JP3865781B2 - K−252aの精製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、K−252aの精製方法に関する。
背景技術
K−252aは微生物で生産される生理活性物質である(特開昭60−41489)。その活性はプロテインキナーゼC阻害剤に分類され種々の薬理作用を示す。
従来のK−252aの精製方法は、培養液を濾過して微生物菌体を取得し、その微生物菌体に含水もしくは無水の例えばメタノール、アセトン等の有機溶媒を添加し抽出した後、濾過して微生物菌体と抽出液に分離し、得られた抽出液を濃縮し無水有機溶媒でさらに収率良く抽出し、活性炭、ダイヤイオンHP−10等の吸着剤及びシリカゲル、シラナイズドシリカゲル、酸化アルミナ、デキストラン等の担体を用いたカラムクロマトグラフィー方法等により分離した後、濃縮し粗結晶を得る方法である。この方法で得られる結晶の純度及び収率は必ずしも十分ではなく純度を上げるためには再結晶の工程を必要とする。また培養液の濾過性が著しく悪く、少量の濾過は可能であるものの大容量の櫨過は困難である。
また、培養液に直接有機溶媒を添加し抽出し濾過により抽出液を取得する方法も可能であるが、K−252aの各種の有機溶媒に対する溶解度は5〜10g/l程度であり、例えばアセトンに対する溶解度は5g/lと高くないことから、添加する有機溶媒量は培養液と等量以上必要となり処理容量が極度に多くなること、抽出液の純度が悪いことからカラム処理等を必要とする。
発明の開示
本発明によれば、式(I)
で表されるK−252aを含んだ微生物菌体をアルカリ液で処理することにより、該K−252aを次式(II)
で表されるK−252b又はそのアルカリ塩に変換し、該K−252b又はそのアルカリ塩を微生物菌体外へ溶出させた後、得られたK−252b又はそのアルカリ塩をメチル化することによりK−252aに再度変換し、これを単離、回収することを特徴とするK−252aの精製方法が提供される。
本発明に用いるK−252aを含む微生物菌体は、K−252a生産能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる。
K−252a生産能を有する微生物としては、米国ARSカルチャーコレクションにNRRL15532として寄託されているノカルデイオプシス・エスピー(Nocardiopsis sp.)K−252(特開昭60−41489号公報)等があげられる。
栄養培地は、K−252a生産能を有する微生物を培養するのに通常用いられる培地であればいずれでもよく、例えば通常の放線菌の培養に用いられる栄養培地があげられる。培養法としては、液体培養、特に深部攪拌培養法が適している。
培養温度は25〜40℃、pHは5〜9、好ましくは6〜8の中性付近で培養することが望ましい。
微生物菌体中にK−252aを蓄積させた後、培養を停止し精製に用いる微生物菌体を得る。微生物菌体中に蓄積されるK−252a濃度は、1.0g/リットル菌体体積以上が好ましく、5.0g/リットル菌体体積以上が特に好ましい。
微生物菌体は、遠心分離等により収穫できる。遠心分離する前に培養液に塩酸、硫酸、硝酸、酢酸等の酸、好ましくは硫酸を添加しpH2〜4に調整した後微生物菌体を収穫するのが好ましい。
遠心分離には、いかなる遠心分離機も用いうるが、例えばウェストファリアー、α−ラバル等の遠心分離機が好ましい。これら遠心分離機は、大量の培養液を連続的に分離処理でき、かつ洗浄水による微生物菌体の洗浄が同時に行える点で好ましい。
収穫した微生物菌体は、10〜80体積%、好ましくは30〜50体積%となるように、アルカリ液に懸濁し微生物菌体を処理する。アルカリ液に用いるアルカリ類としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム等の1〜3価の金属類及びアンモニウム等の水酸化物、炭酸塩及び炭酸水素塩等があげられる。具体的には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム等の水和物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸水素塩等が例示され、アルカリ金属の水酸化物が好ましい。
アルカリ液のアルカリ濃度は、0.1〜5mol/l、好ましくは1〜2mol/lである。
アルカリ液で微生物菌体を処理する方法としては、アルカリ液に懸濁した微生物菌体を、30〜90℃、好ましくは60〜80℃で、1〜24時間、好ましくは3〜5時間加温する方法があげられる。このアルカリ液の処理により微生物菌体内のK−252aは加水分解されてK−252b又はK−252bアルカリ塩に変換されるとともに、微生物菌体外に抽出される。
該アルカリ液で抽出されたK−252b又はそのアルカリ塩を吸着樹脂又はイオン交換樹脂等の樹脂を充填したカラムにかけ分離することができる。アルカリ液抽出液を樹脂で処理する場合は、微生物菌体を分離し行うが、微生物菌体が懸濁したまま行うことももできる。微生物菌体分離は、例えばヌッチェ、桐山ロート、フィルタープレス、バスケット分離機等を用いた濾過で行うことができる。
吸着樹脂としては、例えば三菱化成社製SP−207、HP−20、HP−30、HP−40、HP−50等、ロームアンドハース社製XAD−2、XAD−4、XAD−284、S−30、S−37、ES−33等の吸着樹脂があげられる。イオン交換樹脂としては、例えば三菱化学社製PA−304、PA−412等、ロームアンドハース社製のIRA−410、IRA−911、A−26、ES−109、A−101D、ES−111等、ダウケミカル社製のDOWEX−2、−4等、バイエル社製のMP−500A、MP−5080等の強塩基性イオン交換樹脂があげられる。
K−252b又はそのアルカリ塩を保持した吸着樹脂又はイオン交換樹脂を水又は含水有機溶媒で洗浄後、有機溶媒又は含水有機溶媒を用いてK−252b又はそのアルカリ塩を樹脂から溶出する。
洗浄に用いる含水有機溶媒としては、例えばアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等からなる水を含んだ極性溶媒をあげることができる。含水濃度は、20%以上、好ましくは50%以上である。
溶出には有機溶媒又は含水有機溶媒が用いられる。溶出に用いる有機溶媒としては、例えばアセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類等があげられる。含水有機溶媒としては、例えばアセトン、メタノール、エタノール等からなる水を含んだ極性溶媒をあげることができる。含水濃度としては20%以下、好ましくは10%以下が好ましい。含水有機溶媒には、必要に応じて水酸化ナトリウム等のアルカリ類又は塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の塩を添加することができる。添加するアルカリの濃度としては、0.1〜1.0mol/lが好ましく、また添加する塩の濃度としては0.1〜1.0mol/lが好ましい。
K−252b又はそのアルカリ塩を含むアルカリ液抽出液又はカラム溶出液は、そのまま又は必要に応じて塩酸、硫酸等の酸を添加し溶出液を酸性としてから濃縮される。濃縮は、溶液1ml当たりK−252b又はそのアルカリ塩が0.5〜20mg、より好ましくは5〜10mgとなるまで行われる。また、濃縮溶液は、該溶出液を濃縮乾固して得られるK−252b又はそのアルカリ塩に有機溶媒を添加することによっても得られる。添加する有機溶媒量は、K−252b又はそのアルカリ塩1g当たり50〜2000ml、より好ましくは100〜200mlである。添加する有機溶媒には上記溶出に用いる有機溶媒が用いられる。
K−252b又はそのアルカリ塩は、メチル化処理することによりK−252aに再度変換する。
メチル化処理は、上記濃縮溶液にジメチル硫酸等のメチル化剤をK−252b又はそのアルカリ塩に対し1〜20当量、好ましくは2〜3当量添加し、50〜100℃、好ましくは60〜80℃で、2〜36時間、好ましくは6〜12時間加熱反応させて行なう。
またメチル化処理は、上記濃縮溶液1リットルに対し、メタノール100〜2000ml、好ましくは500〜800ml及び塩酸、硫酸等の無機酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸等の有機酸又は三菱化学社製SK−1A、1B、116等、ロームアンドハース社製IR−120B、200等、ダウケミカル社製DOWEX−50W等のカチオン交換樹脂を添加し、50〜100℃、好ましくは60〜80℃で、2〜36時間、好ましくは6〜12時間加熱反応させて行なうこともできる。添加すべき無機酸、有機酸、カチオン交換樹脂量は、それぞれK−252b又はそのアルカリ塩に対し1〜20当量であり、2〜3当量が好ましい。
K−252aは、メチル化処理を行った反応液を減圧濃縮し冷却することにより析出される。減圧濃縮は、700〜760mmHg、好ましくは720〜760mmHgで、温度は30〜80℃、好ましくは40〜50℃で、飽和濃度以下まで行う。K−252aを析出させる温度は好ましくは10〜60℃である。
また、反応液からK−252aを析出させるためには、メチル化処理を行った反応液を濃縮、乾固した後、水を添加し次いで有機溶媒を添加することによっても行うことができる。添加する水の量は反応に用いた溶媒容量の0.01〜1倍が好ましく、0.1〜0.5倍がより好ましい。また、有機溶媒としては前述の水を溶解する有機溶媒があげられ、添加する有機溶媒の容量としては添加した水の0.5〜1.5倍が好ましい。
析出したK−252aは、濾過、乾燥等通常の方法により単離し取得することができる。
本発明の効果を以下の試験例で説明する。
試験例
試験例1.
種菌としてノカルディオプシス・エスピー K−252(NRRL15532)を用いた。第一種培地として、グルコース0.5g/dl、溶出デンプン3g/dl、ソイビーンミール3g/dl、コーンスチープリカー0.5g/dl、酵母エキス0.5g/dl、炭酸カルシウム0.3g/dl、(殺菌前pH7.2〜7.4)からなる培地を用いた。種菌1白菌耳を上記種培地14mlを含む50ml太型試験管に植菌し、30℃で3日間振とう培養を行った。
この第一種培養液4mlを第二種培地40mlを含む300ml容エルレンマイヤーフラスコに植菌し、30℃で、3日間振とう培養を行った。第2種培地の組成は第1種培地の組成と同じである。この第2種培養液40mlを第三種培地300mlを含む2リットル容バッフル付きエルレンマイヤーフラスコに植菌し、30℃で、4日間振とう培養を行った。第3種培地の組成は第2種培地の組成と同じである。この第3種培養液900mlを主発酵培地16リットルを含む30リットル容ステンレス製ジャーファーメンターに植菌し、30℃で、7日間通気攪拌培養(回転数300rpm、通気量16リットル/分)を行った。主発酵培地組成は第一種培地の組成と同じである。
該培養液1リットルを濃硫酸にてpH3に調整した後、高速冷却遠心分離機(日立製、CR−20)により微生物菌体分離を行ない微生物菌体300mlを収穫した。微生物菌体300ml中には合計2gのK−252aが含まれていた。この微生物菌体に600mlの水を添加し、再度遠心分離機により洗浄し洗浄濃縮微生物菌体を得た。
得られた洗浄濃縮微生物菌体に水酸化ナトリウム溶液を加えpH12とした後、80℃で3時間加熱した。加熱処理した微生物菌体懸濁液は濃硫酸にてpH7に調整した後、ヌッチェで濾過して微生物菌体を取り除き抽出液を得た。
該抽出液中、K−252aは、ほぼ100%K−252b又はそのアルカリ塩に変換され抽出された。
一方、微生物菌体300mlにアセトンを添加しK−252aを80%で抽出するには10リットルのアセトンが必要であった。
以上のように、K−252aは、K−252b又はそのアルカリ塩に変換することにより有機溶媒を用いることなく、ほぼ100%微生物菌体から抽出することができる。
発明を実施するための最良の形態
実施例1
試験例1と同様に培養し得た培養液1リットルを濃硫酸にてpH3に調整した後、高速冷却遠心分離機(日立製、CR−20)により微生物菌体分離を行ない微生物菌体300mlを得た。微生物菌体300ml中には、2gのK−252aが含まれていた。再度遠心分離により洗浄した後、微生物菌体に600mlの水を添加し微生物菌体懸濁液を得た。
該微生物菌体懸濁液に濃水酸化ナトリウム溶液を加えpH12とした後、80℃で3時間加熱した。加熱処理した微生物菌体懸濁液は濃硫酸にてpH7に調整した後、ヌッチェで濾過して微生物菌体を取り除き抽出液を得た。得られた抽出液を吸着樹脂(200ml容、SP−207、三菱化学社製)に流速SV2で通過させた後、樹脂を200mlの水及び400mlの50%メタノールで洗浄した。次いで、100%メタノール2000mlで溶出を行った。K−252b又はK−252bアルカリ塩を含むメタノール区分は、1000mlまで濃縮した。
濃縮液に濃硫酸1mlを添加し、60℃で3時間加熱することによりK−252aに転換した。得られた反応液を冷却後、濾過することにより、純度75%のK−252a粗結晶が70%の収率(純品換算で1.4g)で得られた。このK−252aの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度95%のK−252aを収率80%で得た(純品換算で1.1g)。
実施例2
実施例1と同様に微生物菌体を水酸化ナトリウムで処理し、ろ液を吸着樹脂に通過させた後、樹脂を洗浄した。次いで、樹脂に吸着したK−252b又はそのアルカリ塩をメタノール:水酸化ナトリウム(9:1)で溶出した後、該溶出液を濃縮乾固し、1000mlアセトンに溶かし、2当量のジメチル硫酸を添加し、60℃で3時間加熱することによりK−252aに変換した。得られた反応液は冷却後、濾過することにより、純度75%のK−252a粗結晶を70%の収率(純品換算で1.4g)で得た。このK−252aの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度95%のK−252aを収率80%で得た(純品換算で1.1g)。
実施例3
実施例1と同様に水酸化ナトリウムで微生物菌体を処理した。次いで、菌体を分離せず直接吸着樹脂にかけ、その後実施例2と同様な方法でK−252aを取得した。この結果、純度75%のK−252a粗結晶を70%の収率(純品換算で1.4g)で得た。このK−252aの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度95%のK−252aを収率80%で得た(純品換算で1.1g)。
実施例4
カラムを強塩基性イオン交換レジン(PA−412)とし溶出液をメタノール:0.1mol/l塩化アンモニウム(9:1)にする以外は実施例2と同様に行った。この結果、純度75%のK−252a粗結晶を70%の収率(純品換算で1.4g)で得た。このK−252aの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度95%のK−252aを収率80%で得た(純品換算で1.1g)。
実施例5
微生物菌体を含んだ抽出液を濾過せず直接カラムに通す以外は実施例4と同様に行った。この結果、純度75%のK−252a粗結晶を70%の収率(純品換算で1.4g)で得た。このK−252aの粗結晶は通常の再結により容易に純度を向上することができ、純度95%のK−252aを収率80%で得た(純品換算で1.1g)。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、大量の有機溶媒を使用することなく簡便・安価かつ高い精製効率でK−252aを工業的規模で精製できる。
Claims (4)
- アルカリ液に用いるアルカリ類がアルカリ金属の水酸化物である請求の範囲1〜3のいずれかに記載のK−252aの精製方法。
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