JP2001269199A - Method for detecting monobasic substitution by fluorescence correlation spectroscopy - Google Patents
Method for detecting monobasic substitution by fluorescence correlation spectroscopyInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、単一塩基多型(即
ち、ＳＮＰｓ)の検出方法に関し、詳しくは、ＤＮＡに
おける１塩基置換を検出する方法に関する。The present invention relates to a method for detecting single nucleotide polymorphisms (ie, SNPs), and more particularly, to a method for detecting a single nucleotide substitution in DNA.
【０００２】[0002]
【従来の技術】単一塩基多型(Single Nucleotide Polym
orpism：以下、ＳＮＰｓと称する)は、塩基配列中の１
塩基が置換されていることにより多型性を示す現象を示
す。近年、このような１塩基置換の検出が、疾患関連遺
伝子の探索や病気の遺伝子診断において重要な意味を有
することが明らかになってきた。2. Description of the Related Art Single Nucleotide Polym
orpism: hereinafter referred to as SNPs)
This shows a phenomenon of polymorphism due to substitution of a base. In recent years, it has become clear that the detection of such a single nucleotide substitution has an important meaning in searching for disease-related genes and genetic diagnosis of diseases.
【０００３】現在では、１塩基置換を検出する方法とし
て、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＰおよびＰＣＲ−
ＳＳＯ等が主に使用されている。これらの方法は、生じ
たＰＣＲ産物を電気泳動によって検出するか、または、
９６ウェルプレート上に固相したプローブ配列とのハイ
ブリダイゼーション反応を実施することにより検出を行
なう方法である。例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、夫々、
多型的部位を特異的に増幅するプライマー(sequence-sp
ecific-primer)試薬を用いて行なう方法である。この方
法は、ＳＮＰｓの判定に頻繁に用いられているが、増幅
後、電気泳動で増副産物の存在を確認する必要がある。At present, methods for detecting single base substitution include PCR-RFLP, PCR-SSP and PCR-RFLP.
SSO and the like are mainly used. These methods detect the resulting PCR product by electrophoresis, or
In this method, detection is carried out by performing a hybridization reaction with a probe sequence immobilized on a 96-well plate. For example, in the PCR-SSP method,
Primers that specifically amplify polymorphic sites (sequence-sp
ecific-primer) reagent. Although this method is frequently used for the determination of SNPs, it is necessary to confirm the presence of the by-product by electrophoresis after amplification.
【０００４】また、所謂、ＤＮＡチップまたはＤＮＡア
レイ等を応用したＶＤＡ(High-Density variant detect
ion arrays)技術によるＳＮＰｓの検出も試みられてい
る(Science vol280,15,May 1998)。例えば、ＤＮＡアレ
イの応用技術である、ＶＤＡ技術では、多数のプローブ
ＤＮＡを高密度に固相基板上に配列し、検体ＤＮＡと固
相表面でハイブリダイズする方法である。この方法は、
固相表面と検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションであ
るため効率が悪く、長い反応時間を必要とする。更に、
一塩基置換ではそのＴｍ値が殆ど変化しないため、高感
度にミスマッチを検出することは不可能である。A so-called VDA (High-Density variant detect) using a DNA chip or a DNA array is also used.
Attempts have also been made to detect SNPs by ion arrays) technology (Science vol 280, 15, May 1998). For example, the VDA technique, which is an applied technique of a DNA array, is a method in which a large number of probe DNAs are arranged on a solid-phase substrate at a high density and hybridized with a sample DNA on a solid-phase surface. This method
Since the hybridization is performed between the solid phase surface and the sample DNA, the efficiency is low and a long reaction time is required. Furthermore,
Since the Tm value hardly changes by single nucleotide substitution, it is impossible to detect a mismatch with high sensitivity.
【０００５】以上のように、従来使用される何れの方法
も煩雑であり、且つ多量のサンプルを必要とするもので
あり、その実施には長時間を必要とするものである。ま
た更に、従来の方法により得られる検出結果の精度は、
実際に臨床的に用いるには不十分である。As described above, any of the methods conventionally used are complicated, require a large amount of samples, and require a long time to carry out. Furthermore, the accuracy of the detection result obtained by the conventional method is
Insufficient for practical clinical use.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、高感度且つ高精度な１塩基置換の検出を簡便に行な
うことのできる１塩基置換検出方法を提供することであ
る。また、Ｂ／Ｆ分離、ＰＣＲおよび電気泳動等を必要
としない、簡便な１塩基置換検出方法を提供することで
ある。更に、本発明の目的は、少量の検体および試薬を
用い、所望に応じて複数の多型部位を同時に検出するこ
とが可能な１塩基置換検出方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a single-base substitution detection method which can easily and simply detect a single-base substitution with high sensitivity. Another object of the present invention is to provide a simple single base substitution detection method that does not require B / F separation, PCR, and electrophoresis. It is a further object of the present invention to provide a single-base substitution detection method that can simultaneously detect a plurality of polymorphic sites as needed using a small amount of a sample and a reagent.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明は、１塩基置換検
出方法であって、 １）１塩基置換部位を含む検体ＤＮＡ断片と、前記検体
ＤＮＡ断片に含まれると予期される配列に相補的な配列
を有し、且つ前記１塩基置換部位に対応する塩基に標識
物質が付された少なくとも１種類のＤＮＡプローブと、
をハイブリダイズすることと；および ２）前記ハイブリダイズの進行中において、複数の経過
時点で前記標識物質の位置変化を光学的に測定すること
と；を具備する検出方法である。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a method for detecting a single nucleotide substitution, comprising the steps of: 1) complementary to a sample DNA fragment containing a single nucleotide replacement site and a sequence expected to be contained in the sample DNA fragment; At least one type of DNA probe having a unique sequence, and a labeling substance attached to a base corresponding to the single base substitution site;
And 2) optically measuring a change in the position of the labeling substance at a plurality of points in time during the progress of the hybridization.
【０００８】[0008]
【発明の実施の形態】本発明は、ＤＮＡにおける１塩基
置換を検出するための方法である。本発明の方法は、大
きく分けて２工程、即ち、反応工程と測定工程とからな
る。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention is a method for detecting single base substitution in DNA. The method of the present invention is roughly divided into two steps, namely, a reaction step and a measurement step.
【０００９】前記反応工程は、以下に詳述する通り、検
体ＤＮＡと、標識したＤＮＡプローブとをハイブリダイ
ゼーションすることと、得られた二重鎖を校正機能を有
する酵素で処理することとを具備する工程である。[0009] The reaction step comprises, as described in detail below, hybridization of a sample DNA and a labeled DNA probe, and treatment of the obtained double strand with an enzyme having a proofreading function. This is the step of performing
【００１０】一方、前記測定工程は、以下に上述する通
り、前記反応工程の反応系で生じた分子の自由な微小運
動を測定する工程である。On the other hand, the measurement step is a step of measuring the free minute movement of molecules generated in the reaction system of the reaction step as described above.
【００１１】１．反応工程 以下、本発明の反応工程を図１から３を用いて説明す
る。しかしながら、これは例示であり、本発明を何ら制
限するものではない。1. Reaction Step Hereinafter, the reaction step of the present invention will be described with reference to FIGS. However, this is only an example and does not limit the present invention in any way.
【００１２】（１）検体ＤＮＡ 図１に、本発明の検体ＤＮＡの１例を模式的に示した。
ここでは、検体ＤＮＡが、２つの多型、即ち、多型Ｉと
多型ＩＩで存在する場合を例に説明する。多型Ｉと多型
ＩＩは、１塩基置換部位を除く他の部分の塩基配列は相
同である。また、多型Ｉの１塩基置換部位は、アデニン
［以下、塩基（Ａ）またはＡと称し、図中ではＡと示
す］であり、多型ＩＩの１塩基置換部位は、グアニン
［以下、塩基（Ｇ）またはＧと称し、図中ではＧと示
す］とする。(1) Sample DNA FIG. 1 schematically shows one example of the sample DNA of the present invention.
Here, the case where the sample DNA exists in two polymorphisms, that is, polymorphism I and polymorphism II, will be described as an example. Polymorphism I and polymorphism II have the same nucleotide sequence except for the single nucleotide substitution site. In addition, the single base substitution site of polymorph I is adenine [hereinafter, referred to as base (A) or A and indicated as A in the figure], and the single base substitution site of polymorph II is guanine [hereinafter, base (G) or G, and shown as G in the figure].
【００１３】（２）標識ＤＮＡプローブ 次に、図１に示した１塩基置換部位を検出するためのプ
ローブを図２に示す。プローブＩは、多型Ｉの３’末端
から１塩基置換部位までの配列に相補的な配列からな
り、且つプローブＩの３’末端の塩基（即ち、１塩基置
換部位の塩基と対をなす塩基）には、標識物質が付与さ
れている。この例では、プローブＩの３’末端は標識さ
れたチミン［以下、塩基（Ｔ）またはＴと称し、図中で
はＴと示す］である。(2) Labeled DNA Probe Next, FIG. 2 shows a probe for detecting the single base substitution site shown in FIG. Probe I has a sequence complementary to the sequence from the 3 'end of polymorphism I to the one-base substitution site, and has a base at the 3' end of probe I (that is, a base paired with the base at the one-base substitution site). ) Is provided with a labeling substance. In this example, the 3 ′ end of probe I is labeled thymine [hereinafter referred to as base (T) or T, and shown as T in the figure].
【００１４】同様に、プローブＩＩは多型ＩＩの３’末
端から１塩基置換部位までの配列に相補的な配列からな
り、且つプローブＩＩの３’末端の塩基には標識物質が
付与されている。この例では、プローブＩＩの３’末端
は標識されたシトシン［以下、塩基（Ｃ）またはＣと称
し、図中ではＣと示す］である。Similarly, probe II has a sequence complementary to the sequence from the 3 'end of polymorphism II to the one-base substitution site, and a labeling substance is added to the base at the 3' end of probe II. . In this example, the 3 ′ end of probe II is labeled cytosine [hereinafter, referred to as base (C) or C, and shown as C in the figure].
【００１５】（３）反応工程 本発明の最も簡単な例である第１の態様として、試料中
に含まれる検体ＤＮＡが、多型Ｉであるのか、または多
型ＩＩであるのかを検出する例を、図３および４に例示
し、シュミレートする。また、ここでは試料中に多型Ｉ
が含まれているとする。(3) Reaction Step In the first embodiment, which is the simplest example of the present invention, an example of detecting whether the specimen DNA contained in a sample is polymorph I or polymorph II Is illustrated and simulated in FIGS. Here, the polymorph I
Is included.
【００１６】夫々のプローブを２つの容器に添加して試
料と反応させる。図３は、容器Ｉで進行する反応を示
す。即ち、図３の容器Ｉでは、多型ＩとプローブＩを適
切な条件下でハイブリダイズする。それにより、多型Ｉ
とプローブＩは完全マッチする。一方、図４は、容器Ｉ
Ｉにおいて進行する反応を示す。即ち、図４の容器ＩＩ
では、多型ＩとプローブＩＩを適切な条件下でハイブリ
ダイズする。それにより、１塩基置換部位でミスマッチ
が生じる。Each probe is added to two containers and reacted with a sample. FIG. 3 shows the reaction proceeding in Vessel I. That is, in the container I of FIG. 3, the polymorph I and the probe I are hybridized under appropriate conditions. Thereby, polymorphism I
And probe I match perfectly. On the other hand, FIG.
I shows the reaction proceeding in I. That is, the container II of FIG.
Then, polymorph I and probe II are hybridized under appropriate conditions. This causes a mismatch at the single base substitution site.
【００１７】続いて、前記完全マッチの二重鎖とミスマ
ッチの二重鎖に対して、夫々、校正機能を有したＤＮＡ
ポリメラーゼを添加する（図３および４）。その結果、
完全マッチの二重鎖に対し、前記ポリメラーゼは活性
（即ち、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性）を示さな
い（図３）。それに対して、前記ポリメラーゼは、多型
ＩとプローブＩＩからなる二重鎖の３’末のミスマッチ
を認識し、ミスマッチの塩基を削除する（図４）。この
ような酵素活性により、多型Ｉにミスマッチしたプロー
ブＩＩの３’末の標識された塩基（Ｃ）が遊離する（図
４）。Subsequently, a DNA having a proofreading function is provided for each of the perfect-matched duplex and the mismatched duplex.
Add polymerase (FIGS. 3 and 4). as a result,
The polymerase shows no activity (ie, 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity) on a perfectly matched duplex (FIG. 3). On the other hand, the polymerase recognizes a mismatch at the 3 ′ end of the duplex consisting of polymorphism I and probe II and deletes the mismatched base (FIG. 4). Due to such enzyme activity, the labeled base (C) at the 3 ′ end of probe II mismatched with polymorph I is released (FIG. 4).
【００１８】上述のような反応により得られる標識され
た分子の自由な微小運動を、後述する測定工程手段によ
り測定する。標識分子の自由な微小運動は、該標識分子
の大きさに依存して変化する。従って、標識物質を使用
にし、該分子の微小運動を測定することにより標識分子
についての情報を得ることが可能である。The free minute movement of the labeled molecule obtained by the above-mentioned reaction is measured by a measuring means described later. The free micromotion of the label molecule changes depending on the size of the label molecule. Therefore, it is possible to obtain information on a labeled molecule by using a labeling substance and measuring the micromotion of the molecule.
【００１９】（４）用語 ここで使用する「１塩基置換部位」の語は、単一塩基多
型間で存在する異なる１塩基の存在する部位または塩基
自身を示す。本発明の検出方法では、１つの検体ＤＮＡ
の配列中に、１塩基置換部位が１つ存在しても、また、
それ以上で存在しても測定することが可能である。複数
の１塩基置換部位を検出する場合には、複数種類の標識
物質を使用することが有利である。(4) Term The term "single nucleotide substitution site" as used herein indicates a site where a different single base exists between single nucleotide polymorphisms or the base itself. In the detection method of the present invention, one sample DNA
Even if there is one single base substitution site in the sequence of
It is possible to measure even if there is more than that. When detecting a plurality of single base substitution sites, it is advantageous to use a plurality of types of labeling substances.
【００２０】ここで使用する「校正機能を有する核酸合
成酵素」の語は、一部分が二重鎖になった塩基配列の
３’末のミスマッチを認識し、その塩基を削除し、且つ
適切な条件下で核酸を合成して二重鎖を合成する活性を
有する酵素をいう。本発明の方法で使用可能な酵素の例
は、校正機能を有する核酸合成酵素であり、好ましい酵
素の例は、宝酒造により販売されるＥｘ・Ｔａｑまたは
ＬＡ・Ｔａｑ等であるが、これに限られるものではな
い。As used herein, the term "nucleic acid synthase having a proofreading function" refers to the recognition of a mismatch at the 3 'end of a partially double-stranded base sequence, deletion of the base, and appropriate conditions. An enzyme having the activity of synthesizing a nucleic acid below to synthesize a double strand. An example of an enzyme that can be used in the method of the present invention is a nucleic acid synthase having a proofreading function, and an example of a preferable enzyme is Ex Taq or LA Taq sold by Takara Shuzo, but is not limited thereto. Not something.
【００２１】ここで使用する「標識物質」の語は、異な
る測定時点において、略一定の出力を維持するような標
識材料を示す。例えば、発光性物質、蛍光物質、磁性物
質および放射性物質等である。なお、該標識物質は、後
述する測定工程で使用する手段に適切な標識物質を選択
するべきである。The term "labeling substance" as used herein refers to a labeling material that maintains a substantially constant output at different measurement times. For example, a light-emitting substance, a fluorescent substance, a magnetic substance, a radioactive substance, and the like. As the labeling substance, a labeling substance appropriate for the means used in the measurement step described later should be selected.
【００２２】ここで使用する「自由な微小運動」または
「微小運動」とは、ブラウン運動等をいう。As used herein, "free micromotion" or "micromotion" refers to Brownian motion and the like.
【００２３】（５）反応工程の他の態様 本発明の検出方法に具備される反応工程の最も簡単な１
例は、上述した通りであるが、種々の変更および修飾を
行なうことが可能である。例えば、複数の標識物質を用
いてもよい。また、標識物質によるプローブの標識は、
プローブの３’末だけではなく５’末に対して行なって
もよい。また、複数のプローブを１つの容器内で試料に
混合して反応を行なうことも可能である。(5) Another embodiment of the reaction step The simplest one of the reaction steps provided in the detection method of the present invention.
Examples are as described above, but various changes and modifications can be made. For example, a plurality of labeling substances may be used. In addition, the labeling of the probe with the labeling substance,
It may be performed not only on the 3 'end but also on the 5' end of the probe. Further, it is also possible to perform a reaction by mixing a plurality of probes with a sample in one container.
【００２４】また、校正機能を有する核酸合成酵素によ
るミスマッチの認識および切断の後で、該切断部から
３’末端方向に塩基配列を延伸することも可能である。
その場合、適切な条件を設定し、且つ更に必要な基質お
よび試薬等を更に供給してもよく、ポリメラーゼ連鎖反
応（以下、ＰＣＲと称する）等によって行なってもよ
い。しかしながら、該延伸を必ずしも行なう必要はな
い。After recognition and cleavage of a mismatch by a nucleic acid synthase having a proofreading function, it is also possible to extend the base sequence in the direction of the 3 ′ end from the cleavage site.
In that case, appropriate conditions may be set, and further necessary substrates and reagents may be further supplied, or the reaction may be performed by polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR) or the like. However, the stretching need not necessarily be performed.
【００２５】また、上述した反応を行なう前に、ＰＣＲ
で試料に含有される多型を増幅することも可能である。Before performing the above-mentioned reaction, the PCR
It is also possible to amplify the polymorphism contained in the sample with.
【００２６】２．測定工程 （１）測定原理 上述の反応工程で得られた標識分子の検出は、後述する
工程により実施する。本発明の検出方法に具備される測
定工程は、前記標識分子を微小視野において顕微鏡的に
測定することと、複数の測定データを時間変化のばらつ
きに応じた統計学的データに変換することと、統計学的
データに基づいてハイブリダイゼーション反応の反応曲
線を得ることとを具備する。ここで、反応曲線の立ち上
がりの高さが核酸分子の個数を表している。2. Measurement Step (1) Measurement Principle The detection of the labeled molecule obtained in the above-described reaction step is performed by the steps described later. The measurement step included in the detection method of the present invention is to microscopically measure the labeled molecule in a microscopic field, and to convert a plurality of measurement data into statistical data according to variation in time change, Obtaining a reaction curve of the hybridization reaction based on the statistical data. Here, the height of the rise of the reaction curve represents the number of nucleic acid molecules.
【００２７】本発明の測定工程が、３次元の微小視野内
において実行されることにより、標的分子の試料含有液
の中における自由な微小運動を高精度に測定できる。こ
こで、この測定工程を２次元的な視野内で測定すること
により実施した場合、ブラウン運動のように、標識分子
の３次元的に自由な移動を漏れなく捕えることができな
いため測定精度が低くなり、好ましくない。By performing the measurement step of the present invention within a three-dimensional microscopic field, a free micromotion of a target molecule in a sample-containing liquid can be measured with high accuracy. Here, when this measurement step is performed by measuring in a two-dimensional field of view, the measurement accuracy is low because the three-dimensional free movement of the labeled molecule cannot be completely captured like the Brownian motion. Is not preferred.
【００２８】測定工程の微小視野が共焦点光学系により
形成されることにより、被写界深度の深い測定データが
得られるので、個々の任意の標識分子が視野内で常に合
焦して、正確な位置および出力データを測定手段に供給
することができる。Since the microscopic field of the measuring process is formed by the confocal optical system, measurement data with a large depth of field can be obtained. Position and output data can be supplied to the measuring means.
【００２９】微小視野が、焦点付近の回折限定領域であ
ることにより、個々の標識分子を高いＳ／Ｎ比で測定で
きる。Since the microscopic field is a diffraction limited area near the focal point, individual labeled molecules can be measured with a high S / N ratio.
【００３０】回折限定が平均直径１５±５μｍのピンホ
ールにより形成されることにより、少数の選ばれた標識
分子からの測定データを高率良く得ることができる。Since the diffraction limitation is formed by pinholes having an average diameter of 15 ± 5 μm, measurement data from a small number of selected labeled molecules can be obtained with high efficiency.
【００３１】微小領域が平均半径２００±５０ｎｍおよ
び光軸上の平均長さ２０００±５００ｎｍの略円柱状領
域であることにより、測定視野内に照準された標識分子
に関する自由な微小運動を効率良く取得することができ
る。Since the micro-area is a substantially cylindrical area having an average radius of 200 ± 50 nm and an average length of 2000 ± 500 nm on the optical axis, free micro-motion of the labeled molecule aimed in the measurement visual field can be efficiently obtained. can do.
【００３２】本発明の測定工程では、微小の測定視野内
を出入りする標識分子の運動速度を、所定空間内におい
て１以上の個々の標識分子から測定される出力強度の増
減または消出を指標として測定している。従って、プロ
ーブを標識する標識分子の種類は、複数の測定時点にお
いて、略一定の出力を維持するような標識材料であるの
が好ましい。このような標識分子の材料としては、発光
性物質、蛍光性物質、磁性物質および放射性物質等が挙
げられる。特に、発光性物質と蛍光物質は、長時間、発
光または蛍光を発するような色素を選ぶことが好まし
い。標識分子として、発光色素や蛍光色素を有するもの
を使用すれば、光学的に容易な構成で分子レベルの測定
を実施できる。蛍光色素の中では、特に、核酸分子同士
の相補的な結合の際に、その相補的結合部分にインター
カレートすることによって遊離時とは蛍光特性が変化す
るものも使用することが可能である。インターカレート
に伴ない蛍光特性が変化する蛍光色素としては、アクリ
ジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエ
ロー、ローダミン等がある。In the measurement step of the present invention, the velocity of movement of a labeled molecule entering and exiting a minute measurement field of view is determined by using, as an index, the increase or decrease or disappearance of the output intensity measured from one or more individual labeled molecules in a predetermined space. Measuring. Therefore, it is preferable that the kind of the labeling molecule that labels the probe is a labeling material that maintains a substantially constant output at a plurality of measurement points. Examples of the material for such a labeling molecule include a luminescent substance, a fluorescent substance, a magnetic substance, and a radioactive substance. In particular, as the luminescent substance and the fluorescent substance, it is preferable to select a dye that emits light or emits fluorescence for a long time. If a molecule having a luminescent dye or a fluorescent dye is used as the labeling molecule, measurement at the molecular level can be performed with an optically easy configuration. Among the fluorescent dyes, it is possible to use, in particular, those that change their fluorescence characteristics when they are released by intercalating into the complementary binding part at the time of complementary binding between nucleic acid molecules. . Fluorescent dyes whose fluorescent properties change with intercalation include acridine orange, thiazole orange, oxazole yellow, rhodamine and the like.
【００３３】測定工程が、蛍光分子の位置変化を測定す
る場合には、フォトマルチプライヤやフォトダイオード
等の蛍光測定手段により蛍光データを受光することがで
きる。蛍光測定手段は、単一フォトンを計測し得るよう
な測定モードを備えている方が、蛍光分子に関する個別
の測定を実施するのに有利である。When the measurement step measures a change in the position of the fluorescent molecule, the fluorescent data can be received by a fluorescent measuring means such as a photomultiplier or a photodiode. It is advantageous for the fluorescence measurement means to have a measurement mode capable of measuring a single photon, in order to perform individual measurements on fluorescent molecules.
【００３４】本測定工程では、標識分子の液対中の揺ら
ぎ運動を測定することにより、標的分子の微小運動を正
確に測定することができる。揺らぎ運動の測定を行なう
に当たっては、自己相関関数（Autocorrelation functi
on）を用いて演算することが好ましい。特に、標識分子
として、蛍光を用いる場合には、自己相関蛍光分光法
（Fluoresence Correlation Spectroscopy、以下、ＦＣ
Ｓと略する）を採用することが好ましい。In this measurement step, the minute movement of the target molecule can be accurately measured by measuring the fluctuation movement of the labeled molecule in the liquid. In measuring fluctuation motion, an autocorrelation function (Autocorrelation functi
It is preferable to calculate using (on). In particular, when fluorescence is used as a labeling molecule, autocorrelation fluorescence spectroscopy (hereinafter referred to as FC
It is preferable to employ S (abbreviated as S).
【００３５】ＦＣＳを用いた生物学的材料に関する測定
データの演算手法は、標識された核酸プローブと標的核
酸分子とのハイブリダイゼーション反応においてＦＣＳ
を利用した報告（Dinji,M.,Rigler,R.,Nucleic Acids R
esearch,23,1795-1799,1995）を参照することができ
る。自己相関蛍光分光法および測定データの演算につい
ては、更に後段で記述する。The method of calculating measurement data on biological materials using FCS is based on FCS in a hybridization reaction between a labeled nucleic acid probe and a target nucleic acid molecule.
(Dinji, M., Rigler, R., Nucleic Acids R
esearch, 23, 1795-1799, 1995). The autocorrelation fluorescence spectroscopy and the calculation of the measurement data will be described later.
【００３６】ＦＣＳを用いた測定では、非常に小さな試
料体積に含まれる蛍光粒子の数や拡散定数を、略実時間
で、分離過程を経ずに求めることが可能である。即ち、
Ｂ／Ｆ分離が不要であり、測定に係る時間を短縮するこ
とが可能である。また、溶液系で測定することが可能で
あるため、測定時間を短縮することが可能である。更
に、生体分子を自然な状態で測定することが可能であ
る。In the measurement using FCS, the number and diffusion constant of the fluorescent particles contained in a very small sample volume can be obtained in substantially real time without going through a separation process. That is,
No B / F separation is required, and the time required for measurement can be reduced. In addition, since measurement can be performed in a solution system, measurement time can be reduced. Furthermore, it is possible to measure biomolecules in a natural state.
【００３７】（２）測定装置 以下、図５を用いて、ＦＣＳを用いた測定に使用する測
定装置について説明する。図５に示したＦＣＳ装置は、
共焦点光学系を用いた倒立型の蛍光顕微鏡１と試料から
の蛍光を測定するためのフォトマルチプライヤ２と測定
データを受信して自己相関関数による演算を行なって数
値化またはグラフ化を行なうデータ処理装置３と、演算
結果を画面上に表示する表示装置４とを備えている。(2) Measuring Apparatus A measuring apparatus used for measurement using FCS will be described below with reference to FIG. The FCS device shown in FIG.
An inverted fluorescence microscope 1 using a confocal optical system, a photomultiplier 2 for measuring fluorescence from a sample, and data for receiving measurement data and performing calculation by an autocorrelation function to digitize or graph. The apparatus includes a processing device 3 and a display device 4 for displaying a calculation result on a screen.
【００３８】試料含有液１１は、図５に示す通り、試料
台１２に載せたスライドガラス１３上に点着させること
で簡単にセットできる。この装置では、特に、微量の試
料含有液１１を用いるため、水分の蒸発を防止するため
の蓋１４をスライドガラス１３上にかぶせてある。この
蓋１４は、好ましくは光透過性が低いものを用いる。こ
れにより気密性と遮光性を同時に得られる。但し、蓋の
内面は、励起光線の反射を防止するように、できるだけ
光射性の低いものを使用することが好ましい。試料含有
液１１が位置するスライドガラス１３部分の真下には、
試料含有液１１中で焦点を結ぶように設定した対物レン
ズ１５が配置される。なお、蛍光顕微鏡１は落射型でも
よい。落射型においては、対物レンズ１５のレンズ下面
に直接的に試料含有液１１を点着してもよい。また、蛍
光顕微鏡１の光源であるレーザ発生装置１６は、図５で
は、アルゴン（Ａｒ）イオンレーザを使用しているが、
蛍光の種類に応じて、クリプトンアルゴン（Ｋｒ−Ａ
ｒ）イオンレーザ、ヘリウムネオン（Ｈｅ−Ｎｅ）レー
ザ、ヘリウムカドニウム（Ｈｅ−Ｃｄ）レーザ等に種々
変更してもよい。また、蛍光顕微鏡１におけるスライド
ガラス１３の搬入や搬出、スライドガラス１３等への試
料含有液の点着、蓋１４の開閉等の各種動作は、必要に
応じて適宜自動化してもよい。As shown in FIG. 5, the sample-containing liquid 11 can be easily set by being spotted on a slide glass 13 placed on a sample table 12. In this apparatus, in particular, since a small amount of the sample-containing liquid 11 is used, a lid 14 for preventing evaporation of water is put on the slide glass 13. The lid 14 preferably has low light transmittance. Thereby, airtightness and light shielding properties can be obtained at the same time. However, it is preferable to use an inner surface of the lid having as low a light emitting property as possible so as to prevent reflection of the excitation light. Immediately below the slide glass 13 where the sample-containing liquid 11 is located,
An objective lens 15 set to be focused in the sample-containing liquid 11 is arranged. Note that the fluorescence microscope 1 may be of an epi-illumination type. In the epi-illumination type, the sample-containing liquid 11 may be directly spotted on the lower surface of the objective lens 15. Further, in FIG. 5, the laser generator 16 as a light source of the fluorescence microscope 1 uses an argon (Ar) ion laser,
Depending on the type of fluorescence, krypton argon (Kr-A
r) It may be variously changed to an ion laser, a helium neon (He-Ne) laser, a helium cadmium (He-Cd) laser, or the like. Various operations such as loading and unloading of the slide glass 13, spotting of the sample-containing liquid onto the slide glass 13, and the opening and closing of the lid 14 in the fluorescence microscope 1 may be appropriately automated as necessary.
【００３９】図６は、図５の蛍光顕微鏡１の測定部分を
示す拡大図である。図６（Ａ）において、スライドガラ
ス１３と所定の開口数（図ではＦＡ＝１．２）の対物レ
ンズ１５との位置関係により、微小視野領域２０が形成
される。この微小視野領域２０は、図６（Ｂ）に示すよ
うに、実際には、ボリュームを持ったレーザ光線の焦点
（図では、中間のくびれた部分）から上下に伸びた略円
柱状の視野を有している。この視野領域２０は、焦点を
基準位置として、光軸上の長さＺと平均半径Ｙにより規
定される。このような、微小領域２０における蛍光測定
は、蛍光分子の微小運動を追跡し得る最小の領域にまで
小さくすることにより、試料含有液１１の中の焦点付近
以外の蛍光分子に由来するノイズを有効に除去し、１個
ずつの蛍光分子を正確に測定することを可能にする。FIG. 6 is an enlarged view showing a measurement portion of the fluorescence microscope 1 of FIG. In FIG. 6A, a minute visual field region 20 is formed by the positional relationship between the slide glass 13 and the objective lens 15 having a predetermined numerical aperture (FA = 1.2 in the figure). As shown in FIG. 6B, the microscopic field region 20 actually has a substantially columnar visual field extending vertically from the focal point of the laser beam having a volume (in the figure, an intermediate constricted portion). Have. The visual field region 20 is defined by a length Z and an average radius Y on the optical axis with the focus as a reference position. In such a fluorescence measurement in the minute region 20, the noise derived from the fluorescence molecules other than the vicinity of the focal point in the sample-containing liquid 11 is effectively reduced by reducing the fluorescence to a minimum region where the minute movement of the fluorescent molecule can be traced. To enable accurate measurement of fluorescent molecules one by one.
【００４０】図６に示す通りの長さＬおよび幅Ｗの共焦
点顕微鏡の共焦点領域に出入りする蛍光分子の蛍光強度
を１分子レベルで捕えると、蛍光強度に揺らぎが検出さ
れる。この蛍光強度の揺らぎのデータを自己相関関数で
変換し、統計学的データを得ることにより、蛍光分子の
分子数および大きさが、分子を分離することなく検出す
ることが可能となる。上述の装置により測定したデータ
をグラフとして図７に示した。図７のグラフは、縦軸に
蛍光強度Ｉ(t)を、横軸は時間(t)を示す。このデータを
以下のような自己相関関数で変換すると図８のグラフが
得られる。When the fluorescence intensity of the fluorescent molecules entering and exiting the confocal region of the confocal microscope having the length L and the width W as shown in FIG. 6 is captured at the level of one molecule, fluctuations in the fluorescence intensity are detected. By converting the data of the fluctuation of the fluorescence intensity with the autocorrelation function and obtaining the statistical data, the number and size of the fluorescent molecules can be detected without separating the molecules. FIG. 7 is a graph showing data measured by the above-described apparatus. In the graph of FIG. 7, the vertical axis represents the fluorescence intensity I (t), and the horizontal axis represents time (t). When this data is converted by the following autocorrelation function, a graph shown in FIG. 8 is obtained.
【００４１】自己相関関数は、Ｇ（τ）：Ｇ（τ）＝
〈Ｉ（ｔ）Ｉ（ｔ＋τ）〉であり、これを平均強度
〈Ｉ〉の２乗で規格化し展開すると、The autocorrelation function is G (τ): G (τ) =
<I (t) I (t + τ)>, which is normalized by the square of the average intensity <I> and expanded,
【００４２】[0042]
【化１】 Embedded image
【００４３】と近似できる。このとき、τ＝０のときＣ
（０）＝１＋１／Ｎ、Ｄ＝拡散定数、Ｎ＝溶液中の分子
数である。Can be approximated. At this time, when τ = 0, C
(0) = 1 + 1 / N, D = diffusion constant, N = number of molecules in solution.
【００４４】３．他の好ましい実施の態様 上述した第１の実施の態様と同様に、しかし、プローブ
の３’末の塩基分子に付与する標識物質として、プロー
ブの種類毎に、各々蛍光波長の異なる標識物質を付加す
る。このようなプローブを検体ＤＮＡと混合し、第１の
実施の形態と同様にハイブリダイズをし、該酵素によ
り、ミスマッチを起こした塩基の削除を行なう。続いて
実施するＦＣＳによる検出の際に、異なる波長により、
それぞれ解析を行なえば、どのプローブが完全マッチで
あるかが明確に分り、それと同時にその３’末の塩基の
種別が識別され、何れの多型であるかが分る。その結
果、より確実に１塩基置換を検出できる。また、異種蛍
光を利用する場合には、励起光の波長を変えることによ
り、または検出部にフィルターを用いることにより検出
光の波長を変えることが可能である。3. Other Preferred Embodiments Similar to the first embodiment described above, but as the labeling substance to be added to the base molecule at the 3 'end of the probe, a labeling substance having a different fluorescence wavelength is added for each type of probe. I do. Such a probe is mixed with a sample DNA, hybridized in the same manner as in the first embodiment, and a base having a mismatch is deleted by the enzyme. During subsequent detection by FCS, different wavelengths
When each analysis is performed, it is clear which probe is a perfect match, and at the same time, the type of the base at the 3 ′ end is identified, and which polymorphism is known. As a result, single base substitution can be detected more reliably. In the case where different types of fluorescence are used, the wavelength of the detection light can be changed by changing the wavelength of the excitation light or by using a filter in the detection unit.
【００４５】[0045]
【発明の効果】本発明の１塩基置換検出方法は、簡便且
つ短時間で実施することが可能である。この効果は、本
発明の独創的な原理に基づく。即ち、本発明は、目的と
する検出を、夫々の多型性に特異的なプローブに標識を
付して使用して検体ＤＮＡと反応することによって、こ
の反応を分子レベルで捉える。このとき、複数の経過時
点で標識物質を測定し、その時間的な位置変化を検出す
ることによって、分子の大きさに依存して変化する位置
変化を定量的に検出することが可能になる。従って、従
来方法に必要であったＢ／Ｆ分離等の工程や、酵素標識
試薬の場合の基質反応等、およびＲＩ標識試薬を用いた
場合の放射性感応フィルムへの暴露、並びにＰＣＲおよ
び電気泳動工程等が不要である。The method for detecting single base substitution of the present invention can be carried out simply and in a short time. This effect is based on the inventive principle of the present invention. That is, the present invention captures this reaction at the molecular level by using the target detection with a probe specific to each polymorphism and labeling it to react with the sample DNA. At this time, by measuring the labeling substance at a plurality of lapses and detecting a temporal change in the position, it is possible to quantitatively detect a positional change that changes depending on the size of the molecule. Therefore, steps such as B / F separation and the like required for the conventional method, substrate reactions in the case of enzyme-labeled reagents, and exposure to radioactive films using RI-labeled reagents, and PCR and electrophoresis steps Is unnecessary.
【００４６】具体的には、従来の方法では、ＰＣＲが必
須であり、また、電気泳動を行なった際に明確な結果を
得るためには、その伸長する長さも２００から３００ｂ
まで行なうことが好ましいとされている。しかしなが
ら、本発明では、電気泳動を必要としないのでＰＣＲを
行なう必要はない。しかしながら、より確実性を求め
て、ＰＣＲを行なう場合であっても、１０から３０ｂの
伸長によって充分に確実なデータを得ることが可能であ
る。Specifically, in the conventional method, PCR is essential, and in order to obtain a clear result when electrophoresis is performed, the length of extension must be 200 to 300 b.
It is said that it is preferable to carry out up to. However, in the present invention, there is no need to perform PCR since electrophoresis is not required. However, even when PCR is performed for more certainty, it is possible to obtain sufficiently reliable data by extending 10 to 30b.
【００４７】本発明の検出方法は、検体量および試薬量
とも非常に少量のみを用いて実施することが可能であ
る。具体的には、検体として用いる試料はフェムトリッ
トル（ｆＬ）レベルで充分である。即ち、これは、上述
した通り、本発明の方法における、発光信号の検出領域
が、半径２００ｎｍおよび軸長２０００ｎｍの微量領域
であるためである。これにより、本検出は、極小型の容
器で多数の検体を同時に測定することが可能であり、検
査に要する検体量および酵素試薬等の検出に必要な試薬
を低減することが可能である。The detection method of the present invention can be carried out using only a very small amount of the sample and the amount of the reagent. Specifically, a femtoliter (fL) level is sufficient for a sample used as a specimen. That is, as described above, this is because the detection area of the light emission signal in the method of the present invention is a minute area having a radius of 200 nm and an axial length of 2000 nm. Thus, in the present detection, it is possible to simultaneously measure a large number of samples in an extremely small container, and it is possible to reduce the amount of samples required for the test and the reagents required for detecting enzyme reagents and the like.
【００４８】また、本発明の方法は、同一容器内で異な
る多型部位に特異性を有する複数の試薬を混合し、同時
に検体に対して処理することが可能である。従って、検
体ＤＮＡの必要量の低減、および反応容器数の低減が可
能である。また、多型遺伝子検査の検査工程の簡便化が
可能である。更に、本検出方法は、少なくともＤＮＡ検
体と試薬の混合のみで実施することが可能であるため、
全自動のシステム化も可能である。In the method of the present invention, a plurality of reagents having specificities at different polymorphic sites can be mixed in the same container, and the sample can be processed simultaneously. Therefore, it is possible to reduce the required amount of the sample DNA and the number of reaction vessels. In addition, it is possible to simplify the testing process of polymorphism gene testing. Further, since the present detection method can be performed at least only by mixing a DNA sample and a reagent,
Fully automatic systemization is also possible.
【００４９】本発明の検出方法は、高感度に１塩基置換
を検出することが可能である。また本方法は、バッググ
ラウンドの影響が少ないホモジニアス系であるため、判
定精度が高い。これは本発明の検出原理に基づくもので
ある。The detection method of the present invention can detect single base substitution with high sensitivity. In addition, this method has a high determination accuracy because it is a homogeneous system with little influence of the background. This is based on the detection principle of the present invention.
【図１】本発明の方法で検出する検体ＤＮＡの１例を模
式的に示す図。FIG. 1 is a diagram schematically showing one example of a sample DNA detected by the method of the present invention.
【図２】本発明の方法で使用するプローブの好ましい１
例を模式的に示す図。FIG. 2 shows a preferred probe used in the method of the present invention.
The figure which shows an example typically.
【図３】本発明の検出方法を示すスキーム図。FIG. 3 is a scheme diagram showing the detection method of the present invention.
【図４】本発明の検出方法を示すスキーム図。FIG. 4 is a scheme diagram showing the detection method of the present invention.
【図５】本発明の検出方法に用いる装置の好ましい態様
を示す図。FIG. 5 is a diagram showing a preferred embodiment of an apparatus used for the detection method of the present invention.
【図６】本発明の検出方法に用いる蛍光顕微鏡の測定部
分を示す図。FIG. 6 is a diagram showing a measurement part of a fluorescence microscope used in the detection method of the present invention.
【図７】本発明の検出方法で得られる蛍光強度の時間的
変化のデータを示すグラフ。FIG. 7 is a graph showing data of a temporal change in the fluorescence intensity obtained by the detection method of the present invention.
【図８】図７のデータを自己相関関数で変換した統計学
的データを示すグラフ。FIG. 8 is a graph showing statistical data obtained by converting the data of FIG. 7 using an autocorrelation function.
１．蛍光顕微鏡 ２．フォトマルチプライヤ ３．
データ処理装置 ４．表示装置 １１．試料含有液 １２．試料台
１３．スライドガラス １４．蓋 １５．対物レンズ １６．レーザ発生装
置1. Fluorescence microscope 2. Photo multiplier 3.
Data processing device 4. Display device 11. Sample-containing liquid 12. Sample table
13. Slide glass 14. Lid 15. Objective lens 16. Laser generator
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ Ｆターム(参考） 2G043 AA06 BA16 DA02 FA02 HA09 JA02 JA03 KA02 KA09 LA01 LA02 NA02 2H052 AA08 AA09 AC04 AC34 AF02 AF25 4B063 QA13 QA18 QA19 QQ42 QR08 QR56 QS03 QS34 QX02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 21/64 G01N 21/64 F F-term (Reference) 2G043 AA06 BA16 DA02 FA02 HA09 JA02 JA03 KA02 KA09 LA01 LA02 NA02 2H052 AA08 AA09 AC04 AC34 AF02 AF25 4B063 QA13 QA18 QA19 QQ42 QR08 QR56 QS03 QS34 QX02
Claims (4)
Ａに含まれると予期される配列に相補的な配列を有し、
且つ前記１塩基置換部位に対応する塩基に標識物質が付
された少なくとも１種類のＤＮＡプローブと、をハイブ
リダイズすることと；および ２）前記ハイブリダイズの進行中において、複数の経過
時点で前記標識物質の位置変化を光学的に測定すること
と；を具備する検出方法。1. A method for detecting a single nucleotide substitution, comprising: 1) a sample DNA containing a single nucleotide replacement site;
A has a sequence complementary to the sequence expected to be contained in A,
And hybridizing at least one kind of DNA probe having a label corresponding to the base corresponding to the one base substitution site with the DNA probe; and 2) the labeling is performed at a plurality of time points during the progress of the hybridization. Optically measuring a change in the position of a substance.
Ａに含まれると予期される配列に相補的な配列を有し、
且つ前記１塩基置換部位に対応する塩基に標識物質が付
された少なくとも１種類のＤＮＡプローブと、をハイブ
リダイズすることと； ２）１）で得られた一部が二重鎖であるＤＮＡ鎖に校正
機能を有する核酸合成酵素を反応することと；および ３）２）の反応において、複数の経過時点での前記標識
物質の位置変化を光学的に測定することと；を具備する
検出方法。2. A method for detecting a single base substitution, comprising: 1) a sample DNA containing a single base replacement site;
A has a sequence complementary to the sequence expected to be contained in A,
And hybridizing at least one kind of DNA probe having a label corresponding to the base corresponding to the single base substitution site; and 2) a DNA strand partially obtained in 1) which is a double strand. And 3) optically measuring a change in the position of the labeling substance at a plurality of time points in the reaction of 2).
１塩基置換の検出方法であって、前記標識物質が蛍光物
質である検出方法。3. The method for detecting single base substitution according to claim 1, wherein the labeling substance is a fluorescent substance.
であって、前記標識物質の位置変化を光学的に測定する
手段が、該蛍光標識物質分子のブラウン運動を蛍光相関
分光法により測定すること手段である検出方法。4. The method for detecting single-base substitution according to claim 3, wherein the means for optically measuring a change in the position of the labeling substance uses Brownian motion of the fluorescent labeling substance molecule by fluorescence correlation spectroscopy. A detection method that is a means of measuring.
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