JP3990705B2

JP3990705B2 - Method for measuring catecholamines, electrode for measuring catecholamines used in the method, method for producing the same, and electrochemical cell

Info

Publication number: JP3990705B2
Application number: JP2005139825A
Authority: JP
Inventors: 勝義林; 勉堀内; 弦岩崎; 彰之館
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2005-05-12
Filing date: 2005-05-12
Publication date: 2007-10-17
Anticipated expiration: 2025-05-12
Also published as: JP2006317263A

Description

本発明は、生体内から微量の試料を採取し、その試料中に含まれるカテコールアミン類（ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン等のｏ−ジヒドロキシベンゼン骨格を有する生体アミン）を感度、選択性良く測定するための方法に関する。また、本発明は、前述の測定方法に用いられる医学、生理学用、あるいは医療用センシングデバイスに関する。 The present invention is for collecting a small amount of sample from the living body and measuring catecholamines (biological amines having an o-dihydroxybenzene skeleton such as dopamine, noradrenaline, adrenaline) contained in the sample with high sensitivity and selectivity. Regarding the method. The present invention also relates to a medical, physiological, or medical sensing device used in the measurement method described above.

医学・医療、生物学分野では、カテコールアミン類の高感度・高選択検出には、主に液体クロマトグラフィーと電気化学検出器や光学検出器を組み合わせたシステムが主に用いられてきた。カテコールアミン類は、電気化学活性が高く、光学検出に必要なラベル化のような前処理を必要としないため、電気化学検出は、カテコールアミン類の簡易測定において有効な検出手段といえる。例えば、液体クロマトグラフィーとくし型アレイ電極（特許文献１参照）を組み合わせたシステムでｐＭオーダーのカテコールアミン類（ドーパミン）が検出可能であることが報告されている（非特許文献１参照）。このほか、キャピラリー電気泳動と電気化学検出器を組み合わせたシステムについても多数報告されている。 In the medical / medical / biological fields, systems that combine liquid chromatography with electrochemical detectors and optical detectors have been mainly used for highly sensitive and selective detection of catecholamines. Since catecholamines have high electrochemical activity and do not require pretreatment such as labeling necessary for optical detection, electrochemical detection can be said to be an effective detection means for simple measurement of catecholamines. For example, it has been reported that pM-order catecholamines (dopamine) can be detected by a system combining liquid chromatography and a comb-type array electrode (see Patent Document 1) (see Non-Patent Document 1). In addition, many systems combining capillary electrophoresis and electrochemical detectors have been reported.

カテコールアミン類は、電極上で可逆的に酸化・還元する性質を有していることから、酸化・還元を繰り返すことにより、応答電流を増幅し、感度を向上させることができる。絶縁性の基板上に形成した一対のバンド電極アレイ上では、一方の電極に酸化電位を印加し、もう一方の電極に還元電位を印加することにより、高感度測定が実現されている。また、カテコールアミンの酸化還元反応を、酵素を用いて行わせ、同様な効果が得られることが報告されている（非特許文献２参照）。 Since catecholamines have the property of being reversibly oxidized / reduced on the electrode, repeating the oxidation / reduction can amplify the response current and improve the sensitivity. On a pair of band electrode arrays formed on an insulating substrate, high-sensitivity measurement is realized by applying an oxidation potential to one electrode and applying a reduction potential to the other electrode. In addition, it has been reported that a redox reaction of catecholamine is performed using an enzyme, and similar effects can be obtained (see Non-Patent Document 2).

一方、カテコールアミン類を生体試料中から選択的に検出するための手法として、カーボンファイバーを用いた微小電極型のセンサーでは、特に濃度の高いＬ−アスコルビン酸や尿酸などのアニオン性分子の影響を排除するために、ナフィオンや過酸化ポリピロールなどを用いてカーボンファイバー微小電極表面を修飾する。また、オンライン型のセンサーでは、検出電極の上流側に上記のアニオン性分子を分解するための反応器を設置することができ、連続的かつ選択的な測定を行うことができる（非特許文献３参照）。 On the other hand, as a method for selectively detecting catecholamines from biological samples, a microelectrode sensor using carbon fiber eliminates the influence of anionic molecules such as L-ascorbic acid and uric acid, which are particularly high in concentration. In order to do this, the surface of the carbon fiber microelectrode is modified with Nafion or peroxide polypyrrole. Moreover, in the on-line type sensor, a reactor for decomposing the anionic molecule can be installed upstream of the detection electrode, and continuous and selective measurement can be performed (Non-patent Document 3). reference).

また、上記のようなアニオン性分子の影響を抑制し、カテコールアミン類のようなカチオン性の分子を選択的に検出することができる電極について報告されている（非特許文献４参照）。 In addition, an electrode that suppresses the influence of the anionic molecules as described above and can selectively detect a cationic molecule such as catecholamines has been reported (see Non-Patent Document 4).

一方、光照射による誘起される電流、または電流印加による発光を目的とする光電気化学セルにおいて、その効率を向上させるために、光透過性電極と光不透過性電極とで形成されたくし型アレイ電極構造が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、特許文献２には、カテコールアミン類のようなカチオン性の分子の選択的電気化学的検出、およびその際のアニオン性分子の影響の抑制については、何ら教示されていない。 On the other hand, in a photoelectrochemical cell intended for light emission induced by light irradiation or light emission by current application, a comb array formed of a light-transmissive electrode and a light-impermeable electrode in order to improve the efficiency. An electrode structure has been proposed (see Patent Document 2). However, Patent Document 2 teaches nothing about selective electrochemical detection of cationic molecules such as catecholamines and suppression of the influence of anionic molecules.

特開平０９−２９２３６０号公報JP 09-292360 A 特開平０８−１９０９３９号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-190939 O. Niwa et al., J. Chromatogr. B, 670, 21-28(1995)O. Niwa et al., J. Chromatogr. B, 670, 21-28 (1995) F. Lisdat, et al., Biosensors and Bioelectronics, 12(12), 1199-1211(1997)F. Lisdat, et al., Biosensors and Bioelectronics, 12 (12), 1199-1211 (1997) K.Hayashi, et al., Electrochem, Comm., 5(12), 1037-1042(2003)K. Hayashi, et al., Electrochem, Comm., 5 (12), 1037-1042 (2003) 岩崎他、Review of Polarography, 50(3), 232 (2004)Iwasaki et al., Review of Polarography, 50 (3), 232 (2004)

カテコールアミン類は、生体内温度が低く（脳内数十ｎＭ、血液中１ｎＭ以下）、カーボンファイバーのように電極面積の小さいセンサーでは、応答電流が非常に小さくなり、感度が不十分であるという問題がある。 Catecholamines have a low in vivo temperature (several tens of nM in the brain and 1 nM or less in blood), and a sensor with a small electrode area such as carbon fiber has a problem that the response current is very small and the sensitivity is insufficient. There is.

このため、くし形のアレイ電極による応答の電気化学増幅法や、酵素を用いた増幅法がある。しかしながら、生体試料内には、Ｌ−アスコルビン酸などのアニオン性分子に加えて、ＤＯＰＡＣ（３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）などの電気化学特性が似たカテコールアミン類の代謝物のような夾雑物質が存在し、それらの濃度はカテコールアミン類の濃度よりも高い。したがって、くし型のアレイ電極は高感度であるものの、それら夾雑物質の応答に隠蔽されて、カテコールアミン類から得られる応答が検出できないという問題点がある。また、酵素増幅法では、生体内濃度以上のグルコース等の基質が必要であり、これらの溶液を試料に注入しなければならず、測定が煩雑である。 For this reason, there are an electrochemical amplification method using a comb-shaped array electrode and an amplification method using an enzyme. However, in biological samples, in addition to anionic molecules such as L-ascorbic acid, contaminants such as metabolites of catecholamines having similar electrochemical properties such as DOPAC (3,4-dihydroxyphenylacetic acid) are contained. Present and their concentration is higher than the concentration of catecholamines. Therefore, although the comb-shaped array electrode is highly sensitive, there is a problem that the response obtained from the catecholamines cannot be detected because it is masked by the response of these contaminants. In addition, the enzyme amplification method requires a substrate such as glucose at a concentration higher than that in the living body, and these solutions must be injected into the sample, which makes measurement complicated.

アニオン性分子であるＬ−アスコルビン酸もしくは尿酸、あるいはカテコールアミン類の代謝物の影響を抑制するためには、ナフィオン（登録商標）または過酸化ポリピロールの膜を電極上に形成する手法が用いられる。しかし、高濃度に存在する妨害物質を完全に除去するのは困難であり、また除去効率を上げるために、膜厚を増加させるとカテコールアミンの拡散も阻害され、感度が低下するという問題点がある。液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動のような分離技術と検出器を組み合わせることにより、夾雑物質の影響を受けずにカテコールアミン類を選択的に測定できるが、連続的に試料を導入することができないため、刻一刻と変化する病態、細胞応答、あるいは脳内物質の温度変化のモニターなどには適用できないという問題がある。 In order to suppress the influence of L-ascorbic acid or uric acid, which is an anionic molecule, or a metabolite of catecholamines, a technique of forming a film of Nafion (registered trademark) or polypyrrole peroxide on the electrode is used. However, it is difficult to completely remove high-concentration interfering substances, and there is a problem that increasing the film thickness inhibits the diffusion of catecholamines and lowers the sensitivity in order to increase the removal efficiency. . By combining a separation technique such as liquid chromatography or capillary electrophoresis with a detector, catecholamines can be selectively measured without being affected by contaminants, but samples cannot be introduced continuously. There is a problem that it cannot be applied to the monitoring of a condition that changes every moment, a cellular response, or a temperature change of a substance in the brain.

また、アニオン性の夾雑物質の応答を抑制することのできるインジウム酸化物、あるいはインジウム酸化物にスズをドープした電極上においては、カテコールアミンの酸化体が還元されにくいため、酸化・還元の反復による応答電流の増幅がなされず、高感度な測定が困難であるいう問題点かあった。 In addition, oxidization of catecholamines is difficult to reduce on indium oxide that can suppress the response of anionic impurities, or indium oxide doped with tin. There is a problem that current amplification is not performed and high-sensitivity measurement is difficult.

このような問題を解決するためには、本発明によるカテコールアミン類測定用電極、およびそれを用いた電気化学フローセルは、アニオン性分子の影響を抑制することのできる金属酸化物電極を有し、さらに該電極上で酸化されたカテコールアミン類を還元するための金属電極が設置され、該金属酸化物電極と該金属電極とが接近して配置されていることを特徴とし、簡便な方法で高感度かつ高選択的にカテコールアミン類を測定することができる。 In order to solve such a problem, an electrode for measuring catecholamines according to the present invention and an electrochemical flow cell using the same have a metal oxide electrode capable of suppressing the influence of anionic molecules, A metal electrode for reducing catecholamines oxidized on the electrode is installed, and the metal oxide electrode and the metal electrode are arranged close to each other, and is highly sensitive and easy to use. Catecholamines can be measured with high selectivity.

以上のような構成を採ることにより、本発明のカテコールアミン類測定用電極および電気化学セルは、以下のような効果を奏する。
（１）Ｌ−アスコルビン酸または尿酸のようなアニオン性分子、およびカテコールアミン類の代謝物の影響を排除する機能を有し、酸化・還元の反復によって、カテコールアミン類の検出における感度および選択性を向上させることができる。
（２）ガラスキャピラリー、チューブまたはマイクロダイアリシスプローブ（微小透析膜付プローブ）などの試料採取手段を用いることにより、クロマトグラフィーや電気泳動のような分離システムを必要とせず、生体または細胞から直接試料を採取して連続的に測定を行うことができる。 By adopting the configuration as described above, the catecholamines measuring electrode and electrochemical cell of the present invention have the following effects.
(1) It has a function to eliminate the influence of anionic molecules such as L-ascorbic acid or uric acid, and metabolites of catecholamines, and the sensitivity and selectivity in the detection of catecholamines are improved by repeated oxidation and reduction. Can be made.
(2) By using sample collection means such as glass capillaries, tubes, or microdialysis probes (probes with microdialysis membranes), a sample directly from a living body or cells without the need for a separation system such as chromatography or electrophoresis Can be taken and measured continuously.

本発明のカテコールアミン類の測定法は、第１作用電極および第２作用電極を含むカテコールアミン類測定用電極を微小流路内に集積した電気化学セルを用い、測定用試料を該微小流路に連続的に送液しながら測定を行うことを特徴とする。本測定法において、第１作用電極は金属酸化物を含み、カテコールアミン類の酸化を行う電極である。一方、第２作用電極は金属または炭素から形成され、第１作用電極で酸化されたカテコールアミン類の還元を行う電極である。本測定法において、前述の電気化学セルは、電気化学測定に必要な対向電極および参照電極をさらに含んでもよい。また、測定用試料の採取を、マイクロダイアリシスプローブ、ガラスキャピラリー、チューブを用いて実施することができる。 The method for measuring catecholamines of the present invention uses an electrochemical cell in which electrodes for measuring catecholamines including a first working electrode and a second working electrode are integrated in a microchannel, and a measurement sample is continuously connected to the microchannel. It is characterized in that the measurement is performed while the liquid is being fed. In this measurement method, the first working electrode contains a metal oxide and is an electrode that oxidizes catecholamines. On the other hand, the second working electrode is an electrode that is formed from metal or carbon and that reduces catecholamines oxidized by the first working electrode. In this measurement method, the aforementioned electrochemical cell may further include a counter electrode and a reference electrode necessary for electrochemical measurement. In addition, the measurement sample can be collected using a microdialysis probe, a glass capillary, or a tube.

第１作用電極に用いられる金属酸化物は、インジウム、スズ、亜鉛、イリジウム、チタン、アルミニウム、タングステンの酸化物、またはそれらの混合物であってもよい。これらの金属酸化物は、非晶質構造または微結晶構造を有していてもよい。 The metal oxide used for the first working electrode may be an oxide of indium, tin, zinc, iridium, titanium, aluminum, tungsten, or a mixture thereof. These metal oxides may have an amorphous structure or a microcrystalline structure.

第１作用電極は、前述の金属酸化物と金属との積層構造を有していてもよい。この積層構造において、カテコールアミン類の酸化を円滑に実施するために、少なくとも上表面が金属酸化物であることが望ましく、好ましくは上層として金属酸化物が用いられ、下層として金属が用いられる。積層構造中に用いる金属は低抵抗であることが望ましく、それによって電極全体の抵抗値を減少させ、カテコールアミン類の検出感度を向上させることが可能となる。積層構造中の金属としては、金、白金、銀、銅、アルミニウム、イリジウム、チタン、パラジウムおよびタングステンを用いることができる。 The first working electrode may have a laminated structure of the aforementioned metal oxide and metal. In this laminated structure, in order to smoothly oxidize catecholamines, at least the upper surface is desirably a metal oxide, preferably a metal oxide is used as an upper layer and a metal is used as a lower layer. It is desirable that the metal used in the laminated structure has a low resistance, thereby reducing the resistance value of the entire electrode and improving the detection sensitivity of catecholamines. Gold, platinum, silver, copper, aluminum, iridium, titanium, palladium, and tungsten can be used as the metal in the stacked structure.

第１作用電極は、平面状、くし型など当該技術において知られている任意の形状を有することができる。カテコールアミン類の検出感度を向上させるために、第１作用電極はくし型電極であることが望ましい。くし型電極は、幹部と、幹部から突出する複数の枝状部とで構成され、該複数の枝状部は並行して配列されている電極を意味する。 The first working electrode can have any shape known in the art, such as a planar shape or a comb shape. In order to improve the detection sensitivity of catecholamines, the first working electrode is preferably a comb-type electrode. The comb-shaped electrode is composed of a trunk portion and a plurality of branch portions protruding from the trunk portion, and the plurality of branch portions means an electrode arranged in parallel.

第２作用電極に用いられる金属は、金、白金、銀、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウム、タングステンまたはそれらの合金であることができる。 The metal used for the second working electrode can be gold, platinum, silver, copper, iridium, titanium, palladium, aluminum, tungsten, or an alloy thereof.

第２作用電極は、前述の金属酸化物と金属または炭素との積層構造を有していてもよい。この積層構造において、カテコールアミン類の還元を円滑に実施するために、少なくとも上表面が金属または炭素であることが望ましく、好ましくは上層として金属または炭素が用いられ、下層として金属酸化物が用いられる。積層構造中の金属酸化物としては、インジウム、スズ、亜鉛、イリジウム、チタン、アルミニウム、タングステンの酸化物、またはそれらの混合物を用いることができる。 The second working electrode may have a laminated structure of the above-described metal oxide and metal or carbon. In this laminated structure, in order to smoothly reduce the catecholamines, at least the upper surface is desirably a metal or carbon, preferably a metal or carbon is used as the upper layer and a metal oxide is used as the lower layer. As the metal oxide in the stacked structure, an oxide of indium, tin, zinc, iridium, titanium, aluminum, tungsten, or a mixture thereof can be used.

第２作用電極は、平面状、くし型など当該技術において知られている任意の形状を有することができる。カテコールアミン類の検出感度を向上させるために、第２作用電極はくし型電極であることが望ましい。 The second working electrode can have any shape known in the art, such as a planar shape or a comb shape. In order to improve the detection sensitivity of catecholamines, the second working electrode is preferably a comb-type electrode.

第１作用電極および第２作用電極がともにくし型電極である場合、それらを一対のくし型アレイ電極とすることが望ましい。一対のくし型アレイ電極とは、２つのくし型電極の幹部を並行させ、枝状部が交互に配置されるように配列された電極対を意味する。この構成においては、枝状部の交互配置領域の端部を除いて、第１作用電極の枝状部は、第２作用電極の２つの隣接する枝状部の間に配置され、第２作用電極の枝状部は、第１作用電極の２つの隣接する枝状部の間に配置される。カテコールアミン類の検出感度を向上させるためには、隣接する第１作用電極枝状部と第２作用電極枝状部との間隔は、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。 When the first working electrode and the second working electrode are both comb-type electrodes, it is desirable that they be a pair of comb-type array electrodes. A pair of comb-shaped array electrodes means an electrode pair in which trunk portions of two comb-shaped electrodes are arranged in parallel and branch portions are alternately arranged. In this configuration, except for the end of the alternate arrangement region of the branch portions, the branch portions of the first working electrode are disposed between two adjacent branch portions of the second working electrode, and the second action The electrode branch is disposed between two adjacent branches of the first working electrode. In order to improve the detection sensitivity of catecholamines, the distance between the adjacent first working electrode branch and the second working electrode branch is 0.05 to 5 μm, more preferably 0.05 to 1 μm. It is desirable.

あるいはまた、第１作用電極と第２作用電極とを絶縁膜を介して積層した構造を採ってもよい。たとえば、第１作用電極の上表面の一部の上に、絶縁膜および第２作用電極を積層し、第１作用電極の上表面の一部および第２作用電極の上表面を露出させる構成を採ってもよい。好ましくは、図４に示すように、絶縁性基板４１の上に第１作用電極４３を形成し、その上に形成される絶縁膜４３および第２作用電極４４を複数の部分に分割し、第２作用電極４４の２つの部分の間に第１作用電極４２の露出した上表面が配置された構造が、カテコールアミン類の検出感度を向上させる上で有効である。なお、上記の説明では、第１作用電極を下層、第２作用電極を上層とする構成を説明したが、第１作用電極を上層、第２作用電極を下層とする構成を採った場合でも同様の効果が得られる。この構成においては、第１作用電極４２と第２作用電極４４との間の間隔は絶縁層４３の膜厚によって決定されるので、絶縁層４３の絶縁破壊を起こさないことを条件として、それら電極間の間隔をより小さく設定することが可能となる。第１作用電極４２と第２作用電極４４との間の間隔（すなわち絶縁層４３の膜厚）は、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。 Or you may take the structure which laminated | stacked the 1st working electrode and the 2nd working electrode through the insulating film. For example, the insulating film and the second working electrode are stacked on a part of the upper surface of the first working electrode, and a part of the upper surface of the first working electrode and the upper surface of the second working electrode are exposed. May be taken. Preferably, as shown in FIG. 4, the first working electrode 43 is formed on the insulating substrate 41, the insulating film 43 and the second working electrode 44 formed thereon are divided into a plurality of parts, A structure in which the exposed upper surface of the first working electrode 42 is disposed between the two portions of the two working electrodes 44 is effective in improving the detection sensitivity of catecholamines. In the above description, the configuration in which the first working electrode is the lower layer and the second working electrode is the upper layer has been described, but the same applies to the configuration in which the first working electrode is the upper layer and the second working electrode is the lower layer. The effect is obtained. In this configuration, since the distance between the first working electrode 42 and the second working electrode 44 is determined by the film thickness of the insulating layer 43, these electrodes are provided on condition that the dielectric breakdown of the insulating layer 43 does not occur. It is possible to set the interval between them smaller. The distance between the first working electrode 42 and the second working electrode 44 (that is, the film thickness of the insulating layer 43) is preferably 0.05 to 5 μm, more preferably 0.05 to 1 μm.

第１作用電極および第２作用電極を含むカテコールアミン類測定用電極を微小流路内に集積した電気化学セルは、第１および第２の絶縁性基板を含み、それら絶縁性基板が貼り合わせられて、その間に微小流路が形成される。ここで、第１作用電極は、第１の絶縁性基板上に形成され、第２作用電極が第１または第２の絶縁性基板のいずれかの上に形成される。 An electrochemical cell in which electrodes for measuring catecholamines including a first working electrode and a second working electrode are integrated in a microchannel includes first and second insulating substrates, and these insulating substrates are bonded together. In the meantime, a microchannel is formed. Here, the first working electrode is formed on the first insulating substrate, and the second working electrode is formed on either the first or second insulating substrate.

第１および第２の絶縁性基板は、表面に酸化膜が形成されたシリコン、ガラス、セラミック、ポリマー（ポリエステル、ポリイミドなど）を用いて形成することができる。 The first and second insulating substrates can be formed using silicon, glass, ceramic, or polymer (polyester, polyimide, or the like) having an oxide film formed on the surface.

第２作用電極が、第１作用電極とともに第１の絶縁性基板の上に形成される場合、前述のように、第１作用電極および第２作用電極をともにくし型電極とし、それらを一対のくし型アレイ電極とすることが望ましい。カテコールアミン類の検出感度を向上させるためには、隣接する第１作用電極枝状部と第２作用電極枝状部との間隔は、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。また、試料の流路は、複数の第１作用電極枝状部および第２作用電極枝状部を横切る方向で試料が流れるように形成されることが望ましい。 When the second working electrode is formed on the first insulating substrate together with the first working electrode, as described above, the first working electrode and the second working electrode are both comb-shaped electrodes, and they are paired with each other. A comb array electrode is desirable. In order to improve the detection sensitivity of catecholamines, the distance between the adjacent first working electrode branch and the second working electrode branch is 0.05 to 5 μm, more preferably 0.05 to 1 μm. It is desirable. Further, it is desirable that the flow path of the sample is formed so that the sample flows in a direction crossing the plurality of first working electrode branch portions and the second working electrode branch portions.

あるいはまた、前述のように、第１作用電極と第２作用電極とを絶縁膜を介して積層した構造（図４参照）を採ってもよい。 Or as mentioned above, you may take the structure (refer FIG. 4) which laminated | stacked the 1st working electrode and the 2nd working electrode through the insulating film.

一方、第２作用電極が第２の絶縁性基板の上に形成される場合、第１作用電極および第２作用電極をともに平面状電極とし、それらを対向させて配置することが望ましい。この構成において、第１作用電極と第２作用電極との間隔を、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。 On the other hand, when the second working electrode is formed on the second insulating substrate, it is desirable that both the first working electrode and the second working electrode are planar electrodes, and they are arranged facing each other. In this configuration, the distance between the first working electrode and the second working electrode is preferably 0.05 to 5 μm, more preferably 0.05 to 1 μm.

本発明の測定法に用いられる電気化学セルは、第１作用電極および第２作用電極に加えて、対向電極および参照電極をさらに含んでもよい。対向電極は、金、白金、銀、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウム、タングステンまたはそれらの合金である金属を用いて作製することができる。参照電極は、金、白金、銀、銀／塩化銀、グラッシーカーボンのような当該技術で知られている任意の材料を用いて作製することができる。 The electrochemical cell used in the measurement method of the present invention may further include a counter electrode and a reference electrode in addition to the first working electrode and the second working electrode. The counter electrode can be manufactured using a metal that is gold, platinum, silver, copper, iridium, titanium, palladium, aluminum, tungsten, or an alloy thereof. The reference electrode can be made using any material known in the art, such as gold, platinum, silver, silver / silver chloride, glassy carbon.

本発明の測定法に用いられる電気化学セルは、試料導入口および試料排出口を設けてフローセルとして用いるのに好適な構造を有するものである。試料導入口に、試料採取用のガラスキャピラリー、マイクロダイアリシスプローブ（微小透析膜付プローブ）、あるいはチューブ（たとえばフッ素系チューブ）のような試料採取手段を用いて採取された試料を連続的に送液し、第１作用電極を第２作用電極よりも正の電位に設定することによって、カテコールアミンの測定を行うことが可能となる。本発明の測定法においては、第１作用電極を０〜＋８００ｍＶ（標準電極電位を基準とする）の電位に、第２作用電極を−６００〜０ｍＶ（標準電極電位を基準とする）の電位に設定することが望ましい。これらによって、本発明の測定法において、クロマトグラフィーあるいは電気泳動のような分離システムを必要とせずに、生体または細胞から試料を直接的に採取して、連続的に測定を行うことが可能となる。 The electrochemical cell used in the measurement method of the present invention has a structure suitable for use as a flow cell by providing a sample inlet and a sample outlet. Samples collected using sample collection means such as a glass capillary for sample collection, a microdialysis probe (probe with a microdialysis membrane), or a tube (for example, a fluorine-based tube) are continuously sent to the sample inlet. It is possible to measure catecholamines by setting the first working electrode to a higher potential than the second working electrode. In the measurement method of the present invention, the first working electrode is set to a potential of 0 to +800 mV (referenced to the standard electrode potential), and the second working electrode is set to a potential of −600 to 0 mV (referenced to the standard electrode potential). It is desirable to set. Thus, in the measurement method of the present invention, it is possible to directly take a sample from a living body or a cell without requiring a separation system such as chromatography or electrophoresis, and perform continuous measurement. .

本発明の測定法に用いられるカテコールアミン類測定用電極の製造方法の一例は、一対のくし型アレイ電極であるカテコールアミン類測定用電極を製造する方法であり、ここで第１作用電極が金属酸化物であり、第２作用電極が金属または炭素と金属酸化物との積層体である。本方法は、一対のくし型アレイ電極のパターンを有する金属酸化物薄膜と、金属または炭素薄膜（以下、金属薄膜と称する）との積層体を形成し、一方のくし型電極パターンを構成する積層体から金属または炭素薄膜を除去することによって、金属酸化物薄膜からなる第１作用電極を形成し、他方の積層体を第２作用電極とすることを特徴とする。図２を参照して、本実施形態の方法を説明する。 An example of a method for producing an electrode for measuring catecholamines used in the measurement method of the present invention is a method for producing an electrode for measuring catecholamines which is a pair of comb-type array electrodes, wherein the first working electrode is a metal oxide. The second working electrode is a laminate of metal or carbon and metal oxide. The present method forms a laminate of a metal oxide thin film having a pair of comb array electrode patterns and a metal or carbon thin film (hereinafter referred to as a metal thin film), and constitutes one comb electrode pattern. A first working electrode made of a metal oxide thin film is formed by removing a metal or carbon thin film from the body, and the other laminate is used as a second working electrode. With reference to FIG. 2, the method of the present embodiment will be described.

一対のくし型アレイ電極のパターンを有する金属酸化物薄膜と金属または炭素薄膜との積層体の形成は、たとえば、図２（ａ）に示すような絶縁性基板１１上に一対のくし型アレイ電極のパターンの開口部を有するリフトオフレジスト２１を形成し（図２（ｂ））、絶縁性基板２１上に金属酸化物薄膜２２を積層し、ついで金属酸化物薄膜２２上に金属薄膜２３を積層し（図２（ｃ））、前記リフトオフレジストを除去して、金属酸化物薄膜と金属薄膜の積層体からなる一対のくし型アレイ電極を形成する（図２（ｄ））、いわゆるリフトオフ法を用いて実施することができる。リフトオフ法を用いる場合、金属酸化物薄膜のエッチングを必要としないという利点を有する。 Formation of a laminate of a metal oxide thin film having a pattern of a pair of comb array electrodes and a metal or carbon thin film is performed, for example, on a pair of comb array electrodes on an insulating substrate 11 as shown in FIG. A lift-off resist 21 having an opening of the pattern is formed (FIG. 2B), a metal oxide thin film 22 is laminated on the insulating substrate 21, and then a metal thin film 23 is laminated on the metal oxide thin film 22. (FIG. 2 (c)), the lift-off resist is removed to form a pair of comb array electrodes made of a laminate of a metal oxide thin film and a metal thin film (FIG. 2 (d)), using a so-called lift-off method. Can be implemented. When the lift-off method is used, there is an advantage that etching of the metal oxide thin film is not required.

次いで、検出に用いられる一対のくし型アレイ電極を形成する部分を除いてフォトレジスト１７を用いて被覆し（図２（ｅ））、検出に用いられる一対のくし型アレイ電極の一方のくし型電極の金属薄膜を溶解させて、金属酸化物薄膜を露出させる（図２（ｆ））。金属薄膜の溶解は、電解質溶液に浸漬されたくし型電極に対して、正の電位を印加することによって実施することができる。該電解質溶液は、当該金属イオンを可溶化することができるイオンを含むことが望ましい。たとえば、金または白金を溶解させる場合には、電解質溶液が塩化物イオンを含むことが望ましい。 Next, a portion of the pair of comb-shaped array electrodes used for detection is covered with a photoresist 17 (FIG. 2 (e)), and one of the pair of comb-shaped array electrodes used for detection is comb-shaped. The metal thin film of the electrode is dissolved to expose the metal oxide thin film (FIG. 2 (f)). The dissolution of the metal thin film can be carried out by applying a positive potential to the comb electrode immersed in the electrolyte solution. The electrolyte solution desirably contains ions that can solubilize the metal ions. For example, when gold or platinum is dissolved, it is desirable that the electrolyte solution contains chloride ions.

本発明の測定法に用いられるカテコールアミン類測定用電極の製造方法の別の例は、カテコールアミン類測定用電極を製造する方法であり、ここで第１作用電極が金属酸化物であり、第２作用電極が金属または炭素であり、第１および第２作用電極が絶縁膜によって電気的に絶縁されていることを特徴とする。本方法は、絶縁性基板上に金属酸化物薄膜を形成する工程と、該金属酸化物薄膜上に絶縁層を形成する工程と、該絶縁層上に金属薄膜を形成する工程と、前記絶縁層および前記金属薄膜の一部を除去して前記金属酸化物薄膜の一部を露出させる工程とを含む。 Another example of the method for producing an electrode for measuring catecholamines used in the measurement method of the present invention is a method for producing an electrode for measuring catecholamines, wherein the first working electrode is a metal oxide and the second action The electrode is made of metal or carbon, and the first and second working electrodes are electrically insulated by an insulating film. The method includes the steps of: forming a metal oxide thin film on an insulating substrate; forming an insulating layer on the metal oxide thin film; forming a metal thin film on the insulating layer; And removing a part of the metal thin film to expose a part of the metal oxide thin film.

金属酸化物薄膜、絶縁膜および金属薄膜の積層は、スパッタ、蒸着、イオンビーム蒸着、イオンプレーティング、レーザーアブレーションなどの当該技術において知られている任意の技術を用いて実施することができる。 The lamination of the metal oxide thin film, the insulating film, and the metal thin film can be performed using any technique known in the art, such as sputtering, vapor deposition, ion beam vapor deposition, ion plating, and laser ablation.

次いで、絶縁層および金属薄膜の一部の除去は、スパッタエッチング、反応性イオンエッチング、イオンミリング、ウェットエッチングなどの当該技術において知られている任意の技術を用いて実施することができる。金属薄膜上に所定の形状を有するレジストマスクを形成することによって、所定の領域の絶縁層および金属薄膜を除去することができる。絶縁層および金属薄膜の除去は、１段階で行ってもよいし、あるいは２段階に分けて行ってもよい。２段階で行う場合には、工程が増加するものの、絶縁層および金属薄膜のそれぞれに対して最適な手法を用いることができる。たとえば、絶縁層としてＳｉＯ_２、金属薄膜として金を用いる場合、金の除去をイオンミリングにて行い、ＳｉＯ_２の除去を反応性イオンエッチングによって行ってもよい。 The removal of the insulating layer and part of the metal thin film can then be performed using any technique known in the art such as sputter etching, reactive ion etching, ion milling, wet etching and the like. By forming a resist mask having a predetermined shape on the metal thin film, the insulating layer and the metal thin film in a predetermined region can be removed. The removal of the insulating layer and the metal thin film may be performed in one step, or may be performed in two steps. In the case of performing in two steps, although the number of processes is increased, an optimum method can be used for each of the insulating layer and the metal thin film. For example, when SiO ₂ is used for the insulating layer and gold is used for the metal thin film, the gold may be removed by ion milling and the SiO ₂ may be removed by reactive ion etching.

以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In addition, this invention is not limited to a following example.

（実施例１）
図１に本発明のカテコールアミン類測定用電極の構成例を示す（図１）。熱酸化膜が形成されたシリコン基板１１に、インジウム酸化物からなる第１作用電極１２、金からなる第２作用電極１３、銀からなる参照電極１４、金からなる対向電極１５を形成した。第１作用電極１２および第２作用電極１３は、それぞれ、くし型電極であり、枝状部の電極幅は１０μｍであり、隣接する２つの枝状部の間隔は２０μｍであった。そして、これら第１作用電極１２および第２作用電極１３は、一対のくし型アレイ電極を形成しており、隣接する第１作用電極１２の枝状部と第２作用電極１３の枝状部との間隔が５μｍになるように配置されている。上記の各電極は、電気化学測定装置と接続するためのパッド１６に電気的に接続されている。第１作用電極１２の枝状部と第２作用電極１３の枝状部との交互配置領域１８およびパッド１６の領域を除いて、厚さ１μｍのフォトレジスト１７で覆われている。 Example 1
FIG. 1 shows a configuration example of an electrode for measuring catecholamines of the present invention (FIG. 1). A first working electrode 12 made of indium oxide, a second working electrode 13 made of gold, a reference electrode 14 made of silver, and a counter electrode 15 made of gold were formed on a silicon substrate 11 on which a thermal oxide film was formed. Each of the first working electrode 12 and the second working electrode 13 was a comb-shaped electrode, the electrode width of the branch portion was 10 μm, and the interval between two adjacent branch portions was 20 μm. The first working electrode 12 and the second working electrode 13 form a pair of comb array electrodes, and the branch portions of the first working electrode 12 and the branch portions of the second working electrode 13 that are adjacent to each other. Are arranged so that the distance between them becomes 5 μm. Each of the electrodes is electrically connected to a pad 16 for connection to an electrochemical measurement device. Except for the region 18 where the branches of the first working electrode 12 and the branches of the second working electrode 13 are alternately arranged and the region of the pad 16, the photoresist 17 is covered with a thickness of 1 μm.

上記のカテコールアミン類測定用電極の各電極をポテンシオスタットに接続した後に、交互配置領域１８を１００μＭのドーパミン溶液内に浸漬させた。第２作用電極１３の電位を０ｍＶに固定し、第１作用電極１２の電位を１０ｍＶ／ｓの速さで掃引したところ、＋４５０ｍＶ付近で電流値は定常値を示し、そのときの電流値は、２００ｎＡであった。 After each electrode of the catecholamines measurement electrode was connected to a potentiostat, the alternately arranged region 18 was immersed in a 100 μM dopamine solution. When the potential of the second working electrode 13 was fixed at 0 mV and the potential of the first working electrode 12 was swept at a speed of 10 mV / s, the current value showed a steady value around +450 mV, and the current value at that time was 200 nA.

次に、ドーパミン溶液にアニオン性分子であるＬ−アスコルビン酸を終濃度が１００μＭとなるように混合し、同様な実験を行った。その結果、＋４５０ｍＶ付近の電流値は、２００ｎＡと変化が認められなかった。このように本発明によるカテコールアミン類測定用電極は、高感度で、かつ妨害物質の影響を受けずにドーパミンの検出を行うことができる。また、カテコールアミンの代謝物であるＤＯＰＡＣ、ホモバニリン酸などの妨害物質を用いて同様の試験を行ったところ、これら妨害物質の存在下においても、本発明のカテコールアミン類測定用電極は、ドーパミンのみに応答し、これら妨害物質に対しても応答しないことを確認した。 Next, L-ascorbic acid, which is an anionic molecule, was mixed with the dopamine solution so that the final concentration was 100 μM, and a similar experiment was performed. As a result, the current value near +450 mV did not change as 200 nA. Thus, the electrode for measuring catecholamines according to the present invention is highly sensitive and can detect dopamine without being affected by the interfering substance. In addition, when a similar test was performed using interfering substances such as DOPAC and homovanillic acid, which are metabolites of catecholamine, the catecholamine measuring electrode of the present invention responds only to dopamine even in the presence of these interfering substances. It was confirmed that they did not respond to these interfering substances.

加えて、第１作用電極１２として用いたインジウム酸化物に代えて、インジウム酸化物とスズとの混合物（ＩＴＯ）を用いても同様な結果が得られた。さらに、第２作用電極３の材料として、金に代えて、炭素、白金、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウム、タングステンを用いた場合でも同様な結果が得られた。 In addition, similar results were obtained when a mixture of indium oxide and tin (ITO) was used instead of the indium oxide used as the first working electrode 12. Furthermore, similar results were obtained when carbon, platinum, copper, iridium, titanium, palladium, aluminum, or tungsten was used as the material of the second working electrode 3 instead of gold.

（比較例１）
第１および第２作用電極１２および１３の両方がインジウム酸化物で形成されていることを除いて実施例１と同一であるカテコールアミン類測定用電極を用いて、実施例１と同様の試験を行った。本比較例のカテコールアミン類測定用電極を１００μＭのドーパミン溶液に浸漬させた場合には、１００ｎＡの電流値しか得られなかった。これは、第１作用電極１２で酸化されたドーパミンが、第２作用電極１３上で十分還元されなかったためである。 (Comparative Example 1)
The same test as in Example 1 was performed using the same catecholamine measurement electrode as in Example 1 except that both the first and second working electrodes 12 and 13 were made of indium oxide. It was. When the electrode for measuring catecholamines of this comparative example was immersed in a 100 μM dopamine solution, only a current value of 100 nA was obtained. This is because the dopamine oxidized at the first working electrode 12 was not sufficiently reduced on the second working electrode 13.

（実施例２）
本実施例は、図２に示される方法で製造される一対のくし型アレイ電極であるカテコールアミン類測定用電極に関し、ここで第１作用電極は金属酸化物から形成され、第２作用電極は金属または炭素と金属酸化物との積層体から形成される。 (Example 2)
This embodiment relates to a catecholamine measuring electrode which is a pair of comb array electrodes manufactured by the method shown in FIG. 2, wherein the first working electrode is formed of a metal oxide and the second working electrode is a metal. Or it forms from the laminated body of carbon and a metal oxide.

最初に、絶縁性のガラス基板上にくし形電極のパターンを有するリフトオフレジスト２１を形成した（図２（ｂ））。リフトオフレジスト２は、一対のくし型アレイ電極を形成する部位において、幅１０μｍの開口部を５μｍ間隔で有していた。その後、スパッタ法を用いて、金属酸化物薄膜（ＩＴＯ）２２、金属薄膜（金）２３の順に形成した（図２（ｃ））。この後、メチルエチルケトンを用いてリフトオフを行い、所定の形状を有するＩＴＯおよび金の積層体を形成する（図２（ｄ））。その後、電極として使用する部分と電気化学測定器と接続するのに必要なパッド部分以外をフォトレジスト１７によって被覆し絶縁する（図２（ｅ））。このようにして作製した電極をリン酸緩衝液（１５０ｍＭの塩化物イオンを含有する）に浸漬させ、電気化学測定器に接続する。参照電極として銀／塩化銀電極を、対向電極として白金線を用いた。くし形電極を形成している一方の電極のみに０〜１．０Ｖの範囲において、５００ｍＶ／ｓの速さで電位を掃引した。金の溶解に起因する電流が観測されなくなるまで電位を掃引した。このようにして、一方の電極がＩＴＯ、もう一方の電極が金であるくし形電極を作製することができた（図２（ｆ））。 First, a lift-off resist 21 having a comb electrode pattern was formed on an insulating glass substrate (FIG. 2B). The lift-off resist 2 has openings having a width of 10 μm at intervals of 5 μm at the portions where the pair of comb array electrodes are formed. Thereafter, a metal oxide thin film (ITO) 22 and a metal thin film (gold) 23 were formed in this order by sputtering (FIG. 2C). Thereafter, lift-off is performed using methyl ethyl ketone to form a laminate of ITO and gold having a predetermined shape (FIG. 2D). Thereafter, the part used as an electrode and the pad part other than the pad part necessary for connection to the electrochemical measuring instrument are covered with the photoresist 17 and insulated (FIG. 2 (e)). The electrode thus prepared is immersed in a phosphate buffer (containing 150 mM chloride ions) and connected to an electrochemical measuring instrument. A silver / silver chloride electrode was used as a reference electrode, and a platinum wire was used as a counter electrode. The potential was swept at a speed of 500 mV / s in the range of 0 to 1.0 V only on one electrode forming the comb-shaped electrode. The potential was swept until no current due to gold dissolution was observed. In this manner, a comb-shaped electrode in which one electrode was ITO and the other electrode was gold could be produced (FIG. 2 (f)).

またＩＴＯ薄膜の下層に金属層を設け、電気抵抗を低減させる場合には、Ｃの工程の際、ＩＴＯ薄膜を形成する前に金属層を形成するとよい。 When a metal layer is provided below the ITO thin film to reduce the electrical resistance, the metal layer may be formed before forming the ITO thin film in the step C.

（実施例３）
本実施例は、図４に示すように絶縁層を介して金属酸化物電極と金属電極を積層し、互いに近接させたカテコールアミン類測定用電極に関する。 (Example 3)
This example relates to an electrode for measuring catecholamines in which a metal oxide electrode and a metal electrode are laminated via an insulating layer as shown in FIG.

最初に、絶縁性ガラス基板４１上に、スパッタ法により膜厚０．０５μｍのＩＴＯを積層して金属酸化物薄膜４２を形成した。次に、スパッタ法により膜厚１μｍの酸化シリコンを積層して絶縁層４３を形成し、さらに膜厚０．１μｍの金を積層し金属薄膜４４を形成した。金属薄膜４４上にフォトレジストをスピンコートし、次いでパターニングを行って幅１０μｍ、間隔５μｍで配列される複数の開口部を形成した。次に、アルゴンガスを用いたイオンミリングを行って、開口部の金属薄膜４４を除去し、次いで四フッ化炭素ガスを用いる反応性イオンエッチングにて、開口部の絶縁層４３を除去して金属酸化物薄膜４２を露出させた。 Initially, a metal oxide thin film 42 was formed on an insulating glass substrate 41 by laminating ITO having a thickness of 0.05 μm by sputtering. Next, an insulating layer 43 was formed by laminating silicon oxide having a thickness of 1 μm by sputtering, and further a metal thin film 44 was formed by laminating gold having a thickness of 0.1 μm. Photoresist was spin-coated on the metal thin film 44, and then patterned to form a plurality of openings arranged with a width of 10 μm and an interval of 5 μm. Next, ion milling using argon gas is performed to remove the metal thin film 44 in the opening, and then the insulating layer 43 in the opening is removed by reactive ion etching using carbon tetrafluoride gas to remove the metal. The oxide thin film 42 was exposed.

複数の露出部を有する金属酸化物薄膜４２を第１作用電極として用い、複数の部分に分割された金属薄膜４４を電気的に接続して第２作用電極として用いた。以上のように作製した電極を用いて、以下の実験を行った。なお、参照電極として市販の銀／塩化銀電極を、対向電極として白金線を使用した。 A metal oxide thin film 42 having a plurality of exposed portions was used as a first working electrode, and a metal thin film 44 divided into a plurality of portions was electrically connected to be used as a second working electrode. The following experiment was conducted using the electrode produced as described above. A commercially available silver / silver chloride electrode was used as the reference electrode, and a platinum wire was used as the counter electrode.

最初に、１００μＭのドーパミン溶液内に作製した電極を浸漬させた。それぞれの電極を、ポテンシオスタットに接続した。金属薄膜４４（第２作用電極、金）には０ｍＶの電位を印加し、金属酸化物薄膜４２（第１作用電極、ＩＴＯ）の電位を１０ｍＶ／ｓの速さで掃引した。金属酸化物薄膜４２に＋４５０ｍＶの電位を印加した際に、電流は最大値を示し、そのときの電流値は、約４００ｎＡであった。 First, the prepared electrode was immersed in a 100 μM dopamine solution. Each electrode was connected to a potentiostat. A potential of 0 mV was applied to the metal thin film 44 (second working electrode, gold), and the potential of the metal oxide thin film 42 (first working electrode, ITO) was swept at a speed of 10 mV / s. When a potential of +450 mV was applied to the metal oxide thin film 42, the current showed a maximum value, and the current value at that time was about 400 nA.

次に、１００μＭのドーパミン溶液に対して、尿酸およびアスコルビン酸を終濃度がそれぞれ４００μＭ、１００μＭとなるように混合して同様な実験を行った。その結果、４５０ｍＶ付近の電流値は、尿酸およびアスコルビン酸のいずれを混合した場合であっても４００ｎＡと変化が認められなかった。 Next, a similar experiment was performed by mixing uric acid and ascorbic acid with a 100 μM dopamine solution so that the final concentrations were 400 μM and 100 μM, respectively. As a result, the current value in the vicinity of 450 mV did not change to 400 nA even when either uric acid or ascorbic acid was mixed.

以上のように、本実施例における電極においても選択的にカテコールアミン類を測定することができた。また本電極構造では、絶縁層を薄層化することによって、金属酸化物電極と金属電極の距離をより接近させて、より高感度の測定が可能であるという利点を有する。 As described above, catecholamines could be selectively measured also in the electrode of this example. In addition, the present electrode structure has an advantage that by making the insulating layer thinner, the distance between the metal oxide electrode and the metal electrode can be made closer, and measurement with higher sensitivity is possible.

（実施例４）
ガラス基板３１上に、スパッタ法にて膜厚０．１μｍのＩＴＯを積層し、電極部分およびパッド部分を除いてフォトレジスト３２を用いて被覆して、第１作用電極３３（電極面積１ｍｍ^２）を形成した。 (Example 4)
An ITO film having a thickness of 0.1 μm is laminated on the glass substrate 31 by a sputtering method, covered with a photoresist 32 except for an electrode portion and a pad portion, and a first working electrode 33 (electrode area 1 mm ² ). Formed.

別個のガラス基板３４に対して、スパッタ法にて膜厚０．１μｍの金を積層して第２作用電極３５（電極面積１ｍｍ^２）を形成し、またスパッタ法にて膜厚０．１μｍの銀を積層して参照電極３６（電極面積１ｍｍ^２）を形成した。ガラス基板３４の周囲に紫外線硬化樹脂３７を塗布し、第２作用電極３５と第１作用電極３３とを対向させて配置して２つのガラス基板３１および３４を貼り合わせて、試料溶液を流すための流路３９（幅１ｍｍ、深さ５μｍ）をフォトレジストを用いて形成して、図３に示す電気化学セルを形成した。このため、第１作用電極３３表面と第２作用電極３５表面との距離は５μｍであった。ガラス基板３４に、試料溶液の導入および排出のための孔をあけ、それぞれに対してチューブ３８ａおよび３８ｂを接続した。 On a separate glass substrate 34, gold having a thickness of 0.1 μm is laminated by sputtering to form a second working electrode 35 (electrode area 1 mm ² ), and also having a thickness of 0.1 μm by sputtering. A reference electrode 36 (electrode area 1 mm ² ) was formed by laminating silver. To apply a UV curable resin 37 around the glass substrate 34, arrange the second working electrode 35 and the first working electrode 33 to face each other, and bond the two glass substrates 31 and 34 to flow the sample solution. The channel 39 (width 1 mm, depth 5 μm) was formed using a photoresist, and the electrochemical cell shown in FIG. 3 was formed. For this reason, the distance between the surface of the first working electrode 33 and the surface of the second working electrode 35 was 5 μm. Holes for introducing and discharging the sample solution were made in the glass substrate 34, and tubes 38a and 38b were connected to each.

チューブ３８ａから、流路３９、チューブ３８ｂに向かって、流速０．５μｌ／ｍｉｎでリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を流し、そして各電極をポテンシオスタット（ＡＬＳ８０２、ＣＨｉ）と接続し、第１作用電極３３には、＋４００ｍＶの電位を印加した。 A phosphate buffer solution (PBS) is flowed from the tube 38a toward the flow path 39 and the tube 38b at a flow rate of 0.5 μl / min, and each electrode is connected to a potentiostat (ALS802, CHi). A potential of +400 mV was applied to the electrode 33.

ＰＢＳに代えて１００μＭのドーパミン溶液を導入したところ、２００ｎＡの応答電流が得られた。また、１００μＭの尿酸溶液を導入したところ、有意の応答電流は観測されなかった。 When a 100 μM dopamine solution was introduced instead of PBS, a response current of 200 nA was obtained. When a 100 μM uric acid solution was introduced, no significant response current was observed.

以上のように、電気化学セル内において、一方の基板上の金属酸化物からなる第１作用電極と、他方の基板上の金属からなる第２作用電極とを近接させることにより、ドーパミンの応答を増幅することができ、かつ尿酸の影響を受けずに測定を行うことができた。 As described above, in the electrochemical cell, the first working electrode made of the metal oxide on one substrate and the second working electrode made of the metal on the other substrate are brought close to each other so that the response of dopamine is achieved. It was possible to amplify and measure without being affected by uric acid.

（比較例２）
実施例４と同様に電極を形成したガラス基板３１および３４を、参照電極３６と第１作用電極３３とが対向するような配置で貼り合わせた電気化学セルを作製した。本比較例の電気化学セルに、実施例４と同様の条件下で１００μＭのドーパミン溶液を導入したところ、得られた応答電流は１００ｎＡに低下した。 (Comparative Example 2)
An electrochemical cell was produced in which glass substrates 31 and 34 having electrodes formed in the same manner as in Example 4 were bonded together so that the reference electrode 36 and the first working electrode 33 face each other. When a 100 μM dopamine solution was introduced into the electrochemical cell of this comparative example under the same conditions as in Example 4, the obtained response current decreased to 100 nA.

この結果は、実施例４においては、第１作用電極３３と第２作用電極３５との間隔が５μｍと狭いために、それら電極間においてドーパミンが酸化・還元を繰り返して、応答電流値が増幅されているのに対して、本比較例においては、それら電極間の距離が離れたために応答電流値の増幅が十分に行われなかったためと考えられる。 As a result, in Example 4, since the distance between the first working electrode 33 and the second working electrode 35 is as narrow as 5 μm, dopamine repeatedly oxidizes and reduces between these electrodes, and the response current value is amplified. On the other hand, in this comparative example, it is considered that the response current value was not sufficiently amplified because the distance between the electrodes was increased.

（比較例３）
第２作用電極を形成するのにＩＴＯを用いたことを除いて、実施例４と同様の手順を用いて電気化学セルを作製した。本比較例の電気化学セルに、実施例４と同様の条件下で１００μＭのドーパミン溶液を導入したところ、得られた応答電流は１２０ｎＡに低下した。 (Comparative Example 3)
An electrochemical cell was made using the same procedure as in Example 4 except that ITO was used to form the second working electrode. When a 100 μM dopamine solution was introduced into the electrochemical cell of this comparative example under the same conditions as in Example 4, the obtained response current decreased to 120 nA.

これは、ＩＴＯで形成された第２作用電極３５において、ドーパミンの還元が円滑に進行せず、応答電流値の増幅が十分に行われなかったためと考えられる。 This is probably because the reduction of dopamine did not proceed smoothly in the second working electrode 35 made of ITO, and the response current value was not sufficiently amplified.

（実施例５）
実施例１のカテコールアミン類測定用電極と、流路用スペーサー（厚さ５０μｍ）、流路部分、封止用ガラス基板および試料導入部を組み合わせて、本発明によるフローセルを構成した。試料導入部をシリンジポンプに接続した。各電極は、電気化学測定装置（ＡＬＳ８０２、ＣＨｉ）と接続した。銀からなる参照電極１４を標準として、インジウム酸化物からなる第１作用電極１２に＋４００ｍＶ、金からなる第２作用電極１３に−２００ｍＶの電位を印加した。応答電流の測定データを、コンピューターに保存した。 (Example 5)
The flow cell according to the present invention was configured by combining the catecholamine measurement electrode of Example 1, the flow path spacer (thickness 50 μm), the flow path portion, the sealing glass substrate, and the sample introduction portion. The sample introduction part was connected to a syringe pump. Each electrode was connected to an electrochemical measurement device (ALS802, CHi). Using a reference electrode 14 made of silver as a standard, a potential of +400 mV was applied to the first working electrode 12 made of indium oxide, and −200 mV was applied to the second working electrode 13 made of gold. The response current measurement data was stored in a computer.

最初に、シリンジポンプからリン酸緩衝液をフローセルに導入し、ベースラインを安定するのを確認した。次いで、シリンジポンプから１０ｎＭのノルアドレナリン溶液をフローセルに導入したところ、０．３ｎＡの応答電流を観測した。さらに、シリンジポンプから、１０ｎＭのノルアドレナリンと１００μＭの尿酸との混合溶液をフローセルに導入した場合にも、同じく０．３ｎＡの応答電流を観測した。 First, a phosphate buffer was introduced from the syringe pump into the flow cell, and it was confirmed that the baseline was stabilized. Subsequently, when a 10 nM noradrenaline solution was introduced from the syringe pump into the flow cell, a response current of 0.3 nA was observed. Further, when a mixed solution of 10 nM noradrenaline and 100 μM uric acid was introduced into the flow cell from the syringe pump, a response current of 0.3 nA was also observed.

以上の結果から、本発明のカテコールアミン類測定用電極は、尿酸の影響を受けずにノルアドレナリンのみを選択的かつ高感度に測定を行うことができることが明らかとなった。 From the above results, it has been clarified that the catecholamines measuring electrode of the present invention can selectively and highly sensitively measure noradrenaline without being affected by uric acid.

本発明の第１の実施形態のカテコールアミン類測定用電極の一例を示す図であり、（ａ）は上面図であり、（ｂ）は切断線Ｉｂ−Ｉｂにおける断面図である。It is a figure which shows an example of the electrode for catecholamines measurement of the 1st Embodiment of this invention, (a) is a top view, (b) is sectional drawing in cutting | disconnection line Ib-Ib. 本発明の第２の実施形態のカテコールアミン類測定用電極の製造方法を示す図であり、（ａ）〜（ｆ）は、各工程を示す図である。It is a figure which shows the manufacturing method of the electrode for catecholamines measurement of the 2nd Embodiment of this invention, (a)-(f) is a figure which shows each process. 本発明によるフローセルの一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the flow cell by this invention. 本発明のカテコールアミン類測定用電極の別の例を示す断面図である。It is sectional drawing which shows another example of the electrode for catecholamines measurement of this invention.

符号の説明Explanation of symbols

１１、３１、３４、４１絶縁性基板
１２、３３、４２第１作用電極
１３、３５、４４第２作用電極
１４、３６参照電極
１５対向電極
１６（ａ〜ｄ）パッド
１７、３２フォトレジスト
１８交互配置領域
２１リフトオフレジスト
２２金属酸化物薄膜
２３金属薄膜
３２フォトレジスト
３７紫外線硬化樹脂
３８（ａ，ｂ）チューブ
３９流路
４３絶縁層 11, 31, 34, 41 Insulating substrate 12, 33, 42 First working electrode 13, 35, 44 Second working electrode 14, 36 Reference electrode 15 Counter electrode 16 (ad) Pad 17, 32 Photoresist 18 Alternate Arrangement area 21 Lift-off resist 22 Metal oxide thin film 23 Metal thin film 32 Photo resist 37 UV curable resin 38 (a, b) Tube 39 Flow path 43 Insulating layer

Claims

カテコールアミン類を酸化するための金属酸化物を含む第１作用電極と、第１作用電極に近接し、酸化されたカテコールアミン類を還元するための金属または炭素から形成される第２作用電極とを微小流路内に集積した電気化学セルを用い、測定用試料を該微小流路に連続的に送液しながら測定を行うことを特徴とするカテコールアミン類の測定法。 A first working electrode including a metal oxide for oxidizing catecholamines and a second working electrode formed from metal or carbon adjacent to the first working electrode and used to reduce oxidized catecholamines are finely divided. A method for measuring catecholamines, comprising using an electrochemical cell integrated in a flow channel and performing measurement while continuously feeding a measurement sample to the micro flow channel.

前記電気化学セルが、電気化学測定に必要な対向電極および参照電極をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のカテコールアミン類の測定法。 The method for measuring catecholamines according to claim 1, wherein the electrochemical cell further includes a counter electrode and a reference electrode necessary for electrochemical measurement.

前記測定用試料が、マイクロダイアリシスプローブ、ガラスキャピラリー、チューブを用いて採取されることを特徴とする請求項１に記載のカテコールアミン類の測定法。 The method for measuring catecholamines according to claim 1, wherein the measurement sample is collected using a microdialysis probe, a glass capillary, or a tube.

金属酸化物を含む第１作用電極と、金属または炭素から形成される第２作用電極とを含むことを特徴とするカテコールアミン類測定用電極。 An electrode for measuring catecholamines, comprising: a first working electrode containing a metal oxide; and a second working electrode formed of metal or carbon.

前記金属酸化物が、インジウム、スズ、亜鉛、イリジウム、チタン、アルミニウム、タングステンおよびそれらの混合物からなる群から選択される金属の酸化物であることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。 The catecholamines measurement according to claim 4, wherein the metal oxide is an oxide of a metal selected from the group consisting of indium, tin, zinc, iridium, titanium, aluminum, tungsten, and a mixture thereof. Electrode.

前記金属酸化物が非晶質または微結晶構造を有していることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。 The electrode for measuring catecholamines according to claim 4, wherein the metal oxide has an amorphous or microcrystalline structure.

前記第２作用電極を形成する金属が、金、白金、銀、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウムおよびタングステンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。 The metal for forming the second working electrode is selected from the group consisting of gold, platinum, silver, copper, iridium, titanium, palladium, aluminum, and tungsten, for measuring catecholamines according to claim 4. electrode.

前記第１作用電極が、下層の金属と、上層の前記金属酸化物との積層体であることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。 The catecholamines measuring electrode according to claim 4, wherein the first working electrode is a laminate of a lower layer metal and the upper layer metal oxide.

前記第１作用電極および前記第２作用電極が一対のくし型アレイ電極を形成していることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。 The catecholamines measurement electrode according to claim 4, wherein the first working electrode and the second working electrode form a pair of comb array electrodes.

前記第１作用電極の上表面の一部の上に形成された絶縁膜をさらに含み、前記絶縁膜上に前記第２作用電極が形成されていることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。 The catecholamine according to claim 4, further comprising an insulating film formed on a part of the upper surface of the first working electrode, wherein the second working electrode is formed on the insulating film. Measurement electrode.

第１および第２の絶縁性基板、および請求項４から８のいずれかに記載のカテコールアミン類測定用電極を含み、前記第１作用電極が第１の絶縁性基板上に形成され、前記第２作用電極が第１または第２の絶縁性基板の上に形成され、前記第１および第２の絶縁性基板が貼り合わせられて、その間に微小流路が形成されていることを特徴とする電気化学セル。 A first and second insulating substrates, and the catecholamine measurement electrode according to claim 4, wherein the first working electrode is formed on the first insulating substrate, and the second A working electrode is formed on the first or second insulating substrate, the first and second insulating substrates are bonded together, and a microchannel is formed therebetween. Chemical cell.

前記第２作用電極が第１の絶縁性基板上に形成されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。 12. The electrochemical cell according to claim 11, wherein the second working electrode is formed on a first insulating substrate.

前記第１作用電極および前記第２作用電極が一対のくし型アレイ電極を形成していることを特徴とする請求項１２に記載の電気化学セル。 The electrochemical cell according to claim 12, wherein the first working electrode and the second working electrode form a pair of comb array electrodes.

前記第２作用電極が第２の絶縁性基板上に形成されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。 The electrochemical cell according to claim 11, wherein the second working electrode is formed on a second insulating substrate.

前記第１作用電極の上表面の一部の上に形成された絶縁膜をさらに含み、前記絶縁膜上に前記第２作用電極が形成されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。 12. The electricity according to claim 11, further comprising an insulating film formed on a part of the upper surface of the first working electrode, wherein the second working electrode is formed on the insulating film. Chemical cell.

対向電極および参照電極をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。 The electrochemical cell according to claim 11, further comprising a counter electrode and a reference electrode.

試料採取用のガラスキャピラリー、チューブおよびマイクロダイアリシスプローブからなる群から選択される１つまたは複数の試料採取手段が接続されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。 The electrochemical cell according to claim 11, wherein one or a plurality of sampling means selected from the group consisting of a glass capillary for sampling, a tube, and a microdialysis probe are connected.

絶縁性基板上に一対のくし型アレイ電極のパターンの開口部を有するリフトオフレジストを形成する工程と；前記絶縁性基板上に金属酸化物薄膜を形成する工程と；該金属酸化物薄膜上に金属薄膜を形成する工程と；前記リフトオフレジストを除去して、金属酸化物薄膜と金属薄膜の積層体からなる一対のくし型アレイ電極を形成する工程と；電極として用いる部分を残して、前記一対のくし型電極をフォトレジストにより被覆する工程と；一対のくし型アレイ電極の一方の積層体の金属薄膜を溶解させて、金属酸化物薄膜を露出させて第１作用電極を形成し、一対のくし型アレイ電極の他方が第２作用電極を形成する工程とを含むことを特徴とするカテコールアミン類測定用電極の製造方法。 Forming a lift-off resist having openings of a pair of comb array electrode patterns on an insulating substrate; forming a metal oxide thin film on the insulating substrate; and metal on the metal oxide thin film Forming a thin film; removing the lift-off resist to form a pair of comb-shaped array electrodes made of a laminate of a metal oxide thin film and a metal thin film; and leaving the portions used as electrodes, A step of coating the comb electrode with a photoresist; dissolving a metal thin film of one of the pair of comb array electrodes to expose the metal oxide thin film to form a first working electrode; A method of producing an electrode for measuring catecholamines, wherein the other of the mold array electrodes includes a step of forming a second working electrode.

絶縁性基板上に金属酸化物薄膜を形成する工程と、該金属酸化物薄膜上に絶縁層を形成する工程と、該絶縁層上に金属薄膜を形成する工程と、前記絶縁層および前記金属薄膜の一部を除去して前記金属酸化物薄膜の一部を露出させ、露出した金属酸化物薄膜が第１作用電極を形成し、残存する金属薄膜が第２作用電極を形成する工程とを含むことを特徴とするカテコールアミン類測定用電極の製造方法。
Forming a metal oxide thin film on an insulating substrate; forming an insulating layer on the metal oxide thin film; forming a metal thin film on the insulating layer; the insulating layer and the metal thin film Removing a part of the metal oxide film to expose a part of the metal oxide thin film, the exposed metal oxide thin film forming a first working electrode, and the remaining metal thin film forming a second working electrode. A method for producing an electrode for measuring catecholamines, wherein: