KR100490817B1 - 119아미노산으로구성된mp52유래의단백질및그제법 - Google Patents

Abstract

사람 M52 유래의 서열표 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 그 단백질의 이량체. 상기 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열의 5프라임 말단에 메티오닌을 코드하는 코돈을 부가한 DNA를 함유하는 플라스미드를 구축하며, 이 플라스미드로 대장균을 형질 전환하고 그 대장균을 배양함으로써 얻어지는 인클루젼 바디를 가용화하여 정제함으로써 얻어지는 단량체의 단백질을 이량체로 재생하고 이를 정제함으로써 상기 이량체 단백질이 얻어진다.

이 이량체 단백질은 연골, 골 질환의 치료에 유용하다.

Description

119 아미노산으로 구성된 MP52 유래의 단백질 및 그 제법{MP-52 Derived Protein Consisting of 119 Amino Acids and Process for Producting the Same}

본 발명은 M52 유래의 서열표 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다. 또 본 발명은 상기 단백질의 이량체 및 이 이량체 단백질로 이루어지는 연골, 골 질환 치료제에 관한 것이다. 또 본 발명은 상기 단백질을 발현할 수 있는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드로 형질 전환한 대장균을 사용하여 상기 단백질을 대량 그리고 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 이량체 단백질을 투여함으로써 이루어지는 연골, 골 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

현재 골 질환의 예방 내지는 치료제로서는 에스트로겐, 칼시토닌, 비타민 D3와 그 유도체 및 비스포스핀산 유도체 등이 알려져 있다. 또 최근에는 TGF-β 유전자 수퍼 패밀리에 속하는 골 유전 인자(Bone morphogenetic protein: 이하 BMP라 함)인 BMP-2에서 BMP-9 등의 일련의 단백질에 골 유도 작용이 있다는 것이 보고되어 있다.

또한 MP52라는 단백질(WO 93/16099 및 WO 95/04819)에 골 유도 작용이 있다는 것이 보고되어 있다. 성숙형 MP52는 N말단에 알라닌을 갖는 120 잔기로 이루어지는 단백질이라고 생각되고 있으며 그 아미노산 서열은 이들 특허에 기재되어 있다.

또 MP52와 아주 비슷한 아미노산 서열을 갖는 GDF-5라는 생쥐 유래의 단백질에 대해서는 Nature, vol. 368, p.639-643(1994년) 및 WO 94/15949에 기재되어 있다.

그러나 이들 단백질을 공업적인 규모와 순수한 형태로 제조하기는 용이하지 않다.

MP52를 유전자 공업적으로 제조함에 있어서 L-세포와 같은 동물 세포를 사용하는 것이 시도되었다. 그러나 순수한 MP52를 효율좋게 제조하기는 용이하지 않았다.

<발명의 개시>

본 발명자들은 MP52를 대장균을 사용하여 유전자 공학적 수법으로 보다 대량으로 제조하는 것을 시도하였다. 즉 알라닌에서 시작되는 MP52를 코드하는 DNA의 5프라임 말단에 메티오닌을 코드하는 코돈을 부가하여 대장균에 의해 MP52를 제조하는 것을 시도하였다. 그 결과 생산되는 것은 MP52뿐만 아니라 N말단에 메티오닌을 갖는 121 잔기의 단백질 및 N 말단의 알라닌이 탈락하고 프롤린으로부터 시작되는 119 잔기의 단백질이 생성되어, 이 혼합물로부터 MP52를 순수하게 분리하기는 매우 곤란하였다.

본 발명자들은 MP52의 N 말단의 알라닌을 삭제한 119 잔기로 이루어지는 서열표 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열의 5 프라임 말단에 메티오닌을 코드하는 코돈을 결합시킨 플라스미드를 구축하고, 이 플라스미드를 도입한 대장균을 사용하여 발현시켰더니 N말단이 프롤린부터 시작되는 서열표 서열 번호 1에 기재한 단백질을 선택적으로 매우 효율좋게 생산한다는 것을 발견하였다.

또한 서열표 서열 번호 1에 기재한 단백질의 이량체는 연골, 골 유도 활성을 갖는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열표 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다. 이 단백질은 120 잔기로 이루어지는 성숙형 부분이라 간주되고 있는 사람 MP52에서 N 말단의 알라닌을 삭제한 119 잔기의 아미노산으로 이루어지는 단백질이다. 본 발명에 의해 얻어지는 단백질은 수용액에 가용성이다. 또한 본 발명의 단백질은 사람 유래인 것을 특징으로 하기 때문에 그 자신의 독성은 적다.

또 본 발명은 서열표 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질이량체로 이루어지는 연골 및(또는) 골 질환의 치료제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명의 단백질 이량체는 연골·골 유도 활성을 갖기 때문에 골다공증, 선천성 연골, 골 질환, 변형성 무릎 관절증·변형성 대퇴 관절증 등의 변형성 관절증 또는 골 관절염, 반월 손상 등의 연골 손상, 외상·종창 적출 등에 의한 골·연골 결손의 재생, 골·연골 결손, 골절, 연골 형성 부전증·연골 발육 부전증·연골 무형성증·구개열·골 형성 부전증 등의 선천성 연골·골 질환 나아가 치근·치조 결손 등의 예방 및 치료제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 단백질은 연골·골 유도 활성을 갖기 때문에 미용 외과의 골이식 치료 등에 사용할 수가 있다. 이러한 치료에는 수의 외과 영역의 것도 포함된다.

본 발명은 서열표 서열 번호 1로 표시되는 사람 MP52 유래 119 잔기의 아미노산으로 이루어지는 단백질을 대장균을 사용하여 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 서열표 서열 번호 1로 표시되는 사람 MP52 유래 119 잔기의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열의 5 프라임 말단에 메티오닌을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드의 기구에 관한 것이다. 사람 MP52cDNA는 WO 93/16099에 기재된 cDNA를 포함한 플라스미드 벡터를 주형 DNA로 하고, 성숙형 부분만을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR법)을 사용하여 증폭하였다. 여기에서 사용하는 PCR법이란 통상 핵산 DNA 또는 RNA의 미량 단편을 미국 특허 번호 4,683,195에 기재되어 있는 방법으로 증폭하는 것을 의미한다.

본 발명의 단백질을 생산하기 위하여 이 단백질을 코드하고 있는 DNA를 포함한 적절한 발현 벡터를 구축하고, 유전자 공학의 수법에 의해 바람직한 대장균 숙주에 도입하는 것이 필요하다. 본 발명의 단백질을 대량으로 생산하기 위하여 이하의 두가지 개량 방법을 실시하였다. 1)목적 단백질의 생산성을 올리는 방법:M.Nobuhara 등이 보고(Agric. Bio1. Chem., 52(6), 1331-1338. 1988)한 번역 효율을 올리는 방법, 즉 개시 코돈 ATG 주변의 AT 함량을 올리는 방법 및 2)플라스미드의 복제수를 올리는 방법, 즉 복제 오리진을 pBR계에서 pUC계로 대체하는 방법. 그리고 프로모터 영역과 서열표 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 직접 이음으로써 본 발명의 발현 벡터(pKOT245)를 구축하였다. 이 벡터는 통상 산업성, 공업 기술원 국립 생명 과학·인간 기술 연구소(NIBH)(일본 이바라끼껭쯔꾸바군야따께 히가시 1쪼메1-3)에 1995년 4월 14일자로 수탁 번호 FERM P-14895호로서 기탁되고, 1996년 4월 10일자로 부타페스트 조약을 바탕으로 한 기탁으로 이관되었다(FERM BP-5499).

본 발명은 서열표 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열의 5 프라임 말단에 메티오닌을 코드하는 코돈을 부가한 DNA를 함유하는 플라스미드를 구축하고, 그 플라스미드로 대장균을 형질 변환하며, 이 대장균을 배양함으로써 얻어지는 인클루젼 바디를 가용화하여 정제함으로써 얻어지는 단량체의 단백질 및 이를 리폴딩(refolding), 정제함으로써 얻어지는 서열표 서열 번호 1의 단백질 이량체의 단백질 제조 방법에 관한 것이다. 즉 본 발명의 단백질은 대장균 인클루젼 바디를 가용화한 후, SP-Sepharose FF 칼럼 및 Sephacryl S-200 칼럼에 의해 단일한 술폰화 MP52 단량체를 얻었다. 그래서 리폴딩을 한 후 등전점 침전하고 역상 HPLC의 RESOURCE RPC 칼럼을 통과함으로써 본 단백질의 정제 이량체 분획을 얻었다. 얻어진 본 단백질의 물리 화학적 성질은 N 말단 아미노산 서열, 아미노산 조성 및 전기 영동에 의한 분석으로 해석하였다.

본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 도입한 대장균의 배양을 배양액 온도 28 ℃ 내지 34 ℃, pH 6 내지 8, 용존 산소 농도 20 내지 50 %의 조건하에서 행하는 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 유효량의 단백질 이량체를 포함하는 치료제를 사람에게 투여하는 것을 포함한, 연골 및 골 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 이량체의 생물학적 활성은 이소성 연골·골 형성(엑토픽 본 포메이션)의 연X선 사진 촬영 분석, 조직학적 해석 및 경시적 해석에 의해 평가하였다. 또한 막내골화에 대한 작용, 관절 연골의 재생에 대한 효과 및 골절·골 결손에 대한 치료 효과에 의해 본 발명의 단백질이 연골·골 재건에 유효하다는 것을 확인하였다.

본 발명의 단백질 이량체는 정맥내, 근육내 및 복강내 투여에 의한 전신 투여가 가능하다. 정맥내 투여의 경우는 통상의 정맥내 주사 이외에 점적 정맥 주사가 가능하다.

주사용 제제로서는 예를 들면 주사용 분말 제제로 만들 수가 있다. 그 경우는 적당한 수용성 부형제, 예를 들면 만니톨, 자당, 젖당, 말토스, 포도당, 과당 등의 1종 또는 2종 이상을 첨가하여 물로 용해하고, 바이알 또는 앰플에 분주한 후, 동결 건조하고 밀봉하여 제제로 만들 수가 있다.

국소 투여 방법으로서는 그 부위의 연골·골 또는 치아의 표면을 콜라겐 페이스트, 피브린 풀 또는 기타 접착제를 사용하여 본 단백질로 덮는 방법이 있다. 이들 중, 골 이식에 사용하는 뼈는 천연골 이외에 종래 사용되었던 인공뼈도 이용할 수 있다. 인공뼈란 금속, 세라믹스, 유리 등의 천연 소재 또는 인공 무기질 소재로 만든 뼈를 의미한다. 인공 무기질 소재로서 바람직하게는 하이드록시아파타이트를 들 수 있다. 예를 들면 인공뼈의 내부 재료에 금속, 그리고 그 외측의 재료에 하이드록시아파타이트를 사용한다. 또한 본 단백질은 골 재구축을 촉진하기 위하여 암성 골조직에도 투여할 수 있으며, 연골 이식에도 이용 가능하다.

투여량에 대해서는 본 단백질의 작용에 영향을 주는 여러 가지 요인, 예를 들면 형성이 요망되는 골·연골의 중량, 골·연골 손상 부위 및 그 상태, 환자의 연령, 성별, 감염의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상 요인을 고려하여 담당의가 결정한다. 또 용량은 본 단백질과의 재구성에 사용하는 담체의 종류에 따라 변동할 수 있다. 일반적으로 투여량은 지지체와의 조성물로서 사용할 때, 목적으로 하는 골·연골 습중량당 본 단백질 약 10 내지 10⁶ 나노그램, 주사제로서 국소 및 전신성에 적용할 때 환자 1인당 0.1 내지 10⁴ 마이크로그램을 일주일에 한번에서 하루에 한번의 빈도로 투여하는 것이 바람직하다.

골·연골 재생에 대하여 공지된 성장 인자, 예를 들면 인슐린 유사 성장물질(insulin-like growth factor-I, IGF-I) 등을 동시 적용함으로써 상승 효과를 기대할 수 있다.

이와 같이 본 발명의 단백질을 공업적인 규모와 동시에 순수한 형태로 제조하는 방법은 지금까지 보고되어 있지 않아, 연골·골 유도 활성을 갖는 연골, 골 질환 치료제로서 유효하다. 또한 본 발명의 제조 방법은 지금까지 동물 세포에서밖에 생산할 수 없었던 TGF-β 유전자 수퍼 패밀리에 속하는 상술한 골 유도 인자의 제조에도 응용할 수 있다.

도 1은 실시예 1(2)에서 얻어진 본 발명의 단백질 발현 벡터(pKOT245)의 플라스미드 지도이다.

도 2는 실시예 4(1)에서 얻어진 생쥐 대퇴 근육내로 유도된 골·연골 석회화 조직의 연X선 사진이다.

도 3은 실시예 4(1)에서 얻어진 생쥐 대퇴 근육내로 유도된 골·연골 석회화 조직의 비탈회 절편의 조직 염색 현미경 사진이다.

도 4는 실시예 4(2)에서 얻어진 생쥐 대퇴 근육내에서 관찰된 연골·골 유도의 경시적 변화를 나타내는 조직 염색 현미경 사진이다.

도 5는 실시예 4(3)에서 얻어진 쥐 두정골의 탈회 절편의 조직 염색 현미경 사진이다.

도 6은 실시예 4(4)에서 얻어진 집토끼의 관절 연골을 포함하는 대퇴골 두부(頭部)의 탈회 절편의 조직 염색 현미경 사진이다.

도 7은 실시예 4(5)에서 얻어진 대퇴골에 골 결손이 작성된 쥐의 대퇴부 연X선 사진이다.

<발명을 실시하기 위한 최량의 형태>

이어서 실시예를 나타내어 본 발명의 효과를 구체적으로 설명하겠다. 또한 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 벡터의 제작

(1)변이형 MP52 성숙형 부분의 단리

사람 MP52cDNA는, WO 93/16099에 기재된 cDNA를 포함한 플라스미드 벡터(pSK52s)를 주형 DNA로 하고, 성숙형 부분만을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭하였다.

개시 코돈 ATG 주변의 AT 함량을 올림으로써 목적 단백질의 생산성을 향상시키는 방법[M, Nobuhara 등의 보고(Agric. Bio1. Chem., 52(6), 1331 내지 1338, 1988 ]에 따라 성숙형 MP52 유전자 일부의 DNA를 치환하였다.

치환 방법은 서열 번호 2의 순방향 PCR 프라이머를 사용하여, PCR법으로 행하였다. PCR 프라이머의 DNA 서열은 서열 번호 2에 기재된 DNA를 순방향 프라이머로 하고 서열 번호 3에 기재된 DNA를 역방향 프라이머로서 사용하였다.

PCR은 같은 시험관 중에서 주형 DNA(10 나노그램), 순방향 및 역방향 PCR 프라이머 각각 50 피코몰, dNTP(0.2 밀리몰) 및 MgCl₃(1.5 밀리몰)를 Taq DNA 폴라메라아제(5U)와 함께 첨가함으로써 행하였다.

각 사이클이 변성(94 ℃, 1분간), 프라이머 어닐링(55 ℃, 1분간) 및 프라이머 신장(72 ℃, 2분간)으로 이루어지는 30 사이클의 PCR을 행하였다(이하의 PCR은 모두 이 조건으로 행하였다).

PCR 반응으로부터의 생성물을 1.5 % 저융점 아가로스(FMC사) 중에서 전기 영동에 의해 분리하고, 서열 번호 1의 아미노산 서열에 상당하는 약 360bp로 이루어지는 절편을 얻었다(이를 절편 1이라 한다).

(2) 본 단백질의 대장균 발현 벡터의 구축

플라스미드의 복제수를 올리기 위해서는 복제 오리진을 pBR계에서 pUC계로 대체하였다. 시판 중인 대장균 발현 벡터 pKK223-3(파마시아·바이오테크 주식회사로부터 구입)의 tac 프로모터 영역을 제한 효소 SspI와 EcoRI로 절단한 후, 멍 빈 뉴클레아제 (Mung Bean Nuclease, 다까라 슈조 가부시끼가이샤, 카탈로그 번호 2420A)로 처리하고, 프래그먼트 1의 개시 코돈측에 T4DNA 리가제 (다까라 슈조 가부시끼가이샤, 카탈로그 번호 2011A)로 결합시켜 pKK223-3의 rrnBT₁T₂ 종결서열 영역을 제한 효소 SalI과 SspI로 절단하고 SalI로 절단한 프래그먼트 1의 종지 코돈측과 결합시켜 pUC18의 SmaI 부위에 도입함으로써 본 단백질의 생산을 위한 발현 벡터[pKOT245(수탁 번호 비꼬겡끼(BIOKEKEN-KI) 제 P-14895호](도 1)를 구축하였다. pKOT245의 DNA의 길이는 3.7 kb이다. 제작한 본 발명의 단백질 발현 벡터는 Pharmacia ALF DNA 시퀀서에 의해 그 염기 서열을 결정하였다.

(3)형질 전환

형질 전환은 Kushner 등의 염화 루비듐법(Genetic Engineering. p.17, Elsevier(1978)에 따랐다. 즉 pKOT245를 숙주 대장균 W3110M으로 상기한 수법에 따라 이입하여, 본 발명의 단백질 생산 대장균으로 하였다.

<실시예 2> 배양

(1)배양

본 발명의 단백질 발현 대장균을 변형된 SOC 배지 (박토 트립톤 (Bacto tryptone) 20 g/ℓ, 박토 이스트 추출물 (Bacto yeast extract) 5 g/ℓ, NaCl 0.5 g/ℓ, MgCl₂·6H₂O 2.03 g/ℓ, 글루코스 3.6 g/ℓ)로 예비배양하고, 생산용 배지(박토 트립톤 5 g/ℓ, 시트르산 4.3 g/ℓ, K₂HPO₄ 4.675 g/ℓ, KH₂PO₄ 1.275 g/ℓ, NaCl 0.865 g/ℓ, FeSO4·7H2O 100 mg/ℓ, CuSO₄·5H₂O 1 mg/ℓ, MnSO₄·nH₂O 0.5 mg/ℓ, CuCl₂·2H₂O 2 mg/ℓ, Na₂B4O₇·10H₂O 0.225 mg/ℓ, (NH₄)₅Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1 mg/ℓ, ZnSO₄·7H₂O 2.25 mg/ℓ, CoCl₂·6H₂O 6 mg/ℓ, MgSO₄·7H₂O 2.2 mg/ℓ, 티아민 HCl 5.0 mg/ℓ, 글루코스 3 g/ℓ) 5 L에 대하여 균체 현탁액을 100 ㎖ 첨가하고, 10 L의 배양조에서 통기 교반하면서 배양하며, 대수 증식 전기(OD₅₅₀=5.0)에 달한 단계에서 1 mM의 농도로 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 첨가하고, 다시 OD₅₅₀이 150에 달할 때까지 배양하였다. 배양중 온도는 32 ℃, pH는 암모니아를 첨가함으로써 7.15로 제어하고, 용존 산소 농도의 저하를 방지하기 위하여 교반 속도를 올림으로써 공기 포화의 50 %로 용존 산소 농도를 제어하였다. 또 고균체 농도로 만들기 위하여 용존 산소 농도의 급격한 상승을 지표로 하여, 50 % 글루코스 용액을 0.2 % 농도로 첨가하면서 배양하였다.

(2) 대장균 인클루젼 바디의 조제

상기 방법에 의해 얻어진 배양액을 원심 분리 하여 균체를 회수하고, 10 mM 에틸렌디아민 사아세트산을 포함하는 25 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.3)으로 현탁하고 균체 파쇄 장치(고린사 (Gaulin Inc.) 제품)를 사용하여 세균을 파쇄하고 다시 원심 분리하여 인클루젼 바디를 포함하는 침전을 회수하였다.

<실시예 3> 정제

(1) 대장균 인클루젼 바디의 가용화

대장균 인클루젼 바디를 1 % Triton X-100으로 3회 세정 후, 3000×g로 30분간 4 ℃에서 원심 분리하고, 얻어진 침전을 pH가 3인 20 mM Tris-HCl 완충액, 8M 요소, 10 mM DTT, 1 mM EDTA로 초음파를 부여하면서 가용화하였다.

(2) 단량체 정제

그 가용화액을 20000×g으로 30분간, 4 ℃에서 원심 분리하여 그 상청을 회수하였다. 얻어진 상청을 pH 8.3인 20 mM Tris-HCl 완충액, 6M 요소, 1 mM EDTA로 평형시킨 SP-Sepharose FF(파마시아사)에 통과시키고, 동일 용액으로 세정 후 0.5M 식염을 포함하는 동일 용액으로 용출시켰다. 용출액에 Na₂SO₃와 Na₂S₄O₆을 각각 최종 농도가 111 mM, 13 mM이 되도록 첨가하여 4℃, 15시간 술폰화를 행하였다. 술폰화 용액을 pH 8.3인 20 mM Tris-HCl 완충액, 6M 요소, 0.2 M 식염, 1mM EDTA로 평형시킨 Sephacryl S-200 HR(파마시아사)로 겔 여과를 하여 단일하고 술폰화된 본 발명의 단백질 단량체를 얻었다.

(3)리폴딩

술폰화된 본 발명의 단백질 단량체 용액에 9배 양의 pH가 9.8인 50 mM Na-글리신 완충액, 0.2 M 염화 나트륨, 16 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 2 mM GSH(환원형 글루타치온), 1 mM GSSG(산화형 글루타치온)를 첨가한 후 1일간 4 ℃에서 교반하며 리폴딩하였다.

(4)이량체 정제

리폴딩된 시료를 순수한 물로 2배 희석하고 6N 염산을 첨가하여 pH를 7.4로 맞추어 등전점 침전을 행하였다. 침전을 3000×g 20분의 원심 분리로 모은 후, 30 % 아세토니트릴, 0.1 % TFA에 용해하였다. 그 용액을 순수한 물로 2배 희석하고, 0.05 % TFA, 25 % 아세토니트릴로 평형시킨 둔 역상 HPLC의 RESOURCE RPC 칼럼(파마시아사)에 통과시켜 0.05 % TFA, 25 내지 45 % 아세토니트릴그라젠트로 용출하였다. 용출액은 흡광도 광도계를 사용하고, 280 nm의 흡광도에 의해 모니터하여 정제된 본 발명의 단백질 이량체 획분을 얻었다. 이것을 스피드박 (SpeedVac) 농축기 (서번트 (Servant) 사)로 동결 건조하였다.

(5) 정제된 본 발명 단백질의 물리 화학적 성질의 측정

(가)N 말단 아미노산 서열 분석

상기에서 얻어진 정제된 본 발명의 단백질에 대하여 N 말단 아미노산 서열을 아미노산 시퀀서, 모델 476A(어플라이드 바이오시스템즈사)로 분석했더니 서열표 서열 번호 1에서 나타내는 N 말단에서 30번째까지의 아미노산 서열이 확인되었다.

(나)아미노산 조성 분석

상기에서 얻어진 정제된 본 발명 단백질의 아미노산 조성을 아미노산 분석기[PICO TAG 시스템(워터즈사)]로 조사하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다. 표에 나타낸 수는 1 모노머 당 아미노산 잔기 수를 나타낸다.

아미노산	실측값	기대값
Asx	11.5	12
Glx	10.9	11
Ser	8.4	9
Gly	4.3	4
His	4.0	4
Arg	7.7	7
Thr	5.4	6
Ala	7.3	7
Pro	10.2	10
Tyr	2.9	3
Val	5.7	7
Met	5.1	4
1/2Cys	2.6	7
Ile	4.9	6
Leu	10.0	10
Phe	4.0	4
Lys	5.9	6
Trp	-	2
배열의 길이		119
- : 검출 불가능

(다)전기 영동에 의한 분석

상기에서 얻어진 정제된 본 발명의 단백질 분자량을 비환원 조건하의 SDS-PAGE로 확인했더니 약 28KDa의 분자량을 나타냈다.

상기 (가), (나) 및 (다)에 나타난 결과에 의해, 본 발명의 단백질은 N 말단이 단일하게 Pro부터 시작되는 119 잔기로 이루어지는 단백질이라는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4> 생물학적 활성의 측정

(1)이소성 연골·골 조직의 유도 작용

실시예 3에 의해 얻어진 단백질 약 500 ㎍를 10 mM 염산 50 ㎕에 용해, 동일 용매로 희석하고, 1 ㎍/10 ㎕, 10 ㎍/10 ㎕, 및 100 ㎍/10 ㎕ 농도의 용액을 조제하고 그 10 ㎕을 돼지건(腱) 유래 I 형 콜라겐 용액 150 ㎕(고껜, 0.5 %, pH 3, I-AC)와 혼화하고 중화한 후, 동결 건조하여 얻어진 혼화물을 8주령의 웅성 ICR 생쥐의 대퇴 근육내에 집어 넣고, 21일 후에 대퇴부를 적출하여 피부를 박리한 후 연 X선 사진 촬영에 의해 골·연골 석회화 조직의 발현율을 검토하였다. 표 2에 그 결과를 나타냈다. 1 ㎍/부위 이상의 용량에서 그 발현을 확인하고, 10 ㎍/부위 이상의 용량에서 사용된 생쥐 전체 예에서 그 발현을 확인하였다.

MP52 단백질의 용량	*골·연골 석회화 조직의 발현율
대조(I 형 콜라겐 단독)	0/4
1 ㎍/부위	3/4
10 ㎍/부위	4/4
100 ㎍/부위	4/4
*각군 4예에서 실험한 골·연골 석회화 조직의 연X선 사진 촬영 분석에 의한 발현을 나타낸다.

또, 도 2에 각 용량에서의 전형적인 골·연골 석회화 조직의 연X선 사진상을 나타냈다. 도 2에서 A는 MP52 단백질 1 ㎍/부위, B는 MP52 단백질 10 ㎍/부위, C는 MP 단백질 100 ㎍/부위의 용량으로 각각 MP52 단백질을 생쥐 대퇴 근육내에 집어 넣은 예에 대한 결과를 나타냈다. 이 결과에 의해 용량 의존적인 골·연골 석회화 조직의 증가가 확인되었다. 다시 이들 생쥐의 대퇴부를 고정후 비탈회 단편을 작성하고, 폰 코사(von Kossa) 염색, 알시안 블루(Alcian blue) 염색 및 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-eosin) 염색을 각각 실시하였다.

도 3에 본 단백질 10㎍/부위의 용량에서 I 형 콜라겐과 함께 집어 넣어진 표본의 조직 염색의 현미경 사진을 나타낸다. 도 3에서 A는 폰 코사 염색, B는 알시안 블루 염색, C는 헤마톡실린-에오신 염색을 각각 나타냈다.

도 3(A)에서 화살표 ct 부분은 석회화 조직을 나타내고, 화살표 cc 부분은 석회화 연골 세포를 나타냈다. 도 3(B)에서 화살표 rc 부분은 잔존 연골 조직을 나타냈다. 도 3(C)에서 화살표 ad 부분은 지방 세포, 화살표 bm 부분은 골수 세포, 화살표 Ib 부분은 층판골, 화살표 ob 부분은 골아 세포, 화살표 wb 부분은 선유성골을 각각 나타냈다. 도 3에서 MP52 단백질의 투여에 의해 골아 세포, 골수 세포, 석회화 연골 세포가 생성되고, 골·연골 석회화 조직이 형성된다는 것이 명확했다.

실시예 4의 결과로부터 본 발명의 단백질 이량체는 연골·골 유도 작용을 갖는다는 것이 명확해졌다.

(2)이소성 골화 작용의 경시적 해석

실시예 3에 의해 얻어진 단백질 약 3 ㎍을 함유하는 실시예 4(1)에 기재된 방법과 마찬가지로 제작한 동결 건조물을 ICR 생쥐의 대퇴 근육중에 집어 넣고, 3,7,10,14,21 및 28일후에 조직을 적출, 10 % 포르말린으로 고정 후, 그러한 조직 절편에 헤마톡실린-에오신 염색(HE) 및 폰 코사 염색(von Kossa)을 실시하였다. 도 4에 염색 절편의 광학 현미경 사진을 나타냈다.

3일째(도 4A, HE)에, 집어 넣어진 콜라겐 섬유(co)와 주위의 근육 조직(m)사이에 형태학적으로는 결합 섬유성 세포를 포함하는 미분화 간엽계 세포(mc)의 출현이 발견되었다. 7일째(도 4B, HE)부터 10일째(도 4C, HE)에 걸쳐 이 부위에는 미분화 간엽계 세포(mc)가 집적·증식되고, 미분화 간엽계 세포의 비대화 및 전연골양 세포로의 변화가 발견되었다. 14일째(도 4D, HE; 도 4E, von Kossa)에, 석회화 연골 조직(화살표 cc) 및 골조직(화살표 b)의 형성을 확인하였다. 21일째(도 4F, HE; 도 4G, von Kossa)에, 골수 세포(화살표 bm)의 형성이 나타나는 한편, 14일째에 관찰된 석회화 연골 조직은 거의 발견되지 않아, 석회화 연골 조직이 골조직(화살표 b)으로 변환된 것이라고 생각되었다. 28일째(도 4H, HE)에, 광범위하게 골수 세포(bm)가 발견되어 형성된 골조직(b)는 흡수 과정에 있는 듯하였다.

이와 같이 rMP52는 종래 BMPs에 대하여 밝혀져 있는 바와 같이 이소성에 연골 조직을 유도하고 계속해서 연골내 골형성을 불러 일으킬 수 있는 단백질이라는 것이 명확하였다.

(3)막내 골화에 대한 작용

실시예 3에 의해 얻어진 단백질을 0.01 % 사람 혈청 알부민을 포함하는 생리적 인산 완충액(pH 3.4)에 용해하고, 0.01 ㎍/20 ㎕, 0.1 ㎍/20 ㎕ 및 1 ㎍/20 ㎕ 용액을 조제하여, 그 20 ㎕를 스프라그도울리계 쥐의 좌우 두정골 중 그 한쪽 골막에 생후 1일째부터 마이크로실린지를 사용하여 1일 1회, 12일간 매일 동일 부위에 주사하였다. 다른쪽의 두정골 골막내에는 동량의 그 용액을 주사하였다. 또 양쪽 정골 골막에 그 용매를 주사하여 비교 대조하였다. 최종 투여 1일 후에 좌우 두정골을 적출·고정 후 투여 부위를 횡단하는 탈회 헤마톡실린-에오신 염색 표본을 작성하고 좌우 두정골 투여 부위의 두께를 현미경 사진상으로 측정하여 동일 개체에서의 용매 투여 부위의 두께에 대한 본 발명의 단백질 투여 부위의 두께의 비를 산출하였다. 표 3에 그 결과를 나타냈다. 또 도 5에 본 발명의 단백질 0.1 ㎍/20 ㎕를 연속 주사했을 경우, 조직 절편의 광학 현미경 사진상의 일례(도 5B)를 반대측 용매 투여군의 그것(도 5A)과 함께 나타냈다.

본 발명의 단백질 투여에 의해 골막 세포(p)의 활성화 및 증식이 나타남과 동시에 활성화된 골아 세포(화살표 ob)가 두정골내 및 골막(p)의 경계 영역에 수많이 출현하여, 용량 의존적으로 두정골(b)의 두께가 투여 부위에서 늘어난다는 것이 명확하였다. 이것은 본 발명의 단백질이 적어도 국소 주입했을 경우, 막골화를 항진하여 골다공증, 골절 및 치조, 치근 결손의 치료에 유용하다는 것이 나타났다.

본 발명 단백질의 용량(㎕/부위/일)	투여 부위의 두정골 두께(㎛)		두께의 비(B/A)
	용매 투여(A)	본 발명의 단백질 투여(B)
0(용매)	128±7	141±20	1.10±0.16
0.01	134±9	167±30	1.27±0.33
0.1	119±19	190±29	1.60±0.10*
1	132±19	225±25	1.70±0.14**
두정골의 두께 및 그 비의 값은 4예의 평균값±표준 편차를 나타낸다.
*P<0.05, **P<0.01 대 좌우 두정골 용매 투여군(윌리엄즈법)

(4)관절 연골의 재생에 대한 효과

6마리의 12주령의 웅성 집토끼(뉴질랜드 화이트)의 우측 슬부의 피부 및 관절포를 절개한 후, 건을 손상하지 않도록 대퇴골의 슬개골구를 노출하고, 그 부위에 의과용 드릴을 사용하여 직경 5 mm의 골수강까지 관통한 관절 연골·골 결손을 작성하고, 그 결손 부위에 실시예 3에 의해 얻어진 단백질 약 10 ㎍ 함유 또는 비함유 I 형 콜라겐 동결 건조물을 실시예 4(1)에 기재된 방법과 마찬가지로 조제하여 3예씩 집어 넣고 관절포 및 피부를 봉합하고, 3주일 후에 대퇴골두를 적출·고정후, 전체예의 탈회 조직 절편을 작성하여 알시안 블루 염색을 하였다. 도 6에 각각의 전형적 일례의 광학 현미경 사진상을 나타냈다. I 형 콜라겐 동결 건조물만을 넣었을 경우(도 6A 및 6B), 결손 부위(화살표 d)에는 섬유성의 조직(f)이 나타날뿐이었으나, 실시예 3에 의해 얻어진 본 발명의 단백질 약 10 ㎍ 함유 I 형 콜라겐을 집어 넣은 경우(도 6C 및 6D), 결손 부위에 세포외에 알시안 블루 염색 양성 기질의 침착을 동반한 연골 세포(ch)의 형성을 확인하였다.

또, 그 형성된 조직은 정상 관절 연골 조직에서 관찰되는 정지 세포층, 증식 세포층, 비대 세포층이라는 층상 구조와 유사한 세포 구성 구조를 결손 부위의 외측에서 내측으로 구축하고 있었다. 이러한 소견은 사용된 집토끼 모두에게서 발견되었으며, 본 발명의 단백질이 연골의 재생, 특히 변형성 관절증 또는 골관절염 등에 의해 야기된 관절 연골 변성 조직의 정상 조직으로의 회복에 유효하다는 것을 나타내고 있다.

(5)연골·골 결손에 대한 치료 효과

30마리의 스프라그도울리계 웅성 쥐(약 15주령)를 사용하여 대퇴부의 피부 조직을 절개하여, 주위 근육 조직에서 대퇴골을 노출시키고, 대퇴골 골간부 중앙에 치과용 드릴로 5 mm의 원주상 골 결손부를 작성, 잔존 대퇴골 양단을 스테인레스제 나사를 사용하고 폴리에틸렌제의 플레이트로 고정하였다. 실시예 3에 의해 얻어진 단백질 0, 약 1, 10 또는 100 ㎍ 함유 I 형 콜라겐 동결 건조물을 그 골 결손 부위에 집어 넣고, 피부 조직을 봉합하였다. 넣은 직후 및 12주째에 그들의 연X선 사진 촬영을 한 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7A는 골 결손 작성시의 사진이다. 도 7B 내지 E에 나타나 있는 바와 같이, I 형 콜라겐 단독(도 7B) 및 본 연구의 단백질 1 ㎍ 함유 I 형 콜라겐(도 7C)을 넣은 것에서는 12주째에 결손부 양단에서 약간의 가골 (假骨, 화살표 cs)의 형성을 나타냈을 뿐이며, 골유합에는 이르지 못했다. 한편 10 또는 100 ㎍ 함유 I 형 콜라겐(도 D 및 도 E)을 넣은 것에서는 그 골 결손 부위 전체에 걸쳐 가골(화살표 cs)의 형성을 확인하고, X선 상에서 골유합을 확인하였다. 12주째에 대퇴골을 적출, 폴리에틸렌제 플레이트를 떼어내고 이중 X선 흡수법(Aloka, DCS-600)에 의해 1 mm 간격의 스캐닝 모드로 골 결손 작성부를 포함하는 대퇴골 장축 방향 15 mm를 연속적으로 그 방향에 대하여 수직으로 주사하고, 작성 골 결손 중앙부 3mm 상당 부위에서의 골염량을 적산함과 동시에 양쪽 골단을 수지로 고정하고, 골 강도 측정 장치(말토 제작소, MZ-500)에 장착하여 180°/분의 스피드로 하부 수지로 회전시키고, 대퇴골을 파괴하는데 필요한 최대 비틀림힘을 측정하였다(표 4). 본 발명 단백질의 쥐 대퇴골 결손 부위에 넣은 것은 이와 같이 용량 의존적으로 그 부위에서의 골염량을 증가시킴과 동시에 그 부위의 골 강도(비틀림힘)를 상승시키는 것이 나타나, 본 발명 단백질이 골절 치료 및 골결손부에서의 골재건에 유효하다는 것을 나타냈다.

본 발명 단백질의 용량(㎍/부위)	쥐 대퇴골 골 결손부에서의 골염량(㎎)	최대 비틀림힘(kgf·㎝)	예의 수
콜라겐 단독	120.2±24.5	2.92±0.09	6
1	176.9±36.4	6.24±1.00	8
10	277.4±63.9	9.35±3.14	8
100	374.8±67.1*	4.034±7.64*	8
평균값±준오차를 나타낸다.
*p<0.05 대 콜라겐 단독군(Students's t-test)

서열표 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 이량체로 이루어지는 단백질은 연골·골 유도 활성을 가지며 연골, 골 환자의 치료제로서 유용하다. 또한 본 발명 단백질의 발현 벡터를 변형함으로써 대장균을 사용한 유전자 공학의 수법에 의해 공업적인 규모, 그리고 순수한 형태로 이 단백질을 제조하는 것이 가능하다.

서열표

서열 번호:1

서열의 길이:119

서열 형태:아미노산

토폴로지:직쇄상

서열 종류:펩티드

프래그먼트형:N-말단 프래그먼트

기원:

생물명:사람(homo sapiens)

조직의 종류: 사람 태아

서열의 특징:

존재 위치:

기타 정보:MP52 아미노산 서열의 383번째부터 501번째의 아미노산 서열.

<서열 1>

서열 번호:2

서열의 길이:27

서열 형태:핵산

가닥:한가닥

토폴로지:직쇄상

서열 종류:기타 핵산

기원:없음

생물명:없음

주명(株名):없음

서열의 특징:MP52 성숙형 단리용 순방향 PCR 프라이머

<서열 2>

서열 번호:3

서열의 길이:26

서열 형태:핵산

가닥:한가닥

토폴로지:직쇄상

서열 종류:기타 핵산

기원:없음

생물명:없음

주명:없음

서열의 특징:MP52 성숙형 단리용 역방향 PCR 프라이머

<서열 3>

Claims (23)

1. 서열표 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
2. 제1항에 따른 단백질의 동종 이량체로 이루어지는 단백질.
3. 제2항에 따른 단백질의 치료학적으로 유효량 및 제약학적 담체를 함유하는 연골 및 골 질환 치료용 제약 조성물.
4. 제3항에 있어서, 연골 및 골 질환이 골다공증인 제약 조성물.
5. 제3항에 있어서, 연골 및 골 질환이 변형성 관절증 또는 골관절염인 제약 조성물.
6. 제3항에 있어서, 연골 및 골 질환이 골절 및 골 결손인 제약 조성물.
7. 제3항에 있어서, 연골 및 골 질환이 치근 및 치조의 결손인 제약 조성물.
8. 제1항의 단백질을 발현할 수 있는 DNA를 포함하는 플라스미드로 형질 변환된 대장균을 사용하는 제1항의 단백질의 제조 방법.
9. 제8항에 있어서, 서열표 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열의 5프라임 말단에 메티오닌을 코드하는 코돈을 부가한 DNA을 함유하는 플라스미드를 구축하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
10. (i) N-말단에 메티오닌을 가지는 서열표 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 구축하는 단계,

    (ii) 상기 플라스미드로 대장균을 형질 변환하는 단계,

    (iii) 상기 대장균을 배양함으로써 얻어지는 인클루젼 바디를 가용화하는 단계,

    (iv) 상기 가용화된 용액으로부터 단량체 단백질을 정제하는 단계

    (v) 단량체를 이량체 단백질로 리폴딩하고, 이것을 정제하는 단계

    를 포함하는 제2항에 따른 이량체 단백질의 제조 방법.
11. 제2항에 따른 동종 이량체 단백질의 유효량을 활성 성분으로 포함하는 제약학적 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여함으로써 이루어지는 연골 및 골 질환의 치료 방법.
12. 제11항에 있어서, 연골 및 골 질환이 골다공증인 치료 방법.
13. 제11항에 있어서, 연골 및 골 질환이 변형성 관절증 또는 골 관절염인 치료 방법.
14. 제11항에 있어서, 연골 및 골 질환이 골절, 골 결손인 치료 방법.
15. 제11항에 있어서, 연골 및 골 질환이 치근, 치조의 결손인 치료 방법.
16. 제3항에 있어서, 연골 및 골 질환이 연골 손상 또는 결손인 제약 조성물.
17. 제16항에 있어서, 연골 질환이 관절 반원 손상인 제약 조성물.
18. 제3항에 있어서, 연골 및 골 질환이 선천성인 제약 조성물.
19. 제18항에 있어서, 연골 및 골 질환이 연골 형성 부전증, 연골 발육 부전증, 연골 무형성증, 구개열 또는 골형성부전증인 제약 조성물.
20. 제3항에 있어서, 골 이식 또는 연골 이식 또는 새로운 연골 또는 골의 유도를 위한 것인 제약 조성물.
21. 제3항 내지 제7항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 전신성 또는 국부 투여용인 제약 조성물.
22. 제3항 내지 제7항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 제제 투여용인 제약 조성물.
23. 제20항에 있어서, 천연 또는 인공 골을 이용하는 제약 조성물.

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