JP3949613B2 - 血圧低下剤及びその製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、血圧低下剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、発酵乳が種々の生理活性作用を示すことが知られているが、発酵乳中の如何なる成分が活性に関与しているかはあまり確認されていない(例えば、特許文献1〜3参照)。
一方、カゼインのトリプシン、ペプシン等の酵素分解物が、例えば血圧低下活性、カルシウム可溶化活性等の生理活性を示すことも知られているが、発酵乳中に含まれるペプチド及びそのペプチドの機能に関してはほとんど知られていないのが現状である。
乳酸菌は、乳中で生育し、菌体外プロティナーゼを産生し、カゼイン等の乳蛋白質を分解すると考えられており、最近、乳酸菌産生プロティナーゼによるカゼインの切断部位について一部報告がなされている(例えば、非特許文献1〜2参照)。
しかしながら、前記カゼインの切断部位に関しては、未だ不明な点が多く、生成ペプチドの生理機能に関する報告はなされていない。
また従来カゼインをトリプシン、ペプシン等により分解して得られるペプチドは、苦味の生成が大きな問題となっている。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭61-53216号公報
【特許文献２】
特開昭61-53217号公報
【特許文献３】
特公平3-64486号公報
【非特許文献１】
Monnetら(FEMS Microbiology Letters),36,127-131(1986)
【非特許文献２】
Zevacoら(Le Lait),68,393-408(1988)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、苦みがなく、且つ毒性がなく、優れた血圧低下活性を示す血圧低下剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、有効成分として配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物もしくは配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を含有することを特徴とする血圧低下剤が提供される。
また本発明によれば、獣乳カゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製し、配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を得、得られたペプチド又はペプチド混合物を配合することを特徴とする前記血圧低下剤の製造法が提供される。
【０００６】
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いる配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を製造するには、例えばカゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製する方法又は通常の化学合成法等により得ることができる。
【０００７】
前記乳酸菌産生プロティナーゼは、例えば牛乳、山羊乳、脱脂乳等の乳又は乳酸菌用培地、例えばBL培地、Briggs liver broth培地、MRS培地、GAM培地、TTY培地、MGLP培地等を、乳酸菌で発酵させ、好ましくは対数増殖期の中期に集菌し、次いでカルシウムイオンを含むリン酸緩衝液又はトリス−塩酸緩衝液等により洗浄した後、カルシウムイオンを含まないリン酸緩衝液又はトリス−塩酸緩衝液等により抽出する方法又は更にDEAE−セファロースカラム、ゲル濾過カラム等により精製する方法等により得られるプロティナーゼ等を好ましく挙げることができる。
【０００８】
前記乳酸菌産生プロティナーゼを調製する際の乳酸菌としては、好ましくはラクトコッカス・ラクティスJCM-5805(Lactococcus lactis JCM-5805)等のラクトコッカス属、ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM-1003(Lactobacillus helveticus JCM-1003)、ラクトバチルス・カゼイ・サブスペシィーズカゼイJCM-1134(Lactobacillus casei subsp.casei JCM-1134)、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズブルガリカスJCM-1002(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus JCM-1002)等のラクトバチルス属、ロイコノストック・ラクテスJCM-6123(Leuconostoc lactis JCM-6123)等のロイコノストック属等を挙げることができる。また発酵は、好ましくは25〜45℃にて、3〜12時間の条件下行うことができる。また得られる発酵乳は、通常pH3〜4を示すが、目的とするプロティナーゼの収率を増加させるために、前記発酵を中性域のpHに保ち行うのが好ましい。更に前記抽出は、好ましくは5〜40℃にて10〜60分間抽出する工程を2〜5回繰り返すことにより行うことができる。
【０００９】
該乳酸菌産生プロティナーゼでカゼインを分解するには、該乳酸菌産生プロティナーゼと、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解したカゼインとを混合し、30〜45℃にて、1〜12時間反応させ、次いで、遠心分離し、好ましくは分子量分画10000〜50000の限外濾過膜等で限外濾過し、更に逆相液体カラムクロマトグラフィを用いて精製する方法等により、配列表の配列番号1〜23(ペプチド(1)〜(23)に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチドを精製させることができる。この際乳酸菌産生プロティナーゼとカゼインとの混合割合は、重量比で1：10〜1000であるのが好ましい。
【００１０】
本発明の血圧低下活性剤は、前記ペプチド(1)〜(23)のうちのペプチド(2)、(12)〜(14) 、 (16) 、 (19) 、 (20) 、 (22) 、(23)、ペプチド(1)〜(8)混合物もしくはペプチド(9)〜(23)混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を有効成分とし、少なくとも血圧低下活性を示すものである。
【００１１】
本発明の血圧低下剤において、前記有効成分の含有割合は、0.1〜100重量％、特に0.5〜10重量％とするのが好ましい。
【００１２】
本発明の血圧低下剤の投与形態は、主に経口投与等で行うことができる。剤形は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。また有効成分を、通常の医薬品あるいは医療食品、更には一般食品に添加、配合して用いることもできる。
本発明の血圧低下剤の投与量は、患者の年齢、症状等により異なるが、前記有効成分を基準として1mg／体重kg・日以上で使用するのが好ましい。
【００１３】
本発明の血圧低下剤には、前記有効成分以外に、乳糖、デキストリン等の賦形剤、安定剤等を配合することができる。
【００１４】
【発明の効果】
本発明の血圧低下剤は、毒性がなく、優れた血圧低下活性を示す。
【００１５】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて具体的にするが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1
ラクトバチルスヘルベティカスJCM-1003を、9重量％の脱脂乳中でpHを6.0に保ち培養し、濁度(590nmの吸収度)1.0において、クエン酸ナトリウムを1重量％添加し室温にて20分間保持した。次に5000回転、20分間の遠心分離を行い集菌し、20mM塩化カルシウム、50mMβ-グリセロリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、50mMトリス-塩酸(pH8.0)を50ml加えて37℃で、30分間保温、抽出した。次いで10000回転、10分間の遠心を行い上清液を採取した。同じ操作を合計4回行い上清液約200mlを採集した(粗抽出液)。この粗抽出液を、予め5mMエチレンジアミンテトラ酢酸溶液(EDTA)、20mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.8、TE緩衝液)で平衡化したDEAE-セファロースカラム(5ml)に通した。カラムを0.3Mの塩化ナトリウムを含むTE緩衝液30mlで洗浄後、1.0M塩化ナトリウムを含むTE緩衝液15mlで溶出し、この活性画分(溶出画分)から約150μgの乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして得た。
【００１６】
次に、20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)に溶解したカゼイン1gを上記得られたプロティナーゼあるいは比較としてトリプシン(和光純薬株式会社製)50μgと混合し、40℃で5時間反応させた。それぞれの反応液を10000回転、10分間の遠心後、限外ろ過(商品名「アドバンテック東洋UHP-150」、限外ろ過膜：分子量分画10000、富士フィルター工業株式会社製)を行ったところ、カゼイン1gからプロティナーゼ分解ペプチド約700mg(収率約70％)とトリプシン分解ペプチド約800mg(収率約80％)のペプチドがろ過外液中に得られた。
【００１７】
次いで得られたカゼイン分解ペプチド混合物を用いて、自然発症高血圧ラット(SHRラット、日本チャールズリバー社)に対する血圧降下作用を調べた。15週令雄ラット(1群5匹)に上記カゼイン分解ペプチド各々を胃ゾンデで強制投与(各140mg／kg)し、未投与群と血圧の経時変化を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測定装置(商品名「PE-300」、ナルコバイオシステム社製)を用い、tail-cuff法で最高血圧を求めた。結果を図1に示す。
【００１８】
図1の結果より本発明の有効成分を含むペプチドが、経口投与により約4〜7時間後において有意に血圧低下作用を示す事が確認された。トリプシン分解ペプチドには、このような強い効果は認められなかった。
【００１９】
実施例2
実施例1にて得られたプロティナーゼで分解したカゼイン分解物を、さらに高速液体クロマトグラフ(HPLC)により精製した。該精製は、逆相系樹脂を充填したカラム(M＆S PACK C-18、0.46ψ×150mm)にカゼイン分解物を通し、0.1重量％TFA水溶液で洗浄後、0.1重量％TFA水溶液〜0.06重量％TFA／(アセトニトリル：イソプロパノール＝3：7)溶液により60％迄の直線濃度勾配で溶出した。流速は、1ml／分、濃度勾配は1％／分とした。215nmの主な吸収ピークを各々集めた。さらにこれらのペプチドからそれぞれ溶媒を除去し、同条件により、再クロマトによりさらに精製した。それぞれのペプチドについて、減圧下でアセトニトリルを除去し、凍結乾燥によりペプチドを得た。これらのペプチドについて、6N塩酸で120℃、24時間加水分解し、アミノ酸分析(高速アミノ酸分析装置、商品名「MLC-203型」、アトー株式会社製)を行った。アミノ酸分析よりα-カゼイン及びβ-カゼイン内の位置を特定した。これらのペプチドは、α-カゼイン各々についてHPLCの溶出順にそれぞれ表1に示すα-1〜8、β-1〜15のペプチドであることが確認された。これらのペプチド及び実施例1で調製したプロティナーゼで分解したカゼイン分解物(ペプチド混合物)の血圧降下活性(ACEI活性)、カルシウム可溶化活性(CS活性)及び抗酸化活性(SOD様活性)を、以下に示す方法に従って測定した。比較のためにα-カゼイン及びβ-カゼインのトリプシン分解物についても、同様にそれぞれの活性を調べた。結果を表2に示す。
【００２０】
＜アンジオテンシン変換酵素阻害(ACEI)活性＞
(ACEI活性の測定方法)
ペプチドを含む試料20μlと、5mM Hiproil-His-Leu(HHL、シグマ社)、0.3M NaCl，0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.3)260μlを試験管内で37℃で10分間保温する。その後0.05U／mlのアンジオテンシン変換酵素(ACE：シグマ社)を20μl加え、37℃で30分間反応させた。その後、1N塩酸250μlを加え、反応を停止させた。酢酸エチル1.7mlを加え20秒間撹拌した後、3000回転で10分間遠心を行い酢酸エチル層1.4mlを採取した。その酢酸エチルを120℃で30分間加熱し乾燥後、蒸留水1mlを加え20秒間撹拌し、抽出されたHHLの吸収(228nmの吸光度)を測定した。
【００２１】
阻害率は、次式により算出した。
【数１】
A：試料を含まない場合の228nmの吸光度
B：試料を添加した場合の228nmの吸光度
C：酵素および試料を添加しない場合の228nmの吸光度
ACEIの酵素活性を50％阻害するために必要な試料の濃度(μg／ml)をIC50として示す。
【００２２】
＜カルシウム可溶化(CS)活性＞
(CS活性の測定方法)
カルシウムの定量は、キレート法(オルトクレゾールフタレインコンプレキソン、OCPC法)により行った。
ペプチドを含む試料50μlと、20mM塩化カルシウム、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)10μlを混合し、室温にて5分間保温する。さらに20mMリン酸緩衝液(pH7.0)を40μl加えて37℃でさらに30分間保温する。その後、15000回転で5分間遠心を行い上清液10μlを採取し、商品名「カルシウムC−テストワコー」(和光純薬)に含まれる緩衝液800μlと同封のOCPC試薬80μlを加えて発色させ、570nmの吸光度を測定した。
【００２３】
【数２】
A：リン酸緩衝液を加えない場合の570nmの吸光度
B：試料を添加した場合の570nmの吸光度
C：試料を添加しない場合の570nmの吸光度
カルシウムの可溶化率を50％とするために必要な試料の濃度(μg／ml)をSC50として表2に示す。
【００２４】
＜スーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)様活性＞
(SOD様活性の測定)
ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DETAPAC)溶液(5mg DETAPAC、9.8mlの50mMリン酸カリウム緩衝液、0.37mlの4μg／mlカタラーゼ、0.37mlの1.83mg／mlニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、1.26mlの1.0mMキサンチン)400μlと、ペプチドを含む試料20μlと、キサンチンオキシダーゼ(シグマ社製を400倍希釈)50μlとを混合し、30℃で保温した。この際3分間で変化する吸光度(560 nmの吸光度)の差を測定した。キサンチンオキシダーゼの阻害率は次式により算出した。
【００２５】
【数３】
A：試料を加えないときの560nmの吸光度
B：試料を加えたときの560nmの吸光度
C：酵素添加しない場合の560nmの吸光度
キサンチンオキシダーゼの酵素活性を50％阻害するために必要な試料の濃度(μg／ml)をIC50として表2示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例1でtail-cuff法により測定した最高血圧と投与後の時間との関係を示すグラフである。
【発明の技術分野】
本発明は、血圧低下剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、発酵乳が種々の生理活性作用を示すことが知られているが、発酵乳中の如何なる成分が活性に関与しているかはあまり確認されていない(例えば、特許文献1〜3参照)。
一方、カゼインのトリプシン、ペプシン等の酵素分解物が、例えば血圧低下活性、カルシウム可溶化活性等の生理活性を示すことも知られているが、発酵乳中に含まれるペプチド及びそのペプチドの機能に関してはほとんど知られていないのが現状である。
乳酸菌は、乳中で生育し、菌体外プロティナーゼを産生し、カゼイン等の乳蛋白質を分解すると考えられており、最近、乳酸菌産生プロティナーゼによるカゼインの切断部位について一部報告がなされている(例えば、非特許文献1〜2参照)。
しかしながら、前記カゼインの切断部位に関しては、未だ不明な点が多く、生成ペプチドの生理機能に関する報告はなされていない。
また従来カゼインをトリプシン、ペプシン等により分解して得られるペプチドは、苦味の生成が大きな問題となっている。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭61-53216号公報
【特許文献２】
特開昭61-53217号公報
【特許文献３】
特公平3-64486号公報
【非特許文献１】
Monnetら(FEMS Microbiology Letters),36,127-131(1986)
【非特許文献２】
Zevacoら(Le Lait),68,393-408(1988)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、苦みがなく、且つ毒性がなく、優れた血圧低下活性を示す血圧低下剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、有効成分として配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物もしくは配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を含有することを特徴とする血圧低下剤が提供される。
また本発明によれば、獣乳カゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製し、配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を得、得られたペプチド又はペプチド混合物を配合することを特徴とする前記血圧低下剤の製造法が提供される。
【０００６】
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いる配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を製造するには、例えばカゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製する方法又は通常の化学合成法等により得ることができる。
【０００７】
前記乳酸菌産生プロティナーゼは、例えば牛乳、山羊乳、脱脂乳等の乳又は乳酸菌用培地、例えばBL培地、Briggs liver broth培地、MRS培地、GAM培地、TTY培地、MGLP培地等を、乳酸菌で発酵させ、好ましくは対数増殖期の中期に集菌し、次いでカルシウムイオンを含むリン酸緩衝液又はトリス−塩酸緩衝液等により洗浄した後、カルシウムイオンを含まないリン酸緩衝液又はトリス−塩酸緩衝液等により抽出する方法又は更にDEAE−セファロースカラム、ゲル濾過カラム等により精製する方法等により得られるプロティナーゼ等を好ましく挙げることができる。
【０００８】
前記乳酸菌産生プロティナーゼを調製する際の乳酸菌としては、好ましくはラクトコッカス・ラクティスJCM-5805(Lactococcus lactis JCM-5805)等のラクトコッカス属、ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM-1003(Lactobacillus helveticus JCM-1003)、ラクトバチルス・カゼイ・サブスペシィーズカゼイJCM-1134(Lactobacillus casei subsp.casei JCM-1134)、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズブルガリカスJCM-1002(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus JCM-1002)等のラクトバチルス属、ロイコノストック・ラクテスJCM-6123(Leuconostoc lactis JCM-6123)等のロイコノストック属等を挙げることができる。また発酵は、好ましくは25〜45℃にて、3〜12時間の条件下行うことができる。また得られる発酵乳は、通常pH3〜4を示すが、目的とするプロティナーゼの収率を増加させるために、前記発酵を中性域のpHに保ち行うのが好ましい。更に前記抽出は、好ましくは5〜40℃にて10〜60分間抽出する工程を2〜5回繰り返すことにより行うことができる。
【０００９】
該乳酸菌産生プロティナーゼでカゼインを分解するには、該乳酸菌産生プロティナーゼと、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解したカゼインとを混合し、30〜45℃にて、1〜12時間反応させ、次いで、遠心分離し、好ましくは分子量分画10000〜50000の限外濾過膜等で限外濾過し、更に逆相液体カラムクロマトグラフィを用いて精製する方法等により、配列表の配列番号1〜23(ペプチド(1)〜(23)に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチドを精製させることができる。この際乳酸菌産生プロティナーゼとカゼインとの混合割合は、重量比で1：10〜1000であるのが好ましい。
【００１０】
本発明の血圧低下活性剤は、前記ペプチド(1)〜(23)のうちのペプチド(2)、(12)〜(14) 、 (16) 、 (19) 、 (20) 、 (22) 、(23)、ペプチド(1)〜(8)混合物もしくはペプチド(9)〜(23)混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を有効成分とし、少なくとも血圧低下活性を示すものである。
【００１１】
本発明の血圧低下剤において、前記有効成分の含有割合は、0.1〜100重量％、特に0.5〜10重量％とするのが好ましい。
【００１２】
本発明の血圧低下剤の投与形態は、主に経口投与等で行うことができる。剤形は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。また有効成分を、通常の医薬品あるいは医療食品、更には一般食品に添加、配合して用いることもできる。
本発明の血圧低下剤の投与量は、患者の年齢、症状等により異なるが、前記有効成分を基準として1mg／体重kg・日以上で使用するのが好ましい。
【００１３】
本発明の血圧低下剤には、前記有効成分以外に、乳糖、デキストリン等の賦形剤、安定剤等を配合することができる。
【００１４】
【発明の効果】
本発明の血圧低下剤は、毒性がなく、優れた血圧低下活性を示す。
【００１５】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて具体的にするが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1
ラクトバチルスヘルベティカスJCM-1003を、9重量％の脱脂乳中でpHを6.0に保ち培養し、濁度(590nmの吸収度)1.0において、クエン酸ナトリウムを1重量％添加し室温にて20分間保持した。次に5000回転、20分間の遠心分離を行い集菌し、20mM塩化カルシウム、50mMβ-グリセロリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、50mMトリス-塩酸(pH8.0)を50ml加えて37℃で、30分間保温、抽出した。次いで10000回転、10分間の遠心を行い上清液を採取した。同じ操作を合計4回行い上清液約200mlを採集した(粗抽出液)。この粗抽出液を、予め5mMエチレンジアミンテトラ酢酸溶液(EDTA)、20mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.8、TE緩衝液)で平衡化したDEAE-セファロースカラム(5ml)に通した。カラムを0.3Mの塩化ナトリウムを含むTE緩衝液30mlで洗浄後、1.0M塩化ナトリウムを含むTE緩衝液15mlで溶出し、この活性画分(溶出画分)から約150μgの乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして得た。
【００１６】
次に、20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)に溶解したカゼイン1gを上記得られたプロティナーゼあるいは比較としてトリプシン(和光純薬株式会社製)50μgと混合し、40℃で5時間反応させた。それぞれの反応液を10000回転、10分間の遠心後、限外ろ過(商品名「アドバンテック東洋UHP-150」、限外ろ過膜：分子量分画10000、富士フィルター工業株式会社製)を行ったところ、カゼイン1gからプロティナーゼ分解ペプチド約700mg(収率約70％)とトリプシン分解ペプチド約800mg(収率約80％)のペプチドがろ過外液中に得られた。
【００１７】
次いで得られたカゼイン分解ペプチド混合物を用いて、自然発症高血圧ラット(SHRラット、日本チャールズリバー社)に対する血圧降下作用を調べた。15週令雄ラット(1群5匹)に上記カゼイン分解ペプチド各々を胃ゾンデで強制投与(各140mg／kg)し、未投与群と血圧の経時変化を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測定装置(商品名「PE-300」、ナルコバイオシステム社製)を用い、tail-cuff法で最高血圧を求めた。結果を図1に示す。
【００１８】
図1の結果より本発明の有効成分を含むペプチドが、経口投与により約4〜7時間後において有意に血圧低下作用を示す事が確認された。トリプシン分解ペプチドには、このような強い効果は認められなかった。
【００１９】
実施例2
実施例1にて得られたプロティナーゼで分解したカゼイン分解物を、さらに高速液体クロマトグラフ(HPLC)により精製した。該精製は、逆相系樹脂を充填したカラム(M＆S PACK C-18、0.46ψ×150mm)にカゼイン分解物を通し、0.1重量％TFA水溶液で洗浄後、0.1重量％TFA水溶液〜0.06重量％TFA／(アセトニトリル：イソプロパノール＝3：7)溶液により60％迄の直線濃度勾配で溶出した。流速は、1ml／分、濃度勾配は1％／分とした。215nmの主な吸収ピークを各々集めた。さらにこれらのペプチドからそれぞれ溶媒を除去し、同条件により、再クロマトによりさらに精製した。それぞれのペプチドについて、減圧下でアセトニトリルを除去し、凍結乾燥によりペプチドを得た。これらのペプチドについて、6N塩酸で120℃、24時間加水分解し、アミノ酸分析(高速アミノ酸分析装置、商品名「MLC-203型」、アトー株式会社製)を行った。アミノ酸分析よりα-カゼイン及びβ-カゼイン内の位置を特定した。これらのペプチドは、α-カゼイン各々についてHPLCの溶出順にそれぞれ表1に示すα-1〜8、β-1〜15のペプチドであることが確認された。これらのペプチド及び実施例1で調製したプロティナーゼで分解したカゼイン分解物(ペプチド混合物)の血圧降下活性(ACEI活性)、カルシウム可溶化活性(CS活性)及び抗酸化活性(SOD様活性)を、以下に示す方法に従って測定した。比較のためにα-カゼイン及びβ-カゼインのトリプシン分解物についても、同様にそれぞれの活性を調べた。結果を表2に示す。
【００２０】
＜アンジオテンシン変換酵素阻害(ACEI)活性＞
(ACEI活性の測定方法)
ペプチドを含む試料20μlと、5mM Hiproil-His-Leu(HHL、シグマ社)、0.3M NaCl，0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.3)260μlを試験管内で37℃で10分間保温する。その後0.05U／mlのアンジオテンシン変換酵素(ACE：シグマ社)を20μl加え、37℃で30分間反応させた。その後、1N塩酸250μlを加え、反応を停止させた。酢酸エチル1.7mlを加え20秒間撹拌した後、3000回転で10分間遠心を行い酢酸エチル層1.4mlを採取した。その酢酸エチルを120℃で30分間加熱し乾燥後、蒸留水1mlを加え20秒間撹拌し、抽出されたHHLの吸収(228nmの吸光度)を測定した。
【００２１】
阻害率は、次式により算出した。
【数１】
B：試料を添加した場合の228nmの吸光度
C：酵素および試料を添加しない場合の228nmの吸光度
ACEIの酵素活性を50％阻害するために必要な試料の濃度(μg／ml)をIC50として示す。
【００２２】
＜カルシウム可溶化(CS)活性＞
(CS活性の測定方法)
カルシウムの定量は、キレート法(オルトクレゾールフタレインコンプレキソン、OCPC法)により行った。
ペプチドを含む試料50μlと、20mM塩化カルシウム、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)10μlを混合し、室温にて5分間保温する。さらに20mMリン酸緩衝液(pH7.0)を40μl加えて37℃でさらに30分間保温する。その後、15000回転で5分間遠心を行い上清液10μlを採取し、商品名「カルシウムC−テストワコー」(和光純薬)に含まれる緩衝液800μlと同封のOCPC試薬80μlを加えて発色させ、570nmの吸光度を測定した。
【００２３】
【数２】
B：試料を添加した場合の570nmの吸光度
C：試料を添加しない場合の570nmの吸光度
カルシウムの可溶化率を50％とするために必要な試料の濃度(μg／ml)をSC50として表2に示す。
【００２４】
＜スーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)様活性＞
(SOD様活性の測定)
ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DETAPAC)溶液(5mg DETAPAC、9.8mlの50mMリン酸カリウム緩衝液、0.37mlの4μg／mlカタラーゼ、0.37mlの1.83mg／mlニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、1.26mlの1.0mMキサンチン)400μlと、ペプチドを含む試料20μlと、キサンチンオキシダーゼ(シグマ社製を400倍希釈)50μlとを混合し、30℃で保温した。この際3分間で変化する吸光度(560 nmの吸光度)の差を測定した。キサンチンオキシダーゼの阻害率は次式により算出した。
【００２５】
【数３】
B：試料を加えたときの560nmの吸光度
C：酵素添加しない場合の560nmの吸光度
キサンチンオキシダーゼの酵素活性を50％阻害するために必要な試料の濃度(μg／ml)をIC50として表2示す。
【００２６】
【表１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例1でtail-cuff法により測定した最高血圧と投与後の時間との関係を示すグラフである。
Claims (3)
- 有効成分として配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物もしくは配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を含有することを特徴とする血圧低下剤。
- 獣乳カゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製し、配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を得、得られたペプチド又はペプチド混合物を配合することを特徴とする請求項1記載の血圧低下剤の製造法。
- 前記乳酸菌産生プロティナーゼが、乳又は乳酸菌生育用培地を、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ・サブスペシィーズカゼイ、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズブルガリカス、ロイコノストック・ラクテス及びこれらの混合物からなる群より選択される乳酸菌を用いて発酵させて得られた乳酸菌産生プロティナーゼであることを特徴とする請求項2記載の製造法。
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