JP3931353B2 - 創傷治癒剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はトロンボモジュリン（以下、ＴＭと略す）様蛋白質を含有することを特徴とする創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤、およびＴＭ様蛋白質とヒト成長因子とを含有することを特徴とする創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
創傷治癒機構は皮膚、結合組織および支持組織において類似している。ここでの組織とは、皮膚、骨、軟骨のみならず、筋肉および器官を包み込むコラーゲン基質からなる支持筋膜をも含むものである。
【０００３】
創傷部位における治癒プロセスは、普通いくつかのグループの特殊な細胞あるいは蛋白質が関与している複雑な生物学的機構によって起こるが、成長因子が必須であることは良く知られている。成長因子は創傷領域内に放出され、創傷内に移動し、そこで因子は角質細胞および線維芽細胞の増殖あるいは成長を刺激し、脈管形成を開始し、基質形成および創傷領域の再造形を行う［テンダイクら：バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．）７，７９３−７９８，１９８９］。
【０００４】
なお、この際、線維芽細胞は新たなコラーゲンを合成し、放出する細胞としても重要である。線維芽細胞によって生成される他の蛋白質は基質に寄与する。このような蛋白質の一つであるフィブロネクチンは主要な細胞を基盤となる基質に結合することを促進する重要な物質であり、創傷修復中にその合成が強化される。
【０００５】
このように、生体の損傷部では成長因子がタイムリーに放出され、単独でまたは共同して細胞の遊走・増殖・分化を進めていく。創傷治癒に関与する成長因子として、上皮細胞成長因子（以下、ＥＧＦと略す）、線維芽細胞成長因子（以下、ＦＧＦと略す）、インスリン様成長因子（以下、ＩＧＦと略す）、インスリン、血小板由来成長因子（以下、ＰＤＧＦと略す）などが良く知られている。ＥＧＦは線維芽細胞、血管内皮細胞、上皮細胞の増殖あるいは成長を促すほか、上皮細胞の遊走を促進し、組織修復過程においては上皮の再生に中心的な役割を果たしている。ＦＧＦは線維芽細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞の増殖あるいは成長を促すほか、血管内皮細胞の遊走を促進し、血管再生に中心的な役割を果たしている。ＩＧＦとしては、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の２種の分子種が存在することが知られている。ＩＧＦはＰＤＧＦと共同して作用し、線維芽細胞の増殖あるいは成長や上皮細胞の正常な分化増殖を促進する。現在、これらの因子について、それぞれ臨床応用研究が進められているが、創傷治癒剤としての効果は必ずしも十分とは言えず、より効果的な成長因子あるいは創傷治癒剤が切望されているのが現状である。
【０００６】
一方、ＴＭは１９８１年にエスモンらにより血管内皮細胞表面上に存在する抗凝固物質として発見され［プロシーデイングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ユーエスエー（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．）７８，２２４９−２２５４，１９８１］、その後１９８７年に鈴木らによりその全一次構造が明らかにされた［エンボ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）６，１８９１−１８９７、１９８７；バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２６，４３５０−４３５７，１９８７］糖蛋白質である。ＴＭは、トロンビンと１：１で結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制するとともにトロンビンによるプロテインＣ活性化を著しく促進させることにより効率よく凝固系を抑制することから、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、各種血栓症等の予防や治療に有用であることが示唆されており、近年では、遺伝子組み替え技術を利用して、ＴＭのアミノ酸配列の部分構造を有する様々なヒトＴＭ様蛋白質［特開平１−６２１９、バイオキミカ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．）１２０５巻，ｐ１６２−１７０，１９９４］を用いて、ＤＩＣ治療薬としての臨床応用が試みられつつある。
【０００７】
このようにＴＭは広く凝固線溶系に作用する分子であると考えられているが、他方、細胞機能に及ぼす影響についてはほとんど知られていない。
【０００８】
今田らは、マウステトラカルシノーマＦ９細胞をレチノイン酸あるいはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）で内胚葉系細胞に分化させると、マウスＴＭと同じ機能を有し、また、遺伝子クローニングの結果マウスＴＭとまったく同一であることが明らかとなったフェトモジュリン（以下、ＦＭと略す）が内胚葉系細胞に発現されること、さらに、ＴＭ／ＦＭが血管内のみならず、組織液と直接接することのない組織、あるいはまた、細胞間の相互作用の場、例えば、肺胞、神経上皮、心房、洞結節、および胚発生の中期から後期にかけて心臓のペースメーカーなどに一時的に発現されることを報告した［デベロップメンタル バイオロジー（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）１４０、１１３−１２２、１９９０］。
【０００９】
以上のような報告が見られるが、ＴＭが細胞に対して直接増殖および／または成長促進作用を有することを記載した報告は知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
創傷に対し、その本質的治療薬となりうる新しい細胞成長因子を有効成分として含有する、より有効で安全性の高い創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤を提供することが本発明の課題である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＴＭの各種細胞に対する増殖あるいは成長促進効果に関する研究を行っている途上、ＴＭが抗凝固作用を示す濃度に比し、はるかに低濃度において、スイス３Ｔ３細胞に直接作用しその成長および増殖を促進することを見いだし、さらには他の成長因子とともに用いると一層高い活性を示すという事実を見いだし、さらに鋭意研究を重ねて本発明を完成した。
【００１２】
本発明の第１の態様は、トロンビンと結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制すると
ともにトロンビンのプロテインＣ活性化を著しく促進させるという活性を有するＴＭ様蛋
白質を有効成分として含有することを特徴とする創傷治癒剤である。ＴＭ様蛋白質は、以
下のアミノ酸配列１を有することが好ましい。
（アミノ酸配列１）
1 10
Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly
11 20
Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly
21 30
Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly
31 40
Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala
41 50
Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr
51 60
Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu
61 70
Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp
71 80
Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu
81 90
Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His
91 100
Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu
101 110
Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val
111 120
Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys
121 130
Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu
131 140
Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg
141 150
Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
151 160
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala
161 170
Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro
171 180
His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr
181 190
Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr
191 200
Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr
201 210
Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp
211 220
Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys
221 230
Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
231 240
Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala
241 250
Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp
251 253
Ser Gly Lys
ただし、２４２番目の Val は Ala に置換されていてもよい。
【００１５】
本発明の第２の態様は、ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子とを含有することを特徴とする創傷治癒剤である。ここで、ＴＭ様蛋白質としては、上述の第１の態様と同様に、上述のアミノ酸配列１を有するものが好ましい。また、ヒト細胞成長因子は、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ又はヒト塩基性ＦＧＦ（以下、ｂ−ＦＧＦと略す）であることが好ましい。
【００１６】
ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子との組み合わせとしては、上述のアミノ酸配列１を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせ、上述の特徴１を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせ、あるいは、上述の特徴２を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせが好ましい。
【００１７】
本発明の第３の態様は、ＴＭ様蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする細胞増殖および／または細胞成長促進剤である。好ましくは、肉芽組織形成促進剤である。本発明の第３の態様で使用するＴＭ様蛋白質は、上述の本発明の第１の態様で使用するＴＭ様蛋白質と同様のもの、即ち、以下のアミノ酸配列１を有するものが好ましい。
【００１８】
ただし、２４２番目の Val は Ala に置換されていてもよい。
【００２１】
本発明の第４の態様は、ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子とを含有することを特徴とする細胞増殖および／または細胞成長促進剤である。好ましくは、肉芽組織形成促進剤である。ここで、ＴＭ様蛋白質としては、上述の第３の態様と同様に、上述のアミノ酸配列１を有するものが好ましい。また、ヒト細胞成長因子は、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ又はヒトｂ−ＦＧＦであることが好ましい。
【００２２】
ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子との組み合わせとしては、上述のアミノ酸配列１を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせが好ましい。
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本明細書において、「ＴＭ様蛋白質」の語は、ＴＭおよびＴＭの生物学的もしくは免疫学的活性（即ち、トロンビンと結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制するとともにトロンビンのプロテインＣ活性化を著しく促進させるという活性）に必要な一部分のアミノ酸配列を有するペプチド又はそれらの類似物を意味する。ここでいう「ペプチド」の語は、換言すれば、後述するように、ヒトＴＭを構成する完全長の５５７アミノ酸残基の中の、ＴＭおよびＴＭの生物学的もしくは免疫学的活性を示すペプチドフラグメントを意味する。そして、「それらの類似物」の語は、前述のペプチドフラグメントのＯ−グリコシド結合糖鎖あるいはＮ−グリコシド結合糖鎖などの糖鎖を修飾あるいは欠失させたものを意味する。また、「創傷」の語は、外力によって生じた組織損傷を総括していうが、皮膚や粘膜面の連続性が離断した解放性損傷を創、連続性が保持された閉鎖性損傷を傷として区別して用いられることがあり、「創傷治癒」は、炎症反応が起こり、毛細血管等の透過性亢進や白血球等の遊走が起こって細菌や壊死物質が貪食除去されると共にフィブリン沈着等が起こる滲出破壊相、毛細血管の新生や線維芽細胞の増殖が始まり、肉芽が出現し、フィブリンが吸収されてコラーゲンに置き換わってゆく繊維増殖相および新生血管や滲出細胞が減少し始め、コラーゲン量が増加して創の収縮が起きる成熟期の機転をとる［南山堂医学大辞典、南山堂，１１５６−１１５７頁，１９９０］とされ、本発明においてもこれらの意味を包含する。肉芽（組織）とは、盛んに増殖している若い結合組織のことで、創傷の壊死性組織を吸収し、欠損部を埋め、線維化をおこす創傷治癒に際して形成される重要な組織である。線維芽細胞が肉芽組織の基本的構成細胞である。また、「創傷治癒剤」の語は、種々の創傷、例えば、角膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植その他の手術誘発眼内創傷のような眼創傷、および切開、やけど、切り傷、破傷、深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍、口腔・気道または尿路のごとき粘膜の損傷など、さらに、乾せん、日焼け、皮膚発疹のような皮膚障害等、の治癒を促進するための治療剤を広く包含する。
【００２５】
本発明に用いるＴＭ様蛋白質は、天然型あるいは遺伝子工学的に生産されたもののいずれでも良く、遺伝子工学的手法により得られる改変型あるいはキメラ型であっても良い。医薬品とする場合、好ましくはヒト由来のＴＭが望まれる。また、ヒト由来のＴＭは膜結合性であり、完全長のアミノ酸配列を持つものは水に対する溶解性が低い。このため、本発明においては完全長のアミノ酸配列を持たず、溶解性の高いＴＭ（以下、可溶性ＴＭと略する）がさらに好ましい。
【００２６】
このようなＴＭは、天然型については、例えば、ヒト胎盤由来のＴＭ［特開昭６０−１９９８１９］があげられる。また、可溶性ＴＭとしては、非還元状態での分子量が５５，０００〜５８，０００および６０，０００〜６５，０００のヒト尿由来可溶性ＴＭ［特開平３−８６９００］および非還元状態での分子量が７２，０００±３，０００および７９，０００±３，０００のヒト尿由来可溶性ＴＭ［特開平３−２１８３９９］が挙げられる。これらの内、分子量が７２，０００±３，０００および７９，０００±３，０００のヒト尿由来可溶性ＴＭが好ましい。これらヒト尿由来可溶性ＴＭは、特開平３−２１８３９９号公報に記載されているように、それぞれ、前述の本発明で好ましく使用することができるＴＭ様蛋白質の特徴１または特徴２を有している。
【００２７】
また、本発明に用いるＴＭ様蛋白質は、遺伝子組み替え技術で生産することができる。ヒトの治療剤に用いるためには、ヒトのアミノ酸配列を有するものが好ましい。具体的には、遺伝子工学的手法により製造され、鈴木らにより示されたヒトＴＭの一次構造［エンボ ジャーナル（ＥＭＢＯ．Ｊ．）６，１８９１−１８９７，１９８７；バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２６，４３５０−４３５７，１９８７］を有するポリペプチドおよびその生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる。
【００２８】
鈴木らによれば、完全長のヒトＴＭは５５７アミノ酸残基により構成され、それは、Ｎ末端より順に、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５の５つのドメイン構造から構成される。また、その抗凝固活性は６つの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様構造の繰り返しから成るＤ２ドメインの、４番目から６番目のドメイン（Ｅ４５６）に限局することが報告されている。本発明の治癒剤に使用し得るフラグメントの例としては、鈴木らにより開示されたＥ４５６ペプチド構造を包含する種々のペプチドフラグメント［特開平１−６２１９］あるいは名和らにより示された可溶性ＴＭ様蛋白質［バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチコミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）１７１，７２９−７３７，１９９０］などが挙げられる。さらに具体的には、Ｄ２ドメインのＥＧＦ様構造の１番目から６番目までのドメイン構造（以下、Ｅ１２３４５６とする）を包含する、ヒトＴＭのＮ末端より２１４−４６６番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（以下、ＴＭＥ1-6 とする）、１−４９１番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（以下、ｒｓＴＭとする）、２２７−４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ２）、１−４９７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（以下、Ｄ１２３とする）、１−４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ１２）、２２７−４９７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ２３）、１−５５７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ１２３４５）、３４５−４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｅ４５６）などが好ましい。そして、これらのフラグメントの内、ＴＭの第２番目のドメイン、すなわちＥＧＦ様構造ドメインの１番目から６番目までの構造を包含する、２１４−４６６番目のアミノ酸残基により構成されるフラグメント（ＴＭＥ1-6 )、即ち、前述のアミノ酸配列１を有するもの、ｒｓＴＭあるいはＤ１２３が最も好ましい。
【００２９】
なお、上記フラグメントは遺伝子組み替え技術を用いて、ＴＭ又は上記ペプチドの構造の一部を欠失させたり、アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体およびＯ−グリコシド結合糖鎖あるいはＮ−グリコシド結合糖鎖などの糖鎖を修飾あるいは欠失させた類似物などでも良い。具体的には、上記ポリペプチドの構成アミノ酸が一部欠如している［ＷＯ９２／００３２５、特開平２−２５５６９９、ＥＰ０４７４２７３Ａ２］か、他のアミノ酸に置換されたもの［ＷＯ９１／１５５１４、ＷＯ９３／１５５７５５、特開平５−３１０７８７］が挙げられる。また、メチオニンを他のアミノ酸に置換することによって酸化を防止したもの［ＷＯ９１／１５５１４］、あるいはアミノ酸配列を修飾することによって蛋白分解酵素による分解を防止したもの［ＷＯ９３／１５７５５］が挙げられる。また、コンドロイチン及び／又はコンドロイチン硫酸を含む糖鎖を有するもの［ＷＯ９１／０４２７６、ＷＯ９１／０５８０３、ＥＰ０４１２８４１Ａ１］、ウシトロンボモジュリン由来の酸性アミノ酸配列を含むＯ−グリコシド糖鎖結合部位を付加し、コンドロイチン硫酸糖鎖を結合させたもの［ＥＰ０４８８３１７Ａ２］、あるいは、Ｏ−グリコシル化部位領域の糖鎖を修飾あるいはＯ−グリコシル化部位領域を欠失させたもの［ＷＯ９２／０３１４９］、コンドロイチン及び／又はコンドロイチン硫酸を含まないもの［特開平４−２１０７００］などが挙げられる。
【００３０】
本発明第２の態様ならびに第４の態様は、以上のようなＴＭ様蛋白質の他にヒト細胞成長因子も有効成分として含有するものである。これにより、ＴＭ様蛋白質又はヒト細胞成長因子単独から創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤を構成した場合に対して、大きな治癒効果ならびに促進効果を得ることが可能となる。
【００３１】
本発明において、ヒト細胞成長因子としては、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ、ヒトｂ−ＦＧＦの中から選ばれる１種を使用するか、あるいは複数種を併用することが好ましい。
【００３２】
また、本発明においては、細胞成長因子として上述のようにヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ、ヒトｂ−ＦＧＦを含有することができるが、これらに限定されない。それぞれ、ＩＧＦ、インスリン、ＥＧＦ、ＦＧＦ様活性を有する物質であればいずれでも良い［蛋白質核酸酵素，３６巻，７号，１０７８−１０８７頁，１２３７−１２４６頁，１９９１、臨床免疫，２７巻，サプルメント（Ｓｕｐｐｌ．）１６，３０７−３１６頁，１９９５］。例えば、動物の体内や動物細胞で産生される天然由来の物質、遺伝子組み替え技術で生産される物質、また遺伝子組み替え技術で、これらの構造の一部を欠失させたり、アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体および糖鎖を修飾あるいは欠失させた類似物などが挙げられる。好ましくは、ヒト由来かヒト由来と同等構造を有するものがよい。これらのいくつかは市販品として入手することができる。また、このようなヒト細胞成長因子としては、公知のいかなる製剤学的製造法により得られたものでも使用することができる。
【００３３】
本発明の第１の態様及び第２の態様のいずれの治癒剤ならびに本発明の第３の態様及び第４の態様のいずれの細胞増殖および／または細胞成長促進剤も種々の剤型にすることができ、その場合に種々の添加剤等の成分を配合することができる。例えば、ＴＭ様蛋白質は、薬剤として一般的に用いられる適当な担体または、媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油）、鉱油（例、ワセリン、パラフィン）、高級アルコール（例、セタノール、ステアリルアルコール）、高級脂肪酸（例、ステアリン酸、パルミチン酸）、無害性有機溶媒（例、エタノール）等、さらには必要に応じて賦形剤（例、マンニトール、カルボキシメチルセルロース）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤、ポリエチレングリコール系界面活性剤）、溶解補助剤（例、界面活性剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、吸着防止剤（例、非イオン性界面活性剤、ゼラチン）、安定化剤（例、アミノ酸、糖、糖アルコール、アルブミン）または保存剤（例、ベンジルアルコール、パラベン）、保湿剤（例、尿素、コレステロール）、酸化防止剤（例、トコフェロール）等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経皮吸収剤、点眼剤、経鼻吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤もしくは経皮吸収剤に調製することが出来る。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤、あるいは浸透圧ポンプに封入した形等で提供できる。また、経皮吸収剤としては、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、バップ剤、人工皮膚類等で提供できる。
【００３４】
本発明の創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤の投与方法としては、例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経口投与等の方法によって、ＴＭ様蛋白質量として一日約０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｋｇとなる量を投与したり、浸透圧ポンプ等に封入し生体に留置することにより連続的に投与することができる。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ−ＦＧＦを有効成分として含有させた製剤は、上記のＴＭ様蛋白質投与と同時に、各因子をそれぞれ、一日約０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｋｇとなる量を投与することが好ましい。
【００３５】
また、経皮吸収剤として、熱傷、創傷部位に、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、バップ剤等の方法により局所適用することにより、例えば、ＴＭ様蛋白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で適用することができる。なお、ヒトＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ−ＦＧＦを有効成分として含有する製剤は、上記のＴＭ様蛋白質適用と同時に、各因子をそれぞれ、一日約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌとなる量を適用する。
【００３６】
さらに、熱傷の時に用いる培養皮膚移植等に際しては、細胞の培養液中に、例えば、ヒトＴＭ様蛋白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加することもできる。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ−ＦＧＦをＴＭ様蛋白質添加と同時に、各因子をそれぞれ、約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加することもできる。
【００３７】
【作用】
本発明の創傷治癒剤は、有効成分として、線維芽細胞などの細胞の成長および増殖促進効果を発揮するＴＭ様蛋白質、あるいはＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子の双方を含有するので、種々の創傷、例えば、角膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植その他の手術誘発眼内創傷のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍、口腔・気道または尿路のごとき粘膜の損傷などの治療に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。
【００３８】
本発明の細胞増殖および／または細胞成長促進剤は、特に線維芽細胞の増殖／成長を促進し、肉芽組織形成促進に働く。また、細胞培養系に添加することにより、細胞の増殖を促進することができる。移植に用いるヒト細胞の培養液に添加してそのヒト細胞を培養することもできる。
【００３９】
【実施例】
以下にＴＭ様蛋白質の取得例及び本発明の実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明に用いるＴＭ様蛋白質は、以下の取得例にあげたものに限定されることはなく、また、本発明は以下の実施例に限定されるものでもない。
【００４０】
取得例１（ヒトＴＭ様蛋白質の取得例：ＴＭＥ1-6 )
名和らの方法［バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）１７１、７２９−７３７、１９９０］に準じて、ｐＲＳ７ＴＭを調製した。すなわち、ヒトｃＤＮＡライブラリーより得たＴＭ遺伝子のフラグメントをｐＵＣ１１９発現ベクターに挿入した後、制限酵素処理を行いｐＲＳ７ＴＭを調製した。さらに、ｐＲＳ７ＴＭのＴＭシグナルシーケンスをインターフェロンγシグナルシーケンスで置き換え、さらにＮ末端シーケンスを欠失させた。すなわち、Ｓａｌ−ＢｓｔＮ１制限酵素処理により８０ｂｐの新しいシグナルシーケンスを含むフラグメントを、ＰｓｔＩ制限酵素処理により１番目のＥＧＦドメインをコードしているフラグメントを取得した後、リンカーと結合させｐＴＭＰ２２を作製した。このｐＴＭＰ２２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｌｕＩ制限酵素処理し、生じたフラグメントをｐＴＭｓ０７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｌｕＩフラグメントと置換しｐＰ７ＴＭを作製した。Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｒｉｃｈ領域を欠失させるためにｐＴＭｓ０７をＨｉｎ ｃＩＩ制限酵素処理してフラグメントを単離し、さらにＨｐａＩＩ制限酵素処理を行うことにより６番目のＥＧＦドメインをコードしている７０ｂｐのフラグメントを取得した。このフラグメントのＬｙｓ−４６６の後にストップコドンを含むリンカーを結合させた後、Ａｐａ Ｉ−Ｘｂａ Ｉ制限酵素処理を行い、生じたフラグメントをｐＰ７ＴＭのＡｐａ Ｉ−Ｘｂａ Ｉ部位に組み込みｐＰＧ３ＴＭを作製した。
【００４１】
このプラスミド（ｐＰＧ３ＴＭ）を、常法に従ってチャイニーズハムスター卵母細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１細胞株）にトランスフェクトした。この細胞を選択培地でさらに２〜３週間培養することにより安定した形質転換細胞を選抜し、生じたコロニーをさらに培養した。この培養上清を抗ＴＭモノクローナル抗体カラムとゲル濾過により精製し、ＴＭＥ1-6 を得た。
【００４２】
取得例２（可溶性ＴＭの取得例：ＵＴＭ０）
特開平３−２１８３９９号公報に記載された方法に準じて調製した。すなわち
、原尿１００Ｌをアクリル繊維で濾過して尿中のウロキナーゼを吸着除去し、通過尿を限外濾過膜を使用して脱塩濃縮した。次いで、ＤＥＡＥセルロース（ワットマン社製）カラム、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースクロマトグラフィーおよびセファクリルＳ−３００（ファルマシアファインケミカル社製）カラムを用いて順次精製し、活性画分を採取した（以下、ＵＴＭ０とする）。この画分は一晩蒸留水に対して透析した後凍結乾燥した。
【００４３】
取得例３（可溶性ＴＭの取得例：ｒｓＴＭ）
名和らの方法［バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）１７１、７２９−７３７、１９９０］に準じて、ｐＲＳ７ＴＭを調製した。すなわち、ヒトｃＤＮＡライブラリーより得たＴＭ遺伝子のフラグメントをｐＵＣ１１９発現ベクターに挿入した後、制限酵素処理等を行い、ｒｓＴＭをコードするプラスミドｐＴＭｓ０７を調製した。さらに、Ｎｅｏr 遺伝子を組み込み、発現プラスミドｐＴＭｓ０７−ｎｅｏを作製した。
【００４４】
このプラスミド（ｐＴＭｓ０７−ｎｅｏ）を、常法に従ってチャイニーズハムスター卵母細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１細胞株）にトランスフェクトした。この細胞を選択培地でさらに２〜３週間培養することにより安定した形質転換細胞を選抜し、生じたコロニーをさらに培養した。この培養上清を抗ＴＭモノクローナル抗体カラムとゲル濾過により精製し、ｒｓＴＭを得た。
【００４５】
取得例４（可溶性ＴＭの取得例：Ｄ１２３）
ＷＯ９２／００３２５号公報の方法に準じて製造した。すなわち、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより釣り上げたＤＮＡを利用してアミノ末端のアミノ酸配列がＡｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−であるアミノ酸４９７残基よりなる可溶性トロンボモジュリンを発現するベクターを調製し、これをＣＨＯ細胞に組み込んだ後、遺伝子増幅を行って高発現株を得た。この高発現株の培養液をＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムとゲル濾過により精製し、Ｄ１２３を得た。
【００４６】
実施例１（ヒトＴＭによる線維芽細胞に対する効果１：増殖促進効果）
スイス３Ｔ３細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）を１０％牛胎児血清（以下、ＣＳと略す。：ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社）に懸濁し、３５ｍｍの培養プレートに１ウェルあたり１×１０ ４ 個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒの条件で培養した。２４時間後に５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＭを含む種々の濃度のＣＳを含むＤＭＥＭ培地（０．１〜１０％ＣＳ）に培地交換し、その後は２日間に一度（図１の矢印参照）培地交換した。細胞は０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理し、細胞数を測定した。なお、ヒトＴＭは、取得例１に記載した方法に従い、ヒトＴＭのＥ１２３４５６を包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で発現後、均一に精製したものを使用した。
【００４７】
この結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＴＭＥ1-6 は０．１％あるいは１％血清の存在下で細胞増殖作用を示した。また、ＵＴＭ０、ｒｓＴＭおよびＤ１２３も同様の作用を示す。
【００４８】
一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖促進能は、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織の成長を起こし得る細胞分化と直接関連しており、強いｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖促進能を有する物質がｉｎ ｖｉｖｏにおいても成長刺激効果を有することは成長因子の研究においては良く知られているところである。従って、ヒトＴＭ様蛋白質は、生体でも効果を有することがわかる。
【００４９】
実施例２（ヒトＴＭによる線維芽細胞に対する効果２：ＤＮＡ合成促進効果）
スイス３Ｔ３細胞を１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルのマイクロタイタープレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、培養液を０．１％ＣＳを含む（又は含まない）ＤＭＥＭ培地で置換し４８時間培養することにより、細胞は完全に非活動性となった。次に、表１及び図２に示すように、種々の濃度のヒトＴＭおよび種々の濃度の成長因子を添加し、３７℃、２０時間培養した。その後3Ｈ-チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加え、さらに８時間培養した。ウェルを氷冷リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）で洗浄して、過剰の3Ｈ-チミジンを除いた後、細胞を０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理してプレートより剥離させ、グラスファイバーフィルター上に集めた。細胞を氷冷したトリクロル酢酸で洗浄後、フィルター上に残存する放射能を液体シンチレーションカウンターにより測定した。なお、ヒトＴＭは、取得例１に従い、ヒトＴＭのＥ１２３４５６を包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で発現後、均一に精製したもの、取得例２に従い精製したヒト尿由来可溶性ＴＭ（ＵＴＭ０）および取得例３に従い精製したｒｓＴＭを使用した。ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦはインタージェン社、インスリンは和光純薬、ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー社よりそれぞれ購入して使用した。
【００５０】
結果を図２、図３および表１に示す。
【００５１】
図２から明らかなように、ＴＭＥ1-6 は血清の存在下あるいは非存在下においてＤＮＡ合成促進作用を示した。また、図３から明らかなように、ＴＭＥ1-6 、ｒｓＴＭおよびＵＴＭ０いずれもＤＮＡ合成促進作用を示し、ＵＴＭ０が最も強い作用を示した。
【００５２】
【表１】
表１から明らかなように、ＴＭＥ1-6 は単独でＤＮＡ合成促進作用を示すのみならず、細胞成長因子として知られているＥＧＦやｂ−ＦＧＦとは相加的な作用を示し、インスリンあるいはＩＧＦ−１とは相乗的なＤＮＡ合成促進作用を示した。
また、ＵＴＭ０、ｒｓＴＭおよびＤ１２３も同様の作用を示した。
【００５３】
実施例３（ヒトＴＭによる線維芽細胞に対する効果３：グルコース輸送促進効果）
浜中らの方法［エクスペリメンタル セル リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．）１８６、８３−８９、１９９０］に準じて実施した。すなわち、スイス３Ｔ３細胞を１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、２４ウェルのマルチプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、培養液を０．５％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地で置換し４８時間培養した後、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＭ、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦあるいは１０％ＣＳを添加し、３７℃、６時間培養した。細胞をＫＲＰ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 、１．４７ｍＭＫＨ2ＰＯ4 、８．０６ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）で一回洗浄した後、０．５ｍｌの同緩衝液で３７℃、３０分間プレインキュベートした。その後２−デオキシ−Ｄ−［１−3Ｈ］グルコース（０．５μＣｉ／ウェル、１０μＭ）を加え、１０分間培養した。ウェルを２５ｍＭグルコースを含む氷冷ＰＢＳで３回洗浄して過剰の放射能を除いた後、０．１％ＳＤＳ処理して細胞破砕液を得、その放射能を液体シンチレーションカウンターにより測定した。なお、ヒトＴＭは、実施例に従い、ヒトＴＭのＥ１２３４５６ドメインを包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 )をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で発現後、均一に精製したものを使用した。ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー社より購入して使用した。結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
表２から明らかなように、ＴＭＥ1-6 は２−デオキシグルコース取り込みの促進作用を示した。また、ＵＴＭ０、ｒｓＴＭおよびＤ１２３も同様の作用を示した。
【００５５】
実施例４（製剤例１）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００５６】
ＴＭＥ1-6 ５ ｍｇ
精製ゼラチン ５０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００５７】
実施例５（製剤例２）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００５８】
ＵＴＭ０ ５ ｍｇ
アルブミン ２０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００５９】
実施例６（製剤例３）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００６０】
ｒｓＴＭ １０ ｍｇ
精製ゼラチン ５０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００６１】
実施例７（製剤例４）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００６２】
Ｄ１２３ １０ ｍｇ
アルブミン ２０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００６３】
実施例８（製剤例５）
以下の成分を混合、撹拌して均一な組成物（軟膏剤）を調製した。
【００６４】
ＴＭＥ1-6 ０．０１％
白色ワセリン ９６．８％
流動パラフィン ３ ％
ジブチルヒドロキシトルエン ０．２％
【００６５】
実施例９（製剤例６）
以下の成分を混合、撹拌して均一な組成物（軟膏剤）を調製した。
【００６６】
ＵＴＭ０ ０．０１％
ＩＧＦ−１ ０．０１％
白色ワセリン ９６．８％
流動パラフィン ３ ％
ジブチルヒドロキシトルエン ０．２％
【００６７】
【発明の効果】
本発明の創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤は、組織損傷部位の細胞、例えば線維芽細胞などの細胞の成長あるいは増殖を促進する効果を発揮するヒトＴＭ様蛋白質、あるいはヒトＴＭ様蛋白質に加えてさらにヒト細胞成長因子を含有するので、種々の創傷、例えば、角膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植、他の手術誘発眼内創傷のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍、口腔・気道または尿路のごとき粘膜の損傷などの治療に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。
【００６８】
また、本発明の製剤は、上記の創傷に対し、公知の製剤に比較して、より優れた作用を有しており、創傷治癒剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＭＥ1-6 のスイス３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示したグラフである。数値は、平均値±標準誤差で表している。
【図２】図２は、ＴＭＥ1-6 のスイス３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成に及ぼす影響を示したグラフである。
【図３】図３は、ＴＭＥ1-6 、ｒｓＴＭおよびＵＴＭ０のスイス３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成に及ぼす影響を示したグラフである。数値は、平均値±標準偏差で表している。
【産業上の利用分野】
本発明はトロンボモジュリン（以下、ＴＭと略す）様蛋白質を含有することを特徴とする創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤、およびＴＭ様蛋白質とヒト成長因子とを含有することを特徴とする創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
創傷治癒機構は皮膚、結合組織および支持組織において類似している。ここでの組織とは、皮膚、骨、軟骨のみならず、筋肉および器官を包み込むコラーゲン基質からなる支持筋膜をも含むものである。
【０００３】
創傷部位における治癒プロセスは、普通いくつかのグループの特殊な細胞あるいは蛋白質が関与している複雑な生物学的機構によって起こるが、成長因子が必須であることは良く知られている。成長因子は創傷領域内に放出され、創傷内に移動し、そこで因子は角質細胞および線維芽細胞の増殖あるいは成長を刺激し、脈管形成を開始し、基質形成および創傷領域の再造形を行う［テンダイクら：バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．）７，７９３−７９８，１９８９］。
【０００４】
なお、この際、線維芽細胞は新たなコラーゲンを合成し、放出する細胞としても重要である。線維芽細胞によって生成される他の蛋白質は基質に寄与する。このような蛋白質の一つであるフィブロネクチンは主要な細胞を基盤となる基質に結合することを促進する重要な物質であり、創傷修復中にその合成が強化される。
【０００５】
このように、生体の損傷部では成長因子がタイムリーに放出され、単独でまたは共同して細胞の遊走・増殖・分化を進めていく。創傷治癒に関与する成長因子として、上皮細胞成長因子（以下、ＥＧＦと略す）、線維芽細胞成長因子（以下、ＦＧＦと略す）、インスリン様成長因子（以下、ＩＧＦと略す）、インスリン、血小板由来成長因子（以下、ＰＤＧＦと略す）などが良く知られている。ＥＧＦは線維芽細胞、血管内皮細胞、上皮細胞の増殖あるいは成長を促すほか、上皮細胞の遊走を促進し、組織修復過程においては上皮の再生に中心的な役割を果たしている。ＦＧＦは線維芽細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞の増殖あるいは成長を促すほか、血管内皮細胞の遊走を促進し、血管再生に中心的な役割を果たしている。ＩＧＦとしては、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の２種の分子種が存在することが知られている。ＩＧＦはＰＤＧＦと共同して作用し、線維芽細胞の増殖あるいは成長や上皮細胞の正常な分化増殖を促進する。現在、これらの因子について、それぞれ臨床応用研究が進められているが、創傷治癒剤としての効果は必ずしも十分とは言えず、より効果的な成長因子あるいは創傷治癒剤が切望されているのが現状である。
【０００６】
一方、ＴＭは１９８１年にエスモンらにより血管内皮細胞表面上に存在する抗凝固物質として発見され［プロシーデイングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ユーエスエー（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．）７８，２２４９−２２５４，１９８１］、その後１９８７年に鈴木らによりその全一次構造が明らかにされた［エンボ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）６，１８９１−１８９７、１９８７；バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２６，４３５０−４３５７，１９８７］糖蛋白質である。ＴＭは、トロンビンと１：１で結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制するとともにトロンビンによるプロテインＣ活性化を著しく促進させることにより効率よく凝固系を抑制することから、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、各種血栓症等の予防や治療に有用であることが示唆されており、近年では、遺伝子組み替え技術を利用して、ＴＭのアミノ酸配列の部分構造を有する様々なヒトＴＭ様蛋白質［特開平１−６２１９、バイオキミカ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．）１２０５巻，ｐ１６２−１７０，１９９４］を用いて、ＤＩＣ治療薬としての臨床応用が試みられつつある。
【０００７】
このようにＴＭは広く凝固線溶系に作用する分子であると考えられているが、他方、細胞機能に及ぼす影響についてはほとんど知られていない。
【０００８】
今田らは、マウステトラカルシノーマＦ９細胞をレチノイン酸あるいはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）で内胚葉系細胞に分化させると、マウスＴＭと同じ機能を有し、また、遺伝子クローニングの結果マウスＴＭとまったく同一であることが明らかとなったフェトモジュリン（以下、ＦＭと略す）が内胚葉系細胞に発現されること、さらに、ＴＭ／ＦＭが血管内のみならず、組織液と直接接することのない組織、あるいはまた、細胞間の相互作用の場、例えば、肺胞、神経上皮、心房、洞結節、および胚発生の中期から後期にかけて心臓のペースメーカーなどに一時的に発現されることを報告した［デベロップメンタル バイオロジー（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）１４０、１１３−１２２、１９９０］。
【０００９】
以上のような報告が見られるが、ＴＭが細胞に対して直接増殖および／または成長促進作用を有することを記載した報告は知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
創傷に対し、その本質的治療薬となりうる新しい細胞成長因子を有効成分として含有する、より有効で安全性の高い創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤を提供することが本発明の課題である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＴＭの各種細胞に対する増殖あるいは成長促進効果に関する研究を行っている途上、ＴＭが抗凝固作用を示す濃度に比し、はるかに低濃度において、スイス３Ｔ３細胞に直接作用しその成長および増殖を促進することを見いだし、さらには他の成長因子とともに用いると一層高い活性を示すという事実を見いだし、さらに鋭意研究を重ねて本発明を完成した。
【００１２】
本発明の第１の態様は、トロンビンと結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制すると
ともにトロンビンのプロテインＣ活性化を著しく促進させるという活性を有するＴＭ様蛋
白質を有効成分として含有することを特徴とする創傷治癒剤である。ＴＭ様蛋白質は、以
下のアミノ酸配列１を有することが好ましい。
（アミノ酸配列１）
1 10
Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly
11 20
Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly
21 30
Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly
31 40
Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala
41 50
Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr
51 60
Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu
61 70
Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp
71 80
Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu
81 90
Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His
91 100
Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu
101 110
Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val
111 120
Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys
121 130
Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu
131 140
Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg
141 150
Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
151 160
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala
161 170
Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro
171 180
His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr
181 190
Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr
191 200
Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr
201 210
Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp
211 220
Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys
221 230
Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
231 240
Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala
241 250
Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp
251 253
Ser Gly Lys
ただし、２４２番目の Val は Ala に置換されていてもよい。
【００１５】
本発明の第２の態様は、ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子とを含有することを特徴とする創傷治癒剤である。ここで、ＴＭ様蛋白質としては、上述の第１の態様と同様に、上述のアミノ酸配列１を有するものが好ましい。また、ヒト細胞成長因子は、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ又はヒト塩基性ＦＧＦ（以下、ｂ−ＦＧＦと略す）であることが好ましい。
【００１６】
ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子との組み合わせとしては、上述のアミノ酸配列１を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせ、上述の特徴１を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせ、あるいは、上述の特徴２を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせが好ましい。
【００１７】
本発明の第３の態様は、ＴＭ様蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする細胞増殖および／または細胞成長促進剤である。好ましくは、肉芽組織形成促進剤である。本発明の第３の態様で使用するＴＭ様蛋白質は、上述の本発明の第１の態様で使用するＴＭ様蛋白質と同様のもの、即ち、以下のアミノ酸配列１を有するものが好ましい。
【００１８】
【００２１】
本発明の第４の態様は、ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子とを含有することを特徴とする細胞増殖および／または細胞成長促進剤である。好ましくは、肉芽組織形成促進剤である。ここで、ＴＭ様蛋白質としては、上述の第３の態様と同様に、上述のアミノ酸配列１を有するものが好ましい。また、ヒト細胞成長因子は、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ又はヒトｂ−ＦＧＦであることが好ましい。
【００２２】
ＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子との組み合わせとしては、上述のアミノ酸配列１を有するＴＭ様蛋白質と、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦおよびヒトｂ−ＦＧＦの少なくとも一つとの組み合わせが好ましい。
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本明細書において、「ＴＭ様蛋白質」の語は、ＴＭおよびＴＭの生物学的もしくは免疫学的活性（即ち、トロンビンと結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制するとともにトロンビンのプロテインＣ活性化を著しく促進させるという活性）に必要な一部分のアミノ酸配列を有するペプチド又はそれらの類似物を意味する。ここでいう「ペプチド」の語は、換言すれば、後述するように、ヒトＴＭを構成する完全長の５５７アミノ酸残基の中の、ＴＭおよびＴＭの生物学的もしくは免疫学的活性を示すペプチドフラグメントを意味する。そして、「それらの類似物」の語は、前述のペプチドフラグメントのＯ−グリコシド結合糖鎖あるいはＮ−グリコシド結合糖鎖などの糖鎖を修飾あるいは欠失させたものを意味する。また、「創傷」の語は、外力によって生じた組織損傷を総括していうが、皮膚や粘膜面の連続性が離断した解放性損傷を創、連続性が保持された閉鎖性損傷を傷として区別して用いられることがあり、「創傷治癒」は、炎症反応が起こり、毛細血管等の透過性亢進や白血球等の遊走が起こって細菌や壊死物質が貪食除去されると共にフィブリン沈着等が起こる滲出破壊相、毛細血管の新生や線維芽細胞の増殖が始まり、肉芽が出現し、フィブリンが吸収されてコラーゲンに置き換わってゆく繊維増殖相および新生血管や滲出細胞が減少し始め、コラーゲン量が増加して創の収縮が起きる成熟期の機転をとる［南山堂医学大辞典、南山堂，１１５６−１１５７頁，１９９０］とされ、本発明においてもこれらの意味を包含する。肉芽（組織）とは、盛んに増殖している若い結合組織のことで、創傷の壊死性組織を吸収し、欠損部を埋め、線維化をおこす創傷治癒に際して形成される重要な組織である。線維芽細胞が肉芽組織の基本的構成細胞である。また、「創傷治癒剤」の語は、種々の創傷、例えば、角膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植その他の手術誘発眼内創傷のような眼創傷、および切開、やけど、切り傷、破傷、深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍、口腔・気道または尿路のごとき粘膜の損傷など、さらに、乾せん、日焼け、皮膚発疹のような皮膚障害等、の治癒を促進するための治療剤を広く包含する。
【００２５】
本発明に用いるＴＭ様蛋白質は、天然型あるいは遺伝子工学的に生産されたもののいずれでも良く、遺伝子工学的手法により得られる改変型あるいはキメラ型であっても良い。医薬品とする場合、好ましくはヒト由来のＴＭが望まれる。また、ヒト由来のＴＭは膜結合性であり、完全長のアミノ酸配列を持つものは水に対する溶解性が低い。このため、本発明においては完全長のアミノ酸配列を持たず、溶解性の高いＴＭ（以下、可溶性ＴＭと略する）がさらに好ましい。
【００２６】
このようなＴＭは、天然型については、例えば、ヒト胎盤由来のＴＭ［特開昭６０−１９９８１９］があげられる。また、可溶性ＴＭとしては、非還元状態での分子量が５５，０００〜５８，０００および６０，０００〜６５，０００のヒト尿由来可溶性ＴＭ［特開平３−８６９００］および非還元状態での分子量が７２，０００±３，０００および７９，０００±３，０００のヒト尿由来可溶性ＴＭ［特開平３−２１８３９９］が挙げられる。これらの内、分子量が７２，０００±３，０００および７９，０００±３，０００のヒト尿由来可溶性ＴＭが好ましい。これらヒト尿由来可溶性ＴＭは、特開平３−２１８３９９号公報に記載されているように、それぞれ、前述の本発明で好ましく使用することができるＴＭ様蛋白質の特徴１または特徴２を有している。
【００２７】
また、本発明に用いるＴＭ様蛋白質は、遺伝子組み替え技術で生産することができる。ヒトの治療剤に用いるためには、ヒトのアミノ酸配列を有するものが好ましい。具体的には、遺伝子工学的手法により製造され、鈴木らにより示されたヒトＴＭの一次構造［エンボ ジャーナル（ＥＭＢＯ．Ｊ．）６，１８９１−１８９７，１９８７；バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２６，４３５０−４３５７，１９８７］を有するポリペプチドおよびその生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる。
【００２８】
鈴木らによれば、完全長のヒトＴＭは５５７アミノ酸残基により構成され、それは、Ｎ末端より順に、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５の５つのドメイン構造から構成される。また、その抗凝固活性は６つの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様構造の繰り返しから成るＤ２ドメインの、４番目から６番目のドメイン（Ｅ４５６）に限局することが報告されている。本発明の治癒剤に使用し得るフラグメントの例としては、鈴木らにより開示されたＥ４５６ペプチド構造を包含する種々のペプチドフラグメント［特開平１−６２１９］あるいは名和らにより示された可溶性ＴＭ様蛋白質［バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチコミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）１７１，７２９−７３７，１９９０］などが挙げられる。さらに具体的には、Ｄ２ドメインのＥＧＦ様構造の１番目から６番目までのドメイン構造（以下、Ｅ１２３４５６とする）を包含する、ヒトＴＭのＮ末端より２１４−４６６番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（以下、ＴＭＥ1-6 とする）、１−４９１番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（以下、ｒｓＴＭとする）、２２７−４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ２）、１−４９７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（以下、Ｄ１２３とする）、１−４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ１２）、２２７−４９７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ２３）、１−５５７番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｄ１２３４５）、３４５−４６２番目のアミノ酸残基により構成されるペプチド（Ｅ４５６）などが好ましい。そして、これらのフラグメントの内、ＴＭの第２番目のドメイン、すなわちＥＧＦ様構造ドメインの１番目から６番目までの構造を包含する、２１４−４６６番目のアミノ酸残基により構成されるフラグメント（ＴＭＥ1-6 )、即ち、前述のアミノ酸配列１を有するもの、ｒｓＴＭあるいはＤ１２３が最も好ましい。
【００２９】
なお、上記フラグメントは遺伝子組み替え技術を用いて、ＴＭ又は上記ペプチドの構造の一部を欠失させたり、アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体およびＯ−グリコシド結合糖鎖あるいはＮ−グリコシド結合糖鎖などの糖鎖を修飾あるいは欠失させた類似物などでも良い。具体的には、上記ポリペプチドの構成アミノ酸が一部欠如している［ＷＯ９２／００３２５、特開平２−２５５６９９、ＥＰ０４７４２７３Ａ２］か、他のアミノ酸に置換されたもの［ＷＯ９１／１５５１４、ＷＯ９３／１５５７５５、特開平５−３１０７８７］が挙げられる。また、メチオニンを他のアミノ酸に置換することによって酸化を防止したもの［ＷＯ９１／１５５１４］、あるいはアミノ酸配列を修飾することによって蛋白分解酵素による分解を防止したもの［ＷＯ９３／１５７５５］が挙げられる。また、コンドロイチン及び／又はコンドロイチン硫酸を含む糖鎖を有するもの［ＷＯ９１／０４２７６、ＷＯ９１／０５８０３、ＥＰ０４１２８４１Ａ１］、ウシトロンボモジュリン由来の酸性アミノ酸配列を含むＯ−グリコシド糖鎖結合部位を付加し、コンドロイチン硫酸糖鎖を結合させたもの［ＥＰ０４８８３１７Ａ２］、あるいは、Ｏ−グリコシル化部位領域の糖鎖を修飾あるいはＯ−グリコシル化部位領域を欠失させたもの［ＷＯ９２／０３１４９］、コンドロイチン及び／又はコンドロイチン硫酸を含まないもの［特開平４−２１０７００］などが挙げられる。
【００３０】
本発明第２の態様ならびに第４の態様は、以上のようなＴＭ様蛋白質の他にヒト細胞成長因子も有効成分として含有するものである。これにより、ＴＭ様蛋白質又はヒト細胞成長因子単独から創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤を構成した場合に対して、大きな治癒効果ならびに促進効果を得ることが可能となる。
【００３１】
本発明において、ヒト細胞成長因子としては、ヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ、ヒトｂ−ＦＧＦの中から選ばれる１種を使用するか、あるいは複数種を併用することが好ましい。
【００３２】
また、本発明においては、細胞成長因子として上述のようにヒトＩＧＦ−１、ヒトインスリン、ヒトＥＧＦ、ヒトｂ−ＦＧＦを含有することができるが、これらに限定されない。それぞれ、ＩＧＦ、インスリン、ＥＧＦ、ＦＧＦ様活性を有する物質であればいずれでも良い［蛋白質核酸酵素，３６巻，７号，１０７８−１０８７頁，１２３７−１２４６頁，１９９１、臨床免疫，２７巻，サプルメント（Ｓｕｐｐｌ．）１６，３０７−３１６頁，１９９５］。例えば、動物の体内や動物細胞で産生される天然由来の物質、遺伝子組み替え技術で生産される物質、また遺伝子組み替え技術で、これらの構造の一部を欠失させたり、アミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体および糖鎖を修飾あるいは欠失させた類似物などが挙げられる。好ましくは、ヒト由来かヒト由来と同等構造を有するものがよい。これらのいくつかは市販品として入手することができる。また、このようなヒト細胞成長因子としては、公知のいかなる製剤学的製造法により得られたものでも使用することができる。
【００３３】
本発明の第１の態様及び第２の態様のいずれの治癒剤ならびに本発明の第３の態様及び第４の態様のいずれの細胞増殖および／または細胞成長促進剤も種々の剤型にすることができ、その場合に種々の添加剤等の成分を配合することができる。例えば、ＴＭ様蛋白質は、薬剤として一般的に用いられる適当な担体または、媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油）、鉱油（例、ワセリン、パラフィン）、高級アルコール（例、セタノール、ステアリルアルコール）、高級脂肪酸（例、ステアリン酸、パルミチン酸）、無害性有機溶媒（例、エタノール）等、さらには必要に応じて賦形剤（例、マンニトール、カルボキシメチルセルロース）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤、ポリエチレングリコール系界面活性剤）、溶解補助剤（例、界面活性剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、吸着防止剤（例、非イオン性界面活性剤、ゼラチン）、安定化剤（例、アミノ酸、糖、糖アルコール、アルブミン）または保存剤（例、ベンジルアルコール、パラベン）、保湿剤（例、尿素、コレステロール）、酸化防止剤（例、トコフェロール）等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経皮吸収剤、点眼剤、経鼻吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤もしくは経皮吸収剤に調製することが出来る。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤、あるいは浸透圧ポンプに封入した形等で提供できる。また、経皮吸収剤としては、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、バップ剤、人工皮膚類等で提供できる。
【００３４】
本発明の創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤の投与方法としては、例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経口投与等の方法によって、ＴＭ様蛋白質量として一日約０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｋｇとなる量を投与したり、浸透圧ポンプ等に封入し生体に留置することにより連続的に投与することができる。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ−ＦＧＦを有効成分として含有させた製剤は、上記のＴＭ様蛋白質投与と同時に、各因子をそれぞれ、一日約０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｋｇとなる量を投与することが好ましい。
【００３５】
また、経皮吸収剤として、熱傷、創傷部位に、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、バップ剤等の方法により局所適用することにより、例えば、ＴＭ様蛋白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で適用することができる。なお、ヒトＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ−ＦＧＦを有効成分として含有する製剤は、上記のＴＭ様蛋白質適用と同時に、各因子をそれぞれ、一日約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌとなる量を適用する。
【００３６】
さらに、熱傷の時に用いる培養皮膚移植等に際しては、細胞の培養液中に、例えば、ヒトＴＭ様蛋白質濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加することもできる。なお、ＴＭ様蛋白質に加えてヒトＩＧＦ−１またはヒトインスリンまたはヒトＥＧＦまたはヒトｂ−ＦＧＦをＴＭ様蛋白質添加と同時に、各因子をそれぞれ、約０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加することもできる。
【００３７】
【作用】
本発明の創傷治癒剤は、有効成分として、線維芽細胞などの細胞の成長および増殖促進効果を発揮するＴＭ様蛋白質、あるいはＴＭ様蛋白質とヒト細胞成長因子の双方を含有するので、種々の創傷、例えば、角膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植その他の手術誘発眼内創傷のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍、口腔・気道または尿路のごとき粘膜の損傷などの治療に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。
【００３８】
本発明の細胞増殖および／または細胞成長促進剤は、特に線維芽細胞の増殖／成長を促進し、肉芽組織形成促進に働く。また、細胞培養系に添加することにより、細胞の増殖を促進することができる。移植に用いるヒト細胞の培養液に添加してそのヒト細胞を培養することもできる。
【００３９】
【実施例】
以下にＴＭ様蛋白質の取得例及び本発明の実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明に用いるＴＭ様蛋白質は、以下の取得例にあげたものに限定されることはなく、また、本発明は以下の実施例に限定されるものでもない。
【００４０】
取得例１（ヒトＴＭ様蛋白質の取得例：ＴＭＥ1-6 )
名和らの方法［バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）１７１、７２９−７３７、１９９０］に準じて、ｐＲＳ７ＴＭを調製した。すなわち、ヒトｃＤＮＡライブラリーより得たＴＭ遺伝子のフラグメントをｐＵＣ１１９発現ベクターに挿入した後、制限酵素処理を行いｐＲＳ７ＴＭを調製した。さらに、ｐＲＳ７ＴＭのＴＭシグナルシーケンスをインターフェロンγシグナルシーケンスで置き換え、さらにＮ末端シーケンスを欠失させた。すなわち、Ｓａｌ−ＢｓｔＮ１制限酵素処理により８０ｂｐの新しいシグナルシーケンスを含むフラグメントを、ＰｓｔＩ制限酵素処理により１番目のＥＧＦドメインをコードしているフラグメントを取得した後、リンカーと結合させｐＴＭＰ２２を作製した。このｐＴＭＰ２２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｌｕＩ制限酵素処理し、生じたフラグメントをｐＴＭｓ０７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｌｕＩフラグメントと置換しｐＰ７ＴＭを作製した。Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｒｉｃｈ領域を欠失させるためにｐＴＭｓ０７をＨｉｎ ｃＩＩ制限酵素処理してフラグメントを単離し、さらにＨｐａＩＩ制限酵素処理を行うことにより６番目のＥＧＦドメインをコードしている７０ｂｐのフラグメントを取得した。このフラグメントのＬｙｓ−４６６の後にストップコドンを含むリンカーを結合させた後、Ａｐａ Ｉ−Ｘｂａ Ｉ制限酵素処理を行い、生じたフラグメントをｐＰ７ＴＭのＡｐａ Ｉ−Ｘｂａ Ｉ部位に組み込みｐＰＧ３ＴＭを作製した。
【００４１】
このプラスミド（ｐＰＧ３ＴＭ）を、常法に従ってチャイニーズハムスター卵母細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１細胞株）にトランスフェクトした。この細胞を選択培地でさらに２〜３週間培養することにより安定した形質転換細胞を選抜し、生じたコロニーをさらに培養した。この培養上清を抗ＴＭモノクローナル抗体カラムとゲル濾過により精製し、ＴＭＥ1-6 を得た。
【００４２】
取得例２（可溶性ＴＭの取得例：ＵＴＭ０）
特開平３−２１８３９９号公報に記載された方法に準じて調製した。すなわち
、原尿１００Ｌをアクリル繊維で濾過して尿中のウロキナーゼを吸着除去し、通過尿を限外濾過膜を使用して脱塩濃縮した。次いで、ＤＥＡＥセルロース（ワットマン社製）カラム、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースクロマトグラフィーおよびセファクリルＳ−３００（ファルマシアファインケミカル社製）カラムを用いて順次精製し、活性画分を採取した（以下、ＵＴＭ０とする）。この画分は一晩蒸留水に対して透析した後凍結乾燥した。
【００４３】
取得例３（可溶性ＴＭの取得例：ｒｓＴＭ）
名和らの方法［バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）１７１、７２９−７３７、１９９０］に準じて、ｐＲＳ７ＴＭを調製した。すなわち、ヒトｃＤＮＡライブラリーより得たＴＭ遺伝子のフラグメントをｐＵＣ１１９発現ベクターに挿入した後、制限酵素処理等を行い、ｒｓＴＭをコードするプラスミドｐＴＭｓ０７を調製した。さらに、Ｎｅｏr 遺伝子を組み込み、発現プラスミドｐＴＭｓ０７−ｎｅｏを作製した。
【００４４】
このプラスミド（ｐＴＭｓ０７−ｎｅｏ）を、常法に従ってチャイニーズハムスター卵母細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１細胞株）にトランスフェクトした。この細胞を選択培地でさらに２〜３週間培養することにより安定した形質転換細胞を選抜し、生じたコロニーをさらに培養した。この培養上清を抗ＴＭモノクローナル抗体カラムとゲル濾過により精製し、ｒｓＴＭを得た。
【００４５】
取得例４（可溶性ＴＭの取得例：Ｄ１２３）
ＷＯ９２／００３２５号公報の方法に準じて製造した。すなわち、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより釣り上げたＤＮＡを利用してアミノ末端のアミノ酸配列がＡｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−であるアミノ酸４９７残基よりなる可溶性トロンボモジュリンを発現するベクターを調製し、これをＣＨＯ細胞に組み込んだ後、遺伝子増幅を行って高発現株を得た。この高発現株の培養液をＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムとゲル濾過により精製し、Ｄ１２３を得た。
【００４６】
実施例１（ヒトＴＭによる線維芽細胞に対する効果１：増殖促進効果）
スイス３Ｔ３細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）を１０％牛胎児血清（以下、ＣＳと略す。：ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ社）に懸濁し、３５ｍｍの培養プレートに１ウェルあたり１×１０ ４ 個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒの条件で培養した。２４時間後に５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＭを含む種々の濃度のＣＳを含むＤＭＥＭ培地（０．１〜１０％ＣＳ）に培地交換し、その後は２日間に一度（図１の矢印参照）培地交換した。細胞は０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理し、細胞数を測定した。なお、ヒトＴＭは、取得例１に記載した方法に従い、ヒトＴＭのＥ１２３４５６を包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で発現後、均一に精製したものを使用した。
【００４７】
この結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＴＭＥ1-6 は０．１％あるいは１％血清の存在下で細胞増殖作用を示した。また、ＵＴＭ０、ｒｓＴＭおよびＤ１２３も同様の作用を示す。
【００４８】
一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖促進能は、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織の成長を起こし得る細胞分化と直接関連しており、強いｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖促進能を有する物質がｉｎ ｖｉｖｏにおいても成長刺激効果を有することは成長因子の研究においては良く知られているところである。従って、ヒトＴＭ様蛋白質は、生体でも効果を有することがわかる。
【００４９】
実施例２（ヒトＴＭによる線維芽細胞に対する効果２：ＤＮＡ合成促進効果）
スイス３Ｔ３細胞を１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルのマイクロタイタープレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、培養液を０．１％ＣＳを含む（又は含まない）ＤＭＥＭ培地で置換し４８時間培養することにより、細胞は完全に非活動性となった。次に、表１及び図２に示すように、種々の濃度のヒトＴＭおよび種々の濃度の成長因子を添加し、３７℃、２０時間培養した。その後3Ｈ-チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加え、さらに８時間培養した。ウェルを氷冷リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）で洗浄して、過剰の3Ｈ-チミジンを除いた後、細胞を０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡで処理してプレートより剥離させ、グラスファイバーフィルター上に集めた。細胞を氷冷したトリクロル酢酸で洗浄後、フィルター上に残存する放射能を液体シンチレーションカウンターにより測定した。なお、ヒトＴＭは、取得例１に従い、ヒトＴＭのＥ１２３４５６を包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 ）をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で発現後、均一に精製したもの、取得例２に従い精製したヒト尿由来可溶性ＴＭ（ＵＴＭ０）および取得例３に従い精製したｒｓＴＭを使用した。ＩＧＦ−１およびｂＦＧＦはインタージェン社、インスリンは和光純薬、ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー社よりそれぞれ購入して使用した。
【００５０】
結果を図２、図３および表１に示す。
【００５１】
図２から明らかなように、ＴＭＥ1-6 は血清の存在下あるいは非存在下においてＤＮＡ合成促進作用を示した。また、図３から明らかなように、ＴＭＥ1-6 、ｒｓＴＭおよびＵＴＭ０いずれもＤＮＡ合成促進作用を示し、ＵＴＭ０が最も強い作用を示した。
【００５２】
【表１】
また、ＵＴＭ０、ｒｓＴＭおよびＤ１２３も同様の作用を示した。
【００５３】
実施例３（ヒトＴＭによる線維芽細胞に対する効果３：グルコース輸送促進効果）
浜中らの方法［エクスペリメンタル セル リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．）１８６、８３−８９、１９９０］に準じて実施した。すなわち、スイス３Ｔ３細胞を１０％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、２４ウェルのマルチプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５％Ａｉｒの条件でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、培養液を０．５％ＣＳを含むＤＭＥＭ培地で置換し４８時間培養した後、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＭ、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦあるいは１０％ＣＳを添加し、３７℃、６時間培養した。細胞をＫＲＰ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ2 、１．４７ｍＭＫＨ2ＰＯ4 、８．０６ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 、０．４９ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）で一回洗浄した後、０．５ｍｌの同緩衝液で３７℃、３０分間プレインキュベートした。その後２−デオキシ−Ｄ−［１−3Ｈ］グルコース（０．５μＣｉ／ウェル、１０μＭ）を加え、１０分間培養した。ウェルを２５ｍＭグルコースを含む氷冷ＰＢＳで３回洗浄して過剰の放射能を除いた後、０．１％ＳＤＳ処理して細胞破砕液を得、その放射能を液体シンチレーションカウンターにより測定した。なお、ヒトＴＭは、実施例に従い、ヒトＴＭのＥ１２３４５６ドメインを包含するペプチド（ＴＭＥ1-6 )をチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で発現後、均一に精製したものを使用した。ＥＧＦはアップステートバイオテクノロジー社より購入して使用した。結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例４（製剤例１）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００５６】
ＴＭＥ1-6 ５ ｍｇ
精製ゼラチン ５０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００５７】
実施例５（製剤例２）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００５８】
ＵＴＭ０ ５ ｍｇ
アルブミン ２０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００５９】
実施例６（製剤例３）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００６０】
ｒｓＴＭ １０ ｍｇ
精製ゼラチン ５０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００６１】
実施例７（製剤例４）
以下の成分を注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過したあとに１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射用製剤を調製した。
【００６２】
Ｄ１２３ １０ ｍｇ
アルブミン ２０ ｍｇ
リン酸ナトリウム ３４．８ｍｇ
塩化ナトリウム ８１．８ｍｇ
マンニトール ２５ ｍｇ
【００６３】
実施例８（製剤例５）
以下の成分を混合、撹拌して均一な組成物（軟膏剤）を調製した。
【００６４】
ＴＭＥ1-6 ０．０１％
白色ワセリン ９６．８％
流動パラフィン ３ ％
ジブチルヒドロキシトルエン ０．２％
【００６５】
実施例９（製剤例６）
以下の成分を混合、撹拌して均一な組成物（軟膏剤）を調製した。
【００６６】
ＵＴＭ０ ０．０１％
ＩＧＦ−１ ０．０１％
白色ワセリン ９６．８％
流動パラフィン ３ ％
ジブチルヒドロキシトルエン ０．２％
【００６７】
【発明の効果】
本発明の創傷治癒剤ならびに細胞増殖および／または細胞成長促進剤は、組織損傷部位の細胞、例えば線維芽細胞などの細胞の成長あるいは増殖を促進する効果を発揮するヒトＴＭ様蛋白質、あるいはヒトＴＭ様蛋白質に加えてさらにヒト細胞成長因子を含有するので、種々の創傷、例えば、角膜潰瘍、放射線角膜傷、角膜移植、他の手術誘発眼内創傷のような眼創傷および切開、やけど、切り傷、破傷、深部術創、皮膚移植によるドナー部位創および潰瘍（皮膚、とこずれ、静脈うっ血および糖尿病）のような皮膚創のごとき上皮損傷、あるいは消化管の潰瘍、口腔・気道または尿路のごとき粘膜の損傷などの治療に用いることができる。さらに、乾せん、日焼け、皮膚発疹のような皮膚傷害にも用いることができる。
【００６８】
また、本発明の製剤は、上記の創傷に対し、公知の製剤に比較して、より優れた作用を有しており、創傷治癒剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＭＥ1-6 のスイス３Ｔ３細胞の増殖に及ぼす影響を示したグラフである。数値は、平均値±標準誤差で表している。
【図２】図２は、ＴＭＥ1-6 のスイス３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成に及ぼす影響を示したグラフである。
【図３】図３は、ＴＭＥ1-6 、ｒｓＴＭおよびＵＴＭ０のスイス３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成に及ぼす影響を示したグラフである。数値は、平均値±標準偏差で表している。
Claims (8)
- トロンビンと結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制するとともにトロンビンのプロテインＣ活性化を著しく促進させるという活性を有するトロンボモジュリン様蛋白質を有効成分として含有し、該トロンボモジュリン様蛋白質が、ヒトトロンボモジュリンのＮ末端から３４５−４６２番目のアミノ酸残基を包含するペプチド、又はその構造の一部を欠失させた改変体もしくはアミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体であることを特徴とする創傷治癒剤。
- 該トロンボモジュリン様蛋白質が、以下のアミノ酸配列１を有する請求項１に記載の創傷治癒剤。
（アミノ酸配列１）
1 10
Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly
11 20
Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly
21 30
Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly
31 40
Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala
41 50
Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr
51 60
Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu
61 70
Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp
71 80
Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu
81 90
Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His
91 100
Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu
101 110
Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val
111 120
Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys
121 130
Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu
131 140
Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg
141 150
Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
151 160
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala
161 170
Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro
171 180
His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr
181 190
Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr
191 200
Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr
201 210
Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp
211 220
Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys
221 230
Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
231 240
Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala
241 250
Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp
251 253
Ser Gly Lys - 該トロンボモジュリン様蛋白質が、ヒトトロンボモジュリンのＮ末端から３４５−４６２番目のアミノ酸残基を包含するペプチドのうちの、Ｎ末端から１−４９７番目のアミノ酸残基を包含するペプチドである請求項１記載の創傷治癒剤。
- ヒト細胞成長因子として、ヒトインスリン様細胞成長因子−１、ヒトインスリン、ヒト上皮細胞成長因子および塩基性線維芽細胞成長因子の少なくとも一つを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の創傷治癒剤。
- トロンビンと結合し、トロンビンの凝固促進作用を抑制するとともにトロンビンのプロテインＣ活性化を著しく促進させるという活性を有するトロンボモジュリン様蛋白質を有効成分として含有し、該トロンボモジュリン様蛋白質が、ヒトトロンボモジュリンのＮ末端から３４５−４６２番目のアミノ酸残基を包含するペプチド、又はその構造の一部を欠失させた改変体もしくはアミノ酸を他のアミノ酸で置換あるいは修飾した改変体であることを特徴とする細胞増殖および／または細胞成長促進剤。
- 該トロンボモジュリン様蛋白質が、以下のアミノ酸配列１を有する請求項５に記載の細胞増殖および／または細胞成長促進剤。
（アミノ酸配列１）
1 10
Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly
11 20
Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly
21 30
Cys Glu His Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly
31 40
Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala
41 50
Ala Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr
51 60
Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp Leu
61 70
Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp
71 80
Gln Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu
81 90
Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His
91 100
Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu
101 110
Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln Arg Cys Val
111 120
Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys
121 130
Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu
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Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg
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Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu
151 160
Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala
161 170
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171 180
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181 190
Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr
191 200
Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr
201 210
Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp
211 220
Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys
221 230
Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr
231 240
Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala
241 250
Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp
251 253
Ser Gly Lys - 該トロンボモジュリン様蛋白質が、ヒトトロンボモジュリンのＮ末端から３４５−４６２番目のアミノ酸残基を包含するペプチドのうちの、Ｎ末端から１−４９７番目のアミノ酸残基を包含するペプチドである請求項５記載の細胞増殖および／または細胞成長促進剤。
- ヒト細胞成長因子として、ヒトインスリン様細胞成長因子−１、ヒトインスリン、ヒト上皮細胞成長因子および塩基性線維芽細胞成長因子の少なくとも一つを含有する請求項５〜７のいずれかに記載の細胞増殖および／または細胞成長促進剤。
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