JP4027669B2

JP4027669B2 - 生体分子を固定化するための粘着性シート

Info

Publication number: JP4027669B2
Application number: JP2002005829A
Authority: JP
Inventors: 政次小笠原
Original assignee: Toyo B Net Co Ltd
Current assignee: Toyo B Net Co Ltd
Priority date: 2002-01-15
Filing date: 2002-01-15
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2022-01-15
Also published as: JP2003207510A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNAなどの生体分子を固定化するための粘着性シートに関する。この粘着性シートを用いてDNAチップ等を作製することができる。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイ法とは、多数のDNAプローブを高密度に固定したスライドガラス（DNAチップ）を作製し、そのプローブDNAと蛍光標識したDNAをハイブリダイズさせ、各々のプローブからの蛍光をスキャナで読取ることにより、DNAの検出、解析を行う方法である。この方法は、数多くの遺伝子を同時にかつ迅速に解析できることから近年非常に注目されている技術である。
【０００３】
しかし、この方法にも幾つかの問題点が存在する。例えば、スライドガラス上にDNAを固定するためには、poly-L-lysine法、シリルコート法(sililated)、シランコート法(silanated)などにより、ガラス表面をDNAと親和性の高い分子でコーティングする必要があるが、このようなコーティング処理が施されたスライドガラスは、研磨したガラスを使用したり、コーティング作業が難しいなどの理由により、一般に高価である。また、DNAの検出及び解析は、スライドガラス上のDNAから発せられる蛍光をスキャナで読み取ることにより行うが、マイクロアレイ法に用いられるスライドガラスの仕様が必ずしも統一されていないため、使用しているスキャナの仕様に適合したスライドガラスを入手しなければならないということも高価になる一因である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような従来のマイクロアレイ法が抱えていた問題点を解決し、安価で任意のスキャナに容易に適用可能なDNAチップ等を提供することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、DNAチップの分野では全く注目されていなかった粘着シートに関する技術を応用することにより、安価で任意のスキャナに適用可能なDNAチップを作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｃ）を有することを特徴とする生体分子を固定化するための粘着性シートである。
【０００６】
（Ａ）シート状基材
（Ｂ）シート状基材の一方の面に積層されている粘着剤層
（Ｃ）シート状基材の他方の面に積層されており、一般式（Ｉ）：
【化２】

（式中、Ｒ'は炭素数１〜４のアルキレン基を表し、Ｒ''は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ'''は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｘは水素またはアミノアルキル基〔アルキル基の炭素数1〜４〕を表し、ｎは０または１を表す。）
で表されるアミノ・アルキル・アルコキシ・シランと、これとの反応によりゲル化することのない皮膜形成用樹脂とを含有する溶液の塗布によって形成される樹脂層
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の粘着性シートは、生体分子を固定化するためのものであり、少なくとも、（Ａ）シート状基材（図中の記号２）、（Ｂ）シート状基材の一方の面に積層されている粘着剤層（図中の記号３）、及び（Ｃ）シート状基材の他方の面に積層されており、アミノ・アルキル・アルコキシ・シランと、これとの反応によりゲル化することのない皮膜形成用樹脂とを含有する溶液の塗布によって形成される樹脂層（図中の記号１）を有することを特徴とするものである。
【０００８】
従来のDNA等の固定化基材、例えば、コーティング処理されたスライドガラスなどは、基板部分（スライドガラス）と固定化部分（コーティング層）が一体不可分な構成になっているため、基板部分がスキャナの仕様に適合していなければ使用できないことになる。一方、本発明の粘着性シートは、基板部分（スライドガラス）と固定化部分（本発明の粘着性シート）を分離させるという発想に基づくものであり、基板部分を任意に選択でき、自己の所持するスキャナの仕様に適合したDNA等の固定化基材を作製できるという利点がある。
【０００９】
本発明の粘着性シートは、上述の（Ａ）〜（Ｃ）を有するものであるが、これ以外の構造物を含んでもよい。例えば、粘着剤層を露出させないために、これを覆う剥離材（図中の記号４）を有してもよい。本発明の粘着性シートをスライドガラス等の基材プレート（図中の記号６）に貼り付ける際には、この剥離材は除去する。剥離材としては、離型用シリコン樹脂をコーティングした紙もしくは延伸ポリプロピレンやポリエチレン・テレ・フタレート（ＰＥＴ）フィルムなど、いわゆるプラスチックフィルムやシートを用いることができる。
【００１０】
粘着性シートに固定化する生体分子は、主にDNA及びタンパク質などであるが、樹脂層に固定され得るものであればどのようなものでもよい。
【００１１】
シート状基材としては、ポリエチレン・テレ・フタレート（ＰＥＴ）、コロナ放電等で表面処理されたポリオレフィン（ＰＥ，ＰＰなど）、ポリアミド（６ナイロン、66ナイロンなど）、ポリカーボネート、アセテート、あるいはポリアクリル、ポリスチレン、ポリブタジエンの単独もしくはこれらを共重合して得られる樹脂（ＭＭＡ、ＡＢＳなど）などからなるフィルムやシートを使用することができる。また、これら以外のフィルム等でも、上述の粘着剤層や樹脂層を積層可能なものであれば使用することができる。シート状基材の厚さは特に制限されないが、１０〜１００μm程度が好適である。
【００１２】
シート状基材は、その全部又は一部が特定波長の光を選択的に吸収する機能を有するものであってもよい。このような機能は、シート状基材の粘着剤層側の面を着色又はコーティングすることにより付与できる（図２、図中の５が特定波長の光線選択吸収層）。また、シート状基材の原料樹脂に色素等の物質を練り込んでおくことによっても、このような機能を付与できる。特定波長の光を選択的に吸収する機能を付与することによって、蛍光発色のコントラストを強調することができる。但し、金属蒸着又は白色の着色をした場合には、DNA等を蛍光させるために照射するレーザ光の散乱や反射が起こり、適切な蛍光分析ができない場合があるので、光を吸収する処理剤としては黒色、あるいは蛍光色と補色関係にある色相、例えば緑色や青色などで着色することが望ましい。
【００１３】
粘着剤層は、粘着剤をシート状基材表面に塗布することにより形成させることができる。粘着剤の塗布は、例えば、コンマコーター、グラビアコーター、ロールコーター、カーテンフローコーターなどによって行うことができる。粘着剤としては、シート状基材に粘着層を形成させ得るものであればどのようなものでもよく、例えば、天然ゴム系粘着剤、アクリル系粘着剤、熱可塑性ウレタン系粘着剤、シリコン系粘着剤などを使用することができる。これらの粘着剤の中でも耐寒、耐薬品性の観点から熱可塑性ウレタン系粘着剤やシリコン系粘着剤を使用するのが好ましい。粘着剤層の厚さは特に制限されないが、１０〜１００μm程度が好適である。
【００１４】
樹脂層は、アミノ・アルキル・アルコキシ・シランと皮膜形成用樹脂とを含む有機溶剤溶液（ワニス）をシート状基材に塗布することにより形成させることができる。ワニスの塗布は、例えば、ロールコート、グラビアコート、カーテンフローコート、マイヤーバーコート、ナイフコートによって行うことができる。これらの方法の中でも、仕上がり表面の平滑性、均一性、汚染防止等の観点から、カーテンフローコートを用いるのが好ましい。樹脂層の厚さは特に制限されないが、１〜５μm程度が好適である。ワニス中の各成分の比率は特に制限されないが、皮膜形成用樹脂：アミノ・アルキル・アルコキシ・シラン＝90部：10部
程度が適当である。また、皮膜形成用樹脂成分と有機溶剤の比率は、目的とする塗布量とコーティングする機械の作業適正に応じて適宜選択される。
【００１５】
樹脂層形成に用いるアミノ・アルキル・アルコキシ・シランは、下記の一般式（Ｉ）：
【化３】

で表すことができる。ここで、Ｒ'は炭素数１〜４のアルキレン基を表し、Ｒ''は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ'''は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｘは水素またはアミノアルキル基〔アルキル基の炭素数1〜４〕を表し、ｎは０または１を表す。
【００１６】
アミノ・アルキル・アルコキシ・シランは上記の一般式（Ｉ）で表されるものであればどれを用いてもよいが、ｎが１のものは反応が遅く、十分な接着性を発揮するまでに時間がかかるか、未反応部分がべとついてブロッキングの原因になるので、ｎが０のものを使用するのが好ましい。本発明に使用可能なアミノ・アルキル・アルコキシ・シランの具体例を下表に示す。
【表１】

【００１７】
皮膜形成樹脂にこのアミノ・アルキル・アルコキシ・シランを添加することにより、シート状基材と樹脂層の接着性を改善することができる。即ち、基材シートの表面は、溶解度パラメーターが各々異なる関係上、皮膜形成樹脂だけを含むワニスを塗布しても、接着するとは限らない。そのため、良好な接着が得られなければ、DANチップ等の解析の際に行われる洗浄、ブロッキング、ハイブリダイゼーション等の操作のとき、樹脂層が剥落してしまう危険性がある。本発明は皮膜形成樹脂にアミノ・アルキル・アルコキシ・シランを配することにより、樹脂層とシート状基材との強固な接着を得ている。
【００１８】
樹脂層形成に用いる皮膜形成用樹脂は、アミノ・アルキル・アルコキシ・シランとの反応によりゲル化することのないものであればどのようなものでもよい。具体的には、塩化ビニル／酢酸ビニルの共重合体、ポリ・ビニル・ブチラール樹脂、熱可塑性ポリエステル樹脂、ポリ・メチル・メタアクリレート樹脂、セルロース誘導体、ケトン樹脂、環化ゴム、ポリ・ビニル・ブチル・エーテル樹脂、ポリアミド樹脂、熱可塑性ウレタン樹脂などを例示することができる。
【００１９】
【実施例】
〔試験例１〕
皮膜形成用樹脂（4.0部）、アミノシラン（信越化学社・KBM-603）（0.5部）、有機溶剤（95.5部）からなるワニス（アミノシラン含有ワニス）を調製した。使用した皮膜形成用樹脂及び有機溶剤を表２に示す。
【表２】

【００２０】
このワニスをコロナ放電処理した50μmの厚さの延伸ポリプロピレンフィルムに、30μmの版深によるグラビアコーターを使用して塗布し、形成される樹脂層の接着性を調べた。接着性は、コーティングされた面に18ｍｍ幅のセロテープを貼り付け、60度角で急激に剥がし、フィルム面から樹脂層が剥がれる面積を５段階表示した。また、比較のため、樹脂（4.0部）と有機溶剤（96.0部）とからなるワニス（アミノシラン非含有ワニス）も調製し、同様に樹脂層の接着性を調べた。結果を表３に示した。
【表３】

【００２１】
表３に示すように、ほとんどすべての樹脂において、アミノシランを含有するワニスの方が高い接着性を示した。
【００２２】
〔実施例１〕
表４に示す配合のコーティング液を作製し、厚さ25μmの延伸ポリエチレンテレフタレートフィルムに＃８マイヤーバーで塗布し、10秒間80℃熱風乾燥後その塗布フィルム片をスライドガラスにテープで固定し、マイクロアレーヤーピンによるスタンピングによってDNAチップを作製し、プローブDNAとのハイブリダイゼーションを行った後純水にて洗浄、スキャン解析を行った。
【００２３】
コーティング液によって形成された樹脂層は一連の操作段階で剥がれ落ちることはなかった。また、バックグランドの汚染も支障を生じることなく、高精度の解析が可能であった
【表４】

【００２４】
〔実施例２〕
表５に示す配合のコーティング液を作製し、30μmのトリアセテートフィルムに、版深30μｍのグラビアシリンダーを用いて塗布し、100℃、2秒の熱風乾燥オーブンを通過させて巻き取った。このコーティングされたフィルムの裏面に、熱可塑性ウレタン系粘着剤（東洋インキ社・サイアバインSP205）を、コンマドクターにより約20ｇ／ｍ^２（dry）になるよう固形分とドクター・スリットを調節してコーティングを行い、熱風乾燥後ポリエステルフィルムのセパレーターと張り合わせ、目的のコーティングされたフィルムを得た。このフィルムを適当な大きさに切り取り、離型フィルム（セパレーター）を剥がしてプラスティック製スライド板に添付し、以下実施例１と同じ操作でDNAチップを作製し、プローブDNAとのハイブリダイゼーションを行った後、純水にて洗浄、スキャン解析を行った。
【００２５】
コーティング液によって形成された樹脂層は一連の操作段階で剥がれ落ちることはなかった。また、バックグランドの汚染も支障を生じることなく、高精度の解析が可能であった。更に、試料用DNAチップはマイナス50℃での保管状態でも、初期の特性が損なわれず、良好な分析結果を得た。
【表５】

【００２６】
なお、実施例２で作製された粘着性シート及び基材プレートの構成は次のようになる。
【表６】

【００２７】
〔実施例３〕
実施例２と同様、表５に示す配合のコーティング液を作製し、フィルムの両面をコロナ放電処理した30μmの厚さの２軸延伸ポリプロピレンフィルムの一方に、塗布量が0.5g／ｍ^２（dry）となるよう調製したカーテンフローコーターでコーティングし、熱風乾燥後巻き取った。このコーティングされたフィルムの裏面に、ブラック（黒）インキ（東洋インキ社・New LP スーパーR92A墨）をグラビア印刷した後、ブラック印刷された面に水性アクリルエマルジョン系粘着剤（東洋インキ社・オリバインBPW4792）を、コンマドクターにより約20ｇ／ｍ^２（dry）になるよう固形分とドクター・スリットを調節してコーティングを行い、熱風乾燥後セパレーターと張り合わせ、目的のコーティングされたフィルムを得た。このフィルムを適当な大きさに切り取り、離型フィルム（セパレーター）を剥がしてプラスティック製スライド板に添付し、以下実施例１と同じ操作でDNAチップを作製し、プローブDNAとのハイブリダイゼーションを行った後純水にて洗浄、スキャン解析を行った。
【００２８】
コーティング液によって形成された樹脂層は一連の操作段階で剥がれ落ちることはなかった。また、バックグランドの汚染も支障を生じることなく、高精度の解析が可能であった。更に、レーザー光線を吸収するブラックインキ層を一層入れることで、蛍光発色のコントラストを強調できる可能性があることが見出された。
【００２９】
なお、実施例３で作製された粘着性シート及び基材プレートの構成は次のようになる。
【表７】

【００３０】
【発明の効果】
本発明は、生体分子を固定化するための新規な粘着性シートを提供する。本発明の粘着性シートを利用することにより、任意のスキャナに適用可能なDNAチップ等を容易にかつ低コストで作製できるようになる。
【００３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の粘着性シート（特定波長の光を選択的に吸収する機能が付与されていないタイプ）の構造を示す図である。
【図２】本発明の粘着性シート（特定波長の光を選択的に吸収する機能が付与されているタイプ）の構造を示す図である。
【図３】基材プレートには貼り付けられた本発明の粘着性シートの構造を示す図である。
【符号の説明】
１：樹脂層
２：シート状基材
３：粘着剤層
４：剥離材
５：特定波長の光線選択吸収層
６：基材プレート

Claims

少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｄ）を有することを特徴とする生体分子を固定化するための粘着性シート。
（Ａ）シート状基材
（Ｂ）シート状基材の一方の面に積層されている粘着剤層
（Ｃ）シート状基材の他方の面に積層されており、一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ'は炭素数１〜４のアルキレン基を表し、Ｒ''は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ'''は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｘは水素またはアミノアルキル基〔アルキル基の炭素数1〜４〕を表し、ｎは０または１を表す。）
で表されるアミノ・アルキル・アルコキシ・シランと、これとの反応によりゲル化することのない皮膜形成用樹脂とを含有する溶液の塗布によって形成される樹脂層
（Ｄ）粘着剤層を覆う剥離材
シート状基材の全部又は一部が、特定波長の光を選択的に吸収する機能を有することを特徴とする請求項１記載の生体分子を固定化するための粘着性シート。
粘着剤として、アクリル系、熱可塑性ウレタン系又はシリコン系粘着剤のいずれかを使用することを特徴とする請求項１又は２記載の生体分子を固定化するための粘着性シート。