JP4009532B2 - 感染性レオウイルスの産生方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトを含む哺乳動物に対する臨床投与に適切な感染性哺乳動物レオウイルスを作製する方法に関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【数１】

上記の刊行物、特許、および特許出願の全ては、個々各々の刊行物、特許出願、または特許出願が具体的かつ個々に本明細書中でその全体が参考として援用されるのと同じ程度に、本明細書中において全体が参考として援用される。
【０００４】
（発明の背景）
レオウイルスは、セグメント化されたゲノムを有する二本鎖ＲＮＡウイルスである。この哺乳動物レオウイルスについてのレセプター、シアル酸は、遍在性の分子であり、従って、レオウイルスは、多くの細胞に結合し得る。しかし、ほとんどの細胞は、レオウイルス感染に対して感受性ではなく、そしてその細胞性レセプターに対するレオウイルスの結合によって、ウイルスの複製またはウイルス粒子の産生が生じることはない。これは、レオウイルスが特定の疾患のいずれかに関連することが知られていない理由であろう。
【０００５】
ｒａｓ癌遺伝子で形質転換された細胞は、レオウイルスに感受性になるが、これらの形質転換されていない対応物は感受性でないことが発見された（Ｓｔｒｏｎｇら、１９９８）。例えば、レオウイルス耐性ＮＩＨ ３Ｔ３細胞が、活性化されたＲａｓまたはＳｏｓ（Ｒａｓを活性化するタンパク質）で形質転換された場合、レオウイルス感染は増大された。同様に、レオウイルス感染に対して耐性であるマウス線維芽細胞は、ＥＧＦレセプター遺伝子またはｖ−ｅｒｂＢ癌遺伝子（これらの両方は、ｒａｓ経路を活性化する（Ｓｔｒｏｎｇら、１９９３；Ｓｔｒｏｎｇら、１９９６））でのトランスフェクション後に、感受性になる。従って、レオウイルスは、活性されたＲａｓ経路を有する細胞において、選択的に感染し、そして複製し得る。
【０００６】
このｒａｓ癌遺伝子は、大部分の哺乳動物腫瘍の原因となる。ｒａｓ遺伝子の活性化変異自体が、全ヒト腫瘍の約３０％において生じ（Ｂｏｓ、１９８９）、これは、主に、膵臓癌腫（９０％）、散発性の結腸直腸癌腫（５０％）および肺癌腫（４０％）ならびに骨髄性白血病（３０％）において生じる。ｒａｓ経路におけるｒａｓの上流因子または下流因子の活性化はまた、腫瘍に関連する。例えば、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２または上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターの過剰発現は、乳癌において一般的（２５〜３０％）であり、そして血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプターまたはＥＧＦレセプターの過剰発現は、神経膠腫および神経膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）おいて優勢（４０〜５０％）である。ＥＧＦレセプターおよびＰＤＧＦレセプターの両方が、これらのそれぞれのリガンドに結合する際に、ｒａｓを活性化し、ｖ−ｅｒｂＢが、この細胞外ドメインを欠く構成的に活性化されたレセプターをコードすることは公知である。
【０００７】
多くのヒト腫瘍が、プロト癌遺伝子ｒａｓの遺伝的な変更または高度のＲａｓ活性によって説明されるので、レオウイルス治療は、このような状態に対する新規の有望な治療である（Ｃｏｆｆｅｙら、１９９８）。レオウイルス治療は、Ｒａｓ関連腫瘍細胞に高度に選択的であり、そして正常な細胞を未感染の状態で残す。結果として、ヒトにおける臨床投与に適した感染性レオウイルスの産生のための単純かつ費用効率が高い方法が、必要である。
【０００８】
レオウイルスは、ヒトの健康を脅かす深刻な脅威をもたらさないので、レオウイルスを効率的に産生する徹底的な努力はなされなかった。この哺乳動物レオウイルスは、本来、マウスＬ−９２９線維芽細胞内で増殖する（Ｎｉｂｅｒｔら、１９９６）。これは、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞株）においても増殖することが報告された（Ｔａｂｅｒら、１９７６；Ｄａｖｉｓら、１９９０）。さらに、ブタ腎臓の一次培養物を使用して、ブタレオウイルスを培養した（日本国特許第６３０４４５３２Ａ号、１９８８年２月２５日発行）。レオウイルスの大量生産を目的とする研究において、Ｂｅｒｒｙらは、Ｖｅｒｏ細胞培養およびその後のレオウイルス感染の最適な方法の調査を実施した（Ｂｅｒｒｙら、１９９９）。Ｖｅｒｏ細胞を、Ｃｙｔｏｄｅｘ−１マイクロキャリアまたはＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｇマイクロキャリアのいずれかにおいて増殖させ、培養パラメーター（例えば、細胞密度、ウイルス増殖の時間経過、およびマイクロキャリア中のビーズに対する細胞の比）をが変更し、そしてウイルス収率を決定した。この研究によって、ウイルスの収率が培養パラメーターによって大きく変化することおよび複雑な培養条件（例えば、感染効率に対するビーズ当たりの細胞数）が適切な収率を得るために必要であることが示された。従って、臨床的に有用なレオウイルスを産生する簡潔で、効率的な方法に対する必要性が、なお存在する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、レオウイルスをヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞内で培養することよって、レオウイルスを産生する簡潔かつ効率的な方法に関する。ＨＥＫ２９３細胞でのこの収率は、予想外に高く、特にＬ−９２９細胞またはＶｅｒｏ細胞を使用する、以前の研究に比較して高かった。さらに、本発明を使用することによって、高収率が、ウイルス粒子が細胞から放出される前の、感染過程の初期において達成される。従って、このウイルスはインタクトな細胞から初期に収集され得、このウイルスが培養培地の非存在下で、精製されることを可能にする。これは、比較的簡潔な精製手順を生じる。
【００１０】
従って、本発明の一つの局面は、哺乳動物レオウイルスを産生する方法を提供し、この方法は、ＨＥＫ２９３細胞のレオウイルス感染を生じる条件下で、ＨＥＫ２９３細胞と哺乳動物レオウイルスとを接触させる工程；ウイルス複製を可能にするのに十分な時間にわたって、上記の感染した細胞の培養物をインキュベートする工程；および産生されたウイルスを収集する工程を包含する。
【００１１】
任意の哺乳動物レオウイルスは、この方法を使用して産生され得る。特に、ヒトにおける臨床投与のためのヒトレオウイルスは、この方法を使用して産生され得る。最も具体的には、レオウイルス第３血清型およびこのＤｅａｒｉｎｇ株が産生される。他の哺乳動物レオウイルスは、本明細書中で特許請求された方法によって、同様に効率的に産生され得る。
【００１２】
本発明の別の特徴は、レオウイルスがＨＥＫ２９３細胞内で迅速に産生されるので、本発明が、迅速かつ費用効率の高いレオウイルス産生方法を提供することである。また、ＨＥＫ２９３細胞培養物中のウイルス力価が、この細胞が完全に溶解する前に高いので、このウイルスは、この細胞とまだ結合しているときに収集され得、従って、このウイルスの精製手順は比較的簡潔であり得、産生費用をさらに低減する。従って、本発明は、このウイルスが、全細胞が溶解する前に、回収される方法を提供する。より好ましくは、このウイルスは、２０〜９５％の細胞が生存しているときに、好ましくは３５〜９０％の細胞が生存しているときに、最も好ましくは５０〜８０％の細胞が生存しているときに、収集される。
【００１３】
本発明の別の局面は、広範な感染効率を使用してウイスル産生を達成し得ることである。感染効率０．１は、十分であるが、より高い多重度（例えば、１０までの多重度）を使用して、産生時間を短縮し得る。好ましくは、１未満の感染効率が使用されるが、より好ましくは０．５または０．５付近である。
【００１４】
本発明の別の局面は、接着細胞培養物および懸濁細胞培養物の両方においてレオウイルスを産生する方法を提供し、これはＨＥＫ２９３細胞が、両方の種類の培養物で増殖するように適応され得るためである。他の目的または他の培養条件に適応されたか、または外因性ＤＮＡで形質転換された、ＨＥＫ２９３細胞もまた、本発明において有用である。
【００１５】
本発明はまた、上述の方法によって調製される哺乳動物レオウイルス組成物を提供する。この組成物は、好ましくは精製され得る。この組成物は、例えば、冷凍による、長期の貯蔵に適切である。この組成物は、腫瘍または活性化されたｒａｓ経路によって引き起こされる他の細胞増殖性障害を処置するのに有用であり、そしてこの組成物は、ＨＥＫ２９３細胞が生物学的産物を増殖させるために米国食品医薬品局によって認可されているので、ヒトにおける投与に適切である。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤および／またはその意図された目的のためにレオウイルスと共に使用され得る治療剤をさらに含み得る。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を使用することよる、哺乳動物レオウイルスを産生する方法に関する。本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞が、Ｌ−９２９細胞またはＶｅｒｏ細胞によりも、レオウイルスについて効率的な宿主細胞であることを見出した。以前にレオウイルスの複製を支持する報告はされていないが、ＨＥＫ２９３細胞は、Ｌ−９２９細胞またはＶｅｒｏ細胞に比べ、より短い時間経過でより多くのレオウイルスを産生した。結果として、ＨＥＫ２９３を使用することによって、産生費用が低減され得る。さらに、レオウイルスがまだ、ＨＥＫ２９３細胞と結合しているときに、この力価が十分高いので、比較的簡潔な手順を使用して、このウイルスを精製し得、そしてさらに産生費用を低減し得る。
【００１７】
さらに詳細に本発明を記載する前に、本出願において使用される用語を、別段指摘しない限り、以下の様に定義する。
【００１８】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「ＨＥＫ２９３細胞」とは、２９３と称されるヒト胚性腎細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）またはその誘導体をいう。例えば、２９３／ＳＦ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３．１）は、無血清培地で増殖するように適応されたＨＥＫ２９３細胞である。本発明においてまた企図されるのは、他の培養条件で増殖するように適応されたＨＥＫ２９３細胞、または外来性ＤＮＡで形質転換された任意の種類のＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体であるが、但し、この形質転換は、本発明で記載されるような効率的なレオウイルス産生を支持するこの細胞の能力を損なうことはない。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「レオウイルス」とは、天然に存在するか、改変されるか、または組換え体であるかには関わらず、レオウイルス属に分類される任意のウイルスをいう。レオウイルスは、二本鎖のセグメント化されたＲＮＡゲノムを有するウイルスである。このビリオンは、直径６０〜８０ｎｍの寸法であり、そして２つの同心性のカプシド殻を保有している。殻のそれぞれは正二十面体である。このゲノムは、１０〜１２個の不連続なセグメントである二本鎖ＲＮＡから構成され、１６〜２７ｋｂｐの総ゲノムサイズを有する。個々のＲＮＡセグメントは大きさが異なる。３種の別個のものだが、関連する型のレオウイルスが、多くの種から回収されている。３種全ての型は、共通の相体結合抗原を共有する。
【００２０】
ヒトレオウイルスは３個の血清型から構成される：１型（Ｌａｎｇ株またはＴ１Ｌ株）、２型（Ｊｏｎｅｓ株、Ｔ２Ｊ）、および３型（Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株、Ｔ３Ｄ）。この３種の血清型は、中和反応および血球凝集素阻害アッセイに基づいて容易に同定することができる（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら、１９９６を参照のこと）。
【００２１】
このレオウイルスは、天然に存在し得るか、または改変され得る。このレオウイルスは、これが、天然における供給源から単離され得、そして実験室において人為的な改変がおこなわれていない場合に、「天然に存在する」。例えば、レオウイルスは、「フィールド供給源（ｆｉｅｌｄ ｓｏｕｒｃｅ）」、すなわち、このレオウイルスに感染したヒトに由来し得る。
【００２２】
このレオウイルスは、改変され得るが、活性なｒａｓ経路を有する哺乳動物細胞になお溶解的（ｌｙｔｉｃａｌｌｙ）に感染し得る。このレオウイルスは、増殖する細胞に対する投与の前に化学的または生化学的に（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンのようなプロテアーゼのようなプロテアーゼを用いて処理することによって）前処理され得る。プロテアーゼを用いる前処理によって、このウイスルの外膜またはキャプシドが取り除かれ、そしてこのウイルスの感染性を増大し得る。このレオウイルスは、リポソームまたはミセルで被覆され得る（ＣｈａｎｄｒｏｎおよびＮｉｂｅｒｔ、１９９８）。例えば、このビリオンは、ミセル形成濃度の硫酸アルキル界面活性剤の存在下で、キモトリプシンで処理され得、新規の感染性サブビリオン粒子を生成し得る。
【００２３】
このレオウイルスは、異なる病原性表現型を有する２以上の型のレオウイルス由来の組換えられた（すなわち、再連結された）レオウイルスであり得、その結果、これは、異なる抗原決定基を含み、これによって、以前にレオウイルスサブタイプに曝露された哺乳動物による免疫応答を低減するか、または予防する。このような組換えビリオンは、異なるサブタイプのレオウイルスを用いる哺乳動物細胞の同時感染によって生成され得、再連結および得られたビリオンキャプシドへの異なるサブタイプの被覆タンパク質の取り込みを生じる。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、細胞とこのウイルスとを「接触させる」とは、このウイルスを細胞の培養物中に置き、その結果、このウイルスがこの細胞と接触する機会を持つことをいう。ここで、この細胞は、ウイルスによる首尾よい感染を導き得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ウイルス感染」とは、ウイルスの細胞への侵入およびその後の細胞内でのウイルスの複製をいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「感染効率」は、ウイルスが細胞と接触するために使用される場合のウイルスの数 対 細胞の数の比をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「細胞溶解」は、細胞の細胞膜の破壊および細胞の成分の全てまたは一部の引き続く放出をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「完全な溶解」は、複数の細胞の培養物における全ての細胞の溶解をいう。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「培養条件」は、細胞培養において使用される条件をいい、温度、培養容器の型、湿度、ＣＯ_２の濃度または培養容器において使用される任意の他の気体、培養培地の型、培養細胞の最初の密度、および細胞がウイルスと感染する場合の最初の感染効率を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「細胞（に）会合」したウイルスは、ウイルスが生成される細胞の一部に付着しているかまたは封入されているウイルスをいう。従って、ウイルスは、細胞に会合した後、宿主細胞が溶解する。細胞溶解が始まる場合、ウイルスは、破壊された細胞の一部に付着したままであり得るかまたは封入されたままであり得、そして細胞に会合したままである。しかし、ウイルスが培地に放出される場合、もはや細胞に会合していない。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、細胞は、細胞膜が破裂し、そして細胞成分の少なくともいくつかが細胞から放出される場合、「破壊され」ている。細胞は、例えば、凍結乾燥、超音波処理または界面活性剤処理によって破壊され得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、ウイルスを「収集する」とは、以前にウイルスに感染した細胞培養物から生成されたウイルスを収集する行為をいう。ウイルスの収集は、ウイルスがまだ細胞に会合している場合、宿主細胞を破壊する工程を包含し得る。あるいは、あまり好ましくないが、培養培地に放出されたウイルス粒子は、培地から収集され得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「細胞変性効果」は、細胞がみかけにおいて腫大しそして顆粒状になること、および細胞凝集塊が壊れることによって、示される。生存可能な細胞におけるネガティブな細胞変性効果の染色を示す細胞をカウントする。なぜなら、これらは、染色色素を奪ってしまうためである。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「接着細胞」は、細胞培養中の培養容器に接着する細胞をいう。接着細胞の例は、単層細胞を含み、これらは、培養容器の表面上に細胞の単一の層を形成する細胞である。「懸濁細胞」または「懸濁された細胞」は、細胞培養中の培養容器に接着しない細胞をいう。懸濁細胞は、「スピン培養」において増殖され得、これは、培養培地が、培養プロセスの間に連続的に撹拌される培養である。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「細胞の生存度」または「生存可能なままである細胞の割合」は、集団中で細胞変性効果を示さない細胞の割合である。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「収集時間」は、レトロウイルスが回収されそして精製される時点をいう。ウイルスは、好ましくは、力価が十分に高く、そしてウイルスがまだ細胞に会合している場合に、収集される。ウイルスは、完全な細胞溶解が発生した後でさえ収集され得るが、精製プロセスを単純化するために細胞から放出される前にウイルスを収集することが望ましい。従って、細胞の生存度は、ウイルスがまだ細胞に会合しているか否かの指標として慣例的に測定される。ウイルスは、一般に、細胞の少なくとも５％が生存している場合に、収集される。好ましくは、２０〜９５％の細胞が生存可能である場合に、より好ましくは、３５〜９０％の細胞が生存可能なままである場合に、そして最も好ましくは、５０〜８０％の細胞が生存可能なままである場合に、ウイルスは収集される。
【００３７】
（方法）
正常な細胞は、一般に、レオウイルス感染に感受性ではなく、そして培養細胞株は、レオウイルス生成を支持するそれらの能力において非常に変化する。レトロウイルスを生成するための効率的な宿主細胞を開発する本発明者らの試みにおいて、種々の細胞を使用し、そしてＨＥＫ２９３細胞が非常に効率的であると証明された。代表的な実験において（実施例１）、ＨＥＫ２９３、ＶｅｒｏおよびＬ−９２９細胞をコンフルエンシーまで増殖させ、そして１の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）でレトロウイルスと感染させた。ウイルスの収量を、感染後、種々の時間で決定した。驚くべきことに、ＨＥＫ２９３細胞（これは、レトロウイルス増殖を支持することは報告されていない）は、感染の２４時間後、Ｌ−９２９細胞よりも約５０倍多いレトロウイルスを生成し、これらは、哺乳動物レトロウイルスを培養するために慣例的に使用される。Ｖｅｒｏ細胞は、この時点で、さらに少ないレトロウイルスを生成し、ＨＥＫ−２９３細胞よりも３０００倍少ないレトロウイルスを生成する。
【００３８】
感染の３６〜４８時間後、ＨＥＫ−２９３細胞におけるウイルス収量は、平衡状態に達し始めたが、力価は、Ｌ−９２９細胞において生成された力価よりもなお１オーダー高く、そしてＶｅｒｏ細胞の濃度よりも２オーダー高かった。感染の９６時間後になって初めて、全ての３細胞株が、１ミリリットル当り１０^９〜１０^１０のほぼ同じ力価のレオウイルスを生成した。
【００３９】
これらの結果により、ＨＥＫ−２９３細胞は、レオウイルスの産生について非常に効率的な系であり、産生の費用を顕著に減少させる、短縮された生成時間を可能にすることを示す。
【００４０】
ＨＥＫ２９３細胞生成条件をさらに最適化するために、レオウイルスを使用して、種々のｍ．ｏ．ｉ．でＨＥＫ２９３細胞を感染させ、そして収量を決定した（実施例２）。結果は、より低いｍ．ｏ．ｉ．が、さらに有利であることを示す。従って、感染の４８時間後、０．５のｍ．ｏ．ｉ．で感染された細胞は、１ｍｌ当り１０^１０より多くのウイルスを生成し、これらの培養条件において最大の収量であった。この時点後、力価を約２倍下げ、そして９６時間で再び最大の収量に達した。同様のパターンを、０．１の最初のｍ．ｏ．ｉ．を有する培養について観察した。理由は明らかではないが、７２時間における減少は、ウイルスのタンパク分解によって引き起こされることが可能である。これは、明らかに、９６時間におけるより高い収量を生成するための複製が伴う。
【００４１】
結果として、これらの培養条件下でレトロウイルスを収集する最良な時間は、感染の３６〜６０時間後である。この時点において、力価は高く、そしてウイルスは、まだ、細胞フラグメントおよび細胞膜に会合しており、このことは、ウイルスの精製を比較的単純にする。９６時間で、全ての細胞は溶解し、そしてウイルスは、死んだ細胞の分解産物と共に培地に放出され、ウイルスが細胞に会合する場合よりも、精製をはるかにより複雑にする。
【００４２】
最良の効率のために、収量が十分に高いが、ウイルスのほとんどがなお細胞に会合している場合、ウイルスは収集されるはずである。収集時間は、培養条件が変化する場合に、経験的に決定されるはずである。ウイルスが細胞に会合するか否かを決定するために、培養物の少量のアリコートを、感染後の異なる時点で細胞生存度の程度を決定するために、例えば、顕微鏡下で、調査し得る。あるいは、可視染色は、生存可能な細胞の割合を決定するために行なわれ得る。精製プロセスを単純化するために、代表的には、全ての細胞が溶解する前に、ウイルスを収集する。好ましくは、ウイルスは、細胞の２０〜９５％が生存可能なままである場合に収集される。より好ましくは、細胞の３５〜９０％、およびより好ましくは５０〜８０％が生存可能なままである場合、ウイルスが収集される。
【００４３】
ＨＥＫ２９３細胞は、接着細胞であり、そして細胞培養フラスコ、回転ビン、マイクロキャリアシステムまたは中空線維システム、または接着細胞を増殖するのに適切な任意の他のシステムで、増殖され得る。ＨＥＫ２９３細胞は、誘導細胞改変して誘導細胞を生成し得る。例えば、２９３／ＳＦ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３．１）を、ＨＥＫ２９３細胞から誘導し、そして無血清培養条件に適合させた。２９３／ＳＦ細胞は、接着細胞および懸濁細胞の混合物として増殖し、そして上記のような培養容器、ならびに撹拌ビン、撹拌容器（発酵槽）、中空線維システム、または懸濁細胞に適切な任意の他の培養容器のいずれかにおいて増殖され得る。
【００４４】
工業的量のレオウイルスを生成するために、２９３／ＳＦ細胞を、１５Ｌの撹拌フラスコ中で培養し、そして細胞密度が１０^６／ｍｌに達する際に、０．５の感染効率でレトロウイルスと感染させた。培地中のフェノールレッドの存在に起因する赤からオレンジへの培養培地の色の変化によってか、または顕微鏡下での可視細胞数によって証明されるように、培養物を、細胞溶解が始まるまでインキュベートした。この時点で、ウイルスを遠心分離によって収集した。次いで、ウイルスを、材料および方法において記載されるように精製し、そして臨床投与において使用し、そしてさらなる使用のために貯蔵した。貯蔵のために、ウイルスは、安定剤を用いてかまたは用いずに、当該分野で確立された方法に従って、凍結され得るかまたは凍結乾燥され得る。
【００４５】
（レオウイルス組成物）
レオウイルス組成物は、上記の方法によって生成されたレオウイルスを使用して調製され得る。これらの組成物は、哺乳動物（ヒトを含む）における臨床投与に適切である。臨床投与に使用される場合、組成物は、好ましくは精製されている。ヒトレオウイルス（特に血清型３）（最も詳細にはＤｅａｒｉｎｇ株）が、本発明の方法によって調製される好ましい組成物である。しかし、他の哺乳動物レトロウイルスも同様に生成され得る。
【００４６】
本発明はまた、薬学的組成物を含み、これは、本発明に従って、「薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤」と会合した１つ以上のレオウイルスを含有する。本発明の組成物の作成においては、有効成分／レオウイルスは、通常は賦形剤と混合され、賦形剤によって稀釈されるか、またはカプセル、１回分の袋入りの薬（ｓａｃｈｅｔ）、紙、または他の容器の形態であり得るようなキャリア中に閉じられる。薬学的に受容可能な賦形剤が希釈剤として作用する場合には、これは固体、半固体、または液体材料であり得る。これは、有効成分についてのビヒクル、キャリア、または媒体として作用する。従って、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、１回分の袋入りの薬、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳濁剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体として、または液体媒体中）、（例えば、１０重量％までの）活性化合物を含有している軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌の注射可能な溶液、ならびに滅菌のパッケージされた散剤の形態であり得る。
【００４７】
適切な賦形剤のいくつかの例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物はさらに：タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような潤滑剤；湿潤剤；乳濁剤；ならびに懸濁剤；メチル−およびプロピルヒドロキシ−安息香酸のような保存料；甘味料；ならびに香味料を含有し得る。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することによって、患者への投与後に有効成分の迅速な、持続的な、または遅延させられた放出を提供するように処方され得る。
【００４８】
錠剤のような固体の組成物を調製するために、重要な有効成分／レオウイルスが、本発明の化合物の均質な混合物を含有している固体の事前処方組成物を形成するように、薬学的賦形剤と混合される。これらの事前処方組成物について均質であると言及する場合には、組成物が、錠剤、丸剤、およびカプセル剤のような等しく有効な単位投与量形態に容易に分割され得るように、有効成分が最終的に組成物全体にわたって分散させられことが意味される。
【００４９】
本発明の錠剤または丸剤は、延長させられた作用の利点を付与する投与量形態を提供するように、被覆され得るかまたは他の方法で調合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部の投薬成分、および外部の投薬成分（ｄｏｓａｇｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含有し得る。外部の投薬成分は、内部の投薬成分を包む形態である。２つの成分は、胃での分解に抵抗するように作用し、そして内部の成分が十二指腸内へと完全な状態で移動するかまたは放出を送らせることを可能にする、腸溶性層によって分離され得る。種々の材料が、このような腸溶性層または被覆のために使用され得る。このような材料としては、多数の重合酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、およびセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との重合酸の混合物が挙げられる。
【００５０】
本発明の新規の組成物が、経口投与または注射による投与ためにその中に取り込まれ得る液体の形態として、水溶液、適切に風味をつけたシロップ、水性または油性懸濁剤、および食用油（例えば、トウモロコシ油、ナタネ油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）で香味づけた乳濁剤、ならびにエリキシル剤、および同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００５１】
吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または通気（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）のための組成物は、薬学的に受容可能な水性溶媒もしくは有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁物、ならびに散剤を含む。液体または固体の組成物は、本明細書中に記載されるような適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含有し得る。好ましくは、組成物は、局所または全身的な効果のために、経口または鼻腔の呼吸経路によって投与される。好ましい薬学的に受容可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧溶液は、噴霧デバイスから直接吸入され得るか、または噴霧デバイスはフェースマスクテント、または断続的陽圧呼吸機器（ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ）に取り付けられ得る。溶液、懸濁物、または散剤組成物は、好ましくは、適切な様式で処方物を送達するデバイスから、経口または鼻腔によって投与され得る。
【００５２】
本発明の方法において使用される別の好ましい処方物は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチは、制御された量での本発明のレオウイルスの持続的または断続的な注入を提供するために使用され得る。薬学的薬剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと。このようなパッチは、薬学的薬剤の持続的、拍動性の、またはオンデマンド送達のために構築され得る。
【００５３】
本発明での使用のための他の適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る。
【００５４】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、決して本発明を限定するとは解釈されない。
【００５５】
（実施例）
以下の実施例においては、以下の略号は以下の意味を有する。略号が定義されていない場合は、それはその一般的に容認されている意味を有する：
ＣＩ＝信頼区間
ＴＣＩＤ_５０＝組織培養感染用量_５０
μＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度
ｍｌ＝ミリリットル
μｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
ｇ／Ｌ＝１リットル当たりのグラム
ｒｐｍ＝毎分回転数
ＦＢＳ＝ウシ胎仔血清
ＤＴＴ＝ジチオスレイトール
ＮＰ−４０＝Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
β−ＭＥ＝β−メルカプトエタノール
ＭＯＩまたはｍ．ｏ．ｉ．＝感染効率
ＰＦＵ＝プラーク形成単位
ｈｒ＝時間
℃＝摂氏温度。
【００５６】
（一般的方法）
（細胞およびウイルス）
ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）、Ｖｅｒｏ（アフリカサバンナモンキー腎臓）細胞、およびマウス繊維芽細胞Ｌ−９２９細胞は、製造業者（ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ））によって提供された。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％の熱不活化ウマ血清および９０％の以下の混合物（２ｍＭのＬ−グルタミンを含むイーグル最少必須培地ならびに１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調節されたＥａｒｌｅ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む培養倍地中で増殖させた。マウスＬ−９２９細胞およびＶｅｒｏ細胞を、１０％のＦＢＳおよび９０％の以下の混合物を含む培養倍地中で増殖させた：２ｍＭのＬ−グルタミンを含むイーグル最少必須培地ならびに１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むように調節されたＥａｒｌｅ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ。
【００５７】
２９３／ＳＦ細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンを補充した２９３無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）中で、３５〜４０ｒｐｍの回転速度で、攪拌フラスコ中で３６℃±２℃、６％±２％ ＣＯ_２および８０％±５％の相対湿度で増殖させた。
【００５８】
これらの実験に使用される血清型３のレオウイルスのＤｅａｒｉｎｇ株を、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を抽出緩衝液から除外したこと以外は、Ｓｍｉｔｈ（Ｓｍｉｔｈら、１９６９）に従って精製したＬ−９２９細胞の懸濁培養物において増殖させた。［^３５Ｓ］メチオニンで標識したレオウイルスを増殖させ、そしてＭｃＲａｅおよびＪｏｋｌｉｋによって記載されているように精製した（ＭａＲａｅおよびＪｏｋｌｉｋ、１９７９）。精製したレオウイルスについての粒子／ＰＦＵ比は、代表的には１００／１であった。
【００５９】
（単層細胞の感染およびウイルスの定量）
ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＬ−９２９細胞のコンフルエントな単層を、２４ウェルのプレートで増殖させ、そして既知の感染効率でレオウイルスを感染させた。３７℃で１時間のインキュベーション後、この単層を、温培地で洗浄し、次いでこれらの培養培地中でインキュベートした。感染後の種々の時点で、ＮＰ−４０およびデオキシコール酸ナトリウムの混合物を、１％〜０．５％の最終濃度まで、感染した単層上の培地にそれぞれ直接添加した。次いで、溶解物を収集し、そしてウイルスの収率をＬ−９２９細胞でのプラーク力価決定によって決定し、そしてＬｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌとして表した。
【００６０】
（懸濁細胞の感染およびウイルスの精製）
２９３／ＳＦ細胞を１０^６／ｍｌまで増殖させ、そしてレオウイルスを感染させた。培養物を、培地の色が赤からオレンジに変わるまで、または生存細胞の計数によって明らかなように、所望のレベルまで細胞の生存率が減少するまで増殖させた。生存細胞の計数を、細胞変性効果（これは、細胞の外観が膨れて顆粒状になり、そして細胞の集合がばらばらになることによって示される）を示さない細胞について、顕微鏡下で実行し得る。生存細胞計数はまた、当該分野で一般に使用される生存染色によって実行され得る。所望の細胞生存率レベルが達成された場合、細胞を遠心分離によってペレット化し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に再懸濁した。
【００６１】
次いで、細胞を凍結融解によって溶解し、そして氷上に２０〜４０分間保って周期的にボルテックスして細胞を混合および溶解させた。懸濁物を、予め冷却した等容量のＦｒｅｏｎ（登録商標）（１，１，２−トリクロロ−１，１，２−トリフルオロエタン）を用いて、１０分間のボルテックスによって抽出し、次に２５００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心分離して、異なる相を分離した。水相（上）を取り出し、そして上記のように２回再抽出した。最後の抽出後、水層を新たなチューブに移し、そしてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、０．５％の最終濃度まで添加した。
【００６２】
ウイルスを、塩化セシウム階段勾配によって精製した。勾配は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中に調製されたＣｓＣｌ溶液の２つの層（それぞれ、１．２０ｇ／ｍｌおよび１．４ｇ／ｍｌ）を含んだ。ウイルス懸濁物を、勾配の上端にロードし、そしてＳＷ ２８．１ローターで、４℃にて２時間、２６，０００ｒｐｍで遠心分離した。ウイルスのバンド（上のバンドは、空のキャプシドを含むので、２つのバンドのうちの下のバンド）を収集し、そして滅菌ＰＢＳに対して透析した。
【００６３】
（実施例１）
（レオウイルスの産生のために最適な細胞株の決定）
感染の結果として産生されたレオウイルスの量において、感受性の細胞株間で差異が存在するか否かを決定するため、レオウイルス感受性を示す多くの異なる細胞株を、産生されたレオウイルスの相対的な量についてアッセイした。特に目的の細胞株は、生物学的因子の産生のために種々の監督機関によって承認されている細胞株である。従って、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＬ−９２９細胞をレオウイルスに曝露し、そしてその細胞がレオウイルスを産生する能力を比較した。
【００６４】
ウイルス産生の定量を、感染後種々の時点で感染細胞およびその増殖培地を収集することによって達成した。産生された溶解物を、続いて、プラーク力価決定分析に供して、ウイルス収率を決定し、この収率を力価±９５％ＣＩ（Ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）として、以下の表１に示す。これらの結果は、試験された全ての細胞が、レオウイルス感染に感受性であったが、これらの細胞株の各々において産生されたウイルスの量においては、かなりの差異が存在することを示す。
【００６５】
【表１】

これらの結果は、産生されたウイルスの量が、ＨＥＫ２９３細胞において最も高いことを明らかに示す。さらに、ＨＥＫ２９３細胞は、ウイルスをより早く産生し、レオウイルスの製造のための産生時間を短縮した。
【００６６】
（実施例２）
（最終ウイルス産生に対する開始感染効率の影響）
開始感染効率が、最終的なウイルス産生を決定するか否かを決定するため、ＨＥＫ２９３細胞を、１と０．１との間の範囲の開始感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させた。表２に示される本発明者らの結果は、開始ｍ．ｏ．ｉ．と最終ウイルス産生との間に実際に関連性が存在することを示す。１未満の開始ｍ．ｏ．ｉ．は、レオウイルスの大規模製造に最適である。
【００６７】
【表２】

さらに、本発明者らの結果は、細胞を収集する最適な時間がまた存在し、これが重要であることを実証する。本発明者らは、ウイルス産生が２４時間後に最大であることを見出した。このことは驚くべきことではない。なぜなら、２４時間より前には、適切なウイルスタンパク質合成および成熟ビリオンの集合のための時間が不十分だからである。より驚くべきことは、７２時間の時点でのウイルス量の減少、その後の９６時間の時点での感染性粒子の数の顕著な増大の観察である。７２時間での僅かな減少は、９６時間の時点での第二回のウイルス複製の前の、ウイルスのタンパク質溶解性分解に起因する可能性があると仮定される。

Claims (31)

1. 哺乳動物レオウイルスを産生する方法であって、以下：
   （ａ）ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、該ＨＥＫ２９３細胞のレオウイルス感染を生じる条件下で哺乳動物レオウイルスと接触させる工程；
   （ｂ）該感染細胞培養物を、ウイルス複製を可能にするのに十分な期間でインキュベートする工程；および
   （ｃ）産生された該ウイルスを収集する工程、
   を包含し、
   該ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞は、接着性ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）細胞および懸濁物として培養されたＨＥＫ２９３／ＳＦ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３．１）細胞からなる群より選択される、方法。
2. 前記哺乳動物レオウイルスが、ヒトレオウイルスである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒトレオウイルスが、血清型３のレオウイルスである、請求項２に記載の方法。
4. 前記血清型３のレオウイルスが、Ｄｅａｒｉｎｇ株である、請求項３に記載の方法。
5. 工程（ａ）における感染効率が１０以下である、請求項１に記載の方法。
6. 前記感染効率が５以下である、請求項５に記載の方法。
7. 前記感染効率が１以下である、請求項６に記載の方法。
8. 前記感染効率が０．５である、請求項７に記載の方法。
9. 前記感染効率が０．１である、請求項８に記載の方法。
10. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記培養物中の少なくとも５％の細胞が生存能力を維持している場合に、前記ウイルスが収集される、方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記培養物中の２０〜９５％の細胞が生存能力を維持している場合に、前記ウイルスが収集される、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、ここで前記培養物中の３５〜９０％の細胞が生存能力を維持している場合に、前記ウイルスが収集される、方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、ここで前記培養物中の５０〜８０％の細胞が生存能力を維持している場合に、前記ウイルスが収集される、方法。
14. 前記ＨＥＫ２９３細胞が、接着細胞として培養される、請求項１に記載の方法。
15. 前記ＨＥＫ２９３細胞が、懸濁物として培養される、請求項１に記載の方法。
16. 請求項１に記載の方法であって、前記細胞を前記培養培地から分離し、該細胞を破壊して前記ウイルスを該細胞から放出させ、そして該ウイルスを精製することによって、該ウイルスが収集される、方法。
17. 請求項１６に記載の方法であって、ここで前記細胞が、前記培養培地から遠心分離により分離され、かつ凍結融解により破壊され、そして前記ウイルスが、ＣｓＣｌ勾配により精製される、方法。
18. 前記収集したウイルスを保存するために、凍結する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
19. 前記収集したウイルスが、−６０℃以下で保存される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記収集したウイルスを保存するために、凍結乾燥する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
21. 感染性レオウイルスを産生する方法であって、以下：
    （ａ）ＨＥＫ２９３／ＳＦ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３．１）細胞を、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充した２９３無血清培養培地中で、３６℃±２℃、６％±２％ＣＯ_２および相対湿度８０％±５％において、回転速度３５〜４０ｒｐｍの攪拌フラスコで、細胞密度が約１０^６細胞／ｍｌに達するまで培養する工程；
    （ｂ）該細胞を、レオウイルスＤｅａｒｉｎｇ株を用いて、感染効率０．５で感染させる工程；
    （ｃ）該感染細胞の培養物を、工程（ａ）と同様の条件で、生存可能細胞の割合が５０〜８０％まで落ち込むまで、インキュベートする工程；
    （ｄ）産生されたウイルスを、該培養物を遠心分離すること、凍結乾燥して該細胞から該ウイルスを放出させること、そしてＣｓＣｌ勾配により該ウイルスを精製することによって、収集する工程；ならびに
    （ｅ）−６０℃以下で該ウイルスを保存する工程、
    を包含する、方法。
22. 前記レオウイルスが組換えレオウイルスである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記組換えレオウイルスが２つ以上のレオウイルス株に由来する、請求項２２に記載の方法。
24. 請求項２３に記載の方法であって、ここで前記２つ以上のレオウイルス株が、Ｄｅａｒｉｎｇ株、Ａｂｎｅｙ株、Ｊｏｎｅｓ株、Ｌａｎｇ株からなる群から選択される、方法。
25. 前記組換えレオウイルスが、天然に存在するものである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
26. 前記組換えレオウイルスが、天然には存在しないものである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
27. 請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法であって、ここで前記組換えレオウイルスが、天然に存在する変異コートタンパク質コード配列を含む、方法。
28. 請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法であって、ここで前記組換えレオウイルスが、変異コートタンパク質コード配列を含む、方法。
29. 請求項２２、２３、２５または２６のいずれかに記載の方法であって、ここで前記組換えレオウイルスが、血清型１のレオウイルス、血清型２のレオウイルスおよび血清型３のレオウイルスからなる群から選択されるレオウイルスの再組み合わせより生じる、方法。
30. 請求項２２〜２９のいずれかに記載の方法であって、ここで前記組換えレオウイルスが、哺乳動物細胞を、異なる血清型のレオウイルスを用いて同時感染させることにより生じる、方法。
31. 哺乳動物レオウイルスを産生するための組成物であって、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞と、感染量の哺乳動物レオウイルスとを含み、
    該ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞は、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）細胞およびＨＥＫ２９３／ＳＦ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３．１）細胞からなる群より選択される、組成物。