JP3910000B2

JP3910000B2 - Single base substitution detection method

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Publication number: JP3910000B2
Application number: JP2000087501A
Authority: JP
Inventors: 邦夫堀
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2000-03-27
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2020-03-27
Also published as: JP2001269199A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単一塩基多型(即ち、ＳＮＰｓ)の検出方法に関し、詳しくは、ＤＮＡにおける１塩基置換を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単一塩基多型(Single Nucleotide Polymorpism：以下、ＳＮＰｓと称する)は、塩基配列中の１塩基が置換されていることにより多型性を示す現象を示す。近年、このような１塩基置換の検出が、疾患関連遺伝子の探索や病気の遺伝子診断において重要な意味を有することが明らかになってきた。
【０００３】
現在では、１塩基置換を検出する方法として、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＰおよびＰＣＲ−ＳＳＯ等が主に使用されている。これらの方法は、生じたＰＣＲ産物を電気泳動によって検出するか、または、９６ウェルプレート上に固相したプローブ配列とのハイブリダイゼーション反応を実施することにより検出を行なう方法である。例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、夫々、多型的部位を特異的に増幅するプライマー(sequence-specific-primer)試薬を用いて行なう方法である。この方法は、ＳＮＰｓの判定に頻繁に用いられているが、増幅後、電気泳動で増副産物の存在を確認する必要がある。
【０００４】
また、所謂、ＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイ等を応用したＶＤＡ(High-Density variant detection arrays)技術によるＳＮＰｓの検出も試みられている(Science vol280,15,May 1998)。例えば、ＤＮＡアレイの応用技術である、ＶＤＡ技術では、多数のプローブＤＮＡを高密度に固相基板上に配列し、検体ＤＮＡと固相表面でハイブリダイズする方法である。この方法は、固相表面と検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションであるため効率が悪く、長い反応時間を必要とする。更に、一塩基置換ではそのＴｍ値が殆ど変化しないため、高感度にミスマッチを検出することは不可能である。
【０００５】
以上のように、従来使用される何れの方法も煩雑であり、且つ多量のサンプルを必要とするものであり、その実施には長時間を必要とするものである。また更に、従来の方法により得られる検出結果の精度は、実際に臨床的に用いるには不十分である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、高感度且つ高精度な１塩基置換の検出を簡便に行なうことのできる１塩基置換検出方法を提供することである。また、Ｂ／Ｆ分離、ＰＣＲおよび電気泳動等を必要としない、簡便な１塩基置換検出方法を提供することである。更に、本発明の目的は、少量の検体および試薬を用い、所望に応じて複数の多型部位を同時に検出することが可能な１塩基置換検出方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
１塩基置換検出方法であって、
１）１塩基置換部位を含む検体ＤＮＡ断片と、
前記検体ＤＮＡ断片に含まれると予期される配列に相補的な配列を有し、且つ前記１塩基置換部位に対応する塩基に標識物質が付された少なくとも１種類のＤＮＡプローブと、
をハイブリダイズすることと；および
２）前記ハイブリダイズの進行中において、複数の経過時点で前記標識物質の位置変化を光学的に測定することと；
を具備する検出方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡにおける１塩基置換を検出するための方法である。本発明の方法は、大きく分けて２工程、即ち、反応工程と測定工程とからなる。
【０００９】
前記反応工程は、以下に詳述する通り、検体ＤＮＡと、標識したＤＮＡプローブとをハイブリダイゼーションすることと、得られた二重鎖を校正機能を有する酵素で処理することとを具備する工程である。
【００１０】
一方、前記測定工程は、以下に上述する通り、前記反応工程の反応系で生じた分子の自由な微小運動を測定する工程である。
【００１１】
１．反応工程
以下、本発明の反応工程を図１から３を用いて説明する。しかしながら、これは例示であり、本発明を何ら制限するものではない。
【００１２】
（１）検体ＤＮＡ
図１に、本発明の検体ＤＮＡの１例を模式的に示した。ここでは、検体ＤＮＡが、２つの多型、即ち、多型Ｉと多型ＩＩで存在する場合を例に説明する。多型Ｉと多型ＩＩは、１塩基置換部位を除く他の部分の塩基配列は相同である。また、多型Ｉの１塩基置換部位は、アデニン［以下、塩基（Ａ）またはＡと称し、図中ではＡと示す］であり、多型ＩＩの１塩基置換部位は、グアニン［以下、塩基（Ｇ）またはＧと称し、図中ではＧと示す］とする。
【００１３】
（２）標識ＤＮＡプローブ
次に、図１に示した１塩基置換部位を検出するためのプローブを図２に示す。プローブＩは、多型Ｉの３’末端から１塩基置換部位までの配列に相補的な配列からなり、且つプローブＩの３’末端の塩基（即ち、１塩基置換部位の塩基と対をなす塩基）には、標識物質が付与されている。この例では、プローブＩの３’末端は標識されたチミン［以下、塩基（Ｔ）またはＴと称し、図中ではＴと示す］である。
【００１４】
同様に、プローブＩＩは多型ＩＩの３’末端から１塩基置換部位までの配列に相補的な配列からなり、且つプローブＩＩの３’末端の塩基には標識物質が付与されている。この例では、プローブＩＩの３’末端は標識されたシトシン［以下、塩基（Ｃ）またはＣと称し、図中ではＣと示す］である。
【００１５】
（３）反応工程
本発明の最も簡単な例である第１の態様として、試料中に含まれる検体ＤＮＡが、多型Ｉであるのか、または多型ＩＩであるのかを検出する例を、図３および４に例示し、シュミレートする。また、ここでは試料中に多型Ｉが含まれているとする。
【００１６】
夫々のプローブを２つの容器に添加して試料と反応させる。図３は、容器Ｉで進行する反応を示す。即ち、図３の容器Ｉでは、多型ＩとプローブＩを適切な条件下でハイブリダイズする。それにより、多型ＩとプローブＩは完全マッチする。一方、図４は、容器ＩＩにおいて進行する反応を示す。即ち、図４の容器ＩＩでは、多型ＩとプローブＩＩを適切な条件下でハイブリダイズする。それにより、１塩基置換部位でミスマッチが生じる。
【００１７】
続いて、前記完全マッチの二重鎖とミスマッチの二重鎖に対して、夫々、校正機能を有したＤＮＡポリメラーゼを添加する（図３および４）。その結果、完全マッチの二重鎖に対し、前記ポリメラーゼは活性（即ち、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性）を示さない（図３）。それに対して、前記ポリメラーゼは、多型ＩとプローブＩＩからなる二重鎖の３’末のミスマッチを認識し、ミスマッチの塩基を削除する（図４）。このような酵素活性により、多型ＩにミスマッチしたプローブＩＩの３’末の標識された塩基（Ｃ）が遊離する（図４）。
【００１８】
上述のような反応により得られる標識された分子の自由な微小運動を、後述する測定工程手段により測定する。標識分子の自由な微小運動は、該標識分子の大きさに依存して変化する。従って、標識物質を使用にし、該分子の微小運動を測定することにより標識分子についての情報を得ることが可能である。
【００１９】
（４）用語
ここで使用する「１塩基置換部位」の語は、単一塩基多型間で存在する異なる１塩基の存在する部位または塩基自身を示す。本発明の検出方法では、１つの検体ＤＮＡの配列中に、１塩基置換部位が１つ存在しても、また、それ以上で存在しても測定することが可能である。複数の１塩基置換部位を検出する場合には、複数種類の標識物質を使用することが有利である。
【００２０】
ここで使用する「校正機能を有する核酸合成酵素」の語は、一部分が二重鎖になった塩基配列の３’末のミスマッチを認識し、その塩基を削除し、且つ適切な条件下で核酸を合成して二重鎖を合成する活性を有する酵素をいう。本発明の方法で使用可能な酵素の例は、校正機能を有する核酸合成酵素であり、好ましい酵素の例は、宝酒造により販売されるＥｘ・ＴａｑまたはＬＡ・Ｔａｑ等であるが、これに限られるものではない。
【００２１】
ここで使用する「標識物質」の語は、異なる測定時点において、略一定の出力を維持するような標識材料を示す。例えば、発光性物質、蛍光物質、磁性物質および放射性物質等である。なお、該標識物質は、後述する測定工程で使用する手段に適切な標識物質を選択するべきである。
【００２２】
ここで使用する「自由な微小運動」または「微小運動」とは、ブラウン運動等をいう。
【００２３】
（５）反応工程の他の態様
本発明の検出方法に具備される反応工程の最も簡単な１例は、上述した通りであるが、種々の変更および修飾を行なうことが可能である。例えば、複数の標識物質を用いてもよい。また、標識物質によるプローブの標識は、プローブの３’末だけではなく５’末に対して行なってもよい。また、複数のプローブを１つの容器内で試料に混合して反応を行なうことも可能である。
【００２４】
また、校正機能を有する核酸合成酵素によるミスマッチの認識および切断の後で、該切断部から３’末端方向に塩基配列を延伸することも可能である。その場合、適切な条件を設定し、且つ更に必要な基質および試薬等を更に供給してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する）等によって行なってもよい。しかしながら、該延伸を必ずしも行なう必要はない。
【００２５】
また、上述した反応を行なう前に、ＰＣＲで試料に含有される多型を増幅することも可能である。
【００２６】
２．測定工程
（１）測定原理
上述の反応工程で得られた標識分子の検出は、後述する工程により実施する。本発明の検出方法に具備される測定工程は、前記標識分子を微小視野において顕微鏡的に測定することと、複数の測定データを時間変化のばらつきに応じた統計学的データに変換することと、統計学的データに基づいてハイブリダイゼーション反応の反応曲線を得ることとを具備する。ここで、反応曲線の立ち上がりの高さが核酸分子の個数を表している。
【００２７】
本発明の測定工程が、３次元の微小視野内において実行されることにより、標的分子の試料含有液の中における自由な微小運動を高精度に測定できる。ここで、この測定工程を２次元的な視野内で測定することにより実施した場合、ブラウン運動のように、標識分子の３次元的に自由な移動を漏れなく捕えることができないため測定精度が低くなり、好ましくない。
【００２８】
測定工程の微小視野が共焦点光学系により形成されることにより、被写界深度の深い測定データが得られるので、個々の任意の標識分子が視野内で常に合焦して、正確な位置および出力データを測定手段に供給することができる。
【００２９】
微小視野が、焦点付近の回折限定領域であることにより、個々の標識分子を高いＳ／Ｎ比で測定できる。
【００３０】
回折限定が平均直径１５±５μｍのピンホールにより形成されることにより、少数の選ばれた標識分子からの測定データを高率良く得ることができる。
【００３１】
微小領域が平均半径２００±５０ｎｍおよび光軸上の平均長さ２０００±５００ｎｍの略円柱状領域であることにより、測定視野内に照準された標識分子に関する自由な微小運動を効率良く取得することができる。
【００３２】
本発明の測定工程では、微小の測定視野内を出入りする標識分子の運動速度を、所定空間内において１以上の個々の標識分子から測定される出力強度の増減または消出を指標として測定している。従って、プローブを標識する標識分子の種類は、複数の測定時点において、略一定の出力を維持するような標識材料であるのが好ましい。このような標識分子の材料としては、発光性物質、蛍光性物質、磁性物質および放射性物質等が挙げられる。特に、発光性物質と蛍光物質は、長時間、発光または蛍光を発するような色素を選ぶことが好ましい。標識分子として、発光色素や蛍光色素を有するものを使用すれば、光学的に容易な構成で分子レベルの測定を実施できる。蛍光色素の中では、特に、核酸分子同士の相補的な結合の際に、その相補的結合部分にインターカレートすることによって遊離時とは蛍光特性が変化するものも使用することが可能である。インターカレートに伴ない蛍光特性が変化する蛍光色素としては、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等がある。
【００３３】
測定工程が、蛍光分子の位置変化を測定する場合には、フォトマルチプライヤやフォトダイオード等の蛍光測定手段により蛍光データを受光することができる。蛍光測定手段は、単一フォトンを計測し得るような測定モードを備えている方が、蛍光分子に関する個別の測定を実施するのに有利である。
【００３４】
本測定工程では、標識分子の液対中の揺らぎ運動を測定することにより、標的分子の微小運動を正確に測定することができる。揺らぎ運動の測定を行なうに当たっては、自己相関関数（Autocorrelation function）を用いて演算することが好ましい。特に、標識分子として、蛍光を用いる場合には、自己相関蛍光分光法（Fluoresence Correlation Spectroscopy、以下、ＦＣＳと略する）を採用することが好ましい。
【００３５】
ＦＣＳを用いた生物学的材料に関する測定データの演算手法は、標識された核酸プローブと標的核酸分子とのハイブリダイゼーション反応においてＦＣＳを利用した報告（Dinji,M.,Rigler,R.,Nucleic Acids Research,23,1795-1799,1995 ）を参照することができる。自己相関蛍光分光法および測定データの演算については、更に後段で記述する。
【００３６】
ＦＣＳを用いた測定では、非常に小さな試料体積に含まれる蛍光粒子の数や拡散定数を、略実時間で、分離過程を経ずに求めることが可能である。即ち、Ｂ／Ｆ分離が不要であり、測定に係る時間を短縮することが可能である。また、溶液系で測定することが可能であるため、測定時間を短縮することが可能である。更に、生体分子を自然な状態で測定することが可能である。
【００３７】
（２）測定装置
以下、図５を用いて、ＦＣＳを用いた測定に使用する測定装置について説明する。図５に示したＦＣＳ装置は、共焦点光学系を用いた倒立型の蛍光顕微鏡１と試料からの蛍光を測定するためのフォトマルチプライヤ２と測定データを受信して自己相関関数による演算を行なって数値化またはグラフ化を行なうデータ処理装置３と、演算結果を画面上に表示する表示装置４とを備えている。
【００３８】
試料含有液１１は、図５に示す通り、試料台１２に載せたスライドガラス１３上に点着させることで簡単にセットできる。この装置では、特に、微量の試料含有液１１を用いるため、水分の蒸発を防止するための蓋１４をスライドガラス１３上にかぶせてある。この蓋１４は、好ましくは光透過性が低いものを用いる。これにより気密性と遮光性を同時に得られる。但し、蓋の内面は、励起光線の反射を防止するように、できるだけ光射性の低いものを使用することが好ましい。試料含有液１１が位置するスライドガラス１３部分の真下には、試料含有液１１中で焦点を結ぶように設定した対物レンズ１５が配置される。なお、蛍光顕微鏡１は落射型でもよい。落射型においては、対物レンズ１５のレンズ下面に直接的に試料含有液１１を点着してもよい。また、蛍光顕微鏡１の光源であるレーザ発生装置１６は、図５では、アルゴン（Ａｒ）イオンレーザを使用しているが、蛍光の種類に応じて、クリプトンアルゴン（Ｋｒ−Ａｒ）イオンレーザ、ヘリウムネオン（Ｈｅ−Ｎｅ）レーザ、ヘリウムカドニウム（Ｈｅ−Ｃｄ）レーザ等に種々変更してもよい。また、蛍光顕微鏡１におけるスライドガラス１３の搬入や搬出、スライドガラス１３等への試料含有液の点着、蓋１４の開閉等の各種動作は、必要に応じて適宜自動化してもよい。
【００３９】
図６は、図５の蛍光顕微鏡１の測定部分を示す拡大図である。図６（Ａ）において、スライドガラス１３と所定の開口数（図ではＦＡ＝１．２）の対物レンズ１５との位置関係により、微小視野領域２０が形成される。この微小視野領域２０は、図６（Ｂ）に示すように、実際には、ボリュームを持ったレーザ光線の焦点（図では、中間のくびれた部分）から上下に伸びた略円柱状の視野を有している。この視野領域２０は、焦点を基準位置として、光軸上の長さＺと平均半径Ｙにより規定される。このような、微小領域２０における蛍光測定は、蛍光分子の微小運動を追跡し得る最小の領域にまで小さくすることにより、試料含有液１１の中の焦点付近以外の蛍光分子に由来するノイズを有効に除去し、１個ずつの蛍光分子を正確に測定することを可能にする。
【００４０】
図６に示す通りの長さＬおよび幅Ｗの共焦点顕微鏡の共焦点領域に出入りする蛍光分子の蛍光強度を１分子レベルで捕えると、蛍光強度に揺らぎが検出される。この蛍光強度の揺らぎのデータを自己相関関数で変換し、統計学的データを得ることにより、蛍光分子の分子数および大きさが、分子を分離することなく検出することが可能となる。上述の装置により測定したデータをグラフとして図７に示した。図７のグラフは、縦軸に蛍光強度Ｉ(t)を、横軸は時間(t)を示す。このデータを以下のような自己相関関数で変換すると図８のグラフが得られる。
【００４１】
自己相関関数は、
Ｇ（τ）：Ｇ（τ）＝〈Ｉ（ｔ）Ｉ（ｔ＋τ）〉であり、
これを平均強度〈Ｉ〉の２乗で規格化し展開すると、
【００４２】
【化１】

【００４３】
と近似できる。このとき、τ＝０のときＣ（０）＝１＋１／Ｎ、Ｄ＝拡散定数、Ｎ＝溶液中の分子数である。
【００４４】
３．他の好ましい実施の態様
上述した第１の実施の態様と同様に、しかし、プローブの３’末の塩基分子に付与する標識物質として、プローブの種類毎に、各々蛍光波長の異なる標識物質を付加する。このようなプローブを検体ＤＮＡと混合し、第１の実施の形態と同様にハイブリダイズをし、該酵素により、ミスマッチを起こした塩基の削除を行なう。続いて実施するＦＣＳによる検出の際に、異なる波長により、それぞれ解析を行なえば、どのプローブが完全マッチであるかが明確に分り、それと同時にその３’末の塩基の種別が識別され、何れの多型であるかが分る。その結果、より確実に１塩基置換を検出できる。また、異種蛍光を利用する場合には、励起光の波長を変えることにより、または検出部にフィルターを用いることにより検出光の波長を変えることが可能である。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の１塩基置換検出方法は、簡便且つ短時間で実施することが可能である。この効果は、本発明の独創的な原理に基づく。即ち、本発明は、目的とする検出を、夫々の多型性に特異的なプローブに標識を付して使用して検体ＤＮＡと反応することによって、この反応を分子レベルで捉える。このとき、複数の経過時点で標識物質を測定し、その時間的な位置変化を検出することによって、分子の大きさに依存して変化する位置変化を定量的に検出することが可能になる。従って、従来方法に必要であったＢ／Ｆ分離等の工程や、酵素標識試薬の場合の基質反応等、およびＲＩ標識試薬を用いた場合の放射性感応フィルムへの暴露、並びにＰＣＲおよび電気泳動工程等が不要である。
【００４６】
具体的には、従来の方法では、ＰＣＲが必須であり、また、電気泳動を行なった際に明確な結果を得るためには、その伸長する長さも２００から３００ｂまで行なうことが好ましいとされている。しかしながら、本発明では、電気泳動を必要としないのでＰＣＲを行なう必要はない。しかしながら、より確実性を求めて、ＰＣＲを行なう場合であっても、１０から３０ｂの伸長によって充分に確実なデータを得ることが可能である。
【００４７】
本発明の検出方法は、検体量および試薬量とも非常に少量のみを用いて実施することが可能である。具体的には、検体として用いる試料はフェムトリットル（ｆＬ）レベルで充分である。即ち、これは、上述した通り、本発明の方法における、発光信号の検出領域が、半径２００ｎｍおよび軸長２０００ｎｍの微量領域であるためである。これにより、本検出は、極小型の容器で多数の検体を同時に測定することが可能であり、検査に要する検体量および酵素試薬等の検出に必要な試薬を低減することが可能である。
【００４８】
また、本発明の方法は、同一容器内で異なる多型部位に特異性を有する複数の試薬を混合し、同時に検体に対して処理することが可能である。従って、検体ＤＮＡの必要量の低減、および反応容器数の低減が可能である。また、多型遺伝子検査の検査工程の簡便化が可能である。更に、本検出方法は、少なくともＤＮＡ検体と試薬の混合のみで実施することが可能であるため、全自動のシステム化も可能である。
【００４９】
本発明の検出方法は、高感度に１塩基置換を検出することが可能である。また本方法は、バッググラウンドの影響が少ないホモジニアス系であるため、判定精度が高い。これは本発明の検出原理に基づくものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法で検出する検体ＤＮＡの１例を模式的に示す図。
【図２】本発明の方法で使用するプローブの好ましい１例を模式的に示す図。
【図３】本発明の検出方法を示すスキーム図。
【図４】本発明の検出方法を示すスキーム図。
【図５】本発明の検出方法に用いる装置の好ましい態様を示す図。
【図６】本発明の検出方法に用いる蛍光顕微鏡の測定部分を示す図。
【図７】本発明の検出方法で得られる蛍光強度の時間的変化のデータを示すグラフ。
【図８】図７のデータを自己相関関数で変換した統計学的データを示すグラフ。
【符号の説明】
１．蛍光顕微鏡２．フォトマルチプライヤ３．データ処理装置
４．表示装置１１．試料含有液１２．試料台１３．スライドガラス１４．蓋１５．対物レンズ１６．レーザ発生装置[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting single nucleotide polymorphisms (ie, SNPs), and more particularly, to a method for detecting single base substitution in DNA.
[0002]
[Prior art]
Single nucleotide polymorphism (Single Nucleotide Polymorpism: hereinafter referred to as SNPs) shows a phenomenon that polymorphism is caused by substitution of one base in a nucleotide sequence. In recent years, it has become clear that detection of such single nucleotide substitutions has important implications in the search for disease-related genes and the genetic diagnosis of diseases.
[0003]
At present, PCR-RFLP, PCR-SSP, PCR-SSO and the like are mainly used as methods for detecting single base substitution. In these methods, the generated PCR product is detected by electrophoresis, or detection is performed by performing a hybridization reaction with a probe sequence immobilized on a 96-well plate. For example, the PCR-SSP method is a method performed using a primer (sequence-specific-primer) reagent that specifically amplifies a polymorphic site. This method is frequently used to determine SNPs, but after amplification, it is necessary to confirm the presence of increased by-products by electrophoresis.
[0004]
In addition, detection of SNPs by so-called VDA (High-Density variant detection arrays) technology using a DNA chip or a DNA array has been attempted (Science vol 280, 15, May 1998). For example, VDA technology, which is an applied technology of DNA array, is a method in which a large number of probe DNAs are arranged at high density on a solid phase substrate and hybridized with sample DNA on the solid phase surface. This method is inefficient because of the hybridization between the solid phase surface and the sample DNA, and requires a long reaction time. Furthermore, since the Tm value hardly changes in single base substitution, it is impossible to detect a mismatch with high sensitivity.
[0005]
As described above, any conventionally used method is complicated, requires a large amount of sample, and requires a long time for its implementation. Furthermore, the accuracy of the detection result obtained by the conventional method is insufficient for actual clinical use.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a single-base substitution detection method that can easily detect single-base substitution with high sensitivity and high accuracy. Another object of the present invention is to provide a simple single-base substitution detection method that does not require B / F separation, PCR, electrophoresis and the like. Furthermore, an object of the present invention is to provide a single-base substitution detection method capable of simultaneously detecting a plurality of polymorphic sites as desired using a small amount of specimen and reagent.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
A single base substitution detection method comprising:
1) a sample DNA fragment containing a single base substitution site;
At least one DNA probe having a sequence complementary to a sequence expected to be contained in the sample DNA fragment and having a labeling substance attached to a base corresponding to the one base substitution site;
And 2) optically measuring the positional change of the labeling substance at a plurality of time points during the progress of the hybridization;
It is the detection method which comprises.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a method for detecting single base substitutions in DNA. The method of the present invention is roughly divided into two steps, that is, a reaction step and a measurement step.
[0009]
As described in detail below, the reaction step is a step comprising hybridizing a sample DNA and a labeled DNA probe, and treating the obtained duplex with an enzyme having a calibration function. is there.
[0010]
On the other hand, the measurement step is a step of measuring free minute movement of molecules generated in the reaction system of the reaction step as described above.
[0011]
1. Reaction Step Hereinafter, the reaction step of the present invention will be described with reference to FIGS. However, this is an exemplification, and does not limit the present invention.
[0012]
(1) Sample DNA
FIG. 1 schematically shows an example of the sample DNA of the present invention. Here, a case where the sample DNA exists in two polymorphisms, that is, polymorphism I and polymorphism II will be described as an example. Polymorphism I and polymorphism II are homologous in the base sequence of the other part except for the single base substitution site. The single base substitution site of polymorph I is adenine [hereinafter referred to as base (A) or A, and indicated as A in the figure], and the single base substitution site of polymorph II is guanine [hereinafter referred to as base. (G) or G, indicated as G in the figure].
[0013]
(2) Labeled DNA probe Next, a probe for detecting the 1-base substitution site shown in FIG. 1 is shown in FIG. Probe I consists of a sequence complementary to the sequence from the 3 ′ end of polymorphism I to the 1 base substitution site, and is the base at the 3 ′ end of probe I (ie, the base paired with the base at the 1 base substitution site) ) Is provided with a labeling substance. In this example, the 3 ′ end of probe I is a labeled thymine [hereinafter referred to as base (T) or T, and indicated as T in the figure].
[0014]
Similarly, probe II has a sequence complementary to the sequence from the 3 ′ end of polymorphism II to the 1-base substitution site, and a labeling substance is attached to the base at the 3 ′ end of probe II. In this example, the 3 ′ end of the probe II is labeled cytosine [hereinafter referred to as base (C) or C, and indicated as C in the figure].
[0015]
(3) Reaction process As a first embodiment which is the simplest example of the present invention, an example of detecting whether the sample DNA contained in a sample is polymorph I or polymorph II is shown in FIG. Examples 3 and 4 are simulated. Here, it is assumed that polymorph I is contained in the sample.
[0016]
Each probe is added to two containers and allowed to react with the sample. FIG. 3 shows the reaction proceeding in vessel I. That is, in the container I of FIG. 3, the polymorph I and the probe I are hybridized under appropriate conditions. Thereby, polymorphism I and probe I match completely. On the other hand, FIG. 4 shows the reaction proceeding in the container II. That is, in the container II of FIG. 4, the polymorph I and the probe II are hybridized under appropriate conditions. Thereby, a mismatch occurs at a single base substitution site.
[0017]
Subsequently, a DNA polymerase having a proofreading function is added to the perfectly matched duplex and the mismatched duplex, respectively (FIGS. 3 and 4). As a result, the polymerase does not exhibit activity (ie, 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity) for perfectly matched duplexes (FIG. 3). In contrast, the polymerase recognizes the mismatch at the 3 ′ end of the duplex consisting of polymorphism I and probe II, and deletes the mismatched base (FIG. 4). By such enzyme activity, the labeled base (C) at the 3 ′ end of probe II mismatched with polymorphism I is released (FIG. 4).
[0018]
The free minute movement of the labeled molecule obtained by the reaction as described above is measured by a measurement process means described later. The free minute movement of the label molecule varies depending on the size of the label molecule. Therefore, it is possible to obtain information about a labeled molecule by using a labeling substance and measuring the minute movement of the molecule.
[0019]
(4) Terminology The term “single base substitution site” as used herein indicates a site where a different one base exists between single base polymorphisms or the base itself. In the detection method of the present invention, it is possible to measure whether one single base substitution site is present or more than one site in the sequence of one sample DNA. When detecting a plurality of single-base substitution sites, it is advantageous to use a plurality of types of labeling substances.
[0020]
As used herein, the term “nucleic acid synthase having a proofreading function” refers to a nucleic acid that recognizes a mismatch at the 3 ′ end of a base sequence that is partially double-stranded, deletes the base, and under appropriate conditions. Is an enzyme having the activity of synthesizing a double chain. An example of an enzyme that can be used in the method of the present invention is a nucleic acid synthesizing enzyme having a proofreading function, and examples of a preferable enzyme are Ex · Taq or LA · Taq sold by Takara Shuzo, but are not limited thereto. It is not a thing.
[0021]
As used herein, the term “labeling substance” refers to a labeling material that maintains a substantially constant output at different measurement points. For example, a luminescent substance, a fluorescent substance, a magnetic substance, and a radioactive substance. As the labeling substance, a labeling substance suitable for the means used in the measurement step described later should be selected.
[0022]
As used herein, “free micromotion” or “micromotion” refers to Brownian motion or the like.
[0023]
(5) Other Embodiments of Reaction Step The simplest example of the reaction step included in the detection method of the present invention is as described above, but various changes and modifications can be made. For example, a plurality of labeling substances may be used. The labeling of the probe with a labeling substance may be performed not only on the 3 ′ end of the probe but also on the 5 ′ end. It is also possible to carry out a reaction by mixing a plurality of probes with a sample in one container.
[0024]
It is also possible to extend the base sequence from the cleaved portion toward the 3 ′ end after recognition and cleavage of the mismatch by a nucleic acid synthase having a proofreading function. In that case, appropriate conditions may be set, and further necessary substrates and reagents may be further supplied, or may be performed by polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) or the like. However, it is not always necessary to perform the stretching.
[0025]
It is also possible to amplify the polymorphism contained in the sample by PCR before performing the above-described reaction.
[0026]
2. Measurement Step (1) Measurement Principle Detection of the labeled molecule obtained in the above-described reaction step is performed by the steps described later. The measurement step provided in the detection method of the present invention includes measuring the labeled molecule microscopically in a microscopic field, converting a plurality of measurement data into statistical data corresponding to variations in time change, Obtaining a reaction curve of the hybridization reaction based on the statistical data. Here, the rising height of the reaction curve represents the number of nucleic acid molecules.
[0027]
By performing the measurement process of the present invention in a three-dimensional microscopic field, free micromotion of the target molecule in the sample-containing liquid can be measured with high accuracy. Here, when this measurement process is carried out by measuring in a two-dimensional field of view, the measurement accuracy is low because the three-dimensional free movement of the labeled molecules cannot be captured without omission as in the Brownian motion. It is not preferable.
[0028]
Since the measurement field has a small field of view formed by the confocal optical system, measurement data having a deep depth of field can be obtained. Output data can be supplied to the measuring means.
[0029]
Since the microscopic field is a diffraction limited region near the focal point, individual labeled molecules can be measured with a high S / N ratio.
[0030]
Since the diffraction limitation is formed by pinholes having an average diameter of 15 ± 5 μm, measurement data from a small number of selected labeled molecules can be obtained with high efficiency.
[0031]
Since the minute region is a substantially cylindrical region having an average radius of 200 ± 50 nm and an average length of 2000 ± 500 nm on the optical axis, it is possible to efficiently acquire free minute motion relating to the labeled molecule aimed in the measurement visual field. it can.
[0032]
In the measurement process of the present invention, the movement speed of the label molecules entering and exiting the minute measurement visual field is measured using the increase or decrease or disappearance of the output intensity measured from one or more individual label molecules in a predetermined space as an index. Yes. Therefore, it is preferable that the type of label molecule for labeling the probe is a label material that maintains a substantially constant output at a plurality of measurement points. Examples of such a labeled molecule material include a luminescent substance, a fluorescent substance, a magnetic substance, and a radioactive substance. In particular, for the luminescent substance and the fluorescent substance, it is preferable to select a dye that emits light or fluorescence for a long time. If a labeling molecule having a luminescent dye or a fluorescent dye is used, measurement at the molecular level can be performed with an optically easy configuration. Among the fluorescent dyes, in particular, in the case of complementary binding of nucleic acid molecules, it is possible to use those whose fluorescence characteristics are changed from that of free by intercalating the complementary binding portion. . Examples of fluorescent dyes whose fluorescence characteristics change with intercalation include acridine orange, thiazole orange, oxazole yellow, and rhodamine.
[0033]
When the measurement process measures a change in the position of the fluorescent molecule, the fluorescence data can be received by a fluorescence measuring means such as a photomultiplier or a photodiode. It is advantageous that the fluorescence measurement means has a measurement mode in which a single photon can be measured, in order to perform an individual measurement on a fluorescent molecule.
[0034]
In this measurement step, the minute movement of the target molecule can be accurately measured by measuring the fluctuation movement of the labeled molecule in the liquid pair. In measuring the fluctuation motion, it is preferable to calculate using an autocorrelation function. In particular, when fluorescence is used as the labeling molecule, it is preferable to employ autocorrelation fluorescence spectroscopy (hereinafter abbreviated as FCS).
[0035]
The calculation method for measurement data on biological materials using FCS has been reported using FCS in the hybridization reaction between a labeled nucleic acid probe and a target nucleic acid molecule (Dinji, M., Rigler, R., Nucleic Acids Research). 23,1795-1799, 1995). Autocorrelation fluorescence spectroscopy and calculation of measurement data will be described later.
[0036]
In the measurement using FCS, the number of fluorescent particles contained in a very small sample volume and the diffusion constant can be obtained in substantially real time without going through a separation process. That is, B / F separation is not necessary, and the measurement time can be shortened. In addition, since measurement can be performed in a solution system, the measurement time can be shortened. Furthermore, it is possible to measure biomolecules in a natural state.
[0037]
(2) Measuring apparatus Hereinafter, a measuring apparatus used for measurement using FCS will be described with reference to FIG. The FCS apparatus shown in FIG. 5 receives an inverted fluorescence microscope 1 using a confocal optical system, a photomultiplier 2 for measuring fluorescence from a sample, and measurement data, and performs calculation using an autocorrelation function. A data processing device 3 for digitizing or graphing, and a display device 4 for displaying a calculation result on a screen.
[0038]
As shown in FIG. 5, the sample-containing liquid 11 can be easily set by spotting on the slide glass 13 placed on the sample table 12. In this apparatus, in particular, since a very small amount of the sample-containing liquid 11 is used, a lid 14 for preventing evaporation of moisture is placed on the slide glass 13. The lid 14 is preferably one having a low light transmittance. Thereby, both airtightness and light-shielding property can be obtained at the same time. However, the inner surface of the lid is preferably as low as possible in order to prevent reflection of excitation light. An objective lens 15 set so as to be focused in the sample-containing liquid 11 is disposed immediately below the portion of the slide glass 13 where the sample-containing liquid 11 is located. The fluorescent microscope 1 may be an epi-illumination type. In the epi-illumination type, the sample-containing liquid 11 may be spotted directly on the lower surface of the objective lens 15. Further, in FIG. 5, an argon (Ar) ion laser is used as the laser generator 16 as the light source of the fluorescence microscope 1, but depending on the type of fluorescence, a krypton argon (Kr-Ar) ion laser, helium is used. Various changes may be made to a neon (He—Ne) laser, a helium cadmium (He—Cd) laser, or the like. Further, various operations such as loading and unloading of the slide glass 13 in the fluorescence microscope 1, spotting of the sample-containing liquid on the slide glass 13 and the opening and closing of the lid 14 may be appropriately automated as necessary.
[0039]
FIG. 6 is an enlarged view showing a measurement part of the fluorescence microscope 1 of FIG. In FIG. 6A, a minute visual field region 20 is formed by the positional relationship between the slide glass 13 and the objective lens 15 having a predetermined numerical aperture (FA = 1.2 in the figure). As shown in FIG. 6B, the minute visual field region 20 actually has a substantially cylindrical visual field extending up and down from the focal point of the laser beam having a volume (in the drawing, an intermediate constricted portion). Have. The visual field region 20 is defined by a length Z and an average radius Y on the optical axis with the focal point as a reference position. In such a fluorescence measurement in the micro region 20, noise derived from fluorescent molecules other than the vicinity of the focal point in the sample-containing liquid 11 is effectively reduced by reducing it to the minimum region where the micro movement of the fluorescent molecule can be traced. This makes it possible to accurately measure each fluorescent molecule.
[0040]
When the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal region of the confocal microscope having the length L and the width W as shown in FIG. 6 is captured at the single molecule level, fluctuations in the fluorescence intensity are detected. By converting this fluorescence intensity fluctuation data with an autocorrelation function and obtaining statistical data, the number and size of fluorescent molecules can be detected without separating the molecules. The data measured by the above-described apparatus is shown in FIG. 7 as a graph. In the graph of FIG. 7, the vertical axis represents fluorescence intensity I (t), and the horizontal axis represents time (t). When this data is converted by the following autocorrelation function, the graph of FIG. 8 is obtained.
[0041]
The autocorrelation function is
G (τ): G (τ) = <I (t) I (t + τ)>,
When this is standardized by the square of the average intensity <I> and developed,
[0042]
[Chemical 1]

[0043]
Can be approximated. At this time, when τ = 0, C (0) = 1 + 1 / N, D = diffusion constant, and N = number of molecules in the solution.
[0044]
3. Other Preferred Embodiments As in the first embodiment described above, however, a labeling substance having a different fluorescence wavelength is added for each type of probe as a labeling substance to be attached to the 3 ′ terminal base molecule of the probe. To do. Such a probe is mixed with the sample DNA, hybridized in the same manner as in the first embodiment, and the mismatched base is deleted by the enzyme. In the subsequent detection by FCS, if each analysis is performed with different wavelengths, it is clear which probe is a perfect match, and at the same time, the type of base at the 3 ′ end is identified, You can see if it is polymorphic. As a result, single base substitution can be detected more reliably. In addition, when using different types of fluorescence, it is possible to change the wavelength of the detection light by changing the wavelength of the excitation light or by using a filter in the detection unit.
[0045]
【The invention's effect】
The single base substitution detection method of the present invention can be carried out simply and in a short time. This effect is based on the inventive principle of the present invention. That is, the present invention captures this reaction at the molecular level by reacting with the sample DNA by using the target detection with a label attached to a probe specific to each polymorphism. At this time, it is possible to quantitatively detect the change in position depending on the size of the molecule by measuring the labeling substance at a plurality of time points and detecting the temporal change in position. Therefore, processes such as B / F separation required for conventional methods, substrate reactions in the case of enzyme labeling reagents, exposure to radiosensitive films when using RI labeling reagents, and PCR and electrophoresis processes Etc. are unnecessary.
[0046]
Specifically, in the conventional method, PCR is essential, and in order to obtain a clear result when electrophoresis is performed, it is preferable to extend the length from 200 to 300b. Yes. However, in the present invention, since electrophoresis is not required, it is not necessary to perform PCR. However, even when PCR is performed for more certainty, it is possible to obtain sufficiently reliable data by extension of 10 to 30b.
[0047]
The detection method of the present invention can be carried out using only a very small amount of both sample and reagent. Specifically, the femtoliter (fL) level is sufficient for the sample used as the specimen. That is, as described above, this is because the detection region of the light emission signal in the method of the present invention is a minute region having a radius of 200 nm and an axial length of 2000 nm. As a result, this detection can simultaneously measure a large number of samples in a very small container, and can reduce the amount of sample required for the test and the reagents necessary for detecting the enzyme reagent and the like.
[0048]
In addition, the method of the present invention can mix a plurality of reagents having specificity at different polymorphic sites in the same container and simultaneously process the specimen. Therefore, it is possible to reduce the required amount of sample DNA and the number of reaction vessels. In addition, it is possible to simplify the testing process for polymorphic gene testing. Furthermore, since this detection method can be carried out only by mixing at least a DNA sample and a reagent, a fully automatic system can be realized.
[0049]
The detection method of the present invention can detect single base substitution with high sensitivity. Moreover, since this method is a homogeneous system with little influence of the background, the determination accuracy is high. This is based on the detection principle of the present invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing an example of sample DNA to be detected by the method of the present invention.
FIG. 2 is a diagram schematically showing a preferred example of a probe used in the method of the present invention.
FIG. 3 is a scheme showing the detection method of the present invention.
FIG. 4 is a scheme showing the detection method of the present invention.
FIG. 5 is a view showing a preferred embodiment of an apparatus used in the detection method of the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing a measurement part of a fluorescence microscope used in the detection method of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing temporal change data of fluorescence intensity obtained by the detection method of the present invention.
FIG. 8 is a graph showing statistical data obtained by converting the data of FIG. 7 with an autocorrelation function.
[Explanation of symbols]
1. Fluorescence microscope 2. Photomultiplier Data processing device 4. Display device 11. Sample-containing liquid 12. Sample stage 13. Slide glass14. Lid 15. Objective lens 16. Laser generator

Claims

１塩基置換の検出方法であって、
１）１塩基置換部位を含む検体ＤＮＡと、
前記検体ＤＮＡに含まれる配列に相補的な配列を有し、且つ前記１塩基置換部位に対応する塩基の種類毎に異なる波長を生ずる標識物質が付された複数種類のＤＮＡプローブと、
をハイブリダイズすることと；
２）１）で得られた一部が二重鎖であるＤＮＡ鎖に校正機能を有する核酸合成酵素を反応することと；および
３）２）の反応において、複数の経過時点での前記標識物質の微小運動を光学的に測定することと；
を具備する検出方法。A method for detecting a single base substitution comprising:
1) a sample DNA containing a single base substitution site;
Have a sequence complementary to a sequence contained in the sample DNA, a plurality of types of DNA probes and the labeled substance that different wavelength for each type of the corresponding base to the single base substitution site are attached,
Hybridizing;
2) reacting a nucleic acid synthesizing enzyme having a proofreading function with a DNA strand partially obtained in 1); and 3) in the reaction of 2), the labeling substance at a plurality of time points it and measuring the micromotion optically;
A detection method comprising:

請求項１に記載の１塩基置換の検出方法であって、前記微小運動が共焦点顕微鏡の共焦点領域に出入りする微小運動である検出方法。The method for detecting single-base substitution according to claim 1, wherein the minute motion is a minute motion that enters and exits a confocal region of a confocal microscope.

請求項１または２の何れか１項に記載の１塩基置換の検出方法であって、前記標識物質が発光性物質および蛍光性物質からなる群より選択される物質である検出方法。 The method for detecting single base substitution according to claim 1 or 2 , wherein the labeling substance is a substance selected from the group consisting of a luminescent substance and a fluorescent substance .

請求項２に記載の１塩基置換の検出方法であって、前記標識物質の微小運動を光学的に測定する手段が、該蛍光標識物質分子のブラウン運動を蛍光相関分光法により測定すること手段である検出方法。 3. The method for detecting single base substitution according to claim 2 , wherein the means for optically measuring the minute movement of the labeling substance is a means for measuring the Brownian motion of the fluorescent labeling substance molecule by fluorescence correlation spectroscopy. A detection method.