治療介入が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において引用された文献は、全て本明細書の一部として組込まれる。
実験に用いたＩＦＮ−γＲ^−／−マウス、ＩＲＦ−１^−／−マウス、およびＩＲＦ−９^−／−マウスの作製は以前記載されている（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，１７４２−５（１９９３）；Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５，８３−９７（１９９３）；Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １，１１５−１２４（１９９６））。ＩＦＮＡＲ１^−／−マウスの作製は文献（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４（５１６７）：１９１８−２１，１９９４）に記載されている。ＩＦＮ−β^−／−マウスの作製は、文献（Ｔａｋａｏｋａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８，２３５７−２３６０（２０００））に記載されている。これらのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６のバックグランドで維持した。これらの変異マウスと遺伝的に同一のバックグランドを持つＣ５７ＢＬ／６マウスを野生型コントロールとして用いた。Ｓｔａｔ１^−／−マウス（Ｍｅｒａｚ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８４，４３１−４２（１９９６））はＴａｃｏｎｉｃ社から購入した。ＰＫＲ^−／−マウスの作製は文献（Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１４，６０９５−６１０６（１９９５））に記載されている。Ｆｏｓ^−／−マウスの作製は文献（Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６０，７４１−７４５（１９９２））に記載されている。ＩＲＦ−３／ＩＲＦ−９^−／−マウスの作製は文献（Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，５３９−５４８（２０００））に記載されている。全てのマウスは、病原体除去条件下で産仔、維持した。
［実施例１］ 破骨細胞形成に対するＩ型ＩＦＮの効果
Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）の破骨細胞形成に対する効果を、野生型マウス由来の骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）を用いて調べた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成を観察するため、非接触性骨髄細胞（２４穴プレートの１ウェル当たり５×１０^５細胞）を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ社）を含むα−最小必須培地（α−ＭＥＭ）で２日間培養し、ＢＭＭとして用いた。これらのＢＭＭは１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）および１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの存在下でさらに３日間培養し破骨細胞を形成させた。多核細胞の観察は以前記載したように行った（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，３５９７−６０２（１９９８））。培地は４８時間おきに交換した。このアッセイ系に、組み換えマウスＩＦＮ−αおよび組み換えマウスＩＦＮ−βを添加しその効果を検証した。組み換えＩＦＮ−α／βの添加は、ＢＭＭ培養へのＲＡＮＫＬの添加と同時に行った。
図１に示したように、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの添加は破骨細胞形成に対し強い阻害効果を示した。さらに、ＩＦＮ−γＲ、Ｓｔａｔ１、またはＩＲＦ−１を欠損したマウス由来のＢＭＭにおける破骨細胞形成に対するＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）の効果を検証した。その結果、ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞形成のＩ型ＩＦＮによる阻害には、Ｓｔａｔ１を介し、ＩＲＦ−１に非依存的な遺伝子誘導経路が重要であることが示された（図１）。
［実施例２］ Ｉ型ＩＦＮ受容体欠損マウスにおける骨格系の評価
骨ホメオスタシスの制御におけるＩＦＮ−α／βの生理学的な役割を調べるため、ＩＦＮ−α／βの受容体成分の１つを欠損したマウス（ＩＮＦＡＲ１^−／−マウス）の骨格系の評価を行った。ＩＮＦＡＲ１^−／−マウスでは、厳密な病原体除去条件下で海綿骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）の骨量の著しい減少が観察された（図２ａ）。また、野生型マウスに比べ、ＩＮＦＡＲ１^−／−マウスの骨では破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰに陽性の多核細胞（ＴＲＡＰ^＋ ＭＮＣ）が顕著に増加していた（図２ｂ）。さらに骨の形態計測学的解析からも、海綿骨梁の骨量の有意な減少が明らかとなった（図３ａ）。これには破骨細胞による骨吸収の亢進を伴っていたが、骨芽細胞による骨形成のマーカーに顕著な違いはなかった。これらの結果は、破骨細胞による骨吸収を負に調節することを通して正常な骨量を維持するために、ＩＦＮ−α／βシグナル伝達は生理学的に必須であることを示唆している。ＩＮＦＡＲ１^−／−マウス由来の骨髄単球・マクロファージ系前駆細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ；ＢＭＭｓ）においても、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦによるｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成の誘導が亢進している（図３ｂ）ことから、破骨細胞形成の亢進はストローマ細胞ではなく、ＢＭＭｓに依存することが示唆された。これに一致して、野生型（ＷＴ）由来のＢＭＭｓを用いた場合、ＢＭＭｓと骨芽細胞との共培養における破骨細胞形成は、骨芽細胞がどちらに由来するものであっても違いは見られなかった（データ省略）。さらに、頭蓋骨の細胞における骨芽細胞分化をＡＬＰ活性およびアリザリンレッド染色により評価したが、ＩＮＦＡＲ１^−／−とＷＴとの間で違いはなかった（図３ｃ）。インビトロで得られたこれらの結果は、上記のインビボにおける観察と一致しており、ＩＮＦＡＲ１^−／−マウスにおける破骨細胞形成の増強は、ＢＭＭの細胞自律性の異常によることを示唆している。
［実施例３］ ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−β遺伝子の誘導
上記の知見は、ＩＦＮ−α／β系は破骨細胞形成のネガティブフィードバック調節に必須であり、またＲＡＮＫＬはＢＭＭにおけるＩＦＮ−α／β遺伝子の発現を誘導し得ることを示唆している。そこで、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＩＦＮ−β ｍＲＮＡの発現を観察した。Ｍ−ＣＳＦ存在下で２日間ＢＭＭを培養後、ＲＡＮＫＬで２または２４時間刺激した。文献（Ｈｉｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：６４３−６５５，２０００）に従ってＲＮＡを抽出し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はシークエンスを行ってＩＦＮ−β ｃＤＮＡの増幅を確認した。定量的ＲＴ−ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒとＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＲＡＮＫＬで刺激したＢＭＭｓでＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導が検出されたことから（図４ａ）、オートクラインに産生される因子であるＩＦＮ−βが、ＲＡＮＫＬシグナル伝達のネガティブフィードバック調節因子であることが示唆される。しかし、同じ条件でＩＦＮ−α ｍＲＮＡの誘導は見られなかったことから、これらの２つのＩＦＮのサブタイプは抗ウイルス作用が共通するにも関わらず、ＩＦＮ−βが選択的に破骨細胞形成に関与していることを示唆している。そこで、ＩＦＮ−βが欠失したマウス（ＩＦＮ−β^−／−マウス）の骨格系を調べた。図４ｂに示したように、ＩＮＦＡＲ１^−／−マウスと同様、これらのマウスはやはり破骨細胞形成の増強による重篤な骨減少症を発症したことから、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＩＦＮ−βが骨ホメオスタシスに必須の役割を果たすことが示された。ＩＮＦＡＲ１^−／−マウスと同様、ＩＦＮ−β^−／−マウスの骨芽細胞性骨形成には異常はみられなかった。
［実施例４］ Ｉ型ＩＦＮによる破骨細胞形成抑制機構の解析
ｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成におけるＩ型ＩＦＮの効果を調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成は実施例１と同様にして行った。具体的には、非接触性骨髄細胞（２４穴プレートの１ウェル当たり５×１０^５細胞）を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）を含むα−ＭＥＭで２日間培養し、ＢＭＭとして用いた。これらのＢＭＭは１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）および１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦの存在下でさらに培養し破骨細胞を形成させた。ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦはこの実験においてこれらの濃度に固定して用いた。組み換えマウスＩＦＮ−βの添加は、ＢＭＭ培養へのＲＡＮＫＬの添加と同時に行った。３日後にＴＲＡＰ^＋多核細胞（ＴＲＡＰ^＋ ＭＮＣｓ）（３核より多い細胞）を計数した。全てのデータは平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝６）で表した。ＴＲＡＰ^＋ ＭＮＣｓは象牙質切片の骨吸収活性およびカルシトニン受容体の発現を調べて解析した。生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）破骨細胞培養は以前記載したように行った（Ｏｇａｔａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：９３５−９４３（２０００））。
組み換えマウスＩＦＮ−βの破骨細胞形成に対する顕著な阻害効果が、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで誘導されるＢＭＭｓからの破骨細胞形成（図５ａ）、およびＲＡＮＫＬで誘導されるＲＡＷ２６４．７細胞からの破骨細胞形成（データ省略）において観察されたことから、ＩＦＮ−βはＲＡＮＫＬシグナル伝達を妨害することが示された。Ｍ−ＣＳＦの存在下、ＲＡＮＫＬで誘導されるＢＭＭからの破骨細胞形成に対する著明な阻害効果が、わずか１Ｕ／ｍｌの濃度のＩＦＮ−βで観察された。この濃度では、Ｍ−ＣＳＦにより誘導される細胞増殖に対する効果はほとんどまたは全く見られなかった。ＩＦＮ−β（およびＩＦＮ−αも同様）はそのレセプター複合体に結合し、ＩＳＧＦ３［Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、およびＩＲＦ−９からなるヘテロ三量体複合体］、ＧＡＦ／ＡＡＦ（Ｓｔａｔ１ホモダイマー）、およびＩＲＦ−１を含む転写因子の活性化および誘導を通して細胞応答を引き起こす（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，２２７−２４６（１９９８））。ＩＦＮ−βによる破骨細胞形成の阻害効果は、ＩＦＮＡＲ１^−／−マウス、Ｓｔａｔ１^−／−マウス、およびＩＲＦ−９^−／−マウスでは失われたが、ＩＲＦ−１^−／−マウスでは認められた（図１および５ｂ，ｃ）。これらの知見は、ＩＦＮ−βによる破骨細胞形成の阻害には、ＩＦＮＡＲ１およびＳｔａｔ１に加え、ＩＲＦ−９が必要であることを示し、この阻害作用がＩＳＧＦ３を介した遺伝子誘導経路と関連していることを示している。
［実施例５］ Ｉ型ＩＦＮによる破骨細胞形成抑制機構の解析
大理石骨病の表現型を示す遺伝子改変マウスにより、ＲＡＮＫＬ、そのレセプターであるＲＡＮＫ、ＴＲＡＦ６、ＮＦ−κＢ成分であるｐ５０／ｐ５２、およびＡＰ−１成分であるｃ−Ｆｏｓを含む破骨細胞形成に必須な分子が明らかとなっている。ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合すると、ＴＲＡＦ６が動員され、これがＮＦ−κＢ経路およびＪＮＫ経路を活性化する。ＲＡＮＫＬがどのようにｃ−Ｆｏｓ経路を活性化するのかは知られていないが、ｃ−ｆｏｓ^−／−マウスにおける大理石骨病は、ｃ−Ｆｏｓの転写標的であるＦｒａ−１の過剰発現によりレスキューできることから、Ｆｏｓファミリー蛋白質もまた、破骨細胞形成に本質的な役割を果たしている可能性が示唆される。破骨細胞形成におけるＩＦＮ−βによる阻害の標的を調べるため、ＩＦＮ−β処理したＢＭＭｓにおいて、ＲＡＮＫＬ誘導性のＮＦ−κＢおよびＪＮＫの活性化を試験した。
ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、同時にＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下で２４時間プレインキュベートしたＢＭＭｓから細胞抽出液を調製し、ＩＦＮ−βプロモーターのＮＦ−κＢ結合部位を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて以前に記載した通りにＥＭＳＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）により解析した（Ｌｏｍａｇａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，１０１５−２４（１９９９））。抗Ｒｅｌ Ａ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）によりスーパーシフトを行った。またＪＮＫアッセイのため、ＲＡＮＫＬで刺激し、同時にＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下で２４時間プレインキュベートしたＢＭＭから細胞抽出液を調製し、抗リン酸化ＪＮＫ抗体および抗ＪＮＫ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｓ社）を用いたイムノブロットにより解析した。
さらに破骨細胞形成におけるＲＡＮＫＬシグナル伝達の下流の分子の発現を評価するため、ＲＡＮＫＬ添加後２４時間おきに、ＢＭＭの全細胞溶解物をＲＡＮＫ，ＴＲＡＦ６，ＴＡＫ１，ＲｅｌＡ，ｃ−Ｆｏｓ，Ｆｒａ−１，Ｆｒａ−２，ｃ−Ｊｕｎ（以上Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社），およびリン酸化ｃ−Ｊｕｎ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｓ）特異抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。
ＥＭＳＡおよびイムノブロッティングにより、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫ経路の活性化はＩＦＮ−βによって障害されないことが示された（図６ａおよび６ｂ）。ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路の下流のエフェクター分子をイムノブロットにより解析したところ、ｃ−Ｆｏｓ以外の分子の発現は影響されないが、ＩＦＮ−βによりｃ−Ｆｏｓ蛋白質の発現が特異的にダウンレギュレートされることが判明した（図６ｃ）。ＴＲＡＦ６の発現が正常であることは、この下流の分子であるＮＦ−κＢやＪＮＫの活性化が正常に誘導されたという上記のＥＭＳＡおよびイムノブロット解析の結果と合致している。
さらに、破骨細胞形成時における様々なＡＰ−１成分のｍＲＮＡレベルをＲＮＡプロテクションアッセイにより調べた。ＲＮＡプロテクションアッセイは、ＲＡＮＫＬ添加後２４時間おきにＢＭＭから全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて添付の説明書に従って解析した。興味深いことに、ＲＡＮＫＬによるｃ−Ｆｏｓ ｍＲＮＡの誘導は、ＩＦＮ−βにより有意に変化しなかった（図７ａ）。このことは、ｃ−Ｆｏｓの蛋白質レベルは転写後制御を受けることを示唆している。ＩＦＮ−βによるｃ−Ｆｏｓ蛋白質のダウンレギュレーションは、Ｆｒａ−１およびＦｒａ−２ ｍＲＮＡ発現の低下を伴っていた（図７ｂ）。Ｆｒａ−１はｃ−Ｆｏｓの制御下にあることが報告されているが、本実験の結果はＦｒａ−２ ｍＲＮＡ発現もまた、ｃ−Ｆｏｓに依存していることを示唆している。期待される通り、Ｆｒａ−１およびＦｒａ−２蛋白質発現も著しくダウンレギュレートされていることがイムノブロッティングにより判明した（図７ｃ）。
ＩＦＮ−βによるｃ−Ｆｏｓ抑制機構を解析するため、パルス−チェイス実験によりｃ−Ｆｏｓ蛋白質の合成を調べた。ＲＡＮＫＬの存在下、ＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下で４８時間ＢＭＭをプレインキュベートした。このＢＭＭを、１０％の透析ウシ胎児血清を含むメチオニン不含のダルベッコ改変イーグル培地中、１００μＣｉ／ｍｌの［^３５Ｓ］メチオニンと共に３０分間インキュベートした。標識された培地を除き、全細胞抽出液を調製した。ｃ−Ｆｏｓに対するポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはβ−アクチンに対するポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを実施した。図８ａに示したように、ＲＡＮＫＬで刺激したＢＭＭにおいて、ＩＦＮ−βはｃ−Ｆｏｓ蛋白質合成を阻害することが判明した。
上記の結果からは、ＩＦＮ−βの作用はＩＳＧＦ３を介し、さらにｃ−Ｆｏｓ合成の阻害を介していることを示している。このことから、メディエーターの候補の１つとしてｄｓＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＰＫＲ）が考えられる。ＰＫＲ遺伝子はＩＦＮ−βによりＩＳＧＦ３の活性化を介して誘導され、ＰＫＲは、蛋白質合成のイニシエーション因子の１つであるｅＩＦ２αのリン酸化による蛋白質合成の阻害に関与している（Ｔｈｏｍｉｓ，Ｄ．Ｃ．＆ Ｓａｍｕｅｌ，Ｃ．Ｅ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，７６９５−７７００（１９９３）；Ｓａｍｕｅｌ，Ｃ．Ｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，７６０３−７６０６（１９９３））。そこで、ＰＫＲを欠失したマウス（ＰＫＲ^−／−マウス）由来のＢＭＭにおいてＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成に対するＩＦＮ−βの阻害効果を調べた（図８ｂ）。その結果、ＰＫＲは一定の役割を果たしているものの、明らかにＩＦＮ−βの他の標的が存在していることが示され、それらの標的もまた、このシグナル伝達のクロストークに関わっていると予想された。
Ｆｏｓ蛋白質の発現が、ＩＦＮ−βによる破骨細胞形成の阻害の原因であるかを決定するため、ｃ−ｆｏｓ、ｆｒａ−１、およびｆｒａ−２ ｃＤＮＡを持つレトロウイルスベクター（それぞれｐＢａｂｅ−ｃ−ｆｏｓ、ｐＢａｂｅ−ｆｒａ−１、およびｐＢａｂｅ−ｆｒａ−２）をＢＭＭｓに感染させた。
ｐＢａｂｅ−ｃ−ｆｏｓ、ｐＢａｂｅ−ｆｒａ−１、ｐＢａｂｅ−ｆｒａ−２、およびｐＢａｂｅ−ｃ−ｊｕｎの作製は以前記載されている（Ｍａｔｓｕｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：１８４−１８７，２０００）。レトロウイルスのパッケージングは、これらのプラスミドとｐＰＡＭｐｓｉ２（Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４４１：１０６−１１０（１９９８））を２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトすることにより行った。感染の２日後にＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）／Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−β（１０Ｕ／ｍｌ）をＢＭＭに添加し、破骨細胞形成のアッセイを行った。ＲＡＮＫＬ添加の３日後に、ＴＲＡＰ染色および骨吸収アッセイ（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，３５９７−６０２（１９９８））により破骨細胞形成を評価した。ｐＢａｂｅ−ｃ−ｆｏｓから得たマウスＦｏｓ遺伝子のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片が挿入されたｐＭＸ−ｃ−ｆｏｓ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを構築し、トランスフェクション効率を決定するために用いた。
ＩＦＮ−βによる分化抑止は、これらのいずれのウイルスによっても有意に減少したが、コントロールベクター（ｐＢａｂｅ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）またはｃ−ｊｕｎウイルス（ｐＢａｂｅ−ｃ−ｊｕｎ）（図９および１０）、さらにはＴＲＡＦ６ウイルス（ｐＭＸ−ＴＲＡＦ６−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）（データ省略）では減少しなかった。これらの結果を合わせると、破骨細胞形成のＩＦＮ−βによる阻害において、ｃ−Ｆｏｓは重要なターゲットであることが示される。
［実施例６］ ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−β誘導におけるｃ−Ｆｏｓの必要性
ウイルスが感染した細胞におけるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの誘導には、２つのＩＲＦ転写因子、すなわちＩＲＦ−３とＩＲＦ−７が必要であることがよく知られている（Ｗａｔｈｅｌｅｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １，５０７−５１８（１９９８））。またＩＦＮ−βはＮＦ−κＢに依存することも知られている（Ｗａｔｈｅｌｅｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １，５０７−５１８（１９９８））。しかしながら、上記のように、ＩＦＮで誘導される遺伝子群の誘導は、ｃ−Ｆｏｓを欠失した破骨細胞前駆細胞では観察されなかったことから、ｃ−Ｆｏｓには、ＲＡＮＫＬのＩＦＮ−β遺伝子誘導に参与するという、これまで知られていなかった機能があることが示唆される。これをさらに調べるため、ｃ−Ｆｏｓ欠失マウス（Ｆｏｓ^−／−マウス）、あるいはＩＲＦ−３およびＩＲＦ−９の両方を欠失するマウス（ＩＲＦ−３／ＩＲＦ−９^−／−マウス；ＩＲＦ−９が欠損するとＩＲＦ−７の発現も喪失する）由来の破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫＬで誘導されるＩＦＮ−β ｍＲＮＡ発現を解析した。Ｆｏｓ^−／−マウスの単球／マクロファージ系前駆細胞は脾臓から回収し、文献（Ｍａｔｓｕｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：１８４−１８７，２０００）に従って培養した。ＩＲＦ−３／ＩＲＦ−９^−／−マウスの脾細胞はウイルスによるＩＦＮ−β遺伝子の誘導は全く欠損するが、同じ欠損がＢＭＭにおいても見られた（データ省略）。
興味深いことに、ＩＲＦ−３／ＩＲＦ−９^−／−マウス由来の破骨細胞前駆細胞では、ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導は検出されたが、Ｆｏｓ^−／−マウス由来の細胞では観察されなかった（図１１ａ）。一方、ウイルスによるＩＦＮ−β遺伝子誘導は、Ｆｏｓ^−／−マウス由来の脾細胞では影響されなかった（データ省略）。これらの知見は、ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−β遺伝子の誘導は、ウイルス感染によるものとはそのメカニズムも生物学的機能も異なっていることを示唆している。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡ誘導の機構をさらに調べるため、ＩＦＮ−βプロモーターにより誘導されるルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐ１２５Ｍｕ−Ｌｕｃ）（Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，５３９−５４８（２０００））をＲＡＷ２６４．７細胞にトランスフェクションすることにより、ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−βプロモーターの活性化を調べた。トランスフェクション後、ＲＡＷ２６４．７細胞はＲＡＮＫＬで４２時間刺激した。ルシフェラーゼアッセイはトランスフェクションの４８時間後に行った。全てのデータは平均±ｓ．ｅ．（ｎ＝４）で示した。図１１ｂに示したように、トランスフェクトした細胞をＲＡＮＫＬで刺激すると、ルシフェラーゼ活性が有意に上昇した。興味深いことに、ＲＡＮＫＬ刺激の代わりにｃ−Ｆｏｓを異所発現させた場合でも、同様の誘導が観察された（図１１ｂ）。さらにこの誘導は、このプロモーター中でｃ−Ｊｕｎ／ＡＴＦ−２が結合することが知られているｃ−Ｆｏｓ結合部位（Ｆａｌｖｏ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０，４８１４−４８２５（２０００））を変異させると失われた（ｐ１２５Ｍｕ−Ｌｕｃ−ｍｔ）（図１１ｂ）。これらの結果は、ＲＡＮＫＬシグナルは、ＩＲＦではなく、ｃ−Ｆｏｓを介してＩＦＮ−β遺伝子の転写を誘導することを示唆している。なお、Ｐ１２５Ｍｕ−Ｌｕｃ−ｍｔは、ＩＦＮ−β遺伝子プロモーターの予想されるｃ−Ｆｏｓ結合部位に変異を導入して作製した（−９５ＴＧＡＣＡＧＡ−８９→ＴＣＴＧＴＣＡ）。
［実施例７］ 骨疾患モデルにおけるＩ型ＩＦＮの治療効果
炎症性骨破壊のエンドトキシン誘導モデルを用いて、ＩＦＮ−βの局所注入の治療効果を調べた。７〜８週齢のマウス（ｎ＝２０）の頭蓋冠に、リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ社）を２５ｍｇ／ｋｇ−体重で局所投与した。ＬＰＳ注入と同じ部位に、続く４日間にわたって組み換えマウスＩＦＮ−β（１００００Ｕ／ｄａｙ）（ｎ＝１０）または対照の生理食塩水（ｎ＝１０）を皮下投与した。ＬＰＳ注入の５日後に、以前の記載に従って海綿骨梁の骨面のミリメートルあたりの破骨細胞数、および破骨細胞で覆われた骨面（侵食面）の割合を解析した（Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７，４２３１−６（１９９９））。
炎症部位へのＩＦＮ−β投与を毎日行った結果、破骨細胞形成および骨吸収が顕著に阻害された（図１２）。これは、ＩＦＮ−βの外来適用が実際に骨破壊に対して有効であることを示しており、骨破壊疾患におけるＩＦＮ−βの臨床適用の可能性を示唆している。ＩＦＮ−βは既に数種のヒト癌および多発性硬化症などの自己免疫疾患に対して適用が行われている。骨破壊は、複数の骨髄腫および転移性骨癌を含む腫瘍、並びに自己免疫性関節炎などの炎症状態にしばしば付随していることから、それぞれの疾患状態における効果を注意深く評価する必要はあるものの、ＩＦＮ−βは癌や関節炎で誘導される骨破壊に対する治療に特に効果を有する可能性がある。骨破壊部位へのＩＦＮ−α／βの局所送達は投与量を低く抑えることができるため、副作用を低減することが可能である。
［実施例８］ ヒト破骨細胞形成におけるＩ型ＩＦＮの効果
マウス破骨細胞形成における組み換えマウスＩＦＮ−βの強い抑制効果が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて見出されたことから、本発明者らはヒト破骨細胞形成における組み換えＩＦＮ−βの効果を確認した。まず、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦで刺激したヒト末梢血単核細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成におけるＩＦＮ−βの効果を調べた。健常者から末梢血を採取し、ＲＰＭＩ １６４０で１：１に希釈し、フィコール／プラークに重層して４００ｇで３０分間遠心した。単離した末梢血単核細胞（１０^６細胞／ウェル）を２４ウェルのマルチウェルプレートに加えた。これらの細胞は２０％ウマ血清を含むα−ＭＥＭ中、１００ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）の存在下、かつ組み換えヒトＩＦＮ−β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下または非存在下で１０日間培養した。その結果、ヒト破骨細胞形成に対し、マウスの場合と同様のＩＦＮ−βの強い抑制効果が観察された（図１３ａ）。
ヒト疾患における病的骨吸収に対するＩＦＮ−βの有益な効果を示すため、慢性関節リウマチ患者由来の培養滑膜細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成の系を利用した。この系は、リウマチ滑膜（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｓｙｎｏｖｉｕｍ）で観察される病的破骨細胞形成のｅｘ ｖｉｖｏモデルである（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４３，２５９（２０００））。滑膜組織を切り離し、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）および０．１５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＰＭＩ １６４０を２０倍の容量加えて混合し、振盪しながら３７℃で９０分間インキュベートした。細胞懸濁液を７０ｍｍのｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒを通して濾過した。細胞は、最終的に２０％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むα−ＭＥＭ中に懸濁した。単離した滑膜細胞（１０^６細胞／ウェル）は２４ウェルのマルチウェルプレートに撒き、１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３［１，２５（ＯＨ）_２Ｄ_３］（１０^−７Ｍ）（Ｔｅｉｊｉｎ Ｃｏ．）および２ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＭ−ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ）の存在下、かつ組み換えヒトＩＦＮ−βの存在下または非存在下で２０日間培養した。３日おきに、培地の半分を交換した。このｅｘ ｖｉｖｏ破骨細胞形成モデルにおいて、組み換えＩＦＮ−βの強い抑制効果が見出された（図１３ｂ）ことから、慢性関節リウマチなどのヒト疾患で見られる破骨細胞性の骨破壊に対して、ＩＦＮ−βは有益な効果を有していることが示された。従って、ＩＦＮ−α／βを局所的または全身的に適用することは、ヒト骨疾患における骨吸収を抑制するための新たな戦略となることが示唆される。
産業上の利用の可能性
本発明は、これまで知られていなかったＩＦＮ−α／βと骨のホメオスタシス、すなわち破骨細胞形成の抑制による骨量の維持との間の結びつきを明らかにした。ジーンターゲティングによりＩＦＮＡＲ１を破壊すると、破骨細胞形成が増強され全身性の骨粗鬆症を引き起こす。これは、元来、抗ウイルス応答に関してその効果が確立されたこれらのサイトカインの恒常的発現における生理機能の興味深い一例である。本発明により、Ｉ型ＩＦＮシグナルを介して破骨細胞形成を抑制する方法が提供された。本発明の方法によれば、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの投与などのＩ型ＩＦＮシグナル伝達の活性化により、破骨細胞形成を抑制することが可能となる。破骨細胞形成を制御することにより、異常な骨代謝を制御することができる。本発明の方法は、自己免疫性関節炎を含む、病的骨破壊を伴う疾患を予防または治療するために有用である。
ＩＦＮ−α／βの外からの添加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両者において、破骨細胞形成を顕著に抑制する効果を有していたことから、骨破壊疾患に対する臨床適用の可能性が強く示唆される。また、破骨細胞形成に必須であるｃ−Ｆｏｓの蛋白質レベルを、ＩＦＮ−βがダウンレギュレートすることを明らかにすることにより、本発明者らはこの抑制効果の分子基盤を提供した。骨疾患の治療へのＩＦＮ−α／βの新たな可能性に加え、本発明はまた、Ｆｏｓ（ファミリー）蛋白質の発現または機能を阻害する方法が、破骨細胞を抑制する創薬の際の１つの代替戦略ともなることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
図１は、野生型マウス、あるいはＩＦＮ−γＲ、Ｓｔａｔ１、またはＩＲＦ−１欠損マウス由来のＢＭＭの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの効果を示す図である。それぞれのマウスに由来するＢＭＭの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの効果を、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で調べた。破骨細胞数（％）は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−β処理した培養中でのＴＲＡＰ^＋多核細胞数を、ＩＦＮ−α／βを含まないコントロールの培養中での数で除して求めた。
図２は、Ｉ型ＩＦＮ受容体欠損マウス（ＩＦＮＡＲ１^−／−マウス）における骨格系の評価を示す写真である。マイクロＸ線撮影解析は、本質的に以前の記載（Ｂｕｃａｙ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：１２６０−１２６８（１９９８）；Ｏｇａｔａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：９３５−９４３（２０００））に従って行った。
ａ，ＩＦＮ−α／βシグナル伝達欠損マウスの骨表現型の解析。ＩＦＮＡＲ１^−／−マウス脛骨の組織学的および放射線学的解析を示す。１２週齢のＩＦＮＡＲ１^−／−マウスの骨幹端領域の縦断切片（トルイジンブルー染色）および横断切片（マイクロＣＴ［微細コンピューター断層撮影］）において、海綿骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）の骨量の減少が明白に認められた。２４週齢においても同程度の骨量の減少が観察された。
ｂ，ＩＦＮＡＲ１^−／−マウスの増殖板（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ）の下のＴＲＡＰ^＋ＭＮＣ（赤く染色）数の増加。
図３は、Ｉ型ＩＦＮ受容体欠損マウス（ＩＦＮＡＲ１^−／−マウス）における骨格系の評価を示す図および写真である。組織形態計測学的解析は、本質的に以前の記載（Ｂｕｃａｙ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：１２６０−１２６８（１９９８）；Ｏｇａｔａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：９３５−９４３（２０００））に従って行った。
ａ，ＩＦＮＡＲ１^−／−マウスの組織形態計測学的解析を示す（ｎ＝６，データは平均±Ｓ．Ｅ．で示した）。海綿骨梁の骨量（ＢＶ／ＴＶ）の有意な減少が示され、破骨細胞による骨吸収の増強を示す指標を伴っていた（骨周囲あたりの破骨細胞数［Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ］、骨面あたりの破骨細胞面［Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ］）、侵食面［ＥＳ／ＢＳ］）。しかしながら、骨芽細胞による骨形成のマーカーに変化はなかった（骨芽細胞面［ＯＢ／ＢＳ］、骨形成率［ＢＦＲ／ＢＳ］）。皮質骨量（ｃｏｒｔｅｘ ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ）の減少（ほぼ２０％）も観察された。
ｂ，ＩＦＮＡＲ１^−／−マウスＢＭＭでは、破骨細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化は細胞自律的にアップレギュレートされている。ＩＦＮＡＲ１^−／−細胞において、ＴＲＡＰ^＋ＭＮＣ数の増加および多核化が見られた。
ｃ，ＩＦＮＡＲ１欠損破骨細胞および骨芽細胞のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）分化を示す。ＩＦＮＡＲ１^−／−マウスでは、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激したＢＭＭｓにおけるＴＲＡＰ陽性多核細胞（ＴＲＡＰ^＋ＭＮＣｓ）形成は増強した（左）が、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性およびアリザリンレッド染色で調べた骨芽細胞の分化に有意な差はなかった（右）。
図４は、ＲＡＮＫＬで刺激後のＢＭＭｓにおけるＩＦＮ−β ｍＲＮＡ発現およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＦＮ−βの機能を示す図および写真である。
ａ，Ｍ−ＣＳＦ存在下で２日間培養後、ＢＭＭｓをＲＡＮＫＬで２または２４時間刺激し、ＲＮＡを抽出して半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β ｍＲＮＡ発現を解析した。希釈倍数を各レーンの下に示した。ＲＮＡ抽出および半定量的ＲＴ−ＰＣＲは以前記載したように行った（Ｈｉｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：６４３−６５５，２０００）。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＲＡＮＫＬ刺激は破骨細胞前駆細胞のＩＦＮ−β ｍＲＮＡ発現を一過的に増加することが示された。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲシステムにより２０倍より大きいと見積られた。この誘導は、ウイルス感染細胞のそれよりも（約一桁）弱い。
ｂ，ＩＦＮ−β^−／−マウスにおける海綿骨梁の骨量の減少および破骨細胞数の増加を図２および３と同様に調べた。
図５は、野生型マウス、あるいはＩＦＮＡＲ１^−／−、Ｓｔａｔ１^−／−、ＩＲＦ−９^−／−、およびＩＲＦ−１^−／−マウス由来のＢＭＭの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−βの効果を示す図および写真である。
ａ，ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激した野生型マウス由来のＢＭＭ培養に対するＩＦＮ−βの効果を示す図である。図示した濃度（Ｕ／ｍｌ）の組み換えＩＦＮ−βをＢＭＭ培養に添加した。組み換えＩＦＮ−βは、破骨細胞形成に対して用量依存的な強い阻害効果を有していた。ＩＦＮ−αでも破骨細胞形成に対する阻害効果が観察されたが、その効果は比較的弱く、同じレベルの阻害効果を達成するには約１０倍の濃度が必要であった。
ｂ，野生型マウス、あるいはＩＦＮＡＲ１、Ｓｔａｔ１、ＩＲＦ−９、またはＩＲＦ−１欠損マウス由来のＢＭＭｓからの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−β（１０Ｕ／ｍｌ）の阻害効果を示す図である。
ｃ，野生型マウス、あるいはＳｔａｔ１、ＩＲＦ−９、またはＩＲＦ−１欠損マウス由来のＢＭＭｓからの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−β（１０Ｕ／ｍｌ）の効果の比較を示す。
図６は、破骨細胞形成に関与するシグナル分子に対するＩＦＮ−βの効果を解析した結果を示す写真である。
ａ，ＲＡＮＫＬで誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対するＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）処理の効果（ＥＭＳＡ）。複合体は、抗Ｒｅｌ Ａ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）によりスーパーシフトが起こり（７レーン目）、過剰量の非標識プローブにより複合体形成が阻害された（８レーン目）。
ｂ，ＲＡＮＫＬで誘導したＪＮＫおよびｃ−Ｊｕｎのリン酸化に対して、ＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）処理は効果を持たないことを示す。抗リン酸化ＪＮＫ抗体または抗リン酸化ｃ−Ｊｕｎ抗体でイムノブロッティングを行った。
ｃ，ＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する下流のエフェクター分子の蛋白質レベルに対するＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）の効果。
図７は、破骨細胞形成時におけるＡＰ−１の様々な成分の発現レベルを解析した結果を示す写真である。
ａ，ＡＰ−１成分のｍＲＮＡ発現に対するＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）の効果（ＲＮＡプロテクションアッセイ）。ｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡはＩＦＮ−βにより変化しなかったが、Ｆｒａ−１およびＦｒａ−２のｍＲＮＡレベルはＩＦＮ−β存在下で顕著に低下した。
ｂ，半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＦｒａ−１ ｍＲＮＡの発現解析。Ｆｒａ−１ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは半定量的ＲＴ−ＰＣＲによっても確認された。
ｃ，Ｆｒａ−１およびＦｒａ−２蛋白質のイムノブロット解析により、両蛋白質はＩＦＮ−βによりダウンレギュレートされることが判明した。
図８は、ＩＦＮ−βによるＲＡＮＫＬシグナル伝達の阻害が、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質発現の抑制を介していることを示す図および写真である。
ａ，ＩＦＮ−βによるｃ−Ｆｏｓ蛋白質合成の阻害を示す。
ｂ，ＰＫＲ^−／−マウス由来のＢＭＭからの破骨細胞形成におけるＩＦＮ−βの効果を示す。
図９は、ＩＦＮ−βによる破骨細胞形成阻害に及ぼすＦｏｓ蛋白質の過剰発現の効果を示す図および写真である。レトロウイルスによるｃ−Ｆｏｓ、Ｆｒａ−１、およびＦｒａ−２の過剰発現は、ＩＦＮ−βによる破骨細胞形成阻害をレスキューすることが示されている。レトロウイルスベクターを感染して２日後に、ＢＭＭｓをＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−β（１０Ｕ／ｍｌ）で刺激し、さらに３日間培養した。コントロールウイルスを感染させたＢＭＭｓでは、ＴＲＡＰ^＋ＭＮＣｓは形成しなかったが、ｃ−Ｆｏｓ発現ウイルスを感染させた場合はＴＲＡＰ^＋ＭＮＣ形成が約２０％に回復した。Ｆｒａ−１およびＦｒａ−２ウイルスの場合も同程度にＴＲＡＰ^＋ＭＮＣ形成がレスキューされたが、ｃ−Ｊｕｎウイルスではレスキューされなかった。
図１０は、ＩＦＮ−βによる破骨細胞形成阻害に及ぼすＦｏｓ蛋白質の過剰発現の効果を示す図および写真である。コントロールウイルスベクター（ｐＢａｂｅ−ＥＧＦＰ）、ｃ−Ｆｏｓ発現ウイルスベクター（ｐＢａｂｅ−ｃ−Ｆｏｓ）、またはｃ−Ｊｕｎ発現ウイルスベクター（ｐＢａｂｅ−ｃ−Ｊｕｎ）を感染させたＢＭＭの破骨細胞形成をｐｉｔ吸収によりアッセイした。また、ウイルスを感染させた細胞におけるＴＲＡＰ^＋細胞形成におけるレスキュー活性を、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクター系を用いることにより、ｃ−Ｆｏｓと共発現するＥＧＦＰを発現する細胞中のＴＲＡＰ^＋細胞を計数することにより決定した。ＩＦＮ−β（１０Ｕ／ｍｌ）の存在下でも、ｃ−Ｆｏｓ発現ウイルスが感染した細胞のうち５０％を超える細胞がＴＲＡＰ^＋となったが、同じ条件下でコントロールウイルスまたはｃ−Ｊｕｎ発現ウイルスを感染させた細胞でＴＲＡＰ陽性となったのは５％に満たなかった。
図１１は、ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−β遺伝子のｃ−Ｆｏｓ依存的な誘導を示す図および写真である。
ａ，ＲＡＮＫＬによるＩＦＮ−β ｍＲＮＡの誘導（ＲＴ−ＰＣＲ）。阻害はＩＲＦ−３／ＩＲＦ−９^−／−マウス由来のＢＭＭでは観察されたが、Ｆｏｓ^−／−マウス由来の破骨細胞前駆細胞では観察されなかった。
ｂ，ＲＡＮＫＬおよびｃ−ＦｏｓによるＩＦＮ−βプロモーターの活性化。ルシフェラーゼ活性の誘導をグラフに示した。ＩＦＮ−βプロモーター中のＡＰ−１、ＩＲＦ、およびＮＦ−κＢの結合部位の位置、およびＡＰ−１部位の配列も図示した。これらの結合配列は、ヒトおよびマウスのＩＦＮ−βプロモーターにおいて全て保存されている（Ｗａｔｈｅｌｅｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １，５０７−５１８（１９９８）；Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３，５３９−５４８（２０００）；Ｂｏｎｎｅｆｏｙ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，２８０３−２８１６（１９９９））。
図１２は、炎症で誘導される骨破壊におけるＩＦＮ−βの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）投与の治療効果を示す図および写真である。生理食塩水（コントロール）またはＬＰＳを注入、ＩＦＮ−β処理または未処理の頭蓋骨の組織学的解析を示す（ＴＲＡＰ染色およびヘマトキシリン染色）。骨形態計測学的解析により、ＬＰＳにより誘導される髄腔（ｍａｒｒｏｗ ｃａｖｉｔｙ）、ＴＲＡＰ^＋ ＭＮＣ数、および侵食表面の増加は、続く４日間のＩＦＮ−β（１００００Ｕ／ｄａｙ）の局所投与により有意に抑制されることが判明した。
図１３は、ヒト破骨細胞形成におけるＩＦＮ−βの効果を示す図である。ａ，ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦで刺激したヒト末梢血単核細胞からの破骨細胞形成における組み換えヒトＩＦＮ−βの効果。ｂ，慢性関節リウマチ患者由来の培養滑膜細胞からの破骨細胞形成における組み換えヒトＩＦＮ−βの効果。

Claims (7)

1. （ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞にＲＡＮＫＬとＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βとを接触させる工程、
   （ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性、または（３）骨吸収を検出する工程、を含む、該化合物のそれぞれ該（１）破骨細胞形成、（２）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性、または（３）骨吸収を促進または抑制する活性を検出する方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、工程（ｂ）においてｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性を検出する、該化合物のｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性を促進または抑制する活性を検出する方法。
3. 化合物の破骨細胞形成または骨吸収を促進または抑制する活性を検出するための、請求項２に記載の方法であって、該蛋白質レベルまたは該転写活性化活性の上昇を該抑制作用、該蛋白質レベルまたは該転写活性化活性の低下を該促進作用の指標とする方法。
4. （ａ）被検化合物を含む試料の存在下で、破骨細胞前駆細胞にＲＡＮＫＬとＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βとを接触させる工程、
   （ｂ）（１）破骨細胞形成、（２）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性、または（３）骨吸収を検出する工程、
   （ｃ）対照の条件下に比べ、それぞれ該（１）破骨細胞形成、（２）ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性、または（３）骨吸収を調節する化合物を選択する工程、を含む該化合物の選択方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、工程（ｂ）においてｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性を検出する、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質レベルもしくはその転写活性化活性を調節する化合物の選択方法。
6. 破骨細胞形成または骨吸収を調節する化合物をスクリーニングするための、請求項５に記載の方法であって、該蛋白質レベルまたは該転写活性化活性を上昇させる化合物を、破骨細胞形成または骨吸収を抑制する化合物として、該蛋白質レベルまたは該転写活性化活性を低下させる化合物を、破骨細胞形成または骨吸収を促進する化合物として選択する方法。
7. 破骨細胞前駆細胞にＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを接触させる工程を、下記（ａ）または（ｂ）に記載の工程により行う、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
   （ａ）ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの投与
   （ｂ）ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを発現するベクターの投与

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