JP4589480B2 - How to analyze repeat sequence polymorphisms - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光相関分光法を用いて反復配列の多型を分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学・遺伝学の進歩により、多数の遺伝性神経疾患の原因遺伝子が同定されてきた(1)（かっこ内の数字は、本発明の属する分野における現状をより的確に把握し得るように、本明細書に引用した参照文献の番号を示す。これらの参照文献のリストは、図面の簡単な説明の前に記載されている）。その中には、塩基の置換、欠失、挿入、重複等の変異ではなく、トリプレットリピート（3塩基反復配列）の異常な伸長が原因で発症する疾患（トリプレットリピート病）(2,3)が新たに見出されている。
【０００３】
これらの疾患では、同一家系内においても症状が異なる臨床的多様性、世代を経るごとに若年化する表現促進現象、疾患を伝えた親の性によって次世代の重症度が異なる等の現象が観察され、臨床遺伝学的な観点から興味が持たれている。
【０００４】
トリプレットリピートの存在する遺伝子上の領域に基づいて、今日までに見出されたトリプレットリピート病を整理すると、トリプレットリピートの伸長が、(1)5’末端の非翻訳領域に存在する脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、(2)翻訳領域に存在する球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症1型、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マチャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、(3)3’末端の非翻訳領域に存在する筋緊張性ジストロフィー、(4)イントロン内に存在するフリートライヒ失調症がある。
【０００５】
これらの疾患の原因遺伝子におけるリピート数は、健常者ではおよそ40リピート以下の一定の範囲に分布し、この範囲の中で著しい多型を示すことが多い。一方、患者におけるリピート数の増大の程度は、タンパク質の翻訳領域に存在するトリプレットリピートの場合は、約40〜100リピート程度であるのに対して、非翻訳部位やイントロンに存在するトリプレットリピートの場合は、約200〜1000リピート以上という著しい増大を示す。これら原因遺伝子の生理的機能については、球脊髄性筋萎縮症がアンドロゲン受容体を、脊髄小脳失調症６型が電位依存性Ca2+チャネルのα1Aサブユニットをコードしていることが分かっている以外は不明である。
【０００６】
これらの疾患の原因遺伝子の反復配列の繰り返し数を測定する方法には、以下のような方法がある。
【０００７】
まず、最も古典的な方法は、サザンブロットを利用する方法であり、概略は以下のとおりである。
【０００８】
(1) 既知の制限酵素でゲノムDNA切片を切断して、多くのDNA断片を作製する。
【０００９】
(2) 該DNA断片をゲル電気泳動にかけて分画した後、得られた電気泳動パターンをナイロン膜上にサザンブロットする(4)。
【００１０】
(3) 目的遺伝子と特異的にハイブリダイズできる標識DNAプローブと前記サザンブロットされたDNA断片とのハイブリダイゼーションを行う。
【００１１】
(4) 標識プローブが結合した電気泳動パターン上のバンドを検出することによって、上記の目的遺伝子の反復配列の繰り返し数を決定する(5)。
【００１２】
また、PCRによる多型分析の一態様として、反復配列の繰り返し数を決定する方法も盛んに行われている。該方法では、検出すべき反復配列を増幅し得るプライマーを用いて該配列を増幅した後、増幅産物を電気泳動し、染色又はオートラジオグラフィー等を用いて該産物を検出している(6)。
【００１３】
しかし、両分析方法は何れも、電気泳動法やブロッティング法のように、複雑な実験操作を必要とするので、多大な労力及び時間を要する。また、ブロッティング法、PCR法とも電気泳動を用いるため、多検体・多項目を処理するのが困難であるのみならず、繰り返し数を正確に測定するためには、1塩基の差異を検出し得る極めて精度の高い電気泳動を行わなければならない。さらに、目的の遺伝子を検出するための標識として、32P等の放射性アイソトープを用いる場合には、関係法令によって取扱者が限定されるという問題もある。
【００１４】
一方、これらの分析法とは全く異なる方法として、近年、ジーンチップ（マイクロアレイ）と呼ばれる基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法と(7)、スライドグラス等にPCR産物やプラスミドDNAをスポットする方法(8)が開発された。これらの方法では、約1万個のクローンがアレイ化され、遺伝子の塩基配列決定、単塩基多型、ジーンハンティング、遺伝子発現モニタリング等の遺伝子解析への適用が試みられている。これらの方法は、多種類のDNAプローブによって効率よく測定できるために、多数の検体を同時に検出することが可能であるという利点を有している。
【００１５】
しかしながら、塩基配列に大きな差違がある核酸群から特定の核酸を検出する場合とは異なり、各反復配列の多型は繰り返し数のみが異なるにすぎないので、各反復配列を識別するためには、各反復配列とプローブとの会合・解離状態を微妙に調整するための複雑な手段が必要であるが、上述の方法では、このような精密な制御は不可能である。また測定が、乾燥状態で行われるために、ハイブリダイゼーションの変化をリアルタイムで検出し得ないという欠点も有している。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な操作で反復配列の多型を短時間に分析できる方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明は、
反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
（２）前記標的核酸を標識する工程と；
（３）標識した標的核酸を検出する工程と；
（４）蛍光相関分光法を用いて検出結果を解析することにより、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、標的核酸中に含まれる反復配列の多型を分析する方法を提供する。
【００１９】
本明細書において、「反復配列」とは、AGTAGTAGTのごとく、同一、あるいは極めて類似した「反復単位」が反復されてなる塩基配列を意味する。
【００２０】
本明細書において「多型」とは、同一の遺伝子座を占める複数の対立遺伝子の型をいう。従って、「多型を分析する」とは、このような対立遺伝子の型を推定し、必要に応じて決定することを意味する。
【００２１】
反復配列の場合、反復単位の繰り返し数の相違によって対立遺伝子の型が決まるので、「反復配列の多型を分析する」とは、反復配列の繰り返し数を推定し、必要に応じて決定することをいう。ここで、反復単位の「繰り返し数」とは、反復配列中に含まれる反復単位の個数を意味する。上記事例の場合、AGTが「反復単位」であり、「繰り返し数」は3回である。
【００２２】
本発明の方法によれば、同一の反復単位を有するが、繰り返し数が異なる2以上の核酸を簡易な操作で区別することができ、必要であれば、繰り返し数を決定することも可能である。
【００２３】
本発明の方法を実施するためには、まず、反復配列を有する核酸を含む検体を準備する。反復配列の繰り返し数は、トリプレットリピート病等の疾病の診断指標となり得るので、前記検体は、典型的には、疾病の有無を診断すべき被験者から採取する。
【００２４】
ここで、「トリプレットリピート病」とは、３塩基を単位とする縦列反復配列が繰り返し数の増加によって伸長することにより発症する遺伝性疾患をいう。トリプレットリピート病には、脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症1型、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マチャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、筋緊張性ジストロフィー、フリートライヒ失調症が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の方法に供すべき「検体」には、血液、唾液、***などの体液、血球成分、生検組織、培養細胞等を溶解又は懸濁したものであり得るがこれらに限定されない。
【００２６】
被験者から検体を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の慣用法を使用し得る。
【００２７】
検体中の核酸の量が少ないときには、核酸を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(以下PCRと略記する)によって行い得る。しかしながら、本発明の方法は、感度が非常に高いので、従来の方法では必須であった増幅操作を省略し得る。
【００２８】
必要に応じて核酸を抽出し、又は増幅した後、検出可能な標識、好ましくは蛍光標識を用いて、検体中の前記核酸（以下、標的核酸という）を標識する。以下に記載されているように、蛍光相関分析法を用いて標的核酸を検出、測定する場合には、検出可能な標識は蛍光標識でなければならない。
【００２９】
標的核酸を標識するためには、標識核酸中に、検出可能な標識を有するヌクレオチドを直接導入すればよい。あるいは、標的核酸と相補的な標識プローブとハイブリダイズさせてもよい。
【００３０】
ジデオキシヌクレオチド３リン酸とデオキシヌクレオチド３リン酸の混合物を用いて標識を導入すれば、反復配列だけを標識できる。例えば、CGAが反復してなる反復配列の場合、デオキシCTP、デオキシGTP、デオキシATP（３種類のデオキシヌクレオチド３リン酸のうち少なくとも１種類はラベルされている）、及びジデオキシTTPの混合物とプライマーとを混合し、該プライマーを伸長させる。反復配列にはチミンが含まれていないので、プライマーが反復配列の末端に到達するまでは、プライマーの伸長を停止させるジデオキシTTPがプライマーに取り込まれない。プライマーが反復配列の末端に到達すれば、ジデオキシTTPがプライマーに取り込まれるので、プライマーの伸長が停止する。反復配列の繰り返し数を測定する場合、反復配列以外の部分が標識されていると測定精度が低下するので、このような方法によって、反復配列部分のみを標識することが好ましい。
【００３１】
検出可能な標識を用いて標的核酸を標識した後、検体中に存在する標的核酸、好ましくは、測定感度を上げるために検体中の「微小空間」に存在する標的核酸を検出する。
【００３２】
ここで、「微小空間」とは、容積が10-21L（1nm四方の立方体の体積に相当する）〜10-3L、典型的には10-18L〜10-9L、最も典型的には10-15L〜10-12Lの空間をいう。微小空間の形状は、球状、円錐状、立方体状、直方体状等任意の形状であり得る。
【００３３】
標的核酸は、標的核酸中に導入された標識、又はプローブ中の標識を検出することによって検出される。微小空間の容積は極めて小さいので、微小空間に存在する標的核酸を検出する場合、レーザー光を用い、顕微鏡視野下において、蛍光を検出することが好ましい。
【００３４】
このような検出は、典型的には、図1に示すような共焦点顕微鏡によってなし得る。共焦点顕微鏡自体は、本分野で公知である。
【００３５】
共焦点顕微鏡を用いた検出は、
１．レーザー光を励起光として照射する；
２．フィルター(IF)を通過させた後、レーザー光を集光し、ダイクロイックミラー(DM)によって試料中の一点にレーザー光を照射する；
３．試料中の蛍光物質をレーザー光で励起して発光させる；
４．ピンホールを通過させることにより、試料の焦点中の蛍光物質から発せられた蛍光のみを光増倍管(PMT)で増幅する
５．増幅した蛍光を検出する
ことによってなされる。
【００３６】
図では、アルゴンイオンレーザーが例示されているが、蛍光物質の種類に応じて、波長の異なるクリプトンアルゴンイオンレーザー、ヘリウムネオンレーザー、ヘリウムカドミニウムレーザーも使用できる。また、図１は、典型的な共焦点顕微鏡の模式図にすぎないので、図１に記載の共焦点顕微鏡以外のシステムも当然使用できる。
【００３７】
このような検出方法は、微少な一点から発せられる蛍光のみを検出するので、バックグラウンドがなく、通常の蛍光検出に比べて著しく感度が高い。標的核酸の検出は、一般的にはミリ秒〜分の単位、最も一般的には秒の単位で行われる。
【００３８】
検出結果が得られたら、該結果を解析して、標的核酸の反復単位の種類、繰り返し数等を決定する。
【００３９】
結果の解析は、検出結果の「解析」は、蛍光相関分析法によって行うのが好ましい。ここで、「蛍光相関分析法（以下FCS(fluorescence correlation spectrometry)と称する）」とは、微小空間内に存在する平均数個（ある場合には一個）の蛍光物質が発する蛍光の強度を一定時間測定した後、ブラウン運動に由来する蛍光のゆらぎの自己相関関数をとり、該関数の分析によって、蛍光物質に関する種々のデータを取得する方法をいう。FCS自体は公知であり、その詳細については、特表平11-502608を参照されたい。
【００４０】
FCSを用いて、標的核酸を同定するには、以下の操作を行う。
【００４１】
１．図２ａ)に示されている微小空間にレーザー光を照射する。
【００４２】
２．該微小空間中に存在する蛍光物質から発せられる蛍光の強度を経時的に測定し、図２ｂ）及び図２ｃ）に示されているデータを取得する。
【００４３】
３．異なる２時点の蛍光強度I(t)とI(t+τ)の積の期待値を計算し、自己相関関数G(τ)＝<I(t) I(t+τ)>を得る。
【００４４】
４．下式１：
【００４５】
【式１】
（ここで、Ｎ：蛍光分子の平均数
τsmall＝wo2/4Dsmall：サイズが小さい核酸の並進拡散時間
τlarge＝wo2/4Dlarge ：サイズが大きい核酸の並進拡散時間
y=繰り返し数が多い反復配列の割合
S=wo/zoである
（なお、woは検出領域の径、2zoは領域長、DsmallとDlargeは、それぞれサイズが小さい核酸及びサイズが大きい核酸の並進拡散定数である））
を用いて、３．で得た自己相関関数を解析する。
【００４７】
FCSによるデータ解析には、Evotec BioSystems社から発売されているコンピュータープログラム「FCS」を使用できる。１〜４までの操作時間は、１つの標的核酸当り10秒未満であり得る。
【００４８】
このような分析の概念は、図２ｂ）及び図２ｃ）によって、より明確となろう。すなわち、サイズが小さい場合にはブラウン運動の速度が大きいので、I(t)が大きい。これに対して、サイズが大きい場合にはブラウン運動の速度が小さいので、I(t)の周波数が小さい。
【００４９】
従って、式(1)を用いれば、標識された核酸のサイズ、各核酸の割合を推定し得る。必要であれば、以下に記載した方法を用いて、核酸のサイズを正確に決定することも可能である。
【００５０】
以上のように、本発明の方法の最も基本的な態様は、
(1)反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
(2)前記標的核酸を標識する工程と；
(3)標識した標的核酸を検出する工程と；
(4)検出結果を解析することにより反復配列の多型を分析する工程と
を具備する。
【００５１】
本発明は、標識した標的核酸の一本鎖部分を分解して、前記一本鎖部分が除去された標的核酸と遊離のヌクレオチドとを生成せしめる工程をさらに備えた方法も提供する。
【００５２】
より具体的には、該方法は、
反復配列の多型を分析する方法であって、
（１）反復配列を有する標的核酸を被験者から採取する工程と；
（２）前記反復配列を標識する工程と；
（３）前記反復配列と相補的なプローブと前記反復配列とをハイブリダイズさせて、前記プローブと前記標的核酸からなるハイブリッドを形成せしめる工程と；
（４）前記ハイブリッド中の一本鎖部分を消化して、前記標的核酸から標識ヌクレオチドを遊離させ、遊離した標識ヌクレオチドと二本鎖ハイブリッドとを生成せしめる工程と；
（５）前記遊離した標識ヌクレオチドを検出又は定量することによって、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法である。
【００５３】
該方法によれば、反復配列の反復回数を正確に決定できる。
【００５４】
該方法を実施するには、まず反復配列を有する標的核酸を被験者から採取して、反復配列部分のみを標識する。標的核酸の採取法は、上述のとおりである。反復配列部分のみを標識するには、反復配列の相補鎖を鋳型にして、上述のジデオキシ三リン酸を用いた方法で標識ヌクレオチドを導入するのが簡便である。
【００５５】
標的核酸を標識した後、プローブに接触させる。該プローブは、反復配列を構成する反復単位と相補的な塩基配列を有するように調製する。従って、該標識プローブは、標識された反復配列とハイブリダイズし得る。
【００５６】
該方法によって反復配列の繰り返し数を決定するためには、該反復配列より短いプローブを使用する。このようなプローブと標識された反復配列とをハイブリダイズさせれば、標識された反復配列の末端が一本鎖として延出したハイブリッドが形成される。
【００５７】
該ハイブリッドを一本鎖特異的ヌクレアーゼによって消化すれば、前記ハイブリッドの一本鎖部分、すなわち一本鎖として延出している標識された反復配列の末端部分のみが消化される。標識された反復配列には標識ヌクレオチドが導入されているので、標識された反復配列を消化すれば、標識ヌクレオチドが遊離する。一本鎖特異的ヌクレアーゼとしては、S1ヌクレアーゼ又はExoIヌクレアーゼを使用し得る。
【００５８】
標識ヌクレオチドが遊離すれば、標的配列中の反復配列がプローブよりも長いことを意味している。反対に、標識されたヌクレオチドが遊離されなかった場合、標的核酸中の反復配列がプローブよりも長くないことを意味している。それ故、標識されたヌクレオチドが遊離されるか否かを調べることにより、反復配列の繰り返し数が、所定の回数を超えるか否かを知ることができる。多くの疾病では、正常者に比べて、繰り返し数は増加する。それ故、正常者の反復配列より長く、患者の反復配列より短いプローブを用いれば、被験者が疾病に罹患しているか否かを診断し得る。
【００５９】
さらに、プローブの繰り返し数は既知なので、遊離したヌクレオチドの濃度と消化されたハイブリッドの濃度を測定すれば、一つのハイブリッドから遊離したヌクレオチド個数を算出することができる。これによって、標的核酸中に含まれる反復配列の繰り返し数を正確に決定できる。
【００６０】
上述した蛍光相関分光法を用いれば、遊離したヌクレオチドの濃度及び消化されたハイブリッドの濃度をリアルタイムに測定し得る。
【００６１】
本方法によれば、２種類又はそれ以上の標的核酸の反復配列を同時に分析することも可能である。
【００６２】
反復単位が異なる２種類の標的核酸を同時に分析するには、両核酸の反復配列をそれぞれ異なる標識でラベルするのが簡便であり、１種類の標的核酸を分析する場合と同様の操作で反復配列の長さを決定できる。
【００６３】
蛍光相関分光法を用いれば、ハイブリッドのサイズ及び存在比率、遊離したヌクレオチドの量を容易に測定できる。従って、蛍光相関分光法を用いる場合には、両反復配列の長さ又は各プローブの長さが異なれば、標識が同じでも、2種類のハイブリッドを容易に区別することができる。
【００６４】
なお、上記の方法では、標的核酸の反復配列を標識したが、これに代えて、標識したプローブを用いてもよい。この場合には、プローブが反復配列より長いときに、標識ヌクレオチドが遊離する。その他の操作は、反復配列を標識した場合と同じである。
【００６５】
以下、実施例により、本発明の方法をさらに詳細に説明する。
【００６６】
［実施例１］
本実施例では、球脊椎性筋萎縮症(以下SBMAと略記する)患者のアンドロゲン受容体遺伝子中の反復配列の繰り返し数を測定することにより、被験者がSBMAに罹患しているか否かを診断する方法について説明する。
【００６７】
アンドロゲン受容体遺伝子には、該受容体のN末端近傍をコードする部分にCAG反復配列が存在する。正常人では、該反復配列の繰り返し数は約20であるのに対して、SBMA患者では40〜60に増加することが報告されている(7)。
【００６８】
従って、アンドロゲン受容体遺伝子中に含まれる該反復配列の繰り返し数を測定することにより、被験者がSBMAに罹患しているか否かを診断することができる。
【００６９】
以下、本実施例の方法について説明する。
【００７０】
まず、正常な繰り返し数（本実施例の場合20回）をするプローブを作成した。
【００７１】
次に、被験者から採取したDNA検体を図１のように蛍光標識した。検体には、蛍光標識したdATP、未標識のdCTP、dGTP、ddTTP（ジデオキシTTP）とプライマーを用いた伸長反応によって、蛍光標識を導入した。ddTTPを用いることにより、T（チミン）の位置で伸長反応が停止するので、反復配列のみを蛍光標識し得る。
【００７２】
続いて、正常者又はSBMA患者由来のDNA検体と該プローブを反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００７３】
図３に示されているように、正常者から採取した検体DNAは、プローブより長くないので、プローブの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる。一方、SBMA患者から採取した検体DNAは、プローブより長いので、検体DNAの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる（図３参照）。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応に続いて、プローブと検体DNAからなるハイブリッドに、二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、一本鎖部分を消化した。
【００７５】
図３に示されているように、該反応によって、一本鎖部分は分解されてヌクレオチドになり、二本鎖部分のみからなるハイブリッドが生成される。
【００７６】
前述のように、正常者由来のハイブリッドの一本鎖部分はプローブの一部によって構成されるので、正常者由来のハイブリッドを消化すると、プローブの一部が分解される。これに対して、SBMA患者由来のハイブリッドの一本鎖部分は検体DNAの一部によって構成されるので、SBMA患者由来のハイブリッドを消化すると、検体DNAの一部が分解される。
【００７７】
検体DNAは標識ヌクレオチドを含むので、SBMA患者由来のハイブリッドの分解産物には標識ヌクレオチドが遊離する。これに対して、プローブは標識ヌクレオチドを含まないので、正常者由来のハイブリッドの分解産物には標識ヌクレオチドが遊離しない。
【００７８】
蛍光分子の挙動すなわち蛍光強度とゆらぎの関係は、分子が小さい場合は速く、分子が大きいと遅い。このため、正常者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が短くなるのに対して、SBMA患者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が長くなり、相関時間の長短によって両者を判別できる。
【００７９】
さらに、SBMA患者由来のハイブリッドの分解産物からは、標識ヌクレオチドが観察されるのに対して、正常者のそれからは、殆ど標識ヌクレオチドが観察されないことを指標として、反復配列の長さを判定することもできる。
【００８０】
また、SBMA患者の場合、標識ヌクレオチドと二本鎖部分の両者が標識されているので、二本鎖部分と標識ヌクレオチドの濃度を計算することができる。具体的には、ヌクレオチドの数を二本鎖の分子数で割り、プローブの繰り返し数20を加算すれば、SBMA患者の反復配列の繰り返し数が得られる。
【００８１】
なお、本実施例では、一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理を行い、反復配列の繰り返し数を正確に決定する方法を説明したが、一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理を行わずに、反復配列の繰り返し数の概数を推定してもよい。
【００８２】
［実施例２］
本実施例では、実施例１とは反対に、プローブを蛍光標識した場合の検査方法について説明する。
【００８３】
まず、正常な繰り返し数（本実施例の場合20回）を有し、全てのA（アデニン）が蛍光標識されたプローブを作成した。続いて、正常者又はSBMA患者由来のDNA検体と該プローブを反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００８４】
図４に示されているように、正常者から採取した検体DNAは、プローブより長くないので、プローブの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる。一方、SBMA患者から採取した検体DNAは、プローブより長いので、検体DNAの一部が一本鎖部分を構成するハイブリッドが得られる（図４参照）。
【００８５】
ハイブリダイゼーション反応に続いて、プローブと検体DNAからなるハイブリッドに、二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、一本鎖部分を消化した。
【００８６】
図４に示されているように、該反応によって、一本鎖部分は分解されてヌクレオチドになり、二本鎖部分のみからなるハイブリッドが生成される。
【００８７】
正常者由来のハイブリッドの一本鎖部分はプローブの一部によって構成されるので、正常者由来のハイブリッドを消化すると、プローブの一部が分解される。これに対して、SBMA患者由来のハイブリッドの一本鎖部分は検体DNAの一部によって構成されるので、SBMA患者由来のハイブリッドを消化すると、検体DNAの一部が分解される。
【００８８】
検体DNAは標識ヌクレオチドを含まないので、SBMA患者由来のハイブリッドからは標識ヌクレオチドが遊離しない。これに対して、プローブは標識ヌクレオチドを含むので、正常者由来のハイブリッドからは標識ヌクレオチドがする。
【００８９】
蛍光分子の挙動すなわち蛍光強度とゆらぎの関係は、分子が小さい場合は速く、分子が大きいと遅い。このため、正常者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が短くなるのに対して、SBMA患者由来のハイブリッドでは、二本鎖部分の相関時間が長くなり、相関時間の長短によって両者を判別できる。
【００９０】
［実施例３］
本実施例では、２種類のトリプレットリピート病を同時に検査する方法について説明する。
【００９１】
第一のトリプレットリピート病としては、正常者における反復配列の繰り返し数が20以下である疾病を選択し、CAGが20回反復してなるプローブ５を作成した。
【００９２】
第ニのトリプレットリピート病としては、正常者における反復配列の繰り返し数が50以下である疾病を選択し、CCGが50回反復してなるプローブ６を作成した。
【００９３】
プローブ５とプローブ６には、蛍光標識を施してある。
【００９４】
まず、診断すべき被験者から両トリプレット病の指標となる検体DNAを含む検体を採取した。
【００９５】
該検体中には、反復配列１(CAGが20回以下反復されてなる反復配列)又は反復配列２(CAGが21回以上反復されてなる反復配列)が含まれており(図５参照)、反復配列１と反復配列２は第一のトリプレットリピート病の有無を診断するための指標となる。前記検体中には、反復配列３(CCGが50回以下反復されてなる反復配列)又は反復配列４(CCGが51回以上反復されてなる反復配列)も含まれており(図５参照)、反復配列３と反復配列４は第二のトリプレットリピート病の有無を診断するための指標となる。
【００９６】
プローブ５とプローブ６及び前記検体を反応容器に入れ、50℃前後の温度でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００９７】
該反応によって、反復配列１は、プローブ５とハイブリダイズして、ハイブリッド７(図５)を形成する。反復配列１は、プローブ５より長くないので、ハイブリッド７に一本鎖部分が生じる場合には、該一本鎖部分はプローブ５の一部によって構成される。一方、反復配列２もプローブ５とハイブリダイズして、ハイブリッド８を形成するが、反復配列２は、プローブ５より長いので、ハイブリッド８の一本鎖部分は、反復配列２の一部によって構成される。
【００９８】
ハイブリダイゼーション反応によって、反復配列３は、プローブ６とハイブリダイズして、ハイブリッド９を形成する。反復配列３は、プローブ６より長くないので、ハイブリッド９に一本鎖部分が生じる場合には、該一本鎖部分はプローブ６の一部によって構成される。一方、反復配列４もプローブ６とハイブリダイズして、ハイブリッド１０を形成するが、反復配列４は、プローブ６より長いので、ハイブリッド１０の一本鎖部分は、反復配列４の一部によって構成される。
【００９９】
ハイブリダイゼーション反応に続いて二本鎖部分には反応しない酵素（例えば、S1ヌクレアーゼ）を加えて、37℃前後で反応させ、前記各ハイブリッド中の一本鎖部分を消化した。
【０１００】
検体が第一のトリプレットリピート病に罹患していない正常者から採取された場合、前記検体には、反復配列１が含まれるので、ハイブリッド７が形成される。図５のように、ハイブリッド７の一本鎖部分は、プローブ５の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が20未満の二本鎖ハイブリッド１２が得られるとともに、蛍光標識されたヌクレオチドが遊離する。これに対して、検体が第一のトリプレットリピート病に罹患した患者から採取された場合、前記検体には、反復配列２が含まれるので、ハイブリッド８が形成される。図５のように、ハイブリッド８の一本鎖部分は、反復配列２の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が20の二本鎖ハイブリッド１１が得られるが、蛍光標識されたヌクレオチドは遊離しない。
【０１０１】
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第一のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０２】
さらに、検体が第二のトリプレットリピート病に罹患していない正常者から採取された場合、前記検体には、反復配列３が含まれるので、ハイブリッド９が形成される。図５のように、ハイブリッド９の一本鎖部分は、プローブ６の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が50以下の二本鎖ハイブリッド１４が得られるとともに、蛍光標識されたヌクレオチドが遊離する。これに対して、検体が第二のトリプレットリピート病に罹患した患者から採取された場合、前記検体には、反復配列４が含まれるので、ハイブリッド１０が形成される。図５のように、ハイブリッド１０の一本鎖部分は、反復配列４の一部によって構成されるので、一本鎖部分を消化すると、繰り返し数が50の二本鎖ハイブリッド１３が得られるが、蛍光標識されたヌクレオチドは遊離しない。
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第二のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０３】
従って、FCSで二本鎖DNAの種類及び蛍光標識ヌクレオチドの遊離の有無を調べれば、被験者が第二のトリプレットリピート病に罹患しているか否かを診断することができる。
【０１０４】
以上の結果を下表にまとめる。
【０１０５】
【表１】
以上、本実施例によれば、２種類のトリプレットリピート病を同時に検査することが可能となる。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、簡便な操作で反復配列の多型を短時間に分析できる。
【０１０８】
［参考文献］
(1) Martin, J.B.:Ann. Neurol., 34, 757-773 (1993)
(2) La Spada, A.R.:Ann. Neurol., 36, 814-822 (1994)
(3) Ross, C.A.:Neurol., 36, 814-822 (1994)
(4) Southern E.M.:J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)
(5) Verkerk, A.J.M.H.:Cell, 65, 905-914 (1991)
(6) Fu, T.:Cell, 67, 1047-1058 (1991)
(7) Fordor, S.P.A.:Science, 251, 767-773 (1991)
(8) Schena, M.:Science, 270, 460-470 (1995)
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に使用し得る検出システムの模式図。
【図２】蛍光相関分光法による反復配列の分析の概念を表す図。
【図３】実施例１の方法を示す図。
【図４】実施例２の方法を示す図。
【図５】実施例３の方法を示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing polymorphisms of repetitive sequences using fluorescence correlation spectroscopy.
[0002]
[Prior art]
Due to advances in molecular biology and genetics, a number of genes responsible for hereditary neurological diseases have been identified (1) (numbers in parentheses are for better understanding of the current situation in the field to which the present invention belongs. , Indicates the number of references cited herein, a list of these references is given before the brief description of the drawings). Among them, there is a disease (triplet repeat disease) (2,3) that develops due to abnormal extension of triplet repeat (3-base repeat sequence), not mutations such as base substitution, deletion, insertion, duplication, etc. Newly found.
[0003]
In these diseases, clinical diversity with different symptoms even within the same family, expression promotion phenomenon that becomes younger with each generation, phenomena such as the severity of the next generation depending on the sex of the parent who transmitted the disease are observed And is of interest from a clinical genetic point of view.
[0004]
Based on the region on the gene where the triplet repeat exists, the triplet repeat disease found to date is arranged, the extension of the triplet repeat is (1) the fragile X syndrome present in the untranslated region at the 5 ′ end, Fragile XE mental retardation, (2) bulbar spinal muscular atrophy present in the translation region, Huntington's disease,
[0005]
The number of repeats in the causative genes of these diseases is distributed in a certain range of about 40 repeats or less in healthy individuals, and often exhibits a remarkable polymorphism within this range. On the other hand, the increase in the number of repeats in patients is about 40 to 100 repeats in the case of triplet repeats existing in the translation region of the protein, whereas in the case of triplet repeats existing in the untranslated region or intron Shows a marked increase of about 200 to 1000 repeats or more. Regarding the physiological functions of these causative genes, bulbar spinal muscular atrophy is an androgen receptor, and spinocerebellar ataxia type 6 is voltage-dependent Ca. 2+ Channel alpha 1A Unknown except that it is known to encode a subunit.
[0006]
There are the following methods for measuring the number of repetitive sequences of the causative genes of these diseases.
[0007]
First, the most classic method is a method using Southern blot, and the outline is as follows.
[0008]
(1) Cleave genomic DNA sections with known restriction enzymes to produce many DNA fragments.
[0009]
(2) After the DNA fragment is fractionated by gel electrophoresis, the obtained electrophoresis pattern is Southern blotted on a nylon membrane (4).
[0010]
(3) A labeled DNA probe capable of specifically hybridizing with the target gene is hybridized with the Southern blotted DNA fragment.
[0011]
(4) By detecting a band on the electrophoresis pattern to which the labeled probe is bound, the number of repetitions of the repetitive sequence of the target gene is determined (5).
[0012]
In addition, as one aspect of polymorphism analysis by PCR, methods for determining the number of repetitive sequences have been actively performed. In this method, after amplifying the sequence using a primer capable of amplifying the repetitive sequence to be detected, the amplified product is electrophoresed, and the product is detected using staining or autoradiography (6) .
[0013]
However, since both analytical methods require complicated experimental operations like the electrophoresis method and the blotting method, much labor and time are required. In addition, since both blotting and PCR methods use electrophoresis, it is difficult to process multiple specimens and multiple items, and in order to accurately measure the number of repetitions, a single base difference can be detected. Electrophoresis with extremely high accuracy must be performed. Furthermore, as a label for detecting the gene of interest, 32 In the case of using a radioactive isotope such as P, there is also a problem that the number of operators is limited by related laws and regulations.
[0014]
On the other hand, as a completely different method from these analytical methods, in recent years, a method of synthesizing oligonucleotides on a substrate called a gene chip (microarray) (7), a method of spotting PCR products or plasmid DNA on a slide glass ( 8) was developed. In these methods, about 10,000 clones are arrayed, and application to gene analysis such as determination of gene nucleotide sequence, single nucleotide polymorphism, gene hunting, gene expression monitoring and the like has been attempted. These methods have the advantage that a large number of specimens can be detected at the same time because they can be measured efficiently with many types of DNA probes.
[0015]
However, unlike the case of detecting a specific nucleic acid from a group of nucleic acids having a large difference in base sequence, the polymorphism of each repetitive sequence differs only in the number of repeats. A complicated means for finely adjusting the association / dissociation state between each repetitive sequence and the probe is necessary, but such precise control is not possible with the above-described method. Further, since the measurement is performed in a dry state, there is a disadvantage that a change in hybridization cannot be detected in real time.
[0016]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a method capable of analyzing polymorphisms of repetitive sequences in a short time with a simple operation.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention provides:
A method for analyzing a polymorphism of a repetitive sequence, comprising:
(1) collecting a target nucleic acid having a repetitive sequence from a subject;
(2) labeling the target nucleic acid;
(3) detecting a labeled target nucleic acid;
(4) analyzing the polymorphism of the repetitive sequence by analyzing the detection result using fluorescence correlation spectroscopy;
A method comprising:
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention provides a method for analyzing polymorphisms of repetitive sequences contained in a target nucleic acid.
[0019]
In the present specification, the “repetitive sequence” means a base sequence formed by repeating the same or very similar “repeat unit” as in AGTAGTAGT.
[0020]
As used herein, “polymorphism” refers to a plurality of allele types that occupy the same locus. Therefore, “analyzing a polymorphism” means estimating the type of such allele and determining it if necessary.
[0021]
In the case of repetitive sequences, the allele type is determined by the difference in the number of repeats in the repeat unit, so "analyze repeat sequence polymorphism" is to estimate the repeat number of repeat sequences and determine if necessary Say. Here, the “repeat number” of the repeat unit means the number of repeat units contained in the repeat sequence. In the above case, AGT is “repetition unit” and “repetition number” is 3 times.
[0022]
According to the method of the present invention, two or more nucleic acids having the same repeat unit but different repeat numbers can be distinguished by a simple operation, and the repeat number can be determined if necessary. .
[0023]
In order to carry out the method of the present invention, first, a specimen containing a nucleic acid having a repetitive sequence is prepared. Since the number of repetitive sequences can be a diagnostic index for diseases such as triplet repeat disease, the specimen is typically collected from a subject to be diagnosed for the presence or absence of the disease.
[0024]
Here, “triplet repeat disease” refers to a hereditary disease that develops when a tandem repeat of 3 bases is extended by increasing the number of repeats. For triplet repeat disease, fragile X syndrome, fragile XE mental retardation, bulbar spinal muscular atrophy, Huntington's disease,
[0025]
The “specimen” to be subjected to the method of the present invention may be, but not limited to, a body fluid such as blood, saliva or semen, a blood cell component, a biopsy tissue, a cultured cell or the like dissolved or suspended.
[0026]
After collecting a specimen from a subject, an operation for extracting nucleic acid from the sample is usually performed. As a method for extracting a nucleic acid, any conventional method other than phenol extraction and ethanol precipitation can be used.
[0027]
When the amount of nucleic acid in the sample is small, an operation of amplifying the nucleic acid may be performed. The amplification operation can be performed, for example, by polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR). However, since the method of the present invention has very high sensitivity, the amplification operation that is essential in the conventional method can be omitted.
[0028]
After extracting or amplifying the nucleic acid as necessary, the nucleic acid in the specimen (hereinafter referred to as target nucleic acid) is labeled with a detectable label, preferably a fluorescent label. As described below, when a target nucleic acid is detected and measured using fluorescence correlation analysis, the detectable label must be a fluorescent label.
[0029]
In order to label the target nucleic acid, a nucleotide having a detectable label may be directly introduced into the labeled nucleic acid. Alternatively, it may be hybridized with a labeled probe complementary to the target nucleic acid.
[0030]
If a label is introduced using a mixture of dideoxynucleotide triphosphate and deoxynucleotide triphosphate, only repetitive sequences can be labeled. For example, in the case of a repetitive sequence consisting of CGA repeats, a mixture of deoxy CTP, deoxy GTP, deoxy ATP (at least one of the three deoxynucleotide triphosphates is labeled), dideoxy TTP, and a primer And extend the primer. Since the repetitive sequence does not contain thymine, dideoxy TTP that stops the extension of the primer is not incorporated into the primer until the primer reaches the end of the repetitive sequence. When the primer reaches the end of the repetitive sequence, dideoxy TTP is incorporated into the primer, and the extension of the primer stops. When measuring the number of repeats of a repetitive sequence, the measurement accuracy decreases if a portion other than the repetitive sequence is labeled. Therefore, it is preferable to label only the repetitive sequence portion by such a method.
[0031]
After labeling the target nucleic acid with a detectable label, the target nucleic acid present in the specimen, preferably the target nucleic acid present in the “microspace” in the specimen is detected in order to increase measurement sensitivity.
[0032]
Here, the “microspace” means a volume of 10 -twenty one L (corresponds to the volume of a 1 nm square cube) ~ 10 -3 L, typically 10 -18 L ~ 10 -9 L, most typically 10 -15 L ~ 10 -12 L space. The shape of the minute space may be any shape such as a spherical shape, a conical shape, a cubic shape, or a rectangular parallelepiped shape.
[0033]
The target nucleic acid is detected by detecting a label introduced into the target nucleic acid or a label in the probe. Since the volume of the minute space is extremely small, when detecting a target nucleic acid present in the minute space, it is preferable to detect fluorescence under a microscope field using laser light.
[0034]
Such detection can typically be done by a confocal microscope as shown in FIG. Confocal microscopes themselves are known in the art.
[0035]
Detection using a confocal microscope
1. Irradiate with laser light as excitation light;
2. After passing through the filter (IF), the laser beam is collected, and a point in the sample is irradiated with the laser beam by a dichroic mirror (DM);
3. Excites the fluorescent material in the sample with laser light to emit light;
4). By passing through the pinhole, only the fluorescence emitted from the fluorescent substance in the focal point of the sample is amplified by the photomultiplier tube (PMT)
5). Detect amplified fluorescence
Is made by
[0036]
In the figure, an argon ion laser is illustrated, but a krypton argon ion laser, a helium neon laser, and a helium cadmium laser having different wavelengths can also be used depending on the type of fluorescent material. Moreover, since FIG. 1 is only a schematic diagram of a typical confocal microscope, a system other than the confocal microscope described in FIG. 1 can also be used.
[0037]
Since such a detection method detects only the fluorescence emitted from a minute point, it has no background and is significantly more sensitive than ordinary fluorescence detection. Detection of the target nucleic acid is generally performed in units of milliseconds to minutes, most commonly in seconds.
[0038]
When the detection result is obtained, the result is analyzed to determine the type of repeat unit of the target nucleic acid, the number of repeats, and the like.
[0039]
The analysis of the result is preferably performed by the fluorescence correlation analysis method for “analysis” of the detection result. Here, “fluorescence correlation analysis” (hereinafter referred to as “FCS (fluorescence correlation spectrometry)”) refers to the intensity of fluorescence emitted by an average of several (in some cases, one) fluorescent substances in a minute space for a certain period of time. After the measurement, an autocorrelation function of the fluorescence fluctuation derived from the Brownian motion is taken, and various data relating to the fluorescent material are obtained by analyzing the function. FCS itself is publicly known, and for details, refer to JP-T-11-502608.
[0040]
To identify a target nucleic acid using FCS, the following operation is performed.
[0041]
1. Laser light is applied to the minute space shown in FIG.
[0042]
2. The intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent substance existing in the minute space is measured over time, and the data shown in FIGS. 2b) and 2c) are acquired.
[0043]
3. Calculate the expected value of the product of fluorescence intensities I (t) and I (t + τ) at two different time points, and autocorrelation function G (τ) = <I (t) I (t + τ)> is obtained.
[0044]
4). Formula 1:
[0045]
[Formula 1]
(Where N is the average number of fluorescent molecules
τ small = Wo 2/4 D small : Translational diffusion time of small nucleic acid
τ large = Wo 2/4 D large : Translational diffusion time of large nucleic acids
y = percentage of repetitive sequences with a large number of repeats
S = wo / zo
(Wo is detection area diameter, 2zo is area length, D small And D large Are the translational diffusion constants for small and large nucleic acids, respectively))
3. Analyze the autocorrelation function obtained in
[0047]
For data analysis using FCS, the computer program “FCS” available from Evotec BioSystems can be used. The operating time from 1 to 4 can be less than 10 seconds per target nucleic acid.
[0048]
The concept of such analysis will become clearer with FIGS. 2b) and 2c). That is, when the size is small, the speed of the Brownian motion is large, so that I (t) is large. On the other hand, when the size is large, the speed of Brownian motion is small, so the frequency of I (t) is small.
[0049]
Therefore, using the formula (1), the size of the labeled nucleic acid and the ratio of each nucleic acid can be estimated. If necessary, the size of the nucleic acid can be accurately determined using the methods described below.
[0050]
As described above, the most basic aspect of the method of the present invention is:
(1) collecting a target nucleic acid having a repetitive sequence from a subject;
(2) labeling the target nucleic acid;
(3) detecting the labeled target nucleic acid;
(4) analyzing the polymorphism of the repetitive sequence by analyzing the detection result;
It comprises.
[0051]
The present invention also provides a method further comprising the step of decomposing a single-stranded portion of the labeled target nucleic acid to produce a target nucleic acid from which the single-stranded portion has been removed and a free nucleotide.
[0052]
More specifically, the method comprises:
A method for analyzing a polymorphism of a repetitive sequence, comprising:
(1) collecting a target nucleic acid having a repetitive sequence from a subject;
(2) labeling the repetitive sequence;
(3) a step of hybridizing a probe complementary to the repetitive sequence and the repetitive sequence to form a hybrid comprising the probe and the target nucleic acid;
(4) digesting a single-stranded portion in the hybrid to release a labeled nucleotide from the target nucleic acid, and generating a released labeled nucleotide and a double-stranded hybrid;
(5) analyzing the polymorphism of the repetitive sequence by detecting or quantifying the released labeled nucleotide;
It is a method provided with.
[0053]
According to this method, the number of repetitions of the repetitive sequence can be accurately determined.
[0054]
In order to carry out the method, first, a target nucleic acid having a repetitive sequence is collected from a subject, and only the repetitive sequence portion is labeled. The method for collecting the target nucleic acid is as described above. In order to label only the repetitive sequence portion, it is convenient to introduce a labeled nucleotide by the above-described method using dideoxytriphosphate using a complementary strand of the repetitive sequence as a template.
[0055]
After labeling the target nucleic acid, it is brought into contact with the probe. The probe is prepared so as to have a base sequence complementary to a repetitive unit constituting the repetitive sequence. Thus, the labeled probe can hybridize with a labeled repeat sequence.
[0056]
In order to determine the number of repeats by the method, a probe shorter than the repeat is used. When such a probe is hybridized with a labeled repetitive sequence, a hybrid in which the end of the labeled repetitive sequence extends as a single strand is formed.
[0057]
When the hybrid is digested with a single-strand specific nuclease, only the single-stranded portion of the hybrid, ie, the terminal portion of the labeled repetitive sequence extending as a single strand, is digested. Since a labeled nucleotide is introduced into the labeled repetitive sequence, the labeled nucleotide is released when the labeled repetitive sequence is digested. S1 nuclease or ExoI nuclease can be used as the single-strand specific nuclease.
[0058]
If the labeled nucleotide is released, it means that the repetitive sequence in the target sequence is longer than the probe. Conversely, if the labeled nucleotide is not released, it means that the repetitive sequence in the target nucleic acid is not longer than the probe. Therefore, it can be determined whether or not the number of repeated sequences exceeds a predetermined number by examining whether or not the labeled nucleotide is released. In many diseases, the number of repetitions is increased compared to normal individuals. Therefore, the use of a probe that is longer than the normal sequence and shorter than the patient sequence can diagnose whether the subject suffers from the disease.
[0059]
Furthermore, since the number of probe repeats is known, the number of nucleotides released from one hybrid can be calculated by measuring the concentration of released nucleotides and the concentration of digested hybrids. This makes it possible to accurately determine the number of repetitive sequences contained in the target nucleic acid.
[0060]
Using the fluorescence correlation spectroscopy described above, the concentration of released nucleotides and the concentration of digested hybrids can be measured in real time.
[0061]
According to this method, it is also possible to analyze two or more target nucleic acid repetitive sequences simultaneously.
[0062]
In order to simultaneously analyze two types of target nucleic acids having different repeating units, it is convenient to label the repetitive sequences of both nucleic acids with different labels, and the repetitive sequences are the same as when analyzing one type of target nucleic acid. The length of can be determined.
[0063]
By using fluorescence correlation spectroscopy, the size and abundance of hybrids and the amount of released nucleotides can be easily measured. Therefore, when fluorescence correlation spectroscopy is used, two types of hybrids can be easily distinguished even if the labels are the same if the length of both repeated sequences or the length of each probe is different.
[0064]
In the above method, the repetitive sequence of the target nucleic acid is labeled, but a labeled probe may be used instead. In this case, the labeled nucleotide is released when the probe is longer than the repeat sequence. Other operations are the same as when the repetitive sequence is labeled.
[0065]
The following examples further illustrate details for the process of the present invention.
[0066]
[Example 1]
In this example, whether or not a subject suffers from SBMA is diagnosed by measuring the number of repetitive sequences in the androgen receptor gene of a patient with bulbar spinal muscular atrophy (hereinafter abbreviated as SBMA). A method will be described.
[0067]
In the androgen receptor gene, a CAG repeat is present in the portion encoding the vicinity of the N-terminus of the receptor. It has been reported that in normal individuals, the number of repeats of the repeat is about 20, whereas in SBMA patients it increases to 40-60 (7).
[0068]
Therefore, it is possible to diagnose whether or not the subject is suffering from SBMA by measuring the number of repetitions of the repetitive sequence contained in the androgen receptor gene.
[0069]
Hereinafter, the method of the present embodiment will be described.
[0070]
First, a probe having a normal number of repetitions (20 in this example) was prepared.
[0071]
Next, a DNA sample collected from the subject was fluorescently labeled as shown in FIG. A fluorescent label was introduced into the specimen by an extension reaction using fluorescently labeled dATP, unlabeled dCTP, dGTP, ddTTP (dideoxy TTP) and a primer. By using ddTTP, the extension reaction stops at the position of T (thymine), so that only the repetitive sequence can be fluorescently labeled.
[0072]
Subsequently, a normal or SBMA patient-derived DNA sample and the probe were placed in a reaction container, and a hybridization reaction was performed at a temperature of about 50 ° C.
[0073]
As shown in FIG. 3, since sample DNA collected from a normal person is not longer than the probe, a hybrid in which a part of the probe constitutes a single-stranded part is obtained. On the other hand, the sample DNA collected from the SBMA patient is longer than the probe, so that a hybrid in which a part of the sample DNA constitutes a single-stranded portion is obtained (see FIG. 3).
[0074]
Following the hybridization reaction, an enzyme that does not react with the double-stranded portion (for example, S1 nuclease) was added to the hybrid consisting of the probe and the sample DNA, and reacted at around 37 ° C. to digest the single-stranded portion.
[0075]
As shown in FIG. 3, the reaction breaks down the single-stranded portion into nucleotides, producing a hybrid consisting of only the double-stranded portion.
[0076]
As described above, since the single-stranded portion of the hybrid derived from a normal person is constituted by a part of the probe, when the hybrid derived from the normal person is digested, a part of the probe is decomposed. On the other hand, since the single-stranded portion of the hybrid derived from the SBMA patient is constituted by a part of the sample DNA, when the hybrid derived from the SBMA patient is digested, a part of the sample DNA is decomposed.
[0077]
Since the sample DNA contains a labeled nucleotide, the labeled nucleotide is released to the degradation product of the hybrid derived from the SBMA patient. In contrast, since the probe does not contain a labeled nucleotide, the labeled nucleotide is not released to the degradation product of the hybrid derived from a normal person.
[0078]
The relationship between the behavior of fluorescent molecules, that is, the fluorescence intensity and fluctuation, is fast when the molecule is small, and slow when the molecule is large. For this reason, in the hybrid derived from a normal person, the correlation time of the double-stranded portion is shortened, whereas in the hybrid derived from SBMA patient, the correlation time of the double-stranded portion is long. Can be determined.
[0079]
In addition, labeled nucleotides are observed from the degradation products of hybrids derived from SBMA patients, while those of normal individuals are used to determine the length of repetitive sequences using as an indicator that almost no labeled nucleotides are observed. You can also.
[0080]
In the case of an SBMA patient, since both the labeled nucleotide and the double-stranded part are labeled, the concentration of the double-stranded part and the labeled nucleotide can be calculated. Specifically, by dividing the number of nucleotides by the number of double-stranded molecules and adding the number of probe repeats 20, the number of repeats of the SBMA patient repeat sequence can be obtained.
[0081]
In the present example, the method for determining the number of repeats by repeating a single-strand-specific nuclease was described. However, the number of repeats by repeating a sequence without performing single-strand-specific nuclease treatment was described. Approximate number may be estimated.
[0082]
[Example 2]
In the present embodiment, in contrast to the first embodiment, an inspection method when the probe is fluorescently labeled will be described.
[0083]
First, a probe having a normal number of repetitions (20 in the case of this example) and all A (adenine) fluorescently labeled was prepared. Subsequently, a normal or SBMA patient-derived DNA sample and the probe were placed in a reaction container, and a hybridization reaction was performed at a temperature of about 50 ° C.
[0084]
As shown in FIG. 4, since sample DNA collected from a normal person is not longer than the probe, a hybrid in which a part of the probe constitutes a single-stranded part is obtained. On the other hand, the sample DNA collected from the SBMA patient is longer than the probe, so that a hybrid in which a part of the sample DNA constitutes a single-stranded portion is obtained (see FIG. 4).
[0085]
Following the hybridization reaction, an enzyme that does not react with the double-stranded portion (for example, S1 nuclease) was added to the hybrid consisting of the probe and the sample DNA, and reacted at around 37 ° C. to digest the single-stranded portion.
[0086]
As shown in FIG. 4, the reaction breaks down the single-stranded portion into nucleotides, producing a hybrid consisting of only the double-stranded portion.
[0087]
Since the single-stranded portion of the hybrid derived from a normal person is constituted by a part of the probe, when the hybrid derived from the normal person is digested, a part of the probe is decomposed. On the other hand, since the single-stranded portion of the hybrid derived from the SBMA patient is constituted by a part of the sample DNA, when the hybrid derived from the SBMA patient is digested, a part of the sample DNA is degraded.
[0088]
Since the sample DNA does not contain a labeled nucleotide, the labeled nucleotide is not released from the hybrid derived from the SBMA patient. On the other hand, since the probe includes a labeled nucleotide, the labeled nucleotide is generated from a hybrid derived from a normal person.
[0089]
The relationship between the behavior of fluorescent molecules, that is, the fluorescence intensity and fluctuation, is fast when the molecule is small, and slow when the molecule is large. For this reason, in the hybrid derived from a normal person, the correlation time of the double-stranded portion is shortened, whereas in the hybrid derived from SBMA patient, the correlation time of the double-stranded portion is long. Can be determined.
[0090]
[Example 3]
In this embodiment, a method for simultaneously testing two types of triplet repeat diseases will be described.
[0091]
As the first triplet repeat disease, a disease in which the number of repeated sequences in normal subjects was 20 or less was selected, and
[0092]
As the second triplet repeat disease, a disease in which the number of repeated sequences in normal individuals was 50 or less was selected, and a probe 6 in which CCG was repeated 50 times was prepared.
[0093]
The
[0094]
First, a sample containing sample DNA serving as an indicator of both triplet diseases was collected from subjects to be diagnosed.
[0095]
The specimen contains repetitive sequence 1 (repeated sequence in which CAG is repeated 20 times or less) or repetitive sequence 2 (repeated sequence in which CAG is repeated 21 times or more) ( FIG. (Refer to the above), the
[0096]
[0097]
By this reaction,
[0098]
Through the hybridization reaction, the
[0099]
Following the hybridization reaction, an enzyme that does not react with the double-stranded portion (for example, S1 nuclease) was added and reacted at around 37 ° C. to digest the single-stranded portion in each hybrid.
[0100]
When the specimen is collected from a normal person who does not suffer from the first triplet repeat disease, since the specimen includes the
[0101]
Therefore, by examining the type of double-stranded DNA and the presence or absence of the release of fluorescently labeled nucleotides by FCS, it can be diagnosed whether the subject is suffering from the first triplet repeat disease.
[0102]
Furthermore, when the specimen is collected from a normal person who does not suffer from the second triplet repeat disease, since the specimen includes the
Therefore, by examining the type of double-stranded DNA and the presence or absence of the release of fluorescently labeled nucleotides by FCS, it can be diagnosed whether or not the subject suffers from the second triplet repeat disease.
[0103]
Therefore, by examining the type of double-stranded DNA and the presence or absence of the release of fluorescently labeled nucleotides by FCS, it can be diagnosed whether or not the subject suffers from the second triplet repeat disease.
[0104]
The above results are summarized in the table below.
[0105]
[Table 1]
As described above, according to this embodiment, two types of triplet repeat diseases can be examined simultaneously.
[0107]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, polymorphisms of repetitive sequences can be analyzed in a short time by a simple operation.
[0108]
[References]
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(2) La Spada, AR: Ann. Neurol., 36, 814-822 (1994)
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(4) Southern EM: J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)
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(8) Schena, M .: Science, 270, 460-470 (1995)
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram of a detection system that can be used in the method of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the concept of repetitive sequence analysis by fluorescence correlation spectroscopy.
FIG. 3 is a diagram illustrating a method according to the first embodiment.
FIG. 4 is a diagram illustrating a method according to the second embodiment.
FIG. 5 is a diagram illustrating a method according to a third embodiment.
Claims (4)
（１）被験者から採取された反復配列を有する標的核酸について、前記反復配列をジデオキシヌクレオチド３リン酸とデオキシヌクレオチド３リン酸とを用いて蛍光標識する工程と；
（２）前記反復配列と相補的な塩基配列を有するプローブと前記反復配列とをハイブリダイズさせて、前記プローブと前記蛍光標識された標的核酸からなるハイブリッドを形成せしめる工程と；
（３）前記ハイブリッドの一本鎖部分を消化して、前記蛍光標識された標的核酸から蛍光標識ヌクレオチドを遊離させ、遊離した蛍光標識ヌクレオチドと蛍光標識二本鎖ハイブリッドとを生成せしめる工程と；
（４）前記遊離した蛍光標識ヌクレオチド及び前記蛍光標識二本鎖ハイブリッドを、蛍光相関分光法を用いて検出又は定量することによって、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法。A method for analyzing a polymorphism of a repetitive sequence, comprising:
(1) For a target nucleic acid having a repetitive sequence collected from a subject, fluorescently labeling the repetitive sequence with dideoxynucleotide triphosphate and deoxynucleotide triphosphate;
(2) a step of hybridizing a probe having a base sequence complementary to the repetitive sequence and the repetitive sequence to form a hybrid comprising the probe and the fluorescently labeled target nucleic acid;
(3) digesting the single-stranded portion of the hybrid, from said fluorescent labeled target nucleic acid to release the fluorescent-labeled nucleotides, the steps allowed to generate the free fluorescent-labeled nucleotide and the fluorescent-labeled double-stranded hybrids;
(4) analyzing the polymorphism of the repetitive sequence by detecting or quantifying the released fluorescently labeled nucleotide and the fluorescently labeled double-stranded hybrid using fluorescence correlation spectroscopy;
With a method.
（１）被験者から採取された反復配列を有する標的核酸における前記反復配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブについて、ジデオキシヌクレオチド３リン酸とデオキシヌクレオチド３リン酸とを用いて蛍光標識する工程と、
（２）前記標的核酸の反復配列と前記蛍光標識プローブとをハイブリダイズさせて、前記蛍光標識プローブと前記標的核酸からなるハイブリッドを形成せしめる工程と；
（３）前記ハイブリッド中の一本鎖部分を消化して、前記蛍光標識プローブから蛍光標識ヌクレオチドを遊離させ、遊離した蛍光標識ヌクレオチドと蛍光標識二本鎖ハイブリッドとを生成せしめる工程と；
（４）前記遊離した蛍光標識ヌクレオチド及び前記蛍光標識二本鎖ハイブリッドを蛍光相関分光法を用いて検出又は定量することによって、前記反復配列の多型を分析する工程と；
を備えた方法。A method for analyzing a polymorphism of a repetitive sequence, comprising:
(1) A step of fluorescently labeling a probe having a base sequence complementary to the repetitive sequence in a target nucleic acid having a repetitive sequence collected from a subject using dideoxynucleotide triphosphate and deoxynucleotide triphosphate When,
(2) a step of hybridizing the repetitive sequence of the target nucleic acid and the fluorescently labeled probe to form a hybrid comprising the fluorescently labeled probe and the target nucleic acid;
(3) digesting the single-stranded portion in said hybrid, wherein the fluorescent-labeled probe to release the fluorescent-labeled nucleotides, the steps allowed to generate the free fluorescent-labeled nucleotide and the fluorescent-labeled double-stranded hybrids;
(4) analyzing the polymorphism of the repetitive sequence by detecting or quantifying the released fluorescently labeled nucleotide and the fluorescently labeled double-stranded hybrid using fluorescence correlation spectroscopy;
With a method.
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