JP3949613B2 - Antihypertensive agent and method for producing the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、血圧低下剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、発酵乳が種々の生理活性作用を示すことが知られているが、発酵乳中の如何なる成分が活性に関与しているかはあまり確認されていない(例えば、特許文献1〜3参照)。
一方、カゼインのトリプシン、ペプシン等の酵素分解物が、例えば血圧低下活性、カルシウム可溶化活性等の生理活性を示すことも知られているが、発酵乳中に含まれるペプチド及びそのペプチドの機能に関してはほとんど知られていないのが現状である。
乳酸菌は、乳中で生育し、菌体外プロティナーゼを産生し、カゼイン等の乳蛋白質を分解すると考えられており、最近、乳酸菌産生プロティナーゼによるカゼインの切断部位について一部報告がなされている(例えば、非特許文献1〜2参照)。
しかしながら、前記カゼインの切断部位に関しては、未だ不明な点が多く、生成ペプチドの生理機能に関する報告はなされていない。
また従来カゼインをトリプシン、ペプシン等により分解して得られるペプチドは、苦味の生成が大きな問題となっている。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭61-53216号公報
【特許文献２】
特開昭61-53217号公報
【特許文献３】
特公平3-64486号公報
【非特許文献１】
Monnetら(FEMS Microbiology Letters),36,127-131(1986)
【非特許文献２】
Zevacoら(Le Lait),68,393-408(1988)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、苦みがなく、且つ毒性がなく、優れた血圧低下活性を示す血圧低下剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、有効成分として配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物もしくは配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を含有することを特徴とする血圧低下剤が提供される。
また本発明によれば、獣乳カゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製し、配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を得、得られたペプチド又はペプチド混合物を配合することを特徴とする前記血圧低下剤の製造法が提供される。
【０００６】
以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いる配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を製造するには、例えばカゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製する方法又は通常の化学合成法等により得ることができる。
【０００７】
前記乳酸菌産生プロティナーゼは、例えば牛乳、山羊乳、脱脂乳等の乳又は乳酸菌用培地、例えばBL培地、Briggs liver broth培地、MRS培地、GAM培地、TTY培地、MGLP培地等を、乳酸菌で発酵させ、好ましくは対数増殖期の中期に集菌し、次いでカルシウムイオンを含むリン酸緩衝液又はトリス−塩酸緩衝液等により洗浄した後、カルシウムイオンを含まないリン酸緩衝液又はトリス−塩酸緩衝液等により抽出する方法又は更にDEAE−セファロースカラム、ゲル濾過カラム等により精製する方法等により得られるプロティナーゼ等を好ましく挙げることができる。
【０００８】
前記乳酸菌産生プロティナーゼを調製する際の乳酸菌としては、好ましくはラクトコッカス・ラクティスJCM-5805(Lactococcus lactis JCM-5805)等のラクトコッカス属、ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM-1003(Lactobacillus helveticus JCM-1003)、ラクトバチルス・カゼイ・サブスペシィーズカゼイJCM-1134(Lactobacillus casei subsp.casei JCM-1134)、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズブルガリカスJCM-1002(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus JCM-1002)等のラクトバチルス属、ロイコノストック・ラクテスJCM-6123(Leuconostoc lactis JCM-6123)等のロイコノストック属等を挙げることができる。また発酵は、好ましくは25〜45℃にて、3〜12時間の条件下行うことができる。また得られる発酵乳は、通常pH3〜4を示すが、目的とするプロティナーゼの収率を増加させるために、前記発酵を中性域のpHに保ち行うのが好ましい。更に前記抽出は、好ましくは5〜40℃にて10〜60分間抽出する工程を2〜5回繰り返すことにより行うことができる。
【０００９】
該乳酸菌産生プロティナーゼでカゼインを分解するには、該乳酸菌産生プロティナーゼと、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解したカゼインとを混合し、30〜45℃にて、1〜12時間反応させ、次いで、遠心分離し、好ましくは分子量分画10000〜50000の限外濾過膜等で限外濾過し、更に逆相液体カラムクロマトグラフィを用いて精製する方法等により、配列表の配列番号1〜23(ペプチド(1)〜(23)に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチドを精製させることができる。この際乳酸菌産生プロティナーゼとカゼインとの混合割合は、重量比で1：10〜1000であるのが好ましい。
【００１０】
本発明の血圧低下活性剤は、前記ペプチド(1)〜(23)のうちのペプチド(2)、(12)〜(14) 、 (16) 、 (19) 、 (20) 、 (22) 、(23)、ペプチド(1)〜(8)混合物もしくはペプチド(9)〜(23)混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を有効成分とし、少なくとも血圧低下活性を示すものである。
【００１１】
本発明の血圧低下剤において、前記有効成分の含有割合は、0.1〜100重量％、特に0.5〜10重量％とするのが好ましい。
【００１２】
本発明の血圧低下剤の投与形態は、主に経口投与等で行うことができる。剤形は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。また有効成分を、通常の医薬品あるいは医療食品、更には一般食品に添加、配合して用いることもできる。
本発明の血圧低下剤の投与量は、患者の年齢、症状等により異なるが、前記有効成分を基準として1mg／体重kg・日以上で使用するのが好ましい。
【００１３】
本発明の血圧低下剤には、前記有効成分以外に、乳糖、デキストリン等の賦形剤、安定剤等を配合することができる。
【００１４】
【発明の効果】
本発明の血圧低下剤は、毒性がなく、優れた血圧低下活性を示す。
【００１５】
【実施例】
以下本発明を実施例に基づいて具体的にするが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1
ラクトバチルスヘルベティカスJCM-1003を、9重量％の脱脂乳中でpHを6.0に保ち培養し、濁度(590nmの吸収度)1.0において、クエン酸ナトリウムを1重量％添加し室温にて20分間保持した。次に5000回転、20分間の遠心分離を行い集菌し、20mM塩化カルシウム、50mMβ-グリセロリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)で洗浄した後、50mMトリス-塩酸(pH8.0)を50ml加えて37℃で、30分間保温、抽出した。次いで10000回転、10分間の遠心を行い上清液を採取した。同じ操作を合計4回行い上清液約200mlを採集した(粗抽出液)。この粗抽出液を、予め5mMエチレンジアミンテトラ酢酸溶液(EDTA)、20mMトリス-塩酸緩衝液(pH7.8、TE緩衝液)で平衡化したDEAE-セファロースカラム(5ml)に通した。カラムを0.3Mの塩化ナトリウムを含むTE緩衝液30mlで洗浄後、1.0M塩化ナトリウムを含むTE緩衝液15mlで溶出し、この活性画分(溶出画分)から約150μgの乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして得た。
【００１６】
次に、20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)に溶解したカゼイン1gを上記得られたプロティナーゼあるいは比較としてトリプシン(和光純薬株式会社製)50μgと混合し、40℃で5時間反応させた。それぞれの反応液を10000回転、10分間の遠心後、限外ろ過(商品名「アドバンテック東洋UHP-150」、限外ろ過膜：分子量分画10000、富士フィルター工業株式会社製)を行ったところ、カゼイン1gからプロティナーゼ分解ペプチド約700mg(収率約70％)とトリプシン分解ペプチド約800mg(収率約80％)のペプチドがろ過外液中に得られた。
【００１７】
次いで得られたカゼイン分解ペプチド混合物を用いて、自然発症高血圧ラット(SHRラット、日本チャールズリバー社)に対する血圧降下作用を調べた。15週令雄ラット(1群5匹)に上記カゼイン分解ペプチド各々を胃ゾンデで強制投与(各140mg／kg)し、未投与群と血圧の経時変化を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測定装置(商品名「PE-300」、ナルコバイオシステム社製)を用い、tail-cuff法で最高血圧を求めた。結果を図1に示す。
【００１８】
図1の結果より本発明の有効成分を含むペプチドが、経口投与により約4〜7時間後において有意に血圧低下作用を示す事が確認された。トリプシン分解ペプチドには、このような強い効果は認められなかった。
【００１９】
実施例2
実施例1にて得られたプロティナーゼで分解したカゼイン分解物を、さらに高速液体クロマトグラフ(HPLC)により精製した。該精製は、逆相系樹脂を充填したカラム(M＆S PACK C-18、0.46ψ×150mm)にカゼイン分解物を通し、0.1重量％TFA水溶液で洗浄後、0.1重量％TFA水溶液〜0.06重量％TFA／(アセトニトリル：イソプロパノール＝3：7)溶液により60％迄の直線濃度勾配で溶出した。流速は、1ml／分、濃度勾配は1％／分とした。215nmの主な吸収ピークを各々集めた。さらにこれらのペプチドからそれぞれ溶媒を除去し、同条件により、再クロマトによりさらに精製した。それぞれのペプチドについて、減圧下でアセトニトリルを除去し、凍結乾燥によりペプチドを得た。これらのペプチドについて、6N塩酸で120℃、24時間加水分解し、アミノ酸分析(高速アミノ酸分析装置、商品名「MLC-203型」、アトー株式会社製)を行った。アミノ酸分析よりα-カゼイン及びβ-カゼイン内の位置を特定した。これらのペプチドは、α-カゼイン各々についてHPLCの溶出順にそれぞれ表1に示すα-1〜8、β-1〜15のペプチドであることが確認された。これらのペプチド及び実施例1で調製したプロティナーゼで分解したカゼイン分解物(ペプチド混合物)の血圧降下活性(ACEI活性)、カルシウム可溶化活性(CS活性)及び抗酸化活性(SOD様活性)を、以下に示す方法に従って測定した。比較のためにα-カゼイン及びβ-カゼインのトリプシン分解物についても、同様にそれぞれの活性を調べた。結果を表2に示す。
【００２０】
＜アンジオテンシン変換酵素阻害(ACEI)活性＞
(ACEI活性の測定方法)
ペプチドを含む試料20μlと、5mM Hiproil-His-Leu(HHL、シグマ社)、0.3M NaCl，0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.3)260μlを試験管内で37℃で10分間保温する。その後0.05U／mlのアンジオテンシン変換酵素(ACE：シグマ社)を20μl加え、37℃で30分間反応させた。その後、1N塩酸250μlを加え、反応を停止させた。酢酸エチル1.7mlを加え20秒間撹拌した後、3000回転で10分間遠心を行い酢酸エチル層1.4mlを採取した。その酢酸エチルを120℃で30分間加熱し乾燥後、蒸留水1mlを加え20秒間撹拌し、抽出されたHHLの吸収(228nmの吸光度)を測定した。
【００２１】
阻害率は、次式により算出した。
【数１】

A：試料を含まない場合の228nmの吸光度
B：試料を添加した場合の228nmの吸光度
C：酵素および試料を添加しない場合の228nmの吸光度
ACEIの酵素活性を50％阻害するために必要な試料の濃度(μg／ml)をIC₅₀として示す。
【００２２】
＜カルシウム可溶化(CS)活性＞
(CS活性の測定方法)
カルシウムの定量は、キレート法(オルトクレゾールフタレインコンプレキソン、OCPC法)により行った。
ペプチドを含む試料50μlと、20mM塩化カルシウム、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)10μlを混合し、室温にて5分間保温する。さらに20mMリン酸緩衝液(pH7.0)を40μl加えて37℃でさらに30分間保温する。その後、15000回転で5分間遠心を行い上清液10μlを採取し、商品名「カルシウムC−テストワコー」(和光純薬)に含まれる緩衝液800μlと同封のOCPC試薬80μlを加えて発色させ、570nmの吸光度を測定した。
【００２３】
【数２】

A：リン酸緩衝液を加えない場合の570nmの吸光度
B：試料を添加した場合の570nmの吸光度
C：試料を添加しない場合の570nmの吸光度
カルシウムの可溶化率を50％とするために必要な試料の濃度(μg／ml)をSC₅₀として表2に示す。
【００２４】
＜スーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)様活性＞
(SOD様活性の測定)
ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DETAPAC)溶液(5mg DETAPAC、9.8mlの50mMリン酸カリウム緩衝液、0.37mlの4μg／mlカタラーゼ、0.37mlの1.83mg／mlニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、1.26mlの1.0mMキサンチン)400μlと、ペプチドを含む試料20μlと、キサンチンオキシダーゼ(シグマ社製を400倍希釈)50μlとを混合し、30℃で保温した。この際3分間で変化する吸光度(560 nmの吸光度)の差を測定した。キサンチンオキシダーゼの阻害率は次式により算出した。
【００２５】
【数３】

A：試料を加えないときの560nmの吸光度
B：試料を加えたときの560nmの吸光度
C：酵素添加しない場合の560nmの吸光度
キサンチンオキシダーゼの酵素活性を50％阻害するために必要な試料の濃度(μg／ml)をIC₅₀として表2示す。
【００２６】
【表１】

【００２７】
【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例1でtail-cuff法により測定した最高血圧と投与後の時間との関係を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a blood pressure low laxative.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, it is known that fermented milk exhibits various physiologically active actions, but it has not been confirmed that what components in fermented milk are involved in the activity (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
On the other hand, it is also known that casein trypsin, pepsin and other enzymatic degradation products exhibit physiological activities such as blood pressure lowering activity, calcium solubilizing activity, etc., but regarding peptides contained in fermented milk and functions of the peptides Is currently unknown.
Lactic acid bacteria are considered to grow in milk, produce extracellular proteinases, and degrade milk proteins such as casein. Recently, some reports have been made on the cleavage sites of casein by lactic acid bacteria-producing proteinases (for example, Non-patent documents 1 and 2).
However, there are still many unclear points regarding the cleavage site of the casein, and no report has been made on the physiological function of the produced peptide.
Conventionally, peptides obtained by degrading casein with trypsin, pepsin or the like have a big problem of generating bitterness.
[0003]
[Patent Document 1]
JP 61-53216 A [Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 61-53217 [Patent Document 3]
Japanese Patent Publication No. 3-64486 [Non-Patent Document 1]
Monnet et al. (FEMS Microbiology Letters), 36 , 127-131 (1986)
[Non-Patent Document 2]
Zevaco et al. (Le Lait), 68 , 393-408 (1988)
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention, no bitter and no toxicity, is to provide a blood pressure low laxative show excellent hypotensive activity.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
According to the present invention, each peptide represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 12-14 , 16 , 19 , 20 , 22 , 23 of the sequence listing as an active ingredient, described in SEQ ID NO: 1-8 blood pressure, characterized in that it contains a peptide mixture or peptide mixture represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9-23, or a pharmaceutically acceptable salt or food acceptable salts their pharmaceutically represented by the amino acid sequence low laxative is provided.
Further, according to the present invention, animal milk casein is decomposed and purified with a lactic acid bacteria-producing proteinase, and each amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 12-14 , 16 , 19 , 20 , 22 , 23 in the sequence listing is used. Obtaining a peptide, a peptide mixture represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 8 or a peptide mixture represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 to 23, and blending the obtained peptide or peptide mixture the blood pressure low laxative preparation is provided which is characterized.
[0006]
The present invention will be described in detail below.
Each peptide represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 12-14 , 16 , 19 , 20 , 22 , 23 , 23 of the sequence listing used in the present invention, represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1-8 In order to produce the peptide mixture or the peptide mixture represented by the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 9 to 23, it can be obtained by, for example, a method of degrading and purifying casein with a lactic acid bacteria-producing proteinase, or a normal chemical synthesis method.
[0007]
The lactic acid bacteria producing proteinase is, for example, milk such as cow's milk, goat's milk, skim milk or medium for lactic acid bacteria, such as BL medium, Briggs liver broth medium, MRS medium, GAM medium, TTY medium, MGLP medium, etc., fermented with lactic acid bacteria, Preferably, cells are collected at the middle stage of the logarithmic growth phase, and then washed with a phosphate buffer solution or a Tris-HCl buffer solution containing calcium ions, and then washed with a phosphate buffer solution or a Tris-HCl buffer solution containing no calcium ions. Preferable examples include proteinases obtained by the extraction method or the purification method by DEAE-Sepharose column, gel filtration column, etc.
[0008]
As the lactic acid bacteria in preparing the lactic acid bacteria-producing proteinase, preferably Lactococcus lactis JCM-5805 (Lactococcus lactis JCM-5805) and other Lactococcus genus, Lactobacillus helveticus JCM-1003 (Lactobacillus helveticus JCM-1003), Lactobacillus casei subspecies casei JCM-1134 (Lactobacillus casei subsp.casei JCM-1134), Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus JCM-1002 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus JCM-1002) Genus, Leuconostoc lactis JCM-6123 and the like. Fermentation can be preferably carried out at 25 to 45 ° C. for 3 to 12 hours. Moreover, although the obtained fermented milk normally shows pH 3-4, in order to increase the yield of the target proteinase, it is preferable to perform the said fermentation by maintaining pH of a neutral range. Furthermore, the said extraction can be preferably performed by repeating the process of extracting for 10 to 60 minutes at 5 to 40 degreeC 2 to 5 times.
[0009]
In order to decompose casein with the lactic acid bacterium-producing proteinase, the lactic acid bacterium-producing proteinase is mixed with casein dissolved in a buffer solution such as a phosphate buffer, and reacted at 30 to 45 ° C. for 1 to 12 hours. Subsequently, the mixture is centrifuged, preferably ultrafiltered with an ultrafiltration membrane or the like having a molecular weight fraction of 10,000 to 50,000, and further purified using reverse phase liquid column chromatography. Peptides represented by the amino acid sequences described in peptides (1) to (23) can be purified, and the mixing ratio of lactic acid bacteria-producing proteinase and casein is 1:10 to 1000 by weight. preferable.
[0010]
The antihypertensive agent of the present invention includes peptides (2), (12) to ( 14) , (16) , (19) , (20) , (22) of the peptides (1) to (23 ) , (23), peptide (1)-(8) mixture or peptide (9)-(23) mixture, or a pharmaceutically acceptable salt or food-acceptable salt thereof, and having at least blood pressure lowering activity. It is shown.
[0011]
In the blood pressure low laxative of the present invention, the content of the active ingredient, preferably 0.1 to 100% by weight, in particular 0.5 to 10 wt%.
[0012]
Dosage forms of the blood pressure low laxative of the present invention can be carried out mainly by oral administration. The dosage form can be used as a tablet, granule, capsule or the like, and further as a liquid preparation. Moreover, an active ingredient can also be added and mix | blended and used for a normal pharmaceutical or medical food, and also general food.
The dose of the blood pressure low laxative of the present invention, the patient's age, although different symptoms like, preferably used in the active ingredient, based on the 1mg / body weight kg · day or more.
[0013]
Blood pressure low laxatives of this invention, in addition to the active ingredient can be blended lactose, excipients such as dextrin, a stabilizer and the like.
[0014]
【The invention's effect】
Blood pressure low laxative of the present invention, non-toxic, exhibit excellent hypotensive activity.
[0015]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is concretely based on an Example, this invention is not limited to these.
Example 1
Lactobacillus helveticus JCM-1003 was cultured in 9% by weight of skim milk while maintaining the pH at 6.0, and at a turbidity (absorbance of 590 nm) of 1.0, sodium citrate was added at 1% by weight, and the temperature was 20 Hold for a minute. Next, collect the cells by centrifugation at 5000 rpm for 20 minutes, wash with 20 mM calcium chloride, 50 mM β-glycerophosphate sodium buffer (pH 8.0), and then add 50 ml of 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0). Incubated at 37 ° C. for 30 minutes for extraction. Next, the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes. The same operation was performed a total of 4 times, and about 200 ml of the supernatant was collected (crude extract). This crude extract was passed through a DEAE-Sepharose column (5 ml) previously equilibrated with 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) and 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8, TE buffer). The column was washed with 30 ml of TE buffer containing 0.3 M sodium chloride, and then eluted with 15 ml of TE buffer containing 1.0 M sodium chloride, and about 150 μg of lactic acid bacteria-producing proteinase was almost isolated from this active fraction (elution fraction). Obtained as one.
[0016]
Next, 1 g of casein dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) was mixed with 50 μg of the proteinase obtained above or trypsin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a comparison, and reacted at 40 ° C. for 5 hours. . Each reaction solution was centrifuged at 10000 rpm for 10 minutes and then subjected to ultrafiltration (trade name “Advantech Toyo UHP-150”, ultrafiltration membrane: molecular weight fraction 10000, manufactured by Fuji Filter Industry Co., Ltd.) From 1 g of casein, about 700 mg of proteinase-degrading peptide (yield about 70%) and about 800 mg of trypsin-degrading peptide (yield about 80%) were obtained in the filtrate.
[0017]
Next, using the obtained casein-degrading peptide mixture, the blood pressure lowering effect on spontaneously hypertensive rats (SHR rats, Charles River Japan) was examined. Each of the above casein-degrading peptides was forcibly administered to a 15-week-old male rat (5 mice per group) with a gastric sonde (140 mg / kg each), and the time course of blood pressure was compared with that of the non-administered group. For blood pressure measurement, a non-invasive blood pressure measuring device (trade name “PE-300”, manufactured by Nalco Biosystems) was used to determine the maximum blood pressure by the tail-cuff method. The results are shown in Figure 1.
[0018]
From the results shown in FIG. 1, it was confirmed that the peptide containing the active ingredient of the present invention exhibited a significant blood pressure lowering effect after about 4 to 7 hours by oral administration. Such a strong effect was not observed for trypsin-degrading peptides.
[0019]
Example 2
The casein degradation product decomposed with proteinase obtained in Example 1 was further purified by high performance liquid chromatography (HPLC). In the purification, a casein decomposition product was passed through a column (M & S PACK C-18, 0.46φ × 150 mm) packed with a reverse phase resin, washed with a 0.1 wt% TFA aqueous solution, and then 0.1 wt% TFA aqueous solution to 0.06 wt% TFA. / (Acetonitrile: isopropanol = 3: 7) solution was eluted with a linear concentration gradient up to 60%. The flow rate was 1 ml / min and the concentration gradient was 1% / min. Each major absorption peak at 215 nm was collected. Further, the solvent was removed from each of these peptides, and further purification was performed by rechromatography under the same conditions. For each peptide, acetonitrile was removed under reduced pressure, and the peptide was obtained by lyophilization. These peptides were hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 120 ° C. for 24 hours and subjected to amino acid analysis (high-speed amino acid analyzer, trade name “MLC-203 type”, manufactured by Ato Co., Ltd.). The position in α-casein and β-casein was identified by amino acid analysis. It was confirmed that these peptides were α-1 to 8 and β-1 to 15 shown in Table 1 in the order of HPLC elution for each α-casein. The blood pressure lowering activity (ACEI activity), calcium solubilizing activity (CS activity) and antioxidant activity (SOD-like activity) of these peptides and the casein degradation product (peptide mixture) degraded with the proteinase prepared in Example 1 are as follows. It measured according to the method shown in. For comparison, the activities of α-casein and β-casein trypsin degradation products were similarly examined. The results are shown in Table 2.
[0020]
<Angiotensin converting enzyme inhibition (ACEI) activity>
(Measurement method of ACEI activity)
Incubate 20 μl of the sample containing peptide and 260 μl of 5 mM Hiproil-His-Leu (HHL, Sigma), 0.3 M NaCl, 0.1 M borate buffer (pH 8.3) at 37 ° C. for 10 minutes in a test tube. Thereafter, 20 μl of 0.05 U / ml angiotensin converting enzyme (ACE: Sigma) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 250 μl of 1N hydrochloric acid was added to stop the reaction. After adding 1.7 ml of ethyl acetate and stirring for 20 seconds, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to obtain 1.4 ml of an ethyl acetate layer. The ethyl acetate was heated at 120 ° C. for 30 minutes and dried, 1 ml of distilled water was added and stirred for 20 seconds, and the absorption of the extracted HHL (absorbance at 228 nm) was measured.
[0021]
The inhibition rate was calculated by the following formula.
[Expression 1]

A: Absorbance at 228 nm without sample
B: Absorbance at 228 nm when sample is added
C: Absorbance at 228 nm without addition of enzyme and sample
The concentration of the sample (μg / ml) required to inhibit the enzyme activity of ACEI by 50% is shown as IC ₅₀ .
[0022]
<Calcium solubilization (CS) activity>
(Method for measuring CS activity)
Calcium was quantified by a chelate method (orthocresolphthalein complexone, OCPC method).
50 μl of a sample containing the peptide and 10 μl of 20 mM calcium chloride and 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) are mixed and incubated at room temperature for 5 minutes. Further, 40 μl of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) is added, and the mixture is kept at 37 ° C. for another 30 minutes. Then, centrifuge at 15000 rpm for 5 minutes to collect 10 μl of the supernatant, and add 800 μl of the buffer solution contained in the trade name `` Calcium C-Test Wako '' (Wako Pure Chemicals) and 80 μl of the enclosed OCPC reagent to develop color, Absorbance at 570 nm was measured.
[0023]
[Expression 2]

A: Absorbance at 570 nm without phosphate buffer
B: Absorbance at 570 nm when sample is added
C: Table 2 shows SC ₅₀ as the sample concentration (μg / ml) required to make the solubilization rate of absorbance calcium at 570 nm without adding the sample 50%.
[0024]
<Superoxide dismutase (SOD) -like activity>
(Measurement of SOD-like activity)
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DETAPAC) solution (5 mg DETAPAC, 9.8 ml 50 mM potassium phosphate buffer, 0.37 ml 4 μg / ml catalase, 0.37 ml 1.83 mg / ml nitroblue tetrazolium (NBT), 1.26 ml 1.0 mM xanthine) 400 μl, 20 μl of a sample containing a peptide, and 50 μl of xanthine oxidase (Sigma, 400-fold diluted) were mixed and kept at 30 ° C. At this time, the difference in absorbance (absorbance at 560 nm) changing in 3 minutes was measured. The inhibition rate of xanthine oxidase was calculated by the following formula.
[0025]
[Equation 3]

A: Absorbance at 560 nm when no sample is added
B: Absorbance at 560 nm when the sample is added
C: as IC ₅₀ concentration (μg / ml) of the sample required for the absorbance xanthine oxidase enzymatic activity of 560nm 50% inhibition in the case of not adding the enzyme shown in Table 2.
[0026]
[Table 1]

[0027]
[Table 2]

[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the relationship between systolic blood pressure measured by the tail-cuff method in Example 1 and time after administration.

Claims (3)

有効成分として配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物もしくは配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物、又はそれらの医薬上許容される塩もしくは食品上許容される塩を含有することを特徴とする血圧低下剤。Each peptide represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 12-14 , 16 , 19 , 20 , 22 , 23 in the sequence listing as an active ingredient, and the peptide represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1-8 mixtures or peptide mixtures represented by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9-23, or blood pressure low laxatives, characterized in that it contains those pharmaceutically acceptable salt or food acceptable salts thereof. 獣乳カゼインを乳酸菌産生プロティナーゼで分解、精製し、配列表の配列番号2、12〜14 、 16 、 19 、 20 、 22 、23に記載されるアミノ酸配列で表わされる各ペプチド、配列番号1〜8に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物又は配列番号9〜23に記載されるアミノ酸配列で表わされるペプチド混合物を得、得られたペプチド又はペプチド混合物を配合することを特徴とする請求項1記載の血圧低下剤の製造法。Animal milk casein was decomposed and purified with proteinase produced by lactic acid bacteria, and each peptide represented by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 12-14 , 16 , 19 , 20 , 22 , 23 in the sequence listing, SEQ ID NO: 1-8 2. A peptide mixture represented by the amino acid sequence described in the above or a peptide mixture represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 9 to 23, and the obtained peptide or peptide mixture is blended. process for the preparation of the blood pressure low laxative. 前記乳酸菌産生プロティナーゼが、乳又は乳酸菌生育用培地を、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ・サブスペシィーズカゼイ、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズブルガリカス、ロイコノストック・ラクテス及びこれらの混合物からなる群より選択される乳酸菌を用いて発酵させて得られた乳酸菌産生プロティナーゼであることを特徴とする請求項2記載の製造法。  The lactic acid bacterium-producing proteinase is a milk or a lactic acid bacterium growth medium. 3. The production method according to claim 2, wherein the proteinase is a proteinase produced by fermentation using a lactic acid bacterium selected from the group consisting of a mixture thereof and a lactic acid bacterium selected from the group consisting of these.

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