JP3990705B2 - カテコールアミン類の測定方法、および該方法に用いられるカテコールアミン類測定用電極およびその製造方法ならびに電気化学セル - Google Patents

Description

本発明は、生体内から微量の試料を採取し、その試料中に含まれるカテコールアミン類（ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン等のｏ−ジヒドロキシベンゼン骨格を有する生体アミン）を感度、選択性良く測定するための方法に関する。また、本発明は、前述の測定方法に用いられる医学、生理学用、あるいは医療用センシングデバイスに関する。

医学・医療、生物学分野では、カテコールアミン類の高感度・高選択検出には、主に液体クロマトグラフィーと電気化学検出器や光学検出器を組み合わせたシステムが主に用いられてきた。カテコールアミン類は、電気化学活性が高く、光学検出に必要なラベル化のような前処理を必要としないため、電気化学検出は、カテコールアミン類の簡易測定において有効な検出手段といえる。例えば、液体クロマトグラフィーとくし型アレイ電極（特許文献１参照）を組み合わせたシステムでｐＭオーダーのカテコールアミン類（ドーパミン）が検出可能であることが報告されている（非特許文献１参照）。このほか、キャピラリー電気泳動と電気化学検出器を組み合わせたシステムについても多数報告されている。

カテコールアミン類は、電極上で可逆的に酸化・還元する性質を有していることから、酸化・還元を繰り返すことにより、応答電流を増幅し、感度を向上させることができる。絶縁性の基板上に形成した一対のバンド電極アレイ上では、一方の電極に酸化電位を印加し、もう一方の電極に還元電位を印加することにより、高感度測定が実現されている。また、カテコールアミンの酸化還元反応を、酵素を用いて行わせ、同様な効果が得られることが報告されている（非特許文献２参照）。

一方、カテコールアミン類を生体試料中から選択的に検出するための手法として、カーボンファイバーを用いた微小電極型のセンサーでは、特に濃度の高いＬ−アスコルビン酸や尿酸などのアニオン性分子の影響を排除するために、ナフィオンや過酸化ポリピロールなどを用いてカーボンファイバー微小電極表面を修飾する。また、オンライン型のセンサーでは、検出電極の上流側に上記のアニオン性分子を分解するための反応器を設置することができ、連続的かつ選択的な測定を行うことができる（非特許文献３参照）。

また、上記のようなアニオン性分子の影響を抑制し、カテコールアミン類のようなカチオン性の分子を選択的に検出することができる電極について報告されている（非特許文献４参照）。

一方、光照射による誘起される電流、または電流印加による発光を目的とする光電気化学セルにおいて、その効率を向上させるために、光透過性電極と光不透過性電極とで形成されたくし型アレイ電極構造が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、特許文献２には、カテコールアミン類のようなカチオン性の分子の選択的電気化学的検出、およびその際のアニオン性分子の影響の抑制については、何ら教示されていない。

特開平０９−２９２３６０号公報 特開平０８−１９０９３９号公報 O. Niwa et al., J. Chromatogr. B, 670, 21-28(1995) F. Lisdat, et al., Biosensors and Bioelectronics, 12(12), 1199-1211(1997) K.Hayashi, et al., Electrochem, Comm., 5(12), 1037-1042(2003) 岩崎他、Review of Polarography, 50(3), 232 (2004)

カテコールアミン類は、生体内温度が低く（脳内数十ｎＭ、血液中１ｎＭ以下）、カーボンファイバーのように電極面積の小さいセンサーでは、応答電流が非常に小さくなり、感度が不十分であるという問題がある。

このため、くし形のアレイ電極による応答の電気化学増幅法や、酵素を用いた増幅法がある。しかしながら、生体試料内には、Ｌ−アスコルビン酸などのアニオン性分子に加えて、ＤＯＰＡＣ（３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）などの電気化学特性が似たカテコールアミン類の代謝物のような夾雑物質が存在し、それらの濃度はカテコールアミン類の濃度よりも高い。したがって、くし型のアレイ電極は高感度であるものの、それら夾雑物質の応答に隠蔽されて、カテコールアミン類から得られる応答が検出できないという問題点がある。また、酵素増幅法では、生体内濃度以上のグルコース等の基質が必要であり、これらの溶液を試料に注入しなければならず、測定が煩雑である。

アニオン性分子であるＬ−アスコルビン酸もしくは尿酸、あるいはカテコールアミン類の代謝物の影響を抑制するためには、ナフィオン（登録商標）または過酸化ポリピロールの膜を電極上に形成する手法が用いられる。しかし、高濃度に存在する妨害物質を完全に除去するのは困難であり、また除去効率を上げるために、膜厚を増加させるとカテコールアミンの拡散も阻害され、感度が低下するという問題点がある。液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動のような分離技術と検出器を組み合わせることにより、夾雑物質の影響を受けずにカテコールアミン類を選択的に測定できるが、連続的に試料を導入することができないため、刻一刻と変化する病態、細胞応答、あるいは脳内物質の温度変化のモニターなどには適用できないという問題がある。

また、アニオン性の夾雑物質の応答を抑制することのできるインジウム酸化物、あるいはインジウム酸化物にスズをドープした電極上においては、カテコールアミンの酸化体が還元されにくいため、酸化・還元の反復による応答電流の増幅がなされず、高感度な測定が困難であるいう問題点かあった。

このような問題を解決するためには、本発明によるカテコールアミン類測定用電極、およびそれを用いた電気化学フローセルは、アニオン性分子の影響を抑制することのできる金属酸化物電極を有し、さらに該電極上で酸化されたカテコールアミン類を還元するための金属電極が設置され、該金属酸化物電極と該金属電極とが接近して配置されていることを特徴とし、簡便な方法で高感度かつ高選択的にカテコールアミン類を測定することができる。

以上のような構成を採ることにより、本発明のカテコールアミン類測定用電極および電気化学セルは、以下のような効果を奏する。
（１）Ｌ−アスコルビン酸または尿酸のようなアニオン性分子、およびカテコールアミン類の代謝物の影響を排除する機能を有し、酸化・還元の反復によって、カテコールアミン類の検出における感度および選択性を向上させることができる。
（２）ガラスキャピラリー、チューブまたはマイクロダイアリシスプローブ（微小透析膜付プローブ）などの試料採取手段を用いることにより、クロマトグラフィーや電気泳動のような分離システムを必要とせず、生体または細胞から直接試料を採取して連続的に測定を行うことができる。

本発明のカテコールアミン類の測定法は、第１作用電極および第２作用電極を含むカテコールアミン類測定用電極を微小流路内に集積した電気化学セルを用い、測定用試料を該微小流路に連続的に送液しながら測定を行うことを特徴とする。本測定法において、第１作用電極は金属酸化物を含み、カテコールアミン類の酸化を行う電極である。一方、第２作用電極は金属または炭素から形成され、第１作用電極で酸化されたカテコールアミン類の還元を行う電極である。本測定法において、前述の電気化学セルは、電気化学測定に必要な対向電極および参照電極をさらに含んでもよい。また、測定用試料の採取を、マイクロダイアリシスプローブ、ガラスキャピラリー、チューブを用いて実施することができる。

第１作用電極に用いられる金属酸化物は、インジウム、スズ、亜鉛、イリジウム、チタン、アルミニウム、タングステンの酸化物、またはそれらの混合物であってもよい。これらの金属酸化物は、非晶質構造または微結晶構造を有していてもよい。

第１作用電極は、前述の金属酸化物と金属との積層構造を有していてもよい。この積層構造において、カテコールアミン類の酸化を円滑に実施するために、少なくとも上表面が金属酸化物であることが望ましく、好ましくは上層として金属酸化物が用いられ、下層として金属が用いられる。積層構造中に用いる金属は低抵抗であることが望ましく、それによって電極全体の抵抗値を減少させ、カテコールアミン類の検出感度を向上させることが可能となる。積層構造中の金属としては、金、白金、銀、銅、アルミニウム、イリジウム、チタン、パラジウムおよびタングステンを用いることができる。

第１作用電極は、平面状、くし型など当該技術において知られている任意の形状を有することができる。カテコールアミン類の検出感度を向上させるために、第１作用電極はくし型電極であることが望ましい。くし型電極は、幹部と、幹部から突出する複数の枝状部とで構成され、該複数の枝状部は並行して配列されている電極を意味する。

第２作用電極に用いられる金属は、金、白金、銀、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウム、タングステンまたはそれらの合金であることができる。

第２作用電極は、前述の金属酸化物と金属または炭素との積層構造を有していてもよい。この積層構造において、カテコールアミン類の還元を円滑に実施するために、少なくとも上表面が金属または炭素であることが望ましく、好ましくは上層として金属または炭素が用いられ、下層として金属酸化物が用いられる。積層構造中の金属酸化物としては、インジウム、スズ、亜鉛、イリジウム、チタン、アルミニウム、タングステンの酸化物、またはそれらの混合物を用いることができる。

第２作用電極は、平面状、くし型など当該技術において知られている任意の形状を有することができる。カテコールアミン類の検出感度を向上させるために、第２作用電極はくし型電極であることが望ましい。

第１作用電極および第２作用電極がともにくし型電極である場合、それらを一対のくし型アレイ電極とすることが望ましい。一対のくし型アレイ電極とは、２つのくし型電極の幹部を並行させ、枝状部が交互に配置されるように配列された電極対を意味する。この構成においては、枝状部の交互配置領域の端部を除いて、第１作用電極の枝状部は、第２作用電極の２つの隣接する枝状部の間に配置され、第２作用電極の枝状部は、第１作用電極の２つの隣接する枝状部の間に配置される。カテコールアミン類の検出感度を向上させるためには、隣接する第１作用電極枝状部と第２作用電極枝状部との間隔は、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。

あるいはまた、第１作用電極と第２作用電極とを絶縁膜を介して積層した構造を採ってもよい。たとえば、第１作用電極の上表面の一部の上に、絶縁膜および第２作用電極を積層し、第１作用電極の上表面の一部および第２作用電極の上表面を露出させる構成を採ってもよい。好ましくは、図４に示すように、絶縁性基板４１の上に第１作用電極４３を形成し、その上に形成される絶縁膜４３および第２作用電極４４を複数の部分に分割し、第２作用電極４４の２つの部分の間に第１作用電極４２の露出した上表面が配置された構造が、カテコールアミン類の検出感度を向上させる上で有効である。なお、上記の説明では、第１作用電極を下層、第２作用電極を上層とする構成を説明したが、第１作用電極を上層、第２作用電極を下層とする構成を採った場合でも同様の効果が得られる。この構成においては、第１作用電極４２と第２作用電極４４との間の間隔は絶縁層４３の膜厚によって決定されるので、絶縁層４３の絶縁破壊を起こさないことを条件として、それら電極間の間隔をより小さく設定することが可能となる。第１作用電極４２と第２作用電極４４との間の間隔（すなわち絶縁層４３の膜厚）は、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。

第１作用電極および第２作用電極を含むカテコールアミン類測定用電極を微小流路内に集積した電気化学セルは、第１および第２の絶縁性基板を含み、それら絶縁性基板が貼り合わせられて、その間に微小流路が形成される。ここで、第１作用電極は、第１の絶縁性基板上に形成され、第２作用電極が第１または第２の絶縁性基板のいずれかの上に形成される。

第１および第２の絶縁性基板は、表面に酸化膜が形成されたシリコン、ガラス、セラミック、ポリマー（ポリエステル、ポリイミドなど）を用いて形成することができる。

第２作用電極が、第１作用電極とともに第１の絶縁性基板の上に形成される場合、前述のように、第１作用電極および第２作用電極をともにくし型電極とし、それらを一対のくし型アレイ電極とすることが望ましい。カテコールアミン類の検出感度を向上させるためには、隣接する第１作用電極枝状部と第２作用電極枝状部との間隔は、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。また、試料の流路は、複数の第１作用電極枝状部および第２作用電極枝状部を横切る方向で試料が流れるように形成されることが望ましい。

あるいはまた、前述のように、第１作用電極と第２作用電極とを絶縁膜を介して積層した構造（図４参照）を採ってもよい。

一方、第２作用電極が第２の絶縁性基板の上に形成される場合、第１作用電極および第２作用電極をともに平面状電極とし、それらを対向させて配置することが望ましい。この構成において、第１作用電極と第２作用電極との間隔を、０．０５〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜１μｍとすることが望ましい。

本発明の測定法に用いられる電気化学セルは、第１作用電極および第２作用電極に加えて、対向電極および参照電極をさらに含んでもよい。対向電極は、金、白金、銀、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウム、タングステンまたはそれらの合金である金属を用いて作製することができる。参照電極は、金、白金、銀、銀／塩化銀、グラッシーカーボンのような当該技術で知られている任意の材料を用いて作製することができる。

本発明の測定法に用いられる電気化学セルは、試料導入口および試料排出口を設けてフローセルとして用いるのに好適な構造を有するものである。試料導入口に、試料採取用のガラスキャピラリー、マイクロダイアリシスプローブ（微小透析膜付プローブ）、あるいはチューブ（たとえばフッ素系チューブ）のような試料採取手段を用いて採取された試料を連続的に送液し、第１作用電極を第２作用電極よりも正の電位に設定することによって、カテコールアミンの測定を行うことが可能となる。本発明の測定法においては、第１作用電極を０〜＋８００ｍＶ（標準電極電位を基準とする）の電位に、第２作用電極を−６００〜０ｍＶ（標準電極電位を基準とする）の電位に設定することが望ましい。これらによって、本発明の測定法において、クロマトグラフィーあるいは電気泳動のような分離システムを必要とせずに、生体または細胞から試料を直接的に採取して、連続的に測定を行うことが可能となる。

本発明の測定法に用いられるカテコールアミン類測定用電極の製造方法の一例は、一対のくし型アレイ電極であるカテコールアミン類測定用電極を製造する方法であり、ここで第１作用電極が金属酸化物であり、第２作用電極が金属または炭素と金属酸化物との積層体である。本方法は、一対のくし型アレイ電極のパターンを有する金属酸化物薄膜と、金属または炭素薄膜（以下、金属薄膜と称する）との積層体を形成し、一方のくし型電極パターンを構成する積層体から金属または炭素薄膜を除去することによって、金属酸化物薄膜からなる第１作用電極を形成し、他方の積層体を第２作用電極とすることを特徴とする。図２を参照して、本実施形態の方法を説明する。

一対のくし型アレイ電極のパターンを有する金属酸化物薄膜と金属または炭素薄膜との積層体の形成は、たとえば、図２（ａ）に示すような絶縁性基板１１上に一対のくし型アレイ電極のパターンの開口部を有するリフトオフレジスト２１を形成し（図２（ｂ））、絶縁性基板２１上に金属酸化物薄膜２２を積層し、ついで金属酸化物薄膜２２上に金属薄膜２３を積層し（図２（ｃ））、前記リフトオフレジストを除去して、金属酸化物薄膜と金属薄膜の積層体からなる一対のくし型アレイ電極を形成する（図２（ｄ））、いわゆるリフトオフ法を用いて実施することができる。リフトオフ法を用いる場合、金属酸化物薄膜のエッチングを必要としないという利点を有する。

次いで、検出に用いられる一対のくし型アレイ電極を形成する部分を除いてフォトレジスト１７を用いて被覆し（図２（ｅ））、検出に用いられる一対のくし型アレイ電極の一方のくし型電極の金属薄膜を溶解させて、金属酸化物薄膜を露出させる（図２（ｆ））。金属薄膜の溶解は、電解質溶液に浸漬されたくし型電極に対して、正の電位を印加することによって実施することができる。該電解質溶液は、当該金属イオンを可溶化することができるイオンを含むことが望ましい。たとえば、金または白金を溶解させる場合には、電解質溶液が塩化物イオンを含むことが望ましい。

本発明の測定法に用いられるカテコールアミン類測定用電極の製造方法の別の例は、カテコールアミン類測定用電極を製造する方法であり、ここで第１作用電極が金属酸化物であり、第２作用電極が金属または炭素であり、第１および第２作用電極が絶縁膜によって電気的に絶縁されていることを特徴とする。本方法は、絶縁性基板上に金属酸化物薄膜を形成する工程と、該金属酸化物薄膜上に絶縁層を形成する工程と、該絶縁層上に金属薄膜を形成する工程と、前記絶縁層および前記金属薄膜の一部を除去して前記金属酸化物薄膜の一部を露出させる工程とを含む。

金属酸化物薄膜、絶縁膜および金属薄膜の積層は、スパッタ、蒸着、イオンビーム蒸着、イオンプレーティング、レーザーアブレーションなどの当該技術において知られている任意の技術を用いて実施することができる。

次いで、絶縁層および金属薄膜の一部の除去は、スパッタエッチング、反応性イオンエッチング、イオンミリング、ウェットエッチングなどの当該技術において知られている任意の技術を用いて実施することができる。金属薄膜上に所定の形状を有するレジストマスクを形成することによって、所定の領域の絶縁層および金属薄膜を除去することができる。絶縁層および金属薄膜の除去は、１段階で行ってもよいし、あるいは２段階に分けて行ってもよい。２段階で行う場合には、工程が増加するものの、絶縁層および金属薄膜のそれぞれに対して最適な手法を用いることができる。たとえば、絶縁層としてＳｉＯ_２、金属薄膜として金を用いる場合、金の除去をイオンミリングにて行い、ＳｉＯ_２の除去を反応性イオンエッチングによって行ってもよい。

以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
図１に本発明のカテコールアミン類測定用電極の構成例を示す（図１）。熱酸化膜が形成されたシリコン基板１１に、インジウム酸化物からなる第１作用電極１２、金からなる第２作用電極１３、銀からなる参照電極１４、金からなる対向電極１５を形成した。第１作用電極１２および第２作用電極１３は、それぞれ、くし型電極であり、枝状部の電極幅は１０μｍであり、隣接する２つの枝状部の間隔は２０μｍであった。そして、これら第１作用電極１２および第２作用電極１３は、一対のくし型アレイ電極を形成しており、隣接する第１作用電極１２の枝状部と第２作用電極１３の枝状部との間隔が５μｍになるように配置されている。上記の各電極は、電気化学測定装置と接続するためのパッド１６に電気的に接続されている。第１作用電極１２の枝状部と第２作用電極１３の枝状部との交互配置領域１８およびパッド１６の領域を除いて、厚さ１μｍのフォトレジスト１７で覆われている。

上記のカテコールアミン類測定用電極の各電極をポテンシオスタットに接続した後に、交互配置領域１８を１００μＭのドーパミン溶液内に浸漬させた。第２作用電極１３の電位を０ｍＶに固定し、第１作用電極１２の電位を１０ｍＶ／ｓの速さで掃引したところ、＋４５０ｍＶ付近で電流値は定常値を示し、そのときの電流値は、２００ｎＡであった。

次に、ドーパミン溶液にアニオン性分子であるＬ−アスコルビン酸を終濃度が１００μＭとなるように混合し、同様な実験を行った。その結果、＋４５０ｍＶ付近の電流値は、２００ｎＡと変化が認められなかった。このように本発明によるカテコールアミン類測定用電極は、高感度で、かつ妨害物質の影響を受けずにドーパミンの検出を行うことができる。また、カテコールアミンの代謝物であるＤＯＰＡＣ、ホモバニリン酸などの妨害物質を用いて同様の試験を行ったところ、これら妨害物質の存在下においても、本発明のカテコールアミン類測定用電極は、ドーパミンのみに応答し、これら妨害物質に対しても応答しないことを確認した。

加えて、第１作用電極１２として用いたインジウム酸化物に代えて、インジウム酸化物とスズとの混合物（ＩＴＯ）を用いても同様な結果が得られた。さらに、第２作用電極３の材料として、金に代えて、炭素、白金、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウム、タングステンを用いた場合でも同様な結果が得られた。

（比較例１）
第１および第２作用電極１２および１３の両方がインジウム酸化物で形成されていることを除いて実施例１と同一であるカテコールアミン類測定用電極を用いて、実施例１と同様の試験を行った。本比較例のカテコールアミン類測定用電極を１００μＭのドーパミン溶液に浸漬させた場合には、１００ｎＡの電流値しか得られなかった。これは、第１作用電極１２で酸化されたドーパミンが、第２作用電極１３上で十分還元されなかったためである。

（実施例２）
本実施例は、図２に示される方法で製造される一対のくし型アレイ電極であるカテコールアミン類測定用電極に関し、ここで第１作用電極は金属酸化物から形成され、第２作用電極は金属または炭素と金属酸化物との積層体から形成される。

最初に、絶縁性のガラス基板上にくし形電極のパターンを有するリフトオフレジスト２１を形成した（図２（ｂ））。リフトオフレジスト２は、一対のくし型アレイ電極を形成する部位において、幅１０μｍの開口部を５μｍ間隔で有していた。その後、スパッタ法を用いて、金属酸化物薄膜（ＩＴＯ）２２、金属薄膜（金）２３の順に形成した（図２（ｃ））。この後、メチルエチルケトンを用いてリフトオフを行い、所定の形状を有するＩＴＯおよび金の積層体を形成する（図２（ｄ））。その後、電極として使用する部分と電気化学測定器と接続するのに必要なパッド部分以外をフォトレジスト１７によって被覆し絶縁する（図２（ｅ））。このようにして作製した電極をリン酸緩衝液（１５０ｍＭの塩化物イオンを含有する）に浸漬させ、電気化学測定器に接続する。参照電極として銀／塩化銀電極を、対向電極として白金線を用いた。くし形電極を形成している一方の電極のみに０〜１．０Ｖの範囲において、５００ｍＶ／ｓの速さで電位を掃引した。金の溶解に起因する電流が観測されなくなるまで電位を掃引した。このようにして、一方の電極がＩＴＯ、もう一方の電極が金であるくし形電極を作製することができた（図２（ｆ））。

またＩＴＯ薄膜の下層に金属層を設け、電気抵抗を低減させる場合には、Ｃの工程の際、ＩＴＯ薄膜を形成する前に金属層を形成するとよい。

（実施例３）
本実施例は、図４に示すように絶縁層を介して金属酸化物電極と金属電極を積層し、互いに近接させたカテコールアミン類測定用電極に関する。

最初に、絶縁性ガラス基板４１上に、スパッタ法により膜厚０．０５μｍのＩＴＯを積層して金属酸化物薄膜４２を形成した。次に、スパッタ法により膜厚１μｍの酸化シリコンを積層して絶縁層４３を形成し、さらに膜厚０．１μｍの金を積層し金属薄膜４４を形成した。金属薄膜４４上にフォトレジストをスピンコートし、次いでパターニングを行って幅１０μｍ、間隔５μｍで配列される複数の開口部を形成した。次に、アルゴンガスを用いたイオンミリングを行って、開口部の金属薄膜４４を除去し、次いで四フッ化炭素ガスを用いる反応性イオンエッチングにて、開口部の絶縁層４３を除去して金属酸化物薄膜４２を露出させた。

複数の露出部を有する金属酸化物薄膜４２を第１作用電極として用い、複数の部分に分割された金属薄膜４４を電気的に接続して第２作用電極として用いた。以上のように作製した電極を用いて、以下の実験を行った。なお、参照電極として市販の銀／塩化銀電極を、対向電極として白金線を使用した。

最初に、１００μＭのドーパミン溶液内に作製した電極を浸漬させた。それぞれの電極を、ポテンシオスタットに接続した。金属薄膜４４（第２作用電極、金）には０ｍＶの電位を印加し、金属酸化物薄膜４２（第１作用電極、ＩＴＯ）の電位を１０ｍＶ／ｓの速さで掃引した。金属酸化物薄膜４２に＋４５０ｍＶの電位を印加した際に、電流は最大値を示し、そのときの電流値は、約４００ｎＡであった。

次に、１００μＭのドーパミン溶液に対して、尿酸およびアスコルビン酸を終濃度がそれぞれ４００μＭ、１００μＭとなるように混合して同様な実験を行った。その結果、４５０ｍＶ付近の電流値は、尿酸およびアスコルビン酸のいずれを混合した場合であっても４００ｎＡと変化が認められなかった。

以上のように、本実施例における電極においても選択的にカテコールアミン類を測定することができた。また本電極構造では、絶縁層を薄層化することによって、金属酸化物電極と金属電極の距離をより接近させて、より高感度の測定が可能であるという利点を有する。

（実施例４）
ガラス基板３１上に、スパッタ法にて膜厚０．１μｍのＩＴＯを積層し、電極部分およびパッド部分を除いてフォトレジスト３２を用いて被覆して、第１作用電極３３（電極面積１ｍｍ^２）を形成した。

別個のガラス基板３４に対して、スパッタ法にて膜厚０．１μｍの金を積層して第２作用電極３５（電極面積１ｍｍ^２）を形成し、またスパッタ法にて膜厚０．１μｍの銀を積層して参照電極３６（電極面積１ｍｍ^２）を形成した。ガラス基板３４の周囲に紫外線硬化樹脂３７を塗布し、第２作用電極３５と第１作用電極３３とを対向させて配置して２つのガラス基板３１および３４を貼り合わせて、試料溶液を流すための流路３９（幅１ｍｍ、深さ５μｍ）をフォトレジストを用いて形成して、図３に示す電気化学セルを形成した。このため、第１作用電極３３表面と第２作用電極３５表面との距離は５μｍであった。ガラス基板３４に、試料溶液の導入および排出のための孔をあけ、それぞれに対してチューブ３８ａおよび３８ｂを接続した。

チューブ３８ａから、流路３９、チューブ３８ｂに向かって、流速０．５μｌ／ｍｉｎでリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を流し、そして各電極をポテンシオスタット（ＡＬＳ８０２、ＣＨｉ）と接続し、第１作用電極３３には、＋４００ｍＶの電位を印加した。

ＰＢＳに代えて１００μＭのドーパミン溶液を導入したところ、２００ｎＡの応答電流が得られた。また、１００μＭの尿酸溶液を導入したところ、有意の応答電流は観測されなかった。

以上のように、電気化学セル内において、一方の基板上の金属酸化物からなる第１作用電極と、他方の基板上の金属からなる第２作用電極とを近接させることにより、ドーパミンの応答を増幅することができ、かつ尿酸の影響を受けずに測定を行うことができた。

（比較例２）
実施例４と同様に電極を形成したガラス基板３１および３４を、参照電極３６と第１作用電極３３とが対向するような配置で貼り合わせた電気化学セルを作製した。本比較例の電気化学セルに、実施例４と同様の条件下で１００μＭのドーパミン溶液を導入したところ、得られた応答電流は１００ｎＡに低下した。

この結果は、実施例４においては、第１作用電極３３と第２作用電極３５との間隔が５μｍと狭いために、それら電極間においてドーパミンが酸化・還元を繰り返して、応答電流値が増幅されているのに対して、本比較例においては、それら電極間の距離が離れたために応答電流値の増幅が十分に行われなかったためと考えられる。

（比較例３）
第２作用電極を形成するのにＩＴＯを用いたことを除いて、実施例４と同様の手順を用いて電気化学セルを作製した。本比較例の電気化学セルに、実施例４と同様の条件下で１００μＭのドーパミン溶液を導入したところ、得られた応答電流は１２０ｎＡに低下した。

これは、ＩＴＯで形成された第２作用電極３５において、ドーパミンの還元が円滑に進行せず、応答電流値の増幅が十分に行われなかったためと考えられる。

（実施例５）
実施例１のカテコールアミン類測定用電極と、流路用スペーサー（厚さ５０μｍ）、流路部分、封止用ガラス基板および試料導入部を組み合わせて、本発明によるフローセルを構成した。試料導入部をシリンジポンプに接続した。各電極は、電気化学測定装置（ＡＬＳ８０２、ＣＨｉ）と接続した。銀からなる参照電極１４を標準として、インジウム酸化物からなる第１作用電極１２に＋４００ｍＶ、金からなる第２作用電極１３に−２００ｍＶの電位を印加した。応答電流の測定データを、コンピューターに保存した。

最初に、シリンジポンプからリン酸緩衝液をフローセルに導入し、ベースラインを安定するのを確認した。次いで、シリンジポンプから１０ｎＭのノルアドレナリン溶液をフローセルに導入したところ、０．３ｎＡの応答電流を観測した。さらに、シリンジポンプから、１０ｎＭのノルアドレナリンと１００μＭの尿酸との混合溶液をフローセルに導入した場合にも、同じく０．３ｎＡの応答電流を観測した。

以上の結果から、本発明のカテコールアミン類測定用電極は、尿酸の影響を受けずにノルアドレナリンのみを選択的かつ高感度に測定を行うことができることが明らかとなった。

本発明の第１の実施形態のカテコールアミン類測定用電極の一例を示す図であり、（ａ）は上面図であり、（ｂ）は切断線Ｉｂ−Ｉｂにおける断面図である。 本発明の第２の実施形態のカテコールアミン類測定用電極の製造方法を示す図であり、（ａ）〜（ｆ）は、各工程を示す図である。 本発明によるフローセルの一例を示す図である。 本発明のカテコールアミン類測定用電極の別の例を示す断面図である。

符号の説明

１１、３１、３４、４１ 絶縁性基板
１２、３３、４２ 第１作用電極
１３、３５、４４ 第２作用電極
１４、３６ 参照電極
１５ 対向電極
１６（ａ〜ｄ） パッド
１７、３２ フォトレジスト
１８ 交互配置領域
２１ リフトオフレジスト
２２ 金属酸化物薄膜
２３ 金属薄膜
３２ フォトレジスト
３７ 紫外線硬化樹脂
３８（ａ，ｂ） チューブ
３９ 流路
４３ 絶縁層

Claims (19)

1. カテコールアミン類を酸化するための金属酸化物を含む第１作用電極と、第１作用電極に近接し、酸化されたカテコールアミン類を還元するための金属または炭素から形成される第２作用電極とを微小流路内に集積した電気化学セルを用い、測定用試料を該微小流路に連続的に送液しながら測定を行うことを特徴とするカテコールアミン類の測定法。
2. 前記電気化学セルが、電気化学測定に必要な対向電極および参照電極をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のカテコールアミン類の測定法。
3. 前記測定用試料が、マイクロダイアリシスプローブ、ガラスキャピラリー、チューブを用いて採取されることを特徴とする請求項１に記載のカテコールアミン類の測定法。
4. 金属酸化物を含む第１作用電極と、金属または炭素から形成される第２作用電極とを含むことを特徴とするカテコールアミン類測定用電極。
5. 前記金属酸化物が、インジウム、スズ、亜鉛、イリジウム、チタン、アルミニウム、タングステンおよびそれらの混合物からなる群から選択される金属の酸化物であることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。
6. 前記金属酸化物が非晶質または微結晶構造を有していることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。
7. 前記第２作用電極を形成する金属が、金、白金、銀、銅、イリジウム、チタン、パラジウム、アルミニウムおよびタングステンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。
8. 前記第１作用電極が、下層の金属と、上層の前記金属酸化物との積層体であることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。
9. 前記第１作用電極および前記第２作用電極が一対のくし型アレイ電極を形成していることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。
10. 前記第１作用電極の上表面の一部の上に形成された絶縁膜をさらに含み、前記絶縁膜上に前記第２作用電極が形成されていることを特徴とする請求項４に記載のカテコールアミン類測定用電極。
11. 第１および第２の絶縁性基板、および請求項４から８のいずれかに記載のカテコールアミン類測定用電極を含み、前記第１作用電極が第１の絶縁性基板上に形成され、前記第２作用電極が第１または第２の絶縁性基板の上に形成され、前記第１および第２の絶縁性基板が貼り合わせられて、その間に微小流路が形成されていることを特徴とする電気化学セル。
12. 前記第２作用電極が第１の絶縁性基板上に形成されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。
13. 前記第１作用電極および前記第２作用電極が一対のくし型アレイ電極を形成していることを特徴とする請求項１２に記載の電気化学セル。
14. 前記第２作用電極が第２の絶縁性基板上に形成されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。
15. 前記第１作用電極の上表面の一部の上に形成された絶縁膜をさらに含み、前記絶縁膜上に前記第２作用電極が形成されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。
16. 対向電極および参照電極をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。
17. 試料採取用のガラスキャピラリー、チューブおよびマイクロダイアリシスプローブからなる群から選択される１つまたは複数の試料採取手段が接続されていることを特徴とする請求項１１に記載の電気化学セル。
18. 絶縁性基板上に一対のくし型アレイ電極のパターンの開口部を有するリフトオフレジストを形成する工程と；前記絶縁性基板上に金属酸化物薄膜を形成する工程と；該金属酸化物薄膜上に金属薄膜を形成する工程と；前記リフトオフレジストを除去して、金属酸化物薄膜と金属薄膜の積層体からなる一対のくし型アレイ電極を形成する工程と；電極として用いる部分を残して、前記一対のくし型電極をフォトレジストにより被覆する工程と；一対のくし型アレイ電極の一方の積層体の金属薄膜を溶解させて、金属酸化物薄膜を露出させて第１作用電極を形成し、一対のくし型アレイ電極の他方が第２作用電極を形成する工程とを含むことを特徴とするカテコールアミン類測定用電極の製造方法。
19. 絶縁性基板上に金属酸化物薄膜を形成する工程と、該金属酸化物薄膜上に絶縁層を形成する工程と、該絶縁層上に金属薄膜を形成する工程と、前記絶縁層および前記金属薄膜の一部を除去して前記金属酸化物薄膜の一部を露出させ、露出した金属酸化物薄膜が第１作用電極を形成し、残存する金属薄膜が第２作用電極を形成する工程とを含むことを特徴とするカテコールアミン類測定用電極の製造方法。
    

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