KR20220098525A - Biosensor - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a biosensor which comprises: a substrate; and a working electrode and a reference electrode formed on the substrate, wherein the working electrode includes: a working electrode layer formed on the substrate; and an enzyme reaction layer formed on the working electrode layer. The enzyme reaction layer includes: one or more enzymes selected from a group consisting of a glucose oxidase, a glucose dehydrogenase, a lactate oxidase, and a lactate dehydrogenase; a mediator; and a pH buffer solution, wherein the pH buffer solution includes 2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid (MES). Accordingly, provided is the biosensor having enhanced accuracy and precision by minimizing a measurement error according to pH of a sample.

Description

바이오센서{BIOSENSOR}biosensor {BIOSENSOR}

본 발명은, 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to a biosensor.

바이오센서란, 분석하고자 하는 대상 물질(analyte)을 선택 특이성이 있는 생체 수용체(bio-receptor)와 반응시키고, 그 반응의 정도를 신호 변환기(signal transducer)로 측정하여, 대상 물질(analyte)의 존재나 양을 확인할 수 있는 장치나 소자를 통칭한다.A biosensor reacts a target substance to be analyzed with a bio-receptor with selection specificity, measures the degree of the reaction with a signal transducer, and the presence of the analyte It refers to a device or element that can confirm the quantity.

바이오센서는 그 변환방법에 따라, 전기화학센서, 열감지센서, 광학센서 등으로 구분되며, 최근에는, 분석하고자 하는 대상 물질의 종류에 따라, 글루코오스 센서, 세포 센서, 면역 바이오센서, DNA 칩 등으로 다양하게 명명된다.Biosensors are classified into electrochemical sensors, thermal sensors, and optical sensors according to their conversion methods. are variously named as

이러한 바이오센서는 일반적으로 효소, 항체 또는 세포 등과 같은 생화학물질을 포함하게 되는데, 이는 온도, 습도 및 pH 등의 외부 요인에 큰 영향을 받는다. Such biosensors generally include biochemicals such as enzymes, antibodies, or cells, which are greatly affected by external factors such as temperature, humidity, and pH.

특히, 측정 시료의 pH는, 어느 정도 환경 제어가 가능한 온도 내지 습도와 달리 피험자에 따라 개인차가 발생하는 것으로 그 제어가 불가능하여, 바이오센서의 성능에 큰 영향을 미치게 된다.In particular, the pH of the measurement sample is not controllable because individual differences occur depending on the subject, unlike temperature and humidity, which can be controlled to some extent, and thus greatly affects the performance of the biosensor.

예를 들어, 인체로부터 발생하는 땀, 타액 등과 같이 pH가 약 4 내지 8 정도인 시료를 측정 시료로 사용하는 바이오센서의 경우 산성도에 따른 측정 편차가 크게 발생하게 되어 정확한 측정이 어려운 문제가 있다.For example, in the case of a biosensor using a sample having a pH of about 4 to 8 as a measurement sample, such as sweat and saliva generated from the human body, there is a problem in that accurate measurement is difficult because a measurement deviation according to acidity occurs greatly.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 종래 바이오센서는 센서 내부에 별도의 pH 센서를 도입하거나, 센서 측정 전 산-염기 지시약 또는 pH 시험지를 이용하여 별도의 pH를 측정하는 단계를 수행하고 있다.In order to solve this problem, a conventional biosensor introduces a separate pH sensor inside the sensor, or performs a step of measuring a separate pH using an acid-base indicator or a pH test paper before measuring the sensor.

대한민국 공개특허 제10-2018-0002231호 또한, 글루코오스 센서와 인접하게 배치되는 pH 센서를 더 포함하는 바이오 센싱 장치를 제공한다.Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2018-0002231 also provides a biosensing device further comprising a pH sensor disposed adjacent to the glucose sensor.

그러나, 상기 공개특허 제10-2018-0002231호를 포함한 종래 바이오센서에 따르면, 센서의 소형화가 어렵고 측정 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.However, according to the conventional biosensor including the Patent Publication No. 10-2018-0002231, there is a disadvantage in that it is difficult to reduce the size of the sensor and it takes a long measurement time.

이러한 요구에 따라 종래 일부 바이오센서는 인산완충식염수(Phosphate-Buffered Saline; PBS) 등을 pH 완충액으로 사용하였으나, 이러한 종래의 pH 완충액은 바이오센서에 포함된 효소 활성도 저하를 수반함으로써 센서의 감도 저하가 발생하는 문제가 있다.In response to this request, some conventional biosensors used Phosphate-Buffered Saline (PBS), etc. as a pH buffer, but this conventional pH buffer is accompanied by a decrease in enzyme activity contained in the biosensor, so that the sensitivity of the sensor is reduced. There is a problem that arises.

따라서, 별도의 pH 측정 장치 내지 측정 단계를 포함하지 않으면서도, 센서의 감도 저하를 방지함과 동시에 넓은 범위의 대상 물질(analyte)의 농도에 대하여 pH에 따른 영향성이 저감된 바이오센서의 개발이 필요하다.Therefore, without including a separate pH measuring device or measuring step, the development of a biosensor in which the effect of pH on the concentration of a wide range of analytes is reduced while preventing a decrease in the sensitivity of the sensor at the same time is difficult. need.

대한민국 공개특허 제10-2018-0002231호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2018-0002231

본 발명은, 별도의 pH 측정 장치 내지 측정 단계를 포함하지 않으면서도, 시료의 pH에 따른 측정 편차를 최소화함으로써, 정확성과 정밀성이 향상된 바이오센서를 제공하는 것을 발명의 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a biosensor with improved accuracy and precision by minimizing a measurement deviation depending on the pH of a sample without including a separate pH measuring device or measuring step.

또한, 본 발명은, 효소 활성도 저하를 방지함으로써, 감도가 향상된 바이오센서를 제공하는 것을 발명의 목적으로 한다.Another object of the present invention is to provide a biosensor with improved sensitivity by preventing a decrease in enzyme activity.

본 발명은, 기판 및 상기 기판 상에 형성되는 작업전극과 기준전극을 포함하며, 상기 작업전극은 기판 상에 형성되는 작업전극층 및 상기 작업전극층 상에 형성되는 효소반응층을 포함하며, 상기 효소반응층은 글루코오스 산화 효소(glucose oxidase), 글루코오스 탈수소 효소(glucose dehydrogenase), 락테이트 산화 효소(lactate oxidase) 및 락테이트 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소; 미디에이터; 및 pH 완충액을 포함하며, 상기 pH 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)을 포함하는, 바이오센서에 관한 것이다.The present invention includes a substrate and a working electrode and a reference electrode formed on the substrate, wherein the working electrode includes a working electrode layer formed on the substrate and an enzyme reaction layer formed on the working electrode layer, the enzyme reaction The layer comprises at least one enzyme selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase and lactate dehydrogenase; mediator; and a pH buffer, wherein the pH buffer comprises 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES).

본 발명은, 그 제1 관점에 있어서, 상기 pH 완충액의 pH가 6.5 내지 8인 것일 수 있다.According to the first aspect of the present invention, the pH of the pH buffer may be 6.5 to 8.

본 발명은, 그 제2 관점에 있어서, 상기 pH 완충액에 포함되는 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)의 농도가 50mM 이상 500mM 미만인 것일 수 있다.In the present invention, in the second aspect, the concentration of 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) contained in the pH buffer may be 50 mM or more and less than 500 mM.

본 발명은, 그 제3 관점에 있어서, 상기 미디에이터는 페리시안화칼륨, 시토크롬C, 피로로퀴놀린퀴논(PQQ), NAD+, NADP+, 동착체, 루테늄 화합물, 페나진메토설페이트 및 그 유도체, 포타슘 페리시아나이드(Potassium ferricyanide, K₃[Fe(CN)₆]), 포타슘 페로시아나이드(Potassium ferrocyanide, K₄[Fe(CN)₆]), 염화헥사아민루테늄(Ⅲ)(hexaamineruthenium(Ⅲ) chloride), 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체 및 하이드로퀴논(hydroquinone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, in the third aspect, the mediator is potassium ferricyanide, cytochrome C, pyrroroquinolinequinone (PQQ), NAD+, NADP+, copper complex, ruthenium compound, phenazinemethosulphate and derivatives thereof, potassium ferric acid Anide (Potassium ferricyanide, K ₃ [Fe(CN) ₆ ]), potassium ferrocyanide (Potassium ferrocyanide, K ₄ [Fe(CN) ₆ ]), hexaamineruthenium (III) chloride (hexaamineruthenium (III) chloride), It may include one or more selected from the group consisting of ferrocene, ferrocene derivatives, quinones, quinone derivatives, and hydroquinone.

본 발명은, 그 제4 관점에 있어서, 상기 작업전극층은 탄소전극층 및 금속전극층으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In the fourth aspect of the present invention, the working electrode layer may include at least one selected from the group consisting of a carbon electrode layer and a metal electrode layer.

본 발명은, 그 제5 관점에 있어서, 상기 금속전극층은 금속층 및 금속보호층으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In the fifth aspect of the present invention, the metal electrode layer may include at least one selected from the group consisting of a metal layer and a metal protective layer.

본 발명은, 그 제6 관점에 있어서, 상기 효소반응층 상에 형성되는 고분자막층을 더 포함하는 것일 수 있다.In the sixth aspect, the present invention may further include a polymer film layer formed on the enzyme reaction layer.

본 발명은, 그 제7 관점에 있어서, 상기 고분자막층은 수용성 고분자 및 비수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In the seventh aspect of the present invention, the polymer film layer may include at least one selected from the group consisting of a water-soluble polymer and a water-insoluble polymer.

본 발명은, 그 제8 관점에 있어서, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate; CA) 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하며, 상기 비수용성 고분자는 폴리우레탄(polyurethane; PU), 폴리카보네이트(polycarbonate; PC) 및 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride; PVC)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, in the eighth aspect, the water-soluble polymer is polyvinyl alcohol (PVA), hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxypropyl cellulose (HPC), carboxymethyl cellulose (carboxy methyl cellulose; CMC), cellulose acetate (CA) and polyvinyl pyrrolidone (PVP) comprising at least one selected from the group consisting of, the water-insoluble polymer is polyurethane (polyurethane) ; PU), polycarbonate (PC), and polyvinyl chloride (PVC) may be one comprising at least one selected from the group consisting of.

본 발명의 일 실시 예에 따른 바이오센서는, 효소반응층에 특정한 pH 완충액을 포함하여, 별도의 pH 측정 장치 내지 측정 단계를 포함하지 않으면서도, 시료의 pH에 따른 측정 편차를 최소화함으로써, 센서의 검출 정확성과 정밀성을 향상시키는 것이 가능하다.The biosensor according to an embodiment of the present invention includes a specific pH buffer in the enzyme reaction layer, without including a separate pH measuring device or measuring step, and by minimizing the measurement deviation according to the pH of the sample, the sensor It is possible to improve detection accuracy and precision.

또한, 본 발명의 일 실시 예에 따른 바이오센서는, 특정한 pH 완충액을 사용하여 효소 활성도 저하를 방지함으로써, 센서의 감도를 향상시키는 것이 가능하다.In addition, in the biosensor according to an embodiment of the present invention, it is possible to improve the sensitivity of the sensor by using a specific pH buffer to prevent a decrease in enzyme activity.

또한, 본 발명의 일 실시 예에 따른 바이오센서는, 특정한 pH 완충액의 pH 내지 농도를 조절함으로써, 센서의 감도를 더욱 향상시키는 것이 가능하다.In addition, in the biosensor according to an embodiment of the present invention, it is possible to further improve the sensitivity of the sensor by adjusting the pH or concentration of a specific pH buffer.

또한, 본 발명의 일 실시 예에 따른 바이오센서는, 별도의 pH 측정 장치 내지 pH 측정 단계를 포함하지 않아 센서의 제작 공정과 측정 방법을 간소화함으로써, 웨어러블(Wearable) 센서 등의 소형화 센서 제작을 가능하게 하면서도 측정 소요 시간을 단축시키는 것이 가능하다.In addition, the biosensor according to an embodiment of the present invention does not include a separate pH measuring device or pH measuring step, thereby simplifying the manufacturing process and measuring method of the sensor, thereby making it possible to manufacture a miniaturized sensor such as a wearable sensor It is possible to shorten the time required for measurement.

도 1은, 본 발명의 일 실시 예에 따른 바이오센서를 나타낸 사시도이다.
도 2는, 도 1의 A-A'선을 따라 절단한 면을 나타낸 단면도이다.
도 3은, 도 1의 B-B'선을 따라 절단한 면을 나타낸 단면도이다.
도 4는, 본 발명의 실험예 1에 따른 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 5는, 본 발명의 실험예 2에 따른 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, 본 발명의 실험예 3에 따른 평가 결과를 나타낸 도이다.1 is a perspective view showing a biosensor according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a cross-sectional view showing a plane cut along the line A-A' of FIG. 1 .
3 is a cross-sectional view showing a plane cut along the line B-B' of FIG. 1 .
4 is a view showing an evaluation result according to Experimental Example 1 of the present invention.
5 is a view showing an evaluation result according to Experimental Example 2 of the present invention.
6 is a view showing an evaluation result according to Experimental Example 3 of the present invention.

본 발명은, 효소반응층에 특정한 pH 완충액을 포함함으로써, 별도의 pH 측정 장치 내지 측정 단계를 포함하지 않으면서도, 시료의 pH에 따른 영향성을 저감 시켜, 센서의 검출 정확성 및 정밀성을 향상시키기 위한 바이오센서에 관한 것이다.The present invention, by including a specific pH buffer in the enzyme reaction layer, without including a separate pH measuring device or measuring step, to reduce the influence of the pH of the sample, to improve the detection accuracy and precision of the sensor It is about biosensors.

구체적으로, 본 발명은, 기판 및 상기 기판 상에 형성되는 작업전극과 기준전극을 포함하며, 상기 작업전극은 기판 상에 형성되는 작업전극층 및 상기 작업전극층 상에 형성되는 효소반응층을 포함하며, 상기 효소반응층에 포함되는 pH 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)을 포함하는, 바이오센서에 관한 것이다.Specifically, the present invention includes a substrate and a working electrode and a reference electrode formed on the substrate, wherein the working electrode includes a working electrode layer formed on the substrate and an enzyme reaction layer formed on the working electrode layer, The pH buffer contained in the enzyme reaction layer relates to a biosensor comprising 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES).

본 발명의 바이오센서에 있어서, 검출 대상 시료는, 혈액, 체액(침, 땀, 눈물 등), 뇨 등의 생체 시료일 수 있으며, 그 외의 액체 시료일 수 있으나, 시료의 다양한 pH에 대한 영향성을 저감 시키기 위한 측면에서, 체액(침, 땀, 눈물 등)이 바람직하다. In the biosensor of the present invention, the detection target sample may be a biological sample such as blood, body fluids (saliva, sweat, tears, etc.), urine, etc., may be other liquid samples, but the effect of the sample on various pH In terms of reducing the amount of blood, bodily fluids (saliva, sweat, tears, etc.) are preferable.

상기 검출 대상 시료의 pH는 특별히 한정되는 것은 아니나, 일 실시 예에 있어서 일반적인 생리학적 pH 범위인 5 내지 8일 수 있다.The pH of the detection target sample is not particularly limited, but in an embodiment, may be 5 to 8, which is a general physiological pH range.

이하, 도면을 참고하여, 본 발명의 실시 예들을 보다 구체적으로 설명하도록 한다. 다만, 본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니된다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to the drawings. However, the following drawings attached to the present specification illustrate preferred embodiments of the present invention, and serve to further understand the technical idea of the present invention together with the above-described content of the present invention, so the present invention is described in such drawings It should not be construed as being limited only to the matters.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시 예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않은 한 복수형도 포함한다.The terminology used herein is for the purpose of describing the embodiments, and is not intended to limit the present invention. In this specification, the singular also includes the plural unless specifically stated otherwise in the phrase.

명세서에서 사용되는 포함한다(comprises) 및/또는 포함하는(comprising)은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자 이외의 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용한다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.As used herein, includes and/or comprising refers to the presence or addition of one or more other components, steps, operations and/or elements other than the recited elements, steps, operations and/or elements. It is used in the sense of not being excluded. Like reference numerals refer to like elements throughout.

공간적으로 상대적인 용어인 "아래", "하(면)", "위", "상(면)" 등은 도면에 도시되어 있는 바와 같이 하나의 소자 또는 구성 요소들과 다른 소자 또는 구성 요소들과의 상관관계를 용이하게 기술하기 위해 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시되어 있는 방향에 더하여 사용 시 또는 동작 시 소자의 서로 다른 방향을 포함하는 용어로 이해되어야 한다. 예를 들면, 도면에 도시되어 있는 소자를 뒤집을 경우, 다른 소자의 "아래" 또는 "하(면)"으로 기술된 소자는 다른 소자의 "위" 또는 "상(면)"에 놓여질 수 있다. 따라서, 예시적인 용어인 "하(면)" 등은 아래와 위의 방향을 모두 포함할 수 있다. 소자는 다른 방향으로도 배향될 수 있고, 이에 따라 공간적으로 상대적인 용어들은 배향에 따라 해석될 수 있다.Spatially relative terms "below", "bottom (surface)", "upper", "upper (surface)", etc. are used with one element or components and other elements or components as shown in the drawings. can be used to easily describe the correlation of Spatially relative terms should be understood as terms including different orientations of the device during use or operation in addition to the orientation shown in the drawings. For example, when an element shown in the figures is turned over, an element described as "below" or "below (side)" of another element may be placed "above" or "above (surface)" of the other element. Accordingly, the exemplary term “bottom (surface)” and the like may include both downward and upward directions. The device may also be oriented in other orientations, and thus spatially relative terms may be interpreted according to orientation.

<바이오센서><Biosensor>

본 발명의 바이오센서는, 시료의 pH에 따른 영향성을 저감 시키면서 효소 활성도 저하를 방지하기 위하여, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)를 포함하는 pH 완충액을 사용함으로써, 시료에 따른 측정 편차를 최소화하며 센서의 감도를 향상시키기 위한 것일 수 있다.The biosensor of the present invention uses a pH buffer containing 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) in order to prevent a decrease in enzyme activity while reducing the influence of the pH of the sample. This may be to minimize the measurement deviation caused by this and improve the sensitivity of the sensor.

구체적으로, 기판 및 상기 기판 상에 형성되는 작업전극과 기준전극을 포함하며, 상기 작업전극은 기판 상에 형성되는 작업전극층 및 상기 작업전극층 상에 형성되는 효소반응층을 포함하며, 상기 효소반응층은 글루코오스 산화 효소(glucose oxidase), 글루코오스 탈수소 효소(glucose dehydrogenase), 락테이트 산화 효소(lactate oxidase) 및 락테이트 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소; 미디에이터; 및 pH 완충액을 포함하며, 상기 pH 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)을 포함하는 것일 수 있다.Specifically, it includes a substrate and a working electrode and a reference electrode formed on the substrate, wherein the working electrode includes a working electrode layer formed on the substrate and an enzyme reaction layer formed on the working electrode layer, the enzyme reaction layer is one or more enzymes selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase and lactate dehydrogenase; mediator; and a pH buffer, wherein the pH buffer may include 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES).

도 1은, 본 발명의 일 실시 예에 따른 바이오센서를 나타낸 사시도이며, 도 2는, 도 1의 A-A'선을 따라 절단한 면을 나타낸 단면도이며, 도 3은, 도 1의 B-B'선을 따라 절단한 면을 나타낸 단면도이다.1 is a perspective view showing a biosensor according to an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a cross-sectional view showing a plane cut along the line A-A' of FIG. 1, and FIG. 3 is a view B- of FIG. It is a cross-sectional view showing the plane cut along the line B'.

도 1 내지 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시 예에 따른 바이오센서는, 기판(100), 작업전극(200), 기준전극(300), 배선부(400) 및 절연막(500)을 포함하며, 상기 작업전극(200)은, 작업전극층(210), 효소반응층(220) 및 고분자막층(230)을 포함하는 것일 수 있다.1 to 3 , the biosensor according to an embodiment of the present invention includes a substrate 100 , a working electrode 200 , a reference electrode 300 , a wiring unit 400 , and an insulating film 500 , , The working electrode 200 may include a working electrode layer 210 , an enzyme reaction layer 220 , and a polymer film layer 230 .

기판(100)은, 바이오센서를 구성하는 구성요소들의 구조적인 기지(base)를 제공하는 역할을 수행한다.The substrate 100 serves to provide a structural base of the components constituting the biosensor.

기판(100)은, 유리 등과 같은 경성 재질을 갖거나, 플렉서블 특성을 갖는 필름 형태로 구현되는 것일 수 있고, 종래 또는 이후에 개발되는 것을 사용할 수 있다.The substrate 100 may be made of a hard material, such as glass, or implemented in the form of a film having flexible characteristics, and those developed conventionally or later may be used.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 기판(100)은, 실리콘, 유리, 유리에폭시, 세라믹, 폴리에틸렌나프탈레이트(PET), 폴리부틸렌테레프탈레이트 등의 폴리에스테르계 수지; 디아세틸셀룰로오스, 트리아세틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 수지; 폴리카보네이트계 수지; 폴리메틸(메타)아크릴레이트, 폴리에틸(메타)아크릴레이트 등의 아크릴계 수지; 폴리스티렌, 아크릴로니트릴-스티렌 공중합체 등의 스티렌계 수지; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 시클로계 또는 노보넨 구조를 갖는 폴리올레핀, 에틸렌-프로필렌 공중합체 등의 폴리올레핀계 수지; 염화비닐계 수지; 나일론, 방향족 폴리아미드 등의 아미드계 수지; 이미드계 수지; 폴리에테르술폰계 수지; 술폰계 수지; 폴리에테르에테르케톤계 수지; 황화 폴리페닐렌계 수지; 비닐알코올계 수지; 염화비닐리덴계 수지; 비닐부티랄계 수지; 알릴레이트계 수지; 폴리옥시메틸렌계 수지; 에폭시계 수지 등과 같은 열가소성 수지로 구성된 필름일 수 있으며, 상기 열가소성 수지의 블렌드물로 구성된 필름도 사용할 수 있다. 또한, (메타)아크릴계, 우레탄계, 아크릴우레탄계, 에폭시계, 실리콘계 등의 열경화성 수지 또는 자외선 경화형 수지로 된 필름을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one or a plurality of embodiments, the substrate 100 is a polyester-based resin such as silicon, glass, glass epoxy, ceramic, polyethylene naphthalate (PET), polybutylene terephthalate; Cellulose resins, such as a diacetyl cellulose and a triacetyl cellulose; polycarbonate-based resin; acrylic resins such as polymethyl (meth)acrylate and polyethyl (meth)acrylate; styrenic resins such as polystyrene and acrylonitrile-styrene copolymer; polyolefin-based resins such as polyethylene, polypropylene, polyolefin having a cyclo-based or norbornene structure, and an ethylene-propylene copolymer; vinyl chloride-based resin; amide-based resins such as nylon and aromatic polyamide; imide-based resin; polyether sulfone-based resin; sulfone-based resins; polyether ether ketone resin; sulfide polyphenylene-based resin; vinyl alcohol-based resin; vinylidene chloride-based resin; vinyl butyral-based resin; allylate-based resin; polyoxymethylene-based resins; It may be a film composed of a thermoplastic resin such as an epoxy-based resin, and a film composed of a blend of the thermoplastic resin may also be used. In addition, a film made of a thermosetting resin or ultraviolet curable resin such as (meth)acrylic, urethane, acrylic urethane, epoxy, or silicone may be used, but is not limited thereto.

기판(100)의 두께는 특별히 한정되는 것은 아니나, 일반적으로는 강도나 취급성 등의 작업성, 박층성 등을 고려하여, 1 내지 500㎛일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 300㎛일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 내지 200㎛일 수 있다.The thickness of the substrate 100 is not particularly limited, but in general, in consideration of workability such as strength and handleability, thin layer properties, etc., it may be 1 to 500 μm, preferably 1 to 300 μm, , more preferably 5 to 200 μm.

일 실시 예에 있어서, 기판(100)은, 적절한 1종 이상의 첨가제가 함유된 것일 수 있으며, 첨가제는, 예를 들어, 자외선흡수제, 산화방지제, 윤활제, 가소제, 이형제, 착색방지제, 난연제, 핵제, 대전방지제, 안료, 착색제 등을 들 수 있다.In one embodiment, the substrate 100 may contain one or more suitable additives, and the additives include, for example, a UV absorber, an antioxidant, a lubricant, a plasticizer, a mold release agent, a color inhibitor, a flame retardant, a nucleating agent, An antistatic agent, a pigment, a coloring agent, etc. are mentioned.

일 실시 예에 있어서, 기판(100)은, 기판의 일면 또는 양면에 하드코팅층, 반사방지층, 가스배리어층과 같은 다양한 기능성층을 포함하는 구조일 수 있으며, 기능성층은 전술한 것으로 한정되는 것은 아니며, 용도에 따라 다양한 기능성층을 포함할 수 있다.In an embodiment, the substrate 100 may have a structure including various functional layers such as a hard coating layer, an anti-reflection layer, and a gas barrier layer on one or both sides of the substrate, and the functional layer is not limited to the above. , may include various functional layers depending on the use.

일 실시 예에 있어서, 기판(100)은, 필요에 따라 표면 처리된 것일 수 있으며, 상기 표면 처리는, 예를 들어, 플라즈마(plasma) 처리, 코로나(corona) 처리, 프라이머(primer) 처리 등의 건식 처리, 검화 처리를 포함하는 알칼리 처리 등의 화학 처리 등을 들 수 있다.In an embodiment, the substrate 100 may be surface-treated as needed, and the surface treatment may include, for example, plasma treatment, corona treatment, primer treatment, etc. Chemical treatment such as dry treatment and alkali treatment including saponification treatment, etc. are mentioned.

작업전극(200) 및 기준전극(300)은, 기판(100) 상에 형성될 수 있다. The working electrode 200 and the reference electrode 300 may be formed on the substrate 100 .

상기 작업전극(200)은, 시료에 포함되는 분석물의 반응에 의해 발생되는 전기적 신호를 감지하는 역할을 수행하기 위하여 구비되는 것일 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 작업전극(200)은 작업전극층(210) 및 효소반응층(220)을 포함하며, 상기 효소반응층(220) 상에 형성되는 고분자막층(230)을 더 포함하는 것일 수 있다.The working electrode 200 may be provided to detect an electrical signal generated by a reaction of an analyte included in a sample. In one embodiment, the working electrode 200 may include a working electrode layer 210 and an enzyme reaction layer 220, and further include a polymer film layer 230 formed on the enzyme reaction layer 220. have.

상기 작업전극층(210)은 기판(100) 상에 배치되는 것일 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 작업전극층(210)은 기판(100)의 상면에 접촉하여 배치되는 것일 수 있다. 작업전극층(210)은 감지 대상 물질의 산화-환원 반응 등에서 발생된 전자 또는 정공이 전달되는 통로로 제공될 수 있다.The working electrode layer 210 may be disposed on the substrate 100 . In an embodiment, the working electrode layer 210 may be disposed in contact with the upper surface of the substrate 100 . The working electrode layer 210 may be provided as a path through which electrons or holes generated in an oxidation-reduction reaction of the sensing target material are transmitted.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 작업전극층(210)은 탄소전극층 및 금속전극층으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In one or a plurality of embodiments, the working electrode layer 210 may include at least one selected from the group consisting of a carbon electrode layer and a metal electrode layer.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 탄소전극층은 카본 페이스트(carbon paste), 파이로리틱그래파이트(pyrolytic graphite), 글래시카본(glassy carbon), 퍼플루오로카본(PFC) 및 카본나노튜브(Carbon Nano Tube; CNT) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 탄소전극층은 효소반응층(220)에서 발생한 전자 및/또는 정공을 안정적으로 수송할 수 있다.In one or a plurality of embodiments, the carbon electrode layer includes carbon paste, pyrolytic graphite, glassy carbon, perfluorocarbon (PFC) and carbon nanotubes (Carbon Nano). Tube; CNT) and the like may include one or more selected from the group consisting of. The carbon electrode layer may stably transport electrons and/or holes generated in the enzyme reaction layer 220 .

일 실시 예에 있어서, 상기 작업전극층(210)은 카본 페이스트(carbon paste) 단일층으로 형성될 수 있다. 상기 카본 페이스트(carbon paste) 단일층이 전극으로 제공됨으로써, 금속 전극이 생략될 수 있다. 따라서, 바이오센서의 박막화가 가능하다.In an embodiment, the working electrode layer 210 may be formed of a single layer of carbon paste. Since the carbon paste single layer is provided as an electrode, the metal electrode may be omitted. Therefore, it is possible to thin the biosensor.

일 실시 예에 있어서, 상기 금속전극층은 금속층 및 상기 금속층 상면에 배치된 금속보호층을 포함하는 것일 수 있다.In an embodiment, the metal electrode layer may include a metal layer and a metal protective layer disposed on an upper surface of the metal layer.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 금속층은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 티타늄(Ti), 니켈(Ni), 주석(Sn), 몰리브덴(Mo), 팔라듐(Pd), 코발트(Co) 및 이들의 합금으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, APC 합금(Ag-Pd-Cu alloy)이 사용될 수 있다.In one or more embodiments, the metal layer is gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt), titanium (Ti), nickel (Ni), tin (Sn), molybdenum (Mo) ), palladium (Pd), cobalt (Co), and may include one or more selected from the group consisting of alloys thereof. For example, an APC alloy (Ag-Pd-Cu alloy) may be used.

상기 금속보호층은, 전기 전도성을 가지면서 금속층의 상면을 전체적으로 덮는 것일 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 금속보호층은 상기 금속층의 상면에 접촉하여 배치되는 것일 수 있다. 상기 금속보호층은 작업전극(200)의 산화-환원 반응으로 인해 금속층이 산화-환원 되는 것을 방지하기 위한 것일 수 있다.The metal protective layer may have electrical conductivity and cover the entire upper surface of the metal layer. In one embodiment, the metal protective layer may be disposed in contact with the upper surface of the metal layer. The metal protective layer may be to prevent oxidation-reduction of the metal layer due to the oxidation-reduction reaction of the working electrode 200 .

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 금속보호층은 ITO(Indium Tin Oxide) 및 IZO(Indium Zinc Oxide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 ITO 및 IZO는 전기 전도성을 가지면서도 화학적으로 안정하여 상기 금속층의 산화-환원 반응을 효과적으로 방지할 수 있다. 또한, 상기 금속보호층은 금속층이 대기와 직접 접촉하는 것을 방지하여 상기 금속층을 구성하는 금속 성분의 산화를 방지할 수 있다. 따라서, 상기 금속층에 의해 감지되는 전기적 신호의 신뢰성을 향상시킬 수 있다.In one or a plurality of embodiments, the metal protective layer may include at least one selected from the group consisting of Indium Tin Oxide (ITO) and Indium Zinc Oxide (IZO). The ITO and IZO are chemically stable while having electrical conductivity, so that the oxidation-reduction reaction of the metal layer can be effectively prevented. In addition, the metal protective layer may prevent the metal layer from being in direct contact with the atmosphere to prevent oxidation of metal components constituting the metal layer. Accordingly, the reliability of the electrical signal sensed by the metal layer may be improved.

일 실시 예에 있어서, 상기 금속전극층은 기판 및 탄소전극층 사이에 구비되는 것일 수 있다.In an embodiment, the metal electrode layer may be provided between the substrate and the carbon electrode layer.

상기 효소반응층(220)은 작업전극층(210) 상에 배치되는 것일 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 효소반응층(220)은 작업전극층(210)의 상면에 접촉하여 배치되는 것일 수 있다.The enzyme reaction layer 220 may be disposed on the working electrode layer 210 . In one embodiment, the enzyme reaction layer 220 may be disposed in contact with the upper surface of the working electrode layer (210).

효소반응층(220)은 시료에 포함된 대상 물질(analyte)의 화학반응이 일어나는 층으로 제공될 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 효소반응층(220)은 효소, 미디에이터 및 pH 완충액을 포함하는 것일 수 있다.The enzyme reaction layer 220 may be provided as a layer in which a chemical reaction of an analyte included in the sample occurs. In one embodiment, the enzyme reaction layer 220 may include an enzyme, a mediator, and a pH buffer.

상기 효소는 시료에 포함된 대상 물질(analyte)과 결합하여 효소-기질 복합체를 형성하여 화학반응의 활성화 에너지를 조절함으로써 물질 대사의 속도를 증가 혹은 감소시키기 위한 것일 수 있다.The enzyme may be for increasing or decreasing the rate of metabolism by binding to an analyte included in the sample to form an enzyme-substrate complex to control the activation energy of a chemical reaction.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 효소는 산화 효소 및 탈수소 효소로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 글루코오스 산화 효소(glucose oxidase), 글루코오스 탈수소 효소(glucose dehydrogenase), 락테이트 산화 효소(lactate oxidase) 및 락테이트 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 락테이트 산화 효소(lactate oxidase) 및 락테이트 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In one or a plurality of embodiments, the enzyme may include one or more selected from the group consisting of oxidative enzymes and dehydrogenases, preferably glucose oxidase, glucose dehydrogenase ), lactate oxidase and lactate dehydrogenase may be one or more selected from the group consisting of, more preferably lactate oxidase and lactate It may include one or more selected from the group consisting of dehydrogenase (lactate dehydrogenase).

상기 예시적인 산화 효소 또는 탈수소 효소에 따라 측정할 수 있는 검출 대상 물질(analyte)은, 글루코오스(glucose) 및 락테이트(lactate) 중 하나 이상일 수 있으며, 이들의 농도를 측정할 수 있다.The detection target substance (analyte) that can be measured according to the exemplary oxidizing enzyme or dehydrogenase may be one or more of glucose and lactate, and the concentration thereof may be measured.

일 실시 예에 있어서, 상기 산화 효소 또는 탈수소 효소는 바인더를 통해 고정될 수 있다. 상기 바인더는 본 발명이 속한 기술분야에서 통상적으로 사용되는 바인더를 포함하며, 일 실시 예에 있어서, 나피온(nafion) 이의 유도체 또는 키토산 등이 있을 수 있다.In one embodiment, the oxidase or dehydrogenase may be immobilized through a binder. The binder includes a binder commonly used in the art to which the present invention pertains, and in one embodiment, there may be a derivative thereof or chitosan, etc. of Nafion.

상기 미디에이터는 페리시안화칼륨, 시토크롬C, 피로로퀴놀린퀴논(PQQ), NAD+, NADP+, 동착체, 루테늄 화합물, 페나진메토설페이트 및 그 유도체, 포타슘 페리시아나이드(Potassium ferricyanide, K₃[Fe(CN)₆]), 포타슘 페로시아나이드(Potassium ferrocyanide, K₄[Fe(CN)₆]), 염화헥사아민루테늄(Ⅲ)(hexaamineruthenium(Ⅲ) chloride), 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체 및 하이드로퀴논(hydroquinone) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 루테늄 화합물, 및 페나진메토설페이트 및 그 유도체일 수 있다.The mediator is potassium ferricyanide, cytochrome C, pyrroroquinoline quinone (PQQ), NAD +, NADP +, a homo complex, a ruthenium compound, phenazinemethosulphate and its derivatives, potassium ferricyanide (Potassium ferricyanide, K ₃ [Fe (CN ) ₆ ]), potassium ferrocyanide (Potassium ferrocyanide, K ₄ [Fe(CN) ₆ ]), hexaamineruthenium(III) chloride, ferrocene, ferrocene derivatives, quinones ), quinone derivatives, and at least one selected from the group consisting of hydroquinone, etc. may be included, and preferably a ruthenium compound, and phenazinemethosulfate and derivatives thereof.

상기 루테늄 화합물로서는 종래 또는 이후 사용되는 루테늄 화합물을 사용할 수 있으며, 루테늄 화합물은 산화형의 루테늄 착체로서 상기 반응계에 존재할 수 있는 것인 것이 바람직하다. 상기 루테늄 착체로서는 미디에이터(전자전달체)로서 기능하면 그 배위자의 종류는 특별히 한정되지 않는다.As the ruthenium compound, a conventional or later ruthenium compound may be used, and the ruthenium compound is preferably an oxidized ruthenium complex that may exist in the reaction system. As the ruthenium complex, if it functions as a mediator (electron transport body), the type of the ligand is not particularly limited.

상기 페나진메토설페이트 및 그 유도체는 종래 또는 이후 사용되는 화합물을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 페나진메토설페이트 및 1-메톡시-5-메틸페나지늄메틸설페이트(1-메톡시PMS) 등이 있을 수 있다.As the phenazinemethosulfate and its derivatives, conventional or later used compounds may be used, for example, phenazinemethosulfate and 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (1-methoxy PMS), etc. This can be.

상기 pH 완충액은 검출 대상 물질(analyte)을 포함하는 시료의 pH에 따른 영향성을 저감 시킴으로써 다양한 pH 범위를 갖는 시료에 대해서도 일정한 검출 결과를 나타낼 수 있도록 하는 역할을 수행한다.The pH buffer serves to reduce the influence of the pH of the sample containing the detection target substance (analyte) so that a constant detection result can be displayed even for samples having various pH ranges.

상기 pH 완충액은 시료의 pH에 따른 영향성 저감 및 효소 활성도 저하 방지의 측면에서 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)을 포함하는 것이 바람직하다. The pH buffer preferably contains 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) in terms of reducing the influence of the pH of the sample and preventing the decrease in enzyme activity.

구체적으로, 종래 바이오센서는 생체 내 이온 농도 및 삼투압의 측면에서, pH 완충액으로 인산완충식염수(Phosphate-Buffered Saline; PBS)를 주로 사용하였다.Specifically, the conventional biosensor mainly used phosphate-buffered saline (PBS) as a pH buffer in terms of in vivo ion concentration and osmotic pressure.

그러나 PBS 완충액은, 포스페이트(Phosphate; PO₄ ^3-) 이외에도 염화 소듐(NaCl), 염화 포타슘(KCl) 등의 염을 포함하며, 이러한 이온들이 효소의 활성도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 글루코오스 산화효소(glucose oxidase)의 경우, PBS 완충액에 포함된 염소 이온(Cl^-) 등의 할라이드(halide) 이온이 산화 효소의 양성자 형태와 결합하여 방해 인자로 작용하므로, 효소의 활성도를 저하시킬 수 있으며, 특히 본 발명의 바람직한 실시예로 포함된 락테이트 산화 효소(lactate oxidase)의 경우 또한, PBS 완충액에 포함된 염소 이온(Cl^-) 및 포스페이트(Phosphate; PO₄ ^3-)가 방해 인자로 작용하여 효소의 활성도를 저하시키게 된다.However, PBS buffer includes salts such as sodium chloride (NaCl) and potassium chloride (KCl) in addition to phosphate (Phosphate; PO ₄ ^3- ), and these ions may affect enzyme activity. For example, in the case of glucose oxidase, halide ions such as chlorine ions (Cl ⁻ ) contained in PBS buffer bind to the proton form of the oxidase and act as an interfering factor, so the activity of the enzyme In particular, in the case of lactate oxidase included as a preferred embodiment of the present invention, chlorine ions (Cl ⁻ ) and phosphate (Phosphate; PO ₄ ^3- ) contained in PBS buffer It acts as an interfering factor and lowers the activity of the enzyme.

따라서, 바이오센서의 시료에 대한 pH 영향성을 저감시키기 위하여 고농도의 PBS 완충액을 사용할 경우 바이오센서의 감도 저하가 수반되는 문제가 있다.Therefore, when a high concentration of PBS buffer is used in order to reduce the effect of pH on the sample of the biosensor, there is a problem that the sensitivity of the biosensor is reduced.

이에, 본 발명은 상술한 종래 바이오센서에 포함되는 pH 완충액, 특히 PBS 완충액의 기술적 과제를 해결하기 위하여 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)을 포함하는 바이오센서를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a biosensor containing 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) in order to solve the technical problems of the pH buffer, particularly the PBS buffer, included in the conventional biosensor described above.

구체적으로, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)은, 쯔비터 이온(Zwitter ion)으로 구성되어 있어, 종래 효소 활성도의 저하를 야기시키는 포스페이트(Phosphate; PO₄ ^3-), 염소 이온(Cl^-) 등을 포함하지 않아 효소 활성도 저하를 방지함으로써 바이오센서의 감도를 향상시킬 수 있다.Specifically, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) is composed of zwitter ions, and phosphate (Phosphate; PO ₄ ^3- ), which causes a decrease in enzyme activity in the prior art, Since it does not contain chlorine ions (Cl ⁻ ), the sensitivity of the biosensor can be improved by preventing a decrease in enzyme activity.

상기 pH 완충액의 pH는, 다양한 pH 범위를 나타내는 시료에 대해서도 일정한 검출 결과를 나타낼 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 일 실시 예에 있어서, 상기 pH 완충액의 pH는, 6.5 내지 8일 수 있으며, 바람직하게는 6.5 내지 7.5일 수 있고, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7일 수 있다. pH 완충액의 pH가 상기 범위를 만족하는 경우, 다양한 pH 범위를 나타내는 시료에 대한 측정 편차를 최소화 할 수 있을 뿐만 아니라 바이오센서의 감도를 향상시킬 수 있다.The pH of the pH buffer is not particularly limited as long as it can show a constant detection result even for samples showing various pH ranges. In an embodiment, the pH of the pH buffer may be 6.5 to 8, preferably 6.5 to 7.5, and more preferably 6.5 to 7. When the pH of the pH buffer satisfies the above range, it is possible to minimize the measurement deviation for samples having various pH ranges, as well as improve the sensitivity of the biosensor.

상기 pH 완충액에 포함되는 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)의 농도는, 다양한 pH 범위를 나타내는 시료에 대해서도 일정한 검출 결과를 나타낼 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 일 실시 예에 있어서, 상기 pH 완충액의 농도는, 50mM 이상 500mM 미만일 수 있다. pH 완충액의 농도가 상기 범위를 만족하는 경우, 다양한 pH 범위를 나타내는 시료에 대한 측정 편차를 최소화 할 수 있을 뿐만 아니라 바이오센서의 감도를 향상시킬 수 있다.The concentration of 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) contained in the pH buffer is not particularly limited as long as it can show a constant detection result even for samples having various pH ranges. In an embodiment, the concentration of the pH buffer may be 50 mM or more and less than 500 mM. When the concentration of the pH buffer satisfies the above range, it is possible to minimize the measurement deviation for samples having various pH ranges, as well as improve the sensitivity of the biosensor.

일 실시 예에 있어서, 상기 효소반응층(220)은, 상술한 구성 성분들을 혼합하기 위한 용매로 탈이온수(DI water) 등을 더 포함할 수 있다.In an embodiment, the enzyme reaction layer 220 may further include deionized water (DI water) as a solvent for mixing the above-described components.

상기 효소반응층(220)에 의한 검출 원리를 예를 들어 설명하면, 검출 대상 물질(analyte)을 포함하는 시료를 바이오센서에 주입하면, 시료에 포함되어 있는 검출 대상 물질(analyte), 예컨대 기질(substrate)이 산화 효소 또는 탈수소 효소에 의해 산화되고, 산화 효소 또는 탈수소 효소는 환원된다. 이때, 전자전달매개체(미디에이터)는 촉매 반응을 일으킴으로써 상기 효소의 반응을 빠르게 유도하게 되며, 산화 효소 또는 탈수소 효소를 산화시키고, 자신은 환원된다. 환원된 전자전달매개체(미디에이터)는 일정 전압이 가해진 전극 표면에서 전자를 잃고 전기화학적으로 다시 산화된다. 시료 내 대상 물질(analyte)의 농도는 전자전달매개체(미디에이터)가 산화되는 과정에서 발생되는 전류량 내지 전류밀도 등에 비례하므로, 이 전류량 내지 전류밀도 등을 측정함으로써 대상 물질(analyte)의 농도를 측정할 수 있다.If the detection principle by the enzyme reaction layer 220 is described as an example, when a sample containing a detection target material (analyte) is injected into the biosensor, the detection target material (analyte) contained in the sample, for example, a substrate ( The substrate) is oxidized by an oxidase or dehydrogenase, and the oxidase or dehydrogenase is reduced. At this time, the electron transfer mediator (mediator) induces the reaction of the enzyme rapidly by causing a catalytic reaction, oxidizes an oxidizing enzyme or a dehydrogenase, and reduces itself. The reduced electron transport medium (mediator) loses electrons on the electrode surface to which a constant voltage is applied and is electrochemically oxidized again. Since the concentration of the analyte in the sample is proportional to the amount of current or the current density generated during the oxidation of the electron transport medium (mediator), the concentration of the analyte can be measured by measuring the amount of current or the current density. can

상기 고분자막층(230)은, 효소반응층(220) 상에 배치되는 것일 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 고분자막층(230)은 효소반응층(220)의 상면에 접촉하여 배치되는 것일 수 있다. 고분자막층(230)은 효소의 산화를 방지하고, 외부 물질로부터 효소를 보호함으로써 효소의 안정성을 높여, 바이오센서의 검출 성능을 향상시키기 위한 층으로 제공될 수 있다.The polymer film layer 230 may be disposed on the enzyme reaction layer 220 . In one embodiment, the polymer film layer 230 may be disposed in contact with the upper surface of the enzyme reaction layer (220). The polymer film layer 230 may be provided as a layer for improving the detection performance of the biosensor by preventing the oxidation of the enzyme and protecting the enzyme from external substances to increase the stability of the enzyme.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 고분자막층(230)은 수용성 고분자 및 비수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. In one or a plurality of embodiments, the polymer film layer 230 may include one or more selected from the group consisting of a water-soluble polymer and a water-insoluble polymer.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate; CA) 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In one or more embodiments, the water-soluble polymer is polyvinyl alcohol (PVA), hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxypropyl cellulose (HPC), carboxymethyl cellulose (carboxy) It may include one or more selected from the group consisting of methyl cellulose (CMC), cellulose acetate (CA), and polyvinyl pyrrolidone (PVP).

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 비수용성 고분자는 폴리우레탄(polyurethane; PU), 폴리카보네이트(polycarbonate; PC) 및 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride; PVC)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.In one or a plurality of embodiments, the water-insoluble polymer comprises at least one selected from the group consisting of polyurethane (PU), polycarbonate (PC) and polyvinyl chloride (PVC). may be doing

상기 기준전극(300)은, 전위가 일정하며 작업전극(200)의 발생 전위를 얻기 위한 전위의 기준이 되는 전극으로써의 역할을 수행하기 위하여 구비되는 것일 수 있다.The reference electrode 300 may have a constant potential and may be provided to serve as an electrode serving as a reference potential for obtaining the generated potential of the working electrode 200 .

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 상기 기준전극(300)은 은-염화은(Ag/AgCl) 전극, 칼로멜(calomel) 전극, 수은-황산수은(mercury sulfate) 전극, 및 수은-산화수은(mercury-oxide mercury) 전극 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있고, 온도 사이클에 대한 전위의 히스테리시스가 덜하고, 고온까지 전위가 안정하다는 점을 고려할 때, 은-염화은(Ag/AgCl) 전극인 것이 바람직하다. 은-염화은(Ag/AgCl) 전극은, Ag/AgCl 페이스트(paste)로부터 형성될 수 있다.In one or more embodiments, the reference electrode 300 is a silver-silver chloride (Ag/AgCl) electrode, a calomel electrode, a mercury-mercury sulfate electrode, and a mercury-mercury-oxide electrode. mercury) electrode, etc., considering that the potential has less hysteresis with respect to a temperature cycle and the potential is stable up to a high temperature, silver-silver chloride (Ag/AgCl) It is preferable that it is an electrode. The silver-silver chloride (Ag/AgCl) electrode may be formed from Ag/AgCl paste.

배선부(400)는, 기판(100) 상에 형성될 수 있다. 일 실시 예에 있어서, 배선부(400)는 기판(100)의 상면에 접촉하여 배치되는 것일 수 있으며, 작업전극(200) 및/또는 기준전극(300)과 전기적으로 연결되는 것일 수 있다. 배선부(400)는, 작업전극(200)과 기준전극(300)으로부터 측정된 신호 및 구동 신호 등의 전기적 신호를 전달하기 위한 채널(Channel)의 역할을 수행하기 위하여 구비되는 것일 수 있다.The wiring unit 400 may be formed on the substrate 100 . In an embodiment, the wiring unit 400 may be disposed in contact with the upper surface of the substrate 100 , and may be electrically connected to the working electrode 200 and/or the reference electrode 300 . The wiring unit 400 may be provided to serve as a channel for transmitting electrical signals such as signals and driving signals measured from the working electrode 200 and the reference electrode 300 .

일 실시 예에 있어서, 작업전극(200)에 연결된 배선과 기준전극(300)에 연결된 배선은 서로 전기적으로 이격될 수 있다.In an embodiment, the wiring connected to the working electrode 200 and the wiring connected to the reference electrode 300 may be electrically spaced apart from each other.

일 실시 예에 있어서, 상기 배선부(400)는, 작업전극(200) 및/또는 기준전극(300)의 적어도 일부와 동일한 소재로 형성되는 것일 수 있다. 일부 실시 예에 있어서, 상기 배선부(400)는, 작업전극(200) 및/또는 기준전극(300)의 적어도 일부와 일체로 형성되는 것일 수 있다. 예를 들어, 기판(100) 상에 금속 막을 형성하고 이를 패터닝(patterning)함으로써 배선부(400)를 일체로 형성할 수 있다.In an embodiment, the wiring unit 400 may be formed of the same material as at least a portion of the working electrode 200 and/or the reference electrode 300 . In some embodiments, the wiring unit 400 may be integrally formed with at least a portion of the working electrode 200 and/or the reference electrode 300 . For example, the wiring unit 400 may be integrally formed by forming a metal film on the substrate 100 and patterning it.

절연막(500)은, 기판(100) 상에 형성될 수 있다. 일 실시 예에 있어서 절연막(500)은 기판(100)의 상면에 접촉하여 형성되는 것일 수 있으며, 작업전극(200) 및 기준전극(300)의 측면에 인접하여 형성되는 것일 수 있다. 예를 들어, 절연막(500)은 작업전극(200) 및 기준전극(300)의 상면을 전체적으로 노출시킬 수 있다. 절연막(500)은, 작업전극(200) 및 기준전극(300)의 직접적 통전을 방지하기 위한 역할을 수행하기 위하여 구비되는 것일 수 있다.The insulating film 500 may be formed on the substrate 100 . In an embodiment, the insulating film 500 may be formed in contact with the upper surface of the substrate 100 , and may be formed adjacent to the side surfaces of the working electrode 200 and the reference electrode 300 . For example, the insulating layer 500 may entirely expose the upper surfaces of the working electrode 200 and the reference electrode 300 . The insulating film 500 may be provided to prevent direct conduction of the working electrode 200 and the reference electrode 300 .

일 실시 예에 있어서, 상기 절연막(500)은 배선부(400)의 상면 및 측면에 인접하여 형성되는 것일 수 있다. 예를 들어, 각각의 배선을 덮는 형태로 배치되는 것일 수 있다.In an embodiment, the insulating film 500 may be formed adjacent to the upper surface and the side surface of the wiring unit 400 . For example, it may be arranged to cover each wiring.

<바이오센서 제조방법> < Biosensor manufacturing method >

본 발명은, 상기 바이오센서의 제조를 위한 바이오센서 제조방법을 포함한다.The present invention includes a biosensor manufacturing method for manufacturing the biosensor.

일 실시 예에 있어서, 기판 상에 작업전극층을 형성하고, 작업전극층 상에 효소반응층을 형성하고, 효소반응층 상에 고분자막층을 형성함으로써, 작업전극을 제조할 수 있다.In one embodiment, the working electrode can be manufactured by forming a working electrode layer on a substrate, forming an enzyme reaction layer on the working electrode layer, and forming a polymer film layer on the enzyme reaction layer.

일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 작업전극층을 형성하는 단계는 스크린 인쇄, 활판 인쇄, 음각 인쇄, 평판 인쇄 및 포토리소그래피(photolithography)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 공정을 포함하여 수행되는 것일 수 있다. In one or a plurality of embodiments, the step of forming the working electrode layer may be performed including one or more processes selected from the group consisting of screen printing, letterpress printing, engraving printing, lithography, and photolithography. .

예를 들어, 기판 상에 카본 페이스트(carbon paste)를 스크린 인쇄법으로 인쇄하거나, 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 티타늄(Ti), 니켈(Ni), 주석(Sn), 몰리브덴(Mo), 팔라듐(Pd), 코발트(Co) 및 이들의 합금으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 금속막을 형성하고 이를 포토리소그래피(photolithography) 공법 등에 의해 패터닝(patterning)하여 형성될 수 있다.For example, carbon paste is printed on a substrate by screen printing, or gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt), titanium (Ti), nickel (Ni) , tin (Sn), molybdenum (Mo), palladium (Pd), cobalt (Co), and forming a metal film containing at least one selected from the group consisting of alloys thereof, and patterning it by a photolithography (photolithography) method, etc. patterning) can be formed.

일 실시 예에 있어서, 작업전극층이 금속보호층을 더 포함할 경우, 금속층을 먼저 패터닝(patterning) 한 후 상기 금속보호층을 형성하거나, 상기 금속막 상에 ITO(Indium Tin Oxide) 또는 IZO(Indium Zinc Oxide) 도전성 산화물 막을 형성한 후, 상기 금속막과 도전성 산화물 막을 함께 패터닝하여 금속층 및 금속보호층을 함께 형성할 수 있다.In an embodiment, when the working electrode layer further includes a metal protective layer, the metal layer is first patterned and then the metal protective layer is formed, or ITO (Indium Tin Oxide) or IZO (Indium) on the metal film After the zinc oxide) conductive oxide layer is formed, the metal layer and the conductive oxide layer may be patterned together to form a metal layer and a metal protective layer together.

효소반응층을 형성하는 단계 및 고분자막층을 형성하는 단계는 본 발명이 속한 기술분야에서 통상적으로 사용되는 도포법이 사용될 수 있다. 일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 흐름코팅(flow coating), 잉크젯(ink jet), 및 드롭 캐스팅(drop casting)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 수행될 수 있으며, 드롭 캐스팅(drop casting)인 것이 더욱 바람직하다.For the step of forming the enzyme reaction layer and the step of forming the polymer film layer, a coating method commonly used in the art to which the present invention belongs may be used. In one or a plurality of embodiments, it may be performed by any one selected from the group consisting of flow coating, ink jet, and drop casting, and drop casting is more preferably.

일 실시 예에 있어서, 기준전극은 Ag/AgCl 페이스트(paste) 등을 사용하여 형성될 수 있으며, 실질적으로 상기 작업전극의 제조 방법과 동일한 방법으로 제조될 수 있다.In an embodiment, the reference electrode may be formed using Ag/AgCl paste, etc., and may be manufactured in substantially the same manner as the manufacturing method of the working electrode.

상기 제조방법에 의해 제조되는 바이오센서는, 상기 항목 <바이오센서>에서 서술한 모든 특성을 나타내는 것일 수 있다.The biosensor manufactured by the manufacturing method may exhibit all the characteristics described in the item <biosensor> .

<바이오센서 신호 측정방법><Measuring method of biosensor signal>

본 발명은, 상기 바이오센서 제조방법으로 제조된 바이오센서를 이용한 분석물의 전기화학적 신호 측정방법을 포함한다.The present invention includes a method for measuring an electrochemical signal of an analyte using a biosensor manufactured by the above biosensor manufacturing method.

본 명세서에 있어서 「전기 화학적으로 측정한다」란, 전기 화학적인 측정 수법을 적용하여 측정하는 것을 말하며, 일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 전류 측정법, 전위차 측정법, 전량 분석법 등을 들 수 있고, 바람직하게는 전류 측정법일 수 있다.As used herein, "electrochemically measured" refers to measurement by applying an electrochemical measurement method, and in one or more embodiments, an amperometric method, a potential difference measurement method, a coulometric analysis method, etc. are mentioned, preferably For example, it may be an amperometric method.

일 실시 예에 있어서, 본 발명의 바이오센서 신호 측정방법은 시료와의 접촉 후에 상기 작업전극과 기준전극을 포함하는 전극부에 전압을 인가하는 것, 인가 시에 방출되는 응답 전류치를 측정하는 것, 및, 상기 응답 전류치에 기초하여 상기 시료 중의 검출 대상 물질(analyte)의 전기화학적 신호를 산출하는 것을 포함할 수 있다. 인가 전압으로서는 특별히 제한되는 것은 아니나, 일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 은-염화은 전극(Ag/AgCl 전극)을 기준으로, -500 내지 +500mV일수 있으며 바람직하게는 -200 내지 +200 mV일수 있다. In an embodiment, the method for measuring a biosensor signal of the present invention includes applying a voltage to an electrode unit including the working electrode and the reference electrode after contact with the sample, measuring a response current emitted upon application, and calculating an electrochemical signal of an analyte in the sample based on the response current value. The applied voltage is not particularly limited, but in one or a plurality of embodiments, it may be -500 to +500 mV, preferably -200 to +200 mV, based on the silver-silver chloride electrode (Ag/AgCl electrode). .

일 실시 예에 있어서, 본 발명의 바이오센서 신호 측정방법은 상기 시료와 접촉 후 소정 시간 비인가의 상태로 유지한 후, 상기 전극부에 전압을 인가해도 되고, 상기 시약과의 접촉과 동시에 전극부에 전압을 인가해도 된다.In an embodiment, in the method for measuring a biosensor signal of the present invention, a voltage may be applied to the electrode part after maintaining the non-applied state for a predetermined time after contact with the sample, or the electrode part may be contacted with the reagent at the same time A voltage may be applied.

본 발명의 바이오센서 신호 측정방법에 의하면, 다양한 pH 범위를 나타내는 시료에 대한 측정 편차를 최소화 함으로써 바이오센서의 정확성과 정밀성을 향상시킬 수 있으며, 바이오센서의 감도를 더욱 향상시킬 수 있다.According to the method for measuring a biosensor signal of the present invention, the accuracy and precision of the biosensor can be improved by minimizing the measurement deviation for samples showing various pH ranges, and the sensitivity of the biosensor can be further improved.

<바이오센서 신호 측정시스템><Biosensor signal measurement system>

본 발명은 상기 바이오센서와, 상기 바이오센서의 전극부에 전압을 인가하는 수단과, 전극부에 있어서의 전류를 측정하기 위한 수단을 포함하는, 시료 중의 검출 대상 물질(analyte)의 전기화학적 신호를 측정하기 위한 바이오센서의 전기화학적 신호 측정시스템에 관한 것이다.The present invention provides an electrochemical signal of a detection target substance (analyte) in a sample, comprising the biosensor, means for applying a voltage to an electrode part of the biosensor, and means for measuring a current in the electrode part It relates to an electrochemical signal measuring system of a biosensor for measuring.

본 발명의 바이오센서 신호 측정시스템에 의하면, 다양한 pH 범위를 나타내는 시료에 대해서도 높은 정확성과 정밀도로 측정이 가능하며, 측정 감도가 더욱 향상될 수 있다.According to the biosensor signal measuring system of the present invention, it is possible to measure with high accuracy and precision even for samples having various pH ranges, and the measurement sensitivity can be further improved.

인가 수단으로서는, 바이오센서의 전극부와 도통하고, 전압을 인가 가능하면 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지의 인가 수단을 사용할 수 있다. 인가 수단으로서는, 일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 바이오센서의 전극부와 접촉 가능한 접촉자, 및 직류 전원 등의 전원 등을 포함할 수 있다.The application means is not particularly limited as long as it conducts with the electrode portion of the biosensor and can apply a voltage, and a known application means can be used. The application means may include, in one or more embodiments, a contact capable of contacting the electrode portion of the biosensor, and a power source such as a DC power supply.

측정 수단은, 전압 인가 시에 발생한 전극부에 있어서의 복수의 전류를 측정하기 위한 것으로서, 일 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 바이오센서의 전극부로부터 방출되는 전자의 양에 상관하는 응답 전류치를 측정 가능한 것이면 되고, 종래 또는 이후 개발되는 바이오센서에 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다.The measuring means is for measuring a plurality of currents in the electrode unit generated at the time of voltage application, and in one or more embodiments, measures a response current value correlating with the amount of electrons emitted from the electrode unit of the biosensor As long as it is possible, the one used in the conventionally or later developed biosensor may be used.

이하, 구체적으로 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Hereinafter, examples of the present invention will be specifically described. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various different forms, and only these embodiments allow the disclosure of the present invention to be complete, and common knowledge in the technical field to which the present invention pertains It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.

<실시예, 비교예 및 참고예><Examples, Comparative Examples and Reference Examples>

실시예 1Example 1

도 1에 도시된 바이오센서와 같은 구조의 실시예 1의 바이오센서를 제작하였다.The biosensor of Example 1 having the same structure as the biosensor shown in FIG. 1 was manufactured.

우선, 락트산 센서의 기판(100)으로서, PET제 기판(길이 30~40㎜, 폭 3~10㎜, 두께 188㎛)을 준비하고, 그 한쪽의 표면에, 작업전극층(210)으로는 Carbon paste(대주전자재료사제)를, 기준전극(300)으로는 Silver paste(대주전자재료사제)를 각각 10~30㎛ 두께로 250 메쉬 스크린을 사용하여 스크린 인쇄하였다. 그리고 Carbon paste는 100℃에서 20분간, Silver paste는 80℃에서 10분간 가열 처리를 하였다.First, as the substrate 100 of the lactic acid sensor, a PET substrate (length 30-40 mm, width 3-10 mm, thickness 188 μm) is prepared, and on one surface, carbon paste is used as the working electrode layer 210 (Daejoo Electronic Materials Co., Ltd.) was screen-printed using a 250 mesh screen to a thickness of 10 to 30 μm, respectively, with silver paste (Daejoo Electronic Materials Co., Ltd.) as the reference electrode 300 . And carbon paste was heated at 100℃ for 20 minutes and silver paste was heated at 80℃ for 10 minutes.

이후, 상기 작업전극층(210)과 기준전극(300)을 제외한 전극부 및 배선부(400)의 상면 상에 절연성 페이스트(대주전자재료사제)를 10~50㎛ 두께로 250 메쉬 스크린을 사용하여 스크린 인쇄하였다. 그리고 120℃에서 15분간 가열 처리를 하였다.Thereafter, an insulating paste (manufactured by Daejoo Electronic Materials Co., Ltd.) is applied on the upper surfaces of the electrode part and the wiring part 400 except for the working electrode layer 210 and the reference electrode 300 to a thickness of 10-50 μm using a 250 mesh screen. printed. And it heat-processed at 120 degreeC for 15 minutes.

이후, 작업전극층(210) 상에 용액 2.0㎕당 락트산 옥시다아제(상품명 「LCO301」, 토요보사제) 8U, Hexaammineruthenium(III) chloride, 98%(363340010, 아크로스사제) 1.5㎍, 1-m-PMS(M8640, 알드리치사제) 20nmol, MES 완충액(pH 7; 100mM) 0.4㎕를 포함하는 용액을 조제하여, 해당 용액 2.0㎕를 검출부에 드롭캐스팅(drop casting)하여 효소반응층(220)을 형성하였다.Then, on the working electrode layer 210, lactic acid oxidase (trade name "LCO301", manufactured by Toyobo) 8U, Hexaammineruthenium(III) chloride, 98% (363340010, manufactured by Acros) 1.5㎍, 1-m-PMS per 2.0 μl of solution on the working electrode layer 210 ( M8640, manufactured by Aldrich) 20 nmol, MES buffer (pH 7; 100 mM) 0.4 μl was prepared, and 2.0 μl of the solution was drop-cast to the detector to form the enzyme reaction layer 220 .

이후, 상기 효소반응층(220) 상에 PVA(1% PVA in PBS, 알드리치사제) 1.2㎕를 도포하고 1시간동안 건조하여, 고분자막층(230)을 형성함으로써, 실시예 1의 바이오센서를 제작하였다.Thereafter, 1.2 μl of PVA (1% PVA in PBS, manufactured by Aldrich) was applied on the enzyme reaction layer 220 and dried for 1 hour to form a polymer film layer 230, thereby preparing the biosensor of Example 1. did.

비교예 1Comparative Example 1

효소반응층(220)에 포함되는 MES 완충액(pH 7; 100mM)을 PBS 완충액(pH 7; 100mM)으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 비교예 1의 바이오센서를 제작하였다.A biosensor of Comparative Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the MES buffer (pH 7; 100 mM) included in the enzyme reaction layer 220 was changed to the PBS buffer (pH 7; 100 mM).

비교예 2Comparative Example 2

효소반응층(220)에 포함되는 MES 완충액(pH 7; 100mM)을 N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산(ADA) 완충액(pH 7; 100mM)으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 비교예 2의 바이오센서를 제작하였다.Example, except that the MES buffer (pH 7; 100 mM) included in the enzyme reaction layer 220 was changed to N-(2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) buffer (pH 7; 100 mM) In the same manner as in 1, a biosensor of Comparative Example 2 was prepared.

참고예 1Reference Example 1

효소반응층(220)에 포함되는 MES 완충액(pH 7; 100mM)을 MES 완충액(pH 6; 100mM)으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 참고예 1의 바이오센서를 제작하였다.The biosensor of Reference Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the MES buffer (pH 7; 100 mM) included in the enzyme reaction layer 220 was changed to the MES buffer (pH 6; 100 mM).

참고예 2Reference Example 2

효소반응층(220)에 포함되는 MES 완충액(pH 7; 100mM)을 MES 완충액(pH 6.5; 100mM)으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 참고예 2의 바이오센서를 제작하였다.The biosensor of Reference Example 2 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the MES buffer (pH 7; 100 mM) included in the enzyme reaction layer 220 was changed to the MES buffer (pH 6.5; 100 mM).

참고예 3Reference Example 3

효소반응층(220)에 포함되는 MES 완충액(pH 7; 100mM)을 MES 완충액(pH 7; 50mM)으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 참고예 3의 바이오센서를 제작하였다.A biosensor of Reference Example 3 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the MES buffer (pH 7; 100 mM) included in the enzyme reaction layer 220 was changed to the MES buffer (pH 7; 50 mM).

참고예 4Reference Example 4

효소반응층(220)에 포함되는 MES 완충액(pH 7; 100mM)을 MES 완충액(pH 7; 200mM)으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 참고예 4의 바이오센서를 제작하였다.A biosensor of Reference Example 4 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the MES buffer (pH 7; 100 mM) included in the enzyme reaction layer 220 was changed to the MES buffer (pH 7; 200 mM).

참고예 5Reference Example 5

효소반응층(220)에 포함되는 MES 완충액(pH 7; 100mM)을 MES 완충액(pH 7; 500mM)으로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 참고예 5의 바이오센서를 제작하였다.A biosensor of Reference Example 5 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the MES buffer (pH 7; 100 mM) included in the enzyme reaction layer 220 was changed to the MES buffer (pH 7; 500 mM).

<실험예 1>: pH 완충액의 종류에 따른 바이오센서 평가<Experimental Example 1>: Biosensor evaluation according to the type of pH buffer

상기 실시예 1, 비교예 1 및 2에 따른 바이오센서를 하기 측정 방법을 이용하여 시료 중의 락트산 농도에 따른 전류 값을 측정함으로써, 다양한 pH 범위의 시료에 대한 pH 안정성을 평가하였다.By measuring the current value according to the lactic acid concentration in the sample using the biosensor according to Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 using the following measurement method, pH stability for samples in various pH ranges was evaluated.

시료로서는 10mM, 20mM 및 30mM의 락트산 조합액 10㎕를 사용하고, 측정 장치는 CHI630를 이용했다. 측정은, 25℃, 60~70RH%로 설정한 항온항습의 환경 실험실 내에서, 바이오센서에 시료를 공급한 후, 검체 검지 후 15초 동안 200mV의 전압을 인가함으로써 행했다. As a sample, 10 microliters of a 10 mM, 20 mM, and 30 mM lactic acid combination solution was used, and CHI630 was used as a measuring device. The measurement was performed by supplying a sample to the biosensor in a constant temperature and humidity environmental laboratory set at 25° C. and 60 to 70 RH%, and then applying a voltage of 200 mV for 15 seconds after detecting the sample.

상기 실시예 1, 비교예 1 및 2에 따른 바이오센서의 평가 결과를 하기 표 1 및 도 4에 나타내었다.The evaluation results of the biosensors according to Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 are shown in Table 1 and FIG. 4 below.

구분division 결과result pH 5pH 5 pH 6pH 6 pH 7pH 7 pH 8pH 8 비교예 1Comparative Example 1 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.310.31 0.400.40 0.410.41 0.380.38 R² R ² 98.598.5 97.897.8 95.695.6 92.892.8 p-valuep-value 10mM10 mM 0.0000.000 20mM20 mM 0.0000.000 30mM30 mM 0.0000.000 비교예 2Comparative Example 2 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.590.59 0.660.66 0.660.66 0.690.69 R² R ² 96.196.1 88.388.3 95.595.5 91.191.1 p-valuep-value 10mM10 mM 0.2710.271 20mM20 mM 0.0070.007 30mM30 mM 0.0000.000 실시예 1Example 1 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.720.72 0.750.75 0.730.73 0.690.69 R² R ² 94.294.2 86.986.9 93.493.4 89.289.2 p-valuep-value 10mM10 mM 0.4660.466 20mM20 mM 0.1230.123 30mM30 mM 0.0590.059

상기 표 1을 참조하면, 실시예 1의 바이오센서의 경우 pH 5 내지 8의 시료에 대하여, 시료 농도 10 내지 30mM에 대한 p-value 값이 0.05 이상을 나타내고 있어, 감응 범위 전체에 대하여 pH 영향성이 저감되었음을 확인할 수 있다.Referring to Table 1, in the case of the biosensor of Example 1, with respect to a sample of pH 5 to 8, a p-value value for a sample concentration of 10 to 30 mM is 0.05 or more, and thus the pH effect over the entire sensitivity range It can be seen that this has been reduced.

반면, 비교예 1의 바이오 센서의 경우 pH 5 내지 8의 시료에 대하여, 시료 농도 10 내지 30mM에 대한 p-value 값이 0.000을 나타내고 있어, 시료의 pH에 따른 측정 편차가 증가하였음을 확인할 수 있다.On the other hand, in the case of the biosensor of Comparative Example 1, the p-value for the sample concentration of 10 to 30 mM for the sample of pH 5 to 8 was 0.000, confirming that the measurement deviation according to the pH of the sample increased. .

또한, 비교예 2의 바이오 센서의 경우 pH 5 내지 8의 시료에 대하여, 시료 농도 20 내지 30mM에 대한 p-value 값이 0.000 내지 0.007을 나타내고 있어, 시료의 pH에 따른 측정 편차가 증가하였음을 확인할 수 있다.In addition, in the case of the biosensor of Comparative Example 2, the p-value for the sample concentration of 20 to 30 mM for the sample of pH 5 to 8 was 0.000 to 0.007, confirming that the measurement deviation according to the pH of the sample increased. can

<실험예 2>: MES 완충액의 pH에 따른 바이오센서 평가<Experimental Example 2>: Biosensor evaluation according to the pH of the MES buffer

상기 실시예 1, 참고예 1 및 2에 따른 바이오센서를 하기 측정 방법을 이용하여 시료 중의 락트산 농도에 따른 전류 값을 측정함으로써, 다양한 pH 범위의 시료에 대한 pH 안정성을 평가하였다.By measuring the current value according to the concentration of lactic acid in the sample using the biosensor according to Example 1 and Reference Examples 1 and 2 using the following measurement method, pH stability for samples in various pH ranges was evaluated.

시료로서는 10mM, 20mM 및 30mM의 락트산 조합액 10㎕를 사용하고, 측정 장치는 CHI630를 이용했다. 측정은, 25℃, 60~70RH%로 설정한 항온항습의 환경 실험실 내에서, 바이오센서에 시료를 공급한 후, 검체 검지 후 15초 동안 200mV의 전압을 인가함으로써 행했다. As a sample, 10 microliters of a 10 mM, 20 mM, and 30 mM lactic acid combination solution was used, and CHI630 was used as a measuring device. The measurement was performed by supplying a sample to the biosensor in a constant temperature and humidity environmental laboratory set at 25° C. and 60 to 70 RH%, and then applying a voltage of 200 mV for 15 seconds after detecting the sample.

상기 실시예 1, 참고예 1 및 2에 따른 바이오센서의 평가 결과를 하기 표 2 및 도 5에 나타내었다.The evaluation results of the biosensors according to Example 1 and Reference Examples 1 and 2 are shown in Table 2 and FIG. 5 below.

구분division 결과result pH 5pH 5 pH 6pH 6 pH 7pH 7 pH 8pH 8 참고예 1Reference Example 1 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.520.52 0.470.47 0.510.51 0.470.47 R² R ² 95.695.6 92.892.8 90.990.9 94.894.8 p-valuep-value 10mM10 mM 0.0050.005 20mM20 mM 0.0000.000 30mM30 mM 0.0020.002 참고예 2Reference Example 2 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.600.60 0.580.58 0.590.59 0.610.61 R² R ² 93.393.3 94.694.6 89.989.9 93.793.7 p-valuep-value 10mM10 mM 0.5260.526 20mM20 mM 0.2690.269 30mM30 mM 0.2860.286 실시예 1Example 1 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.720.72 0.750.75 0.730.73 0.690.69 R² R ² 94.294.2 86.986.9 93.493.4 89.289.2 p-valuep-value 10mM10 mM 0.4660.466 20mM20 mM 0.1230.123 30mM30 mM 0.0590.059

상기 표 2을 참조하면, 실시예 1 및 참고예 2의 바이오센서의 경우 pH 5 내지 8의 시료에 대하여, 시료 농도 10 내지 30mM에 대한 p-value 값이 0.05 이상을 나타내고 있어, 감응 범위 전체에 대하여 pH 영향성이 저감되었음을 확인할 수 있다.Referring to Table 2, in the case of the biosensors of Example 1 and Reference Example 2, the p-value for the sample concentration of 10 to 30 mM for the sample of pH 5 to 8 was 0.05 or more, so that the entire sensitivity range was It can be seen that the pH effect was reduced.

반면, 참고예 1의 바이오센서의 경우 pH 5 내지 8의 시료에 대하여, 시료 농도 10 내지 30mM에 대한 p-value 값이 0.000 내지 0.005를 나타내고 있어, 시료의 pH에 따른 측정 편차가 증가하였음을 확인할 수 있다.On the other hand, in the case of the biosensor of Reference Example 1, the p-value for the sample concentration of 10 to 30 mM for the sample of pH 5 to 8 was 0.000 to 0.005, confirming that the measurement deviation according to the pH of the sample increased. can

<실험예 3>: MES 완충액의 농도에 따른 바이오센서 평가<Experimental Example 3>: Biosensor evaluation according to the concentration of MES buffer

상기 실시예 1 및 참고예 3 내지 5에 따른 바이오센서를 하기 측정 방법을 이용하여 시료 중의 락트산 농도에 따른 전류 값을 측정함으로써, 다양한 pH 범위의 시료에 대한 pH 안정성을 평가하였다.The biosensors according to Example 1 and Reference Examples 3 to 5 were evaluated for pH stability for samples in various pH ranges by measuring current values according to the lactic acid concentration in the sample using the following measurement method.

시료로서는 10mM, 20mM 및 30mM의 락트산 조합액 10㎕를 사용하고, 측정 장치는 CHI630를 이용했다. 측정은, 25℃, 60~70RH%로 설정한 항온항습의 환경 실험실 내에서, 바이오센서에 시료를 공급한 후, 검체 검지 후 15초 동안 200mV의 전압을 인가함으로써 행했다. As a sample, 10 microliters of a 10 mM, 20 mM, and 30 mM lactic acid combination solution was used, and CHI630 was used as a measuring device. The measurement was performed by supplying a sample to the biosensor in a constant temperature and humidity environmental laboratory set at 25° C. and 60 to 70 RH%, and then applying a voltage of 200 mV for 15 seconds after detecting the sample.

상기 실시예 1 및 참고예 3 내지 5에 따른 바이오센서의 평가 결과를 하기 표 3 및 도 6에 나타내었다.The evaluation results of the biosensors according to Example 1 and Reference Examples 3 to 5 are shown in Table 3 and FIG. 6 below.

구분division 결과result pH 5pH 5 pH 6pH 6 pH 7pH 7 pH 8pH 8 참고예 3Reference Example 3 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.470.47 0.430.43 0.430.43 0.570.57 R² R ² 88.388.3 91.891.8 76.476.4 89.589.5 p-valuep-value 10mM10 mM 0.0860.086 20mM20 mM 0.1220.122 30mM30 mM 0.1290.129 참고예 4Reference Example 4 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.660.66 0.590.59 0.660.66 0.570.57 R² R ² 94.294.2 90.290.2 93.193.1 86.986.9 p-valuep-value 10mM10 mM 0.1840.184 20mM20 mM 0.1590.159 30mM30 mM 0.3300.330 참고예 5Reference Example 5 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.320.32 0.290.29 0.150.15 0.240.24 R² R ² 89.789.7 85.685.6 89.389.3 78.378.3 p-valuep-value 10mM10 mM 0.2010.201 20mM20 mM 0.0080.008 30mM30 mM 0.0590.059 실시예 1Example 1 검량선
(10 ~ 30mM)calibration curve
(10 to 30 mM) 기울기inclination 0.720.72 0.750.75 0.730.73 0.690.69 R² R ² 94.294.2 86.986.9 93.493.4 89.289.2 p-valuep-value 10mM10 mM 0.4660.466 20mM20 mM 0.1230.123 30mM30 mM 0.0590.059

상기 표 3을 참조하면, 참고예 3, 4 및 실시예 1의 바이오센서의 경우 pH 5 내지 8의 시료에 대하여, 시료 농도 10 내지 30mM에 대한 p-value 값이 0.05 이상을 나타내고 있어, 감응 범위 전체에 대하여 pH 영향성이 저감되었음을 확인할 수 있다.Referring to Table 3, in the case of the biosensors of Reference Examples 3, 4 and Example 1, for the samples at pH 5 to 8, the p-value for the sample concentration of 10 to 30 mM was 0.05 or more, and the sensitivity range It can be seen that the pH effect was reduced for the whole.

반면, 참고예 5의 바이오센서의 경우 pH 5 내지 8의 시료에 대하여, 시료 농도 20mM에 대한 p-value 값이 0.008을 나타내고 있어, 시료의 pH에 따른 측정 편차가 증가하였음을 확인할 수 있다.On the other hand, in the case of the biosensor of Reference Example 5, the p-value for the sample concentration of 20 mM for the samples of pH 5 to 8 was 0.008, confirming that the measurement deviation according to the pH of the sample increased.

따라서, pH 완충액에 포함되는 MES의 pH 및 농도를 적절히 조절함으로써, pH 영향성이 저감되면서도 감도가 더욱 향상된 바이오센서를 제작할 수 있다.Therefore, by appropriately adjusting the pH and concentration of the MES contained in the pH buffer, a biosensor with improved sensitivity while reducing the pH effect can be manufactured.

100: 기판
200: 작업전극
210: 작업전극층
220: 효소반응층
230: 고분자막층
300: 기준전극
400: 배선부
500: 절연막100: substrate
200: working electrode
210: working electrode layer
220: enzyme reaction layer
230: polymer film layer
300: reference electrode
400: wiring unit
500: insulating film

Claims (9)

기판 및 상기 기판 상에 형성되는 작업전극과 기준전극을 포함하며,
상기 작업전극은 기판 상에 형성되는 작업전극층 및 상기 작업전극층 상에 형성되는 효소반응층을 포함하며,
상기 효소반응층은 글루코오스 산화 효소(glucose oxidase), 글루코오스 탈수소 효소(glucose dehydrogenase), 락테이트 산화 효소(lactate oxidase) 및 락테이트 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소; 미디에이터; 및 pH 완충액을 포함하며,
상기 pH 완충액은 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)을 포함하는, 바이오센서.
It includes a substrate and a working electrode and a reference electrode formed on the substrate,
The working electrode includes a working electrode layer formed on a substrate and an enzyme reaction layer formed on the working electrode layer,
The enzyme reaction layer includes at least one enzyme selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase and lactate dehydrogenase; mediator; and a pH buffer;
The pH buffer comprises 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES).
청구항 1에 있어서, 상기 pH 완충액의 pH가 6.5 내지 8인, 바이오센서.
The biosensor of claim 1, wherein the pH of the pH buffer is 6.5 to 8.
청구항 1에 있어서, 상기 pH 완충액에 포함되는 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)의 농도가 50mM 이상 500mM 미만인, 바이오센서.
The biosensor of claim 1, wherein the concentration of 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) contained in the pH buffer is 50 mM or more and less than 500 mM.
청구항 1에 있어서, 상기 미디에이터는 페리시안화칼륨, 시토크롬C, 피로로퀴놀린퀴논(PQQ), NAD+, NADP+, 동착체, 루테늄 화합물, 페나진메토설페이트 및 그 유도체, 포타슘 페리시아나이드(Potassium ferricyanide, K₃[Fe(CN)₆]), 포타슘 페로시아나이드(Potassium ferrocyanide, K₄[Fe(CN)₆]), 염화헥사아민루테늄(Ⅲ)(hexaamineruthenium(Ⅲ) chloride), 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체 및 하이드로퀴논(hydroquinone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 바이오센서.
The method according to claim 1, wherein the mediator is potassium ferricyanide, cytochrome C, pyrroroquinoline quinone (PQQ), NAD+, NADP+, a copper complex, a ruthenium compound, phenazinemethosulphate and derivatives thereof, potassium ferricyanide (Potassium ferricyanide, K ₃ [Fe(CN) ₆ ]), potassium ferrocyanide (K ₄ [Fe(CN) ₆ ]), hexaamineruthenium(III) chloride), ferrocene, ferrocene A biosensor comprising at least one selected from the group consisting of derivatives, quinones, quinone derivatives, and hydroquinones.
청구항 1에 있어서, 상기 작업전극층은 탄소전극층 및 금속전극층으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 바이오센서.
The biosensor of claim 1, wherein the working electrode layer comprises at least one selected from the group consisting of a carbon electrode layer and a metal electrode layer.
청구항 5에 있어서, 상기 금속전극층은 금속층 및 금속보호층으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 바이오센서.
The biosensor of claim 5, wherein the metal electrode layer comprises at least one selected from the group consisting of a metal layer and a metal protective layer.
청구항 1에 있어서, 상기 효소반응층 상에 형성되는 고분자막층을 더 포함하는, 바이오센서.
The biosensor of claim 1, further comprising a polymer film layer formed on the enzyme reaction layer.
청구항 7에 있어서, 상기 고분자막층은 수용성 고분자 및 비수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 바이오센서.
The biosensor of claim 7, wherein the polymer film layer comprises at least one selected from the group consisting of water-soluble polymers and water-insoluble polymers.
청구항 8에 있어서, 상기 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate; CA) 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하며,
상기 비수용성 고분자는 폴리우레탄(polyurethane; PU), 폴리카보네이트(polycarbonate; PC) 및 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride; PVC)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 바이오센서.
The method according to claim 8, wherein the water-soluble polymer is polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol; PVA), hydroxyethyl cellulose (hydroxyethyl cellulose; HEC), hydroxypropyl cellulose (hydroxypropyl cellulose; HPC), carboxymethyl cellulose (carboxy methyl cellulose; CMC) ), including one or more selected from the group consisting of cellulose acetate (CA) and polyvinyl pyrrolidone (PVP),
The water-insoluble polymer comprises at least one selected from the group consisting of polyurethane (polyurethane; PU), polycarbonate (PC) and polyvinyl chloride (PVC), a biosensor.

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