CN102027376B - 微量分析芯片粘合片、微量分析芯片及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有粘合表面的微量分析芯片粘合片，所述粘合片可以低成本且在较低温度容易地粘结于衬底，利用所述粘合片可以简化分析芯片的制造，并且所述粘合片具有将选择性粘结物质固定于所述片表面的能力。所述微量分析芯片的特征在于，微量分析芯片粘合片与表面具有凹部和凸部的衬底粘结在一起，使得所述具有凸部和凹部的衬底的表面与上述微量分析芯片粘合片的粘合剂层处于内侧，其中，所述微量分析芯片粘合片包含设置有由粘合剂形成的粘合剂层的塑料片，所述粘合剂含有下述聚合物，其中含有羧基或酸酐基的单体结构单元构成所述聚合物中[总]单体结构单元的5重量％～25重量％。所述衬底与上述微量分析芯片粘合片的粘合剂层之间的衬底凹部处的空隙形成流路，所述流路的一部分是上述粘合剂层，并且选择性粘结物质固定于所述粘合剂层表面上。

Description

微量分析芯片粘合片、微量分析芯片及其制造方法
技术领域
本发明涉及用于分析极其微量的组分的微量分析芯片，和制造所述微量分析芯片的方法。
背景技术
近来，人们已经关注作为具有固定于固相衬底的生物活性物质的装置的生物芯片，其是药物发现研究或临床研究中实现高通量操作的工具。固定的生物活性物质的典型实例包括核酸、蛋白质、抗体、糖链、糖蛋白和适体(aptamer)。特别是，核酸微阵列的许多商品(其为具有固定的核酸的生物芯片)已经可从市场获得。所述芯片为具有在平坦的衬底上定位或固定的各种生物活性物质的形式，此类型主要用于研究机构的研究和分析。
更近一些时期，对于利用称作微量分析芯片、μTAS(微型全分析***)或芯片实验室(lab on chip)的微加工技术的分析***的化学反应或分离或微小型化已经进行了活跃的研究，并且已经可以关于微通道(微细流路)进行各种化学反应，特别是生理反应。所述***能够迅速分析痕量样品，因此利用这一特征的下一代生物芯片、特别是医疗机构中的诊断芯片的商业化备受期待和关注。(下文中，这些***被统称为微量分析芯片。)
目前，普通生物芯片或微量分析芯片都是玻璃制成的芯片。为制造具有玻璃衬底的微量分析芯片，存在例如下述方法，根据所述方法，衬底涂布有金属和光刻胶树脂并在传递微通道图案后进行蚀刻。但是，玻璃不适合大规模生产，成本也很高，因此需要实现从玻璃到塑料的转换。
塑料制成的生物芯片或微量分析芯片可以使用不同的塑料材料通过如注射成型等各种成型方法生产。在注射成型中，将熔融的热塑性材料引入模腔，并冷却该腔以使树脂***，由此可以有效且经济地生产芯片衬底。因此，塑料生物芯片和微量分析芯片适于大规模生产。然而，这些塑料生物芯片和微量分析芯片在技术上仍具有许多缺点，并且仍未获得用塑料芯片代替玻璃制成的芯片的充分的技术诀窍。具体而言，不仅塑料生物芯片和微量分析芯片而且玻璃生物芯片和微量分析芯片(生物芯片和微量分析芯片统称为微流体，其体征为在芯片内部设置有微细流路)仍具有许多缺陷，它们还处在开发阶段。特别是，塑料微量分析芯片的一个问题(其中，需要将不同的塑料板粘结在具有微细流路的塑料板上从而覆盖所述流路)在于尚未发现用于粘结的便宜、简单且可靠的***。这是妨碍塑料微量分析芯片的实际应用的重要因素之一。
在制造塑料生物芯片或微量分析芯片的粘结步骤中，主要采取利用通过使用热、超声波或激光而热粘结的***，或者使用有机粘合剂的***(专利文献1)。通过加热而融合倾向于引起生物活性物质因加热而发生下文中所述的失活的问题。在利用抗原-抗体反应的免疫分析中，可以知道样品中拟分析的痕量物质的存在，并且通过利用热透镜显微镜或其它工具进行测量可以知道其浓度。然而，加热倾向于引起微细流路内部变形或者流路表面的表面质量劣化，使得在一些情况下难以进行测量。在通过超声波热粘结的情况下，虽然可以粘结若干平方毫米的面积，但是该方法不适于热粘结若干平方厘米的面积，并倾向于造成不充分粘结。在激光照射的情况下，虽然在照射面积方面不存在问题，但是仅加热塑料的中心部分(例如两个塑料片的粘结区域等)极其困难。该方法也涉及装置的成本较高的问题。
使用有机粘合剂的粘结方法非常有效，因为其能够在较低温度将塑料片粘结在一起。然而，在由例如注射成型获得的塑料片中，由于成型过程中的缩痕或其它原因，在通常应该保持平坦的部分形成有几μm～几十μm左右的凹部和凸部，因此需要修补这些凹部和凸部以使用粘合剂将塑料片良好地彼此粘结在一起。为达到此目的，需要数十μm左右的粘合剂厚度。当使用厚度为10μm左右的粘合剂进行粘结时，会倾向于在衬底之间渗出多余的粘合剂，这容易导致微通道堵塞或内壁受污染。特别是，当使用热固型粘合剂粘结时，倾向于像在热粘结***的情况下那样引起生物活性物质失活的问题。此外，还存在在热透镜显微镜方法中妨碍测量的可能性。
关于塑料产品的粘结(不限于生物芯片和微量分析芯片)，存在不同于上述***的***的提议，其中，在拟粘结的物体的部分粘结表面上设置突出体，并将其配合在拟结合的另一区域中，并且通过超声振动热熔合该部分(专利文献2)。但是，该***的使用只限于不是如此精细的相对较大的成型产品，具有精细结构的生物芯片和微量分析芯片不包括在该***的应用范围内。
此外，当考虑应用于分析芯片、特别是生物芯片时，许多时候不同类型的物质、特别是核酸、蛋白质、抗体、糖链、糖蛋白或适体涂覆或固定在检测位置。这些生物活性物质对热敏感，受热时容易化学失活，因此涉及应用高温的粘结方法不适合用于生物芯片和微量分析芯片的制造。
作为提供能够在较低温度低成本、容易、牢固且安全地粘结于衬底上的塑料微量分析芯片的方法，已经提出过下述方法，其中，利用在具有微细流路的表面侧上引入紫外线固化粘合剂将在表面上具有微细流路的塑料衬底和塑料膜粘结起来(专利文献3)。然而，专利文献3对于将选择性粘结物质固定在覆盖件的内表面上的具体方法却完全没有提及。
在这些微量分析芯片中，不但制造工艺的简化，而且定量质量、分析精度和经济实惠都很重要。微量分析芯片中包装的样品通常量非常少，因此许多时候，成为分析对象的物质是以痕量存在的。微量分析芯片需要在技术上处理这种情况，使其能够在实现高精度的高灵敏度下分析痕量物质。
对于检测灵敏度的改善具有重大影响的因素之一是选择性粘结物质在微细流路上的固定效率，即，将选择性粘结物质固定在微细流路上的能力。当不仅可以固定于形成微细流路的衬底上还可以固定于覆膜的内表面上的选择性结合衬底的量很小时，分析的灵敏度显然受到妨碍。
引文列表
专利文献
专利文献1：日本专利特开2002-139419号公报
专利文献2：日本专利特开平5-16241号公报
专利文献3：日本专利特开2007-240461号公报
发明内容
技术问题
鉴于上述情况做出的本发明旨在提供一种微量分析芯片，所述微量分析芯片通过使用作为微量分析芯片衬底或经涂布的衬底的粘合片可以低成本且在较低温度下容易地得到提供，所述粘合片的片表面具有粘合性并且可以将选择性粘结物质固定在所述片表面上，本发明还旨在提供一种能够迅速处理和高精度检测的微量分析芯片。
问题的解决方案
作为为解决上述问题所进行的深入研究的结果，本发明人已经发现，可以获得微量分析芯片及其粘合片，所述粘合片能够在较低温度下以满意的粘结强度迅速粘结而不引起微细流路的堵塞，并具有将选择性粘结物质固定在粘合剂层表面的能力。这可以通过下述方式实现：利用粘合剂将表面上具有充当微细流路的凹部和凸部的衬底与充当覆盖衬底的表面上具有粘合剂层的塑料片粘结。已经确认，通过利用上述技术制造的生物芯片或微量分析芯片是可以获得的，本发明由此而实现。
因此，本发明提供：
(1)一种微量分析芯片粘合片，所述粘合片包含具有由交联性粘合剂形成的粘合剂层的塑料片，所述交联性粘合剂含有下述聚合物，其中含有羧基或酸酐基的单体结构单元构成所述聚合物中总单体结构单元的5重量％～25重量％；
(2)如(1)所述的微量分析芯片粘合片，其中，选择性粘结物质被固定在所述粘合剂层的表面；
(3)如(2)所述的微量分析芯片粘合片，其中，所述选择性粘结物质通过所述粘合剂层表面上的羧基或酸酐基与所述选择性粘结物质的官能团的结合而固定；
(4)如(2)或(3)所述的微量分析芯片粘合片，其中，所述选择性粘结物质为核酸、蛋白质、肽、糖类和脂质中的任一种；
(5)如(1)～(4)中的任一项所述的微量分析芯片粘合片，其中，所述塑料片由聚酯、纤维素衍生物和聚碳酸酯中的任一种制成；
(6)一种微量分析芯片，所述微量分析芯片通过将表面上具有凹部和凸部的衬底与(1)～(5)中的任一项所述的微量分析芯片粘合片粘结在一起，使得所述衬底的具有凹部和凸部的表面与所述粘合片的粘合剂层置于内侧而制备；
(7)如(6)所述的微量分析芯片，其中，在所述粘合剂层与所述衬底之间形成空隙；
(8)如(6)或(7)所述的微量分析芯片，其中，所述表面上具有凹部和凸部的衬底由塑料制成；
(9)一种制造(6)～(8)中的任一项所述的微量分析芯片的方法，所述方法包括以下步骤：在塑料片上涂布粘合剂；辊层压所述涂布有粘合剂的塑料片和表面上具有凹部和凸部的衬底，使得所述衬底的具有凹部和凸部的表面和所述粘合剂置于内侧；和
(10)一种制造(6)～(8)中的任一项所述的微量分析芯片的方法，所述方法包括以下步骤：在塑料片上涂布粘合剂以形成粘合剂层；将选择性粘结物质固定在所述粘合剂层的表面上；和辊层压具有其上固定有选择性粘结物质的粘合剂层的所述塑料片和表面上具有凹部和凸部的衬底，使得所述衬底的具有凹部和凸部的表面和所述粘合剂层置于内侧。
发明效果
本发明的微量分析芯片粘合片的特征在于，所述片表面具有粘合性，和所述片具有将选择性粘结物质固定在所述片表面上的能力。所述产品适合用作微量分析芯片用覆盖片。通过使用本发明的微量分析芯片粘合片，可以容易地以低成本在较低温度下提供微量分析芯片，所述芯片能够迅速处理和高精度检测。
具体实施方式
下面将参考实施方式更加详细地描述本发明。
本发明涉及一种微量分析芯片粘合片，所述粘合片具有设置有由粘合剂形成的粘合剂层的塑料片，所述粘合剂含有下述聚合物，其中含有羧基或酸酐基的单体结构单元构成所述聚合物中总单体结构单元的5重量％～25重量％；还涉及一种微量分析芯片；及其制造方法。本发明的主要目标是具有微细流路的微量分析芯片。本发明中的“微细流路”是指为了流动如水和有机溶剂等液体物质而形成的微细的被覆盖的沟槽。所述流路优选具有1000μm以下的宽度和500μm以下的深度。
本发明中所使用的粘合剂是共聚物，其单体包括含有至少一个羧基或至少一个酸酐基的单体。所述共聚物优选为通过共聚作为不具有官能团的主要单体的乙烯基衍生物和含有至少一个羧基或至少一个酸酐基的单体而获得的共聚物，更优选为主要含有丙烯酸类粘合剂的共聚物。丙烯酸类粘合剂是作为不具有官能团的主要单体的(甲基)丙烯酸烷基酯和(甲基)丙烯酸单体或不饱和多元酸的共聚物。(甲基)丙烯酸单体和不饱和多元酸充当使用交联剂时的反应位点或者选择性粘结物质的反应位点。
不具有官能团的(甲基)丙烯酸烷基酯的实例包括：丙烯酸烷基酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸戊酯、丙烯酸2-乙基己基酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸环己酯或丙烯酸苄酯，和甲基丙烯酸烷基酯，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸环己酯或甲基丙烯酸苄酯。可用在本发明中的其它乙烯基衍生单体包括乙酸乙烯酯、苯乙烯或丙烯腈。优选使用丙烯酸丁酯或丙烯酸2-乙基己基酯，特别是丙烯酸丁酯作为本发明中的乙烯基衍生单体。
含有至少一个羧基或至少一个酸酐基的单体的实例包括丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸、衣康酸、丙烯酸β-羧基乙酯、单丙烯酸ω-羧基-聚己酸内酯、邻苯二甲酸2-丙烯酰氧基乙酯、邻苯二甲酸2-丙烯酰氧基丙酯和六氢邻苯二甲酸2-丙烯酰氧基乙酯。丙烯酸或甲基丙烯酸优选用作含有至少一个羧基或至少一个酸酐基的单体。
优选这些材料的原因是其优异的粘结性和粘着力，并且所述聚合物中不存在不饱和键因而对于光和氧高度稳定，并且通过选择所述聚合物的种类和分子量可以根据使用目的获得任何质量和特性。
含有羧基或酸酐基的单体结构单元必须构成聚合物中总单体结构单元的5重量％～25重量％。该比例优选处于10重量％～20重量％范围内。如果所述比例低于5重量％，则官能团(羧基或酸酐基)的量降低，并且对选择性粘结物质的粘结量变得不足。如果上述比例高于25重量％，则在活化粘合片表面上的羧基的步骤中浸入缓冲液(pH 6～8)时，粘合剂层变得易于分离或溶解。因此，以上述指定范围内的单体结构单元比例，可以获得下述粘合剂层，所述粘合剂层即使在活化粘合片表面上的羧基的步骤中浸入缓冲液(pH 6～8)时也能抵抗分离或溶解，并且可保持足够量的表面羧基和对选择性粘结物质的足够的粘结量。
作为本发明中的粘合剂，使用的是交联型粘合剂。当粘合剂为交联型时，存在例如使用不同类型的交联剂的方法，所述交联剂例如为环氧化合物、异氰酸酯化合物、金属螯合化合物、金属醇盐、金属盐、胺化合物、肼化合物或醛化合物，和利用照射的方法。根据官能团的种类和其它因素正确选择这些方法。
粘合剂的聚合物的交联度随如粘合剂(粘合剂组合物)的种类和组成等各种条件而不同，并且不受特定限制，不过通常优选在10％～95％范围内，考虑到溶胶-凝胶过程部分更优选为15％～90％。如果交联度低于10％，则在活化粘合片表面上的羧基的步骤中浸入缓冲液(pH 6～8)时，粘合剂层变得易于分离或溶解。如果交联度高于95％，则形成粘合剂层用涂布液的粘度稳定性较差，这会导致操作性劣化，官能团(羧基)的量降低或对选择性粘结物质的粘结量不足。因此，通过将交联度保持在上述范围内，可以由此获得具有以下优点的粘合剂层。即，粘合剂层在活化粘合片表面上的羧基的步骤中浸入缓冲液(pH 6～8)时几乎不会分离或溶解。此外，操作性也良好，并且表面上的羧基的量充足，对选择性粘结物质的粘结量也充足。
如果需要，粘合剂可以含有增塑剂。作为增塑剂，可以单独使用如邻苯二甲酸酯、偏苯三酸酯、均苯酯、己二酸酯、癸二酸酯、磷酸三酯或乙二醇酯等酯类；加工油、液态聚醚、液态聚萜烯和其它液态树脂，也可以使用它们中的两种以上的混合物。增塑剂优选为与所使用的粘合剂具有良好相容性的增塑剂。
此外，除增塑剂外，粘合剂还可以包含各种添加剂，如紫外线吸收剂或抗氧化剂。
粘合剂涂布方法在本发明中并未指定；可以使用各种类型的涂布装置，如逗号涂布机、棒涂机、旋涂机、喷涂机、辊涂机、凹版涂布机和刮刀涂布机等。
粘合剂层厚度优选为1μm～50μm，更优选为1μm～10μm。如果粘合剂厚度低于上述范围的下限，则无法获得充分的粘合强度，并且在粘结过程中倾向于有气胞进入***中。如果粘合剂厚度超过上述范围的上限，则树脂倾向于在粘结过程中进入微细流路，引起流路堵塞。
作为本发明中的塑料片用基材的塑料是具有熔点和Tg的聚合物，例如为高密聚乙烯、低密聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、各种环形聚烯烃和如聚甲基丙烯酸甲酯等丙烯酸类树脂、聚降冰片烯、聚苯醚、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯、半固化酚醛树脂、半固化环氧树脂、各种类型的热塑性塑料和纤维素衍生物。本发明中对于所使用的聚合物的类型和如聚合度、熔点、Tg和弹性模量等其它性质未作具体规定，不过优选的是聚酯、如甲基丙烯酸甲酯等丙烯酸类树脂、聚苯乙烯、纤维素衍生物或聚碳酸酯，其中更优选聚酯、纤维素衍生物或聚碳酸酯等用作本发明中的聚合物。
在本发明中，“选择性粘结物质”是指能够直接或间接选择性地粘结于靶材料的各种材料。可粘结于衬底表面的选择性粘结物质的典型实例为核酸、蛋白质、肽、糖类或脂质。
核酸可以是DNA或RNA，也可以是PNA。具有特定碱基序列的单链核酸可以选择性地与具有与所述碱基序列或其部分互补的碱基序列的其他单链核酸杂交，由此使这些单链核酸落在本发明所指定的“选择性粘结物质”的范围内。
本发明中使用的核酸可以是衍生自如活细胞等天然产物的核酸，也可以是通过核酸合成器合成的核酸。可以使用常规方法由活细胞制备DNA或RNA。例如，对于DNA提取，Blin等的方法(Nucleic Acids Res.3：2303(1976))是可用的，对于RNA提取，Favaloro等的方法(MethodsEnzymol.65：718(1980))是有指导性的。此外，作为拟固定的核酸，可以使用链状或环状质粒DNA或染色体DNA，通过使用限制性内切酶或化学方式切割这些质粒DNA或染色体DNA而获得的DNA片段、在试管中酶促合成的DNA或RNA、或者化学合成的寡核苷酸。
作为蛋白质，可以使用抗体、如Fab或F(ab′)2片段等抗体的抗原粘结片段和各种抗原。抗体及其抗原结合片段选择性地粘结于相应的抗原，而抗原也选择性地结合于相应的抗体，因此，它们包含在“选择性粘结物质”的范畴内。
可用在本发明中的肽的实例包括如核糖体肽、非核糖体肽或消化肽等体内生成的肽，和合成肽。
可用在本发明中的糖类包括各种单糖和糖链，如低聚糖和多聚糖等。
脂质可以是单纯脂质或复合脂质。
也可以固定不同于上述核酸、蛋白质、肽、糖类或脂质的具有抗原性的物质。细胞也可以作为选择性粘结物质固定于衬底表面。
在这些选择性粘结物质中，特别优选用在本发明中的是DNA、RNA、蛋白质、肽、糖、糖链和脂质。
本发明中将拟固定的选择性粘结物质粘结于粘合表面的方法的实例包括已知的能够产生化学键的反应，如缩合反应、加成反应和取代反应，不过优选产生酰胺键或酯键的脱水性缩合反应或取代反应。特别是，优选由羧基和氨基形成酰胺键的脱水性缩合反应或由酸酐和氨基形成酰胺键的缩合反应。可以将普通的肽缩合反应用于脱水性缩合反应。作为用于上述反应的脱水性缩合剂，例如可以使用如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-二甲基氨基丙基-3-乙基碳二亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺等碳二亚胺类、如苯并***-1-基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐等鏻盐和叠氮化磷酸二苯酯。这些化合物中，优选1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。所述脱水性缩合剂的量相对于羧基为0.5摩尔当量～10摩尔当量，并优选为1摩尔当量～2摩尔当量。所述反应可在有添加剂存在或没有添加剂存在下进行。作为添加剂，可以使用N-羟基琥珀酸亚胺、1-羟基苯并***、4-硝基苯酚或五氟苯酚等。当使用添加剂时，其量优选为相对于羧基为约0.5摩尔当量～10摩尔当量，并优选为约1摩尔当量～2摩尔当量。
本发明的粘合片可以具有位于粘合剂层上的防粘片。可以使用例如聚酯膜作为防粘片。
以上述方式获得的粘合片可以根据需要进行风干。
本发明中使用的具有凹部和凸部的衬底可以由塑料、玻璃、硅、金属或陶瓷等制成。可用在本发明中的塑料材料包括高密聚乙烯、低密聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、各种类型的环形聚烯烃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚降冰片烯、聚苯醚、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酯、半固化酚醛树脂、半固化环氧树脂和各种类型的热塑性塑料。在这些材料中，优选的是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、环形聚烯烃或聚对苯二甲酸乙二醇酯，因为它们具有有利于观察和测量的良好的透明度。可用作本发明中的衬底材料的玻璃的种类包括石英玻璃、无碱玻璃、硼硅玻璃或钠钙(soda-lime)玻璃，其中石英玻璃和硼硅玻璃因具有良好的加工性而优选。可用于衬底的金属包括银、镍、铝合金、不锈钢、哈司特镍合金或钛。衬底可以由单一材料或者两种以上不同材料的组合制成。在后一种情况下，可将例如感光树脂涂布在玻璃或硅衬底上，并且选择性单独去除光照射部分或非照射部分，由此在玻璃或硅衬底上形成塑料的凸部或凹部。该方法不是唯一的可用方法。可以使用负性光刻胶或正性光刻胶作为感光树脂组合物，不过优选环氧树脂型负性光刻胶，因为它能够提供充分的膜厚并具有良好的加工性。所述负性光刻胶的典型实例为SU-8(由MicroChem Corporation制造)和SU-83000(由Kayaku MicroChemCorporation制造)。
作为基材，从加工性和利于观察的优点考虑，优选塑料或玻璃，不过最优选塑料，因为其对于微量分析芯片粘合片具有良好的粘合性。
可以通过如蚀刻、光刻、注射成型、热压、压印、模塑、电火花加工、切割、喷砂或立体光刻等方法形成微细凹部和凸部。如果需要，可以组合应用这些方法中的两种以上。凹部和凸部的形状通常为槽状、圆形或矩形孔状或柱状。所述槽等的侧壁的构造通常为垂直的，不过也可以采用锥形、倒锥形或弧形形状。关于凹部和凸部的尺寸，当其为槽时，通常为10μm～1,000μm深和10μm～1,000μm宽，当其为孔或柱状形状时，其圆的直径或矩形的一条边为10μm～1,000μm。凹部和凸部及其侧壁的形状和尺寸已经通过实例的显示在上文中，不过它们可以根据所采用的加工方法和产品的目标功能而明显地与此不同。此外，微量分析芯片通常被制作为各种形状和尺寸，因此以上对于形状和尺寸的描述不是限定性的。
在本发明中，具有凹部和凸部的衬底和微量分析芯片粘合片以使得具有凹部和凸部的衬底的表面和粘合片的粘合剂层置于内侧的方式彼此粘结。在此情况下，衬底的凹陷部分处的空隙构成了微量分析芯片功能部分(如流路、腔室和混合器等)。凸起的部分粘结于微量分析芯片粘合片的粘合剂层，以防止液体泄露或出现其它问题。凸起的部分优选高度一致，以增强对微量分析芯片粘合片的粘合性。
本发明中具有凹部和凸部的衬底和微量分析芯片粘合片的粘结在加热和压力下进行，其在大气压下或真空中使用辊或板。在该操作中，如果需要，可以将微量分析芯片粘合片和衬底之一或二者全部固定在夹具上。考虑到***的运行时间和微量分析芯片粘合片和基片的耐用性，优选将操作时的真空度限定在大气压～10Pa范围内，将加热温度限定在20℃～100℃范围内，并将压力限定在0.01MPa～10MPa范围内。
如上所述而形成的粘合片或微量分析芯片的羧基或酸酐基在使用时需活化。
本发明的微量分析芯片制造方法的特征在于，其能使粘结在较低温度下于较大区域牢固地形成而不造成污染，还在于本发明的产品因此而能够提供高性能的塑料生物芯片或微量分析芯片。特别是，其可以有利地应用于如微流体等已进行微细加工的产品中。特别是，值得注意的是其中生物活性物质被固定在芯片的表面或内部的产品组，如核酸芯片、蛋白质芯片、抗体芯片、适体芯片或糖蛋白芯片等。
实施例
下面将参考实施例具体描述本发明，但本发明不以任何方式受限于这些实施例。
使用聚酯膜作为衬底。通过使用以下组合物的粘合剂形成粘合剂层，以制备粘合片。
实施例1(粘合片制备1)
合成聚合物A的方法
将127.5g丙烯酸正丁酯和22.5g丙烯酸溶解在225g乙酸乙酯中，并向其中添加0.05g偶氮二异丁腈。将该混合物在90℃聚合6.5小时，以获得丙烯酸树脂共聚物(重均分子量：Mw＝800,000)(聚合物A)。使用乙酸乙酯和甲基乙基酮稀释该产物，以获得丙烯酸树脂共聚物(聚合物A)溶液，其固体比例为26.7％且粘度为6,500mPas。
将100重量份聚合物A溶液(丙烯酸丁酯/丙烯酸＝85/15)、0.02重量份环氧型交联剂Tetrad-X(由Mitsubishi Gas Chemical Company，Inc.制造)和570重量份甲基乙基酮均匀混合，使固体物质溶解在液体中。这样就制备了粘合剂组合物，再将其逗号涂布在聚酯膜(其一侧已经进行了易附着处理，A4100)(厚度：100μm)上并干燥，以形成粘合剂层(5μm厚)。使用作为防粘片的聚酯膜(其一侧使用有机硅处理过)(AL5，由LintecCorporation制造，厚度：38μm)覆盖该粘合剂层。将所获得的片在35℃风干7天，以制造粘合片。
实施例2(粘合片制备2)
以与实施例1相同的方式制备粘合片，不同之处在于，环氧型交联剂Tetrad-X(由Mitsubishi Gas Chemical Company，Inc.制造)的加入量为0.05重量份。
比较例1(粘合片制备3)
合成聚合物B的方法
将105g丙烯酸正丁酯和45g丙烯酸溶解在225g乙酸乙酯中，并向其中添加0.05g偶氮二异丁腈。将该混合物在90℃聚合6.5小时，以获得丙烯酸树脂共聚物(重均分子量：Mw＝700,000)(聚合物B)。使用乙酸乙酯和甲基乙基酮稀释该产物，以获得丙烯酸树脂共聚物(聚合物B)溶液，其固体比例为27.7％且粘度为57,000mPas。
以与实施例1相同的方式制备粘合片，不同之处在于，使用100重量份聚合物B溶液(重均分子量(Mw)＝700,000；固体比例：27.7％；粘度：57,000mPas)(丙烯酸丁酯/丙烯酸＝70/30)作为粘合剂组合物。
比较例2(粘合片制备4)
以与比较例1相同的方式制备粘合片，不同之处在于，环氧型交联剂Tetrad-X(由Mitsubishi Gas Chemical Company，Inc.制造)的加入量为0.05重量份。
比较例3(粘合片制备5)
以与实施例1相同的方式制备粘合片，不同之处在于，不加入环氧型交联剂Tetrad-X(由Mitsubishi Gas Chemical Company，Inc.制造)。
比较例4(粘合片制备6)
以与比较例1相同的方式制备粘合片，不同之处在于，不加入环氧型交联剂Tetrad-X(由Mitsubishi Gas Chemical Company，Inc.制造)。
评价实施例1和2和比较例1～4的粘合片的耐酸碱性(pH resistance)和蛋白质(胰蛋白酶)结合能力。评价结果如表1中所示。
评价耐酸碱性的方法
将2-吗啉乙磺酸(MES，由Dojindo Laboratories制造)溶解在蒸馏水中，以具有0.5M的最终浓度，然后逐滴添加1N氢氧化钠溶液以使pH为6.0～7.0，由此制备MES缓冲液。与上述做法相分开地，将2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1，3-二醇(Tris，由Nacalai Tesque，Inc.制造)溶解在蒸馏水中，以具有0.5M的最终浓度，然后逐滴添加1N盐酸以使pH为7.0～8.0，由此制备Tris缓冲液。使用时，利用蒸馏水将各缓冲液稀释为0.1M。
将各粘合片切割为20mm×20mm的尺寸，并在室温浸入各稀释的缓冲液(4ml)中20分钟，并目视观察粘合剂层的状况。
A：在所有pH条件下均未变化。
B：在某些pH条件下粘合剂层溶解、剥落或膨胀。
B：在所有pH条件下粘合剂层溶解、剥落或膨胀。
评价蛋白质(胰蛋白酶)结合能力的方法
将0.5M氯化钠添加至0.1M 2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES，pH 6.0，由Dojindo Laboratories制造)中以形成反应溶液A，并将各粘合片切割为20mm×20mm的尺寸，并在室温浸入2ml反应溶液A中20分钟。将0.8mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，由Pierce，Inc.制造)和2.2mgN-羟基磺基琥珀酸亚胺(Sulfo-NHS，由Pierce，Inc.制造)添加到其中浸有粘合片的反应溶液A中，并将该混合溶液在室温保持60分钟，由此活化粘合片的羧基。使用反应溶液A洗涤已活化的具有羧基的粘合片两次。将2mg的胰蛋白酶(由Roche制造)添加到2ml反应溶液A中，并将粘合片浸入该溶液中，于室温进行反应3小时，以使胰蛋白酶粘结于粘合片。反应结束后，从溶液中取出粘合片，并通过BSA蛋白质定量试剂盒(由Pierce，Inc.制造)使用牛血清白蛋白(BSA，Pierce)作为标准物质测量反应液中的残留胰蛋白酶的量，由此确定结合于粘合片的蛋白质的量。
[表1]
Figure BPA00001255176200141
实施例1和2显示了高耐酸碱性和充足的蛋白质结合量。另一方面，比较例1、2和4的耐酸碱性则不令人满意，并且不能确定蛋白质结合能力。比较例3的pH条件的耐受范围较窄并受限于活化步骤的条件。
实施例3和4(微量分析芯片制造1和2)
以3,000rpm的转速将环氧树脂型负性光刻胶SU-83050(由KayakuMicroChem Corporation制造)旋涂在硅衬底上，并使用加热盘于95℃加热干燥20分钟，以获得50μm厚的均质涂布膜。使用掩模对准器(由MikasaCo.，Ltd.制造的MA-20)通过具有100μm宽的流路图案的掩模将该涂布膜于250mJ/cm2下曝光。使用加热盘于95℃烘烤该涂布膜6分钟，然后使用显影剂将其显影，以获得具有100μm宽的流路图案的衬底。将该衬底与已除去防粘片的实施例1和2获得的微量分析芯片粘合片层压在一起，使得流路图案和粘合剂层置于内侧，由此获得微量分析芯片。用针在流路的两端形成孔，并将管粘结于此，通过注射泵供给纯水。在衬底与微量分析芯片粘合片之间的衔接处未观察到剥落或泄漏，这确证了该产品能够作为微量分析芯片良好地工作。

Claims (9)

1.一种微量分析芯片粘合片，所述粘合片包含具有由交联性粘合剂形成的粘合剂层的塑料片，所述交联性粘合剂含有下述聚合物，所述聚合物中，含有羧基或酸酐基的单体结构单元构成所述聚合物中总单体结构单元的10重量%～20重量%，其中，选择性粘结物质被固定在所述粘合剂层的表面。
2.如权利要求1所述的微量分析芯片粘合片，其中，所述选择性粘结物质通过所述粘合剂层表面上的羧基或酸酐基与所述选择性粘结物质的官能团的结合而固定。
3.如权利要求1或2所述的微量分析芯片粘合片，其中，所述选择性粘结物质为核酸、蛋白质、肽、糖类和脂质中的任一种。
4.如权利要求1所述的微量分析芯片粘合片，其中，所述塑料片由聚酯、纤维素衍生物和聚碳酸酯中的任一种制成。
5.一种微量分析芯片，所述微量分析芯片通过将表面上具有凹部和凸部的衬底与权利要求1～4中的任一项所述的微量分析芯片粘合片粘结在一起，使得所述衬底的具有凹部和凸部的表面与所述粘合片的粘合剂层置于内侧而制备。
6.如权利要求5所述的微量分析芯片，其中，在所述粘合剂层与所述衬底之间形成空隙。
7.如权利要求5或6所述的微量分析芯片，其中，所述表面上具有凹部和凸部的衬底由塑料制成。
8.一种制造权利要求5～7中任一项所述的微量分析芯片的方法，所述方法包括以下步骤：在塑料片上涂布粘合剂；辊层压所述涂布有粘合剂的塑料片和表面上具有凹部和凸部的衬底，使得所述衬底的具有凹部和凸部的表面和所述粘合剂置于内侧。
9.一种制造权利要求5～7中任一项所述的微量分析芯片的方法，所述方法包括以下步骤：在塑料片上涂布粘合剂以形成粘合剂层；将选择性粘结物质固定在所述粘合剂层的表面上；和辊层压具有其上固定有所述选择性粘结物质的粘合剂层的所述塑料片和表面上具有凹部和凸部的衬底，使得所述衬底的具有凹部和凸部的表面和所述粘合剂层置于内侧。
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