JP3955379B2 - Ｃ型肝炎ウイルス除去用吸着材、吸着装置及び吸着方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液、血漿等の体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去することにより、Ｃ型肝炎の治療を促進させるＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材、この吸着材を用いた吸着装置、及び、Ｃ型肝炎ウイルスの吸着除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８９年、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡウイルスゲノムのクローン化が発表され（Ｑ．Ｌ．Ｃｈｏｏら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９（１９８９））、これを基に組換え体を用いたＣ型肝炎ウイルスの抗体の測定が可能となった。その結果、従来非Ａ非Ｂ型肝炎とされていた肝炎の殆どがＣ型肝炎であることが判明すると共に、現在本邦にはＣ型肝炎ウイルスのキャリアーが約２００万人、その内１４０万人が慢性肝炎、３０万人が肝硬変の罹病者であると推定されるようになってきた。（飯野四郎：消化器診療プラクティス２．Ｃ型肝炎，１１−１７（１９９３））。
【０００３】
また、厚生省の人口動態統計によれば、１９９２年の原発性肝癌による死亡者数は年間２．７万人と報告されている（平成４年人口動態統計．厚生省大臣官房統計情報部編，上巻，（１９９３））が、この約７割はＣ型肝炎ウイルス感染が原因となる肝細胞癌であり、慢性肝炎から肝硬変をへて発生するものと考えられてきている（Ｓ．Ｋａｎｅｋｏら；Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，３７，１０８（１９９４）），松下栄紀ら；日本臨床５３，７２７（１９９５増刊））。従って、Ｃ型肝炎は肝硬変、肝細胞癌へと進む難治性の疾患と言える。
【０００４】
Ｃ型肝炎の治療は、従来安静療法、食事療法及び肝庇護剤や漢方薬を中心とした薬物療法が主なものであったが、これらの治療法では肝炎ウイルスを排除できないため、治癒例は極めて少なく、肝壊死の軽減による慢性肝疾患の進展抑制に主眼が置かれていた。従って、長期化に伴い最終的には前述のごとく、肝硬変や肝細胞癌へと不幸な転帰を迎える症例が多い。
【０００５】
一方、最近、インターフェロンの大量生産が可能となり、しかもこれらの蛋白質がＣ型肝炎ウイルスと近縁のＲＮＡ型ウイルスにもｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ウイルス活性を示したのみならず（二宮康行ら；基礎と臨床，１９，２３１（１９８５））、ＲＮＡ型ウイルス感染マウスにおいても感染防御効果を示したことから（Ｍ．Ｋｒａｍｅｒら；Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，３，４２５（１９８３））、臨床でのＣ型肝炎に対する効果が期待された。
【０００６】
実際に、組換え型インターフェロン−αによる非Ａ非Ｂ型肝炎疾患への治療で血清トランスアミナーゼ値が正常化することが見い出され（Ｊ．Ｈ．Ｈｏｏｆｎａｇｅｌら；Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１５，１５７５（１９８６））、又Ｃ型肝炎患者への投与で、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡが血中から持続的に陰性化する症例も認められたことから（Ｋ．Ｃｈａｙａｍａら；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１３，１０４０（１９９１）、萩原秀紀ら；日消誌，８８，１４２０（１９９１））、現在では広く臨床使用されるようになってきた。即ち、Ｃ型肝炎治療は従来の対症療法から原因療法へ大きく進歩したと言える。
【０００７】
しかしながら、本邦でこれまで数年間に実施した約２０万人のＣ型慢性活動性肝炎患者でのインターフェロン療法の治療成績では、ウイルスを排除し、治癒できたのは全体の約３０％程度であり、残り約７０％の患者では肝炎ウイルスが生き残り、無効又は再発の症例となっている（矢野右人；日本臨床，５３，９８６（１９９５増刊））。
【０００８】
この治療効果の可否には、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型、血液中のウイルス量、肝病変の進展度が重要な因子となっているが、中でも血液中のウイルス量が最も重要な因子となっている。例えば、患者の血液１ｍＬ中のウイルス量が１００万コピー未満の場合にはインターフェロンの投与で約８０％の患者の体内ウイルスが完全に排除でき、治癒したのに対し、１００万コピー以上の場合には９％程度の治癒例にしかならなかった（今関文夫ら；日本臨床，５３，１０１７（１９９５））。
【０００９】
また、上記ウイルス量に加えて、本発明者らは、血液中でのウイルス粒子の存在様式もインターフェロン治療効果に対して重要な因子となっていることを見い出した。即ち、Ｃ型肝炎ウイルス粒子は、血液中ではその浮遊密度により、感染性の高い、軽い粒子と感染性の低い、重い粒子とに分類されることが報告されているが、この密度の異なるウイルス粒子と病態、インターフェロン治療との関係に注目し研究した結果、軽いウイルス粒子と重いウイルス粒子の患者血液中での存在比が１０対１の患者の場合、インターフェロン治療で７５％の患者に治癒例が認められるのに対し、１対１０の患者では１３％にしか治癒例は認められなかった。
【００１０】
更に軽いウイルス粒子は血液中のリポ蛋白と結合しており、重いウイルス粒子は免疫グロブリンと結合した免疫複合体型の粒子として存在していることも明らかとなった。（酒井明人ら；日消誌，９２（臨床増刊号），１４８８（１９９５））。
【００１１】
従って、現在のインターフェロン療法は、血液中のウイルス量が少ないほど、また免疫グロブリンと結合した免疫複合体型ウイルス量が少ないほど治療効果は高いが、血液中のウイルス量が高いほど、更には免疫複合体型ウイルス量が多いほど治癒効果は極めて低下するという問題点が明らかとなった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる問題に鑑み、インターフェロンの治療効果をより高めるために、患者血液中のＣ型肝炎ウイルス、特に免疫複合体型Ｃ型肝炎ウイルスを、効率良く選択的に吸着除去でき、かつ安全性に優れたＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材を提供し、更に、この吸着材を用いた吸着装置及びＣ型肝炎ウイルスの吸着除去方法を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成せんとして、各種化合物を水不溶性担体に結合させ、患者血液と接触させることにより、Ｃ型肝炎ウイルスに対しては高い吸着活性を有するが、アルブミン等の蛋白質に対しては吸着活性を有しない化合物を取得すべく、鋭意研究を進めてきた。その結果、水不溶性担体に、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物、特に、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物を固定化した吸着材が、著しく優れたＣ型肝炎ウイルス吸着能を持つという事実を見い出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を水不溶性担体に固定化してなるＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材である。
以下に本発明を詳述する。
【００１４】
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、水不溶性担体に、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を固定化してなる。
上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物としては、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着活性を有する化合物であれば特に限定されないが、より好ましくは、上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物は、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物である。
【００１５】
免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体が結合したＣ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物として、より好ましいものは、Ｃ型肝炎ウイルスを吸着除去するにあたり、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体が結合したＣ型肝炎ウイルスを優先的、かつ効率的に吸着除去できる化合物である。
【００１６】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物は、より好ましくは、免疫グロブリン結合蛋白である。
上記免疫グロブリン結合蛋白として、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体等を挙げることができる。
【００１７】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物は、より好ましくは、抗免疫グロブリン抗体である。
上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物は、より好ましくは、上記免疫グロブリン結合蛋白及び／又は抗免疫グロブリン抗体の一部であり、かつ、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に対する結合部位を含有する蛋白断片若しくはペプチド、又は、それらの誘導体である。
上記水不溶性担体の好ましい一つの形態は、多孔質である。
【００１８】
上記多孔質の水不溶性担体の平均孔径は、１０〜１５００ｎｍが好ましい。
上記水不溶性担体の好ましい一つの形態は、実質的に非多孔質であることである。また、上記水不溶性担体は、親水性であることが好ましい。
【００１９】
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、血液、血漿、その他の体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを吸着除去するために用いることができる。
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、血液、血漿、その他の体液中に存在する免疫複合体型ウイルスを吸着除去するために用いることができる。
【００２０】
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着装置は、上記のいずれか記載のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材が、液体の入口、出口を有する容器内に含まれており、そして上記Ｃ型肝炎ウイルス除去用吸着材の容器外への流出防止手段が備えられていることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着方法は、上記のいずれか記載のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材とＣ型肝炎ウイルスを含有する液体とを接触させる工程を含むことを特徴とするものである。
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着方法においては、上記Ｃ型肝炎ウイルスを含有する液体としては、例えば、血液、血漿、その他の体液等を挙げることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施形態を説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
本発明に用いられるＣ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物とは、実質的にＣ型肝炎ウイルスを吸着する能力を有する化合物を言い、特定の化合物に限定されるものではないが、好ましくは、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体中の重鎖部分又は軽鎖部分に特異的に結合する物質であることが好ましい。
【００２３】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体中の重鎖部分又は軽鎖部分に特異的に結合する物質としては、例えば、免疫グロブリンＧの重鎖中のＦｃ領域に結合活性を有する、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体、又は軽鎖に結合活性を有するプロテインＬ等、一般に免疫グロブリン結合蛋白と称されている化合物（Ｌ．Ｂｊｏｒｃｋ：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０，１１９４（１９８８），Ｈ．Ｇｏｍｉら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，４０４６（１９９０），土居尚之：免疫臨床，２３，８９６，（１９９１））や抗免疫グロブリン抗体等を挙げることができる。
【００２４】
またこれらの化合物中の免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に実質的に結合活性を有する部分を断片化した化合物、例えば、プロテインＡの免疫グロブリン結合部位であり、５８アミノ酸からなるＡ〜Ｅドメインの各ペプチド（Ｍ．Ｕｈｌｅｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１９６５（１９８４））、プロテインＡのＢドメインペプチドを更に短くしたＦＢ２９ペプチド等（Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎら：Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．，６２，８７（１９９２））、プロテインＧの５５アミノ酸からなるＣ１〜Ｃ３ドメインの各ペプチド（Ｂ．Ｇｕｓｓら：ＥＭＢＯ Ｊ．，５，１５６７（１９８６））、プロテインＨのＡドメインペプチド（Ｈ．Ｇｏｍｉら：上記文献）、プロテインＬのＢ１〜Ｂ５ドメインの各ペプチド（ビョルク，ラルスら：特表平７−５０６５７３）、補体Ｃ１ｑのＣＢＰ２ペプチド（Ｍ．Ａ．Ｂａｕｍａｎｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８４１４（１９９０））等、免疫グロブリン結合蛋白と称されている物質中の免疫グロブリン結合ドメインペプチド及びその誘導体等を挙げることができる。
【００２５】
またリウマチ因子又は抗免疫グロブリン抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ）2 、一本鎖Ｆｖポリペプチド等も代表例として挙げることができる。
【００２６】
本発明に用いる水不溶性担体としては特に限定されず、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる有機担体、更にはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機等の複合担体等を挙げることができる。
【００２７】
なかでも、親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、Ｃ型肝炎ウイルスの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が、６０度以下のものを意味する。
【００２８】
このような担体としては特に限定されず、例えば、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス等からなる担体等を挙げることができる。
【００２９】
なかでもＯＨ基が存在する担体は、吸着性能、選択性の点で優れており、更に、多孔質セルロースゲルは、以下の（１）〜（４）等の優れた点を有しており、本発明の水不溶性担体として最も好ましいものの一つである。
【００３０】
（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため、撹拌等の操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合、体液を高流速で流しても圧密化したり、目詰まりしたりせず、更に細孔構造であるため高圧蒸気滅菌等をした場合でも変化を受けにくい。
【００３１】
（２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用し得る水酸基が多数存在し、非特異吸着が少ない。
（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量が得られる。
（４）安全性が合成高分子ゲル等に比べて高い。
【００３２】
上記水不溶性担体は、それぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
本発明に用いる水不溶性担体としては、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材の使用目的及び方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有するもの、すなわち、多孔質であることが好ましい。
【００３３】
上記多孔質の水不溶性担体の平均孔径は、１０〜１５００ｎｍであることが好ましい。Ｃ型肝炎ウイルスは、その直径が５０〜５５ｎｍからなる粒子であり、多孔質性の担体でウイルス粒子をより効率良く吸着するためには、細孔の孔径分布がウイルス粒子の直径よりも大きい孔径側に幅広く分布していることが好ましいが、大きすぎる場合には担体の強度が低下し、また表面積が減少する。より好ましい平均孔径は、５０〜１２５０ｎｍである。
【００３４】
一方、細孔を有しない、実質的に非多孔質の担体においてもウイルスの吸着は可能である。この場合、体液（血液、血漿、血清等）中の蛋白質等の生体にとっての有用成分が細孔内に入ることができないため、ほとんど吸着されないという利点を有しており、利用可能である。
実質的に非多孔質とは、多孔質であっても細孔直径が非常に小さい（例えば、１０ｎｍ未満）細孔を有する多孔質担体も含まれる趣旨である。
【００３５】
上記水不溶性担体の多孔構造については、吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、空孔容積が２０％以上であり、比表面積が３ｍ2 ／ｇ以上であることが好ましい。
【００３６】
上記水不溶性担体の形態としては特に限定されず、例えば、ビーズ状、線維状、膜状（中空糸も含む）等を挙げることができるが、体外循環時の体液の流通面より、ビーズ状が特に好ましく用いられる。上記ビーズ状の担体の平均粒径は、１０〜２５００μｍのものが使いやすいが、２５〜８００μｍのものが好ましく用いられる。
【００３７】
上記水不溶性担体の表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。
上記官能基の代表例としては特に限定されず、例えば、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基等を挙げることができる。
【００３８】
上記水不溶性担体は、硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環治療用の吸着体として使用するためには、カラムに充填し、通液する際等に目詰まりを生じないことが重要であり、そのために充分な機械的強度が要求されるので、上記水不溶性担体は、硬質担体であることがより好ましい。
【００３９】
本明細書中で、硬質担体とは、例えば粒状ゲルの場合、以下の条件でゲルをガラス製円筒状カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｎｍ）に均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失（ΔＰ）と流量の関係が、０．３ｋｇ／ｃｍ2 まで直線関係にあるものをいう。
【００４０】
例えば、両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒状カラム（内径９ｎｍ、カラム長１５０ｎｍ）にアガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のＢｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系ポリマーゲル（東洋曹達工業社製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１０００μｍ）及びセルロースゲル（チッソ社製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失（ΔＰ）との関係を求めた（図１）。
【００４１】
縦軸に流速（ｃｍ／分）を、横軸に圧力損失（ｋｇ／ｃｍ2 ）をプロットした。図１において、○はトヨパールＨＷ−６５、△はセルロファインＧＣ−７００ｍ、黒ぬりの○はＢｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍを示す。
【００４２】
この結果、トヨパールトヨパールＨＷ−６５及びセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、Ｂｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかった。
【００４３】
本発明の水不溶性担体への免疫グロブリン結合蛋白又はペプチドの固定化においては、蛋白質又はペプチドの立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、更に非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。
【００４４】
上記親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
【００４５】
上記水不溶性担体へ導入される免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物、及び、スペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法は特に限定されるものではないが、一般に蛋白質やペプチドを担体に固定化する場合に採用されるエポキシ反応、ニック塩基反応、カルボジイミド試薬等を用いた縮合反応、活性エステル反応、グルタルアルデヒド試薬等を用いた担体架橋反応等による固定化方法等を挙げることができる。
【００４６】
上記固定化にあたっては、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材が体外循環治療及び血液浄化に用いられ得る吸着材であることを考慮して、吸着材の滅菌時又は治療時に、蛋白類が水不溶性担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましく、例えば、以下のような方法等を挙げることができる。
【００４７】
（１）担体が有するカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによってスクシンイミドオキシカルボニル基に置換して、蛋白質又はペプチドをアミノ基の部分で反応させる方法（活性エステル法）。
【００４８】
（２）担体が有するアミノ基又はカルボキシル基に、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬存在下で、蛋白質又はペプチドのカルボキシル基又はアミノ基を縮合反応させる方法（縮合法）。
（３）蛋白質又はペプチドをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）。
【００４９】
上記固定化にあたっては、蛋白類の脱離溶出を極力抑えるためには共有結合法により結合することが好ましい。
【００５０】
Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を固定化した担体を、血液、血漿、血清等の体液と接触させて、体液中のＣ型肝炎ウイルスを吸着除去する方法としては、種々の方法を挙げることができ、例えば、以下の方法等を挙げることができる。
【００５１】
（１）体液を取り出してバック等に貯留し、これを吸着材に混合してＣ型肝炎ウイルスを吸着除去した後、吸着材を濾別してＣ型肝炎ウイルスが除去された体液を得る方法。
（２）体液の入口と出口とを有し、その出口に体液は通過するが吸着剤は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法。
【００５２】
いずれの方法を用いてもよいが、（２）の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液から効率よくオンラインでＣ型肝炎ウイルスを除去することが可能であり、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材はこの方法に適している。
【００５３】
Ｃ型肝炎ウイルスを吸着するＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材を用いた本発明のＣ型肝炎ウイルスの吸着装置を、その概略断面図に基づき説明する。
図２中に示す容器７は、液体の流入口又は流出口１、液体の流出口又は流入口２、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材３、液体及び液体に含まれる成分は通過できるがＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は通過できない吸着材流出防止手段４及び５、並びに、カラム６を有する。
【００５４】
この容器の形状及び材質は特に限定されないが、好ましくは、例えば、容量２０〜４００ｍＬ程度、直径２〜１０ｃｍ程度の筒状容器が用いられる。
【００５５】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。
【００５６】
Ala;Ｌ−アラニン残基、Asp;Ｌ−アスパラギン酸残基、Asn;Ｌ−アスパラギン残基、Cys;Ｌ−システイン残基、Gln;Ｌ−グルタミン残基、Glu;Ｌ−グルタミン酸残基、Gly;Ｌ−グリシン残基、Ile;Ｌ−イソロイシン残基、Leu;Ｌ−ロイシン残基、Lys;Ｌ−リジン残基、Phe;Ｌ−フェニルアラニン残基、Thr;Ｌ−スレオニン残基、Trp;Ｌ−トリプトファン残基、Tyr;Ｌ−タイロシン残基、Val;Ｌ−バリン残基。
また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側に位置し、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【００５７】
実施例１
多孔質担体（ＧＣＬ２０００ｍ）へのＩｇＧ結合タンパク質（プロテインＡ）の固定化
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルであるＧＣＬ−２０００ｍ（チッソ社製、球状タンパク質の排除限界分子量３００万）９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００５８】
プロテインＡの固定化
プロテインＡ（シグマ社製) ４ｍｇを０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）０．５ｍＬに溶解し、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１０に再調整、全量を１．０ｍＬとした（プロテインＡ溶液）。上記エポキシ活性化セルロースゲル１ｍＬにプロテイン溶液（全量）を加えて３７℃で１６時間振盪した後、充分量のＰＢＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液）で洗浄し、ＧＣＬ２０００ｍ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを得た。
【００５９】
固定化量の定量
固定化反応直前と直後の反応溶液のプロテインＡ濃度をＨＰＬＣにより測定し、その反応率を算出することにより固定化量を求めた。その結果、プロテインＡ−ＧＣＬ２０００ｍの１ｍＬ当たり２．１ｍｇのプロテインＡが固定化されたことがわかった。
【００６０】
実施例２
多孔質担体（ＧＣＬ２０００ｍ）へのＩｇＧ結合タンパク質（プロテインＧ）の固定化
実施例１のプロテインＡをプロテインＧ（ファルマシアＬＫＢ社製）に変えたほかは全く同様にプロテインＧを固定化したＧＣＬ２０００ｍ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（３．２ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００６１】
実施例３
多孔質担体（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ）へのプロテインＧの免疫グロブリンＧ結合ドメインの固定化
ペプチドの合成
Ｎ末端側にシステインを付加したプロテインＧのＣ３ドメインの５７残基よりなる配列を有するペプチドの合成を、ペプチドシンセサイザーＭｏｄｅｌ ４１７０型（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いて固相合成法により以下のように行った。
【００６２】
Ｃ末端のグルタミンを結合した支持体であるＦｍｏｃ−グルタミンＮｏｖａＳｙｎ ＫＡ ０．１ｍｍｏｌ（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いて、上記ペプチドシンセサイザーに入力されている合成プログラムにより、Ｎ末端の方向に向かって順に、脱保護基反応及び縮合反応を繰り返してペプチド鎖を延長した。
すなわち、ピペリジンにより該アミノ酸が有するα−アミノ基の保護基である９−フロオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）の除去を行ない、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄し、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートとジイソプロピルエチルアミンで縮合反応を行ない、ＤＭＦで洗浄する操作を繰り返した。
【００６３】
アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ala 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Asn(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Asp(OtBu) 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Cys(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Gln(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Glu(OtBu) 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Gly 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ile 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Leu 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Lys(Boc ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Phe 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Thr(tBu ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Trp 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Tyr(tBu ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Val 、として用い、それらの使用量は基質に対して約５倍モル（０．５ｍｍｏｌ）量を、バイアル中で用いた。ここで、Trt 、OtBu、Boc 、及び、tBu は、それぞれトリチル基、tert−ブチルエステル、tert−ブチルオキシカルボニル基、及び、tert−ブチル基を表す。
【００６４】
脱保護基反応及びペプチド鎖の切断
全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得られた支持体を３Ｇ−３孔のグラスフィルター上でtert−アミルアルコール、酢酸及びジエチルエーテルを用いて順次洗浄し、次いで真空乾燥することによって乾燥支持体を得た。バイアル中で、得られた支持体１ｇに、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２０ｍＬ、１，２−エタンジチオール２６０μＬ、及び、アニソール７８０μＬを加えて室温で１．５時間撹拌した。
【００６５】
その後、この混合物を３Ｇ−３孔のグラスフイルターで支持体と濾別し、この濾液を３５℃の温度下で減圧濃縮した。これに予め冷却しておいた無水ジエチルエーテルを沈殿が現れなくなるまで加えて撹拌し、次いで遠心分離し、沈殿した粗ペプチドを収集した。更に、この粗ペプチドを無水ジエチルエーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥し、目的とする粗精製ペプチドを得た。
【００６６】
ペプチドの精製
上記、粗精製ペプチドを０．１％ＴＦＡに溶解して、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、得られた濾液を高速液体クロマトグラフィーに供した。ＨＰＬＣは、Ｍｏｄｅｌ ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）を用い、カラムは逆相系のμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（日本ミリポア．ウォーターズ社製）を用いた。移動相にはＡ液として０．１％ＴＦＡ水溶液を、Ｂ液として０．１％ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル／水を用い、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。
【００６７】
得られたクロマトピークの相当画分を分取した。分取を数回繰り返し、これを凍結乾燥することにより精製ペプチドを得た。得られたペプチドは、気相プロテインシークエンサー４７７型（アプライドバイオシステムズ社製）及び日立カスタムイオン交換樹脂を用いたアミノ酸分析により解析して、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のペプチドが得られていることを確認した。
【００６８】
ペプチドの固定化
上記ペプチドを、多孔質セファロース上に固定化することにより以下のようにして吸着材を製造した。セファーロースには、チオプロピルセファロース６Ｂ（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いた。チオプロピルセファロース６Ｂ ５０ｍｇに蒸留水５０ｍｌを加え、室温で１５分間放置して樹脂を膨潤させた。次いで、蒸留水を除去し、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）カップリング緩衝液に置換した。
【００６９】
一方、上記精製ペプチド４ｍｇを、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）カップリング緩衝液４００μＬに溶解し、膨潤させた上記チオプロピルセファロース６Ｂ １５０μＬを加えて、４℃で１２時間撹拌することにより、精製ペプチドを固定化した吸着材を得た。
【００７０】
更に、得られたペプチド固定化吸着材を吸引濾過し、濾液中のペプチド含量をＨＰＬＣによる絶対検量線法で定量することにより、担体上へのペプチドの固定化率を求めた。このペプチド固定化吸着材を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で充分に洗浄し、吸引濾過し、担体１ｍＬ当たり３．６ｍｇのペプチドを固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ−Ｃ３Ｐｐｔを得た。
【００７１】
実施例４
多孔質担体（Ｋａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＫ３Ｐ４７）の固定化
ＭＫ３Ｐ４７ペプチドの生産
下記の配列表の配列番号２に記載するアミノ酸配列を有するペプチドであるＭＫ３Ｐ４７ペプチドをコードするＤＮＡをｐＵＣＮＴベクター（特開平４−２１２６９２号公報）に５′側をNde I 、３′側をHind III のそれぞれ制限酵素サイトを利用して連結できるように設計して、合成した。合成したＤＮＡ配列を、配列表の配列番号３に記載した。
【００７２】
上記配列を有するＤＮＡを、制限酵素Nde I 及びHind III(宝酒造社製）消化によって開裂したｐＵＣＮＴベクターと、宝酒造社製ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて手順書に従って連結し、ｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクター（図３）を作製した。
【００７３】
公知の方法で、このｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクターＤＮＡを、大腸菌ＨＢ１０１株（ｉｒｉｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、抗生物質アンピシリンに対する抵抗性を指標として形質転換体を選択した。
また、この形質転換体から常法にてプラスミドＤＮＡを抽出し、遺伝子配列を解析することによってｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクター設計通りのＤＮＡ配列を有していることを確認した。
【００７４】
次に、この形質転換体を６ＬのＬ−ブロス（５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのバクトトリプシン、５ｇ／Ｌのイーストエキストラクト）中で３７℃にて２０時間振盪培養し、菌体を遠心分離（日立ＲＰＲ９−２ローターを用い４℃で６０００ｒｐｍ、２０分間）にて回収した。
ここで得られた沈殿を３００ｍＬのＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ７．５）に懸濁した上で、超音波破砕処理（ＢＲＡＮＳＯＮ２５０を用いて氷中にて６分間３回）を施し、遠心分離（日立ＲＰＲ１６ローターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にて上清を回収した。
【００７５】
ここで得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理を行った後、更に遠心分離（日立ＲＰＲ１６ローターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にてその上清３００ｍＬを回収した。この上清から高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＷａｔｅｒｓμＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ ５μ Ｃ１８ ３００Ａ １９．０×１５０ｍｍ）を用いて４０ｍｌのアセトニトリル溶液を流速５ｍｌ／分にて流してカラムを活性化した後、３００ｍＬのサンプルを同流速にて流し、０．１％ＴＦＡ＋６４％アセトニトリル溶液２００ｍＬにてカラムを洗浄、続いて０．１％ＴＦＡ＋４０％アセトニトリル溶液２００ｍＬにて目的のＭＫ３Ｐ４７ペプチドを溶出、分取した。
これをエバポレーターにて１００ｍＬに濃縮した上で凍結乾燥し、高純度精製標品として１．２ｇを取得した。
【００７６】
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルで球状タンパク質の排除限界分子量５００万以上の当社試作品Ｋａｃ ９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００７７】
ＭＫ３Ｐ４７の固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＫ３Ｐ４７の５０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをＫａｃに変えたほかは全く同様にＭＫ３Ｐ４７を固定化したＫａｃ−ＭＫ３Ｐ４７（３０ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００７８】
実施例５
多孔質担体（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化
配列表の配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドＭＰ４７Ｃを生産した。
配列表の配列番号５に記載される配列を有するＤＮＡ（ＭＰ４７ＣをコードするＤＮＡ）をｐＵＣＮＴベクターに実施例４と同様の方法にて連結できるように設計して合成した。
【００７９】
上記配列を有するＤＮＡを実施例４と同様の方法でｐＵＣＮＴベクターに導入し、ｐＵＣＮＴＭＰ４７Ｃベクターを作製した。
更に実施例４と同様の方法で、大腸菌の形質転換体を作製、その６Ｌ培養を経て目的のペプチドの高純度精製標品１．３ｇを取得し、各種検討に使用した
【００８０】
セファクリルゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルで細孔径が４００ｎｍであるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０００（ファルマシアＬＫＢ社製) ９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セファクリルゲルを得た。
【００８１】
ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＰ４７Ｃの１０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをエポキシ活性化セファクリルゲルに変えたほかは全く同様にＭＰ４７Ｃを固定化したＳ１０００−ＭＰ４７Ｃ（７ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００８２】
実施例６
実質的な非多孔質担体（Ｂａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系硬質ゲルで球状タンパク質の排除限界分子量３万以下の試作品である非多孔質担体（Ｂａｃ）９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００８３】
ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＰ４７Ｃの３０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをＢａｃに変えたほかは全く同様にＭＰ４７Ｃを固定化したＢａｃ−ＭＰ４７Ｃ（２０ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００８４】
実施例７
多孔質担体（ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）への抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）の固定化
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシアＬＫＢ社製）４ｇを１ｍＭのＨＣｌ水溶液少量で１５分間膨潤させ、１ｍＭのＨＣｌ水溶液で洗浄し、更にカップリングバッファー（ｐＨ８．３、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１ＭのＮａＨＣＯ3 ）で洗浄した。
【００８５】
カップリングバッファー１ｍＬに抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体（バインディングサイト社製）をパパイン消化（ＰＩＥＣＥ社、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＦａｂＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）したＦａｂ １ｍｇを溶解し、上記洗浄ゲルを添加して４℃で１６時間反応させた。
カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバッファー（ｐＨ８．３、０．２Ｍのグリシン、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１ＭのＮａＨＣＯ3 ）を添加し室温で２時間反応した。
【００８６】
２種の後処理バッファー（ｐＨ４．０、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝液）で交互に３回づつ洗浄し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−ＡｎｔｉＩｇＧＦａｂを得た。
【００８７】
実施例８
多孔質担体（トレシルトヨパール）への抗ＩｇＧ抗体の固定化
抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（バインディングサイト社製）１ｍｇをカップリングバッファー（０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍの炭酸緩衝液) １ｍＬに溶解し、ＡＦ−トレシルトヨパール６５０を乾燥状態で２００ｍｇ添加して４℃で終夜反応させた。
０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄後、ブロックバッファー（ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液）を添加し、室温で２時間反応した。
更に０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−ＡｎｔｉＩｇＧを得た。
【００８８】
実施例９
合成した吸着体のＣ型肝炎ウイルス吸着能評価
吸着実験
各吸着体１００μＬをバイアル中に採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを含む患者血清１００μＬを加え、３７℃で２時間振盪した。
【００８９】
Ｃ型肝炎ウイルスの吸着能測定
その後この懸濁液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、上清中のＣ型肝炎ウイルス量をＨＣＶ ＲＮＡとして測定した（日本ロッシュ社製、アンプリコアーＨＣＶモニター）。
【００９０】
対照実験として、吸着体の代わりに生理食塩水１００μＬをバイアル中に採取し、上記と同様な処理をした後、溶液中のＣ型肝炎ウイルス量を求めた。
Ｃ型肝炎ウイルスの吸着率（％）は、以下の式により算出した。
吸着率（％）＝ [（Ｖｒ−Ｖｔ）／Ｖｒ］×１００
Ｖｒ：対照実験溶液中のウイルス濃度
Ｖｔ：吸着実験上清中のウイルス濃度
結果を表１に示した。
【００９１】
【表１】
【００９２】
実施例１０
合成した吸着体の評価
吸着実験
各吸着体１００μＬをバイアル中に採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを含む患者血清１００μＬを加え、３７℃で２時間振盪した。
【００９３】
高比重／低比重ＨＣＶウイルスの測定
吸着実験で得られたＨＣＶ浮遊液及び吸着体の代わりに生理食塩水で同様な処理を行ったＨＣＶ浮遊液に抗ＬＤＬ抗体、抗ＩｇＧ抗体と混合し４℃で１６時間反応して５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、沈殿物を回収しＣ型肝炎ウイルス量をＨＣＶ ＲＮＡとして測定し（日本ロッシュ社製、アンプリコアーＨＣＶモニター）、抗ＬＤＬ抗体により沈殿したＨＣＶを低比重、抗ＩｇＧ抗体により沈殿したＨＣＶを高比重ＨＣＶとしてそれらのＨＣＶ ＲＮＡ比（Ｔ／Ｂ＝低比重ＨＣＶ／高比重ＨＣＶ）を求めた。
結果を表２に示した。
【００９４】
【表２】
【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、上記実施例から明らかなとおり、体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去する能力、及び／又は、低比重ＨＣＶウイルスに対する高比重のＨＣＶウイルスの割合を減少させる能力を有する新規な吸着材を提供することができる。また、上記吸着材を充填してなる体液処理装置を用いることによって、血液、血漿、血清等の非処理液中のＣ型肝炎ウイルスを選択的に除去することが可能である。
【００９６】
【配列表】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【図面の簡単な説明】
【図１】ガラス製円筒状カラムに各種水不溶性担体を充填したときの流量と圧力損失との関係を示す図である。縦軸は流量（ｃｍ／分）を、横軸は圧力損失（ｋｇ／ｃｍ2 ）を、それぞれ表す。
【図２】本発明のＣ型肝炎ウイルスの吸着装置示す概略断面図である。
【図３】ｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクターを示す図である。
【符号の説明】
１ 流出口
２ 流入口
３ 除去用吸着材
４，５ 吸着材流出防止手段
６ カラム
７ 容器
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液、血漿等の体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去することにより、Ｃ型肝炎の治療を促進させるＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材、この吸着材を用いた吸着装置、及び、Ｃ型肝炎ウイルスの吸着除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８９年、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡウイルスゲノムのクローン化が発表され（Ｑ．Ｌ．Ｃｈｏｏら；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９（１９８９））、これを基に組換え体を用いたＣ型肝炎ウイルスの抗体の測定が可能となった。その結果、従来非Ａ非Ｂ型肝炎とされていた肝炎の殆どがＣ型肝炎であることが判明すると共に、現在本邦にはＣ型肝炎ウイルスのキャリアーが約２００万人、その内１４０万人が慢性肝炎、３０万人が肝硬変の罹病者であると推定されるようになってきた。（飯野四郎：消化器診療プラクティス２．Ｃ型肝炎，１１−１７（１９９３））。
【０００３】
また、厚生省の人口動態統計によれば、１９９２年の原発性肝癌による死亡者数は年間２．７万人と報告されている（平成４年人口動態統計．厚生省大臣官房統計情報部編，上巻，（１９９３））が、この約７割はＣ型肝炎ウイルス感染が原因となる肝細胞癌であり、慢性肝炎から肝硬変をへて発生するものと考えられてきている（Ｓ．Ｋａｎｅｋｏら；Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，３７，１０８（１９９４）），松下栄紀ら；日本臨床５３，７２７（１９９５増刊））。従って、Ｃ型肝炎は肝硬変、肝細胞癌へと進む難治性の疾患と言える。
【０００４】
Ｃ型肝炎の治療は、従来安静療法、食事療法及び肝庇護剤や漢方薬を中心とした薬物療法が主なものであったが、これらの治療法では肝炎ウイルスを排除できないため、治癒例は極めて少なく、肝壊死の軽減による慢性肝疾患の進展抑制に主眼が置かれていた。従って、長期化に伴い最終的には前述のごとく、肝硬変や肝細胞癌へと不幸な転帰を迎える症例が多い。
【０００５】
一方、最近、インターフェロンの大量生産が可能となり、しかもこれらの蛋白質がＣ型肝炎ウイルスと近縁のＲＮＡ型ウイルスにもｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ウイルス活性を示したのみならず（二宮康行ら；基礎と臨床，１９，２３１（１９８５））、ＲＮＡ型ウイルス感染マウスにおいても感染防御効果を示したことから（Ｍ．Ｋｒａｍｅｒら；Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，３，４２５（１９８３））、臨床でのＣ型肝炎に対する効果が期待された。
【０００６】
実際に、組換え型インターフェロン−αによる非Ａ非Ｂ型肝炎疾患への治療で血清トランスアミナーゼ値が正常化することが見い出され（Ｊ．Ｈ．Ｈｏｏｆｎａｇｅｌら；Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１５，１５７５（１９８６））、又Ｃ型肝炎患者への投与で、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡが血中から持続的に陰性化する症例も認められたことから（Ｋ．Ｃｈａｙａｍａら；Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１３，１０４０（１９９１）、萩原秀紀ら；日消誌，８８，１４２０（１９９１））、現在では広く臨床使用されるようになってきた。即ち、Ｃ型肝炎治療は従来の対症療法から原因療法へ大きく進歩したと言える。
【０００７】
しかしながら、本邦でこれまで数年間に実施した約２０万人のＣ型慢性活動性肝炎患者でのインターフェロン療法の治療成績では、ウイルスを排除し、治癒できたのは全体の約３０％程度であり、残り約７０％の患者では肝炎ウイルスが生き残り、無効又は再発の症例となっている（矢野右人；日本臨床，５３，９８６（１９９５増刊））。
【０００８】
この治療効果の可否には、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型、血液中のウイルス量、肝病変の進展度が重要な因子となっているが、中でも血液中のウイルス量が最も重要な因子となっている。例えば、患者の血液１ｍＬ中のウイルス量が１００万コピー未満の場合にはインターフェロンの投与で約８０％の患者の体内ウイルスが完全に排除でき、治癒したのに対し、１００万コピー以上の場合には９％程度の治癒例にしかならなかった（今関文夫ら；日本臨床，５３，１０１７（１９９５））。
【０００９】
また、上記ウイルス量に加えて、本発明者らは、血液中でのウイルス粒子の存在様式もインターフェロン治療効果に対して重要な因子となっていることを見い出した。即ち、Ｃ型肝炎ウイルス粒子は、血液中ではその浮遊密度により、感染性の高い、軽い粒子と感染性の低い、重い粒子とに分類されることが報告されているが、この密度の異なるウイルス粒子と病態、インターフェロン治療との関係に注目し研究した結果、軽いウイルス粒子と重いウイルス粒子の患者血液中での存在比が１０対１の患者の場合、インターフェロン治療で７５％の患者に治癒例が認められるのに対し、１対１０の患者では１３％にしか治癒例は認められなかった。
【００１０】
更に軽いウイルス粒子は血液中のリポ蛋白と結合しており、重いウイルス粒子は免疫グロブリンと結合した免疫複合体型の粒子として存在していることも明らかとなった。（酒井明人ら；日消誌，９２（臨床増刊号），１４８８（１９９５））。
【００１１】
従って、現在のインターフェロン療法は、血液中のウイルス量が少ないほど、また免疫グロブリンと結合した免疫複合体型ウイルス量が少ないほど治療効果は高いが、血液中のウイルス量が高いほど、更には免疫複合体型ウイルス量が多いほど治癒効果は極めて低下するという問題点が明らかとなった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる問題に鑑み、インターフェロンの治療効果をより高めるために、患者血液中のＣ型肝炎ウイルス、特に免疫複合体型Ｃ型肝炎ウイルスを、効率良く選択的に吸着除去でき、かつ安全性に優れたＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材を提供し、更に、この吸着材を用いた吸着装置及びＣ型肝炎ウイルスの吸着除去方法を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成せんとして、各種化合物を水不溶性担体に結合させ、患者血液と接触させることにより、Ｃ型肝炎ウイルスに対しては高い吸着活性を有するが、アルブミン等の蛋白質に対しては吸着活性を有しない化合物を取得すべく、鋭意研究を進めてきた。その結果、水不溶性担体に、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物、特に、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物を固定化した吸着材が、著しく優れたＣ型肝炎ウイルス吸着能を持つという事実を見い出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を水不溶性担体に固定化してなるＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材である。
以下に本発明を詳述する。
【００１４】
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、水不溶性担体に、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を固定化してなる。
上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物としては、Ｃ型肝炎ウイルスに吸着活性を有する化合物であれば特に限定されないが、より好ましくは、上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物は、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物である。
【００１５】
免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体が結合したＣ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物として、より好ましいものは、Ｃ型肝炎ウイルスを吸着除去するにあたり、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体が結合したＣ型肝炎ウイルスを優先的、かつ効率的に吸着除去できる化合物である。
【００１６】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物は、より好ましくは、免疫グロブリン結合蛋白である。
上記免疫グロブリン結合蛋白として、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体等を挙げることができる。
【００１７】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物は、より好ましくは、抗免疫グロブリン抗体である。
上記Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物は、より好ましくは、上記免疫グロブリン結合蛋白及び／又は抗免疫グロブリン抗体の一部であり、かつ、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に対する結合部位を含有する蛋白断片若しくはペプチド、又は、それらの誘導体である。
上記水不溶性担体の好ましい一つの形態は、多孔質である。
【００１８】
上記多孔質の水不溶性担体の平均孔径は、１０〜１５００ｎｍが好ましい。
上記水不溶性担体の好ましい一つの形態は、実質的に非多孔質であることである。また、上記水不溶性担体は、親水性であることが好ましい。
【００１９】
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、血液、血漿、その他の体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを吸着除去するために用いることができる。
本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は、血液、血漿、その他の体液中に存在する免疫複合体型ウイルスを吸着除去するために用いることができる。
【００２０】
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着装置は、上記のいずれか記載のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材が、液体の入口、出口を有する容器内に含まれており、そして上記Ｃ型肝炎ウイルス除去用吸着材の容器外への流出防止手段が備えられていることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着方法は、上記のいずれか記載のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材とＣ型肝炎ウイルスを含有する液体とを接触させる工程を含むことを特徴とするものである。
本発明のＣ型肝炎ウイルス吸着方法においては、上記Ｃ型肝炎ウイルスを含有する液体としては、例えば、血液、血漿、その他の体液等を挙げることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施形態を説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
本発明に用いられるＣ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物とは、実質的にＣ型肝炎ウイルスを吸着する能力を有する化合物を言い、特定の化合物に限定されるものではないが、好ましくは、免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体中の重鎖部分又は軽鎖部分に特異的に結合する物質であることが好ましい。
【００２３】
上記免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体中の重鎖部分又は軽鎖部分に特異的に結合する物質としては、例えば、免疫グロブリンＧの重鎖中のＦｃ領域に結合活性を有する、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体、又は軽鎖に結合活性を有するプロテインＬ等、一般に免疫グロブリン結合蛋白と称されている化合物（Ｌ．Ｂｊｏｒｃｋ：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０，１１９４（１９８８），Ｈ．Ｇｏｍｉら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，４０４６（１９９０），土居尚之：免疫臨床，２３，８９６，（１９９１））や抗免疫グロブリン抗体等を挙げることができる。
【００２４】
またこれらの化合物中の免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に実質的に結合活性を有する部分を断片化した化合物、例えば、プロテインＡの免疫グロブリン結合部位であり、５８アミノ酸からなるＡ〜Ｅドメインの各ペプチド（Ｍ．Ｕｈｌｅｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１９６５（１９８４））、プロテインＡのＢドメインペプチドを更に短くしたＦＢ２９ペプチド等（Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎら：Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．，６２，８７（１９９２））、プロテインＧの５５アミノ酸からなるＣ１〜Ｃ３ドメインの各ペプチド（Ｂ．Ｇｕｓｓら：ＥＭＢＯ Ｊ．，５，１５６７（１９８６））、プロテインＨのＡドメインペプチド（Ｈ．Ｇｏｍｉら：上記文献）、プロテインＬのＢ１〜Ｂ５ドメインの各ペプチド（ビョルク，ラルスら：特表平７−５０６５７３）、補体Ｃ１ｑのＣＢＰ２ペプチド（Ｍ．Ａ．Ｂａｕｍａｎｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８４１４（１９９０））等、免疫グロブリン結合蛋白と称されている物質中の免疫グロブリン結合ドメインペプチド及びその誘導体等を挙げることができる。
【００２５】
またリウマチ因子又は抗免疫グロブリン抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ）2 、一本鎖Ｆｖポリペプチド等も代表例として挙げることができる。
【００２６】
本発明に用いる水不溶性担体としては特に限定されず、例えば、ガラスビーズ、シリカゲル等の無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる有機担体、更にはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機等の複合担体等を挙げることができる。
【００２７】
なかでも、親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、Ｃ型肝炎ウイルスの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が、６０度以下のものを意味する。
【００２８】
このような担体としては特に限定されず、例えば、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス等からなる担体等を挙げることができる。
【００２９】
なかでもＯＨ基が存在する担体は、吸着性能、選択性の点で優れており、更に、多孔質セルロースゲルは、以下の（１）〜（４）等の優れた点を有しており、本発明の水不溶性担体として最も好ましいものの一つである。
【００３０】
（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため、撹拌等の操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合、体液を高流速で流しても圧密化したり、目詰まりしたりせず、更に細孔構造であるため高圧蒸気滅菌等をした場合でも変化を受けにくい。
【００３１】
（２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用し得る水酸基が多数存在し、非特異吸着が少ない。
（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量が得られる。
（４）安全性が合成高分子ゲル等に比べて高い。
【００３２】
上記水不溶性担体は、それぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
本発明に用いる水不溶性担体としては、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材の使用目的及び方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有するもの、すなわち、多孔質であることが好ましい。
【００３３】
上記多孔質の水不溶性担体の平均孔径は、１０〜１５００ｎｍであることが好ましい。Ｃ型肝炎ウイルスは、その直径が５０〜５５ｎｍからなる粒子であり、多孔質性の担体でウイルス粒子をより効率良く吸着するためには、細孔の孔径分布がウイルス粒子の直径よりも大きい孔径側に幅広く分布していることが好ましいが、大きすぎる場合には担体の強度が低下し、また表面積が減少する。より好ましい平均孔径は、５０〜１２５０ｎｍである。
【００３４】
一方、細孔を有しない、実質的に非多孔質の担体においてもウイルスの吸着は可能である。この場合、体液（血液、血漿、血清等）中の蛋白質等の生体にとっての有用成分が細孔内に入ることができないため、ほとんど吸着されないという利点を有しており、利用可能である。
実質的に非多孔質とは、多孔質であっても細孔直径が非常に小さい（例えば、１０ｎｍ未満）細孔を有する多孔質担体も含まれる趣旨である。
【００３５】
上記水不溶性担体の多孔構造については、吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、空孔容積が２０％以上であり、比表面積が３ｍ2 ／ｇ以上であることが好ましい。
【００３６】
上記水不溶性担体の形態としては特に限定されず、例えば、ビーズ状、線維状、膜状（中空糸も含む）等を挙げることができるが、体外循環時の体液の流通面より、ビーズ状が特に好ましく用いられる。上記ビーズ状の担体の平均粒径は、１０〜２５００μｍのものが使いやすいが、２５〜８００μｍのものが好ましく用いられる。
【００３７】
上記水不溶性担体の表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。
上記官能基の代表例としては特に限定されず、例えば、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基等を挙げることができる。
【００３８】
上記水不溶性担体は、硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環治療用の吸着体として使用するためには、カラムに充填し、通液する際等に目詰まりを生じないことが重要であり、そのために充分な機械的強度が要求されるので、上記水不溶性担体は、硬質担体であることがより好ましい。
【００３９】
本明細書中で、硬質担体とは、例えば粒状ゲルの場合、以下の条件でゲルをガラス製円筒状カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｎｍ）に均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失（ΔＰ）と流量の関係が、０．３ｋｇ／ｃｍ2 まで直線関係にあるものをいう。
【００４０】
例えば、両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒状カラム（内径９ｎｍ、カラム長１５０ｎｍ）にアガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のＢｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系ポリマーゲル（東洋曹達工業社製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１０００μｍ）及びセルロースゲル（チッソ社製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失（ΔＰ）との関係を求めた（図１）。
【００４１】
縦軸に流速（ｃｍ／分）を、横軸に圧力損失（ｋｇ／ｃｍ2 ）をプロットした。図１において、○はトヨパールＨＷ−６５、△はセルロファインＧＣ−７００ｍ、黒ぬりの○はＢｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍを示す。
【００４２】
この結果、トヨパールトヨパールＨＷ−６５及びセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、Ｂｉｏｇｅｌ−Ａ５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかった。
【００４３】
本発明の水不溶性担体への免疫グロブリン結合蛋白又はペプチドの固定化においては、蛋白質又はペプチドの立体障害を小さくすることにより吸着効率を向上させ、更に非特異的吸着を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。
【００４４】
上記親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
【００４５】
上記水不溶性担体へ導入される免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物、及び、スペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法は特に限定されるものではないが、一般に蛋白質やペプチドを担体に固定化する場合に採用されるエポキシ反応、ニック塩基反応、カルボジイミド試薬等を用いた縮合反応、活性エステル反応、グルタルアルデヒド試薬等を用いた担体架橋反応等による固定化方法等を挙げることができる。
【００４６】
上記固定化にあたっては、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材が体外循環治療及び血液浄化に用いられ得る吸着材であることを考慮して、吸着材の滅菌時又は治療時に、蛋白類が水不溶性担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましく、例えば、以下のような方法等を挙げることができる。
【００４７】
（１）担体が有するカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによってスクシンイミドオキシカルボニル基に置換して、蛋白質又はペプチドをアミノ基の部分で反応させる方法（活性エステル法）。
【００４８】
（２）担体が有するアミノ基又はカルボキシル基に、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬存在下で、蛋白質又はペプチドのカルボキシル基又はアミノ基を縮合反応させる方法（縮合法）。
（３）蛋白質又はペプチドをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）。
【００４９】
上記固定化にあたっては、蛋白類の脱離溶出を極力抑えるためには共有結合法により結合することが好ましい。
【００５０】
Ｃ型肝炎ウイルスに吸着能力を有する化合物を固定化した担体を、血液、血漿、血清等の体液と接触させて、体液中のＣ型肝炎ウイルスを吸着除去する方法としては、種々の方法を挙げることができ、例えば、以下の方法等を挙げることができる。
【００５１】
（１）体液を取り出してバック等に貯留し、これを吸着材に混合してＣ型肝炎ウイルスを吸着除去した後、吸着材を濾別してＣ型肝炎ウイルスが除去された体液を得る方法。
（２）体液の入口と出口とを有し、その出口に体液は通過するが吸着剤は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法。
【００５２】
いずれの方法を用いてもよいが、（２）の方法は操作も簡単であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液から効率よくオンラインでＣ型肝炎ウイルスを除去することが可能であり、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材はこの方法に適している。
【００５３】
Ｃ型肝炎ウイルスを吸着するＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材を用いた本発明のＣ型肝炎ウイルスの吸着装置を、その概略断面図に基づき説明する。
図２中に示す容器７は、液体の流入口又は流出口１、液体の流出口又は流入口２、本発明のＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材３、液体及び液体に含まれる成分は通過できるがＣ型肝炎ウイルス除去用吸着材は通過できない吸着材流出防止手段４及び５、並びに、カラム６を有する。
【００５４】
この容器の形状及び材質は特に限定されないが、好ましくは、例えば、容量２０〜４００ｍＬ程度、直径２〜１０ｃｍ程度の筒状容器が用いられる。
【００５５】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。
【００５６】
Ala;Ｌ−アラニン残基、Asp;Ｌ−アスパラギン酸残基、Asn;Ｌ−アスパラギン残基、Cys;Ｌ−システイン残基、Gln;Ｌ−グルタミン残基、Glu;Ｌ−グルタミン酸残基、Gly;Ｌ−グリシン残基、Ile;Ｌ−イソロイシン残基、Leu;Ｌ−ロイシン残基、Lys;Ｌ−リジン残基、Phe;Ｌ−フェニルアラニン残基、Thr;Ｌ−スレオニン残基、Trp;Ｌ−トリプトファン残基、Tyr;Ｌ−タイロシン残基、Val;Ｌ−バリン残基。
また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側に位置し、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように、常法に従って記述する。
【００５７】
実施例１
多孔質担体（ＧＣＬ２０００ｍ）へのＩｇＧ結合タンパク質（プロテインＡ）の固定化
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルであるＧＣＬ−２０００ｍ（チッソ社製、球状タンパク質の排除限界分子量３００万）９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００５８】
プロテインＡの固定化
プロテインＡ（シグマ社製) ４ｍｇを０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）０．５ｍＬに溶解し、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１０に再調整、全量を１．０ｍＬとした（プロテインＡ溶液）。上記エポキシ活性化セルロースゲル１ｍＬにプロテイン溶液（全量）を加えて３７℃で１６時間振盪した後、充分量のＰＢＳ（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液）で洗浄し、ＧＣＬ２０００ｍ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを得た。
【００５９】
固定化量の定量
固定化反応直前と直後の反応溶液のプロテインＡ濃度をＨＰＬＣにより測定し、その反応率を算出することにより固定化量を求めた。その結果、プロテインＡ−ＧＣＬ２０００ｍの１ｍＬ当たり２．１ｍｇのプロテインＡが固定化されたことがわかった。
【００６０】
実施例２
多孔質担体（ＧＣＬ２０００ｍ）へのＩｇＧ結合タンパク質（プロテインＧ）の固定化
実施例１のプロテインＡをプロテインＧ（ファルマシアＬＫＢ社製）に変えたほかは全く同様にプロテインＧを固定化したＧＣＬ２０００ｍ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（３．２ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００６１】
実施例３
多孔質担体（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ）へのプロテインＧの免疫グロブリンＧ結合ドメインの固定化
ペプチドの合成
Ｎ末端側にシステインを付加したプロテインＧのＣ３ドメインの５７残基よりなる配列を有するペプチドの合成を、ペプチドシンセサイザーＭｏｄｅｌ ４１７０型（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いて固相合成法により以下のように行った。
【００６２】
Ｃ末端のグルタミンを結合した支持体であるＦｍｏｃ−グルタミンＮｏｖａＳｙｎ ＫＡ ０．１ｍｍｏｌ（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いて、上記ペプチドシンセサイザーに入力されている合成プログラムにより、Ｎ末端の方向に向かって順に、脱保護基反応及び縮合反応を繰り返してペプチド鎖を延長した。
すなわち、ピペリジンにより該アミノ酸が有するα−アミノ基の保護基である９−フロオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）の除去を行ない、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄し、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートとジイソプロピルエチルアミンで縮合反応を行ない、ＤＭＦで洗浄する操作を繰り返した。
【００６３】
アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ala 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Asn(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Asp(OtBu) 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Cys(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Gln(Trt ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Glu(OtBu) 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Gly 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ile 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Leu 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Lys(Boc ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Phe 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Thr(tBu ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Trp 、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Tyr(tBu ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Val 、として用い、それらの使用量は基質に対して約５倍モル（０．５ｍｍｏｌ）量を、バイアル中で用いた。ここで、Trt 、OtBu、Boc 、及び、tBu は、それぞれトリチル基、tert−ブチルエステル、tert−ブチルオキシカルボニル基、及び、tert−ブチル基を表す。
【００６４】
脱保護基反応及びペプチド鎖の切断
全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得られた支持体を３Ｇ−３孔のグラスフィルター上でtert−アミルアルコール、酢酸及びジエチルエーテルを用いて順次洗浄し、次いで真空乾燥することによって乾燥支持体を得た。バイアル中で、得られた支持体１ｇに、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２０ｍＬ、１，２−エタンジチオール２６０μＬ、及び、アニソール７８０μＬを加えて室温で１．５時間撹拌した。
【００６５】
その後、この混合物を３Ｇ−３孔のグラスフイルターで支持体と濾別し、この濾液を３５℃の温度下で減圧濃縮した。これに予め冷却しておいた無水ジエチルエーテルを沈殿が現れなくなるまで加えて撹拌し、次いで遠心分離し、沈殿した粗ペプチドを収集した。更に、この粗ペプチドを無水ジエチルエーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥し、目的とする粗精製ペプチドを得た。
【００６６】
ペプチドの精製
上記、粗精製ペプチドを０．１％ＴＦＡに溶解して、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、得られた濾液を高速液体クロマトグラフィーに供した。ＨＰＬＣは、Ｍｏｄｅｌ ＬＣ−１０Ａシステム（島津製作所社製）を用い、カラムは逆相系のμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８（日本ミリポア．ウォーターズ社製）を用いた。移動相にはＡ液として０．１％ＴＦＡ水溶液を、Ｂ液として０．１％ＴＦＡを含む８０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル／水を用い、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。
【００６７】
得られたクロマトピークの相当画分を分取した。分取を数回繰り返し、これを凍結乾燥することにより精製ペプチドを得た。得られたペプチドは、気相プロテインシークエンサー４７７型（アプライドバイオシステムズ社製）及び日立カスタムイオン交換樹脂を用いたアミノ酸分析により解析して、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のペプチドが得られていることを確認した。
【００６８】
ペプチドの固定化
上記ペプチドを、多孔質セファロース上に固定化することにより以下のようにして吸着材を製造した。セファーロースには、チオプロピルセファロース６Ｂ（ファルマシアＬＫＢ社製）を用いた。チオプロピルセファロース６Ｂ ５０ｍｇに蒸留水５０ｍｌを加え、室温で１５分間放置して樹脂を膨潤させた。次いで、蒸留水を除去し、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）カップリング緩衝液に置換した。
【００６９】
一方、上記精製ペプチド４ｍｇを、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）カップリング緩衝液４００μＬに溶解し、膨潤させた上記チオプロピルセファロース６Ｂ １５０μＬを加えて、４℃で１２時間撹拌することにより、精製ペプチドを固定化した吸着材を得た。
【００７０】
更に、得られたペプチド固定化吸着材を吸引濾過し、濾液中のペプチド含量をＨＰＬＣによる絶対検量線法で定量することにより、担体上へのペプチドの固定化率を求めた。このペプチド固定化吸着材を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で充分に洗浄し、吸引濾過し、担体１ｍＬ当たり３．６ｍｇのペプチドを固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ−Ｃ３Ｐｐｔを得た。
【００７１】
実施例４
多孔質担体（Ｋａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＫ３Ｐ４７）の固定化
ＭＫ３Ｐ４７ペプチドの生産
下記の配列表の配列番号２に記載するアミノ酸配列を有するペプチドであるＭＫ３Ｐ４７ペプチドをコードするＤＮＡをｐＵＣＮＴベクター（特開平４−２１２６９２号公報）に５′側をNde I 、３′側をHind III のそれぞれ制限酵素サイトを利用して連結できるように設計して、合成した。合成したＤＮＡ配列を、配列表の配列番号３に記載した。
【００７２】
上記配列を有するＤＮＡを、制限酵素Nde I 及びHind III(宝酒造社製）消化によって開裂したｐＵＣＮＴベクターと、宝酒造社製ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて手順書に従って連結し、ｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクター（図３）を作製した。
【００７３】
公知の方法で、このｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクターＤＮＡを、大腸菌ＨＢ１０１株（ｉｒｉｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、抗生物質アンピシリンに対する抵抗性を指標として形質転換体を選択した。
また、この形質転換体から常法にてプラスミドＤＮＡを抽出し、遺伝子配列を解析することによってｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクター設計通りのＤＮＡ配列を有していることを確認した。
【００７４】
次に、この形質転換体を６ＬのＬ−ブロス（５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌのバクトトリプシン、５ｇ／Ｌのイーストエキストラクト）中で３７℃にて２０時間振盪培養し、菌体を遠心分離（日立ＲＰＲ９−２ローターを用い４℃で６０００ｒｐｍ、２０分間）にて回収した。
ここで得られた沈殿を３００ｍＬのＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ７．５）に懸濁した上で、超音波破砕処理（ＢＲＡＮＳＯＮ２５０を用いて氷中にて６分間３回）を施し、遠心分離（日立ＲＰＲ１６ローターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にて上清を回収した。
【００７５】
ここで得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理を行った後、更に遠心分離（日立ＲＰＲ１６ローターを用い４℃で１５０００ｒｐｍ、２０分間）にてその上清３００ｍＬを回収した。この上清から高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＷａｔｅｒｓμＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ ５μ Ｃ１８ ３００Ａ １９．０×１５０ｍｍ）を用いて４０ｍｌのアセトニトリル溶液を流速５ｍｌ／分にて流してカラムを活性化した後、３００ｍＬのサンプルを同流速にて流し、０．１％ＴＦＡ＋６４％アセトニトリル溶液２００ｍＬにてカラムを洗浄、続いて０．１％ＴＦＡ＋４０％アセトニトリル溶液２００ｍＬにて目的のＭＫ３Ｐ４７ペプチドを溶出、分取した。
これをエバポレーターにて１００ｍＬに濃縮した上で凍結乾燥し、高純度精製標品として１．２ｇを取得した。
【００７６】
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルで球状タンパク質の排除限界分子量５００万以上の当社試作品Ｋａｃ ９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００７７】
ＭＫ３Ｐ４７の固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＫ３Ｐ４７の５０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをＫａｃに変えたほかは全く同様にＭＫ３Ｐ４７を固定化したＫａｃ−ＭＫ３Ｐ４７（３０ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００７８】
実施例５
多孔質担体（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１０００）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化
配列表の配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドＭＰ４７Ｃを生産した。
配列表の配列番号５に記載される配列を有するＤＮＡ（ＭＰ４７ＣをコードするＤＮＡ）をｐＵＣＮＴベクターに実施例４と同様の方法にて連結できるように設計して合成した。
【００７９】
上記配列を有するＤＮＡを実施例４と同様の方法でｐＵＣＮＴベクターに導入し、ｐＵＣＮＴＭＰ４７Ｃベクターを作製した。
更に実施例４と同様の方法で、大腸菌の形質転換体を作製、その６Ｌ培養を経て目的のペプチドの高純度精製標品１．３ｇを取得し、各種検討に使用した
【００８０】
セファクリルゲルのエポキシ活性化
セルロース系多孔質硬質ゲルで細孔径が４００ｎｍであるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１０００（ファルマシアＬＫＢ社製) ９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セファクリルゲルを得た。
【００８１】
ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＰ４７Ｃの１０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをエポキシ活性化セファクリルゲルに変えたほかは全く同様にＭＰ４７Ｃを固定化したＳ１０００−ＭＰ４７Ｃ（７ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００８２】
実施例６
実質的な非多孔質担体（Ｂａｃ）へのＩｇＧ結合性ペプチド（ＭＰ４７Ｃ）の固定化
セルロースゲルのエポキシ活性化
セルロース系硬質ゲルで球状タンパク質の排除限界分子量３万以下の試作品である非多孔質担体（Ｂａｃ）９０ｍＬに水を加え全量を１８０ｍＬとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム６０ｍＬを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン２１ｍＬを加え、４０℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ活性化セルロースゲルを得た。
【００８３】
ＭＰ４７Ｃの固定化及び固定化量の定量
実施例１のプロテインＡの４ｍｇをＭＰ４７Ｃの３０ｍｇに変え、エポキシ活性化ゲルをＢａｃに変えたほかは全く同様にＭＰ４７Ｃを固定化したＢａｃ−ＭＰ４７Ｃ（２０ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００８４】
実施例７
多孔質担体（ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）への抗ＩｇＧ抗体の一部分（Ｆａｂ）の固定化
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシアＬＫＢ社製）４ｇを１ｍＭのＨＣｌ水溶液少量で１５分間膨潤させ、１ｍＭのＨＣｌ水溶液で洗浄し、更にカップリングバッファー（ｐＨ８．３、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１ＭのＮａＨＣＯ3 ）で洗浄した。
【００８５】
カップリングバッファー１ｍＬに抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）抗体（バインディングサイト社製）をパパイン消化（ＰＩＥＣＥ社、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＦａｂＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）したＦａｂ １ｍｇを溶解し、上記洗浄ゲルを添加して４℃で１６時間反応させた。
カップリングバッファーで洗浄後、ブロックバッファー（ｐＨ８．３、０．２Ｍのグリシン、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１ＭのＮａＨＣＯ3 ）を添加し室温で２時間反応した。
【００８６】
２種の後処理バッファー（ｐＨ４．０、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのトリス−塩酸緩衝液）で交互に３回づつ洗浄し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−ＡｎｔｉＩｇＧＦａｂを得た。
【００８７】
実施例８
多孔質担体（トレシルトヨパール）への抗ＩｇＧ抗体の固定化
抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（バインディングサイト社製）１ｍｇをカップリングバッファー（０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍの炭酸緩衝液) １ｍＬに溶解し、ＡＦ−トレシルトヨパール６５０を乾燥状態で２００ｍｇ添加して４℃で終夜反応させた。
０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄後、ブロックバッファー（ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液）を添加し、室温で２時間反応した。
更に０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液にて洗浄し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−ＡｎｔｉＩｇＧを得た。
【００８８】
実施例９
合成した吸着体のＣ型肝炎ウイルス吸着能評価
吸着実験
各吸着体１００μＬをバイアル中に採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを含む患者血清１００μＬを加え、３７℃で２時間振盪した。
【００８９】
Ｃ型肝炎ウイルスの吸着能測定
その後この懸濁液を５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、上清中のＣ型肝炎ウイルス量をＨＣＶ ＲＮＡとして測定した（日本ロッシュ社製、アンプリコアーＨＣＶモニター）。
【００９０】
対照実験として、吸着体の代わりに生理食塩水１００μＬをバイアル中に採取し、上記と同様な処理をした後、溶液中のＣ型肝炎ウイルス量を求めた。
Ｃ型肝炎ウイルスの吸着率（％）は、以下の式により算出した。
吸着率（％）＝ [（Ｖｒ−Ｖｔ）／Ｖｒ］×１００
Ｖｒ：対照実験溶液中のウイルス濃度
Ｖｔ：吸着実験上清中のウイルス濃度
結果を表１に示した。
【００９１】
【表１】
実施例１０
合成した吸着体の評価
吸着実験
各吸着体１００μＬをバイアル中に採取し、Ｃ型肝炎ウイルスを含む患者血清１００μＬを加え、３７℃で２時間振盪した。
【００９３】
高比重／低比重ＨＣＶウイルスの測定
吸着実験で得られたＨＣＶ浮遊液及び吸着体の代わりに生理食塩水で同様な処理を行ったＨＣＶ浮遊液に抗ＬＤＬ抗体、抗ＩｇＧ抗体と混合し４℃で１６時間反応して５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、沈殿物を回収しＣ型肝炎ウイルス量をＨＣＶ ＲＮＡとして測定し（日本ロッシュ社製、アンプリコアーＨＣＶモニター）、抗ＬＤＬ抗体により沈殿したＨＣＶを低比重、抗ＩｇＧ抗体により沈殿したＨＣＶを高比重ＨＣＶとしてそれらのＨＣＶ ＲＮＡ比（Ｔ／Ｂ＝低比重ＨＣＶ／高比重ＨＣＶ）を求めた。
結果を表２に示した。
【００９４】
【表２】
【発明の効果】
本発明によれば、上記実施例から明らかなとおり、体液中に存在するＣ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去する能力、及び／又は、低比重ＨＣＶウイルスに対する高比重のＨＣＶウイルスの割合を減少させる能力を有する新規な吸着材を提供することができる。また、上記吸着材を充填してなる体液処理装置を用いることによって、血液、血漿、血清等の非処理液中のＣ型肝炎ウイルスを選択的に除去することが可能である。
【００９６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ガラス製円筒状カラムに各種水不溶性担体を充填したときの流量と圧力損失との関係を示す図である。縦軸は流量（ｃｍ／分）を、横軸は圧力損失（ｋｇ／ｃｍ2 ）を、それぞれ表す。
【図２】本発明のＣ型肝炎ウイルスの吸着装置示す概略断面図である。
【図３】ｐＵＣＮＴＭＫ３Ｐ４７ベクターを示す図である。
【符号の説明】
１ 流出口
２ 流入口
３ 除去用吸着材
４，５ 吸着材流出防止手段
６ カラム
７ 容器
Claims (8)
- 免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物を、水不溶性担体に固定化してなることを特徴とする、免疫複合体型Ｃ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去するための吸着材であって、
免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体のうちの少なくとも１種
である吸着材。 - 免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物を、水不溶性担体に固定化してなることを特徴とする、免疫複合体型Ｃ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去するための吸着材であって、
免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に結合活性を有する化合物が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、プロテインＬ、プロテインＭ、リウマチ因子、補体のうちの少なくとも１種の一部であって、かつ免疫グロブリン及び／又は免疫グロブリン複合体に対する結合部位を含有する蛋白断片若しくはペプチド又はそれらの誘導体
である吸着材。 - 水不溶性担体が、多孔質担体である請求項１または２記載の吸着材。
- 多孔質担体が、平均孔径が１０〜１５００ｎｍのものである請求項３記載の吸着材。
- 水不溶性担体が、実質的に非多孔質のものである請求項１または２記載の吸着材。
- 水不溶性担体が、親水性である請求項１〜５のいずれか記載の吸着材。
- 血液、血漿又はその他 の体液中に存在する免疫複合体型Ｃ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去するために用いられる請求項１〜６のいずれか記載の吸着材。
- 請求項１〜７のいずれか記載の吸着材が、液体の入口、出口を有する容器内に含まれており、そして前記吸着材の容器外への流出防止手段が備えられていることを特徴とする、免疫複合体型Ｃ型肝炎ウイルスを選択的に吸着除去するための吸着装置。
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